CN104080906A - 用于产生诱导多能干细胞或分化细胞的自动化系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于从成年体细胞产生诱导多能干细胞(iPSC)的自动化系统。进一步地，该系统用于从体细胞产生分化成年细胞。本发明系统可用于从组织样本中分离体细胞、通过重编程此类细胞而从成年分化细胞产生iPSC系、在其他细胞中鉴定出多能重编程成年细胞，以及扩充和筛选所鉴定的重编程细胞。
Description
技术领域
本发明一般地涉及用于从分化成年细胞产生诱导多能干细胞(iPSC)的自动化系统，更具体地涉及用于从组织样本分离体细胞、通过重编程此类细胞而从成年分化细胞产生iPSC系、从其他细胞中鉴定出多能重编程成年细胞，以及扩充所鉴定的重编程细胞的自动化系统。
发明背景
干细胞是通过细胞分裂长时间自我更新的非特化细胞并且可被诱导分化成具有特化功能的细胞，即，分化细胞。这些特质使得干细胞有望在治疗应用中使用，用来替换各种医学病状中的受损伤的细胞和组织。胚胎干(ES)细胞来源于早期胚胎的胚泡并且具有发育成内胚层、外胚层和中胚层(三个生殖层)的潜能(即，它们是“多能的”)。在体外，ES细胞趋向于自发地分化成各种类型的组织，并且控制它们的分化方向可能具有挑战性。但是也有一些与为收获人ES细胞而破坏胚胎相关的未解决的伦理问题。这些问题限制了它们在研究和治疗应用中的可用性。
成年干(AS)细胞是在分化组织中发现的。从成年组织获得的干细胞通常具有形成更有限的细胞谱的潜能(即，“专能(multipotent)”)，并且通常仅分化成它们在其中被发现的组织的细胞类型，但是最近的报告已表明在某些类型的AS细胞中具有可塑性。它们一般还具有有限的分化潜能。
诱导多能干细胞(iPSC或iPSC)是通过实验室方法从分化成年细胞产生的。iPSC被广泛地认为是例如用于进行医学研究的重要工具。迄今为止，用于产生iPSC的技术一直耗时耗力。将分化成年细胞例如成纤维细胞重编程，对其进行培养，并让其形成代表独特克隆的各个集落。先前，鉴定这些类型的细胞很困难，因为这些细胞中的大多数不是完全重编程的iPSC克隆。对于待选择的iPSC克隆的标准基于细胞的形态，其中具有清楚划定的边界的理想集落含有具有高核质比的细胞。当鉴定出克隆时，通过微薄玻璃工具手动挑选它们并在细胞，通常，鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的饲养层上进行培养。这一步骤通常在感染后14–21天利用重编程载体进行。然后，再将该克隆扩充14–21天，之后才进行分子表征。
其他则集中于开发快速、更准确地鉴定和表征完全重编程的成年成纤维细胞及它们的下游分化潜能的技术(Bock等人，2011,Cell 144:439-452；Boulting等人，2011,Nat Biotechnol 29:279-286)。还参见，例如，2011年6月13日提交的共同拥有的美国第13/159,030号，其描述了荧光激活细胞分选术(FACS)在鉴定和实时分选如由表面蛋白的独特表达形式界定的细胞的独特亚群中的用途。
因而，干细胞是用于治疗应用、医学研究、药物测试等的有吸引力的细胞来源。然而，本领域仍然长期需要在标准条件下快速产生并分离可再现的iPSC细胞系的自动化系统，以便满足这些和其他需求。
发明概要
本发明提供了用于使用来自成年组织的体细胞并且从这些体细胞，例如，成年成纤维细胞产生诱导多能干细胞(iPSC)的系统。在一方面，系统还利用先前分离的体细胞作为起始点。
本发明提供了用于产生和分离iPSC的自动化系统，其包括：
将体细胞铺在平板上的体细胞铺板单元；以及
通过使体细胞铺板单元上的体细胞与重编程因子接触从而产生iPSC来对体细胞进行自动化重编程的诱导单元。
在一个实施方案中，系统进一步包括选择性地分选和分离由诱导单元产生的iPSC的分选单元，其例如通过鉴定包括例如细胞上的表面标记在内的iPSC特异性标记来进行所述分选和分离。在一个说明性实例中，体细胞为成纤维细胞。
进一步地，在一方面，本发明提供了用于从干细胞，例如，iPSC、胚胎干(ES)细胞或间充质干(MS)细胞产生分化的成年细胞并进行分离的自动化系统，其包括：
将干细胞铺在平板上的干细胞铺板单元；以及
通过使干细胞铺板单元上的细胞与重编程因子接触从而产生分化的成年细胞来对干细胞进行自动化重编程的诱导单元。在一个实施方案中，系统进一步包括选择性地分选和分离由诱导单元产生的分化的成年细胞的分选单元。
在一方面，本发明提供了用于从诱导多能干细胞(iPSC)产生分化的成年细胞并进行分离的自动化系统，其包括：
将iPSC铺在平板上的iPSC铺板单元；以及
通过使iPSC铺板单元上的iPSC与重编程因子接触从而产生分化的成年细胞来对iPSC进行自动化重编程的诱导单元。在进一步的方面，系统包括通过鉴定对分化的成年细胞有特异性的标记来选择性地分选和分离由诱导单元产生的分化的成年细胞的分选单元。
本发明还提供了使用本发明系统产生的iPSC、分化细胞或转分化细胞。进一步地，本文包括了包含从本发明的iPSC或分化细胞获得的细胞群体的阵列。例如，分化细胞包括造血细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿道细胞和神经元细胞。在另一方面，包括了由本发明系统产生的细胞库。
附图简述
图1示出获取成纤维细胞库的步骤。
图2示出从成纤维细胞库获得干细胞阵列的步骤。
图3是示出系统中产生iPSC的步骤的流程图。
图4A-4C示出在自动化重编程过程期间通过多孔组织培养平板的患者样本流的实例。
图5A-5C示出用于完成工作流程的设备配置的实例。
图6A-6C示出自动化活检组织生长晕(outgrowth)跟踪系统。在图6A中，活检组织或丢弃的组织铺在6孔培养皿的多个孔中，并且由对成纤维细胞生长晕进行饲养、成像、传代和冷冻的自动化系统来维持。示出典型样本的图像分析界面实例。图6B：基于线性回归在独立产生的标准曲线上从融合测量值外推细胞数目。图6C：维持在自动化系统上的典型活检组织生长晕的细胞计数的实例。针对每个孔对每个患者样本的外推细胞数目独立地作图(上)，从而允许计算样本的总输出(output)(下)。
图7A-D示出FACS分析及示出自动化iPSC重编程的图表。追踪重编程人成纤维细胞上的多能表面标记的表达水平3周，以观察重编程动力学并确定分离限定的细胞群体的最佳时间点。图7A用于分析的FACS门控方案。图7B：相当大比例的共表达传统多能表面标记SSEA4和TRA-1-60的细胞在使用病毒载体引入重编程因子诸如Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的重编程期间的所有时间点保留了成纤维细胞标记CD13。示出的盒须图指示来自131个实验(逆转录病毒，n＝66；仙台病毒(Sendai virus)，n＝65)的汇总数据。虽然Sendai介导的重编程产生更多的SSEA4/TRA-1-60双阳性细胞，(C)但是CD13从表面上的消除出现延迟。(D)在自动化系统上使用Sendai/Cytotune系统重编程的患者细胞系的示例性染色图案。在感染后7和13天(dpi)，超过半数的SSEA4/TRA-1-60双阳性细胞已失去CD13。另外，在测定的这两个时间点，CD13阴性/Nanog阳性细胞存在于此部分中，表明这些细胞可通过针对CD13的阴性选择来分离。
图8A-C示出FAC预分选分析和用于证明iPSC的富集和克隆选择的自动化系统的一部分。图8A示出可利用成纤维细胞标记通过阴性选择从iPSC培养物中去除非重编程细胞群体。在该实例中，成纤维细胞从含有2％建立的iPSC的培养物中有效除去，而TRA-1-60阳性iPSC不受影响。图8B示出集成到Hamilton液体处理机中的Miltenyi MultiMACS系统可平行地分选24个样本。图8C示出来自抗-成纤维细胞磁性阴性选择步骤的iPSC富集部分，其以极限稀释形式铺在96孔成像平板上。使用针对多能表面标记TRA-1-60或TRA-1-81的活细胞染色对这些平板进行筛选。使用能够确认单个集落的Celigo软件通过自动化图像分析鉴定具有TRA-1-60阳性iPSC的孔。选择满足含有对表面标记呈阳性的单一集落的两个标准的孔用于传代、扩充和QC。
图9A-B提供了本文所描述的记分卡测定的图示。质量控制筛选的第一阶段使用一组多能性分化和转基因标记挑选三个克隆的初始集。图9A示出在第5和10次传代时测定的两个人ESC系、Sendai阳性对照、成纤维细胞阴性对照及通过FACS分选提取的iPSC系在归一化至HK基因表达之后的转录本计数，所有测定都是相对于在相似条件下维持的一组正常人ESC和iPSC系运行的。图9B示出质量控制筛选的第二阶段，其使用另外83种生殖层/谱系标记来在类胚体测定中监测分化能力。产生单一EB，并将它们汇集以收集RNA用于类胚体记分卡测定中生殖层标记的表达分析。示出从九种不同胚胎干细胞系收集的EB中基因表达的聚类树状图分析。在归一化后，由六种EB的直接裂解产生的数据与从抽提和纯化自由大规模培养物制备的EB的总RNA产生的数据相比有优势。
图10A-B示出基于针对CNV的Nanostring nCounter测定的高通量iPSC染色体组型分析。图10A是对BC1 iPSC进行的nCounterKaryotype测定的实例；图10B是对1016个染色体臂部分增加和缺失的成纤维细胞进行的nCounter Karyotype测定的实例。与AffymetrixSNP 6.0芯片数据的比较证明了Chr1的q臂的一部分的拷贝数增加(上迹线，1q21.2-1q43))，而Chr6的长臂的一部分缺失(下迹线，6q16.3-6q26)。
具体实施方式
本发明基于用于制取iPSC和分化细胞的自动化系统的产生。本发明系统大大提高了制备标准化iPSC系的效率和可再现性。通常，研究者手工产生iPSC，这限制了该细胞的实用性，因为研究者之间存在差异性并且不能产生大量细胞。本发明系统利用从接收组织或细胞样本到存库(banking)大量清楚界定的iPSC系完全自动化的系统规避了这些问题。该系统允许对于从许多供体产生大量细胞的一致性和不变性，这将有助于使用iPSC技术来发现许多疾病的治疗和治愈。
在一个实施方案中，本发明的工作流系统包括用于产生和分离iPSC的自动化系统，其包括：
将细胞铺在平板上的体细胞(例如成纤维细胞)铺板单元；以及
通过使铺板单元上的细胞与重编程因子接触从而产生iPSC来对细胞进行自动化重编程的诱导单元。在进一步的实施方案中，本发明系统包括用于选择性地分选和分离由诱导单元产生的iPSC的分选单元，其通过鉴定由转染载体插入的包括例如表面标记或绿色荧光蛋白的iPSC特异性标记来进行所述分选和分离。体细胞可以从细胞系、活检组织或包括血液等在内的其他组织样本获得。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于从干细胞，例如，iPSC、胚胎干(ES)细胞或间充质干(MS)细胞产生分化的成年细胞并进行分离的自动化系统，其包括：
将细胞，例如iPSC、ES或MS细胞铺在平板上的干细胞铺板单元；以及
通过使干细胞铺板单元上的细胞与重编程因子接触从而产生分化的成年细胞来对细胞进行自动化重编程的诱导单元。在一个实施方案中，该系统进一步包括通过鉴定对分化的成年细胞有特异性的标记来选择性地分选和分离由诱导单元产生的分化的成年细胞的分选单元。
在又一个实施方案中，本发明提供了用于从诱导多能干细胞(iPSC)产生分化的成年细胞并进行分离的自动化系统，其包括：
将iPSC铺在平板上的iPSC铺板单元；以及
通过使iPSC铺板单元上的iPSC与重编程因子接触从而产生分化的成年细胞来对iPSC进行自动化重编程的诱导单元。在一个实施方案中，该系统进一步包括通过鉴定对分化的成年细胞有特异性的标记来选择性地分选和分离由诱导单元产生的分化的成年细胞的分选单元。
本发明提供了用于从分化的成年细胞产生iPSC的自动化工作流系统。宽泛地讲，本发明的工作流系统提供了从成年分化细胞(例如，分离的或组织样本)开始并且产生iPSC或来源于多能细胞的成年细胞的新工作流系统。在一个实施方案中，成年分化细胞优选为例如从皮肤活检组织获得的成纤维细胞。成年成纤维细胞由合并了自动化技术和机器人技术的本发明工作流转化成诱导多能干细胞(iPSC)。本发明的工作流系统能够在几个月的时间内，而不是先前所需要的几年内平行地产生数百个iPSC，从而导致时间进度加块。本发明的工作流系统可针对起始物料改造成任何细胞分离系统，并且可应用于例如直接或间接的重编程和转分化。本发明的工作流系统将允许采用来自6、24、96、384、1536大小或更大的阵列的细胞的细胞阵列进行生产。本发明的工作流系统适应性强，并且将允许多次迭代及细胞类型和组织的灵活性。本文的描述是以成纤维细胞作为例证性体细胞来示出的。如本文所指出的，其他细胞类型也可用在系统中。该实例无意欲以这种方式受到限制。
工作流系统
工作流系统被分解成四个独立操作的单元：
(1)检疫体细胞分离和生长(系统1)；
(2)检疫测定(系统2)；
(3)解冻、感染和鉴定(系统3、4和5)；以及
(4)维持、QC、扩充和冷冻(系统6、7和8)
另外，用于将成纤维细胞和最终克隆储藏在1.4mL Matrix螺旋盖管中的自动化-80储藏和取回系统是系统的一部分。下面将描述系统，以及每个单元将执行的步骤和操作。
系统1，部分A：检疫体细胞分离和生长工作流，活检组织处理预支原体测试
1.技术人员每周将把40种活检组织铺在6孔盘中；
2.将6孔板维持在具有200板容量的检疫温育器中；
3.在集成的Cyntellect Celigo Cytometer上执行定期的融合检查。
可用于执行这些自动化步骤的系统组件包括，举例来说，STARletManual Load、用于4/8/12 ch./MPH的模块臂(Modular Arm)、8个具有1000μl移液通道的通道及iSWAP平板处理机(Plate Handler)，这些都可从Hamilton Science Robotics获得。如果需要或期望离心，则可使用Agilent VSpin Microplate Centerfuge。该软件可为Celigo APISoftware。温育器可为Cytomat温育器。为进行板处理，可使用Cytomat24 Barcode Reader、Cytomat 23mm Stackers和Cytomat 400mm中转站(transfer station)。为使平板倾斜，可使用MultiFlex Tilt Module。系统控制器可为具有Windows XP操作系统的Dell PG。承载包装(CarrierPackage)可为Q Growth Carrier Package。
系统1，部分B：检疫生长工作流，支原体测试
1.从温育器中取回置于检疫生长STARlet的台板上，从孔中取回培养基置于用于基于ELISA的支原体测试的平板中。
2.将96孔测定平板手动转移至检疫测定STARlet中。
系统1，部分C：检疫生长工作流，在通过支原体测试之后
1.将扩充的成纤维细胞分配到多个冷冻管中，封盖，转移至SAM-80℃。
可用于执行这些自动化步骤的系统组件可以选自在检疫生长工作流中使用的相同组件，但是可使用STARlet Auto Load。SpectramaxL Reader可以用作光谱采集装置。
系统2：检疫测定工作流
1.使用辉光发光(glow luminescence)方法，Lonza MycoAlert进行测试。
2.在光谱采集设备上执行发光板读数。
可用于执行这些自动化步骤的系统组件包括STARlet ManualLoad、用于4/8/12 ch./MPH的模块臂、8个具有1000μl移液通道的通道及iSWAP平板处理机，这些都可从Hamilton Science Robotics获得。对于发光测定，可以使用BioTek Synergy HT Reader。系统控制器可为具有Windows XP操作系统的Dell PG。承载包装可为Q GrowthCarrier Package。
系统3、4和5：解冻、感染和鉴定
解冻模块和感染模块
1.将冷冻管从SAM-80℃取回(61、190)
2.在温热块上解冻(122)
3.启盖(Hamilton封盖器启盖器)(126)
4.添加培养基以稀释冷冻保护剂(122)
5.旋转(128)
6.重悬在铺板数据中(122)
7.在6孔平板的每个孔中铺入一个样本(62、122)
8.移入温育器(130、132)
9.回收成纤维细胞约3-4天
10.在Cyntellect Celigo Cytometer上进行融合检查(124)
11.在重编程的同一天将所有孔中的成纤维细胞传代(122)
12.分批地用胰蛋白酶对各个孔进行传代(122)
13.在Cyntellect Celigo Cytometer上对细胞进行计数(124)
14.按照每个孔限定的数量铺在24孔板的一至三个孔中，将样品整合在尽可能少的24-孔板中(64、122)
15.将平板放回到温育器中过夜(130、132)
16.取回平板，将病毒以管形式解冻并将其加入到24孔板中的装有成纤维细胞的每个孔中(130、122)
17.每日更换部分培养基(122)
磁性分选模块
18.用accutase将培养物收获到单细胞悬浮液中(134)
19.在染色缓冲液中进行稀释(134)
20.用针对成纤维细胞表面标记的磁珠染色(134)
21.清洁步骤(134)
22.施加至磁体(对于Dynal珠)或柱(对于Miltenyi系统)上(134、136)
23.取回非磁性部分置于新孔中(134)
24.在Cyntellect Celigo Cytometer上对细胞进行计数(124)
25.稀释至合适的细胞密度用于按每孔1-10个细胞递送至96孔板中的传代培养基中(66、134)
26.将新基质胶(Matrigel)或基质包被的96孔板从4℃温育器中取回(142)
27.按基于细胞计数的数目，例如，每次感染每块板两个将细胞分配到96孔基质平板中(66、134)
28.将平板放回至温育器中(132)
29.每日更换部分培养基(122)
集落鉴定模块
30.将96孔平板从温育器中取回置于集落鉴定液体处理机中(66、132、138)
31.用多能性表面标记进行活细胞染色(138)
32.在Cyntellect Celigo Cytometer上成像(140)
33.鉴定含有具有清楚的集落边界的单一标记阳性集落的孔(140)
34.技术人员审核命中数并从每个原始样本中挑选出6个用于传代，并取回平板和阳性孔ID。
35.择优挑选具有单一阳性集落的孔(138)
36.将新基质胶或基质包被的96孔平板从4℃温育器中取回(68、142)
37.收获所选的孔并传代至新的96孔基质板中，将克隆整合到尽可能少的平板中，并将每个克隆铺在传代培养基中(68、138)
38.每日更换部分培养基(122)
可用于执行这些自动化步骤的系统组件可选自在检疫生长工作流中使用的相同组件，外加一个或多个CORE 96 PROBEHEAD II1000μl型号探头。
系统6、7和8：维持、QC、扩充和冷冻
维持模块
39.将连续传代的克隆以1:1置于新的96孔基质包被的平板中直至集落密度足够高(68-72、160)
40.利用96-尖头每日给所有平板更换～75％的培养基(160)
41.在Cyntellect Celigo Cytometer上定期监测集落密度和生长速率(166)
42.复制平板以产生用于克隆的QC的平板(74-86、160)
43.目标是将克隆扩充到多个平板上用于数个QC测定以淘汰效果不佳的克隆直至每个原始样本具有两至三个高质量克隆
44.当不佳的克隆被淘汰时还对通过QC步骤的克隆进行择优挑选和重排列，以将克隆整合到尽可能少的平板中(80、86、160)
45.在这整个过程中每日供给养料(160)
QC模块
46.收获细胞(74、150)
47.对细胞进行计数(164)
48.按每行2-6个重复物将限定数目的细胞铺在V形底平板中(5000-10000个细胞/孔)(84、150)
49.放回到温育器中–(1g聚类)(172)
50.两天后更换培养基(150)
51.再在温育器中温育12天(172)
52.每两天更换部分培养基(150)
53.转移至核酸准备站中以除去孔中的培养基，把类胚体留在孔中(84、192)
54.重悬在RNA裂解缓冲液中，合并并混合每种样本的重复物，并且使平板可供在Nanostring nCounter测定中的分析之用(84、192)
冷冻模块
55.在扩充传代后以96孔平板开始(88)
56.在温育器中温育6天(172)
57.每天更换部分培养基(154)
58.将平板从培养基中移出(88、162)
59.除去培养基(需要彻底)(154)
60.加入变凉的预先冷冻的培养基(在生长培养基中稀释的基质胶)(154)
61.在温育器中温育1h(172)
62.除去培养基(需要彻底)(154)
63.加入冷的冷冻培养基—低体积(154)
64.密封平板(88、164
65.脱机将样本置于-80℃储藏器中至冷冻(190)
66.储藏在蒸气相液氮中
冷冻管储藏
67.在扩充传代后以96孔平板开始(90)
68.温育6天(172)
69.每日更换部分培养基(154)
70.将各个孔以1:1传代至24孔板中(92、154)
71.温育6天(172)
72.每日更换部分培养基(154)
73.将各个孔以1:1传代至6孔板中(94、154)
74.温育4-6天(172)
75.每日更换部分培养基(154)
76.将平板从温育器中移出(162)
77.用预先冷冻的培养基替换部分培养基(154)
78.在温育器中温育1h(172)
79.针对正常传代，收获细胞用于冷冻(154)
80.移入基质管，每孔两至三个管(96、154)
81.旋转并除去培养基(168、154)
82.加入冷的冷冻培养基(154)
83.给管子封盖(170)
84.脱机将样品置于-80℃储藏器中(190)
可用于执行这些自动化步骤的系统组件可选自在检疫生长工作流中使用的相同组件。
如本文所使用的“成年”意指胎儿后，即，从新生儿阶段到生命结束这段时期的有机体，并且包括，例如，从递送的胎盘组织、羊水和/或脐带血获得的细胞。
如本文所使用的术语“成年分化细胞”包括从成年生物体获得的适合于使用本发明描述的自动化系统产生iPSC的广泛范围的分化细胞类型。优选地，成年分化细胞是“成纤维细胞”。成纤维细胞(它们的不太活跃的形式也称为“纤维细胞”)来源于间充质。它们的功能包括分泌细胞外基质组分的前体，包括，例如，胶原蛋白。组织学上，成纤维细胞是高度支化的细胞，但是纤维细胞一般都比较小并且经常被描述为纺锤状。来源于任何组织的成纤维细胞和纤维细胞都可以用作本发明上的自动化工作流系统的起始物料。
如本文所使用的术语“诱导多能干细胞”或iPSC意指该干细胞由分化的成年细胞产生，该分化的成年细胞已被诱导或变化，即，重编程成能够分化成所有三个生殖层或真皮层：中胚层、内胚层和外胚层的细胞。产生的iPSC并不是指在自然界被发现的那些细胞。
可用于本发明的哺乳动物体细胞包括，举例来说，成年干细胞、支持细胞、内皮细胞、粒层上皮细胞、神经元、胰岛细胞、表皮细胞、上皮细胞、肝细胞、毛囊细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、单个核细胞、成纤维细胞、心肌细胞、其他已知的肌细胞，及一般来说任何活体细胞。在具体实施方案中，使用成纤维细胞。如本文所使用的术语体细胞也旨在包括成年干细胞。成年干细胞是能够产生特定组织的所有细胞类型的细胞。示例性成年干细胞包括造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞。
本发明的一个优点是提供了对适合于移植、适合于用在药物发现测定中，或适合于疾病建模的等基因或同基因人细胞的基本上无限制的供应。iPSC专门针对患者进行定制，从而避免了免疫排斥。因此，这将消除与现行移植方法相关的显著问题，诸如，对所移植组织的排斥，其可能是由于宿主抗移植物或移植物抗宿主排斥而发生。当用于药物发现时，该细胞展示出每位患者对在药物发现中使用的化学物的反应，或他们的疾病在疾病模型中的个体表现。可将数种类型的iPSC或由从来源于人的体细胞获得的iPSC制备的完全分化的体细胞作为细胞文库储藏在iPSC库中，并且可使用文库中的一种类型或多种类型的iPSC制备不被待经受干细胞疗法的患者排斥的体细胞、组织或器官。
本发明的iPSC可用本领域中已知的方法分化成许多不同的细胞类型从而治疗多种病症。例如，iPSC可被诱导分化成造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿道细胞、神经元细胞等。然后可将分化细胞移植回患者的身体中以预防或治疗病状，或者可使用分化细胞推进医学研究或开发药物发现测定。因而，本发明方法可用作针对患有以下疾病的受试者的治疗或者用于开发针对患有以下疾病的受试者的治疗：心肌梗死、充血性心脏衰竭、中风、缺血、外周血管疾病、酒精性肝病、肝硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、糖尿病、癌症、关节炎、伤口愈合、免疫缺陷、再生障碍性贫血、贫血症、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、溶酶体贮积病、多发性硬化、脊髓损伤、遗传性病症，以及期望增加或更换特定细胞类型/组织或细胞去分化的类似疾病。
术语“全能性”是指具有产生成体以及包括胎盘在内的胚外组织中的所有细胞的发育潜能的细胞。受精卵(合子)是全能的，桑椹胚(直到受精后的16细胞期)的细胞(卵裂球)也是如此。
如本文所使用的术语“多能”是指具有在不同条件下分化成所有三个生殖细胞层，即，内胚层(例如，肠组织)、中胚层(包括血液、肌肉和血管)和外胚层(诸如皮肤和神经)特有的细胞类型的发育潜能的细胞。多能细胞的发育潜能比全能细胞低。细胞分化成所有三个生殖层的能力可使用例如裸鼠体内畸胎瘤形成测定来测定。在一些实施方案中，多能也可以由胚胎干(ES)细胞标记的表达来证明，尽管使用本文所描述的组合物和方法产生的细胞或细胞群体的多能性的优选测试是证明细胞具有分化成三个生殖层中每一个生殖层的细胞的发育潜能。在一些实施方案中，多能细胞称作“未分化细胞”。因此，如本文所使用的术语“多能性”或“多能状态”是指为细胞提供分化成所有三个胚胎生殖层(内胚层、中胚层和外胚层)的能力的细胞发育潜能。本领域技术人员会知晓产生给定细胞类型的胚胎生殖层或谱系。处于多能状态的细胞通常具有在体外长期分裂的潜能，例如大于一年或超过30次传代。
当针对“专能细胞”使用时术语“专能”是指具有分化成一个或多个生殖层而不是所有三个生殖层的细胞的发育潜能的细胞。因而，专能细胞也可以称为“部分分化的细胞”。专能细胞是本领域中熟知的，专能细胞的实例包括成年干细胞，例如，造血干细胞和神经干细胞。“专能”说明细胞可形成给定谱系中的许多类型的细胞，但不能形成其他谱系的细胞。例如，专能造血干细胞可形成许多不同类型的血细胞(红血细胞、白血细胞、血小板等)，但是它不能形成神经元。因此，术语“专能性”是指发育潜能的程度低于全能和多能的细胞状态。
如本文所使用的术语“干细胞”或“未分化细胞”是指具有自我更新的特性并且具有分化成多个细胞类型的发育潜能的处于未分化或部分分化状态的细胞，没有具体暗示的有关发育潜能(即，全能、多囊、专能等)的含义。干细胞能够增殖并产生更多这样的干细胞，同时维持它的发育潜能。从理论上来说，自我更新可通过两种主要机制中任一种发生。干细胞可以不对称地分裂，这称为强制性的不对称分化，其中一个子代细胞保留了亲代干细胞的发育潜能，而另一个子代细胞表达一些与母细胞截然不同的其他特定功能、表型和/或发育潜能。子代细胞自身可经诱导而增殖并产生随后分化成一种或多种成熟细胞类型的后代，同时还使一个或多个细胞保留了亲代发育潜能。分化细胞可来源于专能细胞，该专能细胞自身来源于专能细胞，等等。虽然这些专能细胞中的每一种均可以视为干细胞，但是每种这样的干细胞可产生的细胞类型范围，即，它们的发育潜能，可能有相当大的差异。替代地，群体中的一些干细胞可对称地分裂成两个干细胞，称作随机分化，从而维持群体中的一些干细胞作为一个整体，而该群体中的其他细胞仅产生分化的后代。因此，术语“干细胞”是指具有在特定环境下分化成更特化或分化的表型的发育潜能并且保留了在某些环境下在基本上不分化的前提下增殖的能力的细胞的任何子集。在一些实施方案中，术语干细胞一般是指天然存在的亲代细胞，其子系体(后代细胞)通过分化，例如，通过获取完全个体化的特征经常在不同方向上特化，如在胚胎细胞和组织的渐进多元化中发生的。一些分化细胞还具有产生具有更高发育潜能的细胞的能力。此种能力可以是天然的或者可以是在用各种因子处理后人工诱导的。作为干细胞开始的细胞可能会继续朝向分化表型发展，但是然后可经诱导而“逆转”和重表达干细胞表型，这一术语经常被本领域技术人员称为“去分化”或“重编程”或“逆分化”。
如本文所使用的术语“胚胎干细胞”是指胚胎胚泡的内细胞团的天然存在的多能干细胞(参见，例如，美国专利第5,843,780号、第6,200,806号、第7,029,913号、第7,584,479号，其以引用的方式并入本文)。此类细胞可类似地从来源于体细胞核转移的胚泡的内细胞团获得(参见，例如，美国专利第5,945,577号、第5,994,619号、第6,235,970，其以引用的方式并入本文)。胚胎干细胞是多能的，并且在发育期间产生三个原始生殖层：外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生物。换言之，当针对特定细胞类型给予充分必要的刺激时，它们可以发育成成体的200种以上细胞类型中的每一种。它们对胚外膜或胎盘没有贡献，即，它们不是全能的。
如本文所使用的，胚胎干细胞的区别性特征定义了“胚胎干细胞表型”。因此，如果细胞具有胚胎干细胞的一个或多个独特特征，使得该细胞可与不具有胚胎干细胞表型的其他细胞相区别，则该细胞具有胚胎干细胞的表型。示例的区别性胚胎干细胞表型特征包括而不限于，包括蛋白和微RNA的特异性细胞表面或细胞内标记的表达、基因表达谱、甲基化谱、脱乙酰化谱、增殖能力、分化能力、染色体组型分、对特定培养条件的反应等。在一些实施方案中，对细胞是否具有“胚胎干细胞表型”的判定是通过将该细胞的一个或多个特征与在同一实验室内培养的胚胎干细胞系的一个或多个特征相比较来进行。
术语“体干细胞”在本文用于指来源于包括胎儿、幼年和成年组织在内的非胚胎组织的任何多能或专能干细胞。天然体干细胞已从包括血液、骨髓、脑、嗅上皮、皮肤、胰腺、骨骼肌和心肌在内的多种多样的成年组织中分离出来。这些体干细胞中的每一种均可以基于基因表达、因子反应性及在培养物中的形态来表征。示例性天然存在的体干细胞包括但不限于，神经干细胞、神经嵴干细胞、间充质干细胞、造血干细胞和胰腺干细胞。在本文所描述的一些方面，“体多能细胞”是指这样的体细胞或体细胞的后代细胞，其发育潜能已被改变为，即，增大至，多能状态的发育潜能，这通过使用本文所描述的组合物和方法使该体细胞或体细胞的后代细胞与一种或多种重编程因子接触或引入一种或多种重编程因子来进行。
术语“祖细胞”在本文用于指具有较高发育潜能的细胞，即，相对于其通过分化产生的细胞而言更加原始(即，处在发育途径或进展上的较前面的步骤)的细胞表型。祖细胞常具有显著或非常高的增殖潜能。祖细胞可产生多个截然不同的具有较低发育潜能的细胞，即，分化细胞类型，或者产生单一的分化细胞类型，这取决于发育途径以及细胞在其中发育和分化的环境。
如本文所使用的术语“体细胞”是指除了生殖细胞、存在于移植前胚胎中或从移植前胚胎获得的细胞，或由此种细胞在体外增殖形成的细胞以外的任何细胞。换句话说，与生殖系细胞相反，体细胞是指形成生物体的身体的任何细胞。在哺乳动物中，生殖系细胞(也称为“胚子”)是精子和卵子，它们在受精期间融合从而产生称作合子的细胞，整个哺乳动物胚胎将由合子发育而成。哺乳动物身体中所有其他细胞类型——除了精子和卵子、由它们形成的细胞(配子体)及未分化的多能胚胎干细胞以外——都是体细胞：内脏器官、皮肤、骨骼、血液和结缔组织都由体细胞构成。在一些实施方案中，体细胞是“非胚胎体细胞”，意指不存在于胚胎中或不是由胚胎获得并且不是由此种细胞在体外增殖形成的体细胞。在一些实施方案中，体细胞是“成年体细胞”，意指存在于除胚胎或胎儿以外的生物体中或由此种生物体获得的细胞，或由此种细胞在体外增殖形成的细胞。除非另外指出，否则本文所描述的用于重编程体细胞的组合物和方法既可以在体内执行，也可以在体外执行(当体细胞存在于受试者体内时在体内实施，而体外实施则使用维持在培养物中的分离的体细胞进行)。
术语“分化细胞”包括其原生形式并非多能(该术语如本文所定义)的任何体细胞。因而，术语“分化细胞”也包括使用本文所描述的任何组合物和方法产生的部分分化的细胞，诸如专能细胞，或稳定的非多能部分重编程或部分分化的细胞。在一些实施方案中，分化细胞是稳定的中间细胞，诸如非多能的部分重编程细胞。应注意，将许多原始细胞置于培养物中可导致完全分化特征受到一些损失。因而，简单地培养此类分化或体细胞不会使得这些细胞变成非分化细胞(例如，未分化细胞)或多能细胞。分化细胞(包括稳定的非多能部分重编程细胞中间体)向多能性的转变需要超过导致在置于培养物中后分化特征部分丧失的刺激的重编程刺激。重编程细胞，以及在一些实施方案中，部分重编程细胞，也具有能够经受长时间传代而不丧失生长潜能的特征，而具有较低发育潜能的亲代细胞与之相比，一般只具有在培养物中经受有限次分裂的能力。在一些实施方案中，术语“分化细胞”还指由特化程度较低的细胞类型(即，发育潜能增加)(例如，非分化细胞或重编程细胞)的细胞衍生出的特化程度较高的细胞类型(即，发育潜能降低)的细胞，其中细胞已经受细胞分化过程。
如本文所使用的术语“重编程”是指使细胞或细胞群体(例如，体细胞)的发育潜能逆转的过程。换句话说，重编程是指驱使细胞到达具有较高发育潜能的状态，即，驱使细胞退回到分化程度较低的状态的过程。待重编程细胞在重编程之前可以是部分分化或终末分化的。在本文所描述的方面的一些实施方案中，重编程包括使分化状态完全或部分逆转，即，使细胞的发育潜能增大至具有多能状态的细胞的发育潜能。在一些实施方案中，重编程包括驱使体细胞达到多能状态，使得该细胞具有胚胎干细胞的发育潜能，即，胚胎干细胞表型。在一些实施方案中，重编程也包括使诸如体细胞或单能细胞的细胞的分化状态部分逆转或发育潜能部分增大至专能状态。重编程还包括使细胞的分化状态部分逆转成这样的状态，其使得该细胞在经受另外的操纵诸如本文所描述的那些时更容易完全重编程成多能状态。此类操纵可导致细胞或细胞后代对其表达有助于重编程或维持重编程的特定基因的内源表达。在某些实施方案中，使用本文所描述的合成的经修饰RNA及其方法进行的细胞重编程导致细胞呈现专能状态(例如，成为专能细胞)。在一些实施方案中，使用本文所描述的合成的经修饰RNA及其方法进行的细胞(例如，体细胞)重编程导致细胞呈现多能样状态或胚胎干细胞表型。由此产生的细胞在本文称为“重编程细胞”、“体多能细胞”和“RNA-诱导的体多能细胞”。如本文所指出的术语“部分重编程的体细胞”是指这样的细胞，其已用如本文所公开的方法由具有较低发育潜能的细胞重编程，使得部分重编程的细胞尚未完全重编程成多能状态而是重编程成非多能的稳定中间状态。此种部分重编程细胞可以具有低于多能细胞，但是高于专能细胞(这些术语如本文所定义)的发育潜能。部分重编程的细胞可以例如分化成三个生殖层中的一个或两个，但是不能分化成所有三个生殖层。
如本文所使用的术语“重编程因子”是指发育潜能改变因子(该术语如本文所定义)，诸如基因、蛋白、RNA、DNA或小分子，其表达有助于细胞例如体细胞重编程成分化程度较低或未分化的状态，例如重编程成多能状态或部分多能状态的细胞。重编程因子可为，例如，可将细胞重编程成多能状态的转录因子，诸如SOX2、OCT3/4、KLF4、NANOG、LIN-28、c-MYC等，包括可在体外重编程细胞的方法中替代这些中的一种或多种的任何基因、蛋白、RNA或小分子。在一些实施方案中，使用本文所描述的合成的经修饰RNA及其方法对重编程因子的外源表达诱导一种或多种重编程因子的内源表达，使得处于重编程或部分重编程状态的细胞的稳定维持不再需要一种或多种重编程因子的外源表达。“在体外重编程成多能状态”在本文用于指不需要和/或不包括例如利用卵母细胞、胚胎、生殖细胞或多能细胞的核转移或细胞质转移或细胞融合的体外重编程方法。重编程因子也可以称为“去分化因子”，其是指诱导细胞去分化成分化程度较低的表型的发育潜能改变因子(该术语如同本文所定义)，诸如蛋白或RNA，就是说去分化因子增大细胞的发育潜能。
如本文所使用的术语“分化因子”是指诱导细胞分化成期望细胞类型的发育潜能改变因子(该术语如同本文所定义)，诸如蛋白、RNA或小分子，即，分化因子降低细胞的发育潜能。在一些实施方案中，分子因子可为细胞类型特异性多肽，然而这不是必需的。分化成特定细胞类型可能需要多于一种分化因子的同时和/或连续表达。在本文所描述的一些方面，首先使用如本文所描述的合成的经修饰RNA经由重编程或部分重编程来增大细胞或细胞群体的发育潜能，然后通过与一种或多种编码分化因子的合成的经修饰RNA接触或引入一种或多种编码分化因子的合成的经修饰RNA来诱导由此种重编程产生的细胞或其细胞后代经受分化，使得细胞或其细胞后代具有降低的发育潜能。
在细胞个体发育学的背景下，术语“分化(differentiate)”或“分化(differentiating)”是相对的术语，是指细胞与其直接前体细胞相比沿着发育途径向下进一步发育的发育过程。因而，在一些实施方案中，重编程细胞(该术语如同本文所定义)可分化成谱系限制性前体细胞(诸如中胚层干细胞)，该前体细胞进而可沿着该途径向下进一步分化成其他类型的前体细胞(诸如组织特异性前体，例如，心肌前体)，然后分化成终末期分化细胞，其在某些组织类型中发挥特征性作用并且可能保留或不保留进一步增殖的能力。
如本文所使用的术语“在不形成多能中间细胞的情况下”是指一种细胞类型优选在一个步骤中转分化成另一种细胞类型；因而在不形成多能中间细胞的情况下修改细胞的分化表型或发育潜能的方法并不要求细胞首先分化(或重编程)，然后去分化成另一种细胞类型。而是，细胞类型仅仅从一种细胞类型“转换”成另一种细胞类型，而没有经历分化程度较低的表型。因此，转分化是指细胞的发育潜能的变化，细胞借此被诱导成变成具有相似发育潜能的不同细胞，例如，干细胞变成胰腺细胞、胰腺α细胞变成胰腺β细胞，等等。本发明的系统和方法非常适合于细胞的转分化。
术语“表达”是指参与产生RNA和蛋白并且在适当的时候参与分泌蛋白的细胞过程，其在适用的情况下包括但不限于，例如，转录、翻译、折叠、修饰和加工。“表达产物”包括由基因转录的RNA和通过翻译由基因转录的mRNA而获得的多肽。在一些实施方案中，表达产物是由不编码多肽的序列诸如微RNA转录的。
如本文所使用的术语“转录因子”是指这样的蛋白质，其使用DNA结合结构域与DNA的特定部分结合并且是控制从DNA到RNA的遗传信息的转录的系统的一部分。
如本文所使用的术语“小分子”是指化学剂，其可包括但不限于，肽、肽模拟物、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、适体、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000克/摩尔的有机或无机化合物(例如，包括杂有机化合物和有机金属化合物)、分子量小于约5,000克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约1,000克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约500克/摩尔的有机或无机化合物，以及此类化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。
如本文所使用的术语“外源的”是指已通过涉及人工的过程引入到其在正常情况下不存在或者其以较低量存在的生物系统诸如细胞或生物体中的核酸(例如，编码转录因子的合成的经修饰RNA)，或蛋白质(例如，转录因子)。如果某因子(例如，编码转录因子的合成的经修饰RNA，或蛋白质，例如多肽)被引入到遗传得到该物质的直接前体细胞或后代细胞中，则该因子被视为外源的。与此相反，术语“内源”是指生物系统或细胞的原生因子或表达产物(例如，诸如SOX2的基因的内源表达是指细胞中的内源基因产生SOX2多肽)。在一些实施方案中，使用包含本文所描述的合成的经修饰RNA的组合物和方法将一种或多种外源因子例如发育潜能改变因子引入到细胞中，以此诱导维持细胞或其一个(多个)后代细胞处于新发育潜能所需要的因子或基因产物在细胞或其一个(多个)后代细胞中的内源表达。
如本文所使用的术语“分离的细胞”是指已从它最初在其中被发现的生物体中移出的细胞，或此种细胞的子系体。任选地，该细胞已在体外，例如，在其他细胞的存在下进行培养。任选地，该细胞后来被引入到第二生物体中或者重新引入到它(或者由它传下来的细胞或细胞群体)分离自其中的生物体中。
如本文所使用的有关分离的细胞群体的术语“分离的群体”是指已从混合或异质的细胞群体中移出或分离出来的细胞群体。在一些实施方案中，分离的群体是与细胞分离或富集自其中的异质群体相比较“基本上纯的”细胞群体。在一些实施方案中，分离的群体是分离的多能细胞群体，其包含与多能细胞来源于其中的异质体细胞群体相比较基本上纯的多能细胞群体。
如本文所使用的术语“合成的经修饰RNA”或“经修饰RNA”是指在体外产生的RNA分子，其包含至少一个经修饰核苷(该术语如本文下文所定义)。本发明方法不需要经修饰RNA。合成的经修饰RNA组合物不包括从具有这些修饰的天然来源诸如细胞、组织、器官等中分离出来的mRNA，而是只包括使用体外技术合成的合成的经修饰RNA。如应用于术语“合成的经修饰RNA”或“经修饰RNA”上的术语“组合物”包括多种不同的合成的经修饰RNA分子(例如，至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少75种、至少90种、至少100种或更多种合成的经修饰RNA分子)。在一些实施方案中，合成的经修饰RNA组合物可进一步包含其他试剂(例如，干扰素表达或活性的抑制剂、转染试剂等)。此种多种可包括不同序列(例如，编码不同多肽的不同序列)的合成的经修饰RNA、具有不同修饰的相同序列的合成的经修饰RNA，或它们的任何组合。
如本文所使用的术语“多肽”是指氨基酸聚合物，其包含至少2个氨基酸(例如，至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少2000个、至少3000个、至少4000个、至少5000个、至少6000个、至少7000个、至少8000个、至少9000个、至少10,000个或更多个氨基酸)。术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换地使用。如本文所使用的术语“肽”是指长度通常介于约2个与60个氨基酸之间的相对短的多肽。
微阵列，特别是“细胞阵列”是当前针对生物功能对大生物分子文库诸如RNA、DNA、蛋白质和小分子的筛选以及细胞和基因功能的基本调查所需要的。学术界和工业界的许多研究设施都需要先进的高密度阵列来提高它们的筛选效率、速度和质量。分别随着下一代微阵列和细胞阵列的发展，许多筛选将首次变得可能或变得明显更能负担得起。本发明阵列通常应该安装到惯用的微量滴定刻度板上以确保传统微孔板处理机器人和显微镜的可使用性。理想地，阵列可为需要作为一个整体在其中唯一变量是细胞系的基因型的相同条件下测定的任何细胞系集合。实例可以是彼此相邻地铺在微量滴定板的孔中的正常和疾病特异性iPSC系或它们的分化衍生物的集合。这将允许研究者使用合适的测定同时探测单一因子(例如小分子)在多个基因型上的活性，从而发现该因子的基因型特异性影响。
在一个实施方案中，本发明系统也可用于从在鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层以及饲养层修复物下培养的已建立的iPSC细胞系中的已经历分化的细胞中获得富含完全重编程细胞的细胞群体。本发明系统进一步使得能够将完全重编程的或分化的iPSC细胞实时分选至96孔平板内用于高通量筛选活动。
图1示出由系统1执行的步骤，包括活检组织铺板(2)、生长晕和传代(4)(在液体处理机器人上滚动进行)、QC(6)(针对支原体的自动化测试)，及(8)在液体处理机器人上自动化冷冻。
图2示出由系统2、3和4执行的步骤。自动化系统将成纤维细胞铺板(10)、自动化系统引入重编程因子(12)、通过自动化分选和分离来分离iPSC(14)、自动化系统挑选出并扩充期望的克隆(16)、通过标记测定和类胚体测定进行多能状态的自动化质量检查(QC)(18)，接着是期望细胞的自动化冷冻和储藏(20)。
图3是示出系统1中所涉及到的步骤(22)至(60)的流程图。
图3示出用于从活检组织产生成纤维细胞的工作流和决定树的实例。工作流划分成检疫阶段(58)和清洁阶段(60)。随着活检组织进入设施，技术人员将活检组织铺入6孔平板中(22)并且将平板送入自动化温育器中(24)。在给予活检组织时间以让其贴附于平板后，液体处理机器人将平板从自动化温育器中取回以提供养料并在自动化显微镜上检查生长晕的融合(26)。将平板放回到温育器中并让其向外生长(outgrow)(28)。液体处理机将平板从温育器中移出并将培养基更换为不含抗生素和抗霉菌剂的培养基(30)。机器人再将平板移入温育器中保持5天(32)。机器人然后移出平板并取回培养基置于子平板中用于支原体测试(34)。将子平板移入检疫测定系统中用于支原体测试(36)。然后基于来自测定的阳性信号进行挑选(38)。如果6孔平板的所有孔都因阳性支原体测定结果而未能通过(40)，则将它们丢弃。如果6孔板的所有孔都是阴性并且不含支原体，则将它们从检疫系统转移到清洁生长系统中(46)。如果一些孔是阳性，而一些孔是阴性，则将阴性孔维持在检疫系统中(42)。将阴性孔传代(44)至新平板中，转移至温育器中，并丢弃含有阳性孔的源平板。这些培养物接下来通过多个步骤进入针对支原体的再测试(24、26、28、30、32、34、36、38)。监测清洁培养物的生长(50)，将其传代(52)并冷冻在冷冻管中(54、56)。
图4A、4B1、4B2和4C示出在自动化重编程过程期间通过多孔组织培养平板的患者样本流的实例。在每个图的顶部，流程图描述了在工作流的每个步骤执行的程序流(70、88、98)。在每个图的底部，利用板图示出多孔细胞培养平板，例如用样本标签标记的由阴影的孔或成组的孔表示的样本(61-68、72-86、88-96)。样本通过该程序从平板到平板或从孔到孔的转移从左到右示出，如由箭头所指示的。如图4A中所示，当患者样本和对照成纤维细胞样本(61)被铺在6孔平板(62)的各个孔中时，自动化iPSC提取过程开始。这些以限定的细胞数量传代到24孔平板(64)的各个孔中，以便使用病毒编码重编程因子或将重编程因子引入到细胞中的其他方式进行感染。在下一个步骤中，通过细胞分选，或者，优选地使用基于磁珠的富集来去除重编程样本中的非重编程细胞，并以克隆密度铺在96孔平板(66)的多个孔中。两块此类平板在这个实例中示出。在这个实例中，如由中间带有圆点的孔指示的6个孔(66)被鉴定出含有如通过在自动化成像仪上的免疫荧光分析测定的对多能表面标记呈阳性的单一克隆。将这些克隆传代，并进行择优挑选以将该克隆重新安排到最小数量的96孔平板(68)中。该示例图形示出每个单独起始样本的6个克隆，并且指示16个起始样本的克隆可被排列到96孔平板上。为了便于平板处理，这个择优挑选步骤可对多次传代进行以将克隆整合到最小数量的平板中。如图4B1和4B2中所示，将这些克隆连续传代直至对于每个起始样本而言孔内的干细胞集落都达到融合(72)。然后将每块平板的样本复制到重复的平板(74-86)上，以允许对展示出合适的干细胞特征的克隆进行质量控制(6)和选择。为了开始QC过程，系统产生一块平板用于测定各个克隆的多能状态所需要的多能性质量控制测定(74)，并且产生一块平板用于在后续传代中继续运行(76)。将继续运行的平板再次传代到三块平板(78、80、82)中用于进一步的质量控制和扩充。收获一块平板用于QC测定以表征染色体组型和遗传多样性(78)。将第二块平板(82)传代到v形底平板中以形成类胚体(84)用于评估iPS克隆的分化能力的QC测定。最后一块平板(80)继续运行用于进一步扩充。未通过先前多能QC测定的质量控制的各个克隆没有继续运行，如用图4中指示的孔中的“X”示出的。在图4B2中示出的实例中，整合的平板(86)将在单一96孔平板上含有来自多达32个个体的每个个体用3个iPS克隆表示的iPS系(或分化系)，或者如果每个个体均用单一克隆表示，则含有来自多达96个个体的iPS系(或分化系)。将剩余克隆整合到尽可能少的平板中直至剩余一至三个克隆(86-92)。如图4C中示出的，这些克隆经扩充用于在贴附于平板上时冷冻保存(88)，或者经进一步扩充(92-94)并冷冻保存在冷冻瓶(96)中。来自图4A中示出的多能标记筛选(70)及图4B1中示出的质量控制测定的任何或所有信息都可单独地或者组合地用来判定选择哪些克隆用于在自动化过程中整合和排列。
用于转染和转化或重编程成年细胞以形成iPSC系的方法是普遍已知的，例如，Takahashi等人，2007 Cell,131:861-872,2007；Yu等人，2007,Science,vol.318,pp.1917-1920。利用重编程因子从体细胞诱导iPSC。考虑了重编程因子包括，例如，转录因子。用于重编程成年细胞的方法包括，例如，引入和表达特定转录因子的组合，例如Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的组合。其他已证明其他转录因子可用于转化或重编程成年细胞。这些其他转录因子包括，例如，Lin28、Nanog、hTert和SV40大T抗原，如例如Takahashi等人，2006 Cell,126:663-676和Huiqun Yin等人，2009,Front.Agric.China 3(2):199–208中所描述的，该文献以引用的方式并入本文。
在另一方面，iPSC可通过将RNA直接引入到细胞中来产生，该RNA在被翻译时将提供一种或多种期望的蛋白质。高等真核细胞已进化形成针对外来的“非自身”RNA的细胞防御，其最终导致细胞蛋白质合成的总体抑制，从而导致细胞毒性。这种反应部分地涉及I型或II型干扰素的生成，并且一般称为“干扰素反应”或“细胞先天免疫反应”。细胞防御通常将合成的RNA识别为外来的，并且诱导这种细胞先天免疫反应。在使用RNA获得外源导向的蛋白质的持续或重复表达的能力受到这种先天免疫反应的诱导妨碍的某些方面，期望使用以避免或降低该反应的方式修饰的合成的RNA。先天免疫反应的避免或降低允许例如修改细胞的发育表型所需要的外源引入的RNA的持续表达。在一方面，持续表达通过重复引入合成的经修饰RNA到靶细胞或其后代中来实现。本发明方法包括天然或合成的RNA。
在一方面，可将天然、经修饰或合成的RNA引入到细胞中以便诱导感兴趣蛋白质在细胞中的外源表达。使用本文所描述的经修饰的合成的RNA引导感兴趣蛋白质的外源表达的能力可用于，例如，治疗由细胞或生物体中的削弱或阻止该细胞或生物体产生感兴趣蛋白质的能力的内源性基因缺陷引起的病症。因此，在一些实施方案中，包含本文所描述的RNA的组合物和方法可用于基因治疗的目的。
所描述的RNA可以有利地用于改变细胞命运和/或发育潜能。从外源RNA表达蛋白质的能力允许改变或逆转细胞的发育潜能，即，重编程细胞，并且允许细胞定向分化成分化程度更高的表型。在改变细胞的发育潜能中的关键方面是要求一种或多种发育潜能改变因子在细胞或其直系后代中的持续和长时间表达。传统上，此种持续表达已通过引入DNA或病毒载体到细胞中来实现。由于可能会引起插入诱变，这些途径的治疗效用有限。
可以从如本文所描述的外源RNA在持续的一段时间内表达一种或多种期望蛋白质的能力中获得最大益处的领域之一是从初始具有分化程度更高的表型的细胞产生多能或专能细胞的领域。在这个方面，使用编码一种或多种重编程因子的RNA将细胞重编程成分化程度较低的表型，即，具有较高的发育潜能。
干细胞技术的主要目标是使干细胞分化成期望的细胞类型，即，定向分化或者经由转分化产生细胞。本文所描述的组合物和方法不仅可用于重编程细胞，而且它们还适用于这种细胞到期望表型的定向分化和转分化。就是说，本文所描述的用于重编程的相同技术直接适用于使重编程细胞，或任何其他干细胞或前体细胞(就此而言)分化成期望的细胞类型。
在本文描述的这个方面和所有此类方面的一些实施方案中，合成的经修饰RNA分子包含至少两个经修饰的核苷。在一个此种实施方案中，该两个经修饰的核苷选自由以下组成的组：5-甲基胞苷(5mC)、N6-甲基腺苷(m6A)、3,2'-O-二甲基尿苷(m4U)、2-硫代尿苷(s2U)、2'-氟尿苷、假尿苷、2'-O-甲基尿苷(Um)、2'-脱氧尿苷(2'dU)、4-硫代尿苷(s4U)、5-甲基尿苷(m5U)、2'-O-甲基腺苷(m6A)、N6,2'-O-二甲基腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基腺苷(m62Am)、2'-O-甲基胞苷(Cm)、7-甲基鸟苷(m7G)、2'-O-甲基鸟苷(Gm)、N2,7-二甲基鸟苷(m2,7G)、N2,N2,7-三甲基鸟苷(m2,2,7G)和肌苷(I)。在本文所描述的这个方面和所有此类方面的一个此种实施方案中，该至少两个经修饰的核苷为5-甲基胞苷(5mC)和假尿苷(参见，例如，Rossi US 2012/0046346，其以引用的方式并入)。
在本发明方法中使用的基因、蛋白质或RNA包括但不限于OCT4、SOX1、SOX 2、SOX 3、SOX15、SOX 18、NANOG、KLF1、KLF 2、KLF 4、KLF 5、NR5A2、c-MYC、1-MYC、n-MYC、REM2、TERT和LIN28。
还已证明，可在添加某些小分子途径抑制剂的情况下采用单一转录因子将成年成纤维细胞重编程成iPSC。此类途径抑制剂包括，例如，转化生长因子-β(TGFb)途径抑制剂、SB431542(4-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺)和A-83-01[3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代酰胺]，细胞外信号调节激酶(ERK)和微管相关蛋白激酶(MAPK/ERK)途径抑制剂PD0325901(N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘代苯基)氨基]-苯甲酰胺)，通过稳定化β-连环蛋白来激活Wnt信号传导的GSK3抑制剂CHIR99021[6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)烟腈]，赖氨酸特异性脱甲基酶1 Parnate(a/k/a反苯环丙胺)，小分子激活剂3’-磷酸肌醇依赖性激酶-1(PDK1)PS48[(2Z)-5-(4-氯代苯基)-3-苯基-2-戊烯酸]、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂丁酸钠和丙戊酸，以及调节线粒体氧化(例如2,4-二硝基苯酚)、糖酵解代谢(果糖2,6-二磷酸盐和草酸盐)、HIF途径激活(N-草酰甘氨酸和槲皮素)的小分子，Zhu等人，2010,Cell Stem Cell 7:651-655，其以引用的方式完整地并入本文。Zhu等人证明Oct4与Parnate和CHIR99021的组合足以重编程成人表皮角质形成细胞。
虽然各种方案不同，但是一般的重编程方案都由以下组成：扩充来自组织样本，例如皮肤活检组织的分化成年细胞，以及使它们与如上面所讨论的重编程因子接触，例如感染它们，即，用例如表达载体，诸如含有多能转录因子的转录本的病毒构建体进行转染。成纤维细胞通过本领域已知的方法，例如，通过如下方式获得：机械地破坏组织，接着进行酶法解离以释放出成纤维细胞，并通过本领域已知的方法培养成纤维细胞，例如如Dimos等人，2008,Science Vol.321(5893):1218-1221所描述的。
虽然本发明的例证性方面使用载体，例如，病毒载体、质粒载体，但是在一些方面，包括将mRNA转移到细胞中的转染技术在内的转染技术不需要载体。
根据与期望载体一起提供的说明书用表达载体转染成纤维细胞。在转染后一段时间(例如约2天至约10天)后，使细胞解离并使其与针对CD13NEG、SSEA4POS和Tra-1-60POS表面标记产生的荧光标识的抗体接触。然后将解离的抗体标记的细胞重悬在磷酸盐缓冲生理盐水溶液中，并移入iPSC克隆的自动化分选和分离系统中。根据标识物颜色或它们的不存在将表面标记阳性细胞直接分选到含有组织培养基的无菌管或用MEF或无细胞生物基质包被的多孔(6-96孔)组织培养平板中，并培养至有可见集落形成。
然后，通过由此产生的集落的光学显微镜检查或者任选地通过用荧光标识的抗体标记的克隆的显微荧光检查来进一步确认集落为iPSC。任选地，在某些实施方案中，一种或多种载体还插入绿色荧光蛋白(GFP)表达标记以便于分选和鉴定。将具有与多能ES细胞系一致的形态特征的数个单独集落从培养物中挑出并单独地扩充以形成单克隆培养物。
在本发明系统的一个优选实施方案中，对经处理的细胞进行遗传分析以提供iPSC的早期确认和鉴定。优选地，遗传分析通过Southern印迹进行，但是可以采用其他本领域已知的方法，包括但不限于，微阵列、NanoString、定量实时PCR(qPCR)、全基因组测序、免疫荧光显微术、流式细胞术。碱性磷酸酶的酶活性，细胞表面标记SSEA3,SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81的阳性表达，及KLF4、Oct3/4、Nanog、Sox2转录因子在重编程人成纤维细胞中的表达的检测确认了克隆为iPSC。优选地，所有标记都存在。
任何本领域已知的转染载体都可用作重编程因子，包括例如，RNA诸如mRNA、微RNA、siRNA、反义RNA及它们的组合。其他可使用的表达载体包括，例如，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、辛德比斯病毒、痘病毒、Bacula病毒、细菌噬菌体、仙台病毒及它们的组合。优选地，所采用的载体为非复制性载体，诸如，例如工程改造成非复制性的仙台病毒载体。优选的仙台病毒载体，虽然不能复制，但是仍然能够富有成效地表达载体携带的一种(多种)核酸编码蛋白，从而阻止任何潜在的向其他细胞或在受接种者身体内不受控制的蔓延。这类Sendai载体可作为CytoTuneTM-iPSC仙台病毒载体试剂盒(DNAVEC,DV-0301)商购获得。
任何本领域已知的转染方法都可用于将此类载体插入到成年成纤维细胞中，包括，例如，电穿孔、基因枪等。化学转染任选地借助于转染剂进行，所述转染剂例如聚合物、磷酸钙、例如用于脂质转染的阳离子脂质等。细胞穿透肽也任选地用于携带载体或其他试剂进入成年成纤维细胞中。简言之，细胞穿透肽包括来源于蛋白质的那些，例如可携带载体或其他试剂进入包括肽的细胞中的蛋白质转导结构域和/或两亲性肽。Heitz等人，2009 British Journal of Pharmacology,157:195–206已综述了细胞穿透肽课题，该文献的全文以引用的方式并入本文。其他细胞穿透肽是本领域熟知的，并且公开在Heitz(同上)中。也考虑在本发明的方法中使用包括例如脂质体和纳米粒子的其他细胞穿透技术。脂质体和纳米粒子也描述在Heitz(同上)中。
可采用抗体来鉴定转化的细胞。四种针对干细胞特异性表面蛋白的抗体常用于鉴定和表征人多能干细胞群体：SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81。阶段特异性胚胎抗原3和4(SSEA3和SSEA4)是两种单克隆抗体，其识别存在于人2102Ep细胞上的神经节苷脂的连续区域(Henderson等人，2002 Stem Cells 20:329-337；Kannagi等人，1983,Embo J 2:2355-2361)。Tra-1-60和Tra-1-81抗体最初是针对人胚胎癌(EC)细胞产生的(PW等人，1984,Hybridoma 3:347-361)并且已被证明能特异性地识别硫酸角质素糖蛋白上的糖抗原表位，硫酸角质素糖蛋白被鉴定为足糖萼蛋白，即CD34相关的唾液粘蛋白家族的成员(Badcock等人，1999,Cancer Research 59:4715-4719；Nielsen等人，2007,PLoS ONE2:e237；Schopperle和DeWolf,2007,Stem Cells 25:723-730)。数种其他表面标记已被证明表达于ES细胞上并且包括CD326或EpCam(Sundberg等人，2009,Stem Cell Res 2:113-124)、CD24(热稳定抗原)和CD133(Barraud等人，2007,Journalof Neuroscience Research 85,250-259)(Gang等人，2007,Blood 109:1743-1751)。Chan等人，2009(同上)报道，从经受经由四因子逆转录病毒转导的重编程的成纤维细胞鉴定真正的(bona fide)IPSc，这可经由活细胞成像及通过观察随着时间的推移成纤维细胞丧失细胞表面标记CD13和D7Fib的表达而获得多能干细胞标记SSEA4和Tra-1-60的表达来实现(Chan等人，2009，同上)。
包含iPSC的组合物，例如，包含有效量的通过本发明系统制备的iPSC的用作研究工具或用作药物组合物的组合物也被考虑落在本发明的范围内。
本发明进一步涉及通过施用iPSC来治疗有需要的动物或人的疾病或病症，例如通过施用由本发明自动化系统产生的iPSC或从其衍生的分化细胞进行的治疗方法和/或组织/器官修复。合适的分化细胞(外胚层、中胚层和内胚层谱系)可以来源于由本发明方法产生的iPSC。施用模式可由本领域技术人员根据待治疗的器官/损伤的类型来确定。例如，iPSC或从其衍生的分化细胞可通过注射(作为混悬剂)施用或植入在生物可降解的基质上。
另外，本发明涉及通过如下方式测试药物的方法：使iPSC、从其衍生的转分化或分化细胞例如与一种或多种感兴趣的药剂接触，然后检测所应用的一种(多种)药剂对接触的细胞的影响。出于效率考虑，将一种(多种)药剂应用到一群iPSC或从其衍生的分化细胞上。该细胞在组织来源、分化细胞类型或等位基因源上可以不同，以允许鉴定对一种或多种感兴趣药剂作出有利或不利反应的细胞或组织类型。
进一步地，由本发明自动化系统产生的iPSC可以用作用于引入用来修正遗传缺陷的基因的载体，所述遗传缺陷诸如成骨不全症、糖尿病、神经退行性疾病，诸如，例如，阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、各种运动神经元疾病(MND)，例如，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)等。
由本发明自动化系统产生的iPSC也可以用来提供用于生物医学研究的特定细胞类型，以及直接用作前体以产生用于基于细胞的测定，例如，用于细胞毒性研究(用于确定测试化合物对细胞毒性的影响)的特定细胞类型，从而通过用测试化合物处理细胞并观察和/或记录所述化合物对细胞的影响，例如对细胞分化的影响来确定所述化合物的致畸或致癌效用。
本发明可以通过参考以下非限制性实施例来更好地理解。提供以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方案。但它们绝不应解读为限制本发明的宽泛范围。
实施例1
图5A、5B、5C示出完成工作流所需的设备配置的实例。图5A示出用于成纤维细胞库的自动化扩充和质量控制的系统配置。图5B示出用于诸如成纤维细胞的患者样本的自动化解冻、重编程因子与诸如成纤维细胞的患者样本的自动化引入、用MultiMACS进行的自动化细胞分选，以及自动化集落鉴定和重新安排的系统配置。图5C示出用于iPS克隆的自动化扩充、自动化类胚体产生和自动化冷冻的系统配置。
成纤维细胞细胞库的自动化提取
举例来说，用于完成成纤维细胞库的提取的硬件配置由HamiltonSTARlet液体处理机器人(100)组成，所述机器人连接至以下硬件组件：允许温育细胞培养物的Cytomat 24C GLS自动化温育器(108)、用于自动化图像采集和分析的Cyntellect Celigo细胞计数器(102)、用于离心平板或管中的细胞的Agilent V-Spin自动化离心机(106)，及用于对冷冻管进行自动化封盖和启盖的Hamilton封盖器启盖器(104)。这些组件由PC上的可编程软件(118)进一步控制，该软件与所有仪器通信并且控制在硬件组件之间的细胞培养皿和细胞的操纵。控制器软件进一步与进度安排软件(120)通信从而将系统交互作用连接起来。Hamilton STARlet(100)装配有用于4/8/12通道移液的模块臂、8个移液通道、iSWAP平板处理机、用于平板和盖处理的CO-RE抓取器(Gripper)、用于在培养基更换期间使平板倾斜的MultiFlex倾斜模块、Hamilton Heated Shaker 2.0，以及用于灵活部署具有平板和盖放置区、移液管堆放架、子平板堆放架及用于容纳培养基的贮槽的液体处理平台的承载包装(Carrier Package)。Cyntellect Celigo(102)包括成像单元和在PC上控制图像采集和图像分析的可编程软件。Celigo是优选的，因为它不会使细胞培养平板在成像期间移动，从而减少对所铺板的活检组织的搅动。Hamilton封盖器启盖器(Capper Decapper)(104)和Agilent V-Spin离心机(106)与Hamilton STARlet一起容纳在NuAireBSL II生物安全柜(110)中，以在细胞培养平板的操纵期间维持无菌操作环境。
为控制自动化系统上的平板处理，MICROLAB STAR VENUSTWO基础包4.3软件(118)与VENUS Dynamic Scheduler 5.1(120)一起，同各个附接的针对离心机(106)、封盖器启盖器(104)、Celigo(102)和Cytomat 24(108)的硬件组件驱动器及Cytomat转移站配合使用以集成系统的操作。使用所提供的控制器软件(118)编程的以下方法是系统的功能性所需要的并且可以以限定的顺序组合以完成成纤维细胞系从患者皮肤活检组织的提取：
1.将6孔活检组织平板装载(22、24)到STARlet(100)上，并转移到Cytomat温育器(108)中。
2.在Celigo(102)上进行融合检查(26、28)，并且在STARlet(100)上进行培养基更换。
3.在Celigo(102)上进行融合检查(28)。
4.在STARlet(100)上变换培养基(30)以提供完全的培养基更换。
5.在STARlet(100)和Agilent V-Spin离心机(106)上进行测定平板制备(34)。
6.在STARlet(100)上进行传代(44)。
7.在STARlet(100)上进行传代和择优挑选(42)。
8.在STARlet(100)上进行传代、收获及冷冻。
9.将平板从Cytomat(108)中取回(46、40)置于STARlet(100)上。
独立的硬件配置用来完成成纤维细胞库的支原体测试，并且由连接至BioTek Synergy HT Reader(114)的Hamilton STARlet液体处理机器人(112)组成。这些组件由PC上的可编程软件(116)进一步控制，该软件与所有仪器通信并且控制在硬件组件之间的细胞培养皿和细胞的操纵。Hamilton STARlet(112)装配有用于4/8/12通道移液的模块臂、8个移液通道、iSWAP平板处理机、用于平板和盖处理的CO-RE抓取器，以及用于灵活布局具有平板和盖放置区、移液管堆放架、子平板堆放架和平板放置区及用于容纳测定所需试剂的贮槽的液体处理平台的承载包装。
为控制自动化系统上的平板处理，MICROLAB STAR VENUSTWO基础包4.3软件(116)与附接的针对BioTek Synergy HT Reader(114)的硬件组件驱动器联合使用从而集成系统的操作。使用这一软件编程允许执行MycoAlert支原体检测测定(36)和数据分析从而确定测定结果(38)的方法。
用于解冻、感染和鉴定重编程细胞的自动化系统
解冻成纤维细胞、用重编程病毒感染成纤维细胞、重编程细胞的磁性分选以及干细胞集落的鉴定所需的硬件配置由以下组成：三个Hamilton STAR液体处理单元(122、136、138)、两个Cytomat 48C温育器(132)、一个Cytomat 2C 425温育器(142)、两个Cyntellect Celigo细胞计数器(124、140)、Hamilton封盖器启盖器(126)、Agilent V-Spin(128)、Miltenyi MultiMACS磁性分离装置(136)。液体处理机、Celigo、Hamilton封盖器启盖器和Agilent V-Spin全部由Hamilton Rack Runner机器人轨道(130)连接。每个Hamilton STAR均装配有用于4/8/12通道移液的模块臂、8个移液通道、iSWAP平板处理机、用于平板和盖处理的CO-RE抓取器、一个或多个用于在培养基更换期间使平板倾斜的MultiFlex倾斜模块、一个或多个Hamilton Heated Shaker 2.0，以及用于灵活部署具有平板和盖放置区、移液管堆放架、子平板堆放架及用于容纳培养基的贮槽的液体处理平台的承载包装。其中一个Hamilton STAR液体处理机(122)还装配有96孔移液头。一个Celigo(140)和Cytomat 2C温育器(142)直接连接至其中一个Hamilton STAR(138)，以方便自动化细胞分选。Hamilton STAR容纳在NuAire BSL II生物安全柜(144、146、148)中，以在细胞培养平板的操纵过程中维持无菌操作环境。其余组件包封在Hepa过滤罩中，以便在细胞培养平板在各装置之间转运期间维持无菌操作环境。Cytomat 48C温育器(132)通过Rack Runner转运轨道(130)连接至系统的其他组件。
为控制自动化系统上的平板处理，MICROLAB STAR VENUSTWO基础包4.3软件控制器(150、152、154)与VENUS DynamicScheduler 5.1(156)一起，同各个附接的针对所有Hamilton STAR(122、134、138)、离心机(128)、封盖器/启盖器(126)、两个Celigo(140、124)、Rack Runner(130)和Cytomat 24(132)、Cytomat 2C(142)的硬件组件驱动器及相关的Cytomat转移站联合使用从而集成系统的操作。使用所提供的控制器软件(150、152、154)编程的以下方法是系统的功能性所需要的并且可以以限定的顺序组合以完成iPS集落从成纤维细胞的提取：
1.将不含支原体的6-孔活检组织平板装载(48)到STAR(122)上，并且转移到处于清洁生长条件(60)下的Cytomat温育器(132)中。
2.在Celigo(124)上进行融合检查(50)并且在STAR(122)上进行培养基更换。
3.在STAR(122)上进行传代、收获(52)及冷冻(54、56)。
4.解冻方法，借此将含有成纤维细胞的冷冻管装载(61)到STAR(122)上并且进行解冻，接着将管启盖(126)并且洗涤成纤维细胞，接着将细胞重悬于铺板培养基中并且将成纤维细胞铺在6孔平板(62)上，并转移至Cytomat温育器(132)中。
5.在STARlet(122)上变换培养基以提供完全的培养基更换。
6.在Celigo(124)上进行融合检查。
7.在STARlet(122)上的24孔平板中进行成纤维细胞的传代和接种(64)。
8.在STARlet(122)上感染成纤维细胞(64)的方法。
9.向STAR(122、138、144)上的孔中加入限定体积的培养基的方法。
10.在STAR(122、138、144)上执行一半培养基的更换的方法。
11.在附接至Miltenyi MultiMACS(136)和Celigo(124)的STAR(144)上进行磁性分选、稀释和铺板(66)的方法。
12.在STAR(122、138、144)上执行四分之三培养基的更换的方法。
13.对活集落执行免疫细胞化学染色并随后使用STAR(138)和Celigo(140)使集落自动化成像(66)的方法。
14.从STAR(138)上的选定孔中收获集落、对其进行择优挑选并重新铺板(68)的方法。
15.将平板从Cytomat(132)上取回置于STARlet(122、138、144)上。
用于重编程细胞的扩充、质量控制和冷冻的自动化系统
扩充重编程干细胞集落、产生用于质量控制测定的集落平板以及产生用于冷冻储藏的平板和管所需的硬件配置由以下组成：三个Hamilton STAR液体处理单元(150、154、160)、Cytomat 24C温育器(172)、一个Cytomat 2C 425温育器(174)、一个Cyntellect Celigo细胞计数器(166)、Hamilton封盖器启盖器(170)、Agilent V-Spin(168)及Agilent平板密封机(164)。液体处理机、Celigo、Hamilton封盖器启盖器、Agilent V-Spin及Agilent PlateLoc平板密封机全部由HamiltonRack Runner机器人轨道(162)连接。Hamilton STAR和STARlet装配有用于4/8/12通道移液的模块臂、8个移液通道、iSWAP平板处理机、用于平板和盖处理的CO-RE抓取器、一个或多个用于在培养基更换期间使平板倾斜的MultiFlex倾斜模块、一个或多个Hamilton HeatedShaker 2.0，以及用于灵活部署具有平板和盖放置区、移液管堆放架、子平板堆放架及用于容纳培养基的贮槽的液体处理平台的承载包装。其中一个STAR(160)还具有96通道多通道移液头，以方便培养基更换和传代。Cytomat 2C和Cytomat 24C温育器通过Hamilton RackRunner转运轨道(162)连接至Hamilton STAR，以方便自动化培养基更换。Hamilton STAR容纳在NuAire BSL II生物安全柜(176、178、180)中，以便在细胞培养平板的操纵期间维持无菌操作环境。其余组件包封在Hepa过滤罩中，以便在细胞培养平板在各装置之间转运期间维持无菌操作环境。
为控制自动化系统上的平板处理，MICROLAB STAR VENUSTWO基础包4.3软件控制器(182、184、186)与VENUS DynamicScheduler 5.1(188)一起，同各个附接的针对离心机、启盖器、平板密封机、Celigo和Cytomat温育器的硬件组件驱动器以及Cytomat转移站联合使用从而集成系统的操作。以下方法是系统的功能性所需要的，并且可以以限定的顺序组合以扩充平板中的细胞培养物用于质量控制测定及用于冷冻在平板或冷冻小瓶中：
1.在STAR(160)上的接收前一阶段的平板(68)置于Cytomat温育器(172)中的装载方法。
2.使用倾斜模块和8通道移液臂在STAR(150、154、160)上变换培养基以提供完全的培养基更换。
3.在Celigo(166)上利用在STAR(150、154、160)与Cytomat温育器(172)之间来回转运平板的相关方法进行融合检查。
4.在STAR(150、154、160)上的96孔平板中传代和接种iPSC(68-90)的方法。
5.在STAR(150、154、160)上执行部分培养基更换的方法。
6.在STAR(150、154、160)上从选定的96孔的孔中收获集落、对其择优挑选并重新铺在新96孔平板(80、82、86、88)中的方法。
7.在STAR(154)上从选定的96孔的孔中收获集落、对其择优挑选并重新铺在新24孔平板(90、92)中的方法。
8.在STAR(154)上从选定的24孔的孔中收获集落、对其择优挑选，并重新铺在新6孔平板(92、94)中的方法。
9.在STAR(154)上的冷冻平板中传代、收获并分配细胞(88)。
10.在STAR(154)上的冷冻管中传代、收获并分配细胞(96)。
11.将平板从Cytomat 24C(172)或Cytomat 2C(174)上取回置于STAR(150、154、160)上。
实施例2
用于重编程的成纤维细胞库的产生
从患者样本中提取出iPSC的工作流的第一步是获得并扩充成年细胞。这例如通过如下方式完成：获得皮肤钻取的活检组织或丢弃的皮肤组织，然后从该组织中分离出成纤维细胞的培养物并进行扩充。在工作流中，这由包括系统1和2的自动化系统完成。系统1和2(100-120)及系统3(122-132、154、190)的自动化组件执行从患者样本中提取储藏于冷冻管中的成纤维细胞库(61)所需的步骤，包括将患者活检组织铺板(2、22-24)、生长晕和传代(4、26-32)(在液体处理机器人上滚动进行)、QC(6、34-46)(针对支原体的自动化测试)，以及在液体处理机器人上自动化冷冻(8、48-56)。例如用于从活检组织样本产生成纤维细胞的工作流和决定树划分成成检疫阶段(58)和清洁阶段(60)。随着活检组织进入设施，技术人员将活检组织样本铺在6孔平板中(22)，并且将平板送入自动化温育器中(24)，从而开始检疫工作流。在给予活检组织时间以让其贴附于平板后，液体处理机器人将平板从自动化温育器中取回以提供养料并在自动化显微镜上检查来自所铺板的组织的成年成纤维细胞生长晕的融合(26)。将平板放回到温育器中并让其继续向外生长(28)。液体处理机将平板从温育器中移出，并且将培养基更换为不含抗生素和抗霉菌剂的培养基(30)从而为支原体测试作准备。机器人再将平板移入温育器中保持5天(32)。机器人然后移出平板，并且取回培养基置于子平板中用于支原体测试(34)。将子平板移入检疫测定系统中用于支原体测试(36)。然后基于来自测定的阳性信号进行挑选(38)。如果6孔平板的所有孔都因阳性测定结果而未能通过(40)，则将它们丢弃。如果6孔平板的所有孔都是阴性并且不含支原体，则将它们从检疫系统转移到由系统3、4、5提供的清洁生长环境中(46)。如果一些孔是阳性，而一些孔是阴性，则将阴性孔维持在检疫系统中(42)。将阴性孔传代(44)至新平板中，转移至温育器中，并且丢弃含有阳性孔的源平板。这些培养物接下来通过多个步骤进入针对支原体的再测试(24-38)。监测清洁培养物的生长(50)，将其传代(52)并冷冻在冷冻小瓶中(54、56、61)。
干细胞阵列的产生
为产生iPSC，自动化系统将冷冻管(61)中的成纤维细胞铺板(10)，自动化系统引入重编程因子(12)，通过系统中的自动化分选和分离来分离iPSC(14)，自动化系统挑选出期望的克隆(16)并且自动化系统对其进行扩充(16)，自动化系统通过标记物测定和类胚体测定进行多能状态的自动化质量检查(QC)(18)，然后自动化系统对期望细胞进行自动化冷冻和储藏(20)。这些步骤在自动化系统3、4、5、6、7以及8上完成(122-192)。
例如，当将冷冻管(61)中的96个患者和对照成纤维细胞样本被铺在6孔平板的各个孔中(62)时，自动化iPS提取过程开始。将这些样本以限定的细胞数量传代到24孔平板的各个孔中以便使用编码重编程因子的病毒进行感染(64)。在下一个步骤中，通过细胞分选或基于磁珠的富集去除重编程样本中的非重编程细胞，并且以克隆密度铺在96孔平板(66)的多个孔中。在这个实例中，6个孔(66)被鉴定出含有对多能表面标记呈阳性的单一克隆。对这些克隆择优挑选，并且将它们整合到最小数量的96孔平板(68)中。将这些克隆连续传代，直至对于每一个起始样本而言孔内均达到融合(72)。然后，将每一个平板的样本复制到重复的平板(74、76)上，一块平板用于测定各个克隆的多能状态所需的多能性质量控制测定(74)，并且一块平板用于在后续传代中继续运行(76)。将继续运行的平板再次传代到三块平板(78、80、82)中。收获一块平板用于评估染色体组型和遗传多样性的QC测定(78)；将一块平板(82)传代到v形底平板上以形成类胚体(84)用于评估iPS克隆的分能化力的QC测定；并且使最后一块平板(80)继续运行用于进一步扩充。未通过先前多能性QC测定的质量控制的各个克隆没有继续运行，如由图4B2和4C中的孔中的“X”所指示的(80、82、90)。将剩余的克隆整合到尽可能少的平板中，直到剩余一至三个克隆(86)。这些克隆经扩充用于在贴附于平板上时冷冻保存(88)，或者经进一步扩充(92、94)并冷冻保存在冷冻瓶(96)中。
还考虑将胚胎干细胞(ES)与本发明的自动化系统一起使用来产生分化的成年细胞。ES细胞来源于早期胚胎的胚泡，并且具有发育成内胚层、外胚层和中胚层(三个生殖层)的潜能(即，它们是“多能的”)。在体外，ES细胞趋向于自发分化成各种类型的组织，并且控制它们的分化方向可能具有挑战性。然而，在从ES细胞至特定类型分化子代细胞的定向分化方面已经取得一些进展。例如，现在可以使用在细胞培养物的逐步分化的限定阶段添加到细胞培养物中的限定因子，引导人ES细胞分化成功能性中脑多巴胺能神经元(参见例如Kriks等人,2011 Nature,11月6日,doi:10.1038/nature10648(电子版))。因为分化不是匀质的，因此仍有必要分离感兴趣群体用于进一步研究或操纵。所描述的过程和仪器可用于首先提取和扩充多能胚胎干细胞，并且还通过包括自动化磁性细胞分离的自动化方法来分离其分化衍生物的亚群。
例如，全人胚泡可铺在适于自动化过程的多孔平板中的基质上。可使用由机器人仪器执行的相同自动化磁性分离程序及针对所诱导的多能干细胞的分离描述的方法来分离来自这些所铺板的胚泡的生长晕。所得人胚胎干细胞系可以被扩充、通过质量控制测定进行挑选并且使用本文描述的相同自动化程序进行冷冻。
进一步地，在使用胚泡来源的或通过限定因子或体细胞核转移诱导的多能干细胞时，分化的衍生物可以使用所描述的工作流和仪器进行分离。分化的衍生物可通过定向施加诱导细胞命运改变所需要的限定因子来获得或者在自发分化后获得。例如，TGFβ途径抑制剂可用于从多能干细胞诱导神经细胞命运。随后可通过表面抗原诸如NCAM的磁珠免疫标记将神经细胞从非神经细胞中分离出来。所描述的工作流和仪器可用于磁性分离、选择、培养和扩充分化的细胞，如神经元。这个过程还适用于其他分化细胞类型，如心肌细胞，在这些细胞类型中存在识别对感兴趣细胞类型有特异性的细胞表面抗原的抗体。
还考虑将多能干细胞与本发明的自动化系统一起使用来产生分化的成年细胞。具体来说，可使用本发明的自动化化系统采用间充质干(MS)细胞产生分化的成年细胞。MS细胞是在骨髓、血液、真皮，及骨外膜和胎盘中发现的形成性多能胚或胚胎样细胞，其能够分化成特定类型的间充质或结缔组织，包括脂肪组织、骨组织、软骨组织、弹性组织、肌肉组织和纤维结缔组织。这些细胞进入的具体分化途径取决于来自以下的各种影响：机械影响和/或内源性生物活性因子，诸如生长因子、细胞因子和/或由宿主组织建立的局部微环境条件。实例包括MS细胞分化成具有软骨细胞的软骨修复特性的分化细胞，例如参见美国专利第8,048,673号。
染色体测试
在一些方面，Nanostring nCounter Plex2测定试剂盒用来靶向通常已知在群体中不变的400个基因座，允许集成分子染色体组型分析与细胞系身份的“指纹”跟踪相结合。分子染色体组型分析利用每个染色体臂的平均8个探针核实在iPSC系的细胞培养物提取和扩充过程中基因组稳定性。还将基于允许清楚地鉴定各个基因组的多态基因座的30个常见拷贝数变异(CNV)，对所有系进行身份分析。
多能性分析
在一方面，进行表面标记染色以证明细胞对Tra-1-60表面标记呈阳性，所述标记例如用Celigo自动化成像仪来监测。PSC系必须展现出显著水平的多能性基因。在一个实例中，我们利用100种基因标记(下文描述)的探针集，其包括六种针对多能性的标记(Oct4、Klf4、cMyc、Nanog、Lin28、ZFP42及Sox2)。为了进行这一分析，我们将细胞样本裂解并收获RNA。我们利用nCounter Plex2测定试剂盒同时分析在多个样本和数百个基因靶标中的表达水平，从而使得高通量途径能够应用于PSC表征。由于nCounter基因表达测定是定量的，因此选择标准是基于相对于在相同条件下分析、生长的已建立的hESC系的对照组落入一定范围内的表达水平。通过多能性基因表达标准的系将进一步扩充并在类胚体(EB)测定中体外分化。
EB形成基因表达测定
已经证明表观遗传和转录变异在人多能细胞系中是常见的，并且这种变异可对细胞系的效用具有显著的影响。在一个说明性实例中，基因标记组包括：
83种选自3个生殖层中的每一个的不同的基因标记(83)
5种逆转录病毒转基因(具有单一检测探针的4个因子，1个探针)
5种Sendai转基因(4个因子+单独的载体，5)
Oct4、Klf4、cMyc、Nanog、Lin28、ZFP42(多能性，Sox2在生殖层组中，6个探针)
性别标记SRY、XIST(2)–供体性别必须匹配或者系将受到排斥。
看家基因ACTB、POLR2A、ALAS1(3个探针)。
hPSC系扩充和储藏
自动化扩充:
通过如下方式扩充细胞系：将原始细胞铺在6孔平板的2个独立孔中，然后将它们置于CO2温育器中并且让它们生长至最高95％的融合。
储藏：
首先将小瓶放置在SAM-80冷冻器中以进行初始缓慢冷却。这个系统具有对温度和所述系统访问的时间日志的自动化监测。
接下来，将小瓶放置在LN2中用于长期储藏。用于监测的质量控制在此方案后文中有详细描述。每个小瓶用唯一2D条形码单独标记，并且在LIMS内跟踪清单。
hPSC系的表征
iPSC和EB基因表达分析-探针集涵盖谱系分化测定计分卡(100种基因)以监测在EB测定中生殖层的分化、多能性标记、性别标记及转基因表达
冷冻-解冻分析在回收后对细胞进行计数，并且将细胞铺在6孔平板的一个孔中。在出现的第一天以及然后在5天后对集落进行照相，集落必须显示出不大于36小时的倍增时间。
表面标记分析：
使用自动化系统进行表面标记分析，利用Celigo自动化成像仪对Tra-1-60染色进行高内涵成像。
iPSC和EB基因表达分析：
多能性基因表达—iPSC克隆必须展现出显著水平的多能性基因。我们利用100种基因标记(下文描述)的探针集，其包括六种针对多能性的标记(Oct4、Klf4、cMyc、Nanog、Lin28、ZFP42及Sox2)。为了进行这一分析，我们将每个所选定克隆的细胞样本裂解并收获RNA。我们利用nCounter Plex2测定试剂盒来同时分析在多个样本和数百种基因靶标中的表达水平，从而使得高通量途径能够应用于iPSC表征。由于nCounter基因表达测定是定量的，因此选择标准是基于相对于在相同条件下分析、生长的已建立的hESC系的对照组落入一定范围内的表达水平。通过多能性基因表达标准的选定克隆将进一步扩充并在类胚体测定中体外分化。
EB形成基因表达测定—为了稳固地确立存在于人多能干细胞系中的表观遗传变异的性质和幅度，将三种基因组测定应用于20种已建立的胚胎干细胞(ESC)系及12种最近提取并进行功能表征的iPSC系。作为降低综合细胞系表征的实验负荷的一个步骤，以及为了提高相对于标准现有测定的准确度，使用三种基因组测定将来自这些研究的所有数据组合到生物信息计分卡中，所述计分卡实现任何多能细胞系的质量和效用的高通量预测。我们利用这种计分卡分析来自由iPSC系的每个克隆形成的EB的基因表达数据。为了测试分化潜能，我们使用自动化系统来在96孔v形底平板上产生EB，并且以用于Nanostring nCounter Plex2测定试剂盒的RNA收获结束。
83种选自3个生殖层中的每一个的不同的基因标记(83)
5种逆转录病毒转基因(具有单一检测探针的4个因子，1个探针)
5种Sendai转基因(4个因子+单独的载体，5)
Oct4、Klf4、cMyc、Nanog、Lin28、ZFP42(多能性，Sox2在生殖层组中，6个探针)
性别标记SRY、XIST(2)
看家基因ACTB、POLR2A、ALAS1(3个探针)。
染色体组型和身份分析
在接收系之前以及在每次扩充结束时，我们利用NanostringnCounter Plex2测定试剂盒靶向400个基因座，其允许集成分子染色体组型分析与细胞系身份的“指纹”跟踪相结合。分子染色体组型分析利用每个染色体臂的平均8个探针来核实iPSC系的细胞培养物提取和扩充过程中基因组稳定性。“指纹”身份跟踪分析将依赖于基于允许清楚地鉴定单独基因组的多态基因座的30种常见拷贝数变异(CNV)的组合签名。另外，为避免错误鉴定，已知有亲缘关系的组织供体将不在同一批次中加以处理，因为它们在理论上有可能具有相似的CNV。来自身份分析的数据将与初始CNV数据交叉参考，以便确保LIMS系统正确地跟踪所有细胞系。
冷冻-解冻分析
冷冻-解冻分析：在冷冻保存后将一只小瓶解冻。在回收后对细胞进行计数，并且将细胞铺在6孔平板的一个孔中。每日观测培养物。在出现的第一天以及然后在5天后对集落进行照相。在第一次观测后5天内，集落的直径必须至少倍增。
自动化活检组织生长晕跟踪：使用本发明系统，我们可以通过自动化且可跟踪的图像分析来跟踪活检组织以及其他组织源的生长晕。如图6所示，在产生过程中跟踪图像和生长率。在图6A中，将活检组织或丢弃的组织铺在6孔盘的多个孔中，并且由对成纤维细胞生长晕进行饲养、成像、传代并且冷冻的自动化系统来维持。示出典型样本的图像分析界面的实例。每个捐赠样本使用单一平板以将交叉污染减至最小。(B)基于线性回归在独立产生的标准曲线上从融合测量值外推细胞数目。(C)在自动化系统上维持的典型活检组织生长晕的细胞计数的实例。针对每个孔对每个患者样本的外推细胞数目独立地作图(上)，从而允许计算自样本的总输出(下)。
图7示出FACS分析及示出自动化iPSC重编程的图表。追踪重编程的人成纤维细胞上的多能表面标记的表达水平3周，以便观察重编程动力学并确定分离限定的细胞群体的最佳时间点。(A)用于分析的FACS门控方案，(B)共表达传统多能性表面标记SSEA4和TRA-1-60的相当大比例的细胞在使用逆转录病毒或Sendai载体引入重编程因子Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的重编程过程中的所有时间点保留了成纤维细胞标记CD13。示出的盒须图指示来自131个实验(逆转录病毒，n＝66；仙台病毒，n＝65)的汇总数据。尽管仙台病毒介导的重编程产生更多的SSEA4/TRA-1-60双阳性细胞，但(C)CD13从表面上的消除出现延迟。(D)使用Sendai/Cytotune系统在自动化系统上重编程的患者细胞系的示例性染色图案。在7与13 dpi，超过半数的SSEA4/TRA-1-60双阳性细胞已失去CD13。另外，在测定的这两个时间点，CD13阴性/Nanog阳性细胞存在于此部分中，表明这些细胞可以通过针对CD13的阴性选择来分离。
图8示出FAC预分选分析和用于证明iPSC的富集和克隆选择的自动化系统的一部分。(A)可以利用成纤维细胞标记通过阴性选择从iPSC的培养物中去除非重编程细胞群体。这一策略使iPSC不受影响。在该实例中，成纤维细胞从含有2％已建立的iPSC的培养物中有效除去，而TRA-1-60阳性iPSC保持不受影响。(B)集成到Hamilton液体处理机中的Miltenyi MultiMACS系统可以平行地分选24个样本。(C)通过在MultiMACS系统上使用抗成纤维细胞抗体缀合的磁珠进行阴性选择而获得的新提取的iPSC的示例性集落。相差、通过Sytox进行的核染色、通过TRA-1-60进行的表面标记染色及核Nanog染色(未示出)。(D)将来自抗成纤维细胞磁性阴性选择步骤的iPS富集的部分以极限稀释形式铺在96孔成像平板上。使用针对多能性表面标记TRA-1-60或TRA-1-81的活细胞染色筛选这些平板。使用能够确认单一集落的Celigo软件通过自动化图像分析鉴定具有TRA-1-60阳性iPSC的孔。选择满足含有对表面标记呈阳性的单一集落的两个标准的孔用于传代和扩充及QC。(E)(未示出)-由成年成纤维细胞的自动化Sendai感染产生的集落。
还通过经修饰mRNA的自动化转染证明了iPSC诱导。在自动化递送含有经修饰mRNA的转染混合物10天后，有效回收来自BJ成纤维细胞的iPSC集落。再培养两天后，用TRA-1-60对同一孔进行染色，以鉴定未分化细胞。孔中的iPSC证明这些是未分化的iPSC。有效回收在自动化系统上使用磁珠去除法通过纯化从非重编程细胞分离出来的iPSC集落。
已经产生了针对基因表达的高通量计分卡测定。质量控制筛选的第一阶段使用一组多能性分化和转基因标记挑选具有三个克隆的初始集。图9A示出在第5次传代和第10次传代时测定的两个HESC系、Sendai阳性对照、成纤维细胞阴性对照及通过FACS分选提取的iPS系在归一化至HK基因表达之后的转录本计数，所有测定均相对于维持在相似条件下的一组正常HESC和iPS系运行。在所述系统上在96孔V形底平板中产生的类胚体的示例性图像未示出。箭头指向EB。图9C示出质量控制筛选的第二阶段使用另外的83种生殖层/谱系标记来在类胚体测定中监测分化能力。产生单一EB并将其汇集以产生RNA用于类胚体计分卡测定中生殖层标记的表达分析。示出了从九种不同胚胎干细胞系收集的EB中的基因表达的聚类树状图分析。在归一化后，从六种EB的直接裂解产生的数据与从抽提和纯化自由大规模培养物制备的EB的总RNA产生的数据相比有优势。
图10示出基于CNV的Nanostring nCounter测定的高通量iPSC染色体组型分析。图10A为对BC1 iPSC进行的nCounter染色体组型测定的实例；图10B为对1016个染色体臂部分增加或缺失的成纤维细胞进行的nCounter染色体组型测定的实例。与Affymetrix SNP 6.0芯片数据的比较证明了Chr1 q臂的一部分的拷贝数增加(上迹线，1q21.2-1q43)，而Chr6长臂的一部分缺失(下迹线，6q16.3-6q26)。
尽管已经描述了本发明的优选实施方案，但本发明不限于这些实施方案，并且本发明的范围由随附权利要求书来限定。
Claims (53)
1.一种用于产生iPSC的自动化系统，其包括：
将细胞铺在平板上的细胞铺板单元；以及
通过使所述铺板单元上的细胞与重编程因子接触从而产生iPSC来对细胞进行自动化重编程的诱导单元。
2.根据权利要求1所述的系统，进一步包括：
通过鉴定iPS特异性标记来选择性地分选和分离由所述诱导单元产生的iPSC的分选单元。
3.根据权利要求2所述的系统，进一步包括：
用于扩充所述分离的iPSC并挑选所述扩充的iPSC的扩充单元。
4.根据权利要求1所述的系统，进一步包括：
用于冷冻所述分离的iPSC的冷冻单元。
5.根据权利要求1所述的系统，进一步包括：
检查所述iPSC的融合以确定所述iPSC是否具有融合特征的融合检查单元。
6.根据权利要求5所述的系统，其中所述融合检查单元定期地检查所述iPSC的融合。
7.根据权利要求5所述的系统，其中所述融合检查单元随着时间的推移更频繁地定期地检查所述iPSC的融合。
8.根据权利要求5所述的系统，其中所述融合检查单元检查所述融合特征是否在70％至100％的范围内。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述诱导单元使用病毒载体启动重编程。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述诱导单元使用逆转录病毒或仙台病毒启动重编程。
11.根据权利要求1所述的系统，其中所述诱导单元使用小分子、肽、蛋白质或核酸启动重编程。
12.根据权利要求1所述的系统，进一步包括用于对所述细胞进行电穿孔的电穿孔单元。
13.根据权利要求1所述的系统，其中所述分选单元包括磁性分选单元。
14.根据权利要求1所述的系统，进一步包括用于获取所述铺板单元使用的细胞的细胞存库单元。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述存库单元包括：
用于将活检组织铺在平板上的活检组织铺板单元；
用于使细胞生长的生长晕和传代单元；以及
用于测试支原体的存在的支原体测试单元。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述支原体测试单元包括辉光发光测试装置。
17.根据权利要求15所述的系统，进一步包括：
用于分配所扩充的细胞的分配单元；以及
用于储藏所述细胞的储藏和取回系统。
18.根据权利要求17所述的系统，其中所述储藏和取回系统冷冻所述细胞。
19.根据权利要求3所述的系统，其中所述扩充单元自动地扩充并挑选较高质量的克隆。
20.根据权利要求1所述的系统，其中所述细胞是体细胞。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述体细胞是成纤维细胞。
22.一种用于从体细胞产生分化成年细胞的自动化系统，包括：
将细胞铺在平板上的干细胞铺板单元；以及
通过使所述干细胞铺板单元上的细胞与重编程因子接触从而产生分化成年细胞来对细胞进行自动化重编程的诱导单元。
23.根据权利要求22所述的系统，进一步包括选择性地分选和分离由所述诱导单元产生的分化成年细胞的分选单元。
24.根据权利要求23所述的系统，进一步包括：
用于扩充所述分离的分化成年细胞并挑选所述扩充的分化成年细胞的扩充单元。
25.根据权利要求24所述的系统，进一步包括：
用于冷冻所述分离的分化成年细胞的冷冻单元。
26.根据权利要求22所述的系统，其中所述干细胞为iPSC、胚胎干细胞、造血干细胞、神经干细胞或间充质干细胞。
27.根据权利要求24所述的系统，进一步包括：
检查所述分化成年细胞的融合以确定所述分化成年细胞是否具有融合特征的融合检查单元。
28.根据权利要求27所述的系统，其中所述融合检查单元定期地检查所述分化成年细胞的融合。
29.根据权利要求22所述的系统，其中所述诱导单元使用病毒载体启动重编程。
30.根据权利要求29所述的系统，其中所述诱导单元使用逆转录病毒或仙台病毒启动重编程。
31.根据权利要求22所述的系统，其中所述诱导单元使用小分子、肽、蛋白质或核酸启动重编程。
32.根据权利要求22所述的系统，进一步包括用于对所述细胞进行电穿孔的电穿孔单元。
33.根据权利要求22所述的系统，其中所述分选单元包括磁性分选单元。
34.根据权利要求22所述的系统，进一步包括用于获取所述细胞铺板单元使用的细胞的存库单元。
35.根据权利要求34所述的系统，其中所述存库单元包括：
用于将活检组织铺在平板上的活检组织铺板单元；
用于使细胞生长的生长晕和传代单元；以及
用于测试支原体的存在的支原体测试单元。
36.根据权利要求35所述的系统，进一步包括：
用于分配所扩充的分化成年细胞的分配单元；以及
用于储藏所述分化成年细胞的储藏和取回系统。
37.根据权利要求36所述的系统，其中所述储藏和取回系统冷冻所述细胞。
38.一种用于从诱导多能干细胞(iPSC)产生分化成年细胞的自动化系统，其包括：
将iPSC铺在平板上的iPSC铺板单元；以及
通过使所述iPSC铺板单元上的iPSC与重编程因子接触从而产生分化成年细胞来对iPSC进行自动化重编程的诱导单元。
39.根据权利要求38所述的系统，进一步包括通过鉴定对所述分化成年细胞有特异性的标记来选择性地分选和分离由所述诱导单元产生的分化成年细胞的分选单元。
40.根据权利要求38所述的系统，进一步包括：
用于扩充所述分离的分化成年细胞并挑选所述扩充的分化成年细胞的扩充单元。
41.根据权利要求38所述的系统，进一步包括：
用于冷冻所述分离的分化成年细胞的冷冻单元。
42.根据权利要求38所述的系统，其中所述诱导单元使用病毒载体启动分化。
43.根据权利要求42所述的系统，其中所述诱导单元使用逆转录病毒或仙台病毒启动分化。
44.根据权利要求38所述的系统，其中所述诱导单元使用小分子、肽、蛋白质或核酸启动分化。
45.根据权利要求38所述的系统，进一步包括用于获取所述铺板单元使用的分化细胞的存库单元。
46.根据权利要求38所述的系统，其中所述细胞存库单元包括：
用于将活检组织铺在平板上的活检组织铺板单元；
用于使细胞生长的生长晕和传代单元；以及
用于测试支原体的存在的支原体测试单元。
47.一种使用根据权利要求1所述的系统产生的诱导多能干细胞。
48.一种使用根据权利要求1所述的系统产生的诱导多能干细胞群体。
49.一种包含由根据权利要求1、22或38中任一项所述的系统产生的细胞的阵列。
50.根据权利要求49所述的阵列，其中所述阵列是至少6、24、96、384、1536大小的阵列
51.根据权利要求22或38所述的系统，其中所述分化细胞选自由造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿道细胞和神经元细胞组成的组。
52.一种由权利要求1、22或38所述的系统产生的细胞库。
53.根据权利要求19所述的系统，其中将较高质量的克隆整合到较整合之前少的平板中。
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