CN103060191B - 一种电穿孔系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了电穿孔系统，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞，该系统包括：电穿孔装置；用于产生电脉冲的脉冲发生器；以及不导电材料的长中空样本填充件，以便在电穿孔过程中提供均匀的电场，其中，执行电穿孔是通过在长中空样本填充件中充满包括细胞的样本之后，由一对电极从长中空样本填充件的两个末端施加电脉冲。
Description
本申请是申请日为2005年06月13日、申请号为200580018428.8、发明名称为“具有长中空件的电穿孔装置”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及具有长中空件的电穿孔装置以及电穿孔方法，由此将一个电脉冲或多个电脉冲施加到包括细胞的样本，将细胞膜电打孔，从而使外来物质可以进入细胞。
背景技术
一般地，电穿孔是一种通过电脉冲使不能穿透细胞膜的大分子进入细胞的技术。电穿孔是直接应用于细胞试验和基因治疗的广泛使用并且强烈推荐的方法。如果施加强的电场，则细胞膜暂时变成多孔的，对外来物质表现出渗透性。
所述的电通透作用（electropermeabilization）取决于多种因素，例如脉冲宽度、脉冲持续时间、脉冲数量和其它试验条件。为了理解电穿孔的机理并加强转染效果，很多研究者对于上述参数进行了多方面的研究。据报导，电场强度对于穿透细胞膜并控制传染发生的细胞区域的范围，是起到决定性参数的作用。当然，对其它参数的研究也取得进步。但是，对细胞相对电脉冲的响应以及转染的机理知道很少。由于对电穿孔理论的缺乏和不足，清楚地看见电穿孔已经成为一项重要事情。
参看图1，为了将电场作用于细胞悬浮液和基因的混合物，通常使用装有两个平行电极板200的试管。如果对电极板200施加强电场，可以使基因进入细胞。一次性试管使用铝电极。
但是，据报导，从铝电极溶解的Al3+离子对细胞有不利影响。此外，如果使用铝电极，由于电极氧化层之间的电压下降会使电场强度改变。因此，优选地使用铂电极或金电极。但是，这些材料的电极很贵，因此实际上难以使用这些材料的电极作为一次或几次使用后丢弃的试管的电极。图2是代表传统电穿孔装置的方波电穿孔装置（ECM830，BTX，USA）的照片。
但是，所示的电穿孔装置具有以下缺点，首先，试管太贵，因为使用铝块作为电极。电穿孔装置的制造商推荐试管使用一次，但是，很多用户反复多次进行试验，因此出现试验误差的几率高。其次，因为电极材料（Al）在溶液中是反应的，并且相对产生氢的超电势（overpotential）低，因此由于水在电极表面分解所述电极容易生成气泡。第三，产生的离子（Al3+）对细胞具有不利作用。第四，由于生成氧化层（Al2O3），表面电阻明显增大。第五，电场不均匀。这是因为大量电流流过电极的角，从而形成电场扭曲。第六，样本体积变大，使其不适合分析少量细胞。第七，样本装入和倒出试管需要多个步骤的样品处理。第八，因为不容易将试管处理过程集成到自动化系统中，所以不可能进行高通量的电穿孔。第九，水在电极表面的分解引起严重的pH值变化，这对细胞有害。因此，对开发克服上述不足的新电穿孔装置的需求上升。
为了解决上述问题，本发明的发明人已经使用了具有不导电材料的长中空样本填充件的电穿孔装置，其中对样本填充件的两个末端施加电脉冲，从而电流流过填充在样本填充件中的样本。本发明的发明人已经使用这种电穿孔仪并进行电穿孔，并将其生物学结果与传统电穿孔法对比，以完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用长中空样本填充件的电穿孔法。
本发明的另一个目的是提供一种电穿孔装置。
本发明的再一个目的是提供一种电穿孔系统。
本发明涉及一种电穿孔法，其中通过对样本施加电场使细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞。更具体地，本发明涉及一种电穿孔法、一种电穿孔装置和一种电穿孔系统，其中使用不导电材料的长中空样本填充件执行电穿孔，并通过从电极两个末端由电极施加电脉冲，使样本填充件内有效地实现电穿孔。
在本发明一个优选实施例中，提供一种电穿孔装置，包括中空样本填充件、贮存器和压力保持装置，压力保持装置连接到样本填充件的一个末端，与该末端流体连通，并提供适当的压力使样本保持在样本填充件中，从而将样本供应到样本填充件。根据本发明的电穿孔装置的构成方式为样本填充件末端和压力保持装置可以直接连接或通过接头（例如，T形接头或Y形接头）连接。
如果压力保持装置通过接头连接到样本填充件，则接头侧面具有用于插入电极的电极插入部分，并且如果样本填充件中填充样本，则插入电极插入部分的电极接触样本。根据本发明的电穿孔装置的压力保持装置可以是泵、注射器或移液管。在使用根据本发明的电穿孔装置进行电穿孔时，通过使用压力保持装置，首先将含有细胞的样本填充到样本填充件中。将电解液注入已经插入电极的贮存器，并连接电穿孔装置的中空样本填充件的末端，使其与贮存器的电解液流体连通。另外，对贮存器的电极以及插入接头的电极施加电脉冲，从而使填充在样本填充件中的样本中的细胞电穿孔。
在本发明的另一个优选实施例中，电穿孔装置根据本发明包括中空样本填充件、贮存器、贮存夹持器和压力保持装置，其构成方式是，压力保持装置是移液管；所述移液管在其主体上形成导电接触；并且处于样本填充件内的可运动电极与活塞配合，并且容易拆卸和安装。可运动电极起到柱塞的功能，将样本注入样本填充件，同时作为通过导电接触电连接样本的电极。移液管尖端包括样本填充件和可运动电极，可运动电极在移液管尖端中往复运动，并直接连接到安装移液管尖端的轴。如果移液管活塞的工作使可运动电极在移液管尖端内部水平运动并且使样本注入样本填充件中，则样本接触可运动电极并电连接到移液管主体的导电接触。在优选实施例中，另一个电极处于贮存器的底部表面，在此处电极接触贮存的电解液或样本，并且该电极可以装到圆柱形贮存夹持器内管并与之分离。贮存夹持器上面具有固定移液管和贮存器的固定部分，通过内管连接到贮存器电极的电极端子。贮存夹持器的构成可以分开成为主体和盖，或者可以按整体方式构成。
如上所述，本发明提供包括电穿孔装置和电脉冲发生器的电穿孔系统。
在根据本发明的电穿孔系统中，如果电脉冲施加到接触贮存器中贮存的电解液或样本的一个电极以及插入接头或与活塞配合工作的另一个电极，则将样本填充件中填充的样本包含的细胞电穿孔。
此外，根据本发明的中空样本填充件可以按通道结构制成。通道是通过结合上板和下板整体形成的，其中通道的两个末端按流体连通方式连接到一对井形的贮存器。如果样本注入一个井中并通过毛细管作用、水头压力或抽吸作用填充在通道中，并且过量的样本填充到另一井，则对通道内的细胞电穿孔的方式是，将一对电极插入相应井中，由此将电场施加到通道中。
优选地，根据本发明的电穿孔方法包括以下步骤：利用压力保持装置、毛细管作用或水头压力将样本填充到样本填充件内；将电穿孔装置的样本填充件的两个末端按流体连通方式连接到贮存器中贮存的样本或电解液中；以及将电极插入每个贮存器并对插入的电极施加电脉冲，将样本填充件中填充的样本的细胞电穿孔。如果样本太少，优选地，在将电极插入贮存器以及将样本电连接到电极之前，将装有样本的贮存器替换为仅装有电解液的贮存器。
优选地，样本填充件和贮存器是不导电材料，从而使用透明塑料或玻璃。因此，聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）、环烯烃共聚物（Cyclicolefin Copolymer，COC）、聚苯乙烯（PS）、聚乙烯（PE）、共聚酯热塑性合成橡胶（Copolyster Thermoplastic Elastomer，TPC）、聚酰亚胺、聚丙烯、硅、玻璃、石英或类似物质用作样本填充件和贮存器的材料，但不限于此。此外，具有上述微通道样本填充件的电穿孔装置，可以容易地与混合、过滤、聚合酶链式反应或毛细管电泳的其它系统集成。
典型的塑料作为中空样本填充件和贮存器的材料具有明显的优点。通过使用这些材料，容易制造根据本发明的微通道装置。此外，这些材料成本合理，透明并且适于活体。如果使用透明塑料，则可以实时观察物质被吸入细胞的过程。结果，可以直观观察到基因转移到活细胞中的过程。
并且，根据本发明的另一种电穿孔方法包括以下步骤：使用压力保持装置，例如注射器或泵，用样本填充该样本填充件内部；将电穿孔装置的样本填充件末端按流体连通方式连接到样本或电解液；通过将一个电极插入贮存器，将另一电极插入用于连接压力保持装置和样本填充件的接头的电极插入部分，并对插入的电极施加电脉冲，将样本填充件中填充的样本的细胞电穿孔。如果样本太少，优选地，在将电极插入贮存器以及接触样本之前，将装有样本的贮存器替换为仅装有电解液的贮存器。
根据本发明的再一个电穿孔方法包括以下步骤：使用移液管型压力保持装置将样本填充到样本填充件内；用电解液填充贮存器并将其插入贮存夹持器；将移液管型压力保持装置插入贮存夹持器并通过固定部分将其固定，并样本填充件的末端按流体连通方式连接到样本或电解液；以及通过对装在贮存器的电极和移液管中的可运动电极施加电脉冲，对样本填充件中填充的样本的细胞电穿孔。如果样本太少，优选地，在将电极插入贮存器以及接触样本之前，将装有样本的贮存器替换为仅装有电解液的贮存器。
此外，通过调节样本的维持和取出以便使中空样本填充件内连续执行，本发明可以连续执行电穿孔。
在根据本发明的电穿孔装置、电穿孔系统或电穿孔方法中，电极可以由任何的导电材料制成，并且优选地使用铂电极、金电极、银电极、铜电极或镀有上述金属的塑料。此外，压力保持装置可以是泵、注射器或移液管。中空样本填充件优选的是毛细管、管或通道。在通道的情况下，优选的是微通道。特别是，样本填充件具有样本填充件纵向长度（L,cm）与水平截面积（A,cm）之比（R,cm-1）在50到10000范围内。
通过容易地测量流过样本填充件的电流，可以电测量与细胞的电穿孔状态有关的信息。根据本发明的电穿孔装置可以有效地用于DNA传递第一步的电穿孔，并能有助于研究电穿孔机理。并且，电穿孔装置可以在基因操作中小型化。
附图说明
图1表示根据传统电穿孔装置装有平行铝电极板的试管；
图2是方波电穿孔装置（ECM830，BTX，USA）的传统电穿孔装置的照片；
图3表示根据本发明电穿孔系统一个实施例的结构；
图4表示根据本发明电穿孔系统一个实施例的结构；
图5表示根据本发明电穿孔装置中圆盘状接头和毛细管之间的连接状态；
图6表示根据本发明电穿孔系统一个实施例的结构；
图7表示根据本发明电穿孔系统另一个实施例的结构；
图8表示根据本发明电穿孔系统再一个实施例的结构；
图9表示用于本发明电穿孔装置的移液管的结构；
图10表示图9移液管的部分放大图；
图11（a）和11（b）表示用于图9移液管的样本填充件和可移动电极；
图12表示用于根据本发明电穿孔装置的贮存器和贮存夹持器的结构；
图13表示根据本发明电穿孔系统一个实施例的结构；
图14表示根据本发明具有通道结构的电穿孔装置的透视图；
图15是图14电穿孔装置的剖视图；
图16、17和18表示根据本发明电穿孔装置的一个实施例；
图19是用本发明的电穿孔装置电穿孔后的细胞显微照片，其中细胞是用明场观察的；
图20是用荧光观察到的、与图19相同区域的细胞的照片；
图21是用现有技术电穿孔装置电穿孔后的细胞显微照片，其中细胞是用明场观察的；
图22是在荧光下观察到的、与图21相同区域的细胞照片；
图23是表示使用本发明的电穿孔装置电穿孔时，样本填充件形状与电穿孔效率之间关系的曲线；
图24到33是表示使用本发明的电穿孔装置电穿孔时，样本填充件形状与电穿孔效率之间关系的显微照片；
图34是表示根据本发明对不同细胞进行电穿孔并通过绿色荧光蛋白（GFP）表达得到转染率（荧光表达的细胞数／存活细胞数）的曲线；
图35是表示图34结果的显微照片；
图36表示通过本发明的电穿孔同时将GFPsiRNA和pEGFP转染到细胞中以及显微镜测得的其GFP表达的结果；
图37表示当使用装有传统Al电极的试管执行电穿孔时施加电脉冲之前（a）和之后（b）的Al电极表面；
图38表示在100微米（μm）宽的微通道中的碘化丙锭（propidium iodide，PI）注射过程；
图39是借助两个微通道的电穿孔通过PI注射的细胞的显微照片，其中两个微通道分别具有100μm（a）和500μm（b）的不同通道宽度；
图40是对比不同通道宽度的PI光散射强度的曲线；
图41表示两个微通道电穿孔之前和之后的细胞尺寸变化，两个微通道分别具有150μm（a）和500μm（b）的不同通道宽度；
图42表示分别在50μm（a）、150μm（b）、200μm（c）和250μm（d）不同通道宽度的微通道中将细胞培养七天得到的结果；
图43（a）是0.75千伏/厘米（kV/cm）电场作用10毫秒（ms）和24小时后通过细胞明场观察到的照片，图43（b）是0.4kV/cm电场作用10ms和24小时后通过重叠细胞明场和荧光观察到的照片；以及43（c）是荧光下观察到的图43(b)细胞的照片。
具体实施方式
下面将参考附图详细说明根据本发明的电穿孔装置、电穿孔系统和电穿孔方法。在所有附图中，为了避免繁琐，不再重复对相似或等价部分或零件的解释。虽然联系某些优选实施例描述了本发明，但应该理解的是，本发明包含的主旨不并限于这些具体的实施例。相反，本发明的主旨包括权利要求精神和范围内包含的替换、修改和等价条款。本发明引用的文件作为参考文献结合在本发明中。
图3表示根据本发明电穿孔系统一个实施例的结构。该电穿孔系统包括：用于产生电脉冲的脉冲发生器100；贮存样本的一对贮存器（reservoir）300；以及样本填充件400，例如其中填充样本的毛细管或管子。这对贮存器300通过样本填充件400连接使流体连通。在这对贮存器300中分别插入连接脉冲发生器100的电极200。通过对电极200施加电场，将填充在样本填充件400中的样本的细胞电穿孔。此时，样本填充件400可以是两个末端都开口，或者仅在任一个末端开口。换句话说，只要样本填充件400适于填充样本并且可以在其两个末端施加电场，样本填充件的任何部分开口都是可以的。
图4表示根据本发明电穿孔系统一个实施例的结构。该电穿孔系统包括：单个贮存器（未图示）；诸如毛细管或管子的中空样本填充件400；以及压力保持装置的注射器600，该注射器连接在样本填充件400的末端，用于保持适当的压力，使样本填充件可以在其内部填充样本。在图4的电穿孔系统中，样本填充件400的末端和压力保持装置600通过T形接头510连接。T形接头510具有电极插入部分512，电极200插入该电极插入部分中以施加电脉冲。向样本填充件400中填充样本，并且电极200接触样本。适配器511将样本填充件400末端连接到接头510，并将接头510连接到压力保持装置600。
图5表示根据本发明的圆盘形接头520和样本填充件400之间的连接状态，其中圆盘形接头520用于在电穿孔装置中连接样本填充件和压力保持装置。图5的圆盘形接头520中具有孔521，样本可以经过这个孔。在圆盘侧面形成电极插入部分512。L形电极220插入电极插入部分512，从而如果在样本填充件400中填充样本，则电极接触样本。
图6表示根据本发明电穿孔系统的一个实施例。该电穿孔系统包括：贮存器300、如图4所示的电穿孔装置，以及用于产生电脉冲的脉冲发生器100。样本包括贮存在贮存器300中的细胞或电解液。电极200插入贮存器300以接触样本。此外，形成连接的方式是，样本填充件400的末端流体地连通贮存器的样本。在执行电穿孔时，泵620控制的注射器600作为压力保持装置，使样本填充件400内部充满样本。此时，在样本填充件400充满样本后，可以用填充电解液的贮存器替换填充样本的贮存器。通过在接触贮存器400中贮存的样本或电解液的电极200和插入接头520的电极之间施加电脉冲，将填充在样本填充件400中的样本的细胞电穿孔。
图7表示本发明电穿孔系统的另一个实施例，其中泵620作为压力保持装置，其连接是与样本填充件的末端流体地相通。因此，样本填充件400通过接头520连接到泵620。
图8表示根据本发明的电穿孔系统的另一个实施例，其中移液管630作为压力保持装置，与样本填充件流体地相通。在此图中，样本填充件400通过接头520连接到移液管630。
图9表示用于根据本发明的电穿孔装置的移液管的结构，其中移液管630作为压力保持装置，与样本填充件流体地相通。图10表示与可运动电极230b和样本填充件440的移液管630连接的局部放大图。样本填充件440直接连接到移液管尖端安装轴631。作为压力保持装置的移液管630在其主体上具有导电接触632，可运动电极230b插入样本填充件并装在移液管中，从而与移液管的活塞634相通，并在样本填充件中往复运动。图11（a）和（b）表示用于移液管的样本填充件440和可运动电极230b。
图12表示用于本发明电穿孔装置的贮存器330和贮存夹持器340的结构。贮存夹持器340在上内管壁形成固定移液管的移液管固定部分640，而且还具有电连接到固定部分640的电极端子250b和在其底部形成的其它电极端子250a。贮存器在其下方装有接触电解液或样本的电极230a。如果移液管630固定在贮存夹持器的移液管固定部分640上，则可运动电极230b、移液管接触632和移液管固定部分640电连接在一起。在执行电穿孔时，用移液管吸取样本并填充到样本填充件440，装有电解液的贮存器330插入贮存夹持器340的内管，移液管固定地插在移液管固定部分640中，使移液管的末端与贮存器的电解液流体地相通，并通过贮存夹持器340的电极端子250a、250b对两个电极230a、230b施加电脉冲，使样本填充件中的细胞电穿孔。在电穿孔之后，将移液管与贮存器和贮存夹持器分离，并按下移液管按钮633，以便容易重新吸取电穿孔的细胞。贮存夹持器340可以制成上盖340a和主体340b之间可分离（见图12），或者可以制成整体。样本填充件可拆卸地连接到移液管尖端安装轴631，从而可以制成一次性的（见图10）。此外，可以使用所述穿孔仪器和电脉冲发生器制成自动电穿孔系统。图13表示根据本发明的电穿孔系统的另一个实施例，其中并行排列有一个或多个电穿孔装置，每个包括连接到注射器型压力保持装置的样本填充件。
图14是根据本发明具有微通道结构的样本填充件和井形贮存器的电穿孔装置的透视图。该电穿孔装置包括由上板350a和下板350b构成的基体，上面形成微通道中空样本填充件和成对的井，所述井与样本填充件的两个末端流体地相通连接。图15是沿图14的线A－A’截取的剖视图。该电穿孔装置在其两侧形成用于插入脉冲发生器电极的一对或多对井（351a-355a,351b-355b），从而对包括细胞的样本施加电脉冲，其中形成微通道（451－455）以连接相应的井（351a-351b,352a-352b,353a-353b,354a-354b,355a-355b）。通过将电极插入井中并施加电脉冲，可以对细胞膜电穿孔，并且使外来物质可以进入细胞。在上述电穿孔装置中，每个通道的通道长度不同。因此即使向脉冲发生器的电极施加相同电压，每个通道的电场强度也是不同的。
电场强度可以通过下面的式1得到：
E=V/L (1)
式中，E是施加的电场强度，
V是电极两端的电压差，以及
L是通道长度。
结果，即使在微通道两端施加相同电压，由于通道长度不同也得到相互不同的电场。
具有微通道样本填充件的上述电穿孔装置可以制成整体，或者可以通过连接玻璃基体或塑料基体制成。在通过连接塑料基体制成电穿孔装置时，优选地，电穿孔装置应包括上基板350a和下基板350b，其中上基板具有形成井的孔，上或下基板形成凹陷的通道。
优选地，根据本发明的电穿孔装置形成的样本填充件的长度为1毫米（mm）－10厘米（cm）。更优选地，样本填充件的长度为1cm－5cm。优选地，如果样本填充件具有通道结构，则其通道的高度为2μm－2mm，其宽度为10μm－10mm。更优选地，通道的高度为20μm－200μm，其宽度为100μm－5mm。根据本发明具有通道结构的电穿孔装置可以通过微型电子机械系统（Micro Electronic Mechanical System，MEMS）技术制造。
图16（a）、（b）、（c）和（d）表示根据本发明的电穿孔装置的各种结构。图16（a）到（c）表示在其两侧形成用于插入脉冲发生器的电极的几对井的结构，并且每对井形成一个通道，通道形成连接多对井的空间并填充样本。特别是，图16（c）表示的电穿孔装置中的井的排列方式是：每对井的距离不同。
图16（d）所示的电穿孔装置在其两侧形成插入脉冲发生器电极的一对井，还形成连接这对井并填充样本的多个通道。
图17所示的电穿孔装置在其两侧形成插入脉冲发生器电极的成对井，并且每对井形成一个通道，其中每个通道的宽度彼此不同。如果样本填充件的每个通道的通道长度不同，则每个通道可以施加不同的电场。
图18(a)和18(b)所示的电穿孔装置是，连接相应井的每个通道的长度和宽度都不同。根据本发明的电穿孔装置是，在相同电场下，与传统电穿孔装置相比，流过很小的电流，因为电流仅流过中空的样本填充件。结果，可以减小功率消耗，并且如果需要，可以为了便携目的制成使用电池作为电源。
下面将说明使用根据本发明的电穿孔装置和电穿孔系统的电穿孔实验和生物学结果。
优选实施例1：使用移液管型电穿孔装置的人胚肾HEK－293细胞株（cell line）的电穿孔实验
1－1细胞制备
HEK－293细胞株（ATCC，CRL－1573）在25平方厘米（cm2）培养瓶中贮存在补充10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的培养基中，在CO2培养箱中培养，并培养到70%汇集（confluency）。接着，移去上述培养基，用磷酸缓冲溶液（PBS）清洗细胞，并胰蛋白酶处理。加入补充FBS的培养基并离心，然后用PBS缓冲溶液清洗细胞，并再次在补充10%FBS的培养基中悬浮，制成细胞样本。
1－2电穿孔
将在1－1中制备的约100微升（μl）HEK－293细胞样本在室温下装入贮存器。在100μl样本中插入5微克（μg）质粒DNA pEGFP（来源：GenBankAccession:U55762;CLONTECH Lab.）作为转染物并混合。将根据本发明的电穿孔装置的样本填充件末端（见图8）插入贮存器中的混合溶液中。使用移液管型压力保持装置在样本填充件内部填充样本，同时样本填充件的末端连接成与贮存器中贮存的混合溶液流体连通。将此贮存器替换为仅含有电解液的贮存器，并将样本填充件的末端浸在含有电解液的贮存器中形成流体连通。另外，设置电场施加条件，例如脉冲电压、脉冲持续时间和脉冲重复频率，等等。在本实验中，电场设置成，施加0.57kV/cm的电场一次，脉冲持续30ms。接着，在上述电场条件下，向插入连接到电穿孔装置外部的接头中的电极以及仅含有电解液的贮存器施加电脉冲。
1－3取出电穿孔的细胞
使用移液管将样本填充件中的样本移到培养盘，并添加培养基。在CO2培养箱中将细胞培养24－48小时。计数细胞数量并测量其转染率。
1-4结果
图19和图20是根据本发明的电穿孔装置插入质粒DNA pEGFP的HEK－293细胞的显微照片。图19是明场（bright field）照片，图20是荧光下观察到的照片。实验的结果是，如照片所示，转染率（荧光表达的细胞数／存活细胞数）在90到95%范围内，并且细胞的存活率超过90%。图21和图22是使用图1所示的传统电穿孔装置在相同条件下得到的实验结果的显微照片，其中HEK－293细胞转染了质粒DNA pEGFP。图21是明场照片，图22是荧光下观察到的照片。实验结果是，转染率约50%，观察到的细胞存活率小于本发明。需要注意的是，经常在现有技术中观察到的死细胞或生长很少的细胞（图21中的圆形细胞）在本发明结果中大大减少（图19和图20）。因此，可以说，当使用根据本发明的电穿孔装置时，转染率和存活率明显改善。此外，如果使用根据本发明的电穿孔装置，容易取回渗入特殊物质的细胞。
1－5基于样本填充件几何结构变化的影响分析
将1－1中制备的约100μl HEK－293细胞样本倒入室温的贮存器。将5μg质粒DNA pEGFP作为转染物加入100μl样本并混合，并且使用图8的电穿孔装置进行实验。用移液管型压力保持装置吸取样本，并将该贮存器替换为仅含有电解液的贮存器。将样本填充件的末端浸入含有电解液的贮存器形成流体连通。电场条件的设置方式是，425V/cm的电场施加三次，脉冲持续时间10ms。在这样的方式下执行穿孔，毛细管样本填充件固定成截面直径0.135cm，而末端之间的长度从0.4cm变到4cm。表1表示几何条件和实验条件。
表1
| L(cm) | D(cm) | A(cm2) | R(cm-1) | 电压 | 细胞计数 | 转染率 |
| 4 | 0.135 | 0.014307 | 279.6 | 2500 | 160/163 | 98.0 |
| 3.6 | 0.135 | 0.014307 | 251.6 | 2250 | 138/142 | 97.0 |
| 3.2 | 0.135 | 0.014307 | 223.7 | 2000 | 122/127 | 96.0 |
| 2.8 | 0.135 | 0.014307 | 195.7 | 1750 | 158/165 | 96.0 |
| 2.4 | 0.135 | 0.014307 | 167.8 | 1500 | 117/124 | 94.0 |
| 2 | 0.135 | 0.014307 | 139.8 | 1250 | 107/117 | 91.0 |
| 1.6 | 0.135 | 0.014307 | 111.8 | 1000 | 104/117 | 89.0 |
| 1.2 | 0.135 | 0.014307 | 83.9 | 750 | 46/63 | 73.0 |
| 0.8 | 0.135 | 0.014307 | 55.9 | 500 | 43/62 | 69.0 |
| 0.4 | 0.135 | 0.014307 | 28.0 | 250 | 18/68 | 26.0 |
在上面的表中，L表示样本填充件的纵向长度（cm），D表示截面直径（cm），A表示截面面积（cm2），并且R(cm-1)=L/A。
在上述条件下电穿孔之后，将样本填充件中的样本移到培养盘并培养24小时。数出细胞数并测量转染率。图22表示其结果。
图23表示当R小于50时转染率大大减小的曲线。图24到图33是用根据本发明的电穿孔装置插入质粒DNA pEGFP的HEK－293细胞的显微照片。每幅图左侧是明场观察到的照片，右侧是荧光下观察到的照片。
1－6使用不同细胞线的电穿孔实验
在相同条件下对不同细胞株进行电穿孔。实验结果如图34所示，表2所示的所有细胞通过本发明的电穿孔装置都表现出优秀的转染率。图34表示以图表给出的转染率，图35表示相对GFP表达的显微照片结果。
表2
1－7siRNA转染
使用中国仓鼠卵巢CHO细胞株（ATCC:CRL-9618）、HeLa细胞株（ATCC，CCL-2）和人卵巢腺瘤SK-OV-3细胞株（ATCC:HTB-77）进行实验。按照与1－1到1－4相同的方式进行电穿孔观察GFP表达，但0.25纳摩尔（nmol）GFP siRNA（Ambion,No.4626,USA）和5μg pEGFP作为转染物与100μl样本混合。如图36所示，当使用GFP siRNA和pEGFP混合溶液作为转染物时几乎未观察到GFP表达，这表明pEGFP和siRNA都在细胞内有效传播，从而GFP表达被细胞内的siRNA阻止。
优选实施例2：使用通道结构的电穿孔装置对SK-OV-3进行电穿孔实验
2－1制造微通道结构
在优选实施例2中，使用具有微通道结构的样本填充件的电穿孔装置进行生物实验。通过诸如模制之类的方法制造电穿孔装置，该装置具有插入电极的井以及用于连接井的中空样本填充件的通道。制造不同的通道结构的样本填充件，通道的高度20μm，长度2cm，宽度100到500μm。但是，明显地，通道图案是通过使用光掩模的照片平版印刷法形成的。例如，首先，在硅晶片上旋转涂覆负性光刻胶（SU-8,MicroChem,Massachusetts,USA），形成20μm厚的母模（mold master）。通过掩模对准器（MA-6,Karl Suss GmbH,Germany）执行软烘烤，在SU－8涂覆的硅晶片上形成掩模图案。将SU－8图案曝光，并执行曝光后烘烤，显影和硬烘烤过程。然后，将PDMS和固化剂的混合物（Sylgard 184,DOW Corning Co.,USA）倒入图案。固化条件为90℃30分钟。将25W氧气等离子处理的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）层结合到玻璃基体上，形成微通道。
2－2细胞制备和培养
使用供应热灭活的胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS,Sigma）、青霉素（100单位／ml）、链霉素（100μg/ml）和L-谷酰胺（4mM）的DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s Medium），在温度37℃、湿度5%的CO2培养箱中培养SK-OV-3细胞（ATCC，HTB-77）。使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）从25cm2组织培养瓶中分离细胞。将最终细胞悬液浓度调节到1×107细胞／ml。施加脉冲后的细胞存活率作为生存能力的直接证据。在施加电脉冲之前，将碘化丙啶（propidium iodide，PI）加入细胞培养基。PI是常规使用的荧光标记。PI是活细胞中细胞膜进入的指示剂，并且插入核酸中。如果细胞膜是可渗透的，则PI进入细胞，并与核酸结合发出红色荧光。由于红色荧光的强度取决于与核酸结合的PI量，因此可以进行定量分析。在本实验中，将1.0毫克/毫升（mg/ml）PI按1:20（体积/体积，v/v）比例加入细胞培养基。
由于从水母Aequorea victoria中提取的绿荧光蛋白（green fluorescentprotein，GFP）具有较高可视性并发出有效的内荧光团，因此它广泛应用于生物化学和细胞生物学领域。GFP作为细胞和器官中蛋白质示踪的基本表达标记。在本实验中，质粒分离试剂盒（Promega,USA）用于提取和提纯pEGFP-NI质粒，用于结肠炎细菌E.coli传递GFP。通过电泳在琼脂糖凝胶上检验提取的质粒DNA。质粒的浓度是用分光光度计测量260纳米（nm）的吸光度确定的。在施加脉冲之前，质粒pEGFP-NI应用于浓度0.1微克/微升（μg/μl）的样本。报告基因表达用于评价成功的转染。为了检查所述表达，将暴露于电脉冲的细胞进行培养。在施加脉冲后，将通道结构的电穿孔装置浸入DMEM培养基中，并在EGFP表达检查之前置于培养器中24小时。为了进行细胞培养，除了氧气等离子（O2 plasma）外，不对微通道装置进行任何前处理。
2－3电穿孔
电穿孔系统包括上述2－1中具有通道结构样本填充件的电穿孔装置，国产高压脉冲发生器、Pt电极和电极夹持器。
将上述2－2中制备的细胞样本输入一个井中，通过毛细管力或水头压作用使通道型样本填充件充满细胞样本或使过量的样本充入其他井中，或通过抽吸（pumping）使井和样本填充件充入。通过将电极夹持器固定在显微镜上，在施加电脉冲下可以观察电渗透过程。将高压脉冲发生器通过模拟输出板（COMI-CP301,Comizoa,韩国）连接到计算机，并通过LabVIEW ver 6.1（National Instrument,USA）程序控制。为了验证根据本发明的电穿孔装置的性能，将我们的实验结果与方波电穿孔装置（ECM830,BTX,USA,见图2）和装有平行铝电极的2毫米（mm）间隙的试管（见图1）的结果进行对比。为了分析相同电场（1kV/cm）下所述两个系统的性能，对试管施加电压200V，对本发明的微通道装置施加电压2kV。通道宽度变化为100μm、200μm、300μm、400μm和500μm，并对这5种情况使用PI进行实验。对于GFP转染和表达，在从0.75kV/cm到0.25kV/cm的不同脉冲条件下进行10ms实验。为了观察PI吸收，使用装有100W汞灯和ⅹ20物镜（0.4数值孔径(NA)）（LX790，Olympus,USA）的反相荧光显微镜。用530±20nm带通滤光器光学地过滤光线，用590nm长通（long pass）滤光器过滤从电穿孔细胞诱发的荧光。使用12位CCD摄像机（PCO，Kelheim,德国）在15帧／秒的速率得到分辨率640ⅹ480像素的图像。所有情况的曝光时间为10ms。为了观察关于细胞生存能力和GFP转染的荧光，用475±5nm带通滤光器过滤激发的光，并用520nm长通滤光器过滤诱发的荧光。使用彩色3IT CCD摄像机（AW-E300,Panasonic,USA）得到分辨率640ⅹ480像素的图像。
2－4结果
当使用Al电极（见图1）对试管中施加电脉冲时，在电极表面电化学产生气泡，形成两层液体和气体相。图37表示在使用装有传统Al电极的试管进行电穿孔时，施加电脉冲之前（a）和之后（b）的Al电极表面。图37(b)表示在电极表面形成气泡。气泡生成非常快并产生复杂的液体运动。所述气泡运动与施加脉冲过程中的电泳一起导致大部分培养基和细胞的不均匀状态。此外，铝是容易形成氧化层（Al2O3）的材料，氧化层起到高电阻层作用。在根据本发明的电穿孔装置中，未发现气泡形成或复杂的培养基运动，这表明仅在两个末端安装的电极以及本发明中使用的电极材料（Pt）的化学稳定性阻止气泡形成直接影响样本。结果，虽然其中生成气泡的试管中的大部分培养基运动强烈，但因为其气泡影响很小，具有本发明通道结构的电穿孔装置中的培养基可以保持在稳定状态下。根据本发明的微通道结构的优点是明显的，并且没有电极的可见影响，这种电穿孔的机理可以使用显微镜和类似方法进行直观研究。
2－5插入率（intercalation）和电渗透率过程(electro-permeability process)检查
在将脉冲施加到本发明具有微通道样本填充件的穿孔装置之后，观察到通道内在毫秒（ms）单位过程中的局部PI进入。如果相同范围的电场作用于常规系统，则在微通道内在几乎所有细胞内检查到PI渗透率过程。图38表示100μm宽的微通道的PI注入过程。在刚施加脉冲之后，仅从正极方向注入PI。随着时间过去，荧光消散到所有细胞内部（c到d），并且在10秒后，核酸开始发出荧光（e到h）。观察直接反映了与核酸有关的PI特性。因为这提供了有关基本细胞过程的重要信息，实时观察单个活细胞的功能非常有优势。例如，通过检测荧光共振能量传递（fluorescence resonance energytransfer，FRET），可以观察到细胞质中的oligo DNA对与c-fos mRNA结合。因为这是实时直接观察到的，因此本发明的微通道装置非常有用。
2－6基于在具有微通道样本填充件的电穿孔装置中通道宽度变化的电穿孔影响
在电穿孔装置中，观察到相对染料吸收的荧光强度根据通道宽度而不同。如果施加相同电脉冲，相对细胞区的灰度单位强度随通道宽度增大而减小。图39是在施加30秒脉冲之后，分别在不同通道宽度100μm（a）和500μm（b）的两个微通道中通过电穿孔将PI注入细胞的显微照片，其中电场是1kV/cm，脉冲持续时间10ms。可以确认，在窄通道宽度（100μm）的微通道中的细胞PI吸收远大于较宽通道宽度（500μm）的微通道中的细胞。为了对比不同通道宽度的5个微通道的PI吸收，在实验过程中以15帧/秒拍摄图像。每50帧进行图像处理。通过使用图形软件（Pait Shop Pro 7.0,Jasc Software,USA）和MATLAB程序（MathWorks,Inc.,USA），从细胞区的灰度单位中减去作为背底的灰度单位平均强度。相对PI强度的对比数据表示在图40中。应该注意的是，通道宽度影响PI吸收。因为在基于试管的系统中除了电极间隙外的几何参数并未得到严重关注，因此微通道样本填充件中的所述现象应予以特殊注意。电脉冲对细胞的影响在明场下分析。明场分析法是在150μm和500μm宽度的两个条件下进行的。脉冲条件与其它实验的相同（在1kV/cm电场下10ms）。在施加脉冲之后，拍摄暴露在电脉冲下的图像25秒。细胞暴露在电脉冲下立即膨胀。图41表示两个微通道电穿孔之前和之后的细胞尺寸变化，每个微通道分别具有不同通道宽度150μm（a）和500μm（b）。通过使用AutoCAD2002（Autodesk,Inc.,USA），测量细胞直径增大，并计算相对施加脉冲之前的直径的增大率。虽然150μm通道宽度的细胞直径增大了约23%，但500μm通道宽度的细胞直径增大了约10%。通道宽度的所述差异可能来自于不同程度的电穿孔。从这些结果可以确认，应该考虑微通道样本填充件电穿孔过程中诸如通道宽度或高度的通道截面的几何形状。
2－7在PDMS通道样本填充件中的细胞培养
PDMS由于其生物相容性和渗透性，是一种适合于通道装置的细胞培养系统。因为通常在EGFP转染实验的电穿孔之后的细胞中表达需要24小时，所以在根据本发明的通道样本填充件的EGFP转染实验中需要具有细胞培养功能。对通道样本填充件是否用于细胞培养的贮存器进行检查。细胞可以注入通道中，并且整个PDMS通道装置浸在细胞培养基（DMEM）中，并在培养器中贮存7天。图42表示其培养结果。在PDMS通道装置中仅进行O2等离子过程，将PDMS结合到玻璃上。7天后，作为对通道末端的井和细胞的观察结果，应该注意到，细胞很好地分散在底部表面并保持优秀的状态。50μm通道宽度的中央通道的细胞仍存活，但其状态不好（见图42(a)）。看起来缺少新鲜培养基和CO2，并且通道宽度相对通道长度窄造成的狭窄物理空间，对细胞培养有不利影响。图42(b)、(c)和(d)也表示分别在150μm、200μm和250μm不同通道宽度的微通道中将细胞培养7天得到的结果。可以注意到，细胞在较宽的微通道中附着、分散并成功运动。作为上述实验的结果，可以确认，在根据本发明的电穿孔装置中可以进行细胞培养。这表明，在长时间研究不同细胞时，实时可视化功能提供很多优点。此外，通过使用纳米尺寸量子点半导体，预计可以使用本发明的电穿孔装置在长时间内同时跟踪活细胞内的多种蛋白质路线。
2－8在SK-OV-3细胞中的EGFP表达
通过广泛用作基因表达标记的EGFP进行生物学实验。首先，施加1.5kV的电脉冲感应0.75kV/cm的电场10ms。在使用目前的标记BTX电穿孔装置感染SK-OV-3细胞时，这是一个适合的条件。所述电场条件对于在通道结构的样本填充件中的细胞太苛刻。在24小时后检查细胞，并且其结果表示在图43（a）。可以注意到，细胞在底部表面的分散未处于优秀状态。未检测到荧光。对于目前标记电穿孔装置足够的电场，用于本发明通道结构电穿孔装置时太强，因此本发明中的电场在0.25kV/cm到0.75kV/cm范围内变化。其结果是，在0.4kV/cm到0.5kV/cm范围内成功感染细胞，并且可以确认绿荧光已经表达。最优选的是条件是0.4kV/cm。图43（b）和（c）表示其结果。从此结果可以证明，根据本发明的电穿孔装置的电穿孔能量效率远远高于使用试管型电穿孔装置的能量效率。
如上所述，使用本发明的相同电穿孔装置可以实时观察注入过程。在根据本发明方法的电穿孔中，气泡的产生以及细胞培养基和细胞的复杂运动均未发现。与试管不同，长、薄和中空的样本填充件由于其几何结构限制了电流方向，因此在整个样本填充件中形成均匀的电场。所述样本填充件中的均匀环境增强了细胞中的物质吸收率。
工业适用性
如上所述，使用本发明的电穿孔装置可以容易地对细胞电穿孔。此外，由于细胞是在毛细管、包括管或微通道的管道中电穿孔的，因此可以有效地取回并使用电穿孔的细胞。薄、长和中空结构的样本填充件使电流仅流过窄的管道，从而与传统的宽而短的试管相比，可以在此样本填充件中得到均匀的电场。因此，可以减少实验条件导致的误差。本发明的电穿孔装置具有可以安装和可以拆卸的电极和样本填充件，从而允许永久使用性能优异的铂电极，或者便宜的一次性电极，使可以在一次使用后方便地丢弃样本填充件。当使用性能优异的电极时，可以减少由于水分解产生的氧气或金属离子形成。此外，样本损失很少。另外，可以仅用少量样本进行实验，因为可以将少量样本填充到样本填充件并从其中取回，并且经过电穿孔取回。此外，通过适当控制压力保持装置，大量样本可以自动实验；并且通过使用并行的多个电穿孔装置，可以容易地建立最佳实验条件，从而同时处理几个样本。
Claims (8)
1.一种电穿孔系统，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞，该系统包括：
电穿孔装置；以及
用于产生电脉冲的脉冲发生器，
其中，所述电穿孔装置还包括：不导电材料的长中空样本填充件，所述样本填充件的长度为1mm-10cm，所述样本填充件是两个末端开口的管；贮存器，所述贮存器连接成与样本填充件的一个末端流体连通；以及压力保持装置，所述压力保持装置通过具有电极插入部分的接头连接到中空样本填充件的另一末端以形成流体连通，
所述贮存器具有接触样本或电解液的电极，样本填充件通过压力保持装置充满样本，填充在贮存器中的样本或电解液连接到样本填充件末端形成流体连通，并且将一个电脉冲或多个电脉冲施加到与填充在贮存器中的样本或电解液接触的一个电极以及插入到接头的电极插入部分的另一个电极上，从而将样本填充件中填充的样本中的细胞实施电穿孔。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述中空样本填充件是毛细管。
3.根据权利要求1所述的系统，其中，并行排列有两个以上的电穿孔装置。
4.一种电穿孔系统，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞，该系统包括：
电穿孔装置；以及
用于产生电脉冲的脉冲发生器，
其中，所述电穿孔装置还包括：不导电材料的长中空样本填充件，所述样本填充件的长度为1mm-10cm，所述样本填充件是两个末端开口的管；压力保持装置，所述压力保持装置连接到中空样本填充件的一个末端形成流体连通；贮存器，其连接到样本填充件的另一个末端形成流体连通，并具有接触样本或电解液的电极；以及贮存夹持器，所述贮存夹持器装有用于固定压力保持装置的固定部分、电连接到固定部分的电极端子以及电连接到装在贮存器上的电极的电极端子，
其中，所述压力保持装置为在其部分主体上具有导电接触的移液管，并且插入置于样本填充件内的可运动电极以与活塞连通；以及
其中，中空样本填充件直接装在移液管尖端安装轴上并可以分离，可运动电极通过移液管的按钮上升或下降到样本填充件末端，以使样本填充到样本填充件或将其取回，移液管插入并固定在贮存夹持器内管，移液管主体的接触通过贮存夹持器内管的固定部分电连接到电极端子，定位样本填充件使得与贮存器中贮存的样本或电解液流体连通，并且将一个电脉冲或多个电脉冲施加到与贮存器中贮存的样本或电解液接触的电极上，从而将填充在样本填充件中的样本中的细胞实施电穿孔。
5.根据权利要求4所述的系统，其中，可运动电极是表面涂覆有导电材料的塑料件。
6.一种电穿孔系统，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞，该系统包括：
电穿孔装置；以及
用于产生电脉冲的脉冲发生器，
其中，所述电穿孔装置还包括：不导电材料的长中空样本填充件，所述样本填充件的长度为1mm-10cm，所述样本填充件由一个微通道或多个微通道制成；在形成有中空样本填充件的基板上形成的一对井，所述井连接到样本填充件的两个末端形成流体连通；以及将脉冲发生器的一个电脉冲或多个电脉冲施加到样本上的电极，以及
其中，电极插在所述井中，对所述井施加电脉冲，从而将样本填充件中的细胞实施电穿孔。
7.一种电穿孔系统，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞，该系统包括：
电穿孔装置；以及
用于产生电脉冲的脉冲发生器，
其中，所述电穿孔装置还包括：不导电材料的长中空样本填充件，所述样本填充件的长度为1mm-10cm，所述样本填充件是两个末端开口的管；一对贮存器，与样本填充件两个末端连接以形成流体连通；以及
贮存器具有与样本或电解液接触的电极，一个电脉冲或多个电脉冲被施加到与贮存器中贮存的样本或电解液接触的电极上，从而将填充在样本填充件中的样本中的细胞实施电穿孔。
8.一种电穿孔装置，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞，该装置包括：
不导电材料的长中空样本填充件，所述样本填充件的长度为1mm-10cm，所述样本填充件是两个末端开口的管；连接到样本填充件的一个末端以形成流体连通的贮存器；以及通过接头连接到样本填充件的另一个末端以形成流体连通的压力保持装置，
其中，所述接头具有用于插入电极的电极插入部分且电极插入其中；所述贮存器具有接触贮存器中样本或电解液的电极。
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