JP6985508B2 - フロースルーエレクトロポレーション機器編成 - Google Patents

Description

本願発明は、フロースルーエレクトロポレーション機器編成に関する。

以下の議論では、背景技術を説明および紹介する目的で、特定の物品および方法を説明する。ここに含まれるものは、先行技術の「承認」と解釈されるべきではない。出願人は、必要に応じて、適用される法令の下で、ここで参照されている物品および方法が先行技術を構成しないことを実証する権利を明示的に有する。

細胞膜は、細胞の内部と外部との間の分子およびイオンの輸送のための主要なバリアを構成する。電気浸透法としても知られるエレクトロポレーション法は、パルス電界の存在下で細胞膜の透過性を大幅に向上させる。従来のエレクトロポレーションシステムは広く使用されている。ただし、従来のシステムでは高電圧入力が必要であり、電界の歪み、局所的なｐＨの変動、金属イオンの溶解、過剰な発熱など、環境条件の悪化の課題があり、これらはすべてエレクトロポレーション効率の低下および／または細胞生存率の低下につながる可能性がある。さらに、従来のエレクトロポレーションシステムは、簡単に自動化されたり、エレクトロポレーションが１つのプロセスとして実行される自動化された細胞処理システムに簡単に組み込まれたりしない。したがって、効率的かつ自動化された方法で複数の細胞を形質転換することができる自動化されたマルチモジュール細胞処理システムおよびそのコンポーネントが必要である。本発明はこの必要性に対処するものである。

この概要は、以下の詳細な説明でさらに説明される選りすぐりの技術的思想集合を簡略化された形式で紹介するために提供される。この概要は、特許請求の範囲の主題の重要なまたは本質的な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求した主題の範囲を制限するために使用されることも意図していない。特許請求した主題の他の特徴、詳細、ユーティリティ、および利点は、添付の図面に示され、添付の特許請求の範囲に定義される態様を含む以下の詳細な説明から明らかになる。

本開示は、独立型エレクトロポレーション装置としての使用および自動化されたマルチモジュール細胞処理環境での使用の両方のために構成されたエレクトロポレーション装置を提供する。この装置は、液体培地中の細胞に外因性物質を導入するためのフロースルーエレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）装置を含み、装置は、ＦＴＥＰ装置に細胞および外因性物質を導入するための入口および入口チャネルと、ＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞を取り出すための出口チャネルおよび出口と、入口チャネルと出口チャネルの間に配置され、入口チャネルがフローチャネルに入る場所と出口チャネルがフローチャネルを出るポイントの間でフローチャネルの幅が任意に減少するフローチャネルと、２つの電極とを含む。いくつかの実施形態では、２つの電極は、フローチャネルの幅が減少する場所においてフローチャネルの壁の一部を形成する。他の実施形態において、電極は、第１の電極チャネルが、第１の電極を入口チャネルとフローチャネルの狭窄部との間のフローチャネルに流体連通し、第２の電極チャネルが、第２の電極を出口チャネルとフローチャネルの狭窄部との間のフローチャネルに流体連通するように配置されてもよい。

したがって、特定の実施形態では、流体中の細胞に外因性物質を導入するためのフロースルーエレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）装置が提供され、ＦＴＥＰ装置は、細胞および外因性物質を含む流体をＦＴＥＰ装置に入れるための少なくとも第１の入口および少なくとも第１の入口チャネルと、ＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞および外因性物質を含む流体を取り出すための出口および出口チャネルと、第１の入口チャネルおよび出口チャネルと交差し第１の入口チャネルと出口チャネルとの間に配置され、第１の入口チャネルとフローチャネルの中心と、出口チャネルとフローチャネルの中心との間で幅が減少するフローチャネルと、フローチャネルと第１の入口チャネルとの交差点と、フローチャネルと出口チャネルとの交差点との間でかつ、フローチャネルの幅が減少する場所の両端にある電極チャネルに配置された２つの電極であって、電極は、フローチャネル内の流体と流体連通している。そして、電極は、細胞を含む流体がフローチャネルを通過する際に、細胞に１つ以上の電気パルスを印加し、それにより、流体中の細胞に外因性物質を導入する。

この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、流体中の細胞をＦＴＥＰ装置に導入するための少なくとも第１の入口に接続されたリザーバ（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）と、ＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞を取り出すための出口に接続されたリザーバとをさらに備える。この実施形態のいくつかの態様において、入口および出口に連結されたリザーバは、体積が１００μＬから１０ｍｌ、または０．５ｍｌから７ｍｌ、または１ｍｌから５ｍｌの範囲である。

この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、２つの入口および２つの入口チャネルを備え、外因性物質をＦＴＥＰ装置に導入するための第２の入口に接続されたリザーバをさらに備える。この態様のいくつかの構成において、第２の入口および第２の入口チャネルは、第１の入口および第１の入口チャネルと電極との間に位置する。また、いくつかの構成では、第２の入口および第２の入口チャネルは、電極と出口チャネルおよび出口との間に位置する。

この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置の２つの電極は、０．５ｍｍから１０ｍｍ離れて、または１ｍｍから８ｍｍ離れて、または３ｍｍから７ｍｍ離れて、または４ｍｍから６離れて位置する。この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、長さが３ｃｍから１５ｃｍ、または長さが４ｃｍから１２ｃｍ、または長さが４．５ｃｍから１０ｃｍ、または長さが５ｃｍから８ｃｍである。この実施形態のいくつかの態様において、ＦＴＥＰ装置のこの実施形態は、０．５ｃｍから５ｃｍの幅、または０．７５ｃｍから３ｃｍの幅、または１ｃｍから２．５ｃｍの幅、または１ｃｍから１．５ｃｍの幅である。この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置のチャネル幅の最狭窄部分は１０μｍから５ｍｍである。

この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰの流量は、毎分０．１ｍｌから５ｍｌ、または毎分０．５ｍｌから３ｍｌ、または毎分１ｍｌから２．５ｍｌの範囲である。
この実施形態のいくつかの態様では、電極は、１〜２５Ｋｖ／ｃｍ、または１０〜２０Ｋｖ／ｃｍを送達するように構成される。

この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、１つまたは複数の入口チャネルと出口チャネルとの間に、１つまたは複数のフィルタをさらに備える。いくつかの態様では、２つのフィルタがあり、１つは入口チャネルとフローチャネルの狭窄部との間にあり、もう１つはフローチャネルの狭窄部と出口チャネルの間にある。この実施形態のいくつかの態様では、フィルタは、入口チャンバまたは出口チャンバに近位の大孔を有し、およびフローチャネルの狭窄部に近位の細孔を有するような孔サイズで目盛りが付けられている。いくつかの態様では、細孔は、フローチャネルの狭窄部のサイズと同じサイズまたはそれより大きい。この実施形態のいくつかの態様では、フィルタは、ＦＴＥＰ装置の本体とは別個に形成され、アセンブリされているときにＦＴＥＰ装置に配置される。あるいは、この実施形態のいくつかの態様では、フィルタは、ＦＴＥＰ装置の本体の一部として形成されてもよく、本体と一体であってもよい。

この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、毎分１０^３〜１０^１２細胞、または毎分１０^４〜１０^１０、毎分１０^５〜１０^９、または毎分１０^６〜１０^８の細胞形質転換率を提供することができる。通常、１分あたり１０^８個の酵母細胞が形質転換され、１分あたり１０^１０〜１０^１１個の細菌細胞が形質転換される。

この実施形態のいくつかの態様では、細胞の形質転換は、少なくとも９０％の生存細胞、または９５％の生存細胞、および最大９９％の生存細胞をもたらす。
この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、結晶スチレン、シクロオレフィンポリマー、またはシクロオレフィンコポリマーから射出成形によって製造され、この実施形態のいくつかの態様では、電極はステンレス鋼から製造される。

さらに別の実施形態では、外因性物質を流体中の細胞に導入するためのフロースルーエレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）装置を提供する。ＦＴＥＰ装置は、細胞および外因性物質を含む流体を導入するための少なくとも１つの入口および少なくとも１つの入口チャネルと、ＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞および外因性物質を取り出すための出口および出口チャネルと、第１の入口チャネルと出口チャネルの間に位置し、フローチャネルが第１の入口チャネルと出口チャネルと交差し、フローチャネルの一部が、フローチャネルと入口チャネルの交差点とフローチャネルと出口チャネルの交差点との間で狭くなるフローチャネルと、フローチャネルの両側に配置され、フローチャネル内の流体と直接接触し、フローチャネルの狭窄部を画定する電極とを含む。そして、電極は、流体中の細胞がフローチャネルを通過するときに、流体中の細胞に１つまたは複数に電気パルスを印加し、それにより、流体中の細胞に外因性物質を導入する。

いくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、流体中の細胞をＦＴＥＰ装置に導入するための入口に接続されたリザーバと、ＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞を取り出すための出口に接続されたリザーバとをさらに備える。いくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は２つの入口と２つの入口チャネルを備え、外因性物質をＦＴＥＰ装置に導入するための第２の入口に接続されたリザーバをさらに備える。この実施形態のいくつかの態様において、入口および出口に連結されたリザーバは、体積が１００μＬから１０ｍｌ、または０．５ｍｌから７ｍｌ、または１ｍｌから５ｍｌの範囲である。

この実施形態のいくつかの態様では、第２の入口および第２の入口チャネルは、第１の入口および第１の入口チャネルと電極との間に位置する。また、いくつかの構成では、第２の入口および第２の入口チャネルは、電極と出口チャネルおよび出口との間に位置する。

この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置の２つの電極は、１０μｍから１ｍｍ離れて、または２５μｍから３ｍｍ離れて、または５０μｍから２ｍｍ離れて、または７５μｍから１ｍｍ離れて位置する。この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、長さが３ｃｍから１５ｃｍ、または長さが４ｃｍから１２ｃｍ、または長さが４．５ｃｍから１０ｃｍ、または長さが０．５ｃｍから８ｃｍである。この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、幅が０．５ｃｍから５ｃｍ、または幅が０．７５ｃｍから３ｃｍ、または幅が１ｃｍから２．５ｃｍ、または幅が１ｃｍから１．５ｃｍである。この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置のチャネル幅の最狭窄部分は１０μｍから５ｍｍであり、いくつかの態様では、チャネル幅の最狭窄部分は１０μｍから１ｍｍである。

この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰの流量は、毎分０．１ｍｌから５ｍｌ、または毎分０．５ｍｌから３ｍｌ、または毎分１ｍｌから２．５ｍｌの範囲である。
この実施形態のいくつかの態様では、電極は、１〜２５Ｋｖ／ｃｍ、または１０〜２０Ｋｖ／ｃｍを送達するように構成される。

この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、１つまたは複数の入口チャネルと出口チャネルとの間に、１つまたは複数のフィルタをさらに備える。いくつかの態様では、２つのフィルタがあり、１つのフィルタは入口チャネルとフローチャネルの狭窄部との間にあり、もう１つのフィルタはフローチャネルの狭窄部と出口チャネルの間にある。この実施形態のいくつかの態様では、フィルタは、入口チャンバまたは出口チャンバに近位の大孔を有し、およびフローチャネルの狭窄部に近位の細孔を有するような孔サイズで目盛りが付けられている。いくつかの態様では、細孔は、フローチャネルの狭窄部のサイズと同じサイズまたはそれより大きい。この実施形態のいくつかの態様では、フィルタは、ＦＴＥＰ装置の本体とは別個に形成され、アセンブリされているときにＦＴＥＰ装置に配置される。あるいは、この実施形態のいくつかの態様では、フィルタは、ＦＴＥＰ装置の本体の一部として形成されてもよく、本体と一体であってもよい。

この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、毎分１０^３〜１０^１２細胞、または毎分１０^４〜１０^１０、毎分１０^５〜１０^９、または毎分１０^６〜１０^８の細胞形質転換率を提供することができる。通常、１０^８個の酵母細胞が１分あたりに形質転換され、１０^１０〜１０^１１個の細菌細胞が１分あたりに形質転換される。

この実施形態のいくつかの態様において、細胞の形質転換は、少なくとも９０％の生存細胞、または９５％の生存細胞、および最大９９％の生存細胞をもたらす。
この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、結晶スチレン、シクロオレフィンポリマー、またはシクロオレフィンコポリマーから射出成形によって製造され、いくつかの態様では、電極はステンレス鋼から製造される。

いずれかの実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、単一基板上に複数のＦＴＥＰ装置として並行して製造され、ＦＴＥＰ装置は使用目的で分離される。
いずれかの実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は試薬カートリッジの一部であり、いくつかの態様では、試薬カートリッジはＦＴＥＰ装置の操作指示を提供するスクリプトを含む。

いずれかの実施形態のいくつかの態様において、ＦＴＥＰ装置は、自動化されたマルチモジュール細胞処理システムの一部であるモジュールに含まれ、自動化されたマルチモジュール細胞処理システムは、１つ以上の細胞用のレセプタクル、細胞にエレクトロポレーションされる核酸または他の材料用の１つ以上の容器、成長モジュール、濾過モジュール、回復モジュール、核酸アセンブリモジュール、精製モジュール、編集モジュール、シンギュレーションおよび成長モジュール、選択モジュール、保存モジュール、およびプロセッサを含む。

さらに、流体中の細胞に外因性物質を導入するためのフロースルーエレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）装置の別の実施形態が提示される。ＦＴＥＰ装置は、細胞または外因性物質を含む流体を受け入れるための少なくとも第１の入口と、流体を受け取るために第１の入口に流体的に結合された狭窄領域を有し、狭窄領域は流体の流れを閉じ込めるフローチャネルと、フローチャネルの狭窄領域内の流体と電気的に連通して配置された少なくとも２つの電極であって、電極がフローチャネルまたはフローチャネルの狭窄領域を通過する際に細胞または外因性物質に電界を印加し、それにより形質転換された細胞を形成するように構成された電極と、フローチャネルの狭窄領域に連結され、形質転換された細胞を受け入れるように構成された少なくとも１つの出口とを備える。いくつかの態様では、少なくとも２つの電極は、流体と直接接触するように構成される。この実施形態のいくつかの態様において、フローチャネルは、細胞に運動量を与える非線形経路をたどり、細胞の少なくとも一部がチャネル内に配置された物体の周りを流れるようにする。いくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、第１の電極の近位端を受け入れるためのフローチャネルの狭窄領域の近位にある少なくとも１つの開口をさらに備え、それにより第１の電極は流体と直接接触する。さらに、いくつかの態様では、開口部は丸い縁を含む。この実施形態のいくつかの態様では、フローチャネルの狭窄領域は第１の断面寸法を有し、少なくとも２つの電極は、その寸法に沿ってフローチャネルの狭窄領域を部分的に横切って延びる。

他の実施形態と同様に、ＦＴＥＰ装置は、流体中の細胞をＦＴＥＰ装置に導入するための入口に接続されたリザーバと、ＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞を取り出すための出口に接続されたリザーバをさらに含む。

すべての実施形態のいくつかの態様において、ＦＴＥＰ装置は、ＦＴＥＰ装置の加圧および圧力駆動流の提供を可能にするシールをさらに備える。いくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、少なくとも複数の細胞がフローチャネルの狭窄領域を複数回横断するように、フローチャネルを通して流体を駆動するポンプをさらに含む。

すべての実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、少なくとも２つの電極に時変電圧を印加するための電圧源をさらに備える。
前述の実施形態と同様に、ＦＴＥＰのこの実施形態の一態様は、流体を受け入れて保持するために第１の入口に接続された第１のリザーバと、形質転換された細胞を受け入れるために出口に接続された第２のリザーバとをさらに含む。いくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、ＦＴＥＰ装置内の細胞に導入される外因性物質を受け入れるための第２の入口をさらに備え、前記入口は、フローチャネルの狭窄領域と流体連通する。また、いくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、細胞よりも実質的に大きい物体のフローチャネルの狭窄領域への透過を防ぐように構成されたフィルタ要素をさらに備え、この実施形態のいくつかの態様では、フィルタ要素は、フローチャネルの狭窄領域を形成する構造、およびいくつかの態様では、フィルタ要素は、フローチャネルの狭窄領域の近位にある位置に向かうに連れ次第に小さな開口を有する。

他の実施形態では、外因性物質を流体中の細胞に導入するためのフロースルーエレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）装置が提供され、装置は、細胞および外因性物質を含む流体を導入するための少なくとも１つの入口および少なくとも１つの入口チャネルと、ＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞および外因性物質を取り出すための出口および出口チャネルと、第１の入口チャネルと出口チャネルとの間に配置されたフローチャネルであって、第１の入口チャネルおよび出口チャネルと交差し、入口チャネル交差点と出口チャネル交差点との間でフローチャネルの一部が狭まるフローチャネルと、フローチャネルの狭窄部の両側に配置され、フローチャネル内の流体と直接接触し、フローチャネルの狭窄部を画定する電極とを備える。そして、電極は、細胞を含む流体がフローチャネルを通過するときに、流体中の１つまたは複数の細胞に電気パルスを印加し、それにより、流体中の細胞に外因性物質を導入する。

さらに他の実施形態は、外因性物質を流体中の細胞に導入するためのフロースルーエレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）装置を提供する。ＦＴＥＰ装置は、ＦＴＥＰ装置へ細胞／外因性物質を含む流体を受け入れるための少なくとも第１の入口および少なくとも第１の入口チャネルと、ＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞／外因性物質を含む流体を取り出すための出口および出口チャネルと、少なくとも第１の入口チャネルおよび出口チャネルと交差し少なくとも第１の入口チャネルと出口チャネルとの間に配置されたフローチャネルと、フローチャネルと第１の入口チャネルとの交差点と、フローチャネルと出口チャネルとの交差点との間の電極チャネルに配置された２つの電極であって、フローチャネル内の流体と電気的に連通し、フローチャネル内を通過する際に流体中の１つまたは複数の細胞に電気パルスを印加し、それにより、流体中の細胞に外因性物質を導入する電極と、少なくとも第１の入口チャネルと電極チャネルとの間に配置されたフィルタとを含む。

一つの態様では、フィルタはＦＴＥＰ装置の一部として一体的に形成され、一つの態様では、フィルタおよびＦＴＥＰ装置は射出成形により形成される。いくつかの態様では、フィルタは勾配フィルタであり、いくつかの態様では、勾配は少なくとも第１の入口チャネルの近位にある大孔と、電極チャネルの近位にある細孔とを含む。フィルタ付きのＦＴＥＰ装置のいくつかの態様では、電極と出口チャネルの間に配置された第２のフィルタがあり、いくつかの態様では、両方のフィルタがＦＴＥＰ装置の一部として一体的に形成される。この実施形態のいくつかの態様では、両方のフィルタは勾配フィルタであり、いくつかの態様では、１つの勾配フィルタは少なくとも第１の入口チャネルの近位にある大孔と電極チャネルの近位にある細孔とを含み、他の勾配フィルタは出口チャネルの近位にある大孔を含み、電極チャネルの近位にある細孔を含む。

この実施形態のいくつかの態様では、フローチャネルの幅は、第１の入口チャネルとフローチャネルの中心と出口チャネルとフローチャネルの中心との間で減少し、この実施形態のいくつかの態様では、２つ電極は、フローチャネルと第１の入口チャネルとの交差点と、フローチャネルと出口チャネルとの交差点との間でかつ、フローチャネルの幅が減少する場所の両端の電極チャネルに配置される。

フィルタを含むＦＴＥＰ装置の実施形態の態様では、フィルタ要素は「ペグ」または「突起」を含み、「ペグ」または「突起」は形状が円形、長円形、楕円形、または多角形であってもよい。

さらに別の実施形態は、細胞をエレクトロポレーションする方法を提供する。その方法は、エレクトロコンピテント細胞および外因性物質を含む流体を受け入れるための入口および少なくとも１つの入口チャネルと、ＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞および外因性物質を含む流体を取り出すための出口および出口チャネルと、入口チャネルおよび出口チャネルと交差し入口チャネルと出口チャネルの間に配置されたフローチャネルと、フローチャネルと入口チャネルとの交差点と、フローチャネルと出口チャネルとの交差点との間に配置され、フローチャネル内の流体と電気的に連通する２つの電極と、を含むフロースルーエレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）装置を用意することと、エレクトロコンピテントセルと外因性物質を含む細胞を入口と入口チャネルに流し、細胞をフローチャネルに流し、２つの電極を通過させることと、細胞が電極を通過してフローチャネルを通って流れるとき、流体中の細胞に電気パルスを提供してエレクトロポレーションされた細胞を生成することと、エレクトロポレーションされた細胞を出口チャネルおよび出口から取り出すことと、を含む。

いくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置のフローチャネルは、入口チャネルとフローチャネルの中間領域と出口チャネルとフローチャネルの中間領域との間の幅が減少し、この実施形態のいくつかの態様では、フローチャネルの幅は、１０μｍ〜５ｍｍ、または５０μｍ〜２ｍｍ、またはエレクトロポレーションされる細胞の直径の少なくとも２倍より小さくならない寸法まで減少する。

いくつかの態様では、電極は、１〜２５Ｋｖ／ｃｍの電圧、または５〜２０Ｋｖ／ｃｍの電圧、または１０〜２０Ｋｖ／ｃｍの電圧を送達するように構成される。いくつかの態様において、ＦＴＥＰ装置の流量は、毎分０．１ｍｌから５ｍｌの間、または毎分０．５ｍｌから３ｍｌの間である。

この実施形態のいくつかの態様では、２つの電極はそれぞれ電極チャネル内に配置され、１つの電極は入口チャネルとフローチャネルの中間領域との間に配置され、１つの電極は出口チャネルとフローチャネルの中央領域との間に配置される。この態様のいくつかの構成では、電極は０．５ｍｍから１０ｍｍ離れているか、３ｍｍから７ｍｍ離れている。

この実施形態のいくつかの態様では、電極は、フローチャネルの両側に配置され、フローチャネル内の流体と直接接触し、フローチャネルの幅の減少を規定する。この態様のいくつかの構成では、電極は１０μｍから５ｍｍ離れているか、２５μｍから２ｍｍ離れている。

この実施形態のいくつかの態様では、ＦＴＥＰ装置は、フローチャネル内に配置された少なくとも１つのフィルタをさらに備え、この態様のいくつかの構成では、フィルタはＦＴＥＰ装置の一部として一体形成される。いくつかの構成では、フィルタは勾配フィルタであり、いくつかの構成では、勾配は、入口チャネルの近位にある大きな細孔と、電極の近位にある小さな細孔とを含む。さらに、いくつかの構成では、ＦＴＥＰ装置は、電極と出口チャネルの間に配置された第２のフィルタをさらに備え、いくつかの構成では、両方のフィルタがＦＴＥＰ装置の一部として一体に形成される。また、２つのフィルタがあるいくつかの構成では、１つの勾配フィルタは入口チャネルの近位にある大孔と電極の近位にある細孔を含み、もう１つの勾配フィルタは出口チャネルの近位にある大孔と電極の近位にある細孔を含む。

さらに、細胞をエレクトロポレーションする方法を提供する。その方法は、エレクトロコンピテント細胞および外因性物質を含む流体を受け入れるための入口および少なくとも１つの入口チャネルと、ＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞および外因性物質を含む流体を取り出すための出口および出口チャネルと、入口チャネルおよび出口チャネルと交差し入口チャネルと出口チャネルの間に配置されたフローチャネルと、フローチャネルと入口チャネルとの交差点と、フローチャネルと出口チャネルとの交差点との間に配置され、フローチャネル内の流体と電気的に連通する２つの電極と、を含むフロースルーエレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）装置を用意することと、エレクトロコンピテントセルと外因性物質を含む細胞を入口と入口チャネルに流し、細胞をフローチャネルに流し、２つの電極を通過させることと、細胞が電極を通過してフローチャネルを通って流れるとき、流体中の細胞に電気パルスを提供してエレクトロポレーションされた細胞を生成することと、エレクトロポレーションされた細胞を出口チャネルおよび出口から取り出すことと、細胞の流れを逆転させて、出口から細胞を流し、出口チャネル、フローチャネルおよび２つの電極を通過させ、細胞がフローチャネルを流れるときに、流体中の細胞に電気パルスを提供し、そして、エレクトロポレーションされた細胞を入口チャネルおよび入口に流すことと、を含む。

この実施形態のいくつかの態様は、エレクトロポレーションされた細胞を入口に流入させた後、細胞の流れを再び反転させて、入口から、入口チャネル、フローチャネル、および２つの電極を通過して細胞を流すことと、細胞が２つの電極を通過してフローチャネルを流れるときに、流体中の細胞に電気パルスを提供することと、エレクトロポレーションされた細胞を出口チャネルおよび出口から取り出すこととを更に含む。

この実施形態のいくつかの態様において、ＦＴＥＰ装置のフローチャネルは、入口チャネルとフローチャネルの中央領域との間の幅が減少し、出口チャネルとフローチャネルの中央領域との間で幅が減少する。１つの態様では、フローチャネルの幅は、エレクトロポレーションされる細胞の直径の少なくとも２倍より少なくない寸法まで減少する。

本発明のこれらの態様および他の特徴および利点は、以下により詳細に説明される。
本発明の前述および他の特徴および利点は、添付の図面と併せて、例示的な実施形態の以下の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。

本開示のＦＴＥＰ装置の一態様の上面図の例示である。 図１Ａに示される装置の態様の断面の上面図である。 図１Ａおよび１Ｂに示される装置の態様の断面の側面図である。 本開示のＦＴＥＰ装置の別の態様の上面図である。 図２Ａに示される装置の態様の断面の上面図である。 図２Ａおよび２Ｂに示される装置の態様の断面の側面図である。 本開示のＦＴＥＰ装置のさらに別の態様の上面図である。 図３Ａに示される装置の態様の断面の上面図である。 図３Ａおよび３Ｂに示される装置の態様の断面の側面図である。 細胞および外因性物質のための別個の入口を備えた、本明細書に記載のＦＴＥＰ装置のさらなる態様の断面の上面図である。 図４Ａに示される装置の態様の断面の上面図である。 図４Ｃに示される装置の態様の断面の側面図である。 図４Ｄに示される装置の態様の変形例の断面の側面図である。 図４Ｃおよび４Ｄに示される装置の態様の別の変形例の断面の側面図である。 本開示のＦＴＥＰ装置のさらに別の態様の断面の上面図であり、ＦＴＥＰは、細胞および外因性物質のための２つの別個の入口を含む。 図５Ａに示される装置の態様の断面の側面図である。 図５Ａおよび５Ｂに示される装置の態様の断面の側面図である。 本開示のＦＴＥＰ装置のさらに追加の態様の断面の上面図であり、ここでは、入口チャネルからの流体の流れ集束を含む。 本開示のＦＴＥＰ装置の第１の多重化された態様の断面の上面図である。 本開示の装置の第２の多重化された態様の断面の上面図である。 本開示の装置の第３の多重化された態様の断面の上面図である。 本開示の装置の第４の多重化された態様の断面の上面図である。 本開示の装置の第５の多重化された態様の断面の上面図である。 本開示のＦＴＥＰ装置のさらに別の態様の上面図である。 図８Ａに示される装置の態様の断面の上面図である。 図８Ａおよび８Ｂに示される装置の態様の断面の側面図である。 図８Ａ、８Ｂ、８Ｃに示される装置の態様の下半分の断面の側面図である。 図８Ａ〜８Ｄに示される装置の態様の変形例の断面の側面図であり、ここでは、電極はＦＴＥＰ装置の底部に配置されている。 本開示のＦＴＥＰ装置のさらに別の態様の上面図である。 図９Ａに示される装置の態様の断面の上面図である。 図９Ａおよび９Ｂに示される装置の態様の断面の側面図である。 本開示のＦＴＥＰ装置の代替の態様の上面図である。 図１０Ａに示される装置の態様の断面の上面図である。 図１０Ａおよび１０Ｂに示される装置の態様の変形例の断面の上面図である。 図１０Ａ−１０Ｃに示される装置の態様の断面の側面図である。 図１０Ａ−１０Ｄに示される装置の態様の下半分の断面の側面図である。 本開示のＦＴＥＰ装置のさらに別の態様の上面図である。 図１１Ａに示される装置の態様の断面の上面図である。 図１１Ａ−１１Ｂに示される本開示の装置の態様の断面の側面図である。 図１１Ａ−１１Ｂに示される装置の態様の変形例の断面の側面図である。 図１１Ａ−１１Ｂに示される装置の態様の変形例の断面の側面図である。 本開示のＦＴＥＰ装置のさらに別の態様の断面の上面図である。 図１２Ａに示される装置の態様の断面の上面図である。 図１２Ａおよび１２Ｂに示される装置の態様の断面の側面図である。 本開示のＦＴＥＰ装置の別の態様の断面の側面図である。 図１３Ａに示される装置の態様の断面の上面図である。 流れ集束機能を備えたＦＴＥＰ装置の一態様の断面の上面図である。 独立型ＦＴＥＰモジュールの一部であり得る、または自動化されたマルチモジュール細胞処理システムにおける１つのモジュールとしてのフロースルーエレクトロポレーション装置の上面斜視図である。 独立型ＦＴＥＰモジュールの一部であり得る、または自動化されたマルチモジュール細胞処理システムにおける１つのモジュールとしてのフロースルーエレクトロポレーション装置の底面斜視図である。 独立型ＦＴＥＰモジュールの一部であり得る、または自動化されたマルチモジュール細胞処理システムにおける１つのモジュールとしてのフロースルーエレクトロポレーション装置の底面図である。 図１５Ｃに描かれたＦＴＥＰユニットの走査型電子顕微鏡写真を示す。 図１５Ｂおよび１５Ｃに黒いバーとして描かれたフィルタ１５７０および１５７２の走査電子顕微鏡写真を示す。 （ｉ）ＦＴＥＰ装置に挿入する前の電極、（ｉｉ）電極、（ｉｉｉ）電極と電極チャネルをフローチャネルに隣接させて、電極を電極チャネルに挿入した状態を示す。 電極チャネルがフローチャネルと出会う開口の２つの異なる構成の２つの走査電子顕微鏡写真を示す。 試薬カートリッジとエレクトロポレーション装置の組み合わせの代替実施形態を示す。 試薬カートリッジとエレクトロポレーション装置の組み合わせの代替実施形態を示す。 ＦＴＥＰ装置および追加のオプションモジュールを備える例示的な自動化されたマルチモジュール細胞処理システムを示す。 形質転換モジュールにＦＴＥＰを含む自動化されたマルチモジュール細胞処理システムを使用する方法の実施形態のブロック図である。 本明細書で説明されるＦＴＥＰ装置の１つまたは複数が使用され得る例示的な自動化されたマルチモジュール細胞処理システムの簡略化されたブロック図である。 本明細書で説明されるＦＴＥＰ装置のうちの１つまたは複数が使用され得る例示的な自動化されたマルチモジュール細胞処理システムの異なる実施形態の簡略ブロック図である。 本明細書で説明されるＦＴＥＰ装置の１つまたは複数が使用され得る例示的な自動化されたマルチモジュール細胞処理システムのさらに別の実施形態の簡略ブロック図である。 本明細書に記載のＦＴＥＰ装置の１つまたは複数が使用され得る例示的な自動化されたマルチモジュール細胞処理システムの実施形態の簡略化されたブロック図である。 本明細書に記載のＦＴＥＰ装置の１つまたは複数が使用され得る例示的な自動化されたマルチモジュール細胞処理システムの実施形態の簡略化されたブロック図である。 本開示のＦＴＥＰ装置のフローチャネルを通るバッファー中の細胞および外因性物質の層流を示す写真である。 本開示の装置および比較器エレクトロポレーション装置を使用した大腸菌のエレクトロポレーションの結果を示す棒グラフである。 コンパレーターエレクトロポレーション装置に対してベンチマークされた、本明細書に記載のＦＴＥＰを介して形質転換された大腸菌細胞の取り込み、切断、および編集効率を示す棒グラフである。 本開示のＦＴＥＰ装置および比較器エレクトロポレーション法を使用したＳ．セレビシエ（S. Cerevisiae）のエレクトロポレーションの結果を示す棒グラフである。 ＦＴＥＰ流量および圧力対経過時間のグラフ（上）、ならびに圧力システムおよびＦＴＥＰの簡単な描写（下）を示す。

図面は必ずしも縮尺通りではなく、また、同様の参照番号は同様の特徴を指すことを理解されたい。
一実施形態に関連して説明される機能のすべては、明示的に述べられる場合、または特徴または機能が追加の実施形態と互換性がない場合を除き、本明細書に記載の追加の実施形態に適用可能である。たとえば、特定の機能または機能が一実施形態に関連して明示的に説明されているが、代替実施形態に関連して明示的に言及されていない場合、機能が代替実施形態と互換性がない場合を除き、機能または代替機能に関連して展開、利用、または実装できることを理解されたい。
本明細書に記載の技術の実施は、特に明記しない限り、当該分野における従来技術としての、従来の技術および説明分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、および遺伝子工学技術を採用してもよい。そのような従来の技術および説明は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる「Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual．第４版」、「Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2014)」、「Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al. eds., (2017)」、「Neumann, et al., Electroporation and Electrofusion in Cell Biology, Plenum Press, New York, 1989」、「Chang, et al., Guide to Electroporation and Electrofusion, Academic Press, California (1992)」などの標準的な実験室マニュアルに記載されている。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「オリゴ」への言及は、同じ機能を果たす１つまたは複数のオリゴを指し、「方法」には、同等のステップおよび当業者に既知の方法への言及などが含まれる。すなわち、特に明記しない限り、本明細書で使用する「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という言葉は「１つ以上」の意味を持っている。さらに、本明細書で使用される「左」、「右」、「頂」、「底」、「前」、「後」、「横」、「高さ」、「長さ」、「幅」、「上方」、「下方」、「内部」、「外部」、「内側」、「外側」などの用語は単に参照点を説明するものであり、本開示の実施形態を必ずしも特定の向きまたは構成に限定するものではない。さらに、「第１」、「第２」、「第３」などの用語は、本明細書で開示されるいくつかの部分、構成要素、ステップ、操作、機能、および／または参照点の１つを単に特定し、同様に特定する本開示の実施形態を特定の構成または向きに必ずしも限定するものではない。

さらに、用語「およそ」、「近位」、「マイナー」、および類似の用語は、一般に、２０％、１０％、または１０％の範囲内で識別された値、特定の実施形態では好ましくは５％、およびその間の任意の値を含む範囲を指す。

特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、現在記載される発明に関連して使用され得る装置、製剤、および方法論を説明および開示する目的を含む、あらゆる目的で参照により組み込まれる。

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の各介在値と、その記載された範囲内の他の記載または介在値は本発明に含まれることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、より小さな範囲に独立して含まれてもよく、記載された範囲内の特に除外された制限があることを条件として、本発明に含まれる。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。

以下の説明では、本発明のより完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細が述べられている。しかし、これらの特定の詳細の１つ以上がなくても本発明を実施できることは当業者には明らかであろう。他の例では、本発明を曖昧にすることを避けるために、当業者に周知の特徴および手順は説明されていない。本明細書で使用される用語は、当業者によって理解されるような明白で通常の意味を有することを意図している。

エレクトロポレーションは、細胞膜を透過性にするために広く使用されている方法であり、電気刺激により細胞膜に一時的に孔を生成することにより機能する。エレクトロポレーションの用途には、哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）、植物細胞、古細菌、酵母、その他の真核細胞、バクテリア、その他の細胞タイプなどのさまざまな細胞へのＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、抗体、薬物、またはその他の物質の送達が含まれる。さらに、例えば、大腸菌株の混合物、細菌株の混合物、酵母株の混合物、哺乳類細胞の混合物などの細胞種の混合物も１回の実行でエレクトロポレーションできる。電気刺激は、ハイブリドーマまたは他の融合細胞の生産における細胞融合にも使用できる。典型的なエレクトロポレーション手順の間、細胞は、細胞の生存に有利なバッファーまたは培地に懸濁される。細菌細胞のエレクトロポレーションでは、水、グリセロール溶液などの低コンダクタンス培地を使用して、一時的な高電流による発熱を低減する。次いで、細胞および細胞にエレクトロポレーションされる材料（集合的に「細胞試料」）を、放電のために２つの平らな電極が埋め込まれたキュベットに入れる。たとえば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）は、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＸＣＥＬＬ（商標）製品シリーズでキュベット内の細胞をエレクトロポレーションする。従来、エレクトロポレーションには高い電界強度が必要である。

一般的に言えば、マイクロ流体エレクトロポレーションは、約２０ｍｌ未満および１μｌの細胞懸濁液を使用し、トランスフェクションまたは形質転換プロセスをより正確に制御でき、ベンチスケールエレクトロポレーション装置と比較して他の細胞処理ツールと柔軟に統合できる。したがって、マイクロ流体エレクトロポレーションは、例えば、単一細胞の形質転換、処理、および分析、マルチユニットＦＴＥＰ装置構成、統合され自動化されたマルチモジュール細胞処理と分析に独自の利点を提供する。

本開示は、エレクトロポレーション装置およびシステムを他の自動化された細胞処理ツールと統合することができる、低毒性で高効率の細胞エレクトロポレーションを達成するエレクトロポレーション装置、エレクトロポレーションシステムおよび方法を提供する。さらに、本開示のエレクトロポレーション装置は、２つから多数のエレクトロポレーションユニットが並行して構築および使用される多重化を可能にし、これにより、ロボット式液体ハンドリング機器との特に容易な統合が可能になる。このような自動化された機器には、テカン（スイス、マンネドルフ）、ハミルトン（ネバダ州リノ）、ベックマンコールター（フォートコリンズ、コロラド州）などの既製の自動化された液体ハンドリングシステムが含まれるが、これらに限定されない。

エレクトロポレーションプロセスの間、細胞への物質のエレクトロポレーションを達成するのに十分な電圧を使用することが重要であるが、過剰電力は細胞の生存率が低下をもたらすため、過剰電圧は好ましくない。たとえば、ヒト細胞株の懸濁液にエレクトロポレーションを行うには、４ｍｍギャップのキュベット内のサンプル０．２ｍｌに約１０００μＦのコンデンサからの指数関数的放電を伴う２００ボルトが必要である。ただし、同じ０．２ｍｌの細胞懸濁液を２ｃｍの電極距離（キュベットギャップ距離の５倍）の長い容器に入れると、必要な電圧は１０００ボルトになるが、コンデンサからの電気エネルギーは次の式に従うため、コンデンサはわずか４０μＦ（１０００μＦの１／２５）のものしか必要でない。
Ｅ＝０．５Ｕ^２Ｃ
ここで、Ｅは電気エネルギー、Ｕは電圧、Ｃは静電容量を現す。したがって、高電圧パルス発生器は、同じ量のエネルギーを保存するためにはるかに小さなコンデンサを必要とするため、製造が容易である。同様に、より高い電圧の他の波形を生成することは難しくない。

本開示のエレクトロポレーション装置は、比較的短い時間で高速の細胞形質転換を可能にすることができる。細胞の形質転換率は、細胞の種類と形質転換される細胞の数に依存する。例えば、大腸菌の場合、エレクトロポレーション装置は、毎分１０^３から１０^１２細胞、毎分１０^４から１０^１０、毎分１０^５から１０^９、または毎分１０^６から１０^８の細胞形質転換率を提供できる。通常、１０^８個の酵母細胞が１分あたりに形質転換され、１０^１０〜１０^１１個の細菌細胞が１分あたりに形質転換される。エレクトロポレーション装置はまた、並列装置を使用した単一の形質転換手順で、１細胞から１０^１１細胞までのひとまとまりの細胞の形質転換を可能にする。
例示的なＦＴＥＰ実施形態
本明細書に記載される本発明の第１の態様は、図１Ａ−１Ｃに示される。図１Ａは、細胞および細胞に送達される外因性物質を含む流体をＦＴＥＰ装置１００に導入するための入口１０２と、エレクトロポレーション後に形質転換された細胞を取り出すための出口１０４とを有するＦＴＥＰ装置１００の平面上面図を示す。長円電極１０８は、電極の湾曲に基づいてチャネルが狭くなるフローチャネル（図示せず）の中央部分（center portion）を画定するように配置される。図１Ｂは、装置１０２の上部からの断面図１１０を示しており、入口１０２、出口１０４、および、フローチャネル１０６に対して配置されている電極１０８を示す。電極１０８は、フローチャネル１０６の狭窄部を画定することに留意されたい。図１Ｃは、入口１０２および入口チャネル１１２、ならびに出口１０４および出口チャネル１１４を備えた装置１００の側面断面図１２０を示す。電極１０８は、形状が長円形であり、フローチャネル１０６の狭窄部を画定するように配置される。

本開示のＦＴＥＰ装置において、形質転換の毒性レベルは、細胞タイプおよび細胞に導入される核酸に応じてエレクトロポレーション後に３０％を超える生存細胞、好ましくは３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を超える生細胞をもたらす程度である。

ＦＴＥＰ装置のハウジングは、ＦＴＥＰ装置が再使用されるか、オートクレーブされるか、または使い捨てであるかに応じて、ステンレス鋼、シリコン、ガラス、樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルブタジエン、ポリカーボネート、ポリエーテルエテケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホンおよびポリウレタン、これらのコポリマーおよび他のポリマーを含む多くの材料から作ることができる。同様に、装置のチャネルの壁は、シリコーン、樹脂、ガラス、ガラス繊維、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルブタジエン、ポリカーボネート、ポリエーテルエテケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホン、ポリウレタン、これらのコポリマーおよび他のポリマーから作ることができる。好ましい材料には、結晶スチレン、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、およびシクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）が含まれ、これらは、電極および例えば底部密封フィルムが存在する場合（例えば、図１６Ｂ（ｖ）を参照）、それらを除いて、射出成形により装置を完全に一体成形できるようにする。

本明細書に記載されるＦＴＥＰ装置（またはＦＴＥＰ装置の一部）は、例えば装置全体として、または融合またはそうでなければ結合される構造層の作成によって、様々な技術を介して作成または製造することができる。たとえば、金属ＦＴＥＰ装置の場合、製造には精密機械加工またはレーザー加工が含まれる。シリコンＦＴＥＰ装置の場合、製造にはドライエッチングまたはウェットエッチングが含まれる。ガラスＦＴＥＰ装置の場合、製造にはドライまたはウェットエッチング、パウダーブラスト、サンドブラスト、または光構造化が含まれる。プラスチックＦＴＥＰ装置の場合、製造には熱成形、射出成形、ホットエンボス、またはレーザー加工が含まれる。ＦＴＥＰ装置のコンポーネントを個別に製造してからアセンブリするか、またはＦＴＥＰ装置の特定のコンポーネント（または電極を除くＦＴＥＰ装置全体）を製造（たとえば、３Ｄ印刷を使用）または成形（たとえば、射出を使用して成形）した単一の実体として、成形後に他のコンポーネントが追加される。例えば、ハウジングおよびチャネルは、単一の実体として製造または成形され、後にＦＴＥＰユニットを形成するために電極が追加される（例えば、図１６Ｆを参照）。いくつかの実施形態では、フィルムまたは平坦な基板を使用して、図１６Ｂ（ｖ）に示されるように、装置の底部を密封することができる。フィルムは、いくつかの実施形態では、ＦＴＥＰ装置と同じ材料、この場合、例えば、結晶スチレン、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）またはシクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）から作られている。ＦＴＥＰ装置は、２つ以上の平行な層、例えば、水平チャネルとフィルタを備えた層、垂直チャネルを備えた層、および個別に製造および／または成形され製造後にアセンブリされた入口ポートと出口ポートを備えた層で形成されてもよい（例えば、図１３Ａを参照）。

特定の態様において、ＦＴＥＰデバイスは、回路基板をベースとして使用して製造することができ、電極、フィルタおよび／または流路は、回路基板上に所望の構成で形成され、デバイスの残りのハウジングは、例えば、１つ以上の入口および出口チャネル、および／または回路基板上に封止される別個の層として形成されたフローチャネルを含む。回路基板上部のハウジングのシーリングは、本開示のＦＴＥＰ装置の異なる要素の望ましい構成を提供する。また、２つから多数のＦＴＥＰ装置（最大４８以上）を単一の基板上で並列に製造し、その後互いに分離するか、並列で使用することができる。特定の実施形態では、ＦＴＥＰ装置は再利用可能であり、いくつかの実施形態では、ＦＴＥＰ装置は使い捨てである。追加の実施形態では、ＦＴＥＰ装置はオートクレーブ可能であってもよい。

電極１０８は、銅、ステンレス鋼、チタン、アルミニウム、真鍮、銀、ロジウム、金または白金、またはグラファイトなどの任意の適切な金属から形成することができる。１つの好ましい電極材料は、合金３０３（ＵＮＳ３３０３００）オーステナイト系ステンレス鋼である。電界をかけると、アルミニウムなどの金属でできた電極が破壊される可能性がある。使い捨ての／一回使用のフロースルーＦＴＥＰ装置とは対照的に、複数回使用の（例えば、使い捨てではない）フロースルーＦＴＥＰ装置が必要な場合、電極プレートは電気化学腐食に強い金属でコーティングされることができる。電極板を保護するために、金などの貴金属のような導電性コーティングを使用してよい。

さらに、ＦＴＥＰ装置は、マルチパスエレクトロポレーション手順を可能にするプッシュプル空気圧手段を備えてもよい。すなわち、エレクトロポレーションされる細胞は、エレクトロポレーションの１回の通過のために入口から出口に向かって「引っ張られ」、別のエレクトロポレーションをパスするため、フロースルーＦＴＥＰ装置の出口端から入口端に向かって「押し出され」、電極間を再び通過する。このプロセスは１回から複数回繰り返される場合がある。

エレクトロポレーションされる細胞のタイプ（例えば、細菌、酵母、哺乳動物）および電極の構成に応じて、フローチャネル内の電極間の距離は大きく異なり得る。例えば、図１Ａ−１Ｃ、２Ａ−２Ｃ、３Ａ−３Ｃ、４Ａ−４Ｅ、５Ａ−５Ｃ、６、および７Ａ−７Ｅに示す実施形態では、電極は、フローチャネルの幅が減少するフローチャネルの壁の一部を形成し、フローチャネル内の電極は、１０μｍ〜５ｍｍ、または２５μｍ〜３ｍｍ、または５０μｍ〜２ｍｍ、または７５μｍ〜１ｍｍであり得る。図８Ａ−８Ｅ、９Ａ−９Ｃ、１０Ａ−１０Ｅ、１１Ａ−１１Ｅ、１２Ａ−１２Ｃ、１３Ａ−１３Ｂ、１４、および１６Ａ−１６Ｄに示すような他の実施形態では、電極はチャネルの狭窄部の両端に配置され、フローチャネル内の電極間の距離は、１ｍｍ〜１０ｍｍ、または２ｍｍ〜８ｍｍ、または３ｍｍ〜７ｍｍ、または４ｍｍ〜６ｍｍである場合がある。ＦＴＥＰ装置の全体サイズは、長さ３ｃｍから１５ｃｍ、長さ４ｃｍから１２ｃｍ、または長さ４．５ｃｍから１０ｃｍである。ＦＴＥＰ装置の全幅は、０．５ｃｍから５ｃｍ、または０．７５ｃｍから３ｃｍ、または１ｃｍから２．５ｃｍ、または１ｃｍから１．５ｃｍであってもよい。

狭窄フローチャネルの領域は、典型的には、少なくとも２つの細胞が狭窄部に並んで適合することができるように十分に広い。たとえば、典型的な細菌細胞は直径１μｍである。したがって、そのような細菌細胞を形質転換するために使用されるＦＴＥＰ装置のフローチャネルの狭窄部は、少なくとも２μｍの幅になる。別の例では、哺乳動物細胞の直径が約５０μｍの場合、そのような哺乳動物細胞を形質転換するために使用されるＦＴＥＰ装置のフローチャネルの狭窄部は少なくとも１００μｍの幅になるだろう。つまり、ＦＴＥＰ装置の狭窄部は、形質転換されている細胞を物理的にゆがめたり、「圧搾」したりしない。

リザーバを使用して細胞および外因性物質をＦＴＥＰ装置に導入するＦＴＥＰ装置の実施形態では、リザーバの体積は１００μＬ〜１０ｍｌ、または５００μＬ〜７５ｍｌ、または１ｍｌ〜５ｍｌの範囲である。ＦＴＥＰの流量は、毎分０．１ｍｌから５ｍｌ、または毎分０．５ｍｌから３ｍｌ、または毎分１．０ｍｌから２．５ｍｌの範囲である。ＦＴＥＰ装置の圧力の範囲は１〜３０ｐｓｉ（６９×１０^２〜２１×１０^４Ｐａ）、２〜１０ｐｓｉ（１４×１０^３〜６９×１０^３Ｐａ）、または３〜５ｐｓｉ（２１×１０^３〜３４×１０^３Ｐａ）である。

電極間の異なる電界強度を避けるために、電極は平行に配置する必要がある。さらに、電極の表面は、ピンホールやピークのない、できるだけ滑らかでなければならない。粗さＲｚが１〜１０μｍの電極が好ましい。本発明の別の実施形態では、フロースルーエレクトロポレーション装置は、ＦＴＥＰ装置に接地電位を印加する少なくとも１つの追加の電極を含む。

電極は、１〜２５Ｋｖ／ｃｍ、または５〜２０Ｋｖ／ｃｍ、または１０〜２０Ｋｖ／ｃｍを送達するように構成される。電極が離れているほど、より多くの電圧が供給される必要がある。さらに、供給される電圧はもちろん、穿孔される細胞の種類、細胞が懸濁されている培地、エレクトロポレーションチャネルのサイズ、電極の長さおよび直径に依存する。指数関数的減衰波、方形波または矩形波、任意の波形、または選択された波形の組み合わせなど、ＦＴＥＰ装置で使用できるさまざまなパルス形式がある。一般的なパルス形式の１つに、指数関数的減衰波がある。これは、通常、負荷のかかったコンデンサを細胞サンプルに放電することによって作成される。指数関数的減衰波は、初期ピーク電流を減衰できるように、インダクタを細胞サンプルにリンクすることにより、より緩やかなにすることができる。指定したシーケンスで複数の波形を使用する場合、同じ方向（直流）または異なる方向（交流）になる。交流を使用すると、１つだけではなく細胞の２つの局所表面を分子輸送に使用でき、交流が電気分解を防ぐことができるという点で有益である。パルス発生器は、デジタルまたはアナログパネルで制御できる。いくつかの実施形態では、方形波形状が好ましく、他の実施形態では、方形波の前の初期波スパイクが好ましい。

ＦＴＥＰ装置は、細胞サンプル量を１μｌから５ｍｌ、１０μｌから２ｍｌ、２５μｌから１ｍｌ、または５０μｌから７５０μｌの間でエレクトロポレーションするように構成することができる。エレクトロポレーションプロセスのために細胞および細胞にエレクトロポレーションされる材料（試薬）を懸濁するために使用される培地またはバッファーは、ＳＯＣ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ハンクス、ＰＢＳ、およびリンゲル液などの形質転換またはトランスフェクトされる細胞のタイプに適した培地またはバッファーであり得、キットの一部として試薬カートリッジに培地が提供される場合がある。さらに、形質転換またはトランスフェクションの前に細胞をエレクトロコンピテントにする必要があるため、バッファーはグリセロールまたはソルビトールを含んでもよく、界面活性剤を含んでもよい。ほとんどの真核細胞のエレクトロポレーションでは、通常、培地またはバッファーに適切な浸透圧を維持するための塩が含まれている。培地またはバッファー中の塩も培地を導電性にする。細菌などの非常に小さい原核細胞のエレクトロポレーションでは、非常に高い電界強度を可能にするために、水または１０％グリセロールを低コンダクタンス培地として使用する場合がある。その場合、送達される荷電分子は、脂質ベースの細胞膜よりも水ベースの媒体をより導電性にし、特に細胞膜と比較して、媒体は依然として導電性であるとおおまかに考えることができる。

細胞にエレクトロポレーションされる化合物は、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、およびホルモン、サイトカイン、ケモカイン、薬物、または薬物前駆体のような小分子など、エレクトロポレーションに有用であることが当技術分野で知られている任意の化合物であり得る。

本明細書に記載されたＦＴＥＰ装置の第２の態様は、図２Ａ−２Ｃに示されている。図２Ａは、細胞および外因性物質を含む流体をＦＴＥＰ装置２００に導入するための入口２０２と、エレクトロポレーション後に形質転換された細胞を取り出すための出口２０４とを有するＦＴＥＰ装置２００の上面図を示す。円筒電極２０８は、電極の湾曲の結果としてフローチャネルが狭くなるフローチャネル（図示せず）の中央部分を画定するように配置される。図２Ｂは、ＦＴＥＰ装置２００の上部からの断面図２１０を示し、入口２０２、出口２０４、および電極２０８は、フローチャネル２０６に対して配置されている。再び、電極２０８は、フローチャネル２０６の狭窄部または領域を画定することに留意されたい。図２Ｃは、入口２０２および入口チャネル２１２、および出口２０４および出口チャネル２１４を備えた装置２００の側面断面図２２０を示す。電極２０８は円筒形であり、フローチャネル２０６に配置されフローチャネル２０６の狭窄部を画定する。

本開示のＦＴＥＰ装置の第３の態様が、図３Ａ−３Ｃに示されている。図３Ａは、細胞および外因性物質を含む流体をＦＴＥＰ装置３００に導入するための入口３０２と、エレクトロポレーション後に形質転換された細胞を取り出すための出口３０４とを有するＦＴＥＰ装置３００の上面図を示す。半円筒形電極３０８は、電極の湾曲に基づいてチャネルが両端から狭くなるフローチャネル（図示せず）の狭窄部を画定するように配置される。図３Ｂは、装置３００の上部からの断面図３１０を示しており、入口３０２、出口３０４、および、フローチャネル３０６に対して配置されている電極３０８を示す。図３Ｃは、入口３０２および入口チャネル３１２、および出口３０４および出口チャネル３１４を備えた装置３００の側断面図３２０を示す。半円筒電極３０８は、フローチャネル３０６内に配置されて、それらの狭窄部を画定する。図１Ａ〜１Ｃ、２Ａ〜２Ｃ、および３Ａ〜３Ｃに示される装置は、フローチャネルに沿って実質的に中間に配置された電極を示すが、装置の他の態様では、電極は、装置の入口のより近位にある、または装置の出口のより近位にあるフローチャネルの狭窄領域に配置されてもよいことに留意されたい。

図４Ａ〜４Ｅは、細胞および外因性物質のための別個の入口を有する本開示のＦＴＥＰ装置の態様を示す。図４Ａは、細胞を含む流体をＦＴＥＰ装置４００に導入するための第１の入口４０２と、細胞にエレクトロポレーションされる外因性物質を含む流体をＦＴＥＰ装置４００に導入するための第２の入口４１８と、電極４０８と、エレクトロポレーション後に形質転換された細胞を取り出すための出口４０４とを含むＦＴＥＰ装置４００の上面図を示す。これらの態様は、図４Ａで示されるように、円筒形電極で示されているが、湾曲した縁部を有する他の形状の電極、例えば、図１Ａ〜１Ｃおよび３Ａ〜３Ｃに関連して示される長円、半円筒形なども本明細書でより詳細に説明されるフローチャネルを定義するために使用されてもよい。図４Ｂは、装置４００の上部からの断面図４１０を示しており、第１の入口４０２、第２の入口４１８、出口４０４、および電極４０８がフローチャネル４０６に対して配置されている。

図４Ｃは、図４Ａおよび４Ｂに示されるように配置された第１の入口４０２および第２の入口４１８を有するＦＴＥＰ装置４００の態様の第１の側断面図４２０を示す。図４Ｃでは、第１の入口チャネル４１２および第２の入口チャネル４２２は、独立してフローチャネル４０６に連結され、液体（細胞および細胞に穿孔または送達される材料）は、フローチャネル４０６を通って出口チャネル４１４および出口４０４に流れ、形質転換された細胞はＦＴＥＰ装置から取り出される。電極４０８は、フローチャネル４０６の狭窄部を画定するようにフローチャネル４０６に配置される。図４Ｄは、図４Ｃに示されたＦＴＥＰ装置４００の態様の変形の側面切断図４３０を示す。ここで、第１の入口チャネル４１２および第２の入口チャネル４２４は、三方接合部でフローチャネル４０６と交差し、液体（細胞および細胞に穿孔されるまたは送達される材料）は、フローチャネル４０６を通って出口チャネル４１４および出口４０４に流れ、形質転換された細胞がＦＴＥＰ装置から取り出される。電極４０８は、フローチャネル４０６内に配置され、フローチャネル４０６の狭窄部を画定する。図４Ｅは、図４Ａおよび４Ｂに示されるＦＴＥＰ装置４００のさらに別の変形例の第１の側断面図４４０を示す。ここで、第１の入口４０２および第２の入口４１８は、細胞および外因性物質を混合させるよう接合部４２６で交差し、混合流体をフローチャネル４０６に導入する。流体は、フローチャネル４０６を通って出口チャネル４１４および出口４０４に流れ、ＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞が取り出される。電極４０８は、フローチャネル４０６の狭窄部を画定するようにフローチャネル４０６に配置される。

図５Ａ〜５Ｃは、細胞および外因性物質のための別個の入口を備えた本開示のＦＴＥＰ装置の別の態様を示す。図５Ａは、細胞を含む流体を導入するための第一の入口５０２、細胞にエレクトロポレーションされる外因性物質を導入するための第二の出口５１８、およびエレクトロポレーション後に形質転換された細胞を取り出すための出口５０４を有するエレクトロポレーション装置５００の平面図を示す。電極５０８は、細胞がＦＴＥＰ装置に導入される第１の入口５０２と、外因性物質がＦＴＥＰ装置に導入される第２の入口５２８との間に配置される。図５Ｂは、第１の入口５０２、第２の入口５２８、出口５０４、および第１の入口チャネル５０２と第２の入口チャネル５２８の間に配置され、フローチャネル５０６の狭窄部を形成する電極５０８を含むＦＴＥＰ装置５００の上部からの断面図５１０を示す。図５Ｃは、細胞がＦＴＥＰ装置に導入される第１の入口５０２と、第１の入口チャネル５１２と、外因性物質がＦＴＥＰ装置に導入される第２の入口５２８と、第２の入口チャネル５３２と、ならびに形質転換された細胞が出口５０４および装置から取り出される出口チャネル５１４および出口５０４とを有するＦＴＥＰ装置５００の側面断面図５２０を示す。電極５０８は、フローチャネル５０６内に配置され、フローチャネル５０６の狭窄部を画定し、第１の入口チャネル５１２と第２の入口チャネル５３２との間に位置し、細胞がエレクトロポレーションされた後に、細胞に導入される材料が細胞を含む流体に加えられる。

図６は、入口チャネルからフローチャネルに導入された流体の流れが、例えば、オイルまたは空気の流れなどの不混和性流体を使用して、電極を通過する際の細胞と外因性物質流体を含む流体の流れを狭めるＦＴＥＰ装置を示す。図６は、第１の入口６０２、第２の入口６３０、出口６０４、および電極６０８が第１の入口チャネル６０２と出口６０４の間に配置されたＦＴＥＰ装置６００の上部からの断面図を示す。電極６０８がフローチャネル６０６の狭窄部を形成する場所で、不混和性流体を使用して、流れの集束が作成される（例えば、Ｋｕｍａｃｈｅｖａの米国公開第２０１０／０１８４９２８号を参照）。

例示的なＦＴＥＰ装置の多重化された態様が、図７Ａ−７Ｅに示されている。図７Ａは、本開示のＦＴＥＰ装置の第１の多重化された態様の断面の上面図を示す。図７ＡのＦＴＥＰ装置は、各ＦＴＥＰユニットの並列フローチャネル７０６が、装置（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）を形成する共有円筒電極７０８ａ〜７０８ｆによって部分的に規定される多重化ＦＴＥＰ装置７００である。各フローチャネル７０６は、細胞および／または外因性物質の異なるセットをＦＴＥＰユニットに導入するための入口７０２と、ＦＴＥＰユニットから形質転換された細胞を取り出すための出口７０４とを有する。隣接するユニットは電極を共有する。電極は交互に帯電する。たとえば、＋／−／＋／−／＋（つまり、電極７０８ａが＋、電極７０８ｂが−、電極７０８ｃが＋、電極７０８ｄが−など）。図７Ｂは、本開示のＦＴＥＰ装置７１０の第２の多重化された態様の断面の上面図である。これは、並列フローチャネル７０６が共有長円電極７０８ａ〜７０８ｆによって部分的に規定される多重化装置７１０である。各フローチャネル７０６は、異なるセットの細胞および／または外因性物質をフローチャネル７０６に導入するための入口７０２と、ＦＴＥＰユニット（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）から形質転換された細胞を取り出すための出口とを有する。繰り返すが、隣接する装置は電極を共有し、電極は、たとえば、＋／−／＋／−／＋のように電荷を交互に切り替える。

図７Ｃは、本開示のＦＴＥＰ装置の第３の多重化された態様の断面の上面図である。この例示的な多重化ＦＴＥＰ装置７２０では、個々のＦＴＥＰユニットは互い違いになっている。平行フローチャネル７０６は、図７Ａおよび７Ｂに示されるように共有されない個々の円筒状電極７１４ａ〜７１４ｊによって部分的に規定される。各フローチャネル７０６は、フローチャネル自身の電極対７０８と、異なるセットの細胞および／または外因性物質をＦＴＥＰ装置に導入するための入口７０２と、およびＦＴＥＰユニット（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）から形質転換された細胞を取り出すための出口とを含む。図７Ｄは、別の例示的な多重化ＦＴＥＰ装置の断面の上面図である。この多重化されたＦＴＥＰ装置７３０では、互い違いの平行なフローチャネル７０６は、個々の長円電極７１６ａ〜７１６ｊによって部分的に規定される。各フローチャネル７０６は、電極７１６の独自の非共有ペア（例えば、７１６ａ／７１６ｂ、７１６ｃ／７１６ｄ、７１６ｅ／７１６ｆ、７１６ｇ／７１６ｈ、および７１６ｉ／７１６ｊ）を有し、ＦＴＥＰユニットへ異なる細胞または外因性物質のセットを導入するための入口７０２およびＦＴＥＰユニットから形質転換された細胞を取り出すための出口７０４を有する。図７Ｅは、別の例示的な多重化ＦＴＥＰ装置の断面の上面図である。この例示的な多重化装置７４０では、互い違いの平行フローチャネル７０６は、個々の半円筒電極７１６ａ〜７１６ｊによって部分的に画定される。各フローチャネル７０６は、それ自体の電極対７１６、異なるセットの細胞および／または外因性物質をＦＴＥＰユニットに導入するための別個の入口７０２、およびＦＴＥＰユニットから形質転換された細胞を取り出すための出口７０４を有する。

本開示のＦＴＥＰ装置の追加の態様を図８Ａ−８Ｅに示す。図のＦＴＥＰ装置では、図８Ａ〜８Ｅ（および図９〜１４）では、電極は、フローチャネルを狭くするためにフローチャネルの両側に配置されていない。代わりに、電極は、第１の電極が入口とフローチャネルの狭窄領域の間に配置され、第２の電極がフローチャネルの狭窄領域と出口の間に配置される。図８Ａは、細胞および外因性物質を含む流体をＦＴＥＰ装置８００に導入するための入口８０２と、エレクトロポレーション後にＦＴＥＰから形質転換された細胞を取り出すための出口８０４とを有するＦＴＥＰ装置８００の上面図を示す。電極８０８は、装置のチャネル（図示せず）を通して導入される。図８Ｂは、装置８００の上部からの断面図８１０、入口８０２、出口８０４、および、フローチャネル８０６に対して配置されている電極８０８を示しており、図８Ｃは、入口８０２および入口チャネル８１２、および出口８０４および出口チャネル８１４を備えた装置８００の側面断面図８２０を示す。電極８０８は、フローチャネル８０６と流体連通するように電極チャネル８１６に配置されるが、フローチャネル８０６を移動する細胞の経路には直接配置されない。再び、第１電極がフローチャネルの入口と狭窄領域の間に配置され、第２電極がフローチャネルの狭窄領域と出口の間に配置されることに留意したい。

図８Ｄの装置８００の底部の拡大側面断面図は装置８３０のこの第１の態様における電極８０８が、細胞および外因性物質を含む流体が入口チャネル８１２からフローチャネル８０６を出口チャネル８１４に送りを通って流れるように、フローチャネル８０６にほぼ垂直な電極チャネル８１６に配置されることを示し、そのプロセスで電極チャネル８１６に流れ込む流体は、電極８０８と接触する。この態様では、図８Ｃおよび８Ｄに示すように入口チャネル、出口チャネル、および電極チャネルはすべて、装置の同じ平面側から生じる。しかしながら、図８Ｅに示されるような特定の態様では、電極は、入口チャネルおよび出口チャネルとは異なるＦＴＥＰ装置の平面側から導入される。ここで、装置８００のこの代替の態様８４０の電極８０８は、細胞および外因性物質を含む流体が入口チャネル８１２からフローチャネル８０６を通って出口８１４に流れるように、フローチャネル８０６に垂直な電極チャネル８１６に配置される。バッファー中の細胞および外因性物質は、両方の電極８０８と接触するように電極チャネル８１６に流入する。この態様では、入口チャネルおよび出口チャネルは、電極および電極チャネルよりも装置の異なる平面側から生じる。

図９Ａ〜９Ｃは、本開示のＦＴＥＰ装置のさらに別の態様を示している。図９Ａは、細胞を含む流体をＦＴＥＰ装置９００に導入するための第１の入口９０２と、エレクトロポレーション後にＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞を取り出すための出口９０４とを有するＦＴＥＰ装置９００の平面図を示す。しかしながら、このＦＴＥＰ装置には、細胞にエレクトロポレーションされる外因性物質を導入するための第２の入口９２２がある。電極９０８は、装置に機械加工されたチャネル（図示せず）を通して導入される。図９Ｂは、ＦＴＥＰ装置９００の上部からの断面図９１０を示し、第１の入口９０２、第２の入口９２２、出口９０４、および電極９０８がフローチャネル９０６に対して配置されている。図９Ｃは、入口９０２および入口チャネル９１２、ならびに出口９０４および出口チャネル９１４を備えた装置９００の側面断面図９２０を示す。電極９０８は、フローチャネル９０６と流体連通するように電極チャネル９１６に配置されるが、フローチャネル９０６を通って移動する細胞の経路には実質的にはない。ＦＴＥＰ装置９２０のこの態様における電極９０８は、電極チャネル９１６は、細胞を含む流体および外因性物質を含む流体が入口９０２、９２２から入口チャネル９１２、９２４を介してフローチャネル９０６および出口チャネル９１４に流れるように、電極チャネル９１６がフローチャネル９０６に対してほぼ垂直である電極チャネル９１６に配置される。その過程で、培地中の細胞および外因性物質は電極チャネル９１６に流れ込み、電極９０８と接触する。電極９０８および電極チャネル９１６の２つのうち一方は入口９０２、９２２および入口チャネル９１２、９２４、フローチャネル９０６の狭窄領域（図示せず）の間に配置される。他の電極９０８および電極チャネル９１６は、フローチャネル９０６の狭窄領域（図示せず）と出口チャネル９１４および出口９０４との間に配置される。図９Ｃでは、入口チャネル、出口チャネル、および電極チャネルはすべて、装置の同じ平面側から生じるが、電極（および入口および出口）は、図８Ｅに示すようにＦＴＥＰ装置の異なる平面側から生じるように構成されてよい。

図１０Ａ〜１０Ｅは、本開示の装置のさらに別の態様を示す。図１０Ａは、細胞および外因性物質を含む流体をＦＴＥＰ装置１０００に導入するための入口１００２と、エレクトロポレーション後にＦＴＥＰ装置１０００から形質転換された細胞を取り出すための出口１００４とを有するエレクトロポレーション装置１０００の平面図を示す。電極１００８は、装置に機械加工されたチャネル（図示せず）を通して導入される。図１０Ｂは、装置１０００の上部からの断面図１０１０を示し、入口１００２、出口１００４、実質的に均一な密度のフィルタ１０５０、およびフローチャネル１００６に対して配置された電極１００８を示す。図１０Ｃは、入口１００２、出口１００４、勾配密度が実質的に増加するフィルタ１０５０、およびフローチャネル１００６に対して配置された電極１００８を備えた、装置１０００の代替構成の上部からの断面図１０２０を示す。図１０Ａ〜１０Ｅにおいては、図９Ａ〜９Ｃのように、第１の電極は、フローチャネルとフローチャネルの狭窄領域との間に配置され、第２の電極は、フローチャネルとフローチャネルの狭窄領域との間に配置される。図１０Ａ〜１０Ｅに示されるようないくつかの実施形態では、ＦＴＥＰ装置は、入口チャネルの後であって第１の電極チャネルの前に、フローチャネル内に配置されたフィルタを含む。フィルタは、多孔率が実質的に均一であってもよい（例えば、図１０Ｂのように均一な密度を有する）。あるいは、フィルタは、入口の近位にあるフィルタの端部の密度が低く、フローチャネルの狭窄部の近位にあるフィルタの端部の勾配密度が大きくなるよう勾配密度が増加してもよい（図１０Ｃに示す）。フィルタは、多孔性プラスチック、疎水性ポリエチレン、綿、ガラス繊維を含む任意の適切かつ好ましくは安価な材料から作られてもよく、またはＦＴＥＰ装置本体の一部として一体化され、製造されてもよい（例えば、図１５Ｅを参照）。

図１０Ｄは、入口１００２および入口チャネル１０１２、ならびに出口１００４および出口チャネル１０１４を備えた装置１０００の側断面図１０３０を示す。電極１００８は、電極チャネル１０１６内に配置されて、フローチャネル１００６と流体連通するが直接的にではない。フィルタ１０５０は、入口１００２と入口チャネル１０１２と電極１００８と電極チャネル１０１６との間に配置されることに留意されたい。図１０Ｅは、ＦＴＥＰ装置１０００の本態様の電極１００８が電極チャネル１０１６に配置され、フローチャネル１００６に垂直であり、細胞および外因性物質を含む流体が入口チャネル１０１２からフローチャネル１００６を通って出口チャネル１０１４流れるように示すＦＴＥＰ装置１０００の底部の拡大側面断面図１０４０であり、プロセス中、流体は電極チャネル１０１６に流れ込み、両方の電極１００８と接触する。図１０Ｄおよび図１０Ｅでは、入口チャネル、出口チャネル、および電極チャネルはすべて、装置の同じ平面側から生じるが、電極（および入口および出口）は、図８Ｅに示すように異なる平面側から生じるように構成することもできる。

図１１Ａ〜図１１Ｅは、本開示のＦＴＥＰ装置の他の態様を示している。図１１Ａは、細胞を含む流体をＦＴＥＰ装置に導入するための第１の入口１１０２と、細胞に導入される外因性物質を含む流体をＦＴＥＰ装置に導入するための第２の入口１１２２と、電極チャネル（図示せず）に配置された電極１１０８と、エレクトロポレーション後に形質転換された細胞を取り出すための出口１１０４とを有するＦＴＥＰ装置１１００の上面図を示す。図１１Ｂは、装置１１００の上部からの断面図１１１０を示し、第１の入口１１０２と、第２の入口１１２２と、出口１１０４と、フィルタ１１５０と、およびフローチャネル１１０６に対して配置された電極１１０８とを含む。再び、電極１１０８は、第１の電極がフローチャネル１１０６の狭窄領域の「入口端」にあり、第２の電極がフローチャネル１１０６の狭窄領域の「出口端」にあるように配置されることに留意されたい。図１１Ｃは、図１１Ａに示すように配置された第１の入口１１０２および第２の入口１１２２を備えた装置１１００の第５の態様の第１の側断面図１１２０を示す。第１の入口チャネル１１１２および第２の入口チャネル１１２４は、フィルタ１１５０に遭遇する前にフローチャネル１１０６と別々に連結し、そして、液体は、入口チャネル１１１２および１１２４から、フローチャネル１１０６（およびフィルタ１１５０）を通って出口チャネル１１１４および出口１１０４に流れる。電極１１０８は、フローチャネル１１０６と流体連通するが、フローチャネル１１０６内に直接ではないように電極チャネル１１１６内に配置される。いくつかの実施形態では、電極１１０８は電極チャネル１１１６内に配置される。電極１１０８は、フローチャネル１１０６の壁と同一平面にある（例えば、図１５Ｆ（ｉｉｉ）を参照）。あるいは、電極１１０８は、フローチャネル１１０６内に最小距離だけ延びていてもよい。しかし、電極１１０８は、電極がフローチャネルを通る細胞の流れを妨げる程度までフローチャネル１１０６内に延びない。

図１１Ｄは、第１の入口１１０２および第２の入口１１２２が図１１Ａに示すように配置された図１１Ａ〜図１１Ｃに示されるＦＴＥＰ装置１１００の態様の変形例の側面切断図１１３０を示す。第１の入口チャネル１１１２および第２の入口チャネル１１２４は、フィルタ１１５０に出会う前に、フローチャネル１１０６との三方接合部でフローチャネル１１０６と交差する。液体は、フローチャネル１１０６を通って出口チャネル１１１４および出口１１０４に流れる。電極１１０８は、フローチャネル１１０６と流体連通するように電極チャネル１１１６に配置されるが、フローチャネル１１０６に直接ではない。再び、電極１１０８は、第１の電極がフローチャネル１１０６の狭窄領域の「入口端」にあり、第２の電極がフローチャネル１１０６の狭窄領域の「出口端」にあるように配置されることに留意されたい。図１１Ｅは、図１１Ａ−１１Ｃに示されるＦＴＥＰ装置１１００の態様のさらに別の変形例の側面切断図１１４０を示す。第１の入口チャネル１１１２および第２の入口チャネル１１２６は、フローチャネル１１０６と交差する前に、接合部で交差して単一のチャネルとなる。流体は、入口１１０２および１１２２から、入口チャネル１１１２および１１２６を通って、フローチャネル１１０６およびフィルタ１１５０に流入し、電極チャネル１１１６に流れ込み（電極１１０８がフローチャネル１１０６と流体連通するように）、続いてフローチャネル１１０６から出口チャネル１１１４へ、最後に出口１１０４へ流れ、そこで形質転換された細胞がＦＴＥＰ装置１１００から取り出される。電極１１０８は、電極がフローチャネル１１０６と流体連通するように電極チャネル１１１６に配置されるが、フローチャネル１１０６を移動する細胞のフローチャネルには直接配置されない。図１１Ｃ−１１Ｅは、装置の同じ平面側から生じる入口チャネル、出口チャネル、および電極チャネルを示す。これらの各側面のすべての入口、出口、および電極は、ＦＴＥＰ装置の異なる平面側から生じるように構成されてよい。

図１２Ａ〜１２Ｃは、本開示のＦＴＥＰ装置の別の態様を示している。図１２Ａは、細胞を含む流体をＦＴＥＰ装置１２００に導入するための第１の入口１２０２、細胞に穿孔される外因性物質をＦＴＥＰ装置１２００に導入するための第２の入口１２２８、およびエレクトロポレーション後、ＦＴＥＰ装置１２００から形質転換された細胞を取り出すための出口１２０４を有するエレクトロポレーション装置１２００の上面図を示す。電極１２０８は、装置に機械加工されたチャネル（図示せず）を通して導入され、第１の入口１２０２と第２の入口１２２８との間に配置される。図１２Ｂは、装置１２００の上部からの断面図１２１０を示し、第１の入口１２０２、第２の入口１２２８、出口１２０４、および電極１２０８がフローチャネル１２０６に対して配置されている。図１２Ｂは、第１の入口１２０２と第１の電極１２０８との間に、フローチャネル１２０６の狭窄領域の前に配置されたフィルタを含む。この実施形態のフィルタ１２５０は、大きいサイズから小さいサイズの細孔サイズの勾配を有する。図１２Ｃは、第１の入口１２０２および第１の入口チャネル１２１２、フィルタ１２５０、第２の入口１２２８および第２の入口チャネル１２３２、出口１２０４および出口チャネル１２１４を含むＦＴＥＰ装置１２００の側面断面図１２２０を示す。電極１２０８は、フローチャネル１２０６に垂直で、第１および第２の入口の間にある電極チャネル１２１６に配置される。電極１２０８は、フローチャネル１２０６と流体連通しているが、フローチャネル１２０６を通って移動する細胞のフローチャネルには実質的にない。外因性物質は、第２の入口１２２８および第２の入口チャネル１２３２を介してＦＴＥＰ装置１２００に加えられ、細胞がエレクトロポレーションされた後の細胞に遭遇する。図１２Ｃでは、入口チャネル、出口チャネル、および電極チャネルはすべて、装置の同じ平面側から生じるが、これらの特徴は、ＦＴＥＰ装置１２００の異なる平面側から生じるように構成することもできる。

図１３Ａおよび１３Ｂは、それぞれ、本発明のさらに別の態様の側面および上面断面図を示す。図１３Ａは、入口１３０２および入口チャネル１３１２、フローチャネル１３０６、出口１３０４および出口チャネル１３１４を有する最上層１３５２を備えた多層装置１３００を示す。電極１３０８は、例えばストリップとして固体基板に上に提供される底層１３５６上にある。中間層１３５４は、内部に電極チャネル１３１６が設けられた固体基板であり、この態様の電極チャネル１３１６は、下部層１３５６の電極１３０８と上部層１３５２のフローチャネル１３０６との間の流体連通を提供する。流体中の細胞および外因性物質は、入口１３０２を介してＦＴＥＰ装置１３００に導入され、入口チャネル１３１２を通ってフローチャネル１３０６に流れ、次に出口チャネル１３１４に流れ込む。本プロセスにおいて、電極１３０８は、フローチャネル１３０６と流体接触するように流体は電極チャネル１３１６に流れ込む。細胞は、２つの電極１３０８の間のフローチャネル１３０６を通過するときに穿孔される。図１３Ｂは、フローチャネル１３０６に対する入口１３０２、出口１３０４、電極１３０８および電極チャネル１３１６の位置を示すＦＴＥＰ装置１３００のこの態様の断面図１３１０の上面図を示す。ここでは、電極はストリップとして示されているが、それらは、他の形状、例えば、円形、円筒形、非対称、長方形、または正方形になるように構成することもできる。

図１４は、例えば、油などの不混和性流体を使用するか、または空気を使用して流れを集束（狭窄化）することにより、入口チャネルからフローチャネルに導入される細胞と外因性物質を含む流体が電極チャネルと電極に出会うときに、流体に対し流れ集束１４３０が行われるＦＴＥＰ装置を示す。図１４は、第１の入口１４０２、入口チャネルを出てフローチャネル１４０６に入った後の流体の流れの集束、および入口１４０２と出口１４０４との間に配置された電極１４０８とともに、装置１４００の上部からの断面図を示す。ここで、電極１４０８は、フローチャネル１４０６の狭窄部のいずれかの端に配置されている。

図１５Ａから図１５Ｃは、例えば、図１６Ａおよび図１６Ｂ（すなわち、試薬カートリッジ１６００でＦＴＥＰ１６０６として機能する）の試薬カートリッジ１６００の一部であり得る６つの共接合ＦＴＥＰ装置１５５０の上面斜視図、底面斜視図、および底面図である。図１５Ａは、単一の一体成形された射出成形シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）基板１５５６上に配置された６つのＦＴＥＰユニット１５５０を示している。図１５に示すチャネル１５０６は、５０ミクロンから１ｍｍの厚さを有するＣＯＣフィルムでシールされている（図示せず）。ＣＯＣフィルムは、アセンブリ１５００の基部（図１５Ｂで最も顕著に示される表面）に熱的に結合されてもよい。図１５Ｂおよび１５Ｃに示されるように、同時結合されたＦＴＥＰ装置は、様々な用途において有利であり得る異なるチャネルアーキテクチャおよび電極配置を有する。たとえば、装置（ｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）の湾曲したチャネルは慣性を利用して、流体内の細胞を電極から遠ざける。電極は、細胞の流れをさらに強化し、細胞への損傷の可能性を減らすために、チャネル内で中心から外れて（off center）配置することができる。これは、電解効果または電極付近のｐＨの局所変化に特に敏感な細胞または材料にとって特に重要である。これらの効果をさらに低減するために、実施形態（ｉｉｉ）および（ｉｖ）に示されるように、電極は少なくとも部分的にチャネル壁に埋め込まれてもよい。

６つのＦＴＥＰユニット１５５０のそれぞれは、細胞サンプル入口を規定するウェル１５５２と、細胞サンプル出口を規定するウェル１５５４とを有する。図１５Ｂは、単一の基板１５５６上に配置された６つのＦＴＥＰユニット１５５０も示している、図１５Ａの６つの共接合ＦＴＥＰ装置１５５０の底面斜視図である。各フロースルーエレクトロポレーションユニット１５５０に１つずつ、６つの入口ウェル１５５２を見ることができ、１つの出口ウェル１５５４を見ることができる。図１５Ｂに示す各ＦＴＥＰユニット１５５０では、入口１５０２、出口１５０４、フローチャネル１５０６、およびフローチャネル１５０６の狭窄領域の両端の２つの電極１５０８をさらに見ることができる。フィルタ１５７０および１５７２は、チャネルの詰まりを防止するために、特にフローチャネルの狭窄領域でのチャネルに含まれる。図１５Ｃは、図１５Ａおよび図１５Ｂの６つの共接合ＦＴＥＰ装置１５５０の底面図である。図１５Ｃは、単一の基板１５５６上に配置された６つのＦＴＥＰユニット１５５０であり、各ＦＴＥＰユニット１５５０は、入口１５０２、出口１５０４、フローチャネル１５０６、および各ＦＴＥＰユニット１５５０のフローチャネル１５０６の狭窄領域の両端にある２つの電極１５０８を含む。一旦６つのＦＴＥＰユニット１５５０が製造されると、それらは、図示されたスコアライン上で互いに分離され（例えば、「スナップ」される）、図１６Ａまたは図１６Ｂに示されるカートリッジに見られるように一度に１つ使用され得る。あるいは、ＦＴＥＰユニットは、２つ以上のＦＴＥＰユニット１５５０が並行して使用される実施形態で使用されてもよい。

図１５Ｄは、図１５Ｃのユニット（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、および（ｖｉ）に対応するＦＴＥＰユニットの図１５Ｄのユニット（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、および（ｖｉ）を有する図１５Ｃ走査型電子顕微鏡写真を示す。図１５Ｄでは、各ユニットについて、電極チャネル１５１６とフローチャネル１５０６の両方を見ることができる。スケールは、各顕微鏡写真の右下隅に示されているように、ハッシュマークごとに１ｍｍである。この実施形態では、入口開口は丸い縁を有し、その利点には、空気トラッピングへの抵抗、層流の促進、および細胞損傷のリスクの低減が含まれる。丸みを帯びた縁は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００または２５０ミクロンの曲率半径を有してもよい。

図１５Ｅは、１５Ｂおよび１５Ｃにおいて黒いバーとして描かれたフィルタ１５７０および１５７２の走査電子顕微鏡写真を示す。この実施形態では、フィルタ１５７２の多孔率は、大孔（入口１５０２の近く）からフローチャネル（図示せず）に向かう細孔まで変化することに留意されたい。この実施形態では、チャネルは、必ずしもではないが、必要に応じて狭くなる。第２のフィルタが存在する場合、第２のフィルタの多孔率も異なる場合がある。第２の電極と出口チャネルとの間の第２のフィルタの場合、フィルタは、出口チャネルに向かって大孔（第２の電極の近く）から細孔まで変化し得る。スケール情報は各顕微鏡写真に示されている。

特定の実施形態では、フィルタは、流体がフローチャネルの狭窄部に遭遇する前に、細胞およびＤＮＡを含む流体を濾過する目的を有する。したがって、フィルタは、細胞または他の物質がフローチャネルの狭窄部を詰まらせる可能性を減らす。代わりに、フローチャネルの狭窄部を詰まらせる恐れのある粒子状物質がある場合、フィルタは粒子状物質を捕捉し、他の細孔が細胞／ＤＮＡ／流体の残りを移動できるようにする。描かれた構造（チャネル壁との一体成形）は、装置のコストと複雑さを軽減すると同時に、フィルタの破片がチャネルを取り除いたり詰まらせたり、装置の動作を妨げたりするリスクを減らすため、特に有利である。この実施形態では、フィルタはサイズ勾配細孔を有することに留意されたい（流入口の近位にある大きな細孔から、フローチャネルの狭窄部の近位にあるより小さい細孔まで）。しかし、代替の実施形態では、細孔は同じサイズであっても、サイズの勾配がなくてもよい。

さらに他の実施形態では、フローチャネルは狭くならない場合がある。これらの特定の実施形態では、細孔自体がエレクトロポレーションを強化するためのそのような狭窄化機能を提供するのに役立ち、流体がチャネルを流れる際にフローチャネル壁は収縮または最小になるまで収縮しない。これらの実施形態は、装置を通る細胞の流量の制御を可能にして、外因性物質の様々な細胞タイプへの導入を最適化することができる。

さらに、図１５Ｅの走査電子顕微鏡写真は、フィルタ要素を丸い「ペグ」として示したが、フィルタ要素は、三角形、正方形、長方形、五角形、六角形、長円形、楕円形、または他のファセット形状のペグであってもよいことを理解されたい。

図１５Ｆは、（ｉ）入口リザーバ１５５２および出口リザーバ１５５４を有するＦＴＥＰ装置１５００（ここでは、６ユニットＦＴＥＰ装置）に挿入する前の電極１５０８を示す。好ましい実施形態では、装置１５００は、図１５Ｆ（ｉ）、図１５Ｆ（ｉｉ）に示すように、シース内に含まれ、シースから突出する電極１５０８と逆向きで使用される。図１５Ｆ（ｉｉｉ）は、電極チャネル１５１６（およびフローチャネル１５０６に隣接する電極１５０８）を示すとともに、電極チャネル１５１６に挿入された電極１５０８を示す。図１５Ｆ（ｉｉｉ）に示される実施形態では、電極はフローチャネルの壁を含む。すなわち、電極は、フローチャネル１５０６を通って流れる細胞／ＤＮＡ／流体の経路にはないが、電極チャネル１５１６内に埋め込まれた電極でもない。実際、電極１５０８は、電極チャネル１５１６内に埋め込まれてよく、電極チャネル１５１６の端まで延びて、したがってフローチャネル１５０６の壁と均一であってもよく、または電極１５０８はフローチャネルを通る細胞の動きを妨げないためフローチャネル１５０６内に最短距離だけ延びていてもよい。フローチャネル１５０６の開口部の丸みを帯びたまたは斜めの縁は、空気の閉じ込めを防ぎ、電界の不連続性を減らすのに役立つ。

図１５Ｇは、電極チャネル１５１６がフローチャネル１５０６と出会う開口の２つの異なる構成の２つの走査電子顕微鏡写真を提示する。図１５Ｇ（ｉ）（上）では、電極チャネル１５１６とフローチャネル１５０６との接合部のエッジは鋭いエッジを含む。対照的に、図１５Ｇ（ｉｉ）（下）では、電極チャネル１５１６とフローチャネル１５０６との接合部のエッジは、丸いエッジを含む。両方の構成をテストし（データは示さず）、丸みを帯びた構成により、空気がフローチャネル１５０６と電極チャネル１５１６の電極（図示せず）の間に閉じ込められる可能性が低くなることがわかった。この時、ＦＴＥＰ装置の電極は「濡れている」つまり、体液／細胞／ＤＮＡに浸されている必要がある。

ＦＴＥＰを含む自動化されたマルチモジュール細胞処理システム
図１６Ａは、自動化されたマルチモジュール細胞処理システムで使用され得る例示的な試薬カートリッジとＦＴＥＰ装置１６００（「カートリッジ」）との組み合わせを示す。カートリッジ１６００は、本体１６０２、および試薬容器またはリザーバ１６０４を含む。さらに、カートリッジ１６００は、ＦＴＥＰ装置１６０６を含み、その態様は、図１〜６および図８〜１５（例えば、カートリッジのこの実施形態では、単一のＦＴＥＰ装置である）に関して説明される。カートリッジ１６００は使い捨てであってもよく、カートリッジ１６００は再利用されるように構成されてもよい。好ましくは、カートリッジ１６００は使い捨てである。カートリッジ１６００は、ステンレス鋼、アルミニウム、またはポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルブタジエン、ポリカーボネート、ポリエーテルエテケトン（ＰＥＥＫ）、ポリ（メチルメチルアクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスルホン、ポリウレタン、およびこれらと他のポリマーのコポリマーを含むプラスチックなど、さまざまな適切な材料で作成できる。カートリッジが使い捨ての場合、プラスチック製であることが好ましい。特定の実施形態では、カートリッジ１６００は、試薬容器またはリザーバ１６０４内の試薬を加熱または冷却する熱装置（図示せず）と接触するため、カートリッジの製造に使用される材料は熱伝導性であることが好ましい。いくつかの実施形態では、熱装置はペルチェ素子または熱電冷却器である。試薬容器またはリザーバ１６０４は、図１６Ａに示すように、試薬の個々のチューブが挿入される容器であってもよく、１つ以上の複数の共同結合チューブが挿入されるレセプタクル（たとえば、図１６Ｂ（ｉｖ）に示すように、共同結合される５つのチューブの列が試薬レセプタクルに挿入される）、または挿入チューブなしで試薬を保持する試薬レセプタクルであってよい。さらに、試薬カートリッジのレセプタクルは、チューブ、共同結合チューブ、および試薬の直接充填の任意の組み合わせ用に構成できる。

一実施形態では、試薬カートリッジ１６００の試薬レセプタクルまたはリザーバ１６０４は、例えば２５０ｍｌチューブ、２５ｍｌチューブ、１０ｍｌチューブ、５ｍｌチューブ、およびエッペンドルフまたは微量遠心管を含む様々なサイズのチューブを保持するように構成される。さらに別の実施形態では、すべてのレセプタクルは同じサイズのチューブ、例えば５ｍｌチューブを保持するように構成され、リザーバインサートは試薬リザーバ内の小さなチューブを収容するために使用される。さらに別の実施形態では（特に試薬カートリッジが使い捨てである実施形態では）、試薬リザーバはチューブを挿入せずに試薬を保持する。この使い捨ての実施形態では、試薬カートリッジはキットの一部であってもよく、試薬カートリッジは試薬で予め満たされ、レセプタクルまたはリザーバは、例えば、ホイル、ヒートシールアクリルなどで密封され、消費者に提示され、試薬カートリッジは、自動化されたマルチモジュール細胞処理システムで使用できる。試薬カートリッジに含まれる試薬は、ワークフローによって異なる。つまり、試薬は、自動化されたマルチモジュール細胞処理システムで細胞が受けるプロセスによって異なる。

さらに、図１６Ａは、試薬容器またはリザーバ１６０４がチューブ１６６０または熱スペーサ１６６２を受け入れるように構成されている試薬カートリッジおよびＦＴＥＰ装置の実施形態の追加の詳細を示す。加えて、熱スペーサ１６６２内には、エッペンドルフまたは微量遠心管などの小さなチューブ１６５４があり、これは少量の試薬量のみが必要な場合に有用である。熱スペーサ１６６２は熱伝導性であり、熱または冷却がエッペンドルフチューブ１６５４などの小さなチューブに含まれる試薬に伝達されることを保証する。上述のように、いくつかの実施形態では、試薬カートリッジの本体自体が熱伝導性であり、ユーザーが望むようにそこに含まれる試薬を加温または冷却するために熱装置と接触している。図１６Ａは、チューブ１６６０および１６５４をシールするために使用されるフォイルシール１６５８である。あるいは、試薬カートリッジが再利用可能である場合、試薬カートリッジは、熱装置に接触するのではなく、内部に含まれる試薬を加熱および冷却する熱装置を備えてもよい。

図１６Ａに示す試薬カートリッジ１６００の特定の実施形態では、試薬カートリッジは、自動化されたシステム（参照により組み込まれた出願を参照）の補完センサーによって読み取り可能なオンボードメモリ要素（図示せず）に格納され、自動化されたシステムのプロセッサに送信される光学的に読み取り可能なコード（バーコードまたはアズテックコードなど）または命令／データを含む。コード、データ、指示、またはスクリプトは、自動化されたシステムによる試薬の分配および試薬カートリッジ１６００に含まれるエレクトロポレーション装置の制御に関する指示を提供（または回収可能に）する。また、自動化されたマルチモジュール細胞処理システムの１つのコンポーネントとしての試薬カートリッジ１６００には、自動化されたマルチモジュール細胞処理システムによって実行される２、３、４、５、１０以上のプロセスを指定するコード、命令、またはスクリプトが含まれるか、自動化されたマルチモジュール細胞処理システムによって実行されるすべてのプロセスを指定することができる。特定の実施形態では、試薬カートリッジは使い捨てであり、特定の細胞処理プロトコル、例えば、ゲノム編集またはタンパク質生産の実施に合わせて調整された試薬で事前にパッケージ化されている。試薬カートリッジの内容はさまざまであるが、自動化されたマルチモジュール細胞処理システムのコンポーネントはそうではないため、特定の試薬カートリッジに関連付けられたスクリプトは、使用される試薬と実行される細胞処理に一致する。したがって、例えば、試薬カートリッジは、ゲノム編集用の試薬と、自動化されたマルチモジュール細胞処理システムでゲノム編集を実行するためのプロセスステップを指定するスクリプトを事前にパッケージ化することができる。

図１６Ｂは、試薬カートリッジとエレクトロポレーション装置の組み合わせの代替実施形態を示す。図１６Ｂ（ｉ）には、試薬カートリッジの本体１６０２が示されており、試薬容器またはリザーバ１６０４は、例えば２５０ｍｌチューブ、２５ｍｌチューブ、１０ｍｌチューブ、５ｍｌチューブ、およびエッペンドルフまたは微量遠心チューブなどのさまざまなサイズのチューブを保持するように構成できる。さらに、ＦＴＥＰ装置（図示せず）を配置できる凹部１６１０がある。図１６Ｂ（ｉｉ）は、試薬カートリッジの本体１６０２用のカバー１６５２を示している。図１６Ｂ（ｉｉｉ）は、アセンブリされたＦＴＥＰ装置の本体１６０２およびカバー１６５２を示し、アセンブリされたＦＴＥＰ装置１６６０が凹部１６１０（（ｉ）に見られる）内に配置される。図１６Ｂ（ｉｖ）は、試薬レセプタクルまたはリザーバ１６０４内に配置され得る共接合チューブを示す。図１６Ｂ（ｖ）は、ＦＴＥＰカートリッジ１６０６、入口および出口リザーバと嵌合するシールまたはガスケット（図示せず）を備えたカバー１６０８、およびＦＴＥＰ装置の底部を密封するために使用されるフィルム１６１０の分解図である。カバーとシールは、前述の方法でＦＴＥＰ装置内の流体を駆動するのに十分な空気圧の印加を可能にする気密シールを形成する。この要素１６１０は、図１５に関連して上述したＣＯＣフィルムに対応し、カートリッジ１６０６の下側のチャネルを密封し、ＦＴＥＰ装置１６００のベースまたは底部として機能する。

図１７は、例えば、以下で説明する例示的なワークフローの１つ、および追加の例示的なワークフローを実行する試薬カートリッジ１７１０の一部として例示的なＦＴＥＰ装置１７３０を備える例示的な自動化されたマルチモジュール細胞処理機器１７００を示す。例示されているガントリ１７０２は、例えば空気置換ピペット１７３２を含む自動化されたマルチモジュール細胞処理機器１７００のモジュールにＸＹＺ軸運動制御を供給する自動化された機械的運動システム（アクチュエータ）（図示せず）を提供する。一部の自動化されたマルチモジュール細胞処理機器では、空気置換ピペッタがガントリによって移動され、さまざまなモジュールと試薬カートリッジが固定されたままになる。しかしながら、他の実施形態では、様々なモジュールが動かされている間、ピペットシステムは静止したままであり得る。また、自動化されたマルチモジュール細胞処理機器１７００には、リザーバ１７０６を含む洗浄または試薬カートリッジ１７０４が含まれる。洗浄または試薬カートリッジ１７０４は、例えば、洗浄溶液、または反復プロセス全体で頻繁に使用される溶液などに関連した大きなチューブを収容するように構成されてもよい。一例では、洗浄または試薬カートリッジ１７０４は、２つ以上の試薬カートリッジ１７１０が連続して使用され交換されるときに所定の位置に留まるように構成されてもよい。図１７では、試薬カートリッジ１７１０および洗浄または試薬カートリッジ１７０４が別個のカートリッジとして示されているが、洗浄カートリッジ３０４の内容物は試薬カートリッジ１７１０に組み込まれてもよい。

図１７の例示的な自動化されたマルチモジュール細胞処理機器１７００は、細胞成長モジュール１７３４をさらに含む。図１７に示す実施形態では、細胞成長モジュール１７３４は、２つの細胞増殖ユニット１７１８、１７２０および細胞濃縮モジュール１７２２を含む。代替の実施形態では、細胞濃縮モジュール１７２２は、例えば、別個の専用モジュールで、細胞成長モジュール１７３４とは別個であってもよい。また、図１７の自動化されたマルチモジュール細胞処理機器１７００の一部として示されているのは、例えば、空気置換ピペッタ１７３２および濾過モジュール１７２４によって提供されるスクリーニング／選択モジュール１７２８である。また、廃棄物貯蔵所１７２６、および反応チャンバまたはチューブレセプタクル（図示せず）を含み、さらに、例えば磁気固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ（ブリティッシュコロンビア州リッチモンドのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社提供）を使用して核酸の精製を可能にする磁石１７１６を含む核酸アセンブリ／脱塩モジュール１７１４も見られる。試薬カートリッジ、形質転換モジュール、および細胞成長モジュールについては、以下で詳しく説明する。

図１８は、図１７に示される自動化されたマルチモジュール細胞処理システムを使用するための方法１８００の一実施形態のブロック図である。最初のステップで、細胞は試薬カートリッジ１８１０から成長バイアル１８１８に移される（１８０１）。細胞は、例えば、所望のＯＤ１８０３まで成長するまでインキュベートされる（１８０２）。次に、細胞を濾過モジュール１８２２に移して（１８０４）、細胞をエレクトロコンピテントにし、細胞サンプルの体積をエレクトロポレーションに適した体積に減らし、細胞サンプルから不要な成分、例えば塩を除去する。細胞がエレクトロコンピテントになり、形質転換のために適切な容量に懸濁されると、細胞サンプルは試薬カートリッジ１８１０内のＦＴＥＰ装置１８３０に移される（１８１０）。

細胞がエレクトロポレーションのために処理されている間、自動化されたマルチモジュール細胞処理システムは、細胞にエレクトロポレーションされる核酸を準備している可能性がある。最初のステップとして、ベクターを含む核酸サンプル、オリゴヌクレオチド、および酵素および他の反応成分を含む核酸サンプルが、試薬カートリッジの試薬リザーバから核酸アセンブリモジュールの使い捨てチューブに転送される（１８０６）。核酸アセンブリミックス（ベクター＋オリゴ＋酵素＋試薬）をインキュベートする（１８０７）。アセンブリ反応が起こるのに十分な時間が経過したら、核酸アセンブリミックスを磁気ビーズと結合させる（１８０８）。混合物は、アセンブリされたベクターとオリゴヌクレオチドが磁気ビーズに結合するのに十分な時間インキュベートされる。アセンブリされたベクターとオリゴヌクレオチドを洗浄し（１８１０）、溶出する（１８１１）ため、磁石を係合させる（１８０９）。アセンブリされたベクターが溶出（１８１１）されると、アセンブリされたベクターは試薬カートリッジのＦＴＥＰ装置に移される（１８１２）。したがって、アセンブリされたベクターと細胞はＦＴＥＰ装置で結合され、ＦＴＥＰ装置は作動する（１８１３）。
エレクトロポレーションの後、形質転換された細胞は、任意で、例えば、形質転換プロセスから回復し、選択に供され、この特定の例ではゲノム編集のために、第２の成長バイアルに移される（１８１４）。形質転換された細胞が回復し、選択されると（例えば、試薬カートリッジから追加される抗生物質または他の試薬により、または例えば温度により）、またはゲノム編集が行われると、細胞は機器から取り出され、さらに調査（１８１８）に使用され、また濾過モジュールにより吸引されて（１８１５）死細胞を除去するために洗浄され、および／または濃縮され、エレクトロコンピテントされ、洗浄または試薬カートリッジの試薬リザーバからフィルタを通して分注された洗浄液を使用して溶出される（１８１６）。溶出した細胞は、洗浄カートリッジ内の空の容器に集められる。空気置換ピペッタは、溶出した細胞に試薬カートリッジから培地を移す。ステップ１８０１〜１８１６のすべてまたは一部を、ゲノム編集（１８１７）の再帰的なラウンドのために繰り返すことができる。あるいは、形質転換された細胞は研究（１８１８）で使用されてもよい。

例示的な自動化されたマルチモジュール細胞処理システムでの試薬カートリッジの使用
上述のように、ＦＴＥＰ装置は、独立型装置で使用されるか、自動化されたマルチモジュール処理システムのモジュールとして使用され得る。マルチモジュール細胞処理システムの一般的な例示的実施形態が図１９に示されている。いくつかの実施形態では、細胞処理システム１９００は、ハウジング１９６０、形質転換またはトランスフェクトされる１９０２細胞を導入するためのレセプタクル、および成長モジュール（細胞増殖装置）１９０４を含むことができる。形質転換される細胞は、試薬カートリッジから成長モジュールに移され、細胞が標的ＯＤに達するまで培養される。細胞が標的ＯＤに達すると、成長モジュールは、後で処理するために細胞を冷却または凍結するか、細胞をエレクトロコンピテントおよび濃縮する濾過モジュール１９２０に移すことができる。濾過モジュール１９２０は、例えば、細胞を処理してそれらを電気適格にし、電気適格細胞を濃縮するためのフィルタを含む。一例では、２０ｍｌの細胞＋増殖培地を４００μｌの１０％グリセロール細胞懸濁液に濃縮する。エレクトロコンピテント細胞が濃縮されると、細胞は試薬カートリッジ内のエレクトロポレーション装置に移され、所望の核酸で形質転換される。細胞を受容するためのレセプタクルに加えて、マルチモジュール細胞処理システムは、細胞１９０６にエレクトロポレーションされる核酸を保存するための試薬カートリッジに位置するレセプタクルを含む。核酸は、特定のＯＤまで成長した濃縮エレクトロコンピテント細胞を既に含むエレクトロポレーション装置１９０８に移され、そこで核酸が細胞に導入される。エレクトロポレーションに続いて、形質転換された細胞は、例えば、回復モジュール１９１０に移される。ここで、細胞には、エレクトロポレーション手順から回復する機会が与えられる。

いくつかの実施形態では、回復後、細胞は、保存モジュール１９１２に移され、例えば４℃で保存されるか、凍結される。次いで、細胞を回収モジュール１９１４から回収し、オフラインでさらなる研究に使用することができる。自動化されたマルチモジュール細胞処理システムは、ユーザー入力または１つまたは複数のスクリプトに基づいて機器を操作するように構成されたプロセッサ１９５０によって制御され、１つまたは複数を試薬カートリッジに関連付けることができる。プロセッサ１９５０は、１つ以上のスクリプトによって指定されるように、システム１９００の様々なモジュールのタイミング、持続時間、温度、および他の動作（例えば、試薬の分配を含む）を制御し得る。１つ以上のスクリプトに加えて、プロセッサは、ユーザーが選択できる標準プロトコルパラメータでプログラムできる。あるいは、ユーザーは１つまたはすべてのパラメーターを手動で選択できる。スクリプトは、例えば、細胞成長モジュールでＯＤが読み取られる波長、細胞が増殖される標的ＯＤ、および細胞が標的ＯＤに到達する標的時間を指定してもよい。プロセッサは、細胞が標的ＯＤに到達したことをユーザーに通知し（例えば、スマートフォンまたは他の装置へのアプリケーションを介して）、さらに自動化されたマルチモジュール細胞処理システムの細胞成長モジュール、エレクトロポレーション装置、濾過モジュール、回復モジュールなどでの細胞の進行に関してユーザーに対し更新してよい。

自動化されたマルチモジュール細胞処理システムの第２の実施形態が図２０に示されている。図１９に示される実施形態のように、細胞処理システム２０００は、ハウジング２０６０、例えば、細胞が形質転換またはトランスフェクトされる２００２の試薬カートリッジ内の細胞のリザーバ、および成長モジュール（細胞成長装置）２００４を含み得る。形質転換されるべき細胞は、例えば、試薬カートリッジのリザーバから細胞が標的ＯＤに達するまで培養される成長モジュールに移される。細胞が標的ＯＤに達すると、成長モジュールは、後で処理するために細胞を冷却または凍結するか、または細胞をエレクトロコンピテントにし、図１９に関連して上記で説明されるように細胞形質転換に最適な体積に濃縮する濾過モジュール２０３０に細胞を移すことができる。濃縮されると、細胞は形質転換のためにＦＴＥＰ装置２００８に移される。

細胞を保存するためのリザーバに加えて、試薬カートリッジは、編集オリゴヌクレオチド２０１６を保存するためのリザーバおよび発現ベクター骨格２０１８を保存するためのリザーバを含んでもよい。編集オリゴヌクレオチドおよび発現ベクター骨格の両方は、例えば、試薬カートリッジから編集オリゴヌクレオチドが発現ベクター骨格に挿入される核酸アセンブリモジュール２０２０（上記の核酸アセンブリモジュールなど）へ輸送される。アセンブリされた核酸は、形質転換のためにアセンブリされた核酸を調製するために必要な脱塩および／または他の精製手順のために、オプションの精製モジュール２０２２に移されてもよい。精製モジュール２０２２によって実行されるプロセスが完了すると、アセンブリされた核酸も、目的のＯＤに成長し、ろ過され、エレクトロコンピテントになった細胞培養物が既に含まれている試薬カートリッジ２００８のＦＴＥＰ装置に移される。ＦＴＥＰ装置２００８では、核酸が細胞に導入される。エレクトロポレーション後、細胞は結合された、回復および編集モジュール２０１０に転送される。上述のように、いくつかの実施形態では、自動化されたマルチモジュール細胞処理システム２０００は、ＲＮＡダイレクトヌクレアーゼ編集システムなどの遺伝子編集を実行するシステムである。２０１８年６月３０日提出のＵＳＳＮ１６／０２４、２０１８年６月３０日提出の８１６ＵＳＳＮ１６／０２４，８３１、２０１７年１０月２日提出のＵＳＳＮ６２／５６６，６８８及び２０１７年１０月３日提出のＵＳＳＮ６２／５６７，６９８を参照されたい。回復および編集モジュール２０１０では、細胞は形質転換後に回復することができ、細胞は以下に説明するように細胞内の所望の遺伝子を編集する編集オリゴヌクレオチドを発現する。

編集に続いて、細胞は、さらなる研究のために細胞が回収されるまで、例えば４℃で細胞を保存することができる保存モジュール２０１２に転送される。マルチモジュール細胞処理システムは、１つまたは複数のスクリプトによって指示されるように、またはユーザー入力またはスクリプトの組み合わせとして、ユーザー入力に基づいて機器を操作するように構成されたプロセッサ２０５０によって制御される。プロセッサ２０５０は、システム２０００の様々なモジュールのタイミング、持続時間、温度、および動作、ならびに例えば試薬カートリッジからの試薬の分配を制御することができる。プロセッサは、ユーザーが選択できる標準プロトコルパラメータでプログラムできる。ユーザーは１つ以上のパラメーターを手動で指定するか、試薬カートリッジに関連付けられた１つ以上のスクリプトで１つ以上の操作および／または反応パラメーターを指定できる。さらに、プロセッサは、細胞がターゲットＯＤに到達したことをユーザーに通知し（たとえば、スマートフォンやその他の装置へのアプリケーションを介して）、ユーザーにマルチモジュールシステム内のさまざまなモジュールでの細胞の進行状況を更新する。

図２０に示すシステムなどのマルチモジュール処理システムの特定の実施形態は、核酸アセンブリモジュール（例えば、酵母のギャップ修復を促進するアセンブリモジュールおよび／またはＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ライゲーション連鎖反応、リガーゼ検出反応、ライゲーション、環状ポリメラーゼ伸長クローニング、またはその他のアセンブリまたはクローニング方法を実行するモジュール）２０２０を含む。核酸アセンブリモジュール２０２０は、ゲノム編集イベントを促進するために必要な核酸をアセンブリするように構成されている。ヌクレアーゼ指向ゲノム編集システムでは、ベクターは、核酸誘導ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された１つまたは複数の調節要素を含む。したがって、これらの実施形態の核酸アセンブリモジュール２０２０は、核酸誘導ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ−ｇｕｉｄｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を発現する発現ベクターをアセンブリするように構成される。したがって、これらの実施形態の核酸アセンブリモジュール２０２０は、核酸誘導ヌクレアーゼを発現する発現ベクターをアセンブリするように構成される。核酸アセンブリモジュール２０２０は、機器で使用される核酸アセンブリのタイプに応じて温度制御されてもよい。たとえば、核酸アセンブリプロトコルを使用する場合、モジュールは５０℃に到達して保持する機能を持つように構成される。ＰＣＲが自動化されたマルチモジュール細胞処理システムの一部として実行される場合、核酸アセンブリモジュールは温度間でサーモサイクルするように構成される。温度と温度を維持するための時間は、事前にプログラムされた一連のパラメーター（スクリプトで指示されるか、プロセッサにプログラムされる）で制御するか、ユーザーがプロセッサを使用して手動で制御できる。

上記のように、一実施形態では、自動化されたマルチモジュール細胞処理システム２０００は、ヌクレアーゼ指向ゲノム編集システムである。細胞に編集を提供するための複数のヌクレアーゼベースのシステムが存在し、図１９の自動化されたシステム１９００で実行できるような単一の編集システム、以下に説明する例えば異なるヌクレアーゼ指向システムを連続して使用して、細胞内で２つ以上のゲノム編集を提供する図２１の自動化されたシステム２１００で実行できるような逐次編集システム、および／または例えば単一のヌクレアーゼ指向システムを利用して、細胞に２つ以上のゲノム編集を同時に連続して導入する、図２１の自動化されたシステム２１００で実行できる再帰的編集システム使用してよい。自動化されたヌクレアーゼ指向プロセッシングシステムは、ヌクレアーゼを使用して細胞のゲノムを切断し、および／または細胞のゲノムの標的領域に１つ以上の編集を導入する。ヌクレアーゼ指向のゲノム編集メカニズムには、亜鉛フィンガー編集メカニズム（「Urnov et al., Nature Reviews Genetics, 11:636-64 (2010)」、メガヌクレアーゼ編集メカニズム(「Epinat et al., Nucleic Acids Research,31(11):2952-62 (2003)」、「Arnould et al., Journal of Molecular Biology, 371(1):49-65 (2007)」)、およびＲＮＡガイド編集メカニズム(「Jinek et al., Science, 337:816-21 (2012)」、「Mali et al, Science, 339:823-26 (2013)」を参照）。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ編集システムは、編集のタイミングの制御を可能にする誘導システムである（「Campbell, Biochem J., 473(17): 2573-2589 (2016)」、「Dow et al., Nature Biotechnology, 33390-94 (2015)」)。すなわち、ＤＮＡをコードする核酸誘導ヌクレアーゼを含む細胞または細胞集団が誘導分子の存在下にある場合、ヌクレアーゼの発現が起こり得る。ヌクレアーゼ活性を調節する能力は、オフターゲット切断を減らし、正確なゲノム工学を促進することができる。

マルチモジュール細胞処理システムの第３の実施形態が図２１に示される。この実施形態は、細胞集団に対して再帰的遺伝子編集を実行する例示的なシステムを示す。図１９および図２０に示す実施形態と同様に、細胞処理システム２１００は、ハウジング２１６０、例えば、形質転換またはトランスフェクトされる細胞２１０２を保存するための試薬カートリッジ内のリザーバ、および細胞成長モジュール（細胞増殖装置）２１０４を含み得る。形質転換される細胞は、試薬カートリッジのリザーバから細胞成長モジュールに移され、細胞が標的ＯＤに達するまで培養される。細胞が標的ＯＤに達すると、成長モジュールは後の処理のために細胞を冷却または凍結するか、成長モジュールは細胞を濾過モジュール２１２０に移し、そこで細胞をエレクトロコンピテントにし、細胞の体積を実質的に減らすことができる。細胞が適切な体積に濃縮されると、細胞は試薬カートリッジ内のＦＴＥＰ装置２１０８に移される。細胞を保存するためのリザーバに加えて、マルチモジュール細胞処理システムは、編集オリゴヌクレオチド２１０６を含むベクターを保存するためのリザーバを含む（すなわち、この実施形態では、自動化されたマルチモジュール細胞処理システムは核酸アセンブリを含まないモジュールであり、代わりに、核酸は事前にアセンブリされて提供される）。アセンブリされた核酸は、標的ＯＤまで成長した細胞培養物を既に含むＦＴＥＰ装置２１０８に移される。ＦＴＥＰ装置２１０８では、核酸が細胞にエレクトロポレーションされる。エレクトロポレーションに続いて、細胞は回復モジュール２１２４に移される。回復モジュール２１２４では、形質転換された細胞は形質転換後に回復を許可される。

細胞は、さらなる研究のために細胞が回収されるまで細胞を例えば４℃で保存することができる保存モジュール２１１２に移されるか、または細胞は第２の任意の成長モジュール２１２６に移されてもよい。細胞が標的ＯＤに達すると、第２の成長モジュールは、後の処理のために細胞を冷却または凍結するか、または例えば熱の導入またはヌクレアーゼおよび／またはガイド核酸の発現のための誘導分子の導入によって、例えば誘導性ヌクレアーゼおよび誘導性ガイド核酸（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｕｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の一方または両方が活性的である、編集モジュール２１２８に細胞を移すことができる。編集後、細胞は分離および濾過モジュール２１３０に転送され、そこでＦＴＥＰ装置２１０８への転送の準備として、編集溶液から細胞が分離および／または濃縮される。

ＦＴＥＰ装置２１０８では、細胞は第２の編集オリゴ（または他の種類のオリゴ）のセットにより形質転換され、細胞が所望の数の編集オリゴヌクレオチドにより形質転換および編集されるまでサイクルが繰り返される。図１９および図２０に関して上述したように、マルチモジュール細胞処理システムは、ユーザー入力に基づいて機器を操作するように構成されたプロセッサ２１５０によって制御されるか、試薬カートリッジに関連する少なくとも１つのスクリプトを含む１つ以上のスクリプトによって制御される。プロセッサ２１５０は、様々なプロセスのタイミング、持続時間、および温度、試薬の分配、およびシステム２１００の様々なモジュールの他の動作を制御し得る。例えば、スクリプトまたはプロセッサは、細胞、試薬、ベクター、および細胞編集のために所定の指令で使用される編集オリゴヌクレオチドの分配、回復および発現モジュールで使用される時間、温度、その他の条件、細胞成長モジュールでＯＤが読み取られる波長、細胞が増殖する標的ＯＤ、および細胞が標的に到達する標的時間ＯＤを制御し得る。加えて、プロセッサは、自動化されたマルチモジュール細胞処理システム内の進行状況に関して（例えば、アプリケーションを介して）ユーザーに通知するようにプログラムされてもよい。

図２２は、編集された細胞をスクリーニングするためのシンギュレーションモジュールを備える例示的な自動化されたマルチモジュール細胞処理システムの実施形態の簡略ブロック図である。細胞処理システム２２００は、ハウジング２２６０、形質転換またはトランスフェクトされる２２０２細胞の貯蔵容器、および成長モジュール（細胞成長装置）２２０４を含み得る。形質転換される細胞は、貯蔵容器から成長モジュールに移されて、細胞が標的ＯＤに達するまで培養される。細胞が標的ＯＤに達すると、成長モジュールは後の処理のために細胞を冷却または凍結するか、または選択的に設けられた濾過モジュール２２３０に細胞を移し、そこで細胞をエレクトロコンピテントにし、細胞の形質転換に最適な体積に濃縮する。濃縮されると、細胞はＦＴＥＰ装置２２０８に移される（形質転換／トランスフェクション）。本明細書に開示される自動化されたマルチモジュール細胞処理システムで使用される例示的なエレクトロポレーション装置には、２０１７年９月３０日出願のＵＳＳＮ６２／５６６，３７４、２０１７年９月３０日出願のＵＳＳＮ６２／５５６，３７５、２０１８年４月１３日出願のＵＳＳＮ６２／６５７，６５１、および２０１８年４月１３日出願のＵＳＳＮ６２／６５７，６５４に記載されたものが含まれ、それらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

細胞を保存するためのリザーバに加えて、システム２２００は、編集オリゴヌクレオチドを保存するためのリザーバ２２１６および発現ベクター骨格を保存するためのリザーバ２２１８を含み得る。編集オリゴヌクレオチドおよび発現ベクター骨格の両方は、例えば、試薬カートリッジのリザーバから、編集オリゴヌクレオチドが発現ベクター骨格に挿入される、核酸アセンブリモジュール２２２０へ輸送される。アセンブリされた核酸は、形質転換のためにアセンブリされた核酸を調製するために必要な脱塩および／または他の精製手順のために、任意の精製モジュール２２２２に移されてもよい。あるいは、事前にアセンブリされた核酸、例えば編集ベクターは、リザーバ２２１６または２２１８内に保存されてもよい。精製モジュール２２２２により実行されるプロセスが完了すると、アセンブリされた核酸は、例えば目的のＯＤまで成長した細胞培養が既に含まれているＦＴＥＰ装置２２０８に移される。ＦＴＥＰ装置２２０８では、アセンブリされた核酸が細胞に導入される。エレクトロポレーションに続いて、細胞は、回復、細胞増殖、および編集の組み合わせモジュール２２１０に移される。いくつかの実施形態では、自動化されたマルチモジュール細胞処理システム２２００は、ＲＮＡ直接ヌクレアーゼ編集システムなどの遺伝子編集を実行するシステムである。たとえば、２０１８年６月３０日出願のＵＳＳＮ１６／０２４，８１６および１６／０２４，８３１、２０１７年１０月２日出願のＵＳＳＮ６２／５６６，６８８、２０１７年１０月３日出願のＵＳＳＮ６２／５６７，６９８を参照されたい。回復、細胞増殖、および編集の組み合わせモジュール２２１０では、細胞は形質転換後の回復を許可され、編集が開始される。

編集に続いて、細胞はシンギュレーションモジュール２２４０に転送され、そこで区画ごとに平均１つの細胞が存在するように細胞が配列される。いくつかの実施形態では、コンパートメントはウェルであり得、いくつかの実施形態ではコンパートメントは液滴であり得、いくつかの実施形態では、コンパートメントはエリア、例えば寒天プレート上で互いに分離されたまたは機能化基板上に配列された細胞であり得る。シンギュレーションされると、細胞は成長し、例えば栄養素または物理的閉じ込めによって制限された最終サイズまで、または飽和するまで成長するコロニーを確立することができる。コロニーが確立されると、コロニーはプールされる。シンギュレーションは、未編集の細胞からの成長バイアスと、異なる編集のフィットネス効果から生じる成長バイアスを克服する。

細胞コロニーがプールされると、細胞は、例えば、さらなる研究のために細胞が回収されるまで細胞を例えば４℃に保つことができる保存モジュール２２１２に保存されることができる。または、別のラウンドの編集で細胞を使用することもできる。マルチモジュール細胞処理システムは、１つまたは複数のスクリプトによって指示されるように、またはユーザー入力またはスクリプトの組み合わせとして、ユーザー入力に基づいて機器を操作するように構成されたプロセッサ２２５０によって制御される。プロセッサ２２５０は、システム２２００の様々なモジュールのタイミング、持続時間、温度、および動作、ならびに試薬の分配を制御し得る。例えば、プロセッサ２２５０は、編集が望まれるまで形質転換後の細胞を冷却することができ、その時点で、温度をゲノム編集および細胞増殖を助長する温度まで上昇させることができる。プロセッサは、ユーザーが選択できる標準プロトコルパラメータでプログラムできる。ユーザーは、１つ以上のパラメーターを手動で指定するか、試薬カートリッジに関連付けられた１つ以上のスクリプトで１つ以上の操作および／または反応パラメーターを指定できる。さらに、プロセッサは、細胞がターゲットＯＤに到達したことをユーザーに通知し（たとえば、スマートフォンまたは他の装置へのアプリケーションを介して）、および／またはユーザーにマルチモジュールシステム内のさまざまなモジュールでの細胞の進行状況を更新する。

自動化されたマルチモジュール細胞処理システム２２００は、ヌクレアーゼ指向ゲノム編集システムであり、単一の編集システムで使用することができる。以下で説明する図２３のシステムは、たとえば、異なるヌクレアーゼ指向システムを連続して使用して細胞内で２つ以上のゲノム編集を提供するなど、順次編集を実行するように構成されている。および／または再帰的編集、例えば単一のヌクレアーゼ指向システムを利用して、細胞に２つ以上のゲノム編集を導入する。

図２３は、マルチモジュール細胞処理システムの別の実施形態を示している。この実施形態は、１）スクリーニングに加えて誘導および細胞選択の編集を含み、２）細胞集団に対して再帰的遺伝子編集を実行する例示的なシステムを示す。図２２に示される実施形態と同様に、細胞処理システム２３００は、ハウジング２３６０、形質転換またはトランスフェクトされる細胞を保存するためのリザーバ２３０２、および細胞成長モジュール（細胞増殖装置）２３０４を含み得る。リザーバから細胞成長モジュールに移され、細胞が標的ＯＤに達するまで培養される。細胞が標的ＯＤに達すると、成長モジュールは、後の処理のために細胞を冷却または凍結するか、細胞を任意の濾過モジュール２３３０に移し、そこで細胞をエレクトロコンピテントにし、細胞の体積を大幅に減らすことができる。細胞が適切な体積に濃縮されると、細胞はＦＴＥＰ装置２３０８に移される。細胞を保存するためのリザーバに加えて、マルチモジュール細胞処理システムは、編集オリゴヌクレオチド２３５２を含むベクターを保存するためのリザーバを含む。核酸はターゲットＯＤまで成長した細胞培養物がすでに含まれているＦＴＥＰ装置２３０８に転送される。ＦＴＥＰ装置２３０８では、核酸が細胞にエレクトロポレーションされる。エレクトロポレーションに続いて、細胞は任意の回復モジュール２３４２に移され、そこで細胞は形質転換後に短時間回復することができる。

回復後、細胞を保存モジュール２３１２に移し、そこで細胞をさらなる研究のために回収するまで、例えば４℃で保存するか、または細胞をシンギュレーションまたは成長モジュール２３４４に移すことができる。モジュール２３４４では、区画ごとに平均して１つの細胞が存在するように細胞が配列される。いくつかの実施形態では、区画はウェル、液滴、またはエリアであり得、例えば寒天プレート上で互いに分離された細胞、または例えば機能化された基質上に配列された細胞であり得る。一旦シンギュレーションされると、細胞は数回から多数回の倍加を通じて成長し、コロニーを確立することができる。コロニーが確立されると、細胞コロニーを含む基質は編集を誘導するための条件（温度、誘導または抑制化学物質の添加）が存在する誘導モジュール２３４６に移される。編集が開始され、続行が許可されると、基板は選択モジュール２３４８に転送される。選択モジュール２３４８には、たとえば、細胞の小さなコロニーを選択するコロニー測定およびピッキング装置と、ウェルまたは液滴のＯＤを測定し、細胞増殖に基づいて編集された細胞のコロニーを回収するように構成された分光光度計、または、ウェルまたは液滴内の他の細胞特性を測定し、細胞増殖と相関する細胞特性に基づいて編集された細胞のコロニーを回収するように構成された分光光度計が含まれる。シンギュレーションモジュールと選択モジュールはリンクされている場合がある。編集されたと推定される細胞が選択されると、それらは、ＦＴＥＰモジュール２３０８を介して別の編集カセット内のさらに別のドナー核酸による形質転換から始まる別のラウンドの編集に供され得る。

ＦＴＥＰ装置２３０８では、編集の第１ラウンドから選択された細胞は、編集オリゴ（または他のタイプのオリゴ）の第２セットによって形質転換され、例えば、細胞がドナー核酸のような所望の数だけ形質転換および編集されるまでサイクルが繰り返される。図２３に例示されるマルチモジュール細胞処理システムは、ユーザー入力に基づいて機器を操作するように構成されたプロセッサ２３５０によって制御されるか、試薬カートリッジに関連する少なくとも１つのスクリプトを含む１つ以上のスクリプトによって制御される。プロセッサ２３５０は、様々なプロセスのタイミング、持続時間、および温度、試薬の分配、およびシステム２３００の様々なモジュールの他の動作を制御し得る。例えば、スクリプトまたはプロセッサは、細胞、試薬、ベクター、および細胞編集のために所定の指令で使用される編集オリゴヌクレオチドの分配、回復および発現モジュールで使用される時間、温度、その他の条件、細胞成長モジュールでＯＤが読み取られる波長、細胞が増殖する標的ＯＤ、および細胞が標的に到達する標的時間ＯＤを制御し得る。加えて、プロセッサは、自動化されたマルチモジュール細胞処理システム内の進行状況に関して（例えば、アプリケーションを介して）ユーザーに通知するようにプログラムされてもよい。

実施例
以下の実施例は、当業者に本発明の製造および使用方法の完全な開示および説明を提供するために提示され、発明者が考えるものの範囲を限定することを意図するものではない。それらの発明も、以下の実験がすべて実施されたものである、または唯一の実験であることを表すことも意味することも意図していない。当業者は、広く記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の態様に示されるように、本発明に対して多数の変形および／または修正を行うことができることを理解するであろう。したがって、本態様は、あらゆる点で例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。

実施例１：エレクトロコンピテント大腸菌の産生および形質転換
ＦＴＥＰ装置の形質転換を試験するために、エレクトロコンピテント大腸菌細胞が作成された。スターターカルチャーを作成するために、６ｍｌのＬＢクロル−２５（２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ）を１４ｍｌ培養チューブに移した。大腸菌の２５μｌアリコートを使用して、ＬＢクロル−２５チューブに接種した。接種後、チューブを２５０ＲＰＭおよび３０℃に設定した振盪インキュベーター内に４５°の角度で１２〜１６時間一晩成長させた。ＯＤ６００の値は２．０〜４．０である必要がある。１：１００の接種量の２５０ｍｌＬＢクロル−２５チューブを、４つの滅菌５００ｍｌバッフル付き振とうフラスコに移した。つまり、２５０ｍｌの振とうフラスコあたり２．５ｍｌである。フラスコを２５０ＲＰＭおよび３０℃に設定した振盪インキュベーターに入れた。１〜２時間ごとにＯＤ６００を測定することにより、成長を監視した。培養物のＯＤ６００が０．５〜０．６（約３〜４時間）になったら、フラスコをインキュベーターから取り出した。細胞を４３００ＲＰＭ、１０分、４℃で遠心分離した。上清を除去し、氷冷した１０％グリセロール１００ｍｌを各サンプルに移した。細胞を穏やかに再懸濁し、洗浄手順を３回実施し、そのたびに細胞を１０％グリセロールに再懸濁した。４回目の遠心分離後、細胞の再懸濁物を５０ｍｌコニカルファルコンチューブに移し、氷冷した１０％グリセロールを追加して容量を３０ｍｌにした。細胞を再度４３００ＲＰＭ、１０分間、４℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを１０ｍｌの氷冷グリセロールに再懸濁した。細胞懸濁液と氷冷グリセロールの１：１００希釈液に細胞を分注した。

図１５Ｂおよび１５Ｃの（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｖｉ）、ならびに図１５Ｄの（ｉｉ）および（ｖｉ）。に示されるＦＴＥＰ装置の実施形態を使用して、エレクトロコンピテント大腸菌の形質転換の効率を決定するために、比較エレクトロポレーション実験を実施した（ＦＴＥＰ装置のフローチャネルの狭窄部を通る細胞および外因性物質の層流を示す走査型電子顕微鏡写真については図２４を参照）。流量は圧力制御システムで制御された。ＤＮＡを含む細胞の懸濁液をＦＴＥＰ入口リザーバにロードした。形質転換された細胞は、入口および入口チャネルから直接、フローチャネルを通り、出口チャネルを通り、回復培地を含む出口に流れた。細胞を追加の回復培地を含むチューブに移し、３０℃のインキュベーターシェーカーに入れ、２５０ｒｐｍで３時間振盪した。細胞を播種して、エレクトロポレーションを生き抜いてプラスミドを取り込まなかったコロニー形成単位（ＣＦＵ）およびエレクトロポレーションを生き抜いてプラスミドを取り込んだＣＦＵを決定した。プレートを３０℃でインキュベートした。大腸菌コロニーは２４時間後に数えられた。

フロースルーエレクトロポレーション実験は、インビトロ高電圧エレクトロポレーター（ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）ＥＬＥＰＯ２１）を使用して、２ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Ｂｕｌｌ ｄｏｇ Ｂｉｏ）に対してベンチマークされた。ＤＮＡを含む細胞懸濁液のストックチューブを準備し、ＮＥＰＡＧＥＮＥ(商標)およびフロースルーエレクトロポレーションを使用した実験に使用した。結果を図２５Ａに示す。図２５Ａにおいて、左端にある（右上がりの）ハッチングのバーは細胞インプットを示し、（右下がりの）ハッチングは形質転換を生き抜いた細胞の数を示し、右端にある（右上がりの）のハッチングのバーは実際に形質転換され細胞の数を示す。ＦＴＥＰ装置は、ＮＥＰＡＧＥＮＥ(商標)エレクトロポレーターと比較して、さまざまな電圧でエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞の同等の形質転換を示した。見て分かるように、形質転換生存率は少なくとも９０％であり、いくつかの実施形態では少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。回復率（形質転換および回復に成功した導入細胞の割合）は、特定の実施形態では、少なくとも０．００１、好ましくは０．００００１〜０．０１である。図２５Ａでは、回復率は約０．０００１である。

さらに、ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）ＥＬＥＰＯ２１とＦＴＥＰ装置の比較を、形質転換（取り込み）、切断、および編集の効率について行った。図２５Ｂ、（右上がりの）ハッチングのバーが形質転換のためにインプットされた細胞の数を示し、（右下がりの）ハッチングは形質転換された細胞の数（取り込み）、細胞に形質転換されたベクターから転写および翻訳されたヌクレアーゼによって切断された細胞の数、編集（細胞に形質転換されたベクターから転写および翻訳されたヌクレアーゼを使用した切断および修復、およびいずれも細胞に形質転換されたベクターから転写されたガイドＲＮＡおよびドナーＤＮＡ配列を使用）が行われた細胞の数を示す。この場合も、ＦＴＥＰがＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）エレクトロポレーターと同等の形質転換、切断、編集の効率を示したことがわかる。図２５Ｂの回復率ＦＴＥＰは、０．００１よりも大きな値である。

実施例２：エレクトロコンピテントＳ．セレビシエの産生および形質転換
ＦＴＥＰ装置の形質転換をさらに試験するために、「Bergkessel and Guthrie,Methods Enzymol.,529:311-20(2013)」に一般的に記載されている方法を使用して、Ｓ．セレビシエ細胞を作製した。手短に言えば、ＹＦＡＰ培地を一晩増殖させて、３ｍｌを接種して１００ｍｌの細胞を生産した。処理された培養液１００ｍｌごとに、約１ｍｌのコンピテント細胞が生じた。細胞は、１．５＋／−０．１のＯＤ６００に達するまで、振盪インキュベーターで３０℃でインキュベートされた。

成長細胞１００ｍｌごとに、１００ｍＭ酢酸リチウム、１０ｍＭジチオトレイトール、および５０ｍｌのバッファーを使用して、調整バッファーを調製しおよび室温維持された。細胞を２５０ｍｌボトルに入れ４３００ｒｐｍで３分間収集し、上清を除去した。細胞ペレットを１００ｍｌの冷１Ｍソルビトールに懸濁し、４３００ｒｐｍで３分間回転させ、上清を再度除去した。細胞をコンディショニングバッファーに懸濁し、次いで懸濁液を適切なフラスコに移し、２００ＲＰＭおよび３０℃で３０分間振盪した。懸濁液を５０ｍｌのコニカルバイアルに移し、４３００ｒｐｍで３分間回転させた。上清を除去し、ペレットを冷１Ｍソルビトールに再懸濁した。これらのステップを３回繰り返し、合計３回の洗浄−スピン−デカントステップを行った。ペレットをソルビトールに懸濁し、最終ＯＤを１５０＋／−２０にした。

ＦＴＥＰ装置を使用して、エレクトロコンピテントＳ．セレビシエの形質転換の効率を決定するために、比較エレクトロポレーション実験を実施した。流量はシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ装置ＰＨＤ ＵＬＴＲＡ^ＴＭ ４４００）で制御した。ＤＮＡを含む細胞の懸濁液を、ポンプに取り付ける前に１ｍｌのガラス製シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ８１３２０シリンジ、ＰＴＦＥルアーロック）にロードした。機能ジェネレーターからの出力は、フローを開始した直後にオンになった。処理された細胞は、カルベニシリンを含む１Ｍソルビトールを含むチューブに直接流入した。ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）でエレクトロポレーションされた同じ容量が処理されるまで細胞を収集し、その時点で機能ジェネレーターからのフローと出力を停止した。３０℃、２５０ｒｐｍのインキュベーターシェーカーで３時間回復した後、細胞を播種して、エレクトロポレーションを生き抜き、プラスミドを取り込まなかったコロニー形成単位（ＣＦＵ）と、エレクトロポレーションを生き抜いてプラスミドを取り込んだＣＦＵを決定した。プレートを３０℃でインキュベートした。酵母コロニーは４８〜７６時間後にカウントされた。

フロースルーエレクトロポレーション実験は、インビトロ高電圧エレクトロポレーター（ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）ＥＬＥＰＯ２１）を使用して、２ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Ｂｕｌｌ ｄｏｇ Ｂｉｏ）に対してベンチマークされた。ＤＮＡを含む細胞懸濁液のストックチューブを準備し、ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）およびフロースルーエレクトロポレーションを使用した実験に使用した。結果を図２６に示す。装置は、ＮＥＰＡＧＥＮＥ（商標）の方法と比較して、２．５ｋＶ電圧でエレクトロコンピテントＳ．セレビシエのより良い形質転換と生存を示した。インプットは、処理された細胞の総数である。

例３：ＦＴＥＰ圧力センシングと流量
インラインフローセンサー測定を使用して、細胞およびＤＮＡを含む液体がＦＴＥＰチップを通って流れた後、入口リザーバが空になったときを示した。約６５μＬの液体を投入タンクに入れ、自動化されたＦＴＥＰモジュールの電源を入れた。図２７の上部のグラフに示すように、起動時のいくつかの短い過渡現象の後、流量は２４ＳＣＣＭにジャンプするまでほぼ８秒（８０００ミリ秒）の間、約〜３立方センチメートル／分（ＳＣＣＭ）の流量を有する。この遷移は、実行終了トリガーで発生する。これは、細胞とＤＮＡを含む液体がＦＴＥＰ装置で処理され、空気がＦＴＥＰ装置を流れていないことを示すインジケーターである。そのトリガーは、増加した流量または空気の圧力（シリンジポンプからつながる導管など）の突然の変動（増加または減少）の検出を構成する場合がある。好ましい一実施形態では、図２７の流量センサーは、流体がインプットリザーバから完全に排出されることを示す空気流量の増加を検出する。この時点で、マルチパスエレクトロポレーション手順を可能にするために、圧力を逆にしてよい。つまり、エレクトロポレーションを行う細胞は、エレクトロポレーションの１回の通過のために入口から出口に向かって「引っ張られ」、入口リザーバが空になると、センサーは液体と細胞／ＤＮＡが「押し出される」圧力を逆転させ、フロースルーＦＴＥＰ装置の出口端を入口端に向けて、エレクトロポレーションの別のパスのために電極間を再び通過させる。このプロセスは１回から複数回繰り返される場合がある。あるいは、圧力を完全に止めて、出口の形質転換された細胞を回収してもよい。

マルチサイクルアプローチは、電場内の細胞および外因性物質の滞留時間を制限するという点で特に有利であり、これにより細胞の損傷を防ぎ、生存率を高めることができる。前後のプロセスは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回繰り返される。下の図２７は、圧力システムとＦＴＥＰの簡単な図を示す。圧力マニホルドは、マニホルドまたはリザーバに配置された１つまたは複数の補完的なシールまたはガスケットを介して、上方に延びるリザーバに結合される。マニホルドは、図１６Ｂ（ｖ）に示される「蓋」１６０８の形態をとってもよい。

本発明は、本発明の好ましい実施形態に関連して詳細に説明されるように、多くの異なる形態の実施形態によって満たされるが、本開示は、本発明の原理の例示と見なされるべきであり、本発明を、本明細書で例示および説明する特定の実施形態に限定することを意図している。本発明の精神から逸脱することなく、当業者によって多数の変形がなされ得る。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によって判断される。要約およびタイトルは、適切な当局および一般大衆が本発明の一般的性質を迅速に決定できるようにすることを目的としているため、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

Claims (14)

1. 流体中の細胞に外因性物質を導入するためのフロースルーエレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）装置であって、
   前記ＦＴＥＰ装置は上面と底面とを有し、
   ａ．細胞および／または外因性物質を含む流体を前記ＦＴＥＰ装置に入れるための少なくとも第１の入口および少なくとも第１の入口チャネルと、前記第１の入口は前記ＦＴＥＰ装置の前記上面に端を発しており、
   ｂ．前記ＦＴＥＰ装置から、形質転換された細胞および外因性物質を含む流体を取り出すための出口および出口チャネルと、前記出口は前記ＦＴＥＰ装置の前記上面に端を発しており、
   ｃ．前記少なくとも第１の入口チャネルおよび前記出口チャネルと交差し前記少なくとも第１の入口チャネルと前記出口チャネルとの間に配置されるフローチャネルであって、前記第１の入口チャネルと前記出口チャネルとの間に、エレクトロポレーションされる細胞の直径の少なくとも２倍より小さくならない寸法まで幅が減少した前記フローチャネルの狭窄を形成する前記フローチャネルと、
   ｄ．前記ＦＴＥＰ装置の前記上面に端を発する電極チャネルにそれぞれ配置された第１の電極と第２の電極であって、前記第１の電極は前記第１の入口チャネルと前記狭窄との間に配置され、前記第２の電極は前記狭窄と前記出口チャネルとの間に配置され、前記第１の電極および前記第２の電極は、前記フローチャネル内の流体と流体的かつ電気的に連通しており、前記第１の電極および前記第２の電極は、前記流体中の前記細胞が前記フローチャネルを通過する際に、前記流体中の前記細胞に１つ以上の電気パルスを印加し、それにより、前記流体中の前記細胞に外因性物質を導入する、前記第１の電極および前記第２の電極を備える、
   ＦＴＥＰ装置。
2. 前記流体中の前記細胞を前記ＦＴＥＰ装置に導入するための前記入口に接続されたリザーバと、前記ＦＴＥＰ装置から形質転換された細胞を取り出すための前記出口に接続されたリザーバとをさらに備える、請求項１に記載のＦＴＥＰ装置。
3. 前記ＦＴＥＰ装置は第２の入口および第２の入口チャネルを備えており、外因性物質を前記ＦＴＥＰ装置に導入するための前記第２の入口に接続されたリザーバをさらに備える、請求項２に記載のＦＴＥＰ装置。
4. 前記第２の入口および第２の入口チャネルは、前記第１の入口および前記第１の入口チャネルと前記第１の電極との間に位置する、請求項３に記載のＦＴＥＰ装置。
5. 前記第２の入口および第２の入口チャネルは、前記第２の電極と前記出口チャネルとの間に位置する、請求項３に記載のＦＴＥＰ装置。
6. バクテリア細胞、酵母細胞、及び哺乳類細胞とともに使用するように構成される、請求項１に記載のＦＴＥＰ装置。
7. 前記第１の電極および前記第２の電極は、互いに１ｍｍ〜１０ｍｍ離間されて配置される、請求項１に記載のＦＴＥＰ装置。
8. 前記チャネルの最狭窄部の幅は、１０μｍ〜５ｍｍである、請求項１に記載のＦＴＥＰ装置。
9. １つまたは複数の前記入口チャネルと前記出口チャネルとの間に、１つまたは複数のフィルタをさらに備える、請求項１に記載のＦＴＥＰ装置。
10. 前記第１の電極および前記第２の電極は、互いに１０μｍ〜１ｍｍ離間されて配置される、請求項１に記載のＦＴＥＰ装置。
11. 前記チャネルの最狭窄部の幅は、１０μｍ〜１ｍｍである、請求項８に記載のＦＴＥＰ装置。
12. 前記１つまたは複数のフィルタは前記ＦＴＥＰ装置の一部として前記ＦＴＥＰ装置と一体に形成される、請求項９に記載のフロースルーエレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）装置。
13. 前記１つまたは複数のフィルタは勾配フィルタである、請求項１２に記載のフロースルーエレクトロポレーション装置。
14. 請求項１に記載のＦＴＥＰ装置を含む、自動化されたマルチモジュール細胞処理システム。

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