CN111386334A - 包括流通式电穿孔设备的自动化细胞处理方法、模块、仪器和系统 - Google Patents

包括流通式电穿孔设备的自动化细胞处理方法、模块、仪器和系统 Download PDF

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Abstract

在说明性实施例中，提供了包括一个或更多个流通式电穿孔设备或模块的自动化多模块细胞编辑仪器以使在活细胞中的基因组编辑自动化。

Description

包括流通式电穿孔设备的自动化细胞处理方法、模块、仪器和 系统
相关申请
本国际PCT申请要求下列申请的优先权：2017年9月30日提交的标题为“Electroporation Device”的美国专利申请序列号62/566,374；2017年9月30日提交的标题为“Electroporation Device”的美国专利申请序列号62/566,375；2017年10月2日提交的标题为“Introduction of Exogenous Materials into Cells”的美国专利申请序列号62/566,688；2017年10月3日提交的标题为“Automated Nucleic Acid Assembly andIntroduction of Nucleic Acids into Cells”的美国专利申请序列号62/567,697；2018年1月22日提交的标题为“Automated Filtration and Manipulation of Viable Cells”的美国专利申请序列号62/620,370；2018年3月29日提交的标题为“Automated Control ofCell Growth Rates for Induction and Transformation”的美国专利申请序列号62/649,731；2018年5月14日提交的标题为“Automated Control of Cell Growth Rates forInduction and Transformation”的美国专利申请序列号62/671,385；2018年3月26日提交的标题为“Genomic Editing in Automated Systems”的美国专利申请序列号62/648,130；2018年4月13日提交的标题为“Combination Reagent Cartridge and ElectroporationDevice”的美国专利申请序列号62/657,651；2018年4月13日提交的标题为“AutomatedCell Processing Systems Comprising Cartridges”的美国专利申请序列号62/657,654；以及2018年6月23日提交的标题为“Nucleic Acid Purification Protocol for Use inAutomated Cell Processing Systems”的美国专利申请序列号62/689,068。所有上面识别的申请为了所有目的特此通过引用被全部并入。
背景
在下面的讨论中，将为了背景和介绍性目的而描述某些文章(articles)和方法。本文包含的任何内容不应被解释为现有技术的“承认”。申请人明确地保留下面的权利：在适当的情况下证明在本文提及的文章和方法在适用的法定条文下不构成现有技术。
用工程核酸酶进行基因组编辑是一种在活生物体的基因组中做出对核酸的变化的方法。某些核酸酶在基因组中的靶区处产生位点特异性双链断裂，其可以通过非同源末端连接或同源重组来修复，导致靶向编辑。然而，由于对细胞转化、生长测量和细胞选择的低效率和挑战，这些方法与自动化不兼容。此外，传统的台式设备不一定按比例调整和很好地集成到自动化的模块化仪器或系统中。因此，创建已编辑细胞群体的方法和仪器——包括用于自动化细胞转化的方法和仪器——依然是麻烦的，并且使用递归技术引入多轮编辑的挑战限制了可以被创建的细胞群体的性质和复杂性。
因此，存在对用于以自动化方式将组装的核酸和其他生物分子引入到活细胞内的自动化仪器、系统和方法的需要，其中已编辑细胞可用于在自动化仪器之外的进一步实验。
例证性实施例的概述
在某些实施例中，自动化模块、仪器、系统和方法用于在多个细胞中的一个或更多个靶基因组区域的核酸酶导向基因组编辑，所述方法在自动化多模块细胞编辑仪器中被执行。这些方法可用于生成具有期望基因组变化的感兴趣的活细胞的文库。使用本文所述的自动化多模块细胞编辑仪器执行的自动化方法可以采用多种核酸酶导向基因组编辑技术，并且可以在有或没有一种或更多种可选择的标记物的使用的情况下被使用。
因此，在选定的实施例中，本公开提供了用于自动化多模块细胞编辑(包括核酸酶导向基因组编辑)的模块、仪器和系统。特别是，仪器和系统包括用于转化待编辑的细胞的流通式电穿孔(FTEP)设备。本公开的自动化多模块细胞编辑仪器的其他特定实施例被设计成用于递归基因组编辑，例如通过两个或更多个编辑操作来将多个编辑顺序地引入到在细胞群体的一个或更多个细胞内部的基因组中。
因此，本文提供了自动化多模块细胞编辑仪器的实施例，自动化多模块细胞编辑仪器包括：被配置为包含所有或一些模块的壳体；被配置成接收细胞的容器(receptacle)；被配置成接收核酸的一个或更多个容器；被配置为将核酸引入到细胞内的转化模块，其中转化模块包括一个或更多个FTEP设备；被配置为允许细胞在转化模块中的细胞转化之后恢复的恢复模块；被配置为允许转化到细胞中的核酸编辑细胞中的核酸的编辑模块；以及被配置为基于用户输入和/或适当控制器脚本的选择来操作自动化多模块细胞编辑仪器的处理器。
在一些实施例中，自动化多模块细胞编辑仪器包括用于将外源性物质引入到流体中的细胞的流通式电穿孔(FTEP)设备，其中FTEP设备包括：用于将包括细胞和外源性物质的流体引入到FTEP设备内的一个或更多个入口和入口通道；用于从FTEP设备移除包括转化的细胞和外源性物质的流体的出口和出口通道；与第一入口通道和出口通道相交并定位在第一入口通道和出口通道之间的流动通道，其中流动通道在第一入口通道和流动通道的中心之间以及在出口通道和流动通道的中心之间在宽度上减小；以及位于在流动通道与第一入口通道的交点和流动通道与出口通道的交点之间的流动通道中的两个或更多个电极，其中电极与在流动通道中的流体处于流体连通，但不在流动通道中的细胞的直接流动路径中，并且其中当流体中的细胞穿过流动通道时，电极将一个或更多个电脉冲施加到细胞，从而将外源性物质引入到流体中的细胞内。
在该实施例的一些方面中，在FTEP设备中的两个电极定位成相隔从0.5mm至10mm，或者相隔从1mm至8mm，或者相隔从3mm至7mm，或者相隔从4mm至6mm。
在其他实施例中，自动化多模块细胞编辑仪器包括用于将外源性物质引入到流体中的细胞内的流通式电穿孔(FTEP)设备，其中FTEP设备包括：用于将包括细胞和外源性物质的流体引入到FTEP设备的至少一个入口和至少一个入口通道；用于从FTEP设备移除转化的细胞和外源性物质的出口和出口通道；在第一入口通道和出口通道之间定位的流动通道，其中流动通道与第一入口通道和出口通道相交，并且其中流动通道的一部分在入口通道交点和出口通道交点之间变窄；以及位于流动通道的任一侧上并与流动通道中的流体直接接触的电极，电极限定流动通道的狭窄部分；并且其中当流体中的细胞穿过流动通道时，电极将一个或更多个电脉冲施加到细胞，从而将外源性物质引入到流体中的细胞内。
在该实施例的一些方面中，电极位于流动通道的任一侧上，与流动通道中的流体直接接触，并限定流动通道的宽度的减小。在这个方面的一些配置中，电极相隔10μm至5mm之间，或相隔25μm至2mm之间。
在这些实施例的一些方面中，FTEP设备在长度上在3cm至15cm之间，或者在长度上在4cm至12cm之间，或者在长度上从4.5cm至10cm，或者在长度上从5cm至8cm。在这些实施例的一些方面中，FTEP设备的这个实施例在宽度上在0.5cm至5cm之间，或者在宽度上从0.75cm至3cm，或者在宽度上从1cm至2.5cm，或者在宽度上从1cm至1.5cm。在这些实施例的一些方面中，在FTEP设备中的通道宽度的最窄部分从10μM到5mm，使得将被转化的任何细胞类型都将不被FTEP设备的特征物理地扭曲或“挤压”。
此外在这些实施例的一些方面中，FTEP的流速范围从每分钟0.1ml至5ml，或从每分钟0.5ml至3ml，或从每分钟1ml至2.5ml。在这些实施例的一些方面中，电极被配置为输送1-25Kv/cm或10-20Kv/cm。
在这些实施例的一些方面中，FTEP设备还包括在一个或更多个入口通道和出口通道之间的一个或更多个过滤器。在一些方面中，有两个过滤器，一个在入口通道和流动通道的狭窄部分之间，以及一个在流动通道的狭窄部分和出口通道之间。在这些实施例的一些方面中，过滤器在孔尺寸上是渐变的，较大的孔靠近入口室或出口室以及较小的孔靠近流动通道的狭窄部分。在一些方面中，小孔具有流动通道的狭窄部分的尺寸的相同尺寸或大于流动通道的狭窄部分的尺寸。在这些实施例的一些方面中，过滤器与FTEP设备的主体分开地形成，并在它被组装时放置到FTEP设备中。可选地，在这些实施例的一些方面中，过滤器可以被形成为FTEP设备的主体的一部分并且对FTEP设备的主体是不可缺的。
在这些实施例的一些方面中，FTEP设备还包括连接到用于将流体中的细胞引入到FTEP设备内的入口的储器，以及连接到用于从FTEP设备移除转化的细胞的出口的储器，并且在一些方面中，FTEP设备包括两个入口和两个入口通道，并且还包括连接到用于将外源性物质引入到FTEP设备内的第二入口的储器。在一些方面中，FTEP设备包括连接到用于将流体中的细胞和外源性物质都引入到FTEP设备内的入口的储器，以及连接到用于从FTEP设备移除转化的细胞的出口的储器。在这些实施例的一些方面中，耦合到入口和出口的储器在体积上范围从100μL到10ml或者从0.5ml到7ml或者从1ml到5ml。
在这些实施例的一些方面中，FTEP设备可以提供每分钟103至1012个细胞或每分钟104至1010个细胞或每分钟105至109个细胞或每分钟106至108个细胞的细胞转化率。通常，每分钟可转化108个酵母细胞，以及每分钟可转化1010-1011个细菌细胞。在这些实施例的一些方面中，细胞的转化导致至少90％的活细胞或95％的活细胞以及高达99％的活细胞。
在这些实施例的一些方面中，FTEP设备通过从结晶苯乙烯、环烯烃聚合物或环烯烃共聚物注射成型而被制造，并且在该实施例的一些方面中，电极由不锈钢制造。在这些实施例的一些方面中，FTEP设备并行地被制造为在单个基底上的多个FTEP设备，其中FTEP设备然后被分离用于使用。
在自动化多模块细胞处理系统(FTEP是该自动化多模块细胞处理系统的一部分)的一些实施例中，在一个或更多个容器中的核酸包括载体骨架和编辑盒(例如，设计成在细胞中表达时指导核酸酶导向编辑的寡核苷酸)，并且自动化多模块细胞编辑仪器还包括核酸组装模块。在一些方面中，核酸组装模块包括磁体，并且在一些方面中，核酸组装模块被配置为使用单个等温反应来执行核酸组装。在其他方面中，核酸组装模块被配置为执行扩增和/或连接方法。在一些方面中，核酸组装模块还包括用于隔离、洗涤、浓缩、稀释和/或再悬浮组装的核酸的装置。
在FTEP是其一部分的自动化多模块细胞编辑仪器的一些实施例中，编辑模块和恢复模块被组合。
在一些实施例中，包括FTEP的自动化多模块细胞编辑仪器还可以包括被配置为使细胞生长的生长模块，并且在一些实现中，生长模块连续地或每隔一段时间测量生长细胞的光密度。在一些实现中，控制仪器的处理器被配置成调节在生长模块中的生长条件，使得细胞在由用户要求的时间处达到目标光密度。此外，在一些实施例中，可以例如通过自动化多模块细胞编辑仪器的用户界面或者通过与自动化多模块细胞编辑仪器通信的便携式计算设备应用关于生长过程来更新用户。
在一些实施例中，包括FTEP的自动化多模块细胞编辑仪器还包括具有被配置为接收细胞的一个或更多个容器和被配置为接收核酸的一个或更多个容器的试剂盒。在一些实施例中，包括FTEP的自动化多模块细胞编辑仪器还包括具有被配置成接收细胞和核酸的一个或更多个容器的试剂盒。此外，试剂盒还可以包含对于细胞编辑所需的一些或全部试剂。在一些实现中，在试剂盒内包含的试剂通过由处理器读取的脚本是可定位的，并且在一些实现中，试剂盒包括试剂并且在套件中被提供。在一些实施例中，FTEP设备(例如，转化模块)被包含在试剂盒内。
自动化多模块细胞编辑仪器的一些实施例还包括被配置为交换在其中悬浮细胞的液体培养基和/或浓缩细胞的过滤模块。在特定的方面中，过滤系统也可用于使细胞变成电转感受态的。
在其他实施例中，提供了自动化多模块细胞编辑仪器，其中自动化多模块细胞编辑仪器包括被配置为容纳一些或所有模块的壳体；被配置成接收细胞的容器；被配置为接收载体骨架和编辑盒的至少一个容器；核酸组装模块，其被配置为a)组装载体骨架和编辑盒，和b)在组装之后使组装的核酸脱盐；被配置为使细胞生长并测量细胞的光密度(OD)的生长模块；被配置为浓缩细胞并使细胞变成电转感受态的过滤模块；包括FTEP设备以将组装的核酸引入到细胞内的转化模块；被配置为允许细胞在转化模块中电穿孔之后恢复并允许组装的核酸编辑细胞中的核酸的组合恢复和编辑模块；以及被配置为基于用户输入和/或适当控制器脚本的选择来操作自动化多模块细胞编辑仪器的处理器。
在一些实施例中，FTEP设备被提供为试剂盒的一部分，试剂盒还包括多个试剂储器和由用于分配位于多个试剂储器中的试剂并控制流通式电穿孔设备的处理器可读的脚本。
在一些方面中，生长模块包括温度受控的旋转生长小瓶、使小瓶旋转的电机组件、用于测量例如小瓶中的OD的分光光度计以及接受来自用户的输入并控制细胞的生长速率的处理器。生长模块可以连续地或每隔一段时间自动测量在旋转生长小瓶中的生长细胞的OD，并将细胞的生长控制到如由用户指定的目标OD和目标时间。也就是说，本文描述的方法和设备提供反馈回路，其实时地监控细胞生长并实时地调节参数(例如，旋转生长小瓶的温度)以在由用户指定的目标时间达到目标OD。
还提供了使用自动化多模块细胞编辑仪器来在细胞内实现基因组编辑操作的系统。这些系统可选地包括在仪器和其他设备或容器之间用于细胞制备、核酸制备、已编辑细胞群体的选择、已编辑细胞群体的功能分析、已编辑细胞群体的储存和诸如此类的一个或更多个接口。
此外，提供了用于使用包含FTEP设备的自动化多模块细胞编辑仪器的方法。在一些方法中，电转感受态细胞被直接提供到仪器并转移到转化模块。在一些方法中，细胞被转移到生长模块，其中它们生长到期望的光密度。然后细胞从生长小瓶转移到过滤模块，其中它们被浓缩并可选地变成电转感受态的。然后细胞被转移到FTEP设备。
在一些方面中，用于转化的组装核酸被直接提供到仪器，并转移到转化模块。在一些方面中，核酸(例如载体骨架和一个或更多个寡核苷酸编辑盒)与细胞引入或制备同时或顺序地转移至核酸组装模块。在这个方面中，核酸被组装、脱盐(例如，通过液体交换或渗透)，并转移到FTEP设备以被电穿孔到电转感受态细胞中。电穿孔(例如，转化或转染)在FTEP设备中发生，然后转化的细胞被转移到恢复/编辑模块，其可选地包括包含一种或更多种基因组编辑的细胞的选择。在恢复、编辑和/或选择之后，细胞可被取回并直接用于研究或被储存用于进一步研究，或通过在仪器内重复编辑步骤而受到另一轮(或多轮)基因组编辑。
还提供了使用自动化多模块细胞编辑仪器创建的细胞文库，其中该仪器包括：壳体；被配置为接收细胞和一种或更多种合理地设计的核酸的容器，所述核酸包括便于在细胞中的核酸酶导向基因组编辑事件的序列；用于将核酸引入到细胞内的FTEP设备；用于允许核酸酶导向基因组编辑事件在细胞中发生的编辑模块；以及被配置为基于用户输入来操作自动化多模块细胞编辑仪器的处理器，其中由自动化仪器创建的核酸酶导向基因组编辑事件导致包括具有合理地设计的编辑的单独细胞的细胞文库。
在一些方面中，使用本公开的仪器和方法创建的细胞文库包括饱和诱变细胞文库。在一些方面中，使用本公开的仪器和方法创建的细胞文库包括启动子交换细胞文库。在其他方面中，使用本公开的仪器和方法创建的细胞文库包括终止子交换细胞文库。在还有其他方面中，使用本公开的仪器和方法创建的细胞文库包括单核苷酸多态性(SNP)交换细胞文库。在还有其他方面中，使用本公开的仪器和方法创建的细胞文库包括启动子交换细胞文库。在一些实现中，使用本公开的仪器和方法创建的文库包括至少100,000个已编辑细胞，并且在还有其他实现中，使用本公开的仪器和方法创建的文库包括至少1,000,000个已编辑细胞。在一些实现中，核酸酶导向基因组编辑是RGN导向基因组编辑。在优选的方面中，该仪器被配置为使用诱导核酸酶或导向核酸。核酸酶可以是例如化学诱导的、病毒诱导的、光诱导的、温度诱导的或热诱导的。
在涉及递归编辑的一些实施例中，本公开的自动化多模块细胞编辑仪器将两个或更多个基因组编辑引入细胞中，单个基因组编辑对于每个循环被添加到细胞群体的基因组。可选地，本公开的自动化多模块细胞编辑仪器的一些方面对于提供每循环在细胞群体中的每细胞两个或更多个编辑、在细胞群体中的每细胞三个或更多个编辑、在群体中的每细胞五个或更多个编辑或者在单个循环中对细胞群体的每细胞10个或更多个编辑是有用的。在任一情形中，可以执行编辑的一个或更多个顺序循环。
在特定实施例中，自动化多模块细胞编辑仪器能够提供每循环被引入到编辑模块的细胞的至少10％的编辑效率，优选地每循环被引入到编辑模块的细胞的至少20％的编辑效率，更优选地每循环被引入到编辑模块的细胞的至少25％的编辑效率，仍然更优选地每循环被引入到编辑模块自动化多模块细胞编辑仪器的细胞的至少30％的编辑效率，仍然更优选地每循环被引入到编辑模块的细胞的至少40％的编辑效率，以及甚至更优选地每循环被引入到编辑模块的细胞的50％、60％、70％、80％、90％或更多的编辑效率。
下面将更详细地描述其他特征、优点和方面。
附图简述
被合并到本说明书中并构成本说明书的一部分的附图示出一个或更多个实施例，并连同描述一起解释这些实施例。附图不一定按比例绘制。在附随的曲线图和图中所示的任何尺寸仅为了说明目的，且可以或可以不代表实际的或优选的值或尺寸。在可适用的情况下，可以不示出一些或所有特征以帮助描述根本特征。在附图中：
图1A和图1B描绘自动化多模块细胞编辑仪器的示例性实施例的平面图和透视图，自动化多模块细胞编辑仪器用于使用作为仪器的一部分的可更换盒进行多个细胞的多重基因组编辑。
图2A和图2B描绘图1A和图1B的自动化多模块细胞编辑仪器的侧视图和正视图。图2C和图2D描绘自动化多模块细胞编辑仪器的第二示例机箱(chassis)。
图3描绘用于在自动化多模块细胞编辑仪器中使用的示例组合核酸组装模块和纯化模块。
图4A是本公开的FTEP设备的一个实施例的顶视图的图示。图4B是图4A所示的设备的实施例的横截面的顶视图的图示。图4C是图4A和图4B所示的设备的实施例的横截面的侧视图的图示。图4D是本公开的FTEP设备的另一个实施例的顶视图的图示。图4E是图4D所示的设备的实施例的横截面的顶视图的图示。图4F是图4D和图4E所示的设备的实施例的横截面的侧视图的图示。图4G是本公开的FTEP设备的又一实施例的顶视图的图示。图4H是图4G所示的设备的实施例的横截面的顶视图的图示。图4I是图4G和图4H所示的设备的实施例的横截面的侧视图的图示。
图5A是具有对于细胞和外源性物质的单独入口的本文描述的FTEP设备的另一个实施例的横截面的顶视图的图示。图5B是图5A所示的设备的实施例的横截面的顶视图的图示。图5C是图5B所示的设备的实施例的横截面的侧视图的图示。图5D是对图5A和图5B所示的设备的实施例的变形的横截面的侧视图的图示。图5E是对图5C和图5D所示的设备的实施例的另一变形的横截面的侧视图的图示。图5F是本公开的FTEP设备的又一实施例的横截面的顶视图的图示，其中FTEP包括对于细胞和外源性物质的两个单独入口。图5G是图5F所示的设备的实施例的横截面的顶视图的图示。图5H是图5F和图5G所示的设备的实施例的横截面的侧视图的图示。
图6是本公开的FTEP设备的又一另外实施例的横截面的顶视图的图示，在这里包括来自输入通道的流体的流动聚焦。
图7A是本公开的FTEP设备的第一多路复用实施例的横截面的顶视图的图示。图7B是本公开的设备的第二多路复用实施例的横截面的顶视图的图示。图7C是本公开的设备的第三多路复用实施例的横截面的顶视图的图示。图7D是本公开的设备的第四多路复用实施例的横截面的顶视图的图示。图7E是本公开的设备的第五多路复用实施例的横截面的顶视图的图示。
图8A是本公开的FTEP设备的又一另外实施例的顶视图的图示，其中电极被放置在流动通道的狭窄区域的两端上而不是在两侧上，并且限定流动通道的狭窄区域。图8B是图8A所示的设备的实施例的横截面的顶视图的图示。图8C是图8A和图8B所示的设备的实施例的横截面的侧视图的图示。图8D是图8A、图8B和图8C所示的设备的实施例的下半部分的横截面的侧视图的图示。图8E是图8A-8D所示的设备的实施例的变形的横截面的侧视图的图示，其中在这里电极位于FTEP设备的底部上，在离入口和出口的相对表面上。图8F是本公开的FTEP设备的又一实施例的顶视图的图示。图8G是图8F所示的设备的实施例的横截面的顶视图的图示。图8H是图8F和图8G所示的设备的实施例的一个变形的横截面的侧视图的图示。
图8I是本公开的FTEP设备的实施例的顶视图的图示。图8J是图8I所示的设备的实施例的横截面的顶视图的图示，其中在该实施例中FTEP设备包括过滤器。图8K是图8I和图8J所示的设备的实施例的变形的横截面的顶视图的图示。图8L是图8I-8K所示的设备的实施例的横截面的侧视图的图示。图8M是图8I-8L所示的设备的实施例的下半部分的横截面的侧视图的图示。图8N是本公开的FTEP设备的又一实施例的顶视图的图示。图8O是图8N所示的设备的实施例的横截面的顶视图的图示。图8P是图8N-8O所示的本公开的设备的实施例的横截面的侧视图的图示。图8Q是对图8N-8O所示的设备的实施例的变形的横截面的侧视图的图示。图8R是对图8N-8Q所示的设备的实施例的另一变形的横截面的侧视图的图示。
图8S是本公开的FTEP设备的又一实施例的横截面的顶视图的图示。图8T是图8S所示的设备的实施例的横截面的顶视图的图示。图8U是图8S和图8T所示的设备的实施例的横截面的侧视图的图示。
图9A是本公开的FTEP设备的另一个实施例的横截面的侧视图的图示。图9B是图9A所示的设备的实施例的横截面的顶视图的图示。图9C是具有流动聚焦特征的FTEP设备的实施例的横截面的顶视图的图示。
图10A至10C分别是流通式电穿孔设备的顶部透视图、底部透视图和底视图，流通式电穿孔设备可以是独立的FTEP模块的一部分或者作为在自动化多模块细胞处理系统中的一个模块。图10D示出了在图10C中描绘的FTEP单元的扫描电子显微照片。图10E示出了在图10B和图10C中被描绘为黑条的过滤器1070和1502的扫描电子显微照片。图10F描绘(i)在插入到FTEP设备内之前的电极；(ii)电极；以及(iii)被插入到电极通道内的电极，其中电极和电极通道相邻于流动通道。图10G示出了开孔的两种不同配置的两个扫描电子显微照片，在该开孔处电极通道与流动通道交会。
图11A-11B分别描绘用于在自动化多模块细胞编辑仪器中使用的示例洗涤盒的分解图和顶视图。图11C-11E描绘用于在自动化多模块细胞编辑仪器中使用的示例试剂盒。
图12A-12C提供用于在自动化多模块细胞编辑仪器中使用的示例过滤模块的功能框图和两个透视图。图12D是用于在自动化多模块细胞编辑仪器中使用的示例过滤盒的透视图。
图13A-13C描绘用于在自动化多模块细胞编辑仪器中使用的示例细胞生长模块部件。
图14是用于自动化多模块细胞编辑的示例方法的流程图。
图15A是用于通过自动化多模块细胞编辑仪器来进行细菌细胞的自动化编辑的第一示例工作流程的流程图。图15B是用于通过自动化多模块细胞编辑仪器来进行细菌细胞的自动化编辑的第二示例工作流程的流程图。图15C是用于通过自动化多模块细胞编辑仪器来进行酵母细胞的自动化细胞编辑的示例工作流程的流程图。
图16示出了用于向自动化多模块细胞编辑仪器提供指令和从自动化多模块细胞编辑仪器接收反馈的示例图形用户界面。
图17A是用于多个细胞的多重基因组编辑的自动化多模块细胞编辑仪器的另一个示例实施例的功能框图。图17B是用于多个细胞的递归、多重基因组编辑的自动化多模块细胞编辑仪器的又一示例实施例的功能框图。
图18是用于在自动化多模块细胞编辑仪器中使用的示例控制系统。
图19A是显示使用本公开的设备和比较器电穿孔设备对大肠杆菌进行的电穿孔的结果的条形图。图19B是以比较器电穿孔设备作为基准的通过如本文所述的FTEP转化的大肠杆菌细胞的摄取、切割和编辑效率的条形图。
图20是示出使用本公开的FTEP设备和比较器电穿孔方法对酿酒酵母进行的电穿孔的结果的条形图。
图21示出了FTEP流量和压力相对于过去的时间的关系曲线图(顶部)以及压力系统和FTEP的简单描述(底部)。
应当理解，附图不一定是按比例的，并且相似的参考数字指相似的特征。
说明性实施例的详细描述
下面结合附图阐述的描述被规定为是所公开的主题的各种说明性实施例的描述。结合每个说明性实施例来描述特定的特征和功能；然而，对本领域中的技术人员将明显，所公开的实施例可以在没有这些特定特征和功能的情况下被实践。此外，结合一个实施例描述的所有功能被规定为可适用于本文描述的附加实施例，除了在被明确规定的情况下或者在特征或功能与附加实施例不兼容的情况下以外。例如，在给定的特征或功能结合一个实施例被明确描述但没有结合替代实施例被明确提及的情况下，应当理解，该特征或功能可以结合替代实施例被部署、利用或实现，除非该特征或功能与替代实施例不兼容。
除非另外指示，本文描述的技术的实践可以采用在本领域中实践的技术人员的技能内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包含重组技术)、细胞生物学、生物化学和测序技术的常规技术和描述。这样的常规技术包括多核苷酸的合成、组装、杂交和连接以及使用标记进行的杂交的检测。可以通过参考本文的例子来拥有合适的技术的具体说明。然而，当然也可以使用其他等同的常规程序。这样的常规技术和描述可以在如下的标准实验室手册中找到，例如：Green等人,Eds.(1999)，Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I-IV卷)；Weiner、Gabriel、Stephens,Eds.(2007),Genetic Variation:A LaboratoryManual；Dieffenbach,Dveksler,Eds.(2003)，PCR Primer:A Laboratory Manual；Bowtell和Sambrook(2003)，DNA Microarrays:A Molecular Cloning Manual；Mount(2004)，Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis；Sambrook和Russell(2006)，CondensedProtocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual；以及Sambrook和Russell(2002)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(都来自Cold Spring HarborLaboratory Press)；Stryer,L.(1995)Biochemistry(第4版)W.H.Freeman,New YorkN.Y.；Gait，“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”(1984,IRL Press,，伦敦)；Nelson和Cox(2000)，Lehninger,Principles of Biochemistry第3版，W.H.FreemanPub.，纽约，N.Y.；Berg等人(2002)Biochemistry，第5版，W.H.Freeman Pub.，纽约，N.Y.；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,eds.,John Wiley&Sons 1998)；Mammalian Chromosome Engineering-Methodsand Protocols(G.Hadlaczky,ed.,Humana Press 2011)；Essential Stem Cell Methods，(Lanza和Klimanskaya,eds.,Academic Press 2011)，所有这些文献为了所有目的通过引用被全部并入本文。CRISPR-特定的技术可以在例如Genome Editing and EngineeringFrom TALENs and CRISPRs to Molecular Surgery(Appasani和Church，2018)以及CRISPR:Methods and Protocols(Lindgren和Charpentier，2015)中找到；出于所有目的，这两个文献为了所有目的通过引用被全部并入本文。
注意，如在本文和在所附的权利要求中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数所指对象，除非上下文另外清楚地规定。因此，例如对“寡核苷酸”的提及指提供相同功能的一种或更多种寡核苷酸，并且对“方法”的提及包括对本领域中的技术人员已知的等同步骤和方法的提及，等等。也就是说，除非另有明确规定，如本文使用的，词“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”具有“一个或更多个”的含义。此外，应当理解，可以在本文使用的术语例如“左”、“右”、“顶”、“底”、“前”、“后”、“侧”、“高度”、“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“内部”、“外部”、“内”、“外”仅描述参考点，且并不一定将本公开的实施例限制到任何特定的定向或配置。此外，术语例如“第一”、“第二”、“第三”等仅仅标识如本文公开的多个部分、部件、步骤、操作、功能和/或参考点中的一个，并且同样不一定将本公开的实施例限制到任何特定的配置或定向。
此外，术语“大约”、“接近”、“较小”和类似术语通常指包括在20％、10％或优选地在某些实施例中5％内的裕度内的所识别的值以及在其间的任何值的范围。
除非另外规定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属的领域内的普通技术人员通常理解的相同的含义。
在本文提到的所有出版物(包括专利、所公开的申请和非专利文献)为了所有目的——包括但不限于描述和公开可结合目前描述的方法、模块、仪器和系统使用或修改的设备、系统和方法的目的——通过引用被并入。
当值的范围被提供时，应该理解，在那个范围的上限和下限之间的每一个中间值和在那个规定的范围中的任何其他规定值或中间值被包括在本发明内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内，且也被包括在本公开内，受制于在规定的范围中的任何特别排除的限制。在规定的范围包括限制中的一个或两个时，排除那些所包括的限制中的任一个或两个的范围也被包括在本发明内。
在本说明书中对“一个实施例”或“实施例”的提及意指结合实施例所描述的特定特征、结构或特性被包括在所公开的主题的至少一个实施例中。因此，短语“在一个实施例中”或“在实施例中”在整个本说明书的各个地方中的出现不一定都指同一实施例。
此外，特定特征、结构或特性可以以任何适当的方式在一个或更多个实施例中组合。此外，意图是所公开的主题的实施例覆盖其修改和变化。
介绍和综述
在选定的实施例中，包括本文所述的FTEP设备的自动化多模块细胞编辑仪器和系统可以在活细胞中的多重基因组编辑中以及在用于构建已编辑细胞群体的文库的方法中被使用。本文公开的自动化多模块细胞编辑仪器可用于多种基因组编辑技术，以及特别是核酸酶导向基因组编辑技术。本公开的自动化多模块细胞编辑仪器提供用于将核酸序列引入到活细胞内至靶基因组位点(target genomic sites)的新颖的方法和模块。方法包括构建包括对编码区、非编码区或两者的基因组编辑的各种类别的文库。自动化多模块细胞编辑仪器特别适合于在单个循环中向多个细胞引入基因组编辑，从而以自动化、多路复用的方式生成具有一个或更多个基因组编辑的细胞的文库。自动化多模块细胞编辑仪器也适合于引入两个或更多个编辑，例如对在细胞群体的单独细胞中的不同靶基因组位点的编辑。
无论是一个还是多个，基因组编辑优选地是合理地设计的编辑；也就是说，被设计和创建来将特定的编辑引入到在细胞的基因组中的靶区域的核酸。用于便于基因组编辑事件的序列包括有助于指导核酸酶裂解、将基因组编辑引入到感兴趣区域和/或两者的序列。序列还可以包括对细胞的基因组的区域的编辑，以允许对在细胞的基因组中的特定的合理地设计的编辑被跟踪。例如，在标题为“CRISPR enabled multiplexed genomeengineering”的美国专利号US 9,982,278和标题为“Methods for generating barcodedcombinatorial libraries”的美国专利号10,017,760中教导了将编辑引入到细胞中的这种方法。
核酸酶导向基因组编辑
在选定的实施例中，包括本文所述的FTEP设备的自动化多模块细胞编辑仪器利用核酸酶导向基因组编辑系统。存在用于编辑生物体的基因组的多个不同的基于核酸酶的系统，并且每个系统可以在单个编辑系统、顺序编辑系统(例如，顺序地使用不同的核酸酶导向系统以在细胞中提供两个或更多个基因组编辑)和/或递归编辑系统(例如，利用单个核酸酶导向系统以在细胞中引入两个或更多个基因组编辑)中被使用。本文描述了示例性核酸酶导向基因组编辑系统，尽管本领域中的技术人员在阅读本公开时将认识到，其他酶导向编辑系统也被说明性实施例的自动化多模块细胞编辑仪器和FTEP设备支持。也就是说，应该注意，如在本文阐述的自动化仪器和系统可以使用引入的核酸酶来使基因组裂解并将编辑引入到靶基因组区域内。
在说明性实施例的特定方面中，核酸酶编辑系统是允许控制编辑的定时的诱导系统。诱导系统可以包括核酸酶的诱导表达、编辑盒的诱导表达或两者。调节核酸酶活性的能力可以减少离靶裂解并便于精确的基因组工程。此外，当选择已编辑细胞时，诱导系统是有用的，如在2018年8月14日提交的美国序列号62/718,449中和2018年8月30日提交的美国序列号62/724,851中所述的，这两个申请都通过引用被全部并入。
在某些方面中，由核酸酶进行的裂解也可在所描述和所主张的自动化多模块细胞编辑仪器中被使用以选择在靶区域处的具有基因组编辑的细胞。例如，受到使用RNA导向核酸酶去除特定核酸酶识别位点或核酸酶识别位点的基因组编辑的细胞可以通过在这个编辑之后使细胞暴露于核酸酶来使用说明性实施例的自动化多模块细胞编辑仪器和系统来进行选择。在没有基因组编辑的细胞中的DNA将被裂解且随后将具有有限的生长和/或死亡，而接受去除核酸酶识别位点的基因组编辑的细胞将不被对核酸酶的随后暴露影响。
驱动核酸导向核酸酶编辑系统的一种或更多种组分(例如，核酸酶和导向核酸中的一个或两个)的转录的启动子可以是可诱导的，并且如果选择被执行，则诱导系统可能被采用。已经开发了许多基因调节控制系统，其用于在植物、微生物和动物细胞(包括哺乳动物细胞)中的基因(包括(由CI857阻遏物的热失活诱导的)pL启动子、(由阿拉伯糖到细胞生长培养基的添加诱导的)pBAD启动子和(由鼠李糖到细胞生长培养基的添加诱导的)鼠李糖诱导启动子)的受控表达。其它系统包括四环素控制的转录激活系统(Tet-On/Tet-Off，Clontech,Inc.(Palo Alto,CA)；Bujard和Gossen，PNAS，89(12):5547-5551(1992))、Lac开关诱导型系统(Wyborski等人，Environ Mol Mutagen,28(4):447-58(1996)；DuCoeur等人，Strategies 5(3):70-72(1992)；美国专利号4,833,080)、蜕皮素诱导基因表达系统(No等人，PNAS，93(8):3346-3351(1996))、cumate基因开关系统(Mullick等人，BMCBiotechnology,6:43(2006))以及他莫昔芬诱导基因表达(Zhang等人，Nucleic AcidsResearch,24:543-548(1996))以及其他。
可以使用FTEP设备转化或转染并使用自动化多模块细胞编辑仪器编辑的细胞包括任何原核、古细菌或真核细胞。例如，用于供本说明性实施例使用的原核细胞可以是革兰氏阳性细菌细胞(例如，枯草芽孢杆菌)或者革兰氏阴性细菌细胞(例如，大肠杆菌细胞)。用于供说明性实施例的自动化多模块细胞编辑仪器使用的真核细胞包括任何植物细胞和任何动物细胞，例如真菌细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、线虫细胞或哺乳动物细胞。
在选定的实施例中，本文描述的自动化多模块细胞编辑仪器执行锌指核酸酶基因组编辑。锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合域融合到DNA裂解域而生成的人工限制性内切酶。锌指域可以被设计成在生物体的基因组中的靶特定区域。(Urnov等人，NatureReviews Genetics，11:636-646(2010)；2003年1月22日提交的Carroll等人的标题为“Targeted Chromosomal Mutagenesis Using Zinc Finger Nucleases”的国际专利申请公WO 2003/087341 A2)。使用生物体的内源性DNA修复机制，ZFN可以用来精确地改变基因组的靶区域。ZFN可用于通过在突变等位基因中的DNA中产生双链断裂(DSB)来使在杂合个体中的显性突变无效，双链断裂在没有同源模板的情况下将通过非同源末端连接(NHEJ)来修复。NHEJ通过将两个末端连接在一起来修复DSB，且通常不产生突变，假定切口是干净的和不复杂的。(Durai等人，Zinc finger nucleases:custom-designed molecularscissors for genome engineering of plant and mammalian cells,Nucleic AcidsRes.,33(18):5978-90(2005))。这个修复机制可用于通过插入缺失或染色体重排来在基因组中诱发错误，常常使在那个位置上编码的基因产物变得无功能。
多对ZFN也可用于完全去除基因组序列的整个大片段(Lee等人，Genome Res.,20(1):81-9(2009)；以及2010年7月28日提交的Gregory等人的标题为“Methods andCompositions for Treating Trinucleotide Repeat Disorders”的美国专利申请公开2011/0082093 A1)。扩展的CAG/CTG重复序列束(repeat tracts)是多于一打遗传性神经系统疾病(包括亨廷顿氏病、强直性肌营养不良和几种脊髓小脑共济失调)的遗传基础。已经在人类细胞中证明，ZFN可以将DSB引导到CAG重复序列，并将重复序列从长的病理长度收缩到短的毒性更小的长度(Mittelman等人，Zinc-finger directed double-strand breakswithin CAG repeat tracts promote repeat instability in human cells,PNAS USA,106(24):9607-12(2009)；以及2013年2月28日提交的Miller等人的标题为“Methods andCompositions for Treating Huntington's Disease”的美国专利申请公开2013/0253040A1)。
在另一个实施例中，本文描述的自动化多模块细胞编辑模块、仪器和系统执行大范围核酸酶基因组编辑。大范围核酸酶在20世纪90年代被识别，且随后的工作表明它们是用于基因组编辑的特别有前途的工具，因为它们能够有效地诱导同源重组，在基因组的编码或非编码区中生成突变，并改变基因组的编码区的阅读框。(参见例如Epinat等人，Nucleic Acids Research,31(11):2952-62(2003)；以及2014年12月30日发布的Choulika等人的标题为“Chromosomal Modification Involving the Induction of Double-stranded DNA Cleavage and Homologous Recombination at the Cleavage Site”的美国专利号8,921,332)。大范围核酸酶的高特异性给予它们高度的精确度和比其他天然地出现的限制性内切酶低得多的细胞毒性。
在又一个实施例中，本文描述的自动化多模块细胞编辑模块、仪器和系统执行转录激活因子样效应物核酸酶编辑。转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)是可被改变基因结构以切割DNA的特定序列的限制性内切酶。它们通过将TAL效应物DNA结合域融合到DNA裂解域(切割DNA链的核酸酶)而制成。转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)可以被改变基因结构以结合到实际上任何期望的DNA序列，因此当与核酸酶组合时，DNA可以在特定位置处被切割。(参见例如Miller等人，Nature Biotechnology,29(2):143—8(2011)；Boch，Nature Biotech.，29(2):135-6(2011)；2010年1月12日提交的Bonas等人的标题为“Modular DNA-binding Domains and Methods of Use”的国际专利申请公开WO 2010/079430 A1；2010年12月10日提交的Voytas等人的标题为“TAL Effector-Mediated DNAModification”的国际专利申请公开WO 2011/072246 A2)。
可选地，可以在存在外源双链DNA片段的情况下使用同源依赖修复(HDR)来将DNA引入到基因组内。可以通过在序列内插入与DSB的侧翼序列同源的期望序列来利用HDR对修复DSB的同源序列的依赖性，侧翼序列当由HDR系统用作模板时导致在感兴趣的基因组区域内的期望变化的产生。
像ZFN一样，TALEN可以通过诱导DSB来编辑基因组。在靶区域处的TALEN创建的位点特异性DSB通过NHEJ或HDR被修复，导致靶向基因组编辑。TALEN可用于在外源双链DNA片段存在的情况下通过NHEJ引入插入缺失、重排或将DNA引入到基因组内。
在其他实施例中，说明性实施例的自动化多模块细胞编辑仪器的基因组编辑利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)技术，其中RNA导向核酸酶(RGN)用于编辑在生物体的基因组中的特定靶区域。通过将与合成导向RNA(gRNA)复合的RGN输送到细胞中，可以在期望的位置处切割细胞的基因组，允许对基因组的靶区域的编辑。导向RNA帮助RGN蛋白质识别和切割靶基因组区域的DNA。通过操纵导向RNA的核苷酸序列，RGN系统可以被编程为以用于裂解的任何DNA序列为目标。
与说明性实施例的自动化多模块细胞编辑仪器一起使用的RGN系统可以使用具有在期望的靶基因组区域处剪切和粘贴的能力的任何RNA导向核酸酶系统来执行基因组编辑。在某些方面中，RNA导向核酸酶系统可以使用两个单独的RNA分子作为gRNA，例如CRISPRRNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。在其他方面中，gRNA可以是包括crRNA和tracrRNA序列的单个gRNA。
在某些方面中，基因组编辑既将期望的DNA变化引入到靶区域，又从靶区域移除前间区序列基序(PAM)区域，因而排除了在该靶区域处的基因组的任何额外编辑，例如在暴露于与和靶区域互补的合成gRNA复合的RNA导向核酸酶时。(参见例如美国专利号9,982,278和10,017,760，这两个专利被全部并入本文。)在这个方面中，第一编辑事件可以是例如RGN导向编辑事件或同源重组事件，并且具有期望编辑的细胞可以使用与和靶区域互补的合成gRNA复合的RGN来被选择。没有经历第一编辑事件的细胞将被切割，且因此在适当的选择标准下将不继续是能存活的。包含期望突变的细胞将不被切割，因为它们将不再包含必需的PAM位点，并将继续在自动化多模块细胞编辑仪器中生长和繁殖。
当RGN系统用于选择时，主要是所需要的切割活动；因此，RNA导向核酸酶蛋白质系统可以与用于编辑的相同，或者可以是RGN系统，其在使用特定的PAM位点进行切割时是有效的，但在该位点处进行编辑时不一定是有效的。用于选择的核酸酶的一个重要方面是使用先前基因组编辑操作的编辑方法来取代的PAM位点的识别。
在又一实施例中，说明性实施例的自动化多模块细胞编辑仪器的基因组编辑可以利用同源重组方法，包括cre-lox技术和FRET技术。位点特异性同源重组不同于一般的同源重组，因为重组酶识别所需的短特异性DNA序列是重组发生的仅有位点。位点特异性重组需要专门的重组酶来识别位点并催化这些位点处的重组。许多噬菌体和酵母源位点特异性重组系统(每一个都包括重组酶和特定的同源位点)已被证明为了DNA整合的目的而在真核细胞中工作，且因此可适用于在本发明中使用，且这些包括噬菌体P1 Cre/lox、酵母FLP-FRT系统和位点特异性重组酶的酪氨酸家族的Dre系统。例如在美国专利号7,422,889、7,112,715、6,956,146、6,774,279、5,677,177、5,885,836、5,654,182和4,959,317中描述这种系统和使用方法，这些专利在本文通过引入被并入以教导使用这种重组酶的方法。酪氨酸家族的其它系统(例如，噬菌体λInt整合酶、HK2022整合酶以及另外属于重组酶的单独丝氨酸家族的系统(例如噬菌体phiC31、R4Tp901整合酶))被已知使用它们各自的重组位点来在哺乳动物细胞中工作，并且也适用于在本发明中使用。在美国专利号6,689,610、6,204,061、5,631,153、5,627,059、5,487,992和5,464,764中描述了同源重组的示例性方法，每个专利通过引用被全部并入。
仪器架构
图1A和图1B描绘利用基于盒的源材料(例如，试剂、酶、核酸、洗涤溶液等)的自动化多模块细胞编辑仪器100的一个例子。例如，仪器100可以被设计为用于在实验室环境中使用的台式仪器。仪器100可以合并用于在细胞中进行自动化基因组裂解和/或编辑时执行各种分段操作的可重复使用的和用后即可丢弃的元件的混合物。例如，基于盒的源材料可以被定位在仪器100的底板102上的指定区中，用于由机器人操纵仪器108使用(access)。如图1B所示，底板102可以包括保护槽，使得从仪器100的任何模块溅出、滴下或溢出的污染物被容纳在保护槽的唇缘内。
转到图1A，在一些实施方式中，仪器100包括用于将DNA样品和其他源材料引入到仪器100的试剂盒104、FTEP设备110c(在这里作为试剂盒104的一部分)、用于将洗脱液和其他源材料引入到仪器100的洗涤盒106以及用于在模块(例如，模块110a、110b和110c)盒容器(例如，盒104和106的容器)和仪器100的储存单元(例如单元112、114、116和118)之间移动材料以执行自动化基因组裂解和/或编辑的机器人操纵系统108。在一些实施例中，在完成细胞供应的处理时，细胞输出可以由机器人操纵仪器108转移到放置在例如试剂盒104或洗涤盒106中的储存单元或容器，用于临时储存和随后取回。
机器人操纵系统108例如可以包括空气排代泵120以将液体从盒104、106的各种试剂储器转移到各种模块110a-110c和储存单元(112、114、116或118)。在其他实施例中，机器人操纵系统108可以包括拾取和放置头(未示出)以将源材料的容纳器(container)(例如，管或小瓶)从试剂盒104和/或洗涤盒106转移到各种模块110a-110c。在一些实施例中，一个或更多个照相机或其他光学传感器(未示出)确认机器人操纵装置沿着台架122的正确移动和定位。
在一些实施例中，机器人操纵系统108使用在转移尖端供应品116(例如，移液管尖端架)中提供的用后即可丢弃的转移尖端来在仪器100内转移源材料、试剂(例如，核酸、酶、缓冲液)和细胞。例如，用过的转移尖端可以被丢弃在固体废物单元112中。在一些实现中，固体废物单元112包含顶件块(kicker)以从机器人操纵系统108的拾取和放置头移除管、尖端、小瓶和/或过滤器。例如，如所示，机器人操纵系统108包括过滤器拾取头124。
在一些实现中，仪器100由处理系统126(例如图18的处理系统1810)控制。处理系统126可以被配置成基于用户输入来操作仪器100。例如，用户输入可以通过触摸屏控制显示器128由仪器100接收。处理系统126可以控制仪器100的各种模块110a-110c的定时、持续时间、温度和其他操作。转到图1B，处理系统126可以连接到用于仪器100的操作的电源150。
返回到图1A，如所示，试剂盒104包括16个储器(5×3储器的矩阵，加上附加的储器)和流通式FTEP设备110c(例如，转化模块，如下面关于图4A-4I、图5A-5G、图6、图7A-7E、图8A-8U、图9A-9C和图10A-10G详细描述的)。洗涤盒106可被构造成容纳大的管或储器以储存例如洗涤溶液或在整个迭代过程中常常使用的溶液。此外，在一些实施例中，洗涤盒106可以包括多个较小的管、小瓶或储器以保持较小体积的例如源培养基以及用于已编辑细胞的容器或储器。例如，当两个或更多个试剂盒104被顺序地使用和更换时，洗涤盒106可以被配置为保持在原位。尽管试剂盒104和洗涤盒106在图1A中被示为单独的盒，但在其他实施例中洗涤盒106的内容物可以合并到试剂盒104中。在另外的实施例中，可以将三个或更多个盒装载到自动化多模块细胞编辑仪器100中。在某些实施例中，在自动化多模块细胞编辑仪器100中的试剂盒104、洗涤盒106和模块110a-110c的其他部件一起被包装在套件中。
在一些实现中，洗涤盒106和试剂盒104是用于在自动化多模块细胞编辑仪器100中使用的用后即可丢弃的套件。例如，用户可以在激活细胞处理之前在自动化多模块细胞编辑仪器的机箱内打开和定位试剂盒104和洗涤盒106中的每一个。下面关于图2A到2D更详细地讨论示例机箱。
在一些实现中，盒104、106的部件被标有机器可读标记，例如条形码，用于由机器人操纵系统108识别。例如，机器人操纵系统108可以扫描在每个盒104、106内的容纳器以确认内容物。在其他实现中，机器可读标记可以被标记在每个盒104、106上，并且自动化多模块细胞编辑仪器100的处理系统可以基于机器可读标记来识别已储存材料图。(参见例如图11B的元素1112和图11D的元素1130。)
在一些实施例中，洗涤盒106(图1A)在一些实施例中是例如图11A-11B所示的洗涤盒。盒1100包括被保持在盒主体1108中的一对容纳器1102a、b，一组四个小管1104a、b、c、d以及的较大管1106。在一些实施例中，容纳器1102a、b和管1104a、b、c、d和1106中的一个或更多个用可刺穿的箔密封，用于由自动化液体处理系统(例如吸管或吸移管)进入。在其它实施例中，容纳器1102a、b和管1104a、b、c、d和1106中的一个或更多个包括可密封的进入垫圈(access gasket)。在一些实施例中，容纳器1102a、b和管1104a、b、c、d和1106中的一个或更多个的顶部用机器可读标记(未示出)来标记，用于内容物的自动识别。
在一些实施例中，容纳器1102a、b包含洗涤溶液。洗涤溶液可以是相同或不同的洗涤溶液。在一些例子中，洗涤溶液可以包含例如缓冲液、缓冲液和10％甘油、80％乙醇。
在一些实现中，盖1120将容纳器1102a、b和管1104a、b、c、d和1106固定在盒主体1108内。转到图11B，盖1120可以包括用于进入容纳器1102a、b和管1104a、b、c、d和1106中的每个的开孔。此外，盖1120可以包括用于识别盒的类型(例如，访问盒内容物的图)的机器可读标记1112。可选地，可以用单独的内容物单独地标记开孔。
在一些实施例中，图1A的试剂盒104是例如图11C所示的试剂盒。图11C示出了包括一组18个管或小瓶1140的试剂盒1122；然而，图11C所示的实施例不包括FTEP设备。看图11E，试剂盒包括被保持在盒主体1122中的十六个管或小瓶1126a-p和FTEP设备1124。在一些实施例中，管或小瓶1140(图11C)或1126a-p(图11E)中的一个或更多个用可刺穿的箔密封，用于由自动化液体处理系统(例如吸管或吸移管)进入。在例如图11E所示的其他实施例中，管或小瓶1126a-1126p中的一个或更多个包括可密封的进入垫圈。在一些实施例中，用机器可读标记(未示出)标记小管或小瓶1126a-1126p中的每个的顶部，用于内容物的自动识别。机器可读标记可以包括条形码、QR码或其他机器可读编码。用于识别特定容纳器的其他自动化手段可以包括颜色编码、符号识别(例如，文本、图像、图标等)和/或形状识别(例如，容纳器的相对形状)。在一些实施例中，不是被标记在盛器(vessels)本身上，盒主体和/或盒盖的上表面可以包含用于识别内容物的机器可读标记。小管或小瓶可以每个具有相同的尺寸。可选地，可以在试剂盒1120中提供多个体积的管或小瓶。在说明性例子中，每个管或小瓶可以设计成容纳2和20mL之间、4和10mL之间或大约5mL。在仅仅小体积的一些试剂被需要的一些实施例中，管插入物可以用于容纳在较大容器中的小(例如，微量离心)管。
在说明性例子中，管或小瓶1126a-1126p可以每个容纳下列材料之一：载体骨架、寡核苷酸、用于核酸组装的试剂、用户提供的细胞样品、诱导剂、在缓冲液中的磁珠、乙醇、用于细胞选择的抗生素、用于洗脱细胞和核酸的试剂、油覆盖层、其他试剂和细胞生长和/或恢复培养基。
在一些实现中，如在图11D中看到的盖1120将管或小瓶1140固定在图11C的盒主体1122内。转到图11D，盖1120可以包括用于进入每个小管或小瓶1126的开孔。用粗体带画出三个大开孔1132的轮廓以指示添加用户提供的材料的位置。例如，用户提供的材料可以包括载体骨架、寡核苷酸和细胞样品。此外，盖1120可以包括用于识别盒的类型(例如，访问盒内容物的图)的机器可读标记1130。可选地，可以用单独的内容物单独地标记每个开孔。在一些实现中，为了确保用户提供的材料的定位，提供用于在实验室环境中填充的小瓶或管可以具有独特的形状或尺寸，使得细胞样品小瓶或管仅配合在细胞样品开孔中，寡核苷酸小瓶或管仅配合在寡核苷酸开孔中，等等。
返回到图1A，还示出了包括台架122的机器人操纵系统108。在一些例子中，机器人操纵系统108可以包括自动液体处理系统，例如由瑞士Mannedorf的Tecan Group Ltd.、内华达州Reno的Hamilton Company(见例如Ott的标题为“Pipetting device,fluidprocessing system and method for operating a fluid processing system”的WO2018015544A1)或科罗拉多州Fort Collins的Beckman Coulter,Inc.(见例如Striebl等人的标题为“Methods and systems for tube inspection and liquid leveldetection”的US20160018427A1)制造的自动液体处理系统。机器人操纵系统108可以包括空气排代吸移管120。试剂盒104、106允许与机器人操纵系统108的液体处理仪器(例如空气排代吸移管120)的特别容易的集成。在一些实施例中，只有空气排代吸移管120由台架122移动，并且各种模块110a-110c和盒104、106保持静止。移液管尖端可以设置在移液管转移尖端供应品116中，用于供空气排代吸移管120使用。
在一些实施例中，自动化机械运动系统(致动器)(未示出)另外向自动化多模块细胞编辑仪器100的一个或更多个模块110a-110c和/或盒104、106提供XY轴运动控制或XYZ轴运动控制。例如，用过的移液管尖端可以由机器人操纵系统放置在废物储器112中。例如，当机器人操纵系统将材料移动到在自动化多模块细胞编辑仪器100内的其他模块时，活动模块可以被升高以与机器人操纵系统形成接触可接近的定位，或者相反在使用之后被降低以避免与机器人操纵系统的碰撞。
在一些实现中，自动化多模块细胞编辑仪器100包括被包括在试剂盒104中的FTEP设备110c(例如，转化或转染模块)。例如，在细胞和核酸通过输入通道转移到流通式电穿孔设备中之后，流通式电穿孔连接桥132与该设备接合。桥132提供了与电极的液密密封和电连接以及用于在FTEP设备110c内进行电穿孔的控制。例如，电穿孔连接桥132可以连接到在自动化多模块细胞编辑仪器100的电子机架136内的FTEP控件134。
在一些实现中，自动化多模块细胞编辑仪器100包括双细胞生长模块110a、110b。如所示，细胞生长模块110a、110b每个包括旋转细胞生长小瓶130a、130b。细胞生长模块110a、110b中的至少一个可以另外包括集成过滤模块(未示出)。在替代实施例中，过滤模块或细胞洗涤和浓缩模块可替代地与细胞生长模块110a、110b分离(例如，如关于图17A和图17B的细胞生长模块1710a和过滤模块1710b所述的)。例如，细胞生长模块110a、110b可以每个包括关于图13A-C的细胞生长模块1300讨论的特征和功能。
在一些实施例中，细胞生长模块110a、110b中的一个或两个的过滤部分使用储存在过滤盒118中的可更换过滤器。例如，机器人操纵系统可以包括过滤器拾取头124以拾取和接合过滤器，用于供细胞生长模块110a、110b中的一个或两个使用。过滤器拾取头将过滤器转移到生长模块，用移液管从生长模块吸取细胞，然后洗涤细胞并使细胞变成电转感受态的。来自细胞的培养基和洗涤液布置在废物模块114中。
在一些实现中，自动化多模块细胞编辑仪器100包括用于将在试剂盒104中提供的材料组合成用于细胞编辑的组装核酸的核酸组装和纯化功能(例如，核酸组装模块)。此外，脱盐或纯化操作纯化组装核酸并使缓冲液脱盐，使得核酸更有效地电穿孔到细胞内。核酸组装和纯化特征可以包括反应室或管容器(未示出)和磁体(未示出)。
尽管示例仪器100被示为包括模块110的特定布置，但该实现仅为了说明目的。例如，在其他实施例中，更多或更少的模块110可以被包括在仪器100内，并且可以包括不同的模块，例如用于细胞融合以产生杂交瘤的模块和/或用于表达和/或蛋白质产生的模块。此外，可以在某些实施例中复制某些模块，例如图1A的复制的细胞生长模块110a、110b。
在一些实施例中，细胞在引入到自动化多模块细胞编辑仪器内之前被修改。例如，感兴趣的细菌细胞可能包含λ红系统以便于基因组修复，和/或细胞可能包含抗生素抗性基因，因此它们可以容易地被选择。图2A至2D示出了用于在自动化多模块细胞编辑仪器的桌面版本中使用的示例机箱200和230。例如，机箱200和230可以具有大约24-48英寸的宽度、大约24-48英寸的高度和大约24-48英寸的深度。机箱200和230中的每一个都可以被设计成容纳在自动化细胞处理中使用的多个模块和用后即可丢弃的供应品。此外，每个机箱200和230可以安装用于在模块之间移动材料的机器人操纵系统。
图2A和图2B描绘自动化多模块细胞编辑仪器的第一示例机箱200。如所示，机箱200包括具有手柄204和铰链206a-206c的盖202，铰链206a-206c用于提升盖202并进入机箱200的内部。冷却格栅214可以允许空气通过内部风扇(未示出)流动。此外，机箱200由可调支脚220提升。例如，支脚220a-220c可以在机箱200下方提供额外的气流。在一些实施例中，控制按钮216允许在机箱200内的细胞处理的单按钮自动开始和/或停止。
在一些实现中，在机箱200内部，机器人操纵系统208沿着台架210设置在材料盒212a、212b上方。在一些实施例中，控制电路、液体处理管、空气泵控件、阀、热单元(例如，加热和冷却单元)和其他控制机构在机箱200的底板之下布置在控制箱区域218中。
尽管未示出，但在一些实施例中，显示屏可以位于机箱200的正面上，例如覆盖盖202的一部分。显示屏可以向用户提供关于自动化多模块细胞编辑仪器的处理状态的信息。在另一个例子中，显示屏可以接受来自用户的输入用于进行细胞处理。
图2C和图2D描绘自动化多模块细胞编辑仪器的第二示例机箱230。如所示，机箱230包括带有铰链234的透明门232。例如，门可以向页面的左侧摆动以提供对机箱的工作区域的访问。例如，用户可以打开透明门232以将供应品(例如试剂盒和洗涤盒)装载到机箱230中。
在一些实施例中，机箱230的正面还包括被示为在门232的右侧的显示器(例如，触摸屏显示设备)236。显示器236可以向用户提供关于自动化多模块细胞编辑仪器的处理状态的信息。在另一例子中，显示器236可以接受来自用户的例如用于暂停或进行细胞处理的输入。
在机箱230的右侧面上的空气格栅238可以在机箱230(例如，在底板上方)的工作区域(例如，在底板上方)内提供气流。在机箱230的左侧上的第二空气格栅240可在机箱230的控制箱区域242内(例如，在底板下方)提供气流。尽管未示出，但在一些实施例中，支脚(例如机箱200的支脚220a-220c)可以将机箱230提升到工作表面上方，提供进一步的空气流动。
在机箱230内部，在一些实现中，机器人操纵系统248沿着台架250布置在盒252a、252b、材料供应品254a、254b(例如，移液管尖端和过滤器)和模块(例如，双生长小瓶、FTEP设备、核酸组装模块(未示出))上方。在一些实施例中，控制电路、液体处理管、空气泵控件、阀和其他控制机构在机箱230的底板下方布置在控制箱区域242中。
在一些实施例中，液体废物单元246安装到机箱230的左侧外壁。例如，液体废物单元246可以在外部安装到机箱230以避免潜在的污染，并确保液体废物单元246的迅速倒空和更换。
核酸组装模块
本公开的自动化多模块细胞编辑仪器的某些实施例包括核酸组装模块仪器。核酸组装模块被配置为接受和组装便于期望基因组编辑事件所必需的核酸。核酸组装模块也可以被配置为接受合适的载体骨架，用于载体组装和随后电穿孔到感兴趣的细胞中。
通常，术语“载体”指能够运输另一核酸的核酸分子，它链接到该另一核酸。载体包括但不限于单链的、双链的或部分双链的核酸分子；包括一个或更多个自由端、没有自由端(例如环状)的核酸分子；包括DNA、RNA或两者的核酸分子；以及本领域中已知的其他种类的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其指环状双链DNA环，额外的DNA片段可以例如通过标准的分子克隆技术插到环状双链DNA环内。另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于载体中用于包装到病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒)内。病毒载体还包括由病毒携带的用于转染到宿主细胞内的多核苷酸。某些载体能够在它们被引入到的宿主细胞中自主复制(例如，具有复制的细菌来源的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中时被整合到宿主细胞的基因组中，并且从而连同宿主基因组一起被复制。此外，某些载体能够指导它们被操作链接到的基因的表达。这种载体在本文中被称为“表达载体”。在重组DNA技术中的有用的常用表达载体常常是以质粒的形式。额外的载体包括福斯质粒、噬菌粒和合成染色体。
重组表达载体可以包括以适合于转化的形式的核酸，并且对于一些核酸序列包括在宿主细胞中的核酸的转译和表达，这意味着重组表达载体包括一个或更多个调节元件(其可以基于用于表达的宿主细胞来被选择)，其可操作地链接到待表达的核酸序列。在重组表达载体中，“可操作地链接”意欲意指感兴趣的核苷酸序列以允许转录的方式链接到调节元件，并且对于一些核酸序列，意指核苷酸序列的转译和表达(例如，在体外转录/转译系统中或者当载体被引入到宿主细胞内时在宿主细胞中)。在2004年9月2日被公开为US2004-0171156 A1的标题为“Recombinational Cloning Using Nucleic Acids HavingRecombination Sites”的美国专利申请序列号10/815,730中公开了适当的重组和克隆方法，该专利申请为了所有目的通过引用被全部并入本文。
在一些实施例中，调节元件可操作地链接到靶向核酸酶系统的一个或更多个元件，以便驱动转录，并且对于一些核酸序列，驱动靶向核酸酶系统的一个或更多个组分的转译和表达。
此外，对核酸导向核酸酶编码的多核苷酸序列可以被密码子优化用于在特定细胞(例如原核或真核细胞)中的表达。真核细胞可以是酵母、真菌、藻类、植物、动物或人类细胞。真核细胞可以是特定生物体的细胞或来源于特定生物体的细胞，特定生物体例如是哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人哺乳动物，包括非人灵长类动物。另外或可选地，载体可以包括可操作地链接到多核苷酸序列的调节元件，多核苷酸序列当被转录时形成导向RNA。
核酸组装模块可以被配置成以自动化方式执行多种不同的核酸组装技术。可在所公开的自动化多模块细胞编辑仪器的核酸组装模块中执行的核酸组装技术包括但不限于使用限制性内切核酸酶的那些组装方法，包括PCR、BioBrick组装(2016年6月7日发布的Hillson的标题为“Scar-less Multi-part DNA Assembly Design”的美国专利9,361,427)、类型IIS克隆(例如，GoldenGate组装；2010年7月6日提交的Weber等人的标题为“System and Method of Modular Cloning”的欧洲专利申请公开EP 2 395 087 A1)和连接酶循环反应(de Kok S,ACS Synth Biol.,3(2):97-106(2014)；Engler等人，PLoS One,3(11):e3647(2008)；2000年11月7日发布的Pachuk等人的标题为“Chain Reaction CloningUsing a Bridging Oligonucleotide and DNA Ligase”的美国专利号6,143,527)。在其他实施例中，由所公开的自动化多模块细胞编辑仪器执行的核酸组装技术基于在核酸的相邻部分之间的重叠，例如Gibson
Figure BDA0002506973470000301
CPEC、SLIC、连接酶循环等。其他组装方法包括在酵母中的缺口修复(Bessa,Yeast,29(10):419-23(2012))、通路克隆(Ohtsuka,CurrPharm Biotechnol,10(2):244-51(2009)；1999年3月30日发布的Hartley等人的标题为“Recombinational Cloning Using Engineered Recombination Sites”的美国专利号5,888,732；2001年8月21日发布的Hartley等人的标题为“Recominational Cloning UsingNucleic Acids Having Recombination Sites”的美国专利号6,277,608)，以及拓扑异构酶介导的克隆(Udo,PLoS One,10(9):e0139349(2015)；2005年7月12日发布的Chestnut等人的标题为“Methods and Reagents for Molecular Cloning”的美国专利号6,916,632B2)。例如在Sands和Brent，Curr Protoc Mol Biol.,113:3.26.1-3.26.20(2016)；Casini等人，Nat Rev Mol Cell Biol.,(9):568-76(2015)；Patron，Curr Opinion PlantBiol.,19:14-9(2014)中描述了这些和其它核酸组装技术。
根据在自动化多模块细胞编辑仪器中使用的核酸组装物的类型，核酸组装模块是温度受控的。例如，当在核酸组装模块中利用PCR时，该模块将具有热循环能力，允许温度在变性、退火和延伸之间循环。当在核酸组装模块中利用单一温度组装方法时，该模块将具有达到并被保持在优化正在被执行的特定组装过程的温度的能力。这些温度和用于维持这些温度的持续时间可以由脚本所执行的预编程的一组参数确定，或者由用户使用自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统手动地控制。
在一个实施例中，核酸组装模块是使用单一等温反应来执行组装的模块，例如图3所示的模块。某些等温组装方法可以基于序列一致性来同时组合多达15个核酸片段。在一些实施例中，组装方法提供待组装的核酸，该待组装的核酸包括与相邻核酸片段重叠的大约20-40个碱基。这些片段与三种酶(核酸外切酶、聚合酶和连接酶)的混合物连同缓冲液组分混合在一起。因为该过程是等温的并且可以使用单个反应盛器在1步骤或2步骤方法中被执行，所以等温组装反应对在自动化多模块细胞编辑仪器中使用是理想的。1步骤方法允许使用单步骤等温过程组装多达五个不同的片段。酶的主混合物(master mix)和片段组合，并在50℃下被培养多达一个小时。为了创建具有多达15个片段的更复杂的构成物或者为了合并从100bp一直到10kb的片段，通常使用2步骤，其中2步骤反应需要主混合物的两次单独添加；一次用于核酸外切酶和退火步骤，以及第二次用于聚合酶和连接步骤。
图3示出了具有综合纯化的示例核酸组装模块300。核酸组装模块300包括室302，该室302具有用于将液体转移到核酸组装模块300和从核酸组装模块300转移液体(例如，通过移液管或吸管)的进入垫圈304。在一些实施例中，进入垫圈304连接到位于室302内的可更换小瓶。例如，用户或机器人操纵系统可以将小瓶放置在核酸组装模块300内用于处理。
室302与电阻加热器308共用壳体306。一旦样品被引入到核酸组装模块300的室302，电阻加热器308就可用于将室302的内容物加热至期望的温度。可基于室302的内容物(例如，经由机器人操纵系统的移液管或吸管单元通过进入垫圈304供应的材料)来设定热斜升。自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统可以确定目标温度和热斜升计划。可以通过监控热传感器(例如被包括在壳体306内的热敏电阻310)来控制热斜升和目标温度。在特定实施例中，电阻加热器308被设计成将壳体306内的温度维持在20°和80℃之间、在25°和75℃之间、在37°和65℃之间、在40°和60℃之间、在45°和55℃之间或优选地大约50℃的温度。
纯化模块
在一些实施例中，当核酸组装模块被包括在自动化多模块细胞编辑仪器中时，该仪器还可以包括纯化模块以去除核酸组装混合物的不需要的组分(例如盐、矿物质)，并且在某些实施例中浓缩组装的核酸。用于在核酸组装之后交换液体的方法的例子包括磁珠(例如，由加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen Corp.生产的SPRI或Dynal(Dynabead))、二氧化硅珠、二氧化硅旋转柱、玻璃珠、沉淀(例如，使用乙醇或异丙醇)、碱裂解、渗透纯化、用丁醇提取、基于膜的分离技术、过滤等。
在一个方面中，纯化模块提供过滤，例如超滤。例如，配备有具有变化的孔隙率的各向异性的、亲水地生成的纤维素膜的一定范围的微型浓缩器是可用的。在另一个例子中，纯化和浓缩涉及使包括组装的核酸和离子盐的液体样品与包括不能溶解的磷酸盐的离子交换剂接触，除去液体，并从离子交换剂洗脱核酸。
在纯化模块的特定方面中，可以使用SPRI珠，其中可以将0.6-2.0倍体积的SPRI珠添加到核酸组装物。核酸组装产物结合到SPRI珠，且SPRI珠通过靠近包含小丸(pellet)的管、盛器或室自动定位磁体而成丸状。例如，可以将0.6-2.0倍体积的SPRI珠添加到核酸组装物。例如，SPRI珠可以用乙醇被洗涤，并且所结合的核酸组装产物例如在水、Tris缓冲液或10％甘油中被洗脱。
在特定方面中，磁体耦合到定位磁体的线性致动器。在一些实现中，核酸组装模块是为综合组装和纯化而设计的组合组装和纯化模块。例如，如上面关于在图3中描绘的核酸组装模块所讨论的，一旦足够的时间过去用于使核酸组装反应发生，在一些实施例中，室302的内容物(例如，核酸组装试剂和核酸)与磁珠(未示出)组合以激活纯化过程。在缓冲液中的SPRI珠例如由机器人操纵系统输送至核酸组装模块的内容物。此后，在一些实施例中，螺线管312由磁体驱动以激励在室302内包含的磁珠。在特定例子中，螺线管可以向在室302内的磁珠施加2磅磁拉力和5磅之间的磁拉力或者大约4磅磁拉力。室302的内容物可以被培养足够长的时间，用于使组装的载体和寡核苷酸结合到磁珠。
在结合之后，在一些实现中，从核酸组装模块移除结合的核酸组装混合物(例如，核酸组装试剂+组装的载体和寡核苷酸)，以及用80％乙醇将附着于珠的核酸洗涤一至几次。一旦被洗涤，附着到珠的核酸就被洗脱到缓冲液中并转移到转化模块。也就是说，在一些实施例中，核酸组装模块和纯化模块被组合。
在一些实现中，小瓶被锁定在室302中的适当位置上用于处理。例如，用户可以在室302中的棘爪(detent)之外按压小瓶，该棘爪设计成在与移液管或吸管接合时保持小瓶。在另一个例子中，用户可以将小瓶扭转到适当的位置上，因而将突出物接合到相应的通道并阻止向上运动。位置传感器(未示出)可以确保小瓶的缩回。在特定实施例中，位置传感器是检测在室302的一部分和小瓶之间的接合的磁传感器。在其他实施例中，位置传感器是检测在缩回位置处的小瓶的存在的光学传感器。在使用通道和突出物的实施例中，被突出物压下的机械开关可以检测小瓶的接合。
生长模块
当核酸被组装时，细胞可以生长以为编辑做准备。可以通过在生长模块中测量的光密度(例如，在OD 600nm处)来监控细胞生长，并且使用反馈回路来调节细胞生长，以便在目标时间达到目标OD。可以测量的细胞密度和生理状态的其他度量包括但不限于pH、溶解氧、释放的酶、声学特性和电特性。
在一些方面中，生长模块包括由分光光度计或荧光计询问的振荡器或混匀装置(vortexer)中的培养管。振荡器或混匀装置可以加热或冷却细胞，且细胞生长通过实时吸光度或荧光测量来被监控。在一个方面中，细胞在25℃-40℃下生长至1-10OD的OD600吸光度。细胞也可以在范围从25℃-35℃、25℃-30℃、30℃-40℃、30℃-35℃、35℃-40℃、40℃-50℃、40℃-45℃或44℃-50℃的温度下生长。在另一方面中，通过在42℃-50℃下加热或通过添加诱导剂来诱导细胞。还可以通过在从42℃-46℃、42℃-44℃、44℃-46℃、44℃-48℃、46℃-48℃、46℃-50℃或48℃-50℃的范围处加热来诱导细胞。在一些方面中，在诱导之后将细胞冷却至0℃-10℃。在诱导之后也可以将细胞冷却到0℃-5℃、0℃-2℃、2℃-4℃、4℃-6℃、6℃-8℃、8℃-10℃或5℃-10℃的温度范围。
图13A示出了用于供细胞生长设备(例如图13B-C中所示的细胞生长设备1350)使用的旋转生长小瓶1300的一个实施例。在一些实现中，旋转生长小瓶1300是透明容纳器，其具有用于接收液体培养基和细胞的开口端1304、限定用于使细胞生长的主容纳器的中心小瓶区域1306、限定至少一个光路1308、1310的锥形到狭窄区域1318、封闭端1316和驱动接合机构1312。旋转生长小瓶1300可以具有中心纵轴1320，小瓶1300围绕该中心纵轴旋转，并且光路1308、1310可以大致垂直于小瓶的纵轴。在一些例子中，第一光路1310可以位于锥形到狭窄区域1318的下部狭窄部分。在一些实现中，驱动接合机构1312与驱动机构(例如，致动器、电机(未示出))接合以旋转小瓶1300。致动器可以包括驱动电机(未示出)的驱动轴1374。
在一些实施例中，旋转生长小瓶1300包括例如在锥形到狭窄区域1318的上部锥形区域中的第二光路1308。在一些例子中，限定对于第二光路1308的锥形到狭窄区域1318的上部锥形区域的壁可以相对于纵轴1320以比限定对于第一光路1310的锥形到狭窄区域1310的下部狭窄部分的壁的更宽角度布置。例如，光路1308、1310都可以位于旋转生长小瓶1300的区域中，该区域不断地用细胞培养物(细胞+生长培养基)填充，并且不被生长小瓶1300的旋转速度影响。如所示，当在小瓶中的细胞培养物的光密度(OD)值在高水平处时(例如，在细胞生长过程中稍后)，第二光路1308比第一光路1310短，允许OD值的灵敏测量，而当在小瓶中的细胞培养物的OD值在较低水平处时(例如，在细胞生长过程中较早)，第一光路1310允许OD值的灵敏测量。
旋转生长小瓶1300可以是可重复使用的，或者优选地，旋转生长小瓶是可消耗的。在一些实施例中，旋转生长小瓶1300是可消耗的，并且可以预先填充有生长培养基来被递呈给用户，其中小瓶1300在开口端1304处用箔密封件密封。以这种方式包装的填充有培养基的旋转生长小瓶可以是用于供独立细胞生长设备或供作为自动化多模块细胞编辑仪器的一部分的细胞生长模块使用的套件的一部分。为了将细胞引入到小瓶内，用户只需要用移液管吸取期望体积的细胞，并使用移液管尖端来刺穿小瓶1300的箔密封件。可选地，当然自动化仪器可以将细胞从例如试剂盒转移到生长小瓶。生长培养基可以在生长小瓶中被提供，或者也可以在细胞的添加之前从试剂盒转移到生长小瓶。开口端1304可以包括延伸唇缘1302以与细胞生长设备1350重叠和接合(图13B)。在自动化仪器中，可以用可以由作为处理系统1810的一部分的扫描仪或照相机读取的条形码或其他识别手段来标记旋转生长小瓶1300，如图18所示。
在一些实现中，旋转生长小瓶1300的体积和细胞培养物(包括生长培养基)的体积可以极大地变化，但旋转生长小瓶1300的体积应该足够大，用于使在生长小瓶1300中的细胞培养物在小瓶1300旋转时得到适当的通气。实际上，旋转生长小瓶1300的体积可以范围从1-250ml、2-100ml、从5-80ml、10-50ml或从12-35ml。同样，细胞培养物(细胞+生长培养基)的体积应该适合于允许在旋转生长小瓶1300中的适当通气。因此，细胞培养物的体积应该约为生长小瓶800的体积的10-85％，或生长小瓶的体积的15-80％，或生长小瓶的体积的20-70％、30-60％或40-50％。在一个例子中，对于35ml生长小瓶1300，细胞培养物的体积将为从约4ml至约27ml。
在一些实施例中，旋转生长小瓶1300由生物相容的透明材料制成，或者至少小瓶1300的包括光路的部分是透明的。另外，制造旋转生长小瓶1300的材料应该能够被冷却到大约0℃或更低，并且被加热到大约75℃或更高，例如大约2℃或到大约70℃、大约4℃或到大约60℃、或者大约4℃或到大约55℃，以适应基于温度的细胞测定和在低温下的长期储存。此外，用于制造小瓶的材料优选地能够在旋转时经得起高达55℃的温度而不变形。合适的材料包括玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚砜、聚氨酯以及这些和其它聚合物的共聚物。优选的材料包括聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯。在一些实施例中，通过例如注射成型或挤压来廉价地制造旋转生长小瓶800。
图13B-C示出了接收旋转生长小瓶1300的示例细胞生长设备1350的视图。在一些实施例中，细胞生长设备1350旋转以将在小瓶1300内的细胞或细胞生长加热或冷却至预定温度范围。在一些实现中，旋转生长小瓶1300可以位于主壳体1352内部，其中小瓶1300的延伸唇缘1302延伸出主壳体1352的上表面。在一些方面中，延伸唇缘1302为从设备1350的主壳体1352插入或取回小瓶1300的用户提供抓握表面。另外，当完全插入主壳体1352内时，延伸唇缘1302的下表面邻接主壳体1352的上表面。在一些例子中，细胞生长设备1350的主壳体1352依尺寸被制造为使得旋转生长小瓶1300的外表面邻接主壳体1352的内表面，从而将小瓶1300固定在主壳体1352内。在一些实现中，细胞生长设备1350可以包括布置在主壳体1354的每一侧上的端部壳体1354和布置在主壳体1352的下端处的下壳体1356。在一些例子中，下壳体1356可以包括凸缘1358，凸缘1358可以用于将细胞生长设备1350附接到温度控制(例如，加热/冷却)机构或其他结构，例如自动化细胞处理系统的机箱。
如图13C所示，在一些实现中，细胞生长设备1350可以包括位于主壳体1352中的上轴承1360和下轴承1362，其支撑插入到主壳体1352中的旋转生长小瓶1300的垂直载荷。在一些例子中，细胞生长设备1350还可以包括当被插入到主壳体1352内时与小瓶1300的第一光路1310和第二光路1308对准的主光端口1366和副光端口1368。在一些例子中，主光端口1366和副光端口1368是由透明材料构成的主壳体的间隙、开口或部分，其允许光穿过小瓶1300以执行细胞生长OD测量。除了光端口1366、1368之外，细胞生长设备1350还可以包括为光路提供一个或更多个照明源的发射板1370和在光行进穿过旋转生长小瓶1300中的细胞培养液之后检测光的检测器板1372。在一个例子中，布置在发射板1370上的照明源可以包括发光二极管(LED)或光电二极管，其提供在与在细胞培养物(不管是例如哺乳动物细胞、细菌细胞、动物细胞、酵母细胞)中通常使用的生长培养基相称的一个或更多个目标波长处的照明。
在一些实现中，发射板1370和/或检测器板1372通过有线或无线连接通信地耦合到处理系统(例如，处理系统126、1720、1810)，该处理系统控制由发射板1370输出的光的波长并接收和处理在检测器板1372处感测的照明。在一些方面中，远程可控制的发射板1370和检测器板1372规定在细胞生长的过程期间进行自动OD测量。例如，处理系统126、1720可以控制OD测量被执行的周期，该周期可以是预定的间隔或响应于用户请求。此外，处理系统126、1720可以使用从检测器板1372接收的传感器数据来执行实时OD测量并调节细胞生长条件(例如，温度、旋转的速度/方向)。
在一些实施例中，下壳体1356可以包含生成旋转运动的驱动电机(未示出)，该旋转运动使旋转生长小瓶1300在细胞生长设备1350内旋转。在一些实现中，驱动电机可以包括接合旋转生长小瓶1300的下端的驱动轴1374。在一些实施例中，对旋转生长小瓶1300生成旋转运动的驱动电机是具有内置驱动控件的无刷DC型驱动电机，其可被配置成维持在0和约3000RPM之间的恒定的每分钟转数(RPM)。可选地，可以使用其他电机类型，例如步进电机、伺服电机或有刷DC电机。可选地，驱动电机也可以具有允许旋转方向的反转的方向控件以及感测和报告实际PRM的转速计。在其他例子中，驱动电机可以通过以预定频率反转旋转方向来生成振荡运动。在一个例子中，小瓶1300以350RPM的速度在每个方向上旋转一秒钟。在一些实现中，驱动电机通过有线或无线通信网络通信地耦合到被配置成控制驱动电机的操作的处理系统(例如，处理系统126、1720)，该操作可以包括执行被编程到处理器中和/或由用户输入提供的协议，例如，如关于图18的模块控制器1830所描述的。例如，驱动电机可被配置成改变小瓶1300的速度和/或旋转方向以引起细胞培养物的轴向进动，从而增强混合，以防止细胞聚集并增加通气。在一些例子中，驱动电机的旋转的速度或方向可以基于从检测器板1372接收的光密度传感器数据而变化。
在一些实施例中，细胞生长设备1350的主壳体1352、端部壳体1354和下壳体1356可以由坚固的材料(包括铝、不锈钢和包括塑料的其他导热材料)制成。可以通过各种技术(例如，金属制造、注射成型、熔合的结构层的创建等)来创建这些结构或其部分。虽然在一些例子中旋转生长小瓶1300是可重复使用的，但在其他实施例中小瓶1300优选地是可消耗的。在一些方面中，细胞生长设备1350的其他部件优选地是可重复使用的，并且可以起独立的台式设备或者作为在自动化多模块细胞编辑仪器中的模块的作用。
在一些实现中，通信地耦合到细胞生长模块的处理系统可以用信息被编程以用作生长细胞培养物的“坯件(blank)”或控件。在一些例子中，“坯件”或控件是仅包含产生100％透射率和0OD的细胞生长培养基的盛器，而细胞样品使光线偏转并将具有较低的百分比透射率和较高的OD。当细胞在培养基中生长并变得更密集时，透射率降低且OD增加。在一些实现中，细胞生长模块的处理器可以被编程为使用与在细胞培养物(不管是例如哺乳动物细胞、细菌细胞、动物细胞、酵母细胞)中通常使用的生长培养基相称的坯件的波长值。可选地，第二分光光度计和盛器可以被包括在细胞生长模块中，其中第二分光光度计用于以指定的间隔读取坯件。
为了减少没有接收基因组编辑的细胞的背景，生长模块还可以允许选择过程对已编辑的细胞富集化。例如，引入的核酸可以包括赋予抗生素抗性或另一可选择标记物的基因。使用于连续轮编辑的可选择标记物的引入交替也可以除去未编辑细胞的背景，并允许自动化多模块细胞编辑仪器的多个循环来选择具有连续基因组编辑的细胞。
合适的抗生素抗性基因包括但不限于以下基因：诸如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、刀豆氨酸抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因和氯霉素抗性基因。在一些实施例中，使用溶解增强剂(例如去污剂)、渗透胁迫、温度、酶、蛋白酶、噬菌体、还原剂或离液剂来协助移除死细胞背景。在其他实施例中，细胞移除和/或培养基交换用于减少死细胞背景。
细胞洗涤和/或浓缩模块
细胞洗涤和/或浓缩模块可以利用用于在自动化多模块细胞处理仪器中交换液体的任何方法，并且可以浓缩细胞或者允许它们保留在与在核酸组装模块中使用的实质上相同或更大体积的液体中。此外，在一些方面中，在细胞洗涤模块中执行的过程还通过例如在洗涤中使用甘油来使细胞变成电转感受态的。
许多不同的方法(包括密度梯度纯化、渗析、离子交换柱、过滤、离心沉淀、稀释和用于纯化的珠的使用)可用于洗涤细胞。
在一些方面中，细胞洗涤和/或浓缩模块利用离心设备。在其他方面中，细胞洗涤和/或浓缩模块利用过滤模块。在还有其他方面中，珠与结合到细胞表面的部分耦合。这些部分包括但不限于抗体、外源凝集素、小麦胚芽凝集素、突变的溶菌酶和配体。
在其他方面中，细胞被改变基因结构以被磁化，允许磁体在洗涤步骤之后使细胞成团。细胞磁化的机制可以包括但不限于铁蛋白表达。
在一些实现中，细胞洗涤和/或浓缩模块是过滤模块。转到图12A，框图示出了过滤模块1200的示例功能单元。在一些实现中，过滤模块1200的主控件1202包括吸入洗涤流体1206的第一液体泵1204b和将液体废物移除到液体废物单元1208(例如，图1A的液体废物单元114或图17A和17B的液体废物单元1728)的第二液体泵1204a。流量传感器1212可以在连接器1214上布置到液体废物单元1208以监控液体废物从过滤模块的释放。阀1216(如所示的三通阀)可以在连接器1218上布置到在洗涤盒1210中的洗涤流体1206以选择性地连接洗涤流体1206和过滤模块1200。
在一些实现中，过滤模块1200包括用于过滤和浓缩细胞样品的过滤器歧管1220。过滤器歧管1220可以包括一个或更多个温度传感器1222和压力传感器1224以监控洗涤流体和/或液体废物的流量和温度。在一些实施例中，传感器1222、1224由自动化多模式细胞处理系统的处理系统(例如图18的处理系统1810)监控和分析。过滤器歧管1220可以包括用于引导洗涤流体和/或液体废物的流动的一个或更多个阀1226和1126b。例如，自动化多模式细胞处理仪器的处理系统可以根据用于由过滤模块1200引导过滤的一组指令来启动阀。
过滤模块1200包括至少一个过滤器1230。适合于在过滤模块1200中使用的过滤器的例子包括膜过滤器、陶瓷过滤器和金属过滤器。过滤器可以以任何形状被使用；过滤器例如可以是圆柱形的或基本上平坦的。在一些实施例中，针对给定操作或给定工作流程选择的过滤器取决于工作流程的类型(例如，细菌、酵母、病毒等)或正在被处理的材料的体积。例如，虽然平坦过滤器是相对低成本的且通常被使用，但具有较大表面积的过滤器(例如圆柱形过滤器)可以接受较高的流速。在另一个例子中，当处理小体积的样品(例如，小于约10ml)时，中空过滤器可以展示较低的恢复率。例如，为了供细菌使用，所使用的过滤器是膜过滤器、特别是中空纤维过滤器可能是优选的。术语“中空纤维”意指管状膜。在一些例子中，管的内径为至少0.1mm、更优选地至少0.5mm、最优选地至少0.75mm，以及优选地管的内径为至多10mm、更优选地至多6mm、最优选地至多1mm。具有中空纤维的过滤器模块从许多公司在商业上可得到，包括G.E.Life Sciences(马萨诸塞州Marlborough)和InnovaPrep(密苏里州Drexel)(参见例如Page等人的标题为“Liquid to Liquid Biological ParticleConcentrator with Disposable Fluid Path”的US20110061474A1)。
在一些实现中，过滤模块1200包括过滤器弹出装置1228(例如，致动器)以在使用后弹出过滤器1230。例如，用户或机器人操纵系统可以将过滤器1230推到适当位置上用于使用，使得过滤器在过滤期间由过滤器歧管1220保持。在过滤之后为了移除用过的过滤器1230，过滤器弹出致动器1228可以弹出过滤器1230，释放过滤器1230，使得用户或机器人操纵系统可以从过滤模块1200移除用过的过滤器1230。在一些例子中，用过的过滤器1230可以布置在图1A-1B的固体废物单元112、图17A和图17B的固体废物单元1718中，或者返回到过滤器盒1240，如图12D所示。
转到图12D，在一些实现中，在布置在自动化多模块细胞编辑仪器的机箱内的过滤器盒1240中提供的过滤器1230a、b、c、d通过机器人操纵系统(例如，关于图1A和图1B描述的机器人操纵系统108，或图17A和图17B的机器人操纵系统1708)运输到过滤模块1200，并在使用之前定位在过滤模块1200内。
在一些实现中，过滤模块1200需要定期清洁。例如，处理系统可以通过自动化多模块细胞编辑仪器的用户界面和/或通过无线消息传递装置(例如，文本消息、电子邮件和/或个人计算设备应用)来警告用户何时需要清洁。例如，去污过滤器可以被装载到过滤模块1200中，并且过滤模块1200可以用洗涤溶液和/或酒精混合物被清洁。
在一些实现中，过滤模块1200通过连接器1218与包含洗涤流体1206的洗涤盒1210(例如图11A的洗涤盒1100)流体连接。例如，当由洗涤盒1210的用户定位在自动化多模块细胞编辑仪器的机箱内时，连接器1218可以与洗涤盒1210的底部入口配合，在洗涤流体1206和过滤模块1200之间创建液体通道。
转到图12B和图12C，在一些实现中，双过滤器过滤模块1250包括布置在双洗涤储器1254a和1254b上的双过滤器1252a和1252b。在一个例子中，每个过滤器可以是具有.45um孔且大于85cm2面积的中空芯纤维过滤器。在一些例子中，洗涤储器1254a和1254b在体积上可以是50mL、100mL或超过200mL。在一些实施例中，洗涤储器1254a和1254b布置在洗涤盒1256(例如图11A的洗涤或试剂盒1100)中。
在一些实现中，自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统控制双过滤器1252a和1252b在X(水平)和Z(垂直)方向上的致动以将过滤器1252a、1252b定位在洗涤储器1254a和1254b中。在特定例子中，双过滤器1252a和1252b可以沿着X轴一致地移动，但具有独立的Z轴运动范围。
如所示，过滤模块1250的双过滤器1252a和1252b连接到细长臂主体1258。在一些实施例中，过滤模块1250的任何泵和阀可以远离主体1258布置(例如，在自动化多模块细胞编辑仪器的机箱的底板内)。以这种方式，过滤模块1250可以替代大得多的传统商业过滤模块。
此外，在一些实施例中，过滤模块1250与废物清除系统液体连通，该废物清除系统被设计成将液体废物释放到液体废物储存单元(例如图12A的液体废物盛器1208或图1A的液体废物储存单元114或图17A和图17B的液体废物储存单元1728)中。
FTEP模块
FTEP(转化)模块可以实现常规地通过电穿孔执行的任何细胞转化或转染技术。电穿孔是一种用于细胞膜的透化的广泛使用的方法，其通过用电刺激在细胞膜中暂时生成孔来工作。电穿孔的应用包括DNA、RNA、siRNA、肽、蛋白质、抗体、药物或其他物质到各种细胞(例如哺乳动物细胞(包括人类细胞)、植物细胞、古细菌、酵母、其他真核细胞、细菌和其他细胞类型)的输送。电刺激也可用于在杂交瘤或其他融合细胞的产生中的细胞融合。细胞在典型的电穿孔过程期间悬浮在有利于细胞存活的缓冲液或培养基中。对于细菌细胞电穿孔，低电导培养基(例如水、甘油溶液和诸如此类)常常用于减少由瞬时高电流引起的热产生。然后将细胞和待电穿孔到细胞中的物质(共同地，“细胞样品”)放置在嵌有两个扁平电极的试管中用于放电。例如，Bio-Rad(加州Hercules)建造GENE PULSER XCELLTM产品线以使在试管中的细胞电穿孔。传统上，电穿孔需要高场强。
一般来说，微流控电穿孔(使用小于约20ml和低至1μl的细胞悬液体积)允许对转染或转化过程的更精确的控制，并且与小型电穿孔设备相比允许与其他细胞处理工具的灵活集成。因此，微流控电穿孔为例如单细胞转化、处理和分析、多单元FTEP设备配置以及综合的自动化多模块细胞编辑和分析提供了独特的优点。
本公开提供了实现具有低毒性的高效细胞电穿孔的电穿孔设备、模块和方法，其中电穿孔设备和系统可以与其他自动化细胞处理工具集成。此外，本公开的电穿孔设备允许多路复用，其中两个到许多个电穿孔单元被构造和并行地使用，且允许与机器人液体操纵仪器的特别容易的集成。这种自动化仪器包括但不限于来自Tecan(瑞士Mannedorf)、Hamilton(内华达州Reno)、Beckman Coulter(科罗拉多州Fort Collins)等的现成自动化液体操纵系统。
在电穿孔过程期间，重要的是使用足以实现物质到细胞内的电穿孔的电压，但不是太大的电压，因为太大的电压将降低细胞生存力。例如，为了使人类细胞系的悬液电穿孔，在来自大约1000μF的电容器的指数放电的情况下对于在4mm间隙试管中的0.2ml样品需要200伏。然而，如果将相同的0.2ml细胞悬液放置在具有2cm电极距离(试管间隙距离的5倍)的较长容纳器中，所需的电压将为1000伏，但仅仅需要40μF(1000μF的1/25)的电容器，因为来自电容器的电能遵循以下方程：
E＝0.5U2 C
其中，E是电能，U是电压以及C是电容。因此，高压脉冲发生器实际上易于制造，因为它需要小得多的电容器来存储相似量的能量。类似地，生成更高电压的其他波形也将不是困难的。
本公开的电穿孔设备可以允许在相对短的时间量内的细胞转化的高速率。细胞转化的速率取决于待转化的细胞的类型和数量。例如，对于大肠杆菌，电穿孔设备可提供每秒103到1012、每秒104到1010、每秒105到109、每秒106到108个细胞的细胞转化率。通常，每分钟可转化108个酵母细胞，以及每分钟可转化1010-1012个细菌细胞。电穿孔设备还允许使用并行设备在单个转化过程中转化范围从1个细胞到1012个细胞的成批细胞。
本文描述的FTEP设备的一个实施例在图4A-4C中示出。图4A示出了具有用于将包含细胞和待输送至细胞的外源性物质的流体引入到FTEP设备400内的入口402和用于在电穿孔之后移除转化的细胞的出口404的FTEP设备400的平面顶视图。椭圆电极408被定位成限定流动通道(未示出)的中心部分，其中通道基于电极的曲率而变窄。图4B示出了从设备400的顶部看的剖视图，其中入口402、出口404和电极408相对于流动通道406被定位。注意，电极408限定流动通道406的变窄。图4C示出具有入口402和入口通道412以及出口404和出口通道414的设备400的侧剖视图。电极408在形状上是椭圆形的，并且被定位成使得它们限定流动通道406的狭窄部分。
在本公开的FTEP设备中，转化的毒性水平导致在电穿孔之后的大于30％的活细胞，优选地在转化之后的大于35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至99％的活细胞，这取决于细胞类型和被引入到细胞内的核酸。
FTEP设备的壳体根据FTEP设备是否将被重新使用、用高压灭菌或是用后即可丢弃的可以由许多材料制成，包括不锈钢、硅、玻璃、树脂、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚砜和聚氨酯、这些和其它聚合物的共聚物。类似地，在设备中的通道的壁可以由任何合适的材料制成，包括硅树脂、树脂、玻璃、玻璃纤维、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚砜和聚氨酯、这些和其它聚合物的共聚物。优选的材料包括结晶苯乙烯、环烯烃聚合物(COP)和环烯烃共聚物(COC)，其允许设备完全通过注射成型整体形成，除电极和例如底部密封膜(如果存在的话)之外。
本文描述的FTEP设备(或FTEP设备的部分)可以通过各种技术例如作为整个设备或者通过被融合或以其他方式耦合的结构层的创建来被创建或制造。例如，对于金属FTEP设备，制造可以包括精密机械加工或激光加工；对于硅FTEP设备，制造可以包括干法或湿法蚀刻；对于玻璃FTEP设备，制造可以包括干法或湿法蚀刻、喷粉、喷沙或光结构化；以及对于塑料FTEP设备，制造可以包括热成型、注射成型、热压印或激光加工。FTEP设备的部件可以单独地被制造，且然后被组装，或者FTEP设备的某些部件(或者甚至除电极之外的整个FTEP设备)可以被制造(例如，使用3D印刷)或者成型(例如，使用注射成型)为单个实体，其他部件在成型之后被添加。例如，壳体和通道可以被制造或成型为单个实体，电极(和例如底部密封膜)稍后被添加以形成FTEP单元(见图10F(i))。可选地，FTEP设备也可以在两个或更多个平行层(例如具有水平通道和过滤器的层、具有垂直通道的层以及具有入口和出口的层)中形成，入口和出口被单独地制造和/或成型并在制造之后被组装(见例如图9A)。
在特定的方面中，可以使用电路板作为底座来制造FTEP设备，其中电极、过滤器和/或流动通道在期望的配置中在电路板上形成，并且设备的剩余壳体包含例如一个或更多个入口和出口通道和/或流动通道被形成为单独层，该单独层然后被密封到电路板上。壳体的顶部到电路板上的密封提供本公开的FTEP设备的不同元件的期望配置。此外，两个到许多个FTEP设备可以在单个基底上制造，然后与彼此分离或并行地被使用。在某些实施例中，FTEP设备是可重新使用的，并且在一些实施例中，FTEP设备是用后即可丢弃的。在额外的实施例中，FTEP设备可以是耐高压灭菌的。
电极408可以由任何合适的金属(例如铜、不锈钢、钛、铝、黄铜、银、铑、金或铂)或石墨形成。一种优选的电极材料是合金303(UNS330300)奥氏体不锈钢。外加电场可能破坏由金属(如铝)制成的电极。如果多次使用(例如，非用后即可丢弃的)流通式FTEP设备是需要的——与用后即可丢弃的一次性流通式FTEP设备相反，则电极板可以被涂覆有抗电化学腐蚀的金属。如贵金属(例如金)的导电涂层可以用来保护电极板。
此外，FTEP设备可以包括推挽式气动装置以允许多遍电穿孔过程；也就是说，待电穿孔的细胞可以从入口被“拉”向出口用于一遍电穿孔，然后从流通式FTEP设备的出口端被“推”向入口端以再次在电极之间通过用于另一遍电穿孔。这个过程可以重复一到许多次。
根据待电穿孔的细胞的类型(例如，细菌、酵母、哺乳动物)和电极的配置，在流动通道中的电极之间的距离可以广泛地改变。例如，在图4A-4I、图5A-5H、图6和图7A-7E所示的实施例中，其中电极形成流动通道壁的一部分，其中流动通道在宽度上减小，在流动通道中的电极之间的距离可以在10μm和5mm之间，或者在25μm和3mm之间，或者在50μm和2mm之间，或者在75μm和1mm之间。在其它实施例中，如在图8A-8U、图9A-9C和图10A-10D所示的实施例中，其中电极位于通道变窄的两端上，在流动通道中的电极之间的距离可以在1mm和10mm之间，或者在2mm和8mm之间，或者在3mm和7mm之间，或者在4mm和6mm之间。FTEP设备的总尺寸可以是在长度上从3cm到15cm，或者在长度上4cm到12cm，或者在长度上4.5cm到10cm。FTEP设备的总宽度可以是从0.5cm到5cm，或者从0.75cm到3cm，或者从1cm到2.5cm，或者从1cm到1.5cm。
变窄的流动通道的区域通常足够宽，使得至少两个细胞可以并排配合在狭窄部分中。例如，典型的细菌细胞在直径上为1μm；因此，用于转化这种细菌细胞的FTEP设备的流动通道的狭窄部分将为至少2μm宽。在另一个例子中，如果哺乳动物细胞在直径上为约50μm，用于转化这种哺乳动物细胞的FTEP设备的流动通道的狭窄部分将为至少100μm宽。也就是说，FTEP设备的狭窄部分将不在物理上扭曲或“挤压”被转化的细胞。
在储器用于将细胞和外源性物质引入到FTEP设备内的FTEP设备的实施例中，储器在体积上范围从100μL到10mL，或从500μL到75mL，或从1mL到5mL。在FTEP中的流速范围从每分钟0.1mL至5mL，或从每分钟0.5mL至3mL，或从每分钟1.0mL至2.5mL。在FTEP设备中的压力范围从1到30psi，或从2到10psi，或从3到5psi。
为了避免在电极之间的不同场强，电极应该平行地被布置。此外，电极的表面应尽可能光滑而没有针孔或峰。具有1至10μm的粗糙度Rz的电极是优选的。在本发明的另一个实施例中，流通式电穿孔设备包括将地电位施加到FTEP设备的至少一个附加电极。
电极被配置为输送1-25Kv/cm或5-20Kv/cm或10-20Kv/cm。电极间隔开越远，越多的电压就需要被提供；此外，所输送的电压当然取决于被穿孔的细胞的类型、细胞被悬浮于其中的培养基、电穿孔通道的大小以及电极的长度和直径。存在可以对FTEP设备采用的许多不同的脉冲形式，包括指数衰减波、方波或矩形波、任意波形或波形的选定组合。一种类型的常见脉冲形式是通常通过使加载电容器放电到细胞样品而产生的指数衰减波。通过将电感器链接到细胞样品使得初始峰值电流可以被衰减，可以使指数衰减波较不陡峭。当在指定序列中的多个波形被使用时，它们可以在同一方向(直流)或不同的方向(交流)上。使用交流电可能是有益的，因为细胞的两个局部表面而不是仅仅一个表面可以用于分子输运，且交流电可以防止电解。脉冲发生器可以由数字或模拟面板控制。在一些实施例中，方波形式是优选的，并且在其他实施例中，在方波之前的初始波尖峰是优选的。
FTEP设备可被配置为使体积在1μl至5ml、10μl至2ml、25μl至1ml或50μl至750μl之间的细胞样品电穿孔。用于使细胞和被电穿孔到细胞内的物质(试剂)悬浮以用于电穿孔过程的培养基或缓冲液可以是任何合适的培养基或缓冲液，例如MEM、DMEM、IMDM、RPMI、Hanks'、PBS和Ringer's溶液，其中培养基可以作为成套材料的一部分在试剂盒中被提供。此外，因为细胞必须在转化或转染之前成为电转感受态的，所以缓冲液也可以包括甘油或山梨醇，且也可以包括表面活性剂。对于大多数真核细胞的电穿孔，培养基或缓冲液通常包含盐以维持适当的渗透压力。在培养基或缓冲液中的盐也使培养基变成导电的。对于非常小的原核细胞(例如细菌)的电穿孔，有时使用水或10％甘油作为低电导培养基以允许非常高的电场强度。在这种情况下，待输送的带电分子仍然使基于水的培养基变得比基于脂质的细胞膜更导电，并且该培养基仍然可以被粗略地考虑为导电的，特别是与细胞膜相比。
待电穿孔到细胞中的化合物可以是在本领域中已知对电穿孔有用的任何化合物，例如核酸、寡核苷酸、多核苷酸、DNA、RNA、肽、蛋白质和小分子，如激素、细胞因子、趋化因子、药物或药物前体。在核酸导向核酸酶编辑实施例中，被电穿孔到细胞内的化合物是核酸和蛋白质。
本文描述的FTEP设备的另一实施例在图4D-4F中示出。图4D示出了具有用于将包含细胞和外源性物质的流体引入到FTEP设备410内的入口402和用于在电穿孔之后移除转化的细胞的出口404的FTEP设备410的顶部平面图。圆柱形电极408被定位成限定流动通道(未示出)的中心部分，其中流动通道由于电极的曲率而变窄。图4E示出了从FTEP设备410的顶部看的剖视图，其中入口402、出口404和电极408相对于流动通道406被定位。再次注意，电极408限定流动通道406的狭窄部分或区域。图4F示出了具有入口402和入口通道412以及出口404和出口通道414的设备410的侧剖视图。电极408是圆柱形的，并且位于流动通道406中，限定流动通道406的狭窄部分。
本公开的FTEP设备的又一实施例在图4G-4I中示出。图4G示出了具有用于将包含细胞和外源性物质的流体引入到FTEP设备420内的入口402和用于在电穿孔之后移除转化的细胞的出口404的FTEP设备420的顶部平面图。半圆柱形电极408定位成限定流动通道(未示出)的狭窄部分，其中通道基于电极的曲率从两端变窄。图4H示出了从设备420的顶部看的剖视图，其中入口402、出口404和电极408相对于流动通道406被定位。图4I示出了具有入口402和入口通道412以及出口404和出口通道414的FTEP设备420的侧剖视图。半圆柱形电极408位于流动通道406中，使得它们限定流动通道406的狭窄部分。应该注意，在图4A-4I中描绘的设备示出实质上位于沿着流动通道的中路的电极；然而，在该设备的其他方面中，电极可以定位在流动通道的更朝着FTEP设备的入口或更朝着FTEP设备的出口的狭窄区域中。
图5A-5E示出了具有对于细胞和外源性物质的单独入口的本公开的FTEP设备的实施例。图5A示出了FTEP设备500的顶部平面图，FTEP设备500具有：用于将包含细胞的流体引入到FTEP设备500内的第一入口502；用于将包含待电穿孔到细胞内的外源性物质的流体引入到FTEP设备500内的第二入口518；电极508；以及用于在电穿孔之后移除转化的细胞的出口504。尽管这些实施例用圆柱形电极示出，如图5A所示，但具有弯曲边缘的其它形状(例如，如关于图4A-4I所示的圆柱形、半圆柱形和诸如此类)的电极可以用于限定流动通道。图5B示出了从设备500的顶部看的剖视图，其中第一入口502、第二入口518、出口504和电极508相对于流动通道506被定位。
图5C示出了FTEP设备500的实施例的剖视图，其中第一入口502和第二入口518如图5A和图5B所示被定位。在图5C中，第一入口通道512和第二入口通道522独立地与流动通道506交会，并且液体(细胞和待穿孔或输送到细胞的物质)通过流动通道506流到出口通道514和出口504，其中转化的细胞从FTEP设备被移除。电极508位于流动通道506中，使得它们限定流动通道506的狭窄部分。图5D示出了对在图5A和图5B中描绘的FTEP设备500的实施例的变形510的侧剖视图。在这里，第一入口通道512和第二入口通道524在三向交叉点处与流动通道506相交，并且液体(细胞和待穿孔或输送到细胞的物质)通过流动通道506流到出口通道514和出口504，其中转化的细胞从FTEP设备被移除。电极508位于流动通道506中，限定流动通道506的狭窄部分。图5E示出了图5A和图5B所示的FTEP设备500的又一变形的第一侧剖视图520。在这里，第一入口通道512和第二入口通道526在交叉点处相交，其中在将组合流体引入到流动通道506之前细胞和外源性物质混合。流体通过流动通道506流到出口通道514和出口504，其中转化的细胞从FTEP设备被移除。电极508位于流动通道506中，使得它们限定流动通道506的狭窄部分。
图5F-5H示出了具有对于细胞和外源性物质的单独入口的本公开的FTEP设备的另一实施例。图5F示出了电穿孔设备530的顶部平面图，该电穿孔设备530具有用于引入包含细胞的流体的第一入口502、用于引入待电穿孔到细胞内的外源性物质的第二出口518以及用于在电穿孔之后移除转化的细胞的出口504。电极508位于第一入口502和第二入口518之间，在第一入口502处细胞被引入到FTEP设备内，以及在第二入口518处外源性物质被引入到FTEP设备内。图5G示出了从FTEP设备530的顶部看的剖视图，具有第一入口502、第二入口518、出口504和位于第一入口通道502和第二入口通道518之间的电极508，其中电极508形成流动通道506的狭窄部分。图5H示出了具有第一入口502和第一入口通道512、第二入口518和第二入口通道532以及出口通道514和出口504的FTEP设备530的侧剖视图，在第一入口502处细胞被引入到FTEP设备内，在第二入口518处外源性物质被引入到FTEP设备内，以及在出口504处转化的细胞从FTEP设备被移除。电极508位于流动通道506中，限定流动通道506的狭窄部分，并且位于第一入口通道512和第二入口通道532之间，使得待引入到细胞内的物质在细胞被电穿孔之后被添加到包括细胞的流体。
图6示出了FTEP设备，其中从输入通道引入到流动通道内的流体的流例如使用不互溶的流体(例如油或空气流)被聚焦，以在包含细胞和外源性物质的流体流经过电极时变窄。图6示出了从FTEP设备600的顶部看的剖视图，其中入口602、出口604和电极608位于第一入口通道602和出口604之间。流动聚焦630由不互溶的流体实现，其中电极608形成流动通道606的狭窄部分。(对于与流动聚焦相关的方法和入口配置，见例如Kumacheva的美国公开号2010/0184928)。
示例性FTEP设备的多路复用方面在图7A-7E中示出。图7A示出了本公开的FTEP设备的第一多路复用方面的横截面的顶视图。图7A中的FTEP设备是多路复用FTEP设备700，其中对于每个FTEP单元的平行流动通道706部分地由形成设备(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的共享圆柱形电极708a-708f限定。每个流动通道706具有用于将不同组的细胞和/或外源性物质引入到FTEP单元内的入口702和用于从FTEP单元移除转化的细胞的出口704。相邻单元共享电极，其中电极使电荷交替，例如+/-/+/-/+(也就是说，如果电极708a是+，电极708b是-，电极708c是+，电极708d是-，以此类推)。图7B是本公开的FTEP设备710的第二多路复用实施例的横截面的顶视图的图示。这是多路复用设备710，其中平行流动通道706部分地由共享椭圆形电极708a-708f限定。每个流动通道706具有用于将不同组的细胞和/或外源性物质引入到流动通道706内的入口702以及用于从FTEP单元(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)移除转化的细胞的出口。再次，相邻的设备共享电极，其中电极使电荷交替，例如+/-/+/-/+。
图7C是本公开的FTEP设备的第三多路复用实施例的横截面的顶视图的图示。在该示例性多路复用FTEP设备720中，单独的FTEP单元是交错的。平行流动通道706部分地由未被共享的单独圆柱形电极708a-708j限定，如图7A和图7B所示。每个流动通道706具有它自己的电极对708、用于将不同组的细胞和/或外源性物质引入到FTEP设备内的入口702以及用于从FTEP单元(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)移除转化的细胞的出口。图7D是另一示例性多路复用FTEP设备的横截面的顶视图的图示。在该多路复用FTEP设备730中，交错的平行流动通道706部分地由单独椭圆形电极708a-708j限定。每个流动通道706具有它自己的非共享电极对708(例如，708a/708b、708c/708d、708e/708f、708g/708h和708i/708j)、用于将不同组的细胞和/或外源性物质引入到FTEP单元内的入口702和用于从FTEP单元移除转化的细胞的出口704。图7E是另一示例性多路复用FTEP设备的横截面的顶视图的图示。在该示例性多路复用设备740中，交错的平行流动通道706部分地由单独半圆柱形电极708a-708j限定。每个流动通道706具有它自己的电极对708、用于将不同组的细胞和/或外源性物质引入到FTEP单元内的单独入口702以及用于从FTEP单元移除转化的细胞的出口704。
本公开的FTEP设备的额外实施例在图8A-8U中示出。注意，在图8A-8U中的FTEP设备中，电极不位于流动通道的两侧上以使流动通道变窄；替代地，电极被放置成使得第一电极放置在入口和流动通道的狭窄区域之间，以及第二电极放置在流动通道的狭窄区域和出口之间。图8A示出了具有用于将包含细胞和外源性物质的流体引入到FTEP设备800内的入口802和用于在电穿孔之后从FTEP移除转化的细胞的出口804的FTEP设备800的顶部平面图。电极808通过设备中的通道(未示出)被引入。图8B示出了从FTEP设备800的顶部看的剖视图810，其中入口802、出口804和电极808相对于流动通道806被定位。图8C示出了具有入口802和入口通道812以及出口804和出口通道814的FTEP设备800的侧剖视图。电极808位于电极通道816中，使得它们与流动通道806流体连通，但不直接在细胞行进通过流动通道806的路径中。再次注意，第一电极放置在入口和流动通道的狭窄区域之间，以及第二电极放置在流动通道的狭窄区域和出口之间。
图8D中的设备800的底部的展开侧剖视图830示出在设备的这个方面中的电极808位于通常垂直于流动通道806的电极通道816中，使得包含细胞和外源性物质的流体从入口通道812通过流动通道806流到出口通道814，并且在该过程中流体流入电极通道816内以与电极808接触。在这个方面中，入口通道、出口通道和电极通道都源自设备的同一平面侧，如图8C和图8D所示。然而，在某些方面例如在图8E中所示的方面中，电极从FTEP设备的与入口和出口通道不同的平面侧被引入。在这里，在FTEP设备800的这个替代方面中的电极808位于垂直于流动通道806的电极通道816中，使得包含细胞和外源性物质的流体从入口通道812通过流动通道806流到出口通道814。在缓冲液中的细胞和外源性物质流入电极通道816内以与两个电极808接触；然而，电极808不直接在流动通道806中。在这个方面中，入口通道和出口通道源自设备的与电极和电极通道源自的不同的平面侧。
图8F-8H示出了本公开的FTEP设备的又一方面。图8F示出了具有用于将包含细胞的流体引入到FTEP设备820内的第一入口802和用于在电穿孔之后从FTEP设备820移除转化的细胞的出口804的FTEP设备820的顶部平面图。然而，在该FTEP设备中，有用于引入待电穿孔到细胞内的外源性物质的第二入口822。电极808通过通道(未示出)被引入。图8G示出了从FTEP设备820的顶部看的剖视图，其中第一入口802、第二入口822、出口804和电极808相对于流动通道806被定位。图8H示出了具有入口802、822和入口通道812、824以及出口804和出口通道814的FTEP设备820的侧剖视图。电极808位于电极通道816中，使得它们与流动通道806流体连通，但实质上不在细胞行进通过流动通道806的路径中。在FTEP设备820的这个方面中的电极808位于电极通道816中，其中电极通道816通常垂直于流动通道806，使得包含细胞的流体和包含外源性物质的流体从入口802、822通过入口通道812、824流入流动通道806内并直通地到出口通道814，并且在该过程中在培养基中的外源性物质和细胞流入电极通道816内以与电极808接触。两个电极808之一和电极通道816位于入口802和822以及入口通道812和824与流动通道806的狭窄区域(未示出)之间，以及另一个电极808和电极通道816位于流动通道806的狭窄区域(未示出)与出口通道814和出口804之间。在图8H中，入口通道、出口通道和电极通道都源自设备的同一平面侧，尽管电极(以及入口和出口)也可以被配置为源自例如图8E所示的FTEP设备的不同平面侧。
图8I-8M示出了本公开的设备的又一方面。图8I示出了具有用于将包含细胞和外源性物质的流体引入到FTEP设备830内的入口802和用于在电穿孔之后从FTEP设备830移除转化的细胞的出口804的电穿孔设备830的顶部平面图。电极808通过用机器加工到设备中的通道(未示出)被引入。图8J示出了从设备830的顶部看的剖视图，其示出相对于流动通道806定位的入口802、出口804、实质上均匀的密度的过滤器850和电极808。图8K示出了从设备830的替代配置840的顶部看的剖视图，其中入口802、出口804、实质上增加的梯度密度的过滤器850和电极808相对于流动通道806被定位。在图8I-8M中，像图8F-8H一样，第一电极放置在入口和流动通道的狭窄区域之间，以及第二电极放置在流动通道的狭窄区域和出口之间。在一些实施例例如在图8I-8M中描绘的实施例中，FTEP设备包括布置在流动通道内的过滤器，其位于在入口通道之后且在第一电极通道之前的流动通道中。过滤器可以在孔隙率方面是实质上均匀的(例如，具有如在图8J中的均匀密度)；可选地，过滤器可以在梯度密度方面增加，其中过滤器的靠近入口的端部是密度较小的，以及过滤器的靠近出口的端部是密度较大的(如图8K所示)。该过滤器可由任何合适的且优选地廉价的材料(包括多孔塑料、疏水聚乙烯、棉花、玻璃纤维)制成，或者该过滤器可与FTEP设备主体成一整体并被制造为FTEP设备主体的一部分(见例如图10E)。
图8L示出了具有入口802和入口通道812以及出口804和出口通道814的设备840的侧剖视图。电极808位于电极通道816中，使得它们与流动通道806流体连通，但不直接在细胞行进穿过流动通道806的路径中。注意，过滤器850位于入口802和入口通道812以及电极808和电极通道816之间。图8M中的FTEP设备840的底部的展开侧剖视图示出在FTEP设备840的该方面中的电极808位于电极通道816中并且垂直于流动通道806，使得包含细胞和外源性物质的流体从入口通道812通过流动通道806流到出口通道814，并且在该过程中流体流入电极通道816内以与两个电极808接触。在图8L和图8M中，入口通道、出口通道和电极通道都源自设备的同一平面侧，尽管电极(以及入口和出口)也可以被配置为源自例如图8E所示的不同的平面侧。
图8N-8R示出了本公开的FTEP设备的其他实施例。图8N示出了具有用于将包含细胞的流体引入到FTEP设备内的第一入口802和用于将包含外源性物质的流体引入到FTEP设备内的第二入口818、位于电极通道(未示出)中的电极808以及用于在电穿孔之后移除转化的细胞的出口804的FTEP设备860的顶视图。图8O示出了从包括相对于流动通道806定位的第一入口802、第二入口818、出口804、过滤器850和电极808的设备860的顶部看的剖视图。再次注意，电极808被定位成使得第一电极在流动通道806中的狭窄区域的“入口端”上，而第二电极在流动通道806中的狭窄区域的“出口端”上。图8P示出了设备860的实施例的第一侧剖视图，其中第一入口802和第二入口818如图8N所示被定位。第一入口通道812和第二入口通道824在遇到过滤器850之前单独地与流动通道806交会，并且液体从入口通道812和824通过流动通道806(和过滤器850)流到出口通道814和出口804。注意，在一些实施例中，电极808可以位于电极通道816中，使得电极808与流动通道806的壁齐平(例如，见图10F(iii))。可选地，电极808可以延伸最小距离到流动通道806内；然而，在这么做时，电极808不延伸到流动通道806中到电极阻碍细胞通过流动通道的流动的程度。
图8Q示出了图8N-8P所示的FTEP设备860的实施例的变形的侧剖视图，其中第一入口802和第二入口818如图8N所示被定位。第一入口通道812和第二入口通道824在与流动通道806的三向交叉点处和在遇到过滤器850之前与流动通道806相交。液体通过流动通道806流到出口通道824和出口804。电极808位于电极通道816中，使得它们与流动通道806流体连通，但不直接在细胞行进通过流动通道806的路径中。再次，电极808被定位成使得第一电极在流动通道806中的狭窄区域的“入口端”上，而第二电极在流动通道806中的狭窄区域的“出口端”上。图8R示出了对图8N-8P所示的FTEP设备860的实施例的又一变形的侧剖视图。第一入口通道812和第二入口通道826在交叉点处交叉成为单个通道，之后该单个通道与流动通道806相交。流体从入口802和818通过入口通道812和826流入并通过流动通道806和过滤器850，流入电极通道816内(使得电极808与流动通道806流体连通)，并继续通过流动通道806到出口通道814，并最终到出口804，在出口804处转化的细胞从FTEP设备860被移除。再次在该实施例中，电极808位于电极通道816中，使得它们与流动通道806流体连通，但不直接在细胞行进穿过流动通道806的流动路径中。尽管图8P-8R中的每一个示出了源自该设备的同一平面侧的入口通道、出口通道和电极通道，但在这些方面的每一个中所有的入口、出口和电极也可以被配置成源自FTEP设备的不同平面侧。
图8S-8U示出了本公开的FTEP设备的另一实施例。图8S示出了具有用于将包含细胞的流体引入到FTEP设备870内的第一入口802、用于将被穿孔到细胞内的外源性物质引入到FTEP设备870内的第二入口818以及用于在电穿孔之后从FTEP设备870移除转化的细胞的出口804的电穿孔设备870的顶视图。电极808通过用机器加工到设备中的通道(未示出)被引入，并位于第一入口802和第二入口818之间。图8T示出了从设备870的顶部看的剖视图，其中第一入口802、第二入口818、出口804和电极808相对于流动通道806被定位。此外，在图8T中描绘的FTEP设备包括布置在第一入口802和第一电极808之间并且在流动通道806的狭窄区域之前的过滤器850。该实施例中的过滤器850具有从大到小(从入口802朝着流动通道806的狭窄部分移动)的孔尺寸的梯度。图8U示出了包括第一入口802和第一入口通道812、过滤器850、第二入口818和第二入口通道832以及出口804和出口通道814的FTEP设备870的侧剖视图。电极808位于垂直于流动通道806的电极通道816中以及第一和第二入口之间。电极808与流动通道806流体连通，但不在流动通道中且因而不在细胞行进穿过流动通道806的流动路径中。外源性物质通过第二入口818并通过第二入口通道832被添加到FTEP设备870，并且在细胞被电穿孔后遇到细胞。在图8U中，入口通道、出口通道和电极通道都源自设备的同一平面侧，尽管这些特征也可以被配置为源自FTEP设备870的不同平面侧。
图9A和9B分别示出了本发明的又一实施例的侧剖视图和顶部剖视图。图9A示出了具有顶层952的多层设备900，顶层952具有入口902和入口通道912、流动通道906以及出口904和出口通道914。电极908在底层956上，例如，作为条带被设置在固体基底上。中间层954是固体基底，电极通道916设置在其中，以及电极通道916在这个方面中提供在底层956的电极908和顶层952的流动通道906之间的流体连通。在流体中的细胞和外源性物质经由入口902被引入到FTEP设备900，并流过入口通道912并流入流动通道906，且然后到出口通道914。在该过程中，流体流入电极通道916内，使得电极908与流动通道906流体接触。当细胞穿过在两个电极908之间的流动通道906时，细胞被穿孔。图9B示出了FTEP设备900的实施例的局部剖视图910的顶视图，其示出入口902、出口904、电极908和电极通道916相对于流动通道906的定位。尽管电极在这里被示为条带，但它们也可以被配置为其他形状，例如圆形、圆柱形、不对称、矩形或正方形。
图9C示出了FTEP设备，其中从输入通道引入到流动通道内的流体的流动聚焦930例如使用不互溶的流体(例如油)或使用空气而发生以当流体遇到电极通道和电极时使包含细胞和外源性物质的流体流聚焦(变窄)。图9C示出了从具有第一入口902、在流体离开入口通道并进入流动通道906之后的流体的流动聚焦930以及位于入口902和出口904之间的电极908的设备920的顶部看的剖视图，其中电极908位于流动通道906的狭窄部分的两端上。
在一些实施例中，用于在自动化多模块细胞编辑仪器中使用的试剂盒(例如，图1A的试剂盒104)包括一个或更多个FTEP设备(例如，图1A的电穿孔模块110c，也见图11E的1124)。图10A至10C分别是六个共同连接的FTEP设备1050的顶部透视图、底部透视图和底视图，这些设备可以是例如下面在图11E中的试剂盒1122的一部分(即，用作在试剂盒1122中的FTEP 1124)。图10A描绘布置在单个整体地形成的注射成型环烯烃共聚物(COC)基底1056上的六个FTEP单元1050(即(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi))。图10B所示的通道1006用具有50微米至1mm的厚度的COC膜(未示出)密封。COC膜可以热粘合到组件1000的基部(在图10B中最突出地显示的表面)。在图10B和10C中，共同连接的FTEP设备具有不同的通道架构和电极布置，其在各种应用中可能是有利的。例如，设备(i)、(iv)和(v)的弯曲通道利用惯性来引导流体中的细胞远离电极。电极可以在通道中偏离中心被定位以进一步增强细胞流动并降低对细胞的损害的可能性。这对于对电解效应或在电极附近的pH的局部变化特别敏感的细胞或物质是尤其重要的。如实施例(iii)和(iv)所示，电极可以至少部分地嵌入通道壁中，以便进一步减少这些效应。
六个FTEP单元1050中的每一个具有限定细胞样品入口的阱或储器1052和限定细胞样品出口的阱1054。图10B是图15A的六个共同连接的FTEP设备1050的底部透视图，其也描绘布置在单个基底1056上的六个FTEP单元1050(即(i)-(vi))。可以看到六个入口阱1052，对于每个流通式电穿孔单元1050有一个入口阱1052，以及可以看到一个出口阱1054。在图10B中还可以看到针对每个FTEP单元1050的入口1002、出口1004、流动通道1006和在流动通道1006中的狭窄区域的两端上的两个电极1008。过滤器1070和1072被包括在通道中以防止通道的堵塞，特别是在流动通道的狭窄区域处。图10C是图10A和图10B的六个共同连接的FTEP设备1050的底视图。在图10C中描绘了布置在单个基底1056上的六个FTEP单元1050，其中每个FTEP单元1050包括入口1002、出口1004、流动通道1006和在每个FTEP单元1050中的流动通道1006中的狭窄区域的两端上的两个电极1008。一旦六个FTEP单元1050被制造，它们就可以在所描绘的划线上从彼此分离(例如，“折断开”)，并且一次被使用一个，如在图11E中所描绘的盒中看到的；可选地，可以在两个或更多个FTEP单元1050并行地被使用的实施例中使用FTEP单元。
图10D示出了在图10C中描绘的FTEP单元的扫描电子显微照片，图10D中的单元(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)对应于图10C中的单元(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)。在图10D中，对于每个单元，两个电极通道1016和流动通道1006都可以被看到。
图10E示出了在图10B和图10C中描绘为黑条的过滤器1070和1072的扫描电子显微照片。注意，在该实施例中，过滤器1072的孔隙率朝着流动通道(未示出)从大孔(靠近入口1002)变化到小孔。在该实施例中，通道可选地但不一定变窄。如果存在第二过滤器，第二过滤器的孔隙率也可以变化。在第二过滤器在第二电极和出口通道之间的情况下，过滤器可以朝着出口通道从大孔(靠近第二电极)变化到小孔。比例信息显示在每张显微照片中。
在某些实施例中，过滤器提供在流体遇到流动通道的狭窄部分之前过滤包含细胞和DNA的流体的目的。过滤器因此降低了细胞或其它物质不堵塞流动通道的狭窄部分的可能性。替代地，如果存在对堵塞流动通道的狭窄部分造成威胁的颗粒物质，过滤器将捕获颗粒物质，留下细胞/DNA/流体的其余部分可以移动通过的其它孔。所描绘的结构(与通道壁整体地成型)是特别有利的，因为它降低了设备的成本和复杂性，同时也降低了过滤器本身的零件可能移动和堵塞通道或以其他方式干扰设备操作的风险。注意，在该实施例中，过滤器具有梯度孔尺寸(从靠近入口的大孔到靠近流动通道的狭窄部分的小孔)；然而，在替代实施例中，孔可以是相同的尺寸或者在尺寸上不是梯度的。
此外，在还有其他实施例中，流动通道可以不变窄。在这些特定的实施例中，孔本身可用于提供这种用于增强电穿孔的变窄功能，并且当流体流过通道时流动通道壁不变窄或最小程度地变窄。这些实施例可以允许对通过该设备的细胞的流速的控制以优化外源性物质到各种细胞类型内的引入。
此外，尽管图10E中的扫描电子显微镜照片将过滤器元件显示为圆形“栓”，但应该理解，过滤器元件可以是三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、卵形、椭圆形或其他多面形状的栓。
图10F描绘了(i)在插入到具有入口储器1052和出口储器1054的FTEP设备1000(在这里，六单元FTEP设备)内之前的电极1008。在优选实施例中，设备1000在相对于图10F(i)所示反转的定向上被使用。图10F(ii)描绘被包含在护套内并从护套突出的电极1008。图10F(iii)描绘插入到电极通道1016中的电极1008，电极通道1016(和电极1008)相邻于流动通道1006。在图10F(iii)所示的实施例中，电极与流动通道的壁齐平；也就是说，电极不在流过流动通道1006的细胞/DNA/流体的路径中，然而，电极也不在电极通道1016内凹进。实际上，电极1008可以在电极通道1016内凹进，可以延伸到电极通道1016的端部，并因此与流动通道1006的壁齐平，或者电极1008可以延伸最小距离到流动通道1006内，只要电极不妨碍细胞通过流动通道的运动。在流动通道1006中的开孔的圆形或形成斜面的边缘有助于防止截留空气并减少电场的不连续性。
图10G示出了开孔(其中电极通道1016与流动通道1006交会)的两种不同配置的两个扫描电子显微照片。在图10G(i)(顶部)中，电极通道1016和流动通道1506的交叉点处的边缘包括锐边缘。相反，在图10G(ii)(底部)中，电极通道1016和流动通道1006的交叉点处的边缘包括圆形边缘。这两种配置都被测试(数据未示出)，并且发现圆形边缘配置降低了空气被截留在流动通道1006和在电极通道1016中的电极(在该图中未看到)之间的可能性。可以看到，在该实施例中，入口开孔具有圆形边缘，其优点包括对空气滞留的抗性、层流的促进和细胞损伤的风险的降低。圆形边缘可以具有大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或250微米的曲率半径。事实上，FTEP设备的电极应该是“湿的”；即浸没在流体/细胞/DNA中。
在转化之后，细胞被允许在促进基因组编辑过程的条件下恢复，该基因组编辑过程作为在细胞中的所引入的核酸的转化和表达的结果而发生。
用于自动化多模块细胞编辑的方法
图14是用于使用自动化多模块细胞编辑仪器(例如，图1A-1B和17A-17B所示的系统)的示例方法1400的流程图。此外，例如图18的处理系统可以指导方法1400的处理阶段。例如，软件脚本可以识别对于每个处理阶段的设置和用于机器人操纵系统的移动的指令，以执行方法1400的行动。在一些实施例中，软件指令脚本可以由提供到自动化多模块细胞编辑仪器的盒识别。例如，盒可以包括机器可读标记，例如条形码或QR码，包括存储在自动化多模块细胞编辑仪器的存储器(例如，图18的存储器1802)中的脚本的标识。在另一个例子中，盒可以包含嵌在机器可读标记(例如射频(RF)标签)中的可下载脚本。在其他实施例中，用户可以例如通过经由有线或无线连接将脚本下载到自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统或者通过经由自动化多模块细胞编辑仪器的用户界面选择所存储的脚本来识别脚本。在特定例子中，自动化多模块细胞编辑仪器可以包括用于提交用户设置和激活细胞处理的触摸屏接口。
在一些实现中，方法1400以将细胞转移到生长模块(1402)开始。生长模块可以是可修改来自动操作的任何生长模块，例如可以是关于图13B和图13C描述的生长模块1350。在特定例子中，处理系统1720可以指导机器人操纵系统1708来将细胞1706转移到生长模块1710a，如关于图17A和图17B所述的。在另一个例子中，如关于图1A所描述的，细胞可以由机器人操纵系统108从盒104、106之一转移到生长模块110a、110b。在一些实施例中，生长小瓶可以包含生长培养基，并且例如作为套件的一部分被提供。在其他实施例中，生长小瓶可以填充有例如通过液体处理设备从试剂容纳器转移的培养基。
在一些实施例中，在转移细胞(例如，从试剂盒或从添加到仪器的小瓶)之前，可以对小瓶或位于为细胞指定的位置上的其他容纳器扫描机器可读标记以确认小瓶或容纳器被标记为包含细胞。此外，机器可读标记可以指示提供到仪器的细胞的类型。在一些实施例中，细胞的类型可以使仪器选择特定的处理脚本(例如，机器人操纵系统的一系列指令以及各种模块的设置和激活)。
在一些实现中，细胞在生长模块中生长至期望的光密度(1404)。例如，图1A-1B的处理系统126或图17A-B的处理系统1720可以管理生长模块110a的温度设置，用于在生长周期中培养细胞。处理系统126、1720可进一步从生长模块110a、110b、1710a接收指示光密度的传感器信号，并分析传感器信号以监控细胞的生长。在一些实施例中，用户可以设置用于管理细胞的生长的生长参数。例如，温度和细胞的搅动程度。此外，在一些实施例中，用户可以关于生长过程被更新。在一些例子中，更新可以包括在自动化多模块细胞编辑仪器的用户界面上呈现的消息、到用户的蜂窝电话号码的文本消息、到电子邮件账户的电子邮件消息或者传输到在便携式电子设备(例如，蜂窝电话、平板电脑等)上执行的应用的消息。在一些实施例中，响应于该消息，用户可以修改参数，例如温度，以调节细胞生长。例如，用户可以通过自动化多模块细胞编辑仪器的用户界面或者通过与自动化多模块细胞编辑仪器通信的便携式计算设备应用(例如图16的用户界面1600)来提交已更新的参数。
尽管关于光密度被描述，但在其他实现中，在生长模块内的细胞生长可以使用细胞密度和生理状态(例如在一些例子中的pH、溶解氧、释放的酶、声学特性和电特性)的不同度量来被监控。
在一些实现中，当达到期望的光密度(1404)时，细胞从生长模块转移到过滤模块或细胞洗涤和浓缩模块(1406)。例如，图1A-1B的机器人操纵系统108或图17A-17B的机器人操纵系统1708可以将细胞从生长模块1710a转移到过滤模块1710b。例如，过滤模块可以设计成使细胞成为电转感受态的。此外，过滤模块可以被配置成将细胞样品的体积减小到适合于电穿孔的体积。在另一个例子中，过滤模块可以被配置为从细胞样品去除不需要的组分，例如盐。在一些例子中，过滤系统执行前述任务中的两个，并且在某些优选实施例中执行所有三个前述任务，使细胞成为电转感受态的，减小包含细胞的流体的体积并且去除不需要的组分。在一些实施例中，机器人操纵系统1708将洗涤溶液转移到过滤模块1710b，用于洗涤细胞。
在一些实现中，细胞变成电转感受态的并在过滤模块或细胞洗涤和浓缩模块中被洗脱(1408)。细胞可以使用洗涤液被洗脱。例如，可以使用来自试剂供应品的试剂来洗脱细胞。例如，过滤模块或细胞洗涤和浓缩模块可以类似于关于图12A-12D描述的过滤模块1200。如上面所讨论的，许多不同的方法(包括密度梯度纯化、渗析、离子交换柱、过滤、离心沉淀、稀释和用于纯化的珠的使用)可用于洗涤细胞。在一些方面中，细胞洗涤和/或浓缩模块利用离心设备。在其他方面中，过滤模块利用过滤仪器。在还有其他方面中，珠与结合到细胞表面的部分耦合。这些部分包括但不限于抗体、外源凝集素、小麦胚芽凝集素、突变的溶菌酶和配体。在其他方面中，细胞被改变基因结构以被磁化，允许磁体在洗涤步骤之后使细胞成团。细胞磁化的机制可以包括但不限于铁蛋白表达。
在一些实施例中，洗涤溶液在洗脱之前被转移到过滤模块。例如，图17A-17B的机器人操纵系统1708可以从位于为洗涤溶液指定的位置上的小瓶或容纳器转移洗涤溶液。在转移洗涤溶液之前，可以对位于为洗涤溶液指定的位置上的小瓶或其他容纳器或储器扫描机器可读标记以确认小瓶、容纳器或储器的内容物。此外，机器可读标记可以指示提供到仪器的洗涤溶液的类型。在一些实施例中，洗涤溶液的类型可以使系统选择特定的处理脚本(例如，适合于特定洗涤溶液的过滤模块的设置和激活)。
在其他实施例中，细胞在洗涤盒的细胞洗涤模块中被洗脱。例如，洗脱的细胞可以被收集在图1A所示的洗涤盒106的空盛器中，并且机器人操纵系统108可以将培养基从试剂盒104(或洗涤盒106的试剂肼)转移到洗脱的细胞。
一旦细胞变成电转感受态的并悬浮在合适的体积(例如，50μl至10ml、或100μl至80ml、或150μl至8ml、或250μl至7ml、或500μl至6ml、或750μl至5ml)中用于通过过滤模块转化(1406)，在一些实现中细胞就被转移至FTEP模块(1418)。例如，图1A-1B的机器人操纵系统108可以将细胞从过滤模块转移到FTEP设备110c。过滤模块可以物理地耦合到FTEP设备，或者这些模块可以是分离的。在例如具有基于盒的供应品的图1A的仪器100的实施例中，在转移到转化模块之前，细胞可以被洗脱到在盒(例如试剂盒104)内的储器。
在一些实现中，核酸在自动化多模块细胞编辑仪器之外被制备。例如，在方法1400中运行转化过程和其他过程之前，组装的载体或其他核酸组装物可以作为试剂由用户包括。
然而，在其他实现中，核酸由自动化多模块细胞编辑仪器制备。在一些实施例中，下面的步骤1410至1416的一部分与步骤1402至1408的一部分并行地被执行。在一些实施例中，下面的步骤中的至少一部分在步骤1402至1408之前和/或之后被执行。
在一些实现中，核酸(例如编辑寡核苷酸)和载体骨架以及在一些例子中酶和其他反应组分被转移到核酸组装模块(1410)。核酸组装模块可以被配置成以自动化方式执行各种不同的核酸组装技术中的一种或更多种。可以在核酸组装模块中执行的核酸组装技术可以包括但不限于使用限制性内切酶的那些组装方法，包括PCR、BioBrick组装、IIS型克隆、GoldenGate组装和连接酶循环反应。在其他例子中，核酸组装模块可以基于在核酸的相邻部分之间的重叠来执行组装技术，例如Gibson
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CPEC、SLIC、连接酶循环等。可由核酸组装模块执行的额外的示例组装方法包括在酵母、通路(gateway)克隆和拓扑异构酶介导克隆中的缺口修复。例如，核酸组装模块可以是关于图3描述的核酸组装模块300。在特定例子中，处理系统1720可以指导机器人操纵系统1708将核酸1704转移到核酸组装模块1710g，如关于图17B所述的。在另一个例子中，如关于图1A所述的，核酸可以由机器人操纵系统108从盒104、106之一转移到核酸组装模块。
在一些实施例中，在转移核酸样品、酶和其他反应组分中的每个之前，可以对位于为这些材料指定的位置上的小瓶或其他容纳器扫描机器可读标记以确认小瓶或容纳器被标记为包含预期的材料。此外，机器可读标记可以指示提供到仪器的核酸样品、酶和其他反应组分中的一个或更多个的类型。在一些实施例中，材料的类型可以使仪器选择特定的处理脚本(例如，用于使机器人操纵系统识别另外的材料和/或核酸组装模块的设置和激活的一系列指令)。
在一些实施例中，根据所使用的核酸组装物的类型，核酸组装模块是温度受控的。例如，当在核酸组装模块中利用PCR时，该模块将具有热循环能力，允许温度在变性、退火和延伸之间循环。当在核酸组装模块中利用单一温度组装方法时，该模块可具有达到并被保持在优化正在被执行的特定组装过程的温度的能力。
在一些实施例中，温度控制由自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统(例如图18的处理系统1810)管理。这些温度和维持温度的持续时间可以由预编程的一组参数确定(例如，在处理脚本中或者在由处理系统可访问的另一个存储器空间中被识别)，或者由用户通过与处理系统接口连接来手动地控制。
一旦足够的时间过去用于使组装反应发生，在一些实现中，核酸组装物被转移到纯化模块(1414)。例如，处理系统可以基于反应的类型、材料的类型和提供到自动化多模块细胞编辑仪器的用户设置中的一个或更多个来监控组装反应的定时。例如，图1A-1B的机器人操纵系统108或图17A-17B的机器人操纵系统1708可以通过吸管或移液管接口来将核酸组装物转移到纯化模块。在另一个例子中，图1A-1B的机器人操纵系统108或图17A-17B的机器人操纵系统1708可以将包含核酸组装物的小瓶从核酸组装模块的室转移到脱盐/纯化模块的室。
在一些实现中，核酸组装物在纯化模块处被脱盐和洗脱(1416)。例如，纯化模块可以去除核酸组装物混合物中不需要的组分(例如，盐、矿物质等)。在一些实施例中，纯化模块将组装的核酸浓缩到比核酸组装物体积更小的体积内。用于在核酸组装之后交换液体的方法的例子包括磁珠(例如，由加利福尼亚州Carlsbad的Invitrogen Corp.生产的SPRI或Dynal(Dynabead))、二氧化硅珠、二氧化硅旋转柱、玻璃珠、沉淀(例如，使用乙醇或异丙醇)、碱裂解、渗透纯化、用丁醇提取、基于膜的分离技术、过滤等。例如，可以使用配备有具有变化的孔隙率的各向异性的、亲水地生成的纤维素膜的一个或更多个微型浓缩器。在另一个例子中，脱盐/纯化模块可以通过将混合物与包括不能溶解的磷酸盐的离子交换剂接触、除去液体以及从离子交换剂洗脱核酸来处理包括核酸和离子盐的液体样品。
在说明性实施例中，核酸组装物可以在纯化模块的室中与磁珠(例如SPRI珠)组合。核酸组装物可以在设定的温度下被培养足够的时间，用于使组装的核酸结合到磁珠。在培养之后，可以在室附近接合磁体，使得核酸组装物可以被洗涤和洗脱。关于图3的组合核酸组装和纯化模块讨论了该过程的说明性例子。
一旦核酸组装物被洗脱，在一些实现中，核酸组装物被转移到转化模块(1418)。例如，图1A-1B的机器人操纵系统108或图17A-17B的机器人操纵系统1708可以如上所述通过吸管或移液管到FTEP的接口来将组装的核酸转移到转化模块。例如，在转移期间，脱盐的组装核酸可以与来自步骤1408的电转感受态细胞组合。在其他实施例中，转化模块可以单独地接受电转感受态细胞和核酸组装物中的每个，并实现混合(例如，打开一个或更多个通道以在共享室中组合材料)。
在FTEP模块中转化细胞(1420)。缓冲液或培养基可以被转移到转化模块并被添加到细胞，使得细胞可以在电穿孔期间悬浮在有利于细胞存活的缓冲液或培养基中。在转移缓冲液或培养基之前，可以对位于为缓冲液或培养基指定的位置上的小瓶或其他容纳器或储器扫描机器可读标记以确认小瓶、容纳器或储器的内容物。此外，机器可读标记可以指示提供到仪器的缓冲液或培养基的类型。在一些实施例中，缓冲液或培养基的类型可以使仪器选择特定的处理脚本(例如，适合于特定缓冲液或培养基的转换模块的设置和激活)。对于细菌细胞电穿孔，低电导培养基(例如水、甘油溶液)可以用于减少由瞬时高电流引起的热产生。对于酵母细胞，可以使用山梨醇溶液。对于哺乳动物细胞电穿孔，细胞可以悬浮在高传导性培养基或缓冲液(例如MEM、DMEM、IMDM、RPMI、Hanks'、PBS、HBSS、HeBS和Ringer's溶液)中。在特定例子中，机器人操纵系统108(图1A)可以将缓冲溶液从盒104、106之一转移到FTEP模块110c。如关于图4A-4I、图5A-5H、图6、图7A-7E、图8A-8U和图9A-9C所述的，FTEP设备可以是用后即可丢弃的FTEP设备和/或FTEP设备110c可以设置有图1A的盒104(或图11E中的盒1122的FTEP设备1124)。
一旦被转化，细胞就被转移到第二生长/恢复/编辑模块(1422)。例如，图1A-1B的机器人操纵系统108或图17A-17B的机器人操纵系统1708可以通过吸管或移液管接口将转化的细胞转移到第二生长模块。在另一个例子中，1A-1B的机器人操纵系统108或图17A-17B的机器人操纵系统1708可以将包含转化的细胞的小瓶从转化模块的室转移到第二生长模块的室。
在一些实施例中，第二生长模块充当恢复模块，允许细胞从转化过程恢复。在其他实施例中，细胞可以在被输运到第二生长模块之前被提供到单独的恢复模块。在恢复期间，第二生长模块允许摄取转化的细胞，并且在某些方面中将引入的核酸整合到细胞的基因组中。第二生长模块可被配置成在对细胞生长最佳的任何用户定义的温度、优选地25°、30°或37℃下培养细胞。
在一些实施例中，第二生长模块表现为选择模块，基于抗生素或其他试剂来选择转化的细胞。在一个例子中，RNA导向核酸酶(RGN)蛋白质系统用于选择，以使还没有接收期望编辑的细胞的基因组裂解。用于选择的RGN蛋白质系统可以与用于编辑的RGN相同或不同。在抗生素选择剂的例子中，可以将抗生素添加到第二生长模块以进行选择。合适的抗生素抗性基因包括但不限于以下基因：诸如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、刀豆氨酸抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。例如，图1A-1B的机器人操纵系统108或图17A-17B的机器人操纵系统1708可以通过吸管或移液管接口将抗生素转移到第二生长模块。在一些实施例中，使用溶解增强剂(例如去污剂)、通过缺氧洗涤(hyponic wash)进行的渗透胁迫、温度、酶、蛋白酶、噬菌体、还原剂或离液剂来协助移除死细胞背景。例如，图18的处理系统1810可以改变环境变量，例如温度，以诱导选择，而图1A-1B的机器人操纵系统108或图17A-17B的机器人操纵系统1708可以输送额外的材料(例如，清洁剂、酶、还原剂等)以帮助选择。在其他实施例中，细胞去除和/或通过过滤进行的培养基交换用于减少死细胞背景。
在另外的实施例中，除了应用选择之外或作为应用选择的替代方案，第二生长模块用作编辑模块，允许在转化的细胞中的基因组编辑。可选地，在其他实施例中，恢复和选择(如果被执行的话)后的细胞被转移到单独的编辑模块。作为编辑模块，第二生长模块例如通过便于引入的核酸的表达来诱导细胞的基因组的编辑。核酸酶和/或编辑盒核酸的表达可以涉及化学、光、病毒或温度诱导方法中的一个或更多个。例如，第二生长模块可以被配置成在温度诱导过程期间加热或冷却细胞。在特定的说明中，可以通过在42℃-50℃下加热来诱导细胞。关于说明，然后可以在诱导之后将细胞冷却至0-10℃。在化学或病毒诱导的例子中，可以将诱导剂转移到第二生长模块以诱导编辑。如果诱导型核酸酶和/或编辑盒在编辑期间被引入到细胞，则它可以通过诱导分子(例如关于图17A描述的诱导分子1724)的引入来被诱导。在一些实现中，诱导剂或诱导分子由图1A-1B的机器人操纵系统108或图17A-17B的机器人操纵系统1708转移到第二生长模块(例如，通过吸移管或移液管接口)。
在一些实现中，如果没有额外的细胞编辑是需要的(1424)，则细胞可以从细胞生长模块转移到储存单元，用于稍后从自动化多模块细胞编辑仪器移除(1426)。例如，储存单元可以包括图17A-17B的储存单元1714。例如，图1A-1B的机器人操纵系统108或图17A-17B的机器人操纵系统1708可以通过吸管或移液管接口来将细胞转移到储存单元114。在另一个例子中，图1A-1B的机器人操纵系统108或图17A-17B的机器人操纵系统1708可以将包含细胞的小瓶从第二生长模块的室转移到在储存单元内的小瓶或管。
在一些实现中，如果额外的细胞编辑是需要的(1424)，则细胞可以被转移到相同或不同的过滤模块并成为电转感受态的(1408)。此外，在一些实施例中，新的所组装的核酸样品可以在这个时间由核酸组装模块制备，或者可选地，第二完全组装的核酸可以被直接引入到细胞。在递归编辑之前，在一些实施例中，自动化多模块细胞编辑仪器可能需要由用户例如通过一个或更多个单独的试剂小瓶或盒的引入来提供额外的材料。
步骤在第二轮编辑期间可以是相同或不同的。例如，在一些实施例中，在随后执行步骤1404时，选择性生长培养基被转移到生长模块以实现来自第一轮编辑的已编辑细胞的选择。例如，图1A-B的机器人操纵系统108或图17A-17B的机器人操纵系统1708可以从位于为选择性生长培养基指定的位置上的试剂盒中的小瓶或容纳器转移选择性生长培养基。在转移选择性生长培养基之前，可以在位于为选择性生长培养基指定的位置上的小瓶或其他容纳器或储器上扫描机器可读标记以确认小瓶、容纳器或储器的内容物。此外，机器可读标记可以指示提供到仪器的选择性生长培养基的类型。在一些实施例中，选择性生长培养基的类型可以使仪器选择特定的处理脚本(例如，适合于特定选择性生长培养基的生长模块的设置和激活)。关于图15A至15C来描述递归编辑工作流程的特定例子。
在一些实现中，方法1400可以被确定时间以引入材料和/或与用户的时间表配合来完成编辑周期或生长周期。例如，自动化多模块细胞编辑仪器可以向用户提供安排一个或更多个细胞处理周期(例如，一个或更多个递归编辑)的完成的能力，使得方法1400以在用户的优选时间完成的目标被制定。例如，可以通过用户界面(例如图18的用户界面1816)来设置时间安排。仅为了说明，用户可以将第一周期的完成时间设置为4:00PM，使得用户可以向自动化多模块细胞编辑仪器提供材料的额外盒以实现另一轮细胞编辑的过夜处理。因此，用户可以对程序计时，使得两个或更多个周期可以在特定时间段(例如24小时时段)内被编程。
在一些实现中，在整个方法1400中，自动化多模块细胞编辑仪器可以向用户警告它的当前状态。例如，图18的用户界面1816可以呈现当前处理阶段的图形指示。在特定例子中，自动化多模块细胞处理仪器的正面可以用用户界面(例如，触摸屏)覆盖，该用户界面呈现描绘细胞处理的当前状态的动画图形。用户界面可以进一步呈现与当前处理阶段相关联的任何用户和/或默认设置(例如，温度设置、时间设置等)。在某些实现中，状态可以通过无线通信控制器传递给用户。
尽管被示为特定的一系列操作，但在其他实施例中在方法1400中可以包括更多或更少的步骤。例如，在一些实施例中，在参与每一轮编辑之前，储器、盒和/或小瓶的内容物可以被筛选以确认合适的材料可用于继续处理。例如，在一些实施例中，一个或更多个成像传感器(例如，条形码扫描仪、照相机等)可以确认在自动化多模块细胞编辑仪器的壳体内的不同位置处的内容物。在一个例子中，多个成像传感器可以布置在自动化多模块细胞编辑仪器的壳体内，每个成像传感器被配置成检测一种或更多种材料(例如，机器可读标记，例如条形码或QR码、材料的形状/尺寸等)。在另一个例子中，至少一个成像传感器可以由机器人操纵系统移动到多个位置以检测一种或更多种材料。在另外的实施例中，一个或更多个重量传感器可以检测用后即可丢弃的或可替换的材料的存在或不存在。在说明性例子中，转移尖端供应品保持器可以包括重量传感器以检测尖端是否被装载到该区域中。在另一个说明性例子中，光学传感器可以检测到液体废物的水平已经达到阈值水平，需要在继续细胞处理之前的处置，或者，如果最低水平没有达到，则需要液体添加，以继续进行。对额外材料的请求、废物供应品的移除或其他用户干预(例如，一个或更多个元件的手动清洁等)在一些实现中被呈现在自动化多模块细胞编辑仪器的图形用户界面上。在一些实现中，自动化多模块细胞编辑仪器例如通过软件应用、电子邮件或文本消息用对新材料或其他手动干预的请求来联系用户。
用于在自动化多模块细胞编辑仪器中的细胞处理的工作流程
自动化多模块细胞编辑仪器被设计成使用相同的模块来执行各种细胞处理工作流程。例如，在单独容纳器中或以盒形式的源材料可以不同，且相应的指令(例如，软件脚本)可以使用相同的基本仪器和机器人操纵系统来相应地被选择；也就是说，多模块细胞编辑仪器可以被配置成执行用于处理细胞样品和不同类型的细胞样品的许多不同的工作流程。在实施例中，可以迭代地执行相同的工作流程以递归地编辑细胞样品。在其他实施例中，细胞样品被递归编辑，但工作流程可以从一个迭代到另一迭代改变。
图15A至15C示出了可以使用包括两个细胞生长模块1502、1508、两个过滤模块1504和1510以及流通式电穿孔模块1506的自动化多模块细胞编辑仪器来执行的示例工作流程。尽管被描述为单独的生长模块1502、1508和过滤模块1504、1510，但每一个模块都可以被设计为双模块或集成模块。例如，双生长模块(包括生长模块1502和1508)可以包括共享某个电路、控件和电源并布置在同一壳体中的双旋转生长小瓶。类似地，双过滤模块可以包括过滤模块1504和1510，包括两个单独的过滤器和液体供应管，但共享电路、控件、电源和壳体。例如，模块1502、1504、1506、1508和1510可以是关于图1A和图1B描述的仪器100的一部分。
转到图15A，流程图示出了第一细菌基因组编辑工作流程1500，其涉及具有相同处理步骤的两个处理阶段，导致对细胞储备物1512的两次编辑。每个阶段可以基于源材料的不同盒来操作。例如，第一盒可以包括第一寡核苷酸文库1514a和第一载体骨架，例如表达质粒1516a。在处理阶段之间或在处理之前引入到自动化多模块细胞编辑仪器内但在与第一盒不同的位置上的第二盒可以包括第二寡核苷酸文库1514b和第二载体骨架1516b。每个盒可以被考虑为用于构建已编辑细胞的文库的“文库盒”。在一些实施例中，细胞文库1512被包括在第一文库盒中。细胞储备物1512可以在包括两个盒的套件中被提供。可选地，用户可以将细胞储备物1512的容纳器(例如小瓶或管)添加到所购买的盒中。
在一些实施例中，基于由自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统(例如图18的处理系统1810)执行的脚本来执行工作流程1500。在第一例子中，可以经由被添加到第一盒的机器可读标记或标签来访问脚本。在一些实施例中，使用单独的脚本来执行每个处理阶段。例如，每个盒可以包括用于处理盒的内容物的脚本本身或脚本的指示。
在一些实现中，第一阶段以将细胞储备物1512引入到第一生长模块1502中用于接种、生长和监控(1518a)开始。在一个例子中，机器人操纵系统将细胞储备物1512的小瓶添加到在第一生长模块1502的旋转生长小瓶中包含的培养基。在另一个例子中，机器人操纵系统用移液管从第一盒吸取细胞储备物1512，并将细胞储备物1012添加到在旋转生长小瓶中包含的培养基。此时细胞可能被维持在4℃的温度处。在特定的例子中，20ml的细胞储备物可以在第一生长模块1002的旋转生长小瓶中在30℃的温度下生长至0.50的OD。添加到第一生长模块1502的细胞储备物1012可以随着时间的过去被监控，直到经由生长小瓶的自动监控感测到0.50OD为止。监控可以是周期性的或连续的。这可能花费例如大约900分钟(所估计的)，尽管确切的时间取决于期望OD的检测。
在一些实现中，在使细胞生长至期望OD之后，将诱导剂添加至第一生长模块1502用于诱导细胞。在特定的例子中，可以添加100μl的诱导剂，并且生长模块1502可以将混合物的温度升至42℃并保持15分钟。
细胞储备物1512在生长和诱导之后在一些实现中被转移到第一过滤模块1504，用于使细胞成为电转感受态的(1520a)并减小用于转化的细胞的体积。在一个例子中，机器人操纵系统将细胞储备物1512的小瓶从第一生长模块1502的旋转生长小瓶移动到第一过滤模块1504的小瓶保持器。在另一个例子中，机器人操纵系统用移液管从第一生长模块1502的旋转生长小瓶吸取细胞储备物1512，并将它输送到第一过滤模块1504。例如，用于将细胞储备物1512转移到第一生长模块1502的用后即可丢弃的移液管尖端可用于将细胞储备物1512从第一生长模块1502转移到第一过滤模块1504。在一些实施例中，在将细胞储备物1512从第一生长模块1502转移至第一过滤模块1504之前，将第一生长模块1502冷却至4℃，使得细胞储备物1512类似地降低至该温度。在特定例子中，第一生长模块1502的温度可以在大约8分钟的时长内降低到大约4℃，并且生长模块1502可以将温度保持在4℃处大约15分钟以确保细胞储备物1512的温度的降低。
在转移细胞储备物之前，在一些实现中，使用洗涤溶液来预洗涤第一过滤模块1504的过滤器。例如，可以在洗涤盒例如参考图1A描述的盒106中提供洗涤溶液。
例如，第一过滤模块1504可以是双过滤模块(例如关于图12B和图12C描述的过滤模块1250)的一部分。在特定例子中，第一过滤模块1504可以在洗涤和洗脱过程期间被维持在4℃处，同时在洗脱小瓶和第一过滤模块1504之间转移细胞材料。
在一些实现中，在过滤模块1504处使细胞成为电转感受态后，细胞储备物1512被转移到转化模块1506(例如，流通式电穿孔模块)用于转化。在一个例子中，机器人操纵系统将细胞储备物1512的小瓶从第一过滤模块1504的小瓶保持器移动到流通式电穿孔模块1506的储器。在另一个例子中，机器人操纵系统用移液管从第一过滤模块1502或临时储器吸取细胞储备物1512，并将它输送到第一过滤模块1504。在特定例子中，来自第一过滤模块1504的400μl的浓缩细胞储备物1512在转移到转化模块1506之前被转移到混合储器。例如，细胞储备物1512可以被转移到盒中的储器用于与组装的核酸混合，然后由机器人操纵系统使用移液尖端来转移。在特定例子中，转化模块被维持在4℃处。在说明性的例子中，细胞储备物1512可以在大约四分钟内被转化。
当细胞正生长和/或成为电转感受态的时，在一些实现中，使用核酸组装过程来组装第一寡核苷酸文库1514a和载体骨架1516a以例如使用热循环器和连接过程或在核酸组装主混合物中产生组装的核酸(1522a)。组装的核酸可以在工作流程1500的第一阶段的第一处理步骤1518a、1520a期间的某个时间点产生。可选地，可以在开始第一处理步骤1518之前产生组装的核酸。
在一些实施例中，使用自动化多模块细胞编辑仪器的核酸组装模块来组装核酸。例如，机器人操纵系统可以将来自在自动化多模块细胞编辑仪器中的试剂盒中的文库盛器的第一寡核苷酸文库1514a和载体骨架1516a添加到核酸组装模块(未示出)，例如关于图17B描述的核酸组装模块1710g。在特定的实施例中，在核酸组装模块中执行的核酸组装是等温核酸组装。例如，核酸组装混合物在特定的例子中可包括50μl Gibson
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主混合物(Master Mix)、25μl载体骨架1516a和25μl寡核苷酸1514a。核酸组装模块可以被保持在室温处或另一期望温度处。
在其他实施例中，核酸在外部被组装到多模块细胞编辑仪器，并作为功能源材料被添加。例如，在激活接种、生长和细胞处理的第一步骤1518a之前，可以将组装的核酸的小瓶或管添加到试剂盒。在特定的例子中，提供100μl的组装核酸。
在其他实施例中，核酸在组分中被引入到细胞，并且转化的细胞的机构将例如使用在酵母细胞中的间隙修复机制在细胞内执行组装。
在一些实现中，组装的核酸在进一步使用之前被纯化(1524a)。例如，组装之后，核酸可以由机器人操纵系统从核酸组装模块转移到纯化模块(未示出)。在其他实施例中，核酸组装模块可以包括纯化特征(例如，组合核酸组装和纯化模块)。在另外的实施例中，组装或分离的核酸在多模块细胞编辑仪器的外部被纯化，并作为功能源材料被添加。例如，在激活细胞处理的第一步骤1518a之前，可以将纯化的组装核酸的小瓶或管添加到具有细胞储备物1012的试剂盒。
在特定的例子中，在核酸组装混合物中的100μl的组装核酸被组装并随后被纯化。在一些实施例中，磁珠被添加到核酸组装模块，例如，在液体悬液中的180μl的磁珠可以由机器人操纵系统添加到核酸组装模块。可激活在功能上耦合到核酸组装模块的磁体，并在200μl乙醇中洗涤样品(例如，机器人操纵系统可将乙醇转移至核酸组装模块)。在一些实施例中，来自该操作的液体废物被转移到盒的废物容器(例如，由机器人操纵系统使用与转移乙醇时使用的相同的移液管尖端)。在这一点上，脱盐的组装核酸可以转移到保存容纳器(例如盒的储器)。脱盐的组装核酸可以例如被保持在4℃的温度处，直到细胞准备好转化。在特定例子中，在转移到转化模块1506之前，100μl的组装核酸被添加到在混合储器中的400μl的浓缩细胞储备物1512。在一些实施例中，纯化过程可能花费大约16分钟。
在一些实现中，组装的核酸和细胞储备物1512被添加到流通式电穿孔模块1506，并且细胞储备物1512被转化(1526a)。例如，机器人操纵系统可以例如使用移液管尖端或通过转移小瓶或管来将细胞储备物1512和组装的核酸的混合物从混合储器转移到流通式电穿孔模块1506。在一些实施例中，内置流通式电穿孔模块(例如在图4A-4I、图5A-5H、图6、图8A-8U和图9A-9C中描绘的流通式电穿孔模块)用于转化细胞储备物1512。在其他实施例中，例如在图10A-10C和图10E中所示的基于盒的电穿孔模块用于转化细胞储备物1512。例如，电穿孔模块1506可以被保持在4℃的温度处。在说明性的例子中，电穿孔过程可能花费大约四分钟。
在一些实现中，转化的细胞储备物1512被转移到第二生长模块1508用于恢复(1528a)。在特定的例子中，转化的细胞在第二生长模块1508中在30℃的温度下经历恢复过程。例如，转化的细胞可以在第二生长模块1508中被维持预定的时间段(例如大约一小时)用于恢复。
在一些实现中，选择性培养基被转移到第二生长小瓶(未示出)，并且细胞被留下以在选择过程中培养另一时间段。在说明性的例子中，可以将抗生素转移到第二生长小瓶，并且细胞可以在30℃的温度下培养额外的两个小时以选择已经接收外源性物质的细胞。
在恢复之后，细胞可以为另一轮编辑或储存在盛器中(例如在自动化细胞处理环境之外进行的另外的实验)做好准备。可选地，细胞的一部分可以作为细胞文库输出被转移到储存单元，而细胞的另一部分可以为第二轮编辑做好准备。
在一些实现中，在为第二轮编辑做准备时，转化的细胞被转移到第二过滤模块1510用于培养基交换和过滤(1530a)。在转移转化的细胞储备物之前，在一些实现中，使用洗涤溶液来预洗涤第二过滤模块1504的过滤器。例如，可以在洗涤盒(例如关于图1A描述的盒106)中提供洗涤溶液。例如，第二过滤模块1510可以流体地连接到洗涤盒的洗涤溶液，如关于图12A所述的。
例如，第二过滤模块1510可以是双过滤模块(例如关于图12B和图12C描述的过滤模块1250)的一部分。在特定例子中，第二过滤模块1510可以在洗涤和洗脱过程期间被维持在预定温度(例如，4℃)处，同时在洗脱小瓶和第二过滤模块1510之间转移细胞材料。在特定的例子中，该过滤过程的输出被存放在小瓶或管中以等待进一步的处理，例如转移到转化模块。小瓶或管可以在储存单元中被维持在4℃的温度处。
第一处理阶段可能在一天期间发生。在一个说明性实施例中，第一处理阶段被估计为花费低于19小时(例如，大约18.7小时)来完成。在工作流程1500中的这一点上，在一些实现中，新材料被手动地添加到自动化多模块细胞编辑仪器。例如，可以添加新的试剂盒。此外，此时可以向自动化多模块细胞编辑仪器添加新的洗涤盒、替换过滤器和/或替换移液器尖端。此外，在一些实施例中，过滤模块可经历清洁过程和/或固体和液体废物单元可被倒空以为下一轮处理做准备。在又一些实施例中，试剂盒可为编辑的两个或更多个循环提供试剂，因而不需要在两轮或更多轮编辑之间的改变。
在一些实现中，第二轮编辑涉及与上述第一处理阶段相同的模块1502、1504、1506、1508和1510、相同的处理步骤1518、1520、1522、1524、1526、1528和1530以及相同的温度和时间范围。例如，第二寡核苷酸文库1514b和第二载体骨架1516b可以用于以与上面所述的几乎相同的方式来编辑转化的细胞。尽管被示为两阶段过程，但在其他实施例中，多达两次、四次、六次、八次或更多次递归可以被进行以继续编辑相同的细胞文库1512。
在其他实现中，转到图15B，工作流程1540涉及相同的模块1502、1504、1506、1508和1510以及过程的第一阶段的相同的处理步骤1518、1520、1522、1524、1526、1528和1530。然而，与图15A的工作流程1500不同，图15B的工作流程1540的第二阶段涉及消除(curing)步骤。“消除”是一个过程，其中从转化的细胞除去载体，例如在前一轮编辑中使用的编辑载体、包括核酸酶的表达序列的“引擎”载体或两者。可以通过例如下列操作来完成消除：使用消除质粒使编辑载体裂解，从而使编辑和/或引擎载体变成非功能性的(在图15b的工作流程中被例示)；通过细胞生长来稀释在细胞群体中的载体(即，细胞经历的生长周期越多，保留编辑载体或引擎载体的子细胞就越少)(未示出)，或者通过例如利用在编辑载体或引擎载体上的复制的热敏起点(未示出)。在一个例子中，“消除质粒”可以被包含在自动化仪器的试剂盒中，或者在第二处理阶段之前被手动地添加到仪器。如同工作流程1500一样，在一些实施例中，工作流程1540基于由自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统(例如图18的处理系统1810)执行的脚本来被执行。在第一例子中，可以经由被添加到第一盒的机器可读标记或标签来访问脚本。在一些实施例中，使用单独的脚本来执行每个处理阶段。例如，每个盒可以包括用于处理盒的内容物的脚本本身或脚本的指示。以这种方式，例如，可以使用为适合于消除的设置(例如，温度、时间、材料量等)设计的脚本来执行涉及消除盒的第二阶段。用于消除的条件将取决于用于消除的机制；也就是说，在该例子中，消除质粒如何使编辑和/或引擎质粒裂解。
在一些实现中，工作流程1540的第二阶段通过在第一生长模块1502处从工作流程1540的第一阶段接收第一次编辑的细胞来开始。例如，可以通过应用如关于图15A的工作流程1500描述的步骤1518、1520、1522、1524、1526、1528和1530使用细胞储备物1542、寡核苷酸文库1544和载体骨架1546编辑了第一次编辑的细胞。例如，第一次编辑的细胞储备物1542可以由机器人操纵系统转移到第一生长模块1502。在一个例子中，机器人操纵系统将第一次编辑的细胞储备物1542的小瓶添加到第一生长模块1502的旋转生长小瓶。在另一个例子中，机器人操纵系统用移液管从储存单元的容器吸取第一次编辑的细胞储备物1542，并将细胞储备物1542添加到旋转生长小瓶。此时细胞可以被维持在4℃的温度处。
在一些实现中，第一次编辑的细胞在第一生长模块1502中被接种、生长和监控(1518d)。在特定的例子中，第一次编辑的细胞储备物1542的等分试样可以被转移到包含例如20ml的生长培养基的旋转生长小瓶在30℃的温度下到0.50的OD。添加到第一生长模块1502的细胞储备物1542可以随着时间的过去被监控，直到经由自动监控检测到0.50OD。监控可以是周期性的或连续的。这可能花费例如大约900分钟(所估计的)，尽管确切的时间取决于期望OD的检测。
在一些实现中，在生长到期望OD之后，将诱导剂添加到第一生长模块1502用于诱导细胞。在特定的例子中，可以添加100μl的诱导剂，并且生长模块1502可以将混合物的温度升至42℃并保持15分钟。
在生长和诱导之后，第一次编辑的细胞储备物1542在一些实现中被转移到第一过滤模块1504用于使第一次编辑的细胞变成电转感受态的(1520d)。在一个例子中，机器人操纵系统将第一次编辑的细胞储备物1542的小瓶从第一生长模块1502的旋转生长小瓶移动到第一过滤模块1504的小瓶保持器。在另一个例子中，机器人操纵系统用移液管从第一生长模块1502的旋转生长小瓶吸取第一次编辑的细胞储备物1542，并将它输送到第一过滤模块1504。例如，用于将第一次编辑的细胞储备物1542转移到第一生长模块1502的用后即可丢弃的移液管尖端可用于将细胞储备物1542从第一生长模块1502转移到第一过滤模块1504。在一些实施例中，在将细胞储备物1542从第一生长模块1502转移至第一过滤模块1504之前，将第一生长模块1502冷却至4℃，使得细胞储备物1542类似地降低至该温度。在特定例子中，第一生长模块1502的温度可以在大约8分钟的时长内降低到大约4℃，并且生长模块1502可以将温度保持在4℃处大约15分钟以确保细胞储备物1512的温度的降低。
在将第一次编辑的细胞储备物1542转移到过滤模块之前，在一些实现中，使用洗涤溶液来预洗涤第一过滤模块1504的过滤器。例如，可以在洗涤盒(例如关于图1A描述的盒106)中提供洗涤溶液。例如，第一过滤模块1504可以流体地连接到洗涤盒的洗涤溶液。
例如，第一过滤模块1504可以是双过滤模块的一部分，例如关于图12B和图12C描述的过滤模块1250。在特定例子中，第一过滤模块1504可以在洗涤和洗脱过程期间被维持在预定温度(例如，4℃)处，同时在洗脱小瓶和第一过滤模块1504之间转移细胞材料。
在一些实现中，在过滤模块1504处使第一次编辑的细胞成为电转感受态的时(1520d)，第一次编辑的细胞储备物1542被转移到转化模块1506(例如，FTEP模块)用于转化。在一个例子中，机器人操纵系统将细胞储备物1542的小瓶从第一过滤模块1504的小瓶保持器移动到流通式电穿孔模块1506的储器。在另一个例子中，机器人操纵系统用移液管从第一过滤模块1502或临时储器吸取细胞储备物1542，并将它输送到第一过滤模块1504。在特定例子中，来自第一过滤模块1504的400μl的浓缩细胞储备物1542在转移到转化模块1506之前被转移到混合储器。例如，细胞储备物1542可以转移到在盒中的储器用于与消除质粒1550混合，然后被混合和由机器人操纵系统使用移液管尖端来转移。在特定例子中，转化模块1506被维持在预定温度例如4℃处。在说明性的例子中，细胞储备物1542可以在大约四分钟内被转化。
在一些实现中，转化的细胞储备物1542被转移到第二生长模块1508用于恢复/消除(1528d)。在特定例子中，20ml的转化的细胞在第二生长模块1508中在30℃的温度下经历恢复过程。例如，转化的细胞可在第二生长模块1508中被维持约一小时用于恢复。如果另一轮编辑是需要的，则第一编辑质粒或载体被消除。如果另一轮编辑不是需要的，第一编辑质粒和引擎质粒可以被消除。
在恢复和消除之后，细胞可以为另一轮编辑或储存做好准备，以在自动化细胞处理仪器外部的进一步的研究中被使用。例如，细胞的一部分可以作为细胞文库输出被转移到储存单元，而细胞的另一部分可以为第二轮编辑做准备。
在一些实现中，在为第二轮编辑做准备时，转化的细胞被转移到第二过滤模块1510，用于包含甘油的培养基交换和过滤(1530d)，用于使细胞成为电转感受态的。在转移转化的细胞储备物之前，在一些实现中，使用洗涤溶液来预洗涤第二过滤模块1504的过滤器。例如，可以在洗涤盒(例如关于图1A描述的盒106)中提供洗涤溶液。例如，第二过滤模块1510可以流体地连接到洗涤盒的洗涤溶液，如关于图12A所述的。
例如，第二过滤模块1510可以是双过滤模块的一部分，例如关于图12B和图12C描述的过滤模块1250。在特定例子中，第二过滤模块1510可以在洗涤和洗脱过程期间被维持在4℃处，同时在洗脱小瓶和第二过滤模块1510之间转移细胞材料。在特定的例子中，该过滤过程的输出是沉积在小瓶或管中的电转感受态细胞，以等待进一步的处理。小瓶或管可以在储存单元中被维持在4℃的温度处。
转到图15C，流程图示出了酵母工作流程1560，其涉及具有相同处理步骤的两个处理阶段，导致对细胞文库1562的两次编辑。每个阶段可以基于源材料的不同盒来操作。例如，第一盒可以包括第一寡核苷酸文库1570a和第一载体骨架1572a。在处理阶段之间或在处理之前引入到自动化多模块细胞编辑仪器中但在与第一盒不同的位置上的第二盒可以包括第二寡核苷酸文库1570b和第二载体骨架1572b。每个盒可以被考虑为“文库盒”，用于构建已编辑细胞的文库。可选地，用户可以将容纳器(例如，细胞储备物1562a的小瓶或管)添加到在酵母细胞试剂套件中包括的每个所购买的盒中。
在一些实施例中，基于由自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统(例如图18的处理系统1810)执行的脚本来执行工作流程1560。在第一例子中，可以经由被添加到第一盒的机器可读标记或标签来访问脚本。在一些实施例中，使用单独的脚本来执行每个处理阶段。例如，每个盒可以包括用于处理盒的内容物的脚本本身或脚本的指示。
在一些实现中，第一阶段以将细胞储备物1562引入到第一生长模块1502中用于接种、生长和监控(1518e)开始。在一个例子中，机器人操纵系统将细胞储备物1562的小瓶添加到第一生长模块1502的旋转生长小瓶。在另一个例子中，机器人操纵系统用移液管从第一盒吸取细胞储备物1562，并将细胞储备物1562添加到旋转生长小瓶。此时细胞可被维持在4℃的温度处。在特定的例子中，20ml的细胞储备物可以在第一生长模块1502的旋转生长小瓶中在30℃的温度下生长至0.75的OD。添加到第一生长模块1502的细胞储备物1512可以在生长模块1502内随着时间的过去而被自动监控，直到经由自动监控感测到0.75OD。监控可以是周期性的或连续的。
在一些实现中，可以使用诱导表达系统。因此，在生长到期望OD之后，诱导剂被添加到第一生长模块1502用于诱导细胞。诱导剂可以是小分子或与具有不同的糖(如半乳糖)的培养基的培养基交换。
在生长和诱导之后，细胞储备物1562在一些实现中被转移到第一过滤模块1504，用于交换培养基(1564a)。在一个例子中，机器人操纵系统将细胞储备物1562的小瓶从第一生长模块1502的旋转生长小瓶移动到第一过滤模块1504的小瓶保持器。在另一个例子中，机器人操纵系统用移液管从第一生长模块1502的旋转生长小瓶吸取细胞储备物1562，并将它输送到第一过滤模块1504。例如，用于将细胞储备物1562a转移到第一生长模块1502的用后即可丢弃的移液管尖端可用于将细胞储备物1562从第一生长模块1502转移到第一过滤模块1504。在一些实施例中，在将细胞储备物1562从第一生长模块1502转移至第一过滤模块1504之前，将第一生长模块1502冷却至4℃，使得细胞储备物1562类似地降低至该温度。在特定例子中，第一生长模块1502的温度可以在大约8分钟的时长内降低到大约4℃，并且生长模块1502可以将温度保持在4℃处大约15分钟，以确保细胞储备物1562的温度的降低。在培养基交换期间，在说明性例子中，可以将0.4ml的1M山梨醇添加到细胞储备物1562。
在转移细胞储备物1562之前，在一些实现中，使用洗涤溶液来预洗涤第一过滤模块1004的过滤器。例如，可以在洗涤盒(例如关于图1A描述的盒106)中提供洗涤溶液。例如，第一过滤模块1504可以流体地连接到洗涤盒的洗涤溶液，如关于图12A所述的。
例如，第一过滤模块1504可以是双过滤模块的一部分，例如关于图12B和图12C描述的过滤模块1250。在特定例子中，第一过滤模块1504可以在洗涤和洗脱过程期间被维持在4℃处，同时在洗脱小瓶和第一过滤模块1504之间转移细胞材料。
在培养基交换操作之后，在一些实现中，细胞储备物1562被转移回到第一生长模块1502用于调节(1566a)。在一个例子中，机器人操纵系统将细胞储备物1562的小瓶从第一过滤模块1504移动到第一生长模块1502。在另一个例子中，机器人操纵系统用移液管从第一过滤模块1504吸取细胞储备物1562，并将它输送到第一生长模块1502的旋转生长小瓶。在调节期间，例如，可以将5ml DTT/LIAc和80mM的山梨醇添加到细胞储备物1562。例如，机器人操纵系统可以分开或同时将DTT/LIAc和山梨醇转移到第一生长模块1502。细胞储备物1562可以例如通过第一生长模块1502的旋转生长小瓶的旋转与DTT/LIAc和山梨醇混合。在调节期间，细胞储备物1562可以被维持在4℃的温度处。
在一些实现中，在调节之后，细胞储备物1562被转移到第一过滤模块1504用于洗涤和制备细胞(1568)。例如，细胞可以在该步骤成为电转感受态的。在一个例子中，机器人操纵系统将细胞储备物1562的小瓶从第一生长模块1502的旋转生长小瓶移动到第一过滤模块1504的小瓶保持器。在另一个例子中，机器人操纵系统用移液管从第一生长模块1502的旋转生长小瓶吸取细胞储备物1562，并将它输送到第一过滤模块1004。
在转移细胞储备物之前，在一些实现中，使用洗涤溶液来预洗涤第一过滤模块1504的过滤器。例如，可以在洗涤盒(例如关于图1A描述的盒106)中提供洗涤溶液。例如，第一过滤模块1504可以流体地连接到洗涤盒的洗涤溶液，如关于图12A所述的。在其他实施例中，与用于在步骤1564a处的培养基交换的过滤器相同的过滤器用于呈现电转感受态。在一些实施例中，1M山梨醇用于使酵母细胞成为电转感受态的。
在一些实现中，在过滤模块1504处成为电转感受态之后，细胞储备物1562被转移到转化模块1506(例如，流通式电穿孔模块)用于转化。在一个例子中，机器人操纵系统将细胞储备物1562的小瓶从第一过滤模块1504的小瓶保持器移动到流通式电穿孔模块1506的储器。在另一个例子中，机器人操纵系统用移液管从过滤模块1504或临时储器吸取细胞储备物1562，并将它输送到第一过滤模块1504。在特定例子中，来自第一过滤模块1504的400μl的浓缩细胞储备物1562在转移到转化模块1506之前被转移到混合储器。例如，细胞储备物1562可以转移到盒中的储器用于与核酸组分(载体骨架和编辑寡核苷酸)混合，然后被混合和由机器人操纵系统使用移液管尖端来转移。因为载体骨架和编辑寡核苷酸在细胞中(体内)被组装，所以核酸组装模块不是用于酵母编辑的必要组成部分。在特定例子中，转化模块被维持在4℃处。
在一些实现中，待组装的核酸和细胞储备物1562被添加到FTEP模块1506，并且细胞储备物1562被转化(1526e)。例如，机器人操纵系统可以例如使用移液管尖端或通过转移小瓶或管来将细胞储备物1562e和核酸组装物的混合物从混合储器转移到流通式电穿孔模块1506。在一些实施例中，内置的FTEP模块(例如图4A-4I、图5A-5G、图6、图8A-8U、图9A-9C和图10A-10C的流通式电穿孔模块)(即，单个单元FTEP)用于转化细胞储备物1562e。在其他实施例中，基于盒的电穿孔模块用于转化细胞储备物1562e。例如，FTEP模块1506可以保持在4℃的温度处。
在一些实现中，转化的细胞储备物1562e被转移到第二生长模块1508用于恢复(1528a)。在特定例子中，20ml转化的细胞在第二生长模块1508中经历恢复过程。
在一些实现中，选择性培养基(例如营养缺陷型生长培养基或包含药物的培养基)被转移至第二个生长小瓶(未示出)，并且细胞被留下以在选择过程中培养另一段时间。在说明性的例子中，可以将抗生素转移到第二个生长小瓶，并且细胞可以在30℃的温度下培养额外的两个小时。
在恢复之后，细胞可以为另一轮编辑或储存在细胞文库中做准备。例如，细胞的一部分可以作为细胞文库输出被转移到储存单元(1576a)，而细胞的另一部分可以为第二轮编辑做准备(1578a)。细胞可以在例如4℃的温度下被储存。
在一些实现中，在为第二轮编辑做准备时，转化的细胞被转移到第二过滤模块1510用于培养基交换(1578a)。在转移转化的细胞储备物1562a之前，在一些实现中，使用洗涤溶液来预洗涤第二过滤模块1504的过滤器。例如，可以在洗涤盒(例如关于图1A描述的盒106)中提供洗涤溶液。例如，第二过滤模块1510可以流体地连接到洗涤盒的洗涤溶液，如关于图12A所述的。
例如，第二过滤模块1510可以是双过滤模块的一部分，例如关于图12B和图12C描述的过滤模块1250。在特定例子中，第二过滤模块1510可以在洗涤和洗脱过程中被维持在4℃处，同时在洗脱小瓶和第二过滤模块1510之间转移细胞材料。
在一些实现中，在过滤过程期间，添加酶制剂以溶解细胞储备物1562a的细胞壁。例如，可以添加酵母溶解酶(例如
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)来溶解细胞壁。在特定的例子中，酵母溶解酶可以在30℃的温度下在细胞储备物1526a中培养5到60分钟之间。在特定的例子中，该过滤过程的输出被存放在小瓶或管中以等待进一步的处理。小瓶或管可以在储存单元中被维持在4℃的温度处。
第一处理阶段可以在一天期间发生。在工作流程1560的这一点上，在一些实现中，新材料被手动地添加到自动化多模块细胞编辑仪器。例如，可以添加新的细胞储备物1562b和新的试剂盒。此外，此时可以向自动化多模块细胞编辑仪器添加新的洗涤盒、替换过滤器和/或替换移液器尖端。此外，在一些实施例中，过滤器模块可以经历清洁过程和/或固体和液体废物单元可以被倒空用于为下一轮处理做准备。
在一些实现中，第二轮编辑涉及与上述第一处理阶段相同的模块1502、1504、1506、1508和1510、相同的处理步骤1518、1564、1566、1526、1528和1576和/或1578以及相同的条件(例如，温度、时间范围等)。例如，第二寡核苷酸文库1570b和第二载体骨架1572b可以用于以与上面所述的几乎相同的方式编辑转化的细胞的组合。尽管被示为两阶段过程，但在其他实施例中多达两次、三次、四次、六次、八次或更多次递归可被进行以继续编辑细胞储备物1562。
仪器架构的替代实施例
图17A和17B示出了用于执行自动化细胞处理(例如在单个周期中在多个细胞中进行编辑)的自动化多模块细胞编辑仪器的示例性替代实施例。例如，自动化多模块细胞编辑仪器可以是为在实验室环境中使用而设计的台式仪器。自动化多模块细胞编辑仪器可以合并用于在细胞中进行自动化基因组裂解和/或编辑时执行各种分段操作的可重新使用的和用后即可丢弃的元件。
图17A是根据本公开的一个实施例的用于执行自动化细胞处理(例如在单个周期中在多个细胞中进行编辑)的第一示例仪器1700的框图。在一些实现中，仪器1700包括底板、用于将DNA样品组分引入到仪器1700的试剂供应品容器1704、用于将细胞引入到仪器1700的细胞供应品容器1706以及用于在仪器1700的模块(例如，模块1710a、1710b、1710c、1710d)、容器(例如，容器1704、1706、1712a-c、1722、1724和1726)和储存单元(例如单元1718、1728和1714)之间移动材料以执行自动化细胞处理的机器人操纵系统1708。在一些实施例中，在完成细胞供应品1706的编辑时，细胞输出1712可以由机器人操纵系统1708转移到储存单元1714，用于临时储存和稍后取回。
机器人操纵系统1708例如可以包括空气排代泵(air displacement pump)以将液体从各种材料源转移到各种模块1710a-d和储存单元1714。在其他实施例中，机器人操纵系统1708可以包括拾取和放置头以将源材料的容纳器(例如，管)从供应品盒(未示出，关于图1A被讨论)转移到各种模块1710。在一些实施例中，一个或更多个照相机或其他光学传感器(未示出)确认适当的台架移动和定位。
在一些实施例中，机器人操纵系统1708使用在转移尖端供应品1716中提供的用后即可丢弃的转移尖端来在仪器1700内转移源材料、试剂1704(例如，用于核酸组装)和细胞1706。例如，用过的转移尖端可以被丢弃在固体废物单元1718中。在一些实现中，固体废物单元1718包含顶件块(kicker)以从机器人操纵系统1708的拾取和放置头移除管。
在一些实施例中，仪器1700包括带有吸管的电穿孔试管，吸管连接到空气排代泵。在一些实现中，细胞1706和试剂1704通过吸管被吸入到电穿孔试管内，并且试管被移动到仪器1700的一个或更多个模块1710a-d。
在一些实现中，仪器1700由处理系统1720(例如图18的处理系统1810)控制。处理系统1720可以被配置成基于用户输入来操作仪器1700。处理系统1720可以控制仪器1700的各种模块1710的定时、持续时间、温度和其他操作。处理系统1720可以连接到电源(未示出)用于仪器1700的操作。
在一些实施例中，仪器1700包括FTEP设备1710c以将核酸引入到细胞1706内。例如，机器人操纵系统1708可以将试剂1704和细胞1706转移到FTEP设备1710c。FTEP设备1710通过电穿孔进行细胞转化或转染。处理系统1720可以控制FTEP设备1710c的温度和操作。在一些实现中，处理系统1720根据由用户设置的一个或更多个可变控件来实现FTEP设备1710c的操作。
在转化之后，在一些实现中，细胞可以被转移到恢复模块1710d。在一些实施例中，恢复模块1710d是组合式恢复和诱导编辑模块。在恢复模块1710d中，允许细胞来恢复、表达核酸，以及在诱导型核酸酶系统中例如借助于在时间上控制的诱导(例如在一些例子中的化学、光、病毒或温度诱导或者用于核酸酶的表达的诱导物分子1724的引入)来在细胞中诱导核酸酶或导向RNA。
在编辑之后，在一些实现中，细胞被转移到储存单元1714，其中细胞可以被储存为细胞输出1712a-d，直到细胞被移除用于已编辑细胞群体(例如已编辑细胞文库)的进一步研究或取回为止。
在一些实现中，仪器1700被设计成用于递归基因组编辑，其中多个编辑被顺序地引入到在细胞群体的细胞内部的基因组中。在一些实现中，在从储存单元访问细胞输出1712a-d用于递归处理之前，试剂供应品1704被补充。在其他实现中，多个试剂供应品1704和/或其大体积可以被引入到仪器1700中，使得在随后的处理循环之前不一定需要用户交互作用。
在一些实施例中，细胞输出1712a的一部分被转移到自动化细胞生长模块1710a。例如，可以转移所有的细胞输出1712a，或者仅转移等分试样，使得仪器保留递增地修改的样品。在一些实现中，细胞生长模块1710a在生长期间测量细胞的OD以确保它们在编辑的诱导之前在期望的浓度处。可以被使用的细胞密度和生理状态的其他度量包括但不限于pH、溶解氧、释放的酶、声学特性和电特性。
为了减少没有接收基因组编辑的细胞的背景，在一些实施例中，生长模块1710a使用选择性生长培养基1726来执行选择过程以对已编辑的细胞富集化。例如，引入的核酸可以包括赋予抗生素抗性或某个其它可选择的标记物的基因。在一些实现中，在递归编辑期间，可以将多个选择性基因或标记物1726引入到细胞内。例如，使用于连续轮编辑的可选择标记物的引入交替可以除去未编辑细胞的背景，并允许仪器1700的多个循环来选择具有连续基因组编辑的细胞。合适的抗生素抗性基因包括但不限于如下基因：氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、刀豆氨酸抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因和氯霉素抗性基因。
细胞可以从生长模块1710a转移到过滤模块1710b。过滤模块1710b或可选地细胞洗涤和浓缩模块可以实现培养基交换。在一些实施例中，使用溶解增强剂(例如去污剂)、渗透胁迫、温度、酶、蛋白酶、噬菌体、还原剂或离液剂来协助移除死细胞背景。在其他实施例中，细胞移除和/或培养基交换用于减少死细胞背景。在一些实施例中，来自过滤模块1710b的废物产物被收集在液体废物单元1728中。
在过滤之后，细胞可被递呈到FTEP设备(转化模块)1710c，且然后到恢复模块1710d，以及最后到储存单元1714，如上面详述的。
转到图17B，类似于图17A，用于在单个循环中在多个细胞中执行自动化基因组裂解和/或编辑的第二示例性仪器1740包括底板1702、用于将一种或更多种核酸组分引入到仪器1740的试剂供应品容器1704、用于将细胞引入到仪器1740的细胞供应品容器1706以及用于在仪器1740的模块(例如，模块1710a、1710b、1710c、1710f、1710g、1710m和1710h)、容器(例如，容器1704、1706、1712a-c、1724、1742、1744和1746)和储存单元(例如，单元1714、1718和1728)之间移动材料以执行自动化细胞处理的机器人操纵系统1708。在一些实施例中，在完成细胞供应品1706的处理后，细胞输出1712a-c可以由机器人操纵系统1708转移到储存单元1714，用于临时储存和稍后取回。
在一些实施例中，机器人操纵系统1708使用在转移尖端供应品1716中提供的用后即可丢弃的转移尖端来转移源材料、载体骨架1742、编辑寡核苷酸1744、试剂1704(例如，用于核酸组装，核酸纯化，以使细胞成为电转感受态的，等)以及在仪器1740内的细胞1706，如关于图17A所述的。
如关于图17A所述的，在一些实现中，仪器1740由处理系统1720(例如图18的处理系统1810)控制。
在一些实施例中，仪器1740包括核酸组装模块1710g，并且在某些示例性自动化多模块细胞编辑仪器中，核酸组装模块1710g可以在一些实施例中执行核酸组装。
在一些实施例中，在核酸组装之后，核酸(例如，在核酸组装的例子中，核酸组装混合物(核酸+核酸组装试剂))被转移到纯化模块1710h。在这里，核酸组装混合物的不需要的组分(例如盐)被去除，并且在某些实施例中，组装的核酸被浓缩。例如，在说明性实施例中，在纯化模块1710h中，核酸组装混合物可以与无盐缓冲液和磁珠(例如固相可逆固定(SPRI)磁珠或AMPureTM磁珠)组合。核酸组装混合物可以被培养足够的时间(例如，30秒至10分钟)，用于使组装的核酸结合到磁珠。在一些实施例中，纯化模块包括构造成接合磁珠的磁体。磁体可以被接合，使得上清液可以从所结合的组装核酸被去除，并且使得所结合的组装核酸可以用例如80％乙醇被洗涤。再次，可以接合磁体并移除80％乙醇洗涤溶液。磁珠/组装的核酸可以被允许干燥，然后组装的核酸可以被洗脱，且磁体可以再次被接合，这一次隔离磁珠并去除包含洗脱的组装核酸的上清液。然后可以将组装的核酸转移到转化模块(例如，在优选地实施例中的电穿孔仪)。转化模块在转移时可能已经包含电转感受态细胞。
仪器1740包括用于将核酸引入细胞1706内的FTEP设备1710c，如关于图17A所述的。然而，在这种情况下，从纯化模块1710h输出的组装的核酸1704被转移到FTEP设备1710c以与细胞1706组合。
在FTEP设备1710c中的转化之后，在一些实现中，细胞可以被转移到恢复模块1710m。在恢复模块1710e中，允许细胞来恢复、表达外源核酸、电穿孔到细胞中，以及在诱导型系统中例如借助于在时间上控制的诱导(例如在一些例子中的化学、光、病毒或温度诱导或者用于编辑组分的表达的诱导分子的引入)来诱导核酸酶或其他编辑组分(例如导向核酸)。
在恢复之后，在一些实现中，细胞被转移到编辑模块1710f。编辑模块1710f提供适当的条件以例如通过引入的核酸的表达和诱导型核酸酶或导向核酸的诱导来诱导细胞的基因组的编辑。在一些例子中，编辑组分可以是在编辑模块1710f内化学诱导的、生物诱导的(例如，通过诱导型启动子)、病毒诱导的、光诱导的、温度诱导的和/或热诱导的。
在编辑之后，在一些实现中，细胞被转移到储存单元1714，如关于图17A所述的。
在一些实现中，仪器1740被设计成用于递归基因组编辑，其中多个编辑被顺序地引入到细胞群体中的细胞的基因组中。在一些实现中，在访问来自储存单元的细胞输出1712用于递归处理之前，试剂供应品1704被补充。例如，额外的载体骨架1742和/或编辑寡核苷酸1744可以被引入到仪器1740中用于通过核酸组装模块1710g和纯化模块1710h进行组装和制备。在其他实现中，多个载体骨架体积1742和/或编辑寡核苷酸1744可以被引入到仪器1700中，使得在随后的处理周期之前不一定需要用户交互作用。对于每个后续周期，载体骨架1742和/或编辑寡核苷酸1744可以改变。在制备核酸组装物时，可以在试剂供应品1704或另一个存储区域中提供核酸组装物。
在一些实施例中，细胞输出1712a的一部分被转移到自动化细胞生长模块1710a，如关于图17A所讨论的。
为了减少没有接收基因组编辑的细胞的背景，在一些实施例中，生长模块1710a使用选择性生长培养基1726来执行选择过程以使已编辑的细胞富集化，如关于图17A所讨论的。
细胞可以从生长模块1710a转移到过滤模块1710b，如关于图17A所讨论的。如所示，来自洗脱供应品1746的洗脱液(例如缓冲液、甘油)可以转移到过滤模块1710b中用于培养基交换。
在过滤之后，细胞可被转移到FTEP设备1710c用于转化，且然后转移到恢复模块1710m和编辑模块1710f，以及最后转移到储存单元1714，如上面所详述的。
在一些实施例中，图17A和/或17B的自动化多模块细胞编辑仪器包含一个或更多个可更换的供应盒和机器人操纵系统，如关于图1A和图1B所讨论的。每个盒可包含核酸组装混合物、寡核苷酸、载体、生长培养基、选择剂(例如抗生素)、诱导剂、核酸纯化试剂(例如固相可逆固定(SPRI)珠)、乙醇和10％甘油中的一个或更多个。
尽管示例性仪器1700、1740被示为包括模块1710的特定布置，但这些布置仅用于说明目的。例如，在其他实施例中，更多或更少的模块1710可以被包括在仪器1700、1740中的每个内。此外，在仪器中可以包括不同的模块，例如用于提供例如杂交瘤的便于细胞融合的模块、在组装之前放大核酸的模块和/或便于蛋白质表达和/或分泌的模块。此外，可以在某些实施例中复制某些模块1710，例如图1A的复制细胞生长模块110a、110b。在另一个例子中，仪器1700和1740中的每一个可以被设计成接受培养基盒，例如图1A的盒104和106。另外的修改是可能的。
用于自动化多模块细胞编辑仪器的控制系统
转到图16，屏幕截图示出了用于与自动化多模块细胞编辑仪器通过接口连接的示例图形用户界面(GUI)1600。例如，该界面可以呈现在图2C和2D的显示器236上。在一个例子中，GUI 1600可以由图18的处理系统1810呈现在触摸屏1816上。
在一些实现中，GUI 1600被分成多个信息和数据输入窗格，例如协议窗格1602、温度窗格1606、电穿孔窗格1608和细胞生长窗格1610。另外的窗格是可能的。例如，在一些实施例中，GUI 1600包括对于每个模块(例如在一些例子中的核酸组装模块、纯化模块、细胞生长模块、过滤模块、转化模块、编辑模块和恢复模块中每一个的一个或更多个)的窗格。在一些实施例中，GUI 1600的下部窗格表示适用于当前工作流程的模块(例如，如在协议窗格1602中选择的或者如在通过脚本接口(未示出)加载的脚本中指定的)。在一些实施例中，滚动或分页特征可以允许用户访问未在图16的屏幕截图中示出的附加窗格。
在一些实施例中，GUI 1600包括用于访问各种屏幕(例如所示的屏幕截图)(例如，通过使用主控件1620a)的一系列控件1620。例如，通过选择编辑控件1620b，可以向用户提供选项以提供一个、两个或一系列细胞编辑步骤。通过选择脚本控件1620c，可以向用户提供添加新编辑脚本或改变现有编辑脚本的机会。在一些实施例中，用户可以选择帮助控件1620d以获得关于GUI 1600和自动化多模块细胞编辑仪器的特征的另外的信息。在一些实现中，用户选择设置控件1620e以访问对于期望过程和/或GUI1600的设置选项，例如在一些例子中的时区、语言、单位、网络访问选项。电源控件1620f当被选择时允许用户使自动化多模块细胞编辑仪器断电。
转到协议窗格1602，在一些实现中，用户通过在协议条目字段1612(或可选地，下拉菜单)中输入协议来选择协议(例如，脚本或工作流程)用于由自动化多模块细胞编辑仪器执行。在其他实施例中，协议可以通过单独的用户界面屏幕来被选择，例如通过选择脚本控件1620b来被访问。在另一个例子中，自动化多模块细胞编辑仪器可以选择协议并将它呈现在协议条目字段1612中。例如，自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统可以扫描位于装载到自动化多模块细胞编辑仪器中的一个或更多个盒上的机器可读标记以确定适当的协议。如所示，已选择“Microbe_Kit1(1.0.2)”协议，其可能对应于为与自动化多模块细胞编辑仪器一起使用而购买的试剂盒和其他用后即可丢弃的供应品的套件。
在一些实现中，协议窗格1602还包括开始控件1614a和停止控件1614b以控制在协议条目字段1612中呈现的协议的执行。例如，可以在触摸屏界面上提供GUI 1600，其中开始控件1614a的触摸选择开始细胞处理，并且停止控件1614b的选择停止细胞处理。
转到运行状态窗格1604，在一些实现中，图表1616示出了在协议窗格1602中识别的协议的处理的阶段。例如，运行完成1618a的一部分以蓝色示出，而当前阶段1618b的一部分以绿色示出，并且任何错误1618c用从沿着运行完成1618a的部分的路线的时间点延伸的标记物来标记，错误在该路线上出现。消息区域1618d呈现所完成的运行的百分比、所完成的阶段的百分比和错误的总数。在一些实施例中，在选择图表1616时，可以向用户呈现关于运行状态的更多细节，例如，在一些例子中，错误的类型的识别、当前处理阶段的名称(例如，核酸组装、纯化、细胞生长、过滤、转化、恢复、编辑等)以及在运行中的处理阶段的列表。此外，在一些实施例中，运行完成时间消息指示运行被估计完成的日期和时间。在一些例子中，运行可以指示在没有用户干预的情况下被安排用于执行的单个细胞编辑过程或一系列递归细胞编辑过程。在一些实施例(未示出)中，运行状态窗格1604另外示出了用户干预(例如，盒更换、固体废物处理、液体废物处理等)被需要时的所估计的时间。
在一些实现中，运行状态窗格1604包括用于暂停细胞处理的暂停控件1624。用户可以选择暂停当前运行，例如以纠正已识别的错误或进行手动干预，例如废物去除。
在一些实施例中，温度窗格1606示出了具有指示自动化多模块细胞编辑仪器的各种装置的温度设置的相应消息1628的一系列图标1126。图标从左到右可以代表FTEP模块1626a(例如，与图1A的试剂盒110c相关联的FTEP设备)、纯化模块1626b、第一生长模块1626c、第二生长模块1626d和过滤模块1626e。相应消息1628a-e识别相应模块的当前温度、低温和高温(例如，对于这个阶段或这个运行)。在选择图标1626之一时，在一些实施例中，可以复查时间的温度的图形显示。
在温度窗格之下，在一些实现中，一系列窗格识别多个模块的当前状态。例如，电穿孔窗格1608代表转化模块的状态，而细胞生长窗格1610代表生长模块的状态。在一些实施例中，在这里呈现的窗格识别当前操作的模块(例如，在当前阶段中细胞处理所涉及的模块)的状态以及在当前运行期间已经被利用的任何模块的状态(例如，如在运行状态窗格1604中所示的)。例如，过去的状态信息可以向用户呈现关于在细胞处理的前面的阶段中使用的参数的信息。
转到电穿孔窗格1608，在一些实现中，伏特、毫安和焦耳的操作参数1630a被呈现。此外，状态消息1632a可以识别关于转换模块的功能的附加信息，例如在一些例子中的错误状态、对处理剩余的时间或模块的内容物(例如，添加到模块的材料)。在一些实现中，当相应的模块正在主动处理时，在状态消息1632a上方的图标1634a将在活动模式中被呈现(例如，彩色的、“点亮”、用粗体等)。在一些实施例中，图标1634a的选择引起关于操作参数1630a的详细信息的图形显示的呈现。
转到细胞生长窗格1610，在一些实现中，OD和生长的小时的操作参数1630b被呈现。此外，状态消息1632b可以识别关于生长模块的功能的附加信息，例如在一些例子中的错误状态、对处理剩余的时间或模块的内容物(例如，添加到模块的材料)。在一些实现中，当相应的模块正在主动处理时，在状态消息1632b上方的图标1634b将在活动模式中被呈现(例如，彩色的、“点亮”、用粗体等)。在一些实施例中，图标1634b的选择引起关于操作参数1630b的详细信息的图形显示的呈现。
接下来，参考图18描述根据示例性实施例的示例处理系统和处理环境的硬件描述。在图18中，处理系统1810包括执行上述过程的一部分的CPU 1808。例如，CPU 1808可以管理图14的方法1400的处理阶段和/或图15A-15C的工作流程。过程数据和脚本、指令和/或用户设置可以存储在存储器1802中。这些过程数据和脚本、指令和/或用户设置也可以存储在存储介质盘1804上，例如便携式存储介质(例如，USB驱动器、光盘驱动器等)或者可以远程地被存储。例如，过程数据和脚本、指令和/或用户设置可以存储在处理系统1810通过网络1828可访问的位置上。此外，所主张的进步不被计算机可读介质的形式限制，发明过程的指令存储在计算机可读介质上。例如，指令可以存储在快闪存储器、RAM、ROM或处理系统1810与之通信的任何其他信息处理设备(例如服务器、计算机、智能电话或其他手持计算设备)中。
此外，所主张的进步的部件可以作为与CPU 1808和操作系统(例如与本领域中的技术人员已知的其他计算系统)协力执行的实用应用、后台守护进程或操作系统的部件或其组合被提供。
CPU 1808可以是ARM处理器、片上系统(SOC)、微处理器、微控制器、数字信号处理器(DSP)，或者可以是本领域中的普通技术人员将认识到的其他处理器类型。此外，CPU1808可以被实现为协同地并行工作以执行上述发明过程的指令的多个处理器。
处理系统1810是处理环境1800的一部分。图18中的处理系统1810还包括用于与网络1828通过接口连接以访问在处理环境1800中的附加元件的网络控制器1806。如可以认识到的，网络1828可以是公共网络(例如因特网)或专用网络(例如LAN或WAN网络)或其任何组合，并且还可以包括PSTN或ISDN子网络。网络1828可以是无线的，例如包括EDGE、3G和4G无线蜂窝系统的蜂窝网络。无线网络也可以是Wi-Fi、蓝牙或已知的任何其他无线通信形式。
处理系统1810还包括与用户界面(例如，触摸屏)1816、一个或更多个传感器1814和一个或更多个外围设备1818通过接口连接的通用I/O接口1812。在一些例子中，外围I/O设备1818可以包括视频记录系统、音频记录系统、麦克风、外部存储设备和/或外部扬声器系统。一个或更多个传感器1814可以包括陀螺仪、加速度计、重力传感器、线性加速度计、全球定位系统、条形码扫描仪、QR码扫描仪、RFID扫描仪、温度监测器和照明系统或照明元件中的一个或更多个。
通用存储控制器1824将存储介质盘1804与通信总线1840(例如并行总线或串行总线，例如通用串行总线(USB)或类似总线)连接，用于使处理系统的所有部件互连。存储控制器1824、网络控制器1806和通用I/O接口1812的一般特征和功能的描述在本文为了简洁起见被省略，因为这些特征是已知的。
在一些实施例中，处理系统1810包括一个或更多个板载和/或外围传感器1814。例如，传感器1814可以直接合并到自动化多模块处理仪器的内部电子设备和/或壳体中。传感器1814的一部分可以例如通过电线处于与I/O接口1812的直接物理接触中；或者例如通过蓝牙、Wi-Fi或NFC连接处于无线接触中。例如，无线通信控制器1826可以实现在一个或更多个无线传感器1814和I/O接口1812之间的通信。此外，一个或更多个传感器1814可以例如经由在网络1828中作为基础的中间服务器或存储设备而处于间接接触中；或者与在自动化多模块细胞编辑仪器内某处的信号累加器处于(有线、无线或间接)接触中，该信号累加器又与I/O接口1812处于(有线或无线或间接)接触中。
与I/O接口1812通信的一组传感器1814可以组合地被使用以从多个地方收集给定的信号类型，以便生成信号的更完整的图。与I/O接口1812通信的一个或更多个传感器1814可以用作比较器或验证元件，例如以过滤、取消或拒绝其他信号。
在一些实施例中，处理环境1800包括通过无线通信控制器1826与处理系统1810通信的计算设备1838。例如，无线通信控制器1826可以实现被指定到用户的智能电话或其他个人计算设备的电子邮件消息、文本消息和/或软件应用警报的交换。
在一些实现中，处理环境1800包括机器人材料操纵系统1822。处理系统1810可以包括机器人控制器1820，其用于发出控制信号以启动机器人材料操纵系统的元件，例如操纵台架的定位、降低或升高吸管或移液管元件，和/或启动泵和阀以引起在自动化多模块细胞编辑仪器中的吸管/移液管和各种盛器(例如室、小瓶等)之间的液体转移。在一些例子中，机器人控制器1820可以包括用于使处理系统1810与机器人材料操纵系统1822通过接口连接的硬件驱动器、固件元件和/或一个或更多个算法或软件包。
在一些实现中，处理环境1810包括一个或更多个模块接口1832，例如在一些例子中的一个或更多个传感器接口、功率控制接口、阀和泵接口和/或用于激活和控制自动化多模块处理系统的每个模块的处理的致动器接口。例如，模块接口1832可以包括旋转细胞生长设备1350的驱动电机的致动器接口(图8C和8D)和检测器板1372的传感器接口，该检测器板1372感测在旋转生长小瓶1300内的细胞生长的光密度。在一些实施例中，模块控制器1830被配置成与模块接口1832通过接口连接。模块控制器1830可以包括一个或许多个控制器(例如，可能每模块一个控制器，尽管一些模块可以共享单个控制器)。在一些例子中，模块控制器1830可以包括用于使处理系统1810与模块接口1832通过接口连接的硬件驱动器、固件元件和/或一个或更多个算法或软件包。
在一些实现中，处理环境1810包括用于控制在自动化多模块处理系统的壳体内的气候条件的热管理系统1836。热管理系统1836可以此外控制在自动化多模块细胞编辑仪器的一个或更多个模块内的气候条件。在一些实施例中，处理系统1810包括用于与热管理系统1836通过接口连接的温度控制器1834。在一些例子中，温度控制器1834可以包括用于使处理系统1810与热管理系统1836通过接口连接的硬件驱动器、固件元件和/或一个或更多个算法或软件包。
使用自动化编辑方法、模块、仪器和系统制作细胞文库
在一个方面中，本公开提供了用于创建细胞文库的自动化编辑方法、模块、仪器和自动化多模块细胞编辑仪器，该细胞文库使用各种编辑策略来改变在各种细胞类型中的感兴趣的RNA和/或蛋白质的表达、水平和/或活性，如在本文更详细描述的。因此，本公开旨在涵盖由本公开的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器创建的已编辑细胞文库。这些细胞文库可以具有不同的靶向编辑，包括但不限于在各种生物体的细胞中的基因敲除、基因敲入、插入、缺失、单核苷酸编辑、短串联重复编辑、移码、三联体密码子扩展和诸如此类。这些编辑可以针对基因组的编码或非编码区域，并且优选地被合理地设计。
在其他方面中，本公开提供了用于创建细胞文库的、改变DNA链接过程的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器。例如，细胞文库可以包括具有在DNA结合位点中的编辑的单独细胞，以干扰调节选定基因的表达的调节元件的DNA结合。此外，细胞文库可以包括在基因组DNA中的影响细胞过程(例如异染色质形成、开关类重组和VDJ重组)的编辑。
在特定方面中，使用在细胞群体中的单独细胞的多重编辑来创建细胞文库，在细胞群体中的多个细胞在单轮编辑中被编辑，即，在细胞文库的细胞内的多个改变在单个自动化操作中。可以在单个多重自动化操作中创建的文库可以包括多达500个已编辑细胞、1000个已编辑细胞、2000个已编辑细胞、5000个已编辑细胞、10,000个已编辑细胞、50,000个已编辑细胞、100,000个已编辑细胞、200,000个已编辑细胞、300,000个已编辑细胞、400,000个已编辑细胞、500,000个已编辑细胞、600,000个已编辑细胞、700,000个已编辑细胞、800,000个已编辑细胞、900,000个已编辑细胞、1,000,000个已编辑细胞、2,000,000个已编辑细胞、3,000,000个已编辑细胞、4,000,000个已编辑细胞、5,000,000个已编辑细胞、6,000,000个已编辑细胞、7,000,000个已编辑细胞、8,000,000个已编辑细胞、9,000,000个已编辑细胞、10,000,000个已编辑细胞或更多。
在其他特定方面中，使用在细胞群体中的单独细胞的递归编辑来创建细胞文库，其中编辑在两轮或更多轮编辑中被添加到单独细胞。递归编辑的使用导致以在文库的单独细胞中的基因组中的两个或更多个位点为目标的两个或更多个编辑的合并。可以在自动递归操作中创建的文库可以包括多达500个已编辑细胞、1000个已编辑细胞、2000个已编辑细胞、5000个已编辑细胞、10,000个已编辑细胞、50,000个已编辑细胞、100,000个已编辑细胞、200,000个已编辑细胞、300,000个已编辑细胞、400,000个已编辑细胞、500,000个已编辑细胞、600,000个已编辑细胞、700,000个已编辑细胞、800,000个已编辑细胞、900,000个已编辑细胞、1,000,000个已编辑细胞、2,000,000个已编辑细胞、3,000,000个已编辑细胞、4,000,000个已编辑细胞、5,000,000个已编辑细胞、6,000,000个已编辑细胞、7,000,000个已编辑细胞、8,000,000个已编辑细胞、9,000,000个已编辑细胞、10,000,000个已编辑细胞或更多。
可以找到可以基于本说明书来修改以利用自动化系统的非自动化编辑策略的例子，例如美国专利号8,110,360、8,332,160、9,988,624、20170316353和20120277120。
在特定方面中，递归编辑可用于首先创建细胞表型以及然后用于反转表型和/或加速其他细胞属性的后面轮的编辑。
在一些方面中，细胞文库包括用于在细胞中产生非天然氨基酸的编辑。
在特定方面中，本公开提供了已编辑细胞文库，其具有在使用本公开的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器创建的一个或更多个调节元件中的编辑。术语“调节元件”指在特定环境和/或背景中可影响可操作地链接的编码序列的转录和/或转译的核酸分子。该术语意欲包括促进或调节转录的所有元件以及包括启动子、RNA聚合酶和转录因子的基本交互作用所需的核心元件、上游元件、增强子和响应元件的RNA稳定性(见例如Lewin的“Genes V”(Oxford University Press,Oxford)，第847-873页)。在原核生物中的示例性调节元件包括但不限于启动子、操作符序列和核糖体结合位点。在真核细胞中使用的调节元件可以包括但不限于启动子、增强子、绝缘体、剪接信号和聚腺苷酸化信号。
优选地，已编辑细胞文库包括基于在特定细胞类型中的蛋白质结构、表达和/或活性的预测而设计的合理地设计的编辑。例如，合理的设计可以基于具有特定核酸酶和基因调节的基因组编辑的全系统生物物理模型，以预测包括核酸酶表达和/或结合、生长条件和其他实验条件的不同编辑参数如何共同控制核酸酶编辑的动力学。见例如Farasat和Salis的PLoS Comput Biol.,29:12(1):e1004724(2016)。
在一个方面中，本公开提供了具有使用本发明的自动化编辑仪器、系统和方法创建的各种合理地设计的调节序列的已编辑细胞的文库的创建。例如，已编辑细胞文库可以包括使用一组组成型和/或诱导型启动子、增强子序列、操作符序列和/或核糖体结合位点创建的原核细胞群体。在另一个例子中，已编辑细胞文库可以包括使用一组组成型和/或诱导型启动子、增强子序列、操作符序列和/或不同的Kozak序列创建的真核序列，用于感兴趣的蛋白质的表达。
在一些方面中，本公开提供了包括具有合理地设计的编辑的细胞的细胞文库，所述编辑包括在跨越生物体的基因组的感兴趣的序列中的一个或更多个类别的编辑。在特定方面中，本公开提供了包括具有合理地设计的编辑的细胞的细胞文库，所述编辑包括在跨越基因组的子集的感兴趣序列中的一个或更多个类别的编辑。例如，细胞文库可以包括具有合理地设计的编辑的细胞，所述编辑包括在跨越外显子组的感兴趣序列中的一个或更多个类别的编辑，例如基因组的每个或最开放的阅读框。例如，细胞文库可以包括具有合理地设计的编辑的细胞，所述编辑包括在跨越激酶组的感兴趣序列中的一个或更多个类别的编辑。在又一个例子中，细胞文库可以包括具有合理地设计的编辑的细胞，所述编辑包括在跨越分泌组的感兴趣序列中的一个或更多个类别的编辑。在还有其他方面中，细胞文库可以包括具有合理地设计的编辑的细胞，所述编辑被创建来分析在外显子组内编码的蛋白质的各种同工型，并且细胞文库可以被设计来控制一种或更多种特定同工型的表达，例如用于转录组分析。
重要地，在某些方面中，细胞文库可以包括使用随机序列(例如随机启动子序列)的编辑，以减少在文库中的单独细胞中的一种或更多种蛋白质的表达之间的相似性。此外，在细胞文库中的启动子可以是组成型的、诱导型的或两者，以实现强烈的和/或可滴定的表达。
在其他方面中，本公开提供了用于创建包括编辑的细胞文库以识别选定基因靶的最佳表达的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器。例如，通过代谢工程产生生物化学品常常需要途径酶的表达，并且最佳产量并不总是通过在细胞中的最高量的靶途径酶但更确切地通过单独酶和相关调节蛋白和/或途径的表达水平的微调来实现。类似地，有时可以为了最佳产量而根据实验调节异源蛋白质的表达水平。
转录影响基因表达水平的最明显的方式是通过Pol II启动的速率，这可以通过启动子或增强子强度和反式激活因子的组合来调节(Kadonaga等人,Cell,116(2):247-57(2004))。在真核生物中，延伸率也可以通过影响选择性剪接来确定基因表达模式(Cramer等人,PNAS USA,94(21):11456-60(1997))。在基因上的失败的终止可通过减小启动子对Pol II的可及性来削弱下游基因的表达(Greger等人,PNAS USA,97(15):8415-20(2000))。被称为转录干扰的这一过程在低等真核生物中是特别相关的，因为它们常常具有紧密间隔的基因。
在一些实施例中，本公开提供了用于优化细胞基因转录的方法。基因转录是几种不同生物学现象(包括转录起始(RNAp募集和转录复合物形成)、伸长(链合成/延伸)和转录终止(RNAp分离和终止))的结果。
位点定向诱变
可以使用自动化编辑方法、模块、仪器和采用位点定向诱变的系统来创建细胞文库，即，当蛋白质或其他基因组特征的氨基酸序列可以通过故意地和精确地使蛋白质或基因组特征突变来改变时。这些细胞系对于各种目的(例如，确定在细胞内的蛋白质功能、在细胞内的酶活性位点的识别和新蛋白质的设计)可能是有用的。例如，位点定向诱变可以以多重方式用于将在蛋白质的序列中的单个氨基酸交换为具有不同化学性质的另一氨基酸。这允许人们确定在细胞群体内的单独细胞中的合理地设计或随机地生成的突变的影响。参见例如Berg等人的Biochemistry第六版(纽约:W.H.Freeman and Company)(2007)。
在另一个例子中，可以对细胞文库内的单独细胞进行编辑以取代在结合位点中的氨基酸，例如取代在蛋白质结合位点中的一个或更多个氨基酸，用于在蛋白质络合物内的交互作用，或者取代在可容纳辅因子或配体的酶袋(enzymatic pocketsz)中的一个或更多个氨基酸。这类编辑允许对蛋白质的特定操纵的创建以测量一种或更多种蛋白质的某些性质，包括在蛋白质络合物中的与其他辅因子、配体等的交互作用。
在又一个例子中，可以使用位点特异性诱变对在细胞文库内的单独细胞进行各种编辑类型，用于研究表达数量性状基因座(eQTL)。eQTL是解释基因表达表型的遗传方差的一部分的基因座。本发明的文库对评估eQTL并将它链接到实际患病状态是有用的。
在特定方面中，可以使用基于蛋白质的已知的或所预测的结构的合理设计来创建引入到本公开的细胞文库中的编辑。参见例如Chronopoulou和Labrou的Curr ProtocProtein Sci.；Chapter 26:Unit 26.6(2011)。这种位点定向突变可以为在文库内的单独细胞提供一个或更多个位点定向编辑，并且优选地在细胞群体内的两个或更多个位点定向编辑(例如组合编辑)。
在其他方面中，使用在基因的编码区中的所有或实质上所有密码子的位点定向密码子突变“扫描”来创建本公开的细胞文库。以这种方式，可以基于基因的一个或更多个密码子的特定多态性针对功能丧失或功能获得来检查特定密码子的单独编辑。这些文库可以是用于确定哪些遗传变化在细胞或细胞群体中是无症状的或特定表型的原因的强有力的工具。密码子的编辑可以是随机地生成的，或者可以基于在待分析的基因中识别的已知多态性和/或突变来被合理地设计。此外，对在细胞中的一个途径中的两个或更多个基因使用这些技术可以确定在细胞功能或途径中的潜在蛋白质:蛋白质交互作用或冗余。
例如，丙氨酸扫描可用于确定特定残基对给定蛋白质的稳定性或功能的贡献。参见例如Lefèvre等人的Nucleic Acids Research,卷25(2):447-448(1997)。丙氨酸常常由于它的非庞大的、在化学上惰性的甲基官能团而在这个密码子扫描技术中被使用，甲基官能团可以模仿许多其他氨基酸拥有的二级结构偏好。密码子扫描也可用于确定特定残基的侧链是否在细胞功能和/或活性中起重要作用。如果需要突变残基的大小的保存，其他氨基酸(例如缬氨酸或亮氨酸)有时可在密码子扫描细胞文库的创建中被使用。
在其他特定方面中，可以使用本发明的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器来创建细胞文库，以确定蛋白质(例如酶或激素)的活性位点，并阐明在细胞文库中的这些蛋白质的一个或更多个的作用机制。与分子建模研究相关的位点定向突变可用于发现酶的活性位点结构和因而它的作用机制。这些细胞文库的分析可以提供由在蛋白质的活性位点处、在蛋白质络合物的亚单位之间的接触中、在各种遗传背景中的细胞内转运(trafficking)和蛋白质稳定性/半衰期上由特定氨基酸残基施加的作用的理解。
饱和诱变
在一些方面中，使用本公开的自动化编辑方法和自动化多模块细胞编辑仪器创建的细胞文库可以是饱和诱变文库，其中单个密码子或一组密码子被随机化以在特定的一个或更多个感兴趣基因的位置处产生所有可能的氨基酸。这些细胞文库对于生成变体例如用于定向进化可能是特别有用的。参见例如Chica等人的Current Opinion inBiotechnology 16(4):378-384(2005)和Shivange的Current Opinion in ChemicalBiology,13(1):19-25(2009)。
在一些方面中，包括不同简并密码子的编辑可用于对在文库中的单独细胞中的多组氨基酸编码。因为一些氨基酸由比其它氨基酸更多的密码子编码，所以氨基酸的精确比例不能是相等的。在某些方面中，使用更受限制的简并密码子。“NNK”和“NNS”具有对所有20个氨基酸编码的益处，但仍然在3％的时间对终止密码子编码。替代密码子(例如“NDT”、“DBK”)完全避免终止密码子，并对仍然包含所有主要生物物理类型(阴离子、阳离子、脂肪族疏水、芳香族疏水、亲水、小)的最小的一组氨基酸编码。
在特定方面中，非冗余饱和诱变，其中对于特定生物体的最常用的密码子在饱和诱变编辑过程中被使用。
启动子交换和阶梯(ladders)
用于分析和/或优化一个或多个感兴趣基因的表达的一种机制是通过“启动子交换”细胞文库的创建，其中细胞包括具有链接到一个或更多个感兴趣基因的特定启动子的基因编辑。因此，使用本公开的方法、自动化多模块细胞编辑仪器创建的细胞文库可以是启动子交换细胞文库，其可以用于例如增加或减少感兴趣基因的表达以优化代谢或遗传途径。在一些方面中，启动子交换细胞文库可用于识别影响细胞活力或生存力的基因(例如，对影响细胞的生长率或整体健康的蛋白质编码的基因)的表达的增加或减少。在一些方面中，启动子交换细胞文库可用于创建具有在启动子之间的依赖性和逻辑的细胞，以创建合成基因网络。在一些方面中，启动子交换可用于控制在自然界中的同质和异质(复杂组织)群体的细胞之间的细胞间通信。
细胞文库可以利用任何给定数量的启动子，其基于一系列表达强度和任何给定数量的靶基因的展示而被组合在一起。启动子序列的阶梯在至少一种条件下改变至少一个基因座的表达。然后，使用本公开的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器来将该阶梯有系统地应用于在生物体中的一组基因。
在特定方面中，使用本公开的自动化编辑过程、模块和系统形成的细胞文库包括代表给定启动子的单独细胞，所述启动子可操作地链接到在否则相同的遗传背景中的一个或更多个感兴趣的靶基因。可以例如在美国专利号9,988,624中找到可以被修改以利用自动化系统的非自动化编辑策略的例子。
在特定方面中，通过编辑一组靶基因以可操作地链接到预选的一组启动子来产生启动子交换细胞文库，该一组启动子充当用于感兴趣基因的表达的“启动子阶梯”。例如，细胞被编辑，使得一个或更多个单独的感兴趣基因被编辑以与在启动子阶梯中的不同启动子可操作地链接。当内源启动子不存在、它的序列是未知的或者它以前以某种方式被改变时，启动子阶梯的单独启动子可以被插在感兴趣基因的前面。这些产生的细胞文库具有单独细胞，其中阶梯的单独启动子可操作地链接到在否则相同的遗传背景中的一个或更多个靶基因。
启动子通常被选择以导致跨越不同基因座的可变表达，并且可以包括诱导型启动子、组成型启动子或两者。
使用启动子阶梯编辑的这组靶基因可以包括在基因组中的所有或大多数开放阅读框(ORF)或者基因组的选定子集(例如激酶组或分泌组的ORF)。在一些方面中，靶基因可以包括基因的各种同工型的编码区，并且细胞文库可以被设计成表达一种或更多种特定同工型，例如，用于使用各种启动子进行转录组分析。
该组靶基因也可以是被已知或被怀疑为在特定细胞途径(例如调节途径或信令途径)中牵涉的基因。通过与先前证明的有益编辑(先前的启动子交换或先前的SNP交换)相关，通过基于在先前生成的编辑之间的上位交互作用的算法选择，基于关于有益ORF对靶的假设的其它选择标准，或通过随机选择，该组靶基因可以是与功能相关的ORF。在特定的实施例中，靶基因可以包括非蛋白编码基因，包括非编码RNA。
其他功能性遗传因子(包括绝缘体元素和其他基因组组织元素)的编辑也可以用于有系统地改变一组靶基因的表达水平，并且可以使用本公开的方法、自动化多模块细胞编辑仪器来被引入。在一个方面中，单独地或与选定启动子或启动子阶梯组合地使用增强子序列的阶梯来编辑细胞群体以创建具有在这些增强子元素中的各种编辑的细胞文库。在另一方面中，单独地或与选定启动子或启动子阶梯组合地使用核糖体结合序列的阶梯来编辑细胞群体以创建具有在这些核糖体结合序列中的各种编辑的细胞文库。
另一方面中，细胞群体被编辑以允许将各种mRNA和/或蛋白质稳定化或去稳定化序列附着到转录物或蛋白质的5’或3’末端或在任何其他位置处。
在某些方面中，可以使用本公开的自动化编辑方法、模块、仪器和系统来编辑先前建立的细胞系的细胞群体以创建细胞文库，以改善细胞的功能、健康和/或生存力。例如，目前用于大规模制造的许多工业菌株使用随机诱变过程被反复地开发了许多年，有时几十年。不需要的中性突变和有害突变连同有益的变化一起被引入到菌株中，且随着时间的推移这导致具有在整体鲁棒性和关键性状(例如生长率)方面的缺陷的菌株。在另一个例子中，哺乳动物细胞系在一段时间内通过细胞的传代而继续产生突变，且同样这些细胞系可能变得不稳定并获取不希望有的性状。本公开的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器可以使用编辑策略(例如SNP和/或STR交换、插入缺失创建或其他技术)来移除或改变不希望有的基因组序列和/或引入新的基因组序列以解决缺陷，同时保留细胞的合乎需要的特性。
当递归编辑被使用时，在已编辑细胞文库中的单独细胞中的编辑可以合并在基因组中的异位位点(例如，CarT基因座)中的“着陆垫”的包括以优化表达、稳定性和/或控制。
在一些实施例中，根据一种或更多种标准(例如，感兴趣的化学品或产品的生产)来培养和分析具有包括一个或更多个编辑(引入或去除)的单独细胞的所产生的每个文库。然后，拥有特定标准的细胞与细胞中的一个或更多个特定编辑相关联或关联。以这种方式，可以确定给定编辑对任何数量的感兴趣的基因或表型性状的影响。与特定标准或增强的功能/鲁棒性相关联的多个编辑的识别可能导致具有高度合乎需要的特性的细胞。
敲除或敲入文库
在某些方面中，本公开提供了用于创建具有各种感兴趣基因的“敲除”(KO)或“敲入”(KI)编辑的细胞的文库的自动化编辑方法、模块、仪器和系统。因此，本公开意欲涵盖由本公开的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器创建的已编辑细胞文库，其具有去除或减少选定感兴趣基因的表达的一个或更多个突变，以询问这些编辑对在细胞文库内的单独细胞中的基因功能的影响。
可以使用靶向基因KO(例如，通过插入/缺失)或KO(例如，通过同源定向修复)来创建细胞文库。例如，常常通过非同源末端连接DNA修复途径来修复双链断裂。已知该修复是容易出错的，且因此可能引入可能干扰基因功能的插入和缺失。优选地，编辑被合理地设计以特别地影响感兴趣基因，并且具有一个或更多个感兴趣基因座的KI或KI的单独细胞可以被创建。可以使用本公开的自动递归编辑来创建具有两个或更多个感兴趣基因座的KO或KI的细胞。
在特定方面中，使用在细胞群体内的细胞的同时多重编辑来创建KO或KI细胞文库，并且在细胞群体内的多个细胞在单轮编辑中被编辑，即，在细胞文库的细胞内的多个变化在单个自动化操作中。在其他特定方面中，细胞文库使用在细胞群体中的单独细胞的递归编辑被创建，并导致在基因组中的两个或更多个位点的多个编辑合并到单个细胞内。
SNP或短串联重复交换
在一个方面中，使用本公开的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器通过将单核苷酸多态性(“SNP”)有系统地引入或替代到单独细胞的基因组中以创建“SNP交换”细胞文库来创建细胞文库。在一些实施例中，本公开的SNP交换方法包括添加有益的SNP以及去除有害的和/或中性的SNP。SNP交换可以将编码序列、非编码序列或两者作为目标。
在另一方面中，使用本公开的自动化编辑方法、模块、仪器、仪器和系统通过系统地将短串联重复序列(“STR”)引入或替代到单独细胞的基因组中以创建“STR交换”细胞文库来创建细胞文库。在一些实施例中，本公开的STR交换方法包括添加有益的STR和去除有害的和/或中性的STR。STR交换可以将编码序列、非编码序列或两者作为目标。
在一些实施例中，用于创建细胞文库的SNP和/或STR交换是多重的，并且在细胞群体内的多个细胞在单轮编辑中被编辑，即，在细胞文库的细胞内的多个改变在单个自动化操作中。在其他实施例中，用于创建细胞文库的SNP和/或STR交换是递归的，并且导致多个有益序列合并到单个细胞内和/或有害序列从单个细胞去除。多个变化可以是特定的一组已定义的变化或部分地随机化的组合突变文库。有害突变的去除和有益突变的合并可以提供在各种细胞过程中的立即改进。去除遗传负担或将有益变化合并到没有遗传负担的菌株中也为额外的随机诱变提供了新的、强健的起点，其可能使进一步的改进成为可能。
SNP交换克服了随机诱变方法的基本限制，因为它不是随机方法，而是跨越细胞的单独突变的系统性引入或去除。
剪接位点编辑
RNA剪接是一个过程，在这个过程期间内含子被切除以及外显子被剪接在一起以产生被转变成蛋白质的mRNA。由细胞机器对剪接信号的精确识别对这个过程是至关重要的。因此，在一些方面中，使用对在各种基因座中的已知和/或预测的剪接供体和/或受体位点的系统性编辑来编辑细胞群体以创建各种基因的剪接位点变体的文库。这种编辑可以有助于阐明在细胞背景中的基因的各种同工型的生物相关性。可以使用如下分析技术来预测各种编码区的剪接位点的合理设计的序列，包括与各种哺乳动物失调相关联的实际或预测的突变：例如在Nalla和Rogan的Hum Mutat,25:334-342(2005)、Divina等人的Eur J HumGenet,17:759-765(2009)、Desmet等人的Nucleic Acids Res,37:e67(2009)、Faber等人的BMC Bioinformatics,12(suppl 4):S2(2011)中找到的技术。
起始/终止密码子交换和核酸类似物的合并
在一些方面中，本公开提供了使用本公开的自动化编辑方法、模块、仪器和系统来创建细胞文库，其中文库通过在生物体的整个基因组中或对于在基因组中的编码区的选定子集(例如激酶组或分泌组)交换起始和终止密码子变体来被创建。在细胞文库中，单独细胞将具有替代对于一个或更多个感兴趣基因的天然起始或终止密码子的一个或更多个起始或终止密码子。
例如，由真核生物使用的典型起始密码子是ATG(AUG)，且原核生物使用ATG(AUG)最多，后面是GTG(GUG)和TTG(UUG)。细胞文库可以包括对一个或更多个感兴趣基因的天然起始密码子的替代的单独细胞。
在一些方面中，本公开提供了通过在选定的感兴趣基因前面用TTG替换ATG起始密码子来自动创建细胞文库。在其他方面中，本公开提供了通过用GTG替换ATG起始密码子来自动创建细胞文库。在其他方面中，本公开提供了通过用ATG替换GTG起始密码子来自动创建细胞文库。在其他方面中，本公开提供了通过用TTG替换GTG起始密码子来自动创建细胞文库。在其他方面中，本公开提供了通过用ATG替换TTG起始密码子来自动创建细胞文库。在其他方面中，本公开提供了通过用GTG替换TTG起始密码子来自动创建细胞文库。
在其他例子中，对于酿酒酵母和哺乳动物的典型终止密码子分别是TAA(UAA)和TGA(UGA)。对于单子叶植物的典型终止密码子是TGA(UGA)，而昆虫和大肠杆菌通常使用TAA(UAA)作为终止密码子(Dalphin等人，Nucl.Acids Res.，24:216-218(1996))。细胞文库可以包括具有对一个或更多个感兴趣基因的天然终止密码子的替代的单独细胞。
在一些方面中，本公开提供了通过用TAG替换TAA终止密码子来自动创建细胞文库。在其他方面中，本公开提供了通过用TGA替换TAA终止密码子来自动创建细胞文库。在其他方面中，本公开提供了通过用TAA替换TGA终止密码子来自动创建细胞文库。在其他方面中，本公开提供了通过用TAG替代TGA终止密码子来自动创建细胞文库。在其他方面中，本公开提供了通过用TAA替换TAG终止密码子来自动创建细胞文库。在其他方面中，本发明教导了通过用TGA替换TAG终止密码子来自动创建细胞文库。
终止子交换和阶梯
一种用于识别一个或更多个感兴趣基因的预剪接的mRNA的最佳终止的机制是通过“终止子交换”细胞文库的创建，其中细胞包括具有链接到一个或更多个感兴趣基因的特定终止子序列的基因编辑。因此，使用本公开的方法、模块、仪器和系统创建的细胞文库可以是终止子交换细胞文库，其可以用于例如通过从合成的位点释放转录物来影响mRNA稳定性。在其它实施例中，终止子交换细胞文库可用于识别转录终止的效率的增加或降低和因而未剪接的前体mRNA的积聚(例如West和Proudfoot,Mol Cell.；33(3-9)；354-364(2009))和/或3’端处理(例如，West等人，Mol Cell.29(5):600-10(2008))。在基因被链接到多个终止位点的情况下，编辑可以编辑对与基因相关联的多个终止子的编辑的组合。额外的氨基酸也可以被添加到蛋白质的末端以确定蛋白质长度对终止子的影响。
细胞文库可以利用基于一定范围的活性和任何给定数量的靶基因的展示为终止子阶梯选择的终止子的任何给定数量的编辑。终止子序列的阶梯在至少一种条件下改变至少一个基因座的表达。然后，使用本公开的自动化编辑方法、模块、仪器和系统来将该阶梯有系统地应用于在生物体中的一组基因。
在一些方面中，本公开提供了使用本公开的自动化编辑方法、模块、仪器和系统来创建细胞文库，其中文库被创建以编辑在文库的单独细胞中的基因组中的一个或更多个区域中的终止子信号。在真核生物中的转录终止通过由与RNA聚合酶II相关联的蛋白质因子识别的终止子信号来操作。例如，细胞文库可以包含对多聚腺苷酸化特异性因子(CPSF)和裂解刺激因子(CstF)编码的基因和/或对由CPSF和CstF因子募集到终止位点的蛋白质编码的基因的单独真核细胞。在原核生物中，被称为Rho非依赖性和Rho依赖性终止的两种主要机制介导转录终止。例如，细胞文库可以包含具有在对影响这些终止途径的结合、效率和/或活性的蛋白质编码的基因中的编辑的单独原核细胞。
在某些方面中，本公开提供了选择具有最佳性质的终止序列(“终止子”)的方法。例如，在一些实施例中，本公开教导提供用于在宿主细胞内引入和/或编辑一个或更多个终止子和/或生成一个或更多个终止子的变体的方法，所述变体展示一定范围的活性。终止子的特定组合可以被组合在一起作为终止子阶梯，并且本公开的细胞文库包括代表终止子的单独细胞，终止子可操作地链接到在否则相同的遗传背景中的一个或更多个感兴趣靶基因。可以被修改以利用自动化仪器的非自动化编辑策略的例子可以在例如Serber等人的标题为“Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform”的美国专利号9,988,624中找到。
在特定方面中，通过编辑一组靶基因以可操作地链接到预选的一组终止子来产生终止子交换细胞文库，该预选的一组终止子充当用于感兴趣基因的表达的“终止子阶梯”。例如，细胞被编辑，使得内源启动子可操作地链接到单独感兴趣基因，其利用启动子阶梯中的不同启动子被编辑。当内源启动子不存在、它的序列是未知的或者它以前以某种方式被改变时，启动子阶梯的单独启动子可以被插在感兴趣基因前面。这些所产生的细胞文库具有带有阶梯的单独启动子的单独细胞，单独启动子可操作地链接到在否则相同的遗传背景中的一个或更多个靶基因。讨论中的终止子阶梯于是与给定的感兴趣基因相关联。
终止子阶梯可用于更一般地影响在基因组或基因组的选定子集中的所有或大多数ORF(例如激酶组或分泌组的ORF)的终止。该组靶基因也可以是被已知或被怀疑为在特定细胞途径(例如调节途径或信令途径)中牵涉的基因。通过与先前证明的有益编辑(先前的启动子交换或先前的SNP交换)相关，通过基于在先前生成的编辑之间的上位交互作用的算法选择，基于关于有益ORF对靶的假设的其它选择标准，或通过随机选择，该组靶基因可以是与功能相关的ORF。在特定的实施例中，靶基因可以包括非蛋白编码基因，包括非编码RNA。
例子
下面的例子被提出以便为本领域中的技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，且并不意欲限制发明人认为是他们的发明的内容的范围，它们也不意欲代表或暗示下面的实验是所执行的所有实验或仅有的实验。本领域中的技术人员将认识到，可以对如在特定方面中所示的发明做出许多变化和/或修改而不偏离如广泛描述的本发明的精神或范围。因此，当前的方面在所有方面中被考虑为说明性的而非限制性的。
例子1：电转感受态大肠杆菌的产生和转化
为了测试FTEP设备(例如，如图10B-10D(vi)所示被配置的FTEP设备)的转化，电转感受态大肠杆菌细胞被创建。为了创建起子培养物，将6ml体积的LB chlor-25(具有25μg/ml氯霉素的LB)转移到14ml培养管。大肠杆菌的25μl等分试样用于注入LB chlor-25管。在注入之后，管以45°角放置在被设置到250RPM和30℃的振荡培养箱中用于在12-16小时之间的过夜生长。OD600值应该在2.0和4.0之间。将250ml LB chlor-25管的1:100培养液体积转移到四个无菌的500ml带挡板的摇瓶，即每250ml体积摇瓶有2.5ml。将瓶置于被设置到250PRM和30℃的振荡培养箱中。通过每1至2小时测量OD600来监控生长。当培养物的OD600在0.5-0.6之间(大约3-4小时)时，将瓶从培养箱中移除。细胞在4300RPM、4℃下用离心机分离10分钟。上清液被去除，且100ml冰冷10％甘油被转移到每个样品。细胞被轻轻地再悬浮，且洗涤程序被执行三次，每次细胞再悬浮于10％甘油中。在第四次离心分离后，将细胞再悬液转移到50ml圆锥形Falcon管，并添加另外的冰冷10％甘油以使体积达到30ml。细胞再次在4300RPM、4℃下用离心机分离10分钟，上清液被去除，且细胞团块再悬浮于10ml冰冷甘油中。细胞在细胞悬液和冰冷甘油的1:100稀释液中被等分。
使用在图10B和图10C的(ii)、(iii)和(vi)以及图10D的(ii)和(vi)处所示的FTEP设备的实施例来执行比较电穿孔实验以确定电转感受态大肠杆菌的转化效率。用压力控制系统控制流速。将具有DNA的细胞的悬液装载到FTEP入口储器中。转化的细胞直接从入口和入口通道、通过流动通道、通过出口通道流动并进入包含恢复培养基的出口内。细胞被转移到包含额外恢复培养基的管中，在30℃下被置于培养箱中以250rpm振动3小时。细胞覆在板上以确定经受电穿孔且未能吸收(take up)质粒的菌落形成单位(CFU)以及经受电穿孔并吸收质粒的CFU。板在30℃下被培养；大肠杆菌菌落在24小时之后被计数。
使用体外高压电穿孔仪(NEPAGENETM ELEPO21)对照2mm电穿孔试管(Bulldog Bio，Portsmouth，NH)来对流通式电穿孔实验进行基准检验。具有DNA的细胞悬液的储备管被制备并用于用NEPAGENETM和流通式电穿孔进行边对边实验。结果在图19A中示出。在图19A中，加阴影线///的最左侧条表示细胞输入，在加阴影线\\\的条左侧的条表示经受转化的细胞的数量，加阴影线///的右侧条表示实际上被转化的细胞的数量。与NEPAGENETM电穿孔仪相比，FTEP设备显示在不同电压下电转感受态大肠杆菌细胞的等效转化。如可以看到的，转化存活率至少为90％，且在一些实施例中至少为95％、96％、97％、98％或99％。在某些实施例中，恢复率(成功地被转化和恢复的所引入的细胞的部分)至少为0.001，且优选地在0.00001和0.01之间。在图19A中，恢复率约为0.0001。
此外，为了转化(摄取)、切割和编辑的效率而做出NEPAGENETM ELEPO21和FTEP设备的比较。在图19B中，执行三重实验，其中加阴影线///的条表示用于转化的细胞输入的数量，以及加阴影线\\\的条表示被转化(摄取)的细胞的数量、其中细胞的基因组被从转化到细胞(切割)中的载体转录和转换的核酸酶切割的细胞的数量，以及其中编辑被实现(使用从转化到细胞中的载体转录和转换的核酸酶以及使用都从转化到细胞中的载体转录的导向RNA和供体DNA序列来切割和修复)的细胞的数量。此外注意，在非编辑细胞系中，NEPAGENETM电穿孔仪和FTEP的菌落的数量显示相等的转化效率。此外可以看到，FTEP显示与NEPAGENETM电穿孔仪相当的转化、切割和编辑效率。
例子2：电转感受态酿酒酵母的产生和转化
为了进一步测试FTEP设备(诸如在图10B-10D(vi)中所示配置的FTEP设备)的转化，使用如在Bergkessel和Guthrie的Methods Enzymol,529:311-20(2013)中综合阐述的方法来制备酿酒酵母细胞。简要地，YFAP培养基被注入用于过夜生长，3ml注入以产生100ml的细胞。所处理的每100ml的培养物产生大约1ml的感受态细胞。细胞在30℃下被注入振动培养箱中，直到它们达到1.5+/-0.1的OD600为止。
对于被生长并被保持在室温下的每100mL的细胞使用100mM的乙酸锂、10mM的二硫苏糖醇和50mL的缓冲液来制备调节缓冲液。在250ml瓶中在4300rpm下收获细胞3分钟，并去除上清液。细胞团块悬浮在100ml的冷1M山梨醇中，在4300rpm下旋转3分钟，并且上清液再一次被去除。细胞悬浮在调节缓冲液中，然后悬液被转移到合适的瓶中并在200RPM和30℃下被振动30分钟。悬液被转移到50ml锥形瓶，并在4300rpm下旋转3分钟。上清液被去除，且团块再悬浮于冷的1M山梨醇中。这些步骤对于总共三个洗涤-旋转-倾析步骤重复三次。团块悬浮在山梨醇中到150+/-20的最终OD。
使用FTEP设备来执行比较电穿孔实验以确定电转感受态酿酒酵母的转化效率。用注射泵(Harvard装置PHD ULTRATM 4400)控制流速。在安装到泵上之前，具有DNA的细胞的悬液被装载到1mL玻璃注射器(Hamilton 81320注射器，PTFE Luer Lock)内。紧接着在开始流动之前，来自函数发生器的输出被开启。经处理的细胞直接流入具有1M山梨醇和羧苄青霉素的管中。细胞被收集，直到在NEPAGENETM中被电穿孔的相同体积被处理为止，此时流动和来自函数发生器的输出停止。在30℃和250rpm下的培养箱振动器中的3小时恢复之后，细胞覆在板上以确定经受电穿孔且未能吸收质粒的菌落形成单位(CFU)和经受电穿孔并吸收质粒的CFU。板在30℃下被培养。酵母菌落在48-76小时之后被计数。
使用体外高压电穿孔仪(NEPAGENETM ELEPO21)对照2mm电穿孔试管(Bull dogBio，Portsmouth，NH)来对流通式电穿孔实验进行基准检验。具有DNA的细胞悬液的储备管被准备并用于用NEPAGENETM和流通式电穿孔进行边对边实验。结果在图20中示出。与NEPAGENETM方法相比，该设备显示在2.5kV电压下的电转感受态酿酒酵母的更好的转化和存活。输入是被处理的细胞的总数。
例子3：FTEP压力感测和流速
也使用实质上如图1-B-10D(vi)所示的FTEP设备作为如图1A所示的盒设备的一部分来测试压力和感测。在线流量传感器测量用于指示在包含细胞和DNA的液体流过FTEP芯片之后，入口储器何时、在哪里被倒空。大约65μL的液体被装载到输入储器中，并且自动化FTEP模块被通电。看在图21的顶部处的图，可以看到，在几个短暂的启动瞬变之后，流速显示在几乎8秒(8000ms)期间的大约每分钟3标准立方厘米(SCCM)的流速，直到它跳到24SCCM为止。这个瞬变出现在运行触发结束时，这是包含细胞和DNA的液体已经通过FTEP设备被处理以及空气没有流过FTEP设备的指示。该触发可构成在空气的压力(例如在从注射泵引出的导管处)中的增加的流速或突然的波动(增加或减少)的检测。在一个优选实施例中，图27中的流量传感器检测到空气流量的增加，指示流体完全从输入储器排出。在这一点上，压力可以反转以允许多遍电穿孔过程；也就是说，对于一遍电穿孔，待电穿孔的细胞可以从入口被“拉”向出口，并且一旦入口储器被倒空，传感器就可以反转压力，其中液体和细胞/DNA从流通式FTEP设备的出口端被“推”向入口端，以对于另一遍电穿孔再次在电极之间通过。这个过程可以重复一到很多次。可选地，可以完全停止压力，并取回在出口中的转化的细胞。
多周期方法可能是特别有利的，因为它限制了细胞和外源性物质在电场中的停留时间，这又可以防止细胞损伤并提高存活率。来回过程可以重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。图27在底部处示出压力系统和FTEP的简单描绘。压力歧管通过布置在歧管或储器上的一个或更多个互补的密封件或垫圈来与向上延伸的储器配合。
例子4：全自动化单定位点(Singleplex)RGN导向编辑运行
使用本公开的自动化多模块仪器来成功地执行使用MAD7核酸酶进行的单定位点自动化基因组编辑。参见美国专利号9,982,279。
ampR质粒骨架和lacZ_F172*编辑盒通过Gibson
Figure BDA0002506973470001111
被组装在自动化仪器中的等温核酸组装模块中的“编辑载体”内。lacZ_F172在功能上敲除lacZ基因。“lacZ_F172*”指示编辑发生在lacZ氨基酸序列中的第172个残基处。在组装之后，产物在等温核酸组装模块中使用AMPure珠被脱盐，用80％乙醇洗涤，并在缓冲液中被洗脱。组装的编辑载体和重组工程就绪的电转感受态大肠杆菌细胞被转移到转化模块中用于电穿孔。转化模块包括ADP-EPC试管。参见例如美国专利号62/551069。细胞和核酸被组合并被允许混合1分钟，且电穿孔被执行30秒。穿孔脉冲的参数是：电压，2400V；长度，5ms；间隔，50ms；脉冲的数量，1；极性，+。传输脉冲的参数是：电压，150V；长度，50ms；间隔，50ms；脉冲的数量，20；极性，+/-。在电穿孔之后，细胞被转移至恢复模块(另一个生长模块)，并被允许在包含氯霉素的SOC培养基中恢复。羧苄青霉素在1小时之后被添加到培养基，且细胞被允许恢复另外2小时。在恢复之后，细胞被保持在4℃下，直到由用户恢复为止。
在自动化处理和恢复之后，细胞的等分试样被覆在包含被补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和羧苄青霉素的MacConkey琼脂基的培养皿上，且接种物生长直到可见菌落出现为止。白色菌落代表在功能上编辑的细胞，紫色菌落代表未编辑的细胞。所有液体转移由自动化多模块细胞编辑仪器的自动化液体操纵设备执行。
自动化处理的结果是大约1.0E-03个总细胞被转化(与常规台式结果相当)，且编辑效率为83.5％。通过细胞的基因组的编辑区的测序来确认在白色菌落中的lacZ_172编辑。此外，通过网络摄像头来远程地观察自动细胞处理的步骤，且文本消息被发送以更新自动处理过程的状态。
例子5：全自动递归编辑运行
使用自动化多模块细胞编辑仪器成功地实现了递归编辑。ampR质粒骨架和lacZ_V10*编辑盒通过Gibson
Figure BDA0002506973470001121
被组装在自动化系统中包括的等温核酸组装模块中的“编辑载体”内。相似于lacZ_F172编辑，lacZ_V10编辑在功能上敲除lacZ基因。“lacZ_V10”指示编辑发生在lacZ氨基酸序列中的氨基酸位置10处。在组装之后，产物在等温核酸组装模块中使用AMPure珠被脱盐，用80％乙醇洗涤，并在缓冲液中被洗脱。将第一组装的编辑载体和重组工程就绪的电转感受态大肠杆菌细胞转移到转化模块(例如实质上如图1-B-10D(vi)所示的作为如图1A所示的盒设备的一部分的FTEP设备)中，用于电穿孔。转化模块包括ADP-EPC试管。细胞和核酸被组合并被允许混合1分钟，且电穿孔被执行30秒。穿孔脉冲的参数是：电压，2400V；长度，5ms；间隔，50ms；脉冲的数量，1；极性，+。传输脉冲的参数是：电压，150V；长度，50ms；间隔，50ms；脉冲的数量，20；极性，+/-。在电穿孔之后，细胞被转移至恢复模块(另一个生长模块)，被允许在包含氯霉素的SOC培养基中恢复。羧苄青霉素在1小时之后被添加到培养基，且细胞生长另外2小时。然后将细胞转移到离心模块，且然后执行培养基交换。将细胞再悬浮于包含氯霉素和羧苄青霉素的TB中，其中细胞生长至2.7的OD600，然后被浓缩并成为电转感受态的。
在细胞生长期间，在等温核酸组装模块中制备第二编辑载体。第二编辑载体包括卡那霉素抗性基因，且编辑盒包括galK Y145*编辑。如果是成功的，galK Y145*编辑在细胞上赋予摄取半乳糖和使半乳糖产生代谢变化的能力。由galK Y154*盒生成的编辑在第154个氨基酸残基处引入终止密码子，将酪氨酸氨基酸改变为终止密码子。这个编辑使galK基因产物变成无功能的，并抑制细胞能够使半乳糖产生代谢变化。在组装之后，第二编辑载体产物在等温核酸组装模块中使用AMPure珠被脱盐，用80％乙醇洗涤，并在缓冲液中被洗脱。组装的第二编辑载体和电转感受态大肠杆菌细胞(其用第一编辑载体被转化并被选择用于第一编辑载体)使用与上面详述的相同的参数被转移到转化模块(实质上如图1-B-10D(vi)所示的作为如图1A所示的盒设备的一部分的FTEP设备)中，用于电穿孔。在电穿孔之后，细胞被转移到恢复模块(另一个生长模块)，被允许在包含羧苄青霉素的SOC培养基中恢复。在恢复之后，细胞被保持在4℃下直到被取回为止，其后细胞的等分试样被覆在被补充有氯霉素和卡那霉素的LB琼脂上。为了量化lacZ和galK编辑，在两种培养基类型上生成复制补丁板：1)被补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的MacConkey琼脂基，和2)被补充有半乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的MacConkey琼脂基。所有液体转移由自动化多模块细胞编辑仪器的自动化液体操纵设备执行。
在这个递归编辑实验中，41％的所筛选的菌落同时具有lacZ和galK编辑，其结果与使用“台式”或手动方法获得的双重编辑效率相当。
尽管描述了某些实施例，但这些实施例仅作为例子被呈现，且并不意欲限制本公开的范围。实际上，本文描述的新颖方法、装置、模块、仪器和系统可以体现在多种其他形式中；此外，可以做出在本文描述的方法、装置、模块、仪器和系统的形式中的各种省略、替换和变化而不偏离本公开的精神。附随的权利要求及其等同物意欲涵盖如落在本公开的范围和精神内的这样的形式或修改。

Claims (20)

1.一种自动化多模块细胞编辑仪器，包括：
壳体，其被配置为容纳所述模块中的所有或一些；
容器，其被配置成接收细胞；
一个或更多个容器，其被配置成接收核酸；
流通式电穿孔(FTEP)模块，其被配置为将所述核酸引入到所述细胞内；
恢复模块，其被配置为允许所述细胞在所述FTEP模块中的细胞转化之后恢复；
编辑模块，其被配置为允许所引入的核酸编辑所述细胞中的核酸；以及
处理器，其被配置为基于用户输入和/或预编程的脚本的选择来操作所述自动化多模块细胞编辑仪器。
2.根据权利要求1所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块包括：
a.一个或更多个入口和入口通道，其用于将包括细胞和外源性物质的流体引入到所述FTEP模块内；
b.出口和出口通道，其用于从所述FTEP模块移除包括转化的细胞和外源性物质的流体；
c.流动通道，其与第一入口通道和所述出口通道相交并定位在所述第一入口通道和所述出口通道之间，其中所述流动通道在所述第一入口通道和所述流动通道的中心之间以及在所述出口通道和所述流动通道的中心之间在宽度上减小；以及
d.两个或更多个电极，其位于在所述流动通道与所述第一入口通道的交点和所述流动通道与所述出口通道的交点之间的所述流动通道中；其中所述电极与在所述流动通道中的流体处于流体连通，但不在所述流动通道中的所述细胞的直接流动路径中；并且其中当所述流体中的所述细胞穿过所述流动通道时，所述电极将一个或更多个电脉冲施加到所述细胞，从而将所述外源性物质引入到所述流体中的所述细胞内。
3.根据权利要求2所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块还包括连接到用于将所述流体中的所述细胞引入到所述FTEP模块内的所述入口的储器，以及连接到用于从所述FTEP模块移除转化的细胞的所述出口的储器。
4.根据权利要求2所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块还包括两个入口和两个入口通道，并且还包括连接到用于将所述外源性物质引入到所述FTEP模块内的第二入口的储器。
5.根据权利要求4所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块的所述第二入口和第二入口通道位于所述第一入口和第一入口通道与所述FTEP模块的所述电极之间。
6.根据权利要求4所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块的所述第二入口和第二入口通道位于所述电极和所述FTEP模块的所述出口通道和出口之间。
7.根据权利要求2所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块的通道宽度的最窄部分为从10μM到5mm。
8.根据权利要求2所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块还包括位于所述一个或更多个入口通道和所述电极之间的过滤器。
9.根据权利要求1所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，设备被配置为供细菌、酵母和哺乳动物细胞使用。
10.根据权利要求2所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，一个电极位于所述入口通道和所述流动通道在宽度上减小的位置之间，以及第二电极位于所述流动通道在宽度上减小的位置和所述出口通道之间。
11.根据权利要求1所述的自动化多模块细胞编辑仪器，还包括试剂盒。
12.根据权利要求1所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块包括：
a.至少一个入口和至少一个入口通道，其用于将包括细胞和外源性物质的流体引入到所述FTEP模块内；
b.出口和出口通道，其用于从所述FTEP模块移除转化的细胞和外源性物质；
c.流动通道，其定位在第一入口通道和所述出口通道之间，其中所述流动通道与所述第一入口通道和所述出口通道相交，以及其中所述流动通道的一部分在所述入口通道交点和所述出口通道交点之间变窄；以及
d.电极，其位于所述流动通道的任一侧上并与所述流动通道中的所述流体直接接触，所述电极限定所述流动通道的狭窄部分；并且其中当所述流体中的所述细胞通过所述流动通道时，所述电极将一个或更多个电脉冲施加到所述细胞，从而将所述外源性物质引入到所述流体中的所述细胞内。
13.根据权利要求12所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块还包括连接到用于将流体中的所述细胞引入到所述FTEP模块内的所述入口的储器，以及连接到用于从所述FTEP模块移除转化的细胞的所述出口的储器。
14.根据权利要求12所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块还包括两个入口和两个入口通道，并且还包括连接到用于将所述外源性物质引入到所述FTEP模块内的第二入口的储器。
15.根据权利要求14所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块的所述第二入口和第二入口通道位于所述FTEP模块的所述第一入口和第一入口通道与所述电极之间。
16.根据权利要求14所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块的所述第二入口和第二入口通道位于所述FTEP模块的电极与所述出口通道和出口之间。
17.根据权利要求12所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块的通道宽度的最窄部分是从10μM到5mm。
18.根据权利要求12所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块还包括位于所述一个或更多个入口通道和所述电极之间的过滤器。
19.根据权利要求18所述的自动化多模块细胞编辑仪器，其中，所述FTEP模块位于所述试剂盒上。
20.根据权利要求12所述的自动化多模块细胞编辑仪器，还包括试剂盒。
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