JPH08266275A - Ｄｎａ修復酵素 - Google Patents
Ｄｎａ修復酵素Info
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- JPH08266275A JPH08266275A JP7094137A JP9413795A JPH08266275A JP H08266275 A JPH08266275 A JP H08266275A JP 7094137 A JP7094137 A JP 7094137A JP 9413795 A JP9413795 A JP 9413795A JP H08266275 A JPH08266275 A JP H08266275A
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- Japan
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- dna
- mus
- protein
- sequence
- gene
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 紫外線によってＤＮＡ中のＴＴ配列およびＴ
Ｃ配列からそれぞれ誘発されたシクロブタン型ダイマー
および（６−４）結合生成物をＤＮＡ中で特異的に認識
し、そしてそれらを５′側で切断することのできる酵素
活性を有する蛋白質。該蛋白質をコードするＤＮＡ。 【効果】 新規なＤＮＡ修復酵素が提供される。
Ｃ配列からそれぞれ誘発されたシクロブタン型ダイマー
および（６−４）結合生成物をＤＮＡ中で特異的に認識
し、そしてそれらを５′側で切断することのできる酵素
活性を有する蛋白質。該蛋白質をコードするＤＮＡ。 【効果】 新規なＤＮＡ修復酵素が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ修復酵素に関す
る。より具体的には、本発明は紫外線によって誘発され
るＤＮＡの損傷の修復に関与する酵素活性を有する蛋白
質に関する。また、本発明は、かかる蛋白質をコードす
るＤＮＡ、およびかかる蛋白質の製造方法に関する。
る。より具体的には、本発明は紫外線によって誘発され
るＤＮＡの損傷の修復に関与する酵素活性を有する蛋白
質に関する。また、本発明は、かかる蛋白質をコードす
るＤＮＡ、およびかかる蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【背景技術】進化を通じて、紫外線（ＵＶ）は生物に対
して多大な影響を及ぼし、ＵＶ誘発ＤＮＡ損傷の修復は
生命を維持する上で重要であった。最も重要な有毒で突
然変異誘発性のＵＶ光化学反応物は、シクロブタンピリ
ミジンダイマー（ＣＰＤ）と（６−４）光化学反応物
［（６−４）ＰＰ］である。これらの光化学反応物を除
去する数種の解決手段が確認されている。酵素的光回復
（ＰＨＲ）は、多くの微生物および高等真核細胞で使用
されており、可視光のエネルギーによるフォトリアーゼ
を介して特異的にＣＰＤをモノマー形にもどす機構であ
る。また、（６−４）ＰＰに作用する光回復酵素は、昆
虫に存在することが知られている（Todo et al.,１９９
３，Nature, ３６１，３７１−３７４）。
して多大な影響を及ぼし、ＵＶ誘発ＤＮＡ損傷の修復は
生命を維持する上で重要であった。最も重要な有毒で突
然変異誘発性のＵＶ光化学反応物は、シクロブタンピリ
ミジンダイマー（ＣＰＤ）と（６−４）光化学反応物
［（６−４）ＰＰ］である。これらの光化学反応物を除
去する数種の解決手段が確認されている。酵素的光回復
（ＰＨＲ）は、多くの微生物および高等真核細胞で使用
されており、可視光のエネルギーによるフォトリアーゼ
を介して特異的にＣＰＤをモノマー形にもどす機構であ
る。また、（６−４）ＰＰに作用する光回復酵素は、昆
虫に存在することが知られている（Todo et al.,１９９
３，Nature, ３６１，３７１−３７４）。
【０００３】また、細菌ミクロコッカス ルテウス（Mic
rococcus luteus）およびＴ４ファージ感染大腸菌（Esc
herichia coli）では、ピリミジンダイマー・ＤＮＡグ
リコシラーゼ／エンドヌクレアーゼ（Ｔ４endo）がＣＰ
Ｄの生じる部位での塩基除去修復を開始することにより
ＣＰＤを特異的に認識し、そしてＣＰＤを除去すること
が知られている。ＤＮＡ由来の主要な上記２種のＵＶ光
化学反応物を除去できる多機能経路は、現実には、シク
ロブタンダイマーより遥かに効率よく（６−４）ＰＰを
修復するヌクレオチド除去修復である（例えば et al.,
１９８５；Szymkowski et al.,１９９３，Proc. Natl.
Acad. Sci. USA，９０，９８２３−９８２７）。ヌクレ
オチド除去修復（ＮＥＲ）は、多くの細菌酵母およびヒ
トを含む種々の原核細胞および真核細胞で発見されてい
る。
rococcus luteus）およびＴ４ファージ感染大腸菌（Esc
herichia coli）では、ピリミジンダイマー・ＤＮＡグ
リコシラーゼ／エンドヌクレアーゼ（Ｔ４endo）がＣＰ
Ｄの生じる部位での塩基除去修復を開始することにより
ＣＰＤを特異的に認識し、そしてＣＰＤを除去すること
が知られている。ＤＮＡ由来の主要な上記２種のＵＶ光
化学反応物を除去できる多機能経路は、現実には、シク
ロブタンダイマーより遥かに効率よく（６−４）ＰＰを
修復するヌクレオチド除去修復である（例えば et al.,
１９８５；Szymkowski et al.,１９９３，Proc. Natl.
Acad. Sci. USA，９０，９８２３−９８２７）。ヌクレ
オチド除去修復（ＮＥＲ）は、多くの細菌酵母およびヒ
トを含む種々の原核細胞および真核細胞で発見されてい
る。
【０００４】３０を超える糸状菌ニュウロスポラ クラ
ッサ（Neurospora crassa）の突然変異誘発剤感受性変
異株からは、ヒト細胞の色素性乾皮症（ＸＰ）または酵
母サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerev
isiae）のＲＡＤ３エピスタシス群に類するＮＥＲ欠失
突然変異株は発見されていない。
ッサ（Neurospora crassa）の突然変異誘発剤感受性変
異株からは、ヒト細胞の色素性乾皮症（ＸＰ）または酵
母サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerev
isiae）のＲＡＤ３エピスタシス群に類するＮＥＲ欠失
突然変異株は発見されていない。
【０００５】ところが、ＵＶに対してだけでなく化学突
然変異誘発剤に対しても感受性の異常な表現型を有する
ｍｕｓ−１８変異細胞が見い出されている（Ishii et a
l.,１９９１，Mol. Gen. Genet., ２２８，３３−３
９）。ＵＶ照射による突然変異細胞のＤＮＡで生じるＣ
ＰＤは、液体に１８時間保持した後でさえも修復されな
いまま残る（同上）。
然変異誘発剤に対しても感受性の異常な表現型を有する
ｍｕｓ−１８変異細胞が見い出されている（Ishii et a
l.,１９９１，Mol. Gen. Genet., ２２８，３３−３
９）。ＵＶ照射による突然変異細胞のＤＮＡで生じるＣ
ＰＤは、液体に１８時間保持した後でさえも修復されな
いまま残る（同上）。
【０００６】本発明者らは、独自に、ｍｕｓ−１８変異
細胞はおそらくＴ４ｅｎｄｏのような酵素をコードする
遺伝子中のＣＰＤ修復機構中に欠陥があるものと考え
た。このような遺伝子はＮＥＲ欠失大腸菌のＵＶ感受性
を補足する可能性がある。そこで、本発明者らは、ニュ
ウロスポラ クラッサ（N. Crassa）のｃＤＮＡ発現ライ
ブラリーを、３種のＣＰＤ修復経路（ＮＥＲ、ＰＨＲお
よび組換え）のすべてを欠失している大腸菌（E. col
i）に導入し、新たなＤＮＡ修復酵素が存在する可能性
を検討してきた。その結果、Ｎ. ｃｒａｓｓａのｍｕｓ
−１８変異株における欠失遺伝子がＣＰＤ部位と（６−
４）ＰＰ部位の双方に特異的なエンドヌクレアーゼをコ
ード化することを見い出した。
細胞はおそらくＴ４ｅｎｄｏのような酵素をコードする
遺伝子中のＣＰＤ修復機構中に欠陥があるものと考え
た。このような遺伝子はＮＥＲ欠失大腸菌のＵＶ感受性
を補足する可能性がある。そこで、本発明者らは、ニュ
ウロスポラ クラッサ（N. Crassa）のｃＤＮＡ発現ライ
ブラリーを、３種のＣＰＤ修復経路（ＮＥＲ、ＰＨＲお
よび組換え）のすべてを欠失している大腸菌（E. col
i）に導入し、新たなＤＮＡ修復酵素が存在する可能性
を検討してきた。その結果、Ｎ. ｃｒａｓｓａのｍｕｓ
−１８変異株における欠失遺伝子がＣＰＤ部位と（６−
４）ＰＰ部位の双方に特異的なエンドヌクレアーゼをコ
ード化することを見い出した。
【０００７】他方、組換え技術によって製造されたＴ４
エンドヌクレアーゼはＣＰＤのみに選択的に作用するも
のであるが、その活性を利用して、日焼け止めクリーム
などに混ぜ、皮膚ガンを予防するクリームへの用途も開
発されている。
エンドヌクレアーゼはＣＰＤのみに選択的に作用するも
のであるが、その活性を利用して、日焼け止めクリーム
などに混ぜ、皮膚ガンを予防するクリームへの用途も開
発されている。
【０００８】以上のような背景を考慮すれば、ＣＰＤと
（６−４）ＰＰとの双方の除去修復に寄与しうる酵素を
提供できれば、さらに有効なクリーム剤等の開発に資す
ることができるであろう。
（６−４）ＰＰとの双方の除去修復に寄与しうる酵素を
提供できれば、さらに有効なクリーム剤等の開発に資す
ることができるであろう。
【０００９】
【発明の構成】本発明は、上記のように、Ｎ. ｃｒａｓ
ｓａの特定の遺伝子が、損傷を受けたＤＮＡのＣＰＤ部
位にも（６−４）ＰＰ部位にも作用するエンドヌクレア
ーゼをコード化することを発見し、さらにかかる遺伝子
の単離および発現に成功することによつて完成した。
ｓａの特定の遺伝子が、損傷を受けたＤＮＡのＣＰＤ部
位にも（６−４）ＰＰ部位にも作用するエンドヌクレア
ーゼをコード化することを発見し、さらにかかる遺伝子
の単離および発現に成功することによつて完成した。
【００１０】従って、本発明によれば、紫外線によって
ＤＮＡ中のＴＴ配列およびＴＣ配列からそれぞれ誘発さ
れたシクロブタン型ダイマー（ＣＰＤ）および（６−
４）結合生成物（または「光反応物」）［（６−４）Ｐ
Ｐ］を、特異的に認識し、そしてそれらの５′側で切断
することのできる酵素活性を有する蛋白質が提供され
る。
ＤＮＡ中のＴＴ配列およびＴＣ配列からそれぞれ誘発さ
れたシクロブタン型ダイマー（ＣＰＤ）および（６−
４）結合生成物（または「光反応物」）［（６−４）Ｐ
Ｐ］を、特異的に認識し、そしてそれらの５′側で切断
することのできる酵素活性を有する蛋白質が提供され
る。
【００１１】より具体的には、前記蛋白質は、後述する
配列表の配列番号：１のＤＮＡ配列がコード化する蛋白
質またはその誘導体である。本発明の文脈上誘導体とい
う用語は、遺伝的および／または化学的性質の変性によ
って得られ、本発明の目的に沿う活性が保存されている
すべての蛋白質を意味する。遺伝的および／または化学
的性質の変性は、１つまたはそれ以上の残基のいずれか
の突然変異、置換、欠失、付加及び／又は修飾をも意味
すると理解することができる。そのような誘導体として
は、例えば特に蛋白質が作用する部位への親和性を向上
する目的、その生産量の増加または精製の容易化の目
的、プロテアーゼへの耐性の向上または細胞膜貫通の促
進の目的、その他の目的に資するように変性されたもの
を挙げることができる。
配列表の配列番号：１のＤＮＡ配列がコード化する蛋白
質またはその誘導体である。本発明の文脈上誘導体とい
う用語は、遺伝的および／または化学的性質の変性によ
って得られ、本発明の目的に沿う活性が保存されている
すべての蛋白質を意味する。遺伝的および／または化学
的性質の変性は、１つまたはそれ以上の残基のいずれか
の突然変異、置換、欠失、付加及び／又は修飾をも意味
すると理解することができる。そのような誘導体として
は、例えば特に蛋白質が作用する部位への親和性を向上
する目的、その生産量の増加または精製の容易化の目
的、プロテアーゼへの耐性の向上または細胞膜貫通の促
進の目的、その他の目的に資するように変性されたもの
を挙げることができる。
【００１２】従って、本発明の蛋白質は、配列番号：２
に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質それ自体および
それから上述の少なくとも１つの目的に沿って誘導され
た蛋白質である。当業者は、配列番号：２のアミノ酸配
列に基づき、それ自体既知のペプチド合成法により、各
種誘導体を容易に製造できるであろう。また、必要な蛋
白質をコードするヌクレオチド配列を適当な宿主で発現
させ、必要があれば、その後さらに化学的または酵素的
修飾を行って、所望の蛋白質を製造できる。
に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質それ自体および
それから上述の少なくとも１つの目的に沿って誘導され
た蛋白質である。当業者は、配列番号：２のアミノ酸配
列に基づき、それ自体既知のペプチド合成法により、各
種誘導体を容易に製造できるであろう。また、必要な蛋
白質をコードするヌクレオチド配列を適当な宿主で発現
させ、必要があれば、その後さらに化学的または酵素的
修飾を行って、所望の蛋白質を製造できる。
【００１３】本発明はまた、遺伝子組換え法による前記
蛋白質の製造方法も提供する。より具体的には、前記蛋
白質のいずれか１種をコードするＤＮＡを発現できる状
態で含む宿主細胞を、栄養培地で培養し、前記ＤＮＡの
発現によって産生した蛋白質を採取する工程を含んでな
る方法が提供される。
蛋白質の製造方法も提供する。より具体的には、前記蛋
白質のいずれか１種をコードするＤＮＡを発現できる状
態で含む宿主細胞を、栄養培地で培養し、前記ＤＮＡの
発現によって産生した蛋白質を採取する工程を含んでな
る方法が提供される。
【００１４】「ＤＮＡを発現できる状態」とは、目的の
ＤＮＡが自律複製できるベクターに組み込まれ、しかも
それを発現させるシグナルの制御下に置かれたような状
態をいう。ここでいう、シグナルとは、プロモーター、
ターミネーター、分泌のためのリーダー配列等を包含す
るが、これらは用いる宿主細胞の種類に従って任意に選
ぶことができる。
ＤＮＡが自律複製できるベクターに組み込まれ、しかも
それを発現させるシグナルの制御下に置かれたような状
態をいう。ここでいう、シグナルとは、プロモーター、
ターミネーター、分泌のためのリーダー配列等を包含す
るが、これらは用いる宿主細胞の種類に従って任意に選
ぶことができる。
【００１５】さらに、前記ＤＮＡはベクタープラスミド
の一部を形成することができ、こうして構築されたベク
タープラスミドも本発明の一態様である。
の一部を形成することができ、こうして構築されたベク
タープラスミドも本発明の一態様である。
【００１６】ベクターは自律複製性又は組込み複製性で
あることができる。さらに具体的には、自律複製性のベ
クターは選ばれた宿主における自律複製の配列を用いて
製造することができる。組込みベクターについては、例
えば宿主ゲノムのある領域と相同の配列を用いることに
より製造することができ、相同的組み換えによるベクタ
ープラスミドの組込みを可能にする。組換え技法による
本発明の蛋白質の製造に用いることができる宿主は真核
細胞または原核細胞である。適した真核宿主として動物
細胞、酵母または細菌を挙げることができる。特に挙げ
ることができる酵母はサッカロミセス（Saccharomyce
s）またはクルイベロミセス（Kluyveromyces）属等に属
する酵母である。挙げることができる動物細胞は細胞Ｃ
ＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７などである。菌の中でさらに特
定するとアスペルギルス（Aspergillus）またはトリコ
デルマ種（Trichoderma）属等に属するものを挙げるこ
とができる。原核細胞としては、大腸菌（E. coli）、
バシルス（Bacillus）等を用いるのが好ましい。
あることができる。さらに具体的には、自律複製性のベ
クターは選ばれた宿主における自律複製の配列を用いて
製造することができる。組込みベクターについては、例
えば宿主ゲノムのある領域と相同の配列を用いることに
より製造することができ、相同的組み換えによるベクタ
ープラスミドの組込みを可能にする。組換え技法による
本発明の蛋白質の製造に用いることができる宿主は真核
細胞または原核細胞である。適した真核宿主として動物
細胞、酵母または細菌を挙げることができる。特に挙げ
ることができる酵母はサッカロミセス（Saccharomyce
s）またはクルイベロミセス（Kluyveromyces）属等に属
する酵母である。挙げることができる動物細胞は細胞Ｃ
ＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７などである。菌の中でさらに特
定するとアスペルギルス（Aspergillus）またはトリコ
デルマ種（Trichoderma）属等に属するものを挙げるこ
とができる。原核細胞としては、大腸菌（E. coli）、
バシルス（Bacillus）等を用いるのが好ましい。
【００１７】こうして、本発明の蛋白質は大量生産する
ことが可能である。
ことが可能である。
【００１８】本発明の実体およびその作用効果の理解を
より容易にするため、以下に、配列番号：１で示される
本発明のＤＮＡを例に添付図面を参照しながらさらに説
明を加える。
より容易にするため、以下に、配列番号：１で示される
本発明のＤＮＡを例に添付図面を参照しながらさらに説
明を加える。
【００１９】大腸菌ＳＹ２株のＵＶ感受性を補足するＮ
ｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ｃＤＮＡライブラリ
ーからの遺伝子のクローニング 野生型Ｎ. ｃｒａｓｓａのｃＤＮＡライブラリーを修復
欠失Ｅ. ｃｏｌｉ ＳＹ２株に導入し、プラスミド（ｐ
ＵＶＧ３１）を含むＵＶ耐性形質転換体を得る。このプ
ラスミドは、ＳＹ２だけでなく、他のＥ. ｃｏｌｉ宿主
のＵＶ耐性を向上させた（図１）。ｐＵＶＧ３１中の
２.４ｋｂインサートのヌクレオチド配列を決定する。
開始コドンは前記ｃＤＮＡの５′側に配置されるゲノム
フラグメントの配列決定によって確認された（アクセス
番号：Ｄ１１３９２）。前記配置は１９６８塩基の読み
取り枠（ＯＲＦ）を含む。堆定アミノ酸配列は、既に報
告されているＴ４ｅｎｄｏを始めとするＤＮＡ修復酵素
のいずれとも異なる７４,４２１Ｍｒの蛋白質である
（図２、配列番号：２）。
ｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ｃＤＮＡライブラリ
ーからの遺伝子のクローニング 野生型Ｎ. ｃｒａｓｓａのｃＤＮＡライブラリーを修復
欠失Ｅ. ｃｏｌｉ ＳＹ２株に導入し、プラスミド（ｐ
ＵＶＧ３１）を含むＵＶ耐性形質転換体を得る。このプ
ラスミドは、ＳＹ２だけでなく、他のＥ. ｃｏｌｉ宿主
のＵＶ耐性を向上させた（図１）。ｐＵＶＧ３１中の
２.４ｋｂインサートのヌクレオチド配列を決定する。
開始コドンは前記ｃＤＮＡの５′側に配置されるゲノム
フラグメントの配列決定によって確認された（アクセス
番号：Ｄ１１３９２）。前記配置は１９６８塩基の読み
取り枠（ＯＲＦ）を含む。堆定アミノ酸配列は、既に報
告されているＴ４ｅｎｄｏを始めとするＤＮＡ修復酵素
のいずれとも異なる７４,４２１Ｍｒの蛋白質である
（図２、配列番号：２）。
【００２０】酵母レッド変異株およびヒト色素性乾皮症
細胞系におけるＵＶ感受性の部分補足 他の生物体でのクローン化遺伝子によるＵＶ感受性の補
足性をみるために、酵母プロモーターの後に導入し、各
種のＤＮＡ修復に欠陥のあるサッカロマイセスセレビシ
エを形質転換した。ＮＥＲ遺伝子、ｒａｄ１およびｒａ
ｄ２に欠陥のある２種の変異株、ならびに複製後修復欠
失ｒａｄ１８株を導入プラスミドによってＵＶ耐性細胞
に変換したが、野生型株のＵＶ感受性ではそのトランス
フォーメーションによってＵＶ耐性をわずかに増大した
だけである（図３のａ）。同様に前記ｃＤＮＡを有する
ヒト色素性乾皮症を補足するグループＡ（ＸＰＡ）細胞
は、ヘラ（Hela）細胞のほぼ半分までＵＶ耐性を獲得し
た（図３のｂ）。ＨｅＬａ細胞のＵＶ耐性は、前記プラ
スミドの導入によって影響を受けなかった。従って、ク
ローン化遺伝子は多様な種に由来するＤＮＡ修復欠失細
胞の耐性を高める。このことは、前記ＯＲＦが細胞の他
の蛋白質と独立して作用して、ＵＶ損傷の修復を開始す
るファクターをコードすることを示唆している。
細胞系におけるＵＶ感受性の部分補足 他の生物体でのクローン化遺伝子によるＵＶ感受性の補
足性をみるために、酵母プロモーターの後に導入し、各
種のＤＮＡ修復に欠陥のあるサッカロマイセスセレビシ
エを形質転換した。ＮＥＲ遺伝子、ｒａｄ１およびｒａ
ｄ２に欠陥のある２種の変異株、ならびに複製後修復欠
失ｒａｄ１８株を導入プラスミドによってＵＶ耐性細胞
に変換したが、野生型株のＵＶ感受性ではそのトランス
フォーメーションによってＵＶ耐性をわずかに増大した
だけである（図３のａ）。同様に前記ｃＤＮＡを有する
ヒト色素性乾皮症を補足するグループＡ（ＸＰＡ）細胞
は、ヘラ（Hela）細胞のほぼ半分までＵＶ耐性を獲得し
た（図３のｂ）。ＨｅＬａ細胞のＵＶ耐性は、前記プラ
スミドの導入によって影響を受けなかった。従って、ク
ローン化遺伝子は多様な種に由来するＤＮＡ修復欠失細
胞の耐性を高める。このことは、前記ＯＲＦが細胞の他
の蛋白質と独立して作用して、ＵＶ損傷の修復を開始す
るファクターをコードすることを示唆している。
【００２１】クローン化遺伝子とｍｕｓ−１８変異との
関係 クローン化された遺伝子とＮ. ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−
１８変異との関係を調べた。Ｎ. ｃｒａｓｓａのゲノム
ライブラリーに由来する全ｃＤＮＡ領域にわたるＤＮＡ
を単離し、このゲノムフラグメントをｍｕｓ−１８変異
細胞に導入した。２種の形質転換体はＵＶに対して同じ
耐性を示した（図４）。さらに、我々は反復誘導点突然
変異誘発（repeat-enduced point mutation：ＲＩＰ）
を使用して野生型株のｍｕｓ−１８遺伝子を不活化し
た。ＲＩＰは重複ＤＮＡ配列を減数分裂前（premeiotic
ally）に不活化するようなＮ. ｃｒａｓｓａの一般的な
応答を利用する（Selker et al，１９８７，Cell, ５
１，７４１−７５２；Selker and Garrett，１９８８，
Proc. Natl. Acad. Sci USA，８５，６８７０−６８７
４）。野生型細胞とクローン化ゲノム遺伝子で形質転換
した野生型細胞との間の交雑からの２つの子孫はｍｕｓ
−１８変異株と同様なＵＶ感受性を示した（図５）。こ
れらのクローン中では内因性遺伝子と導入ｍｕｓ−１８
遺伝子のどちらもＲＩＰによって不活化されたことを示
す。最後に、野生型とｍｕｓ−１８変異株のゲノムＤＮ
Ａのサザンハイブリダイゼーション分析は、変異株ゲノ
ムに欠失を含む変化を示す（図６）。これらの結果か
ら、前記クローン化された遺伝子はＮ. ｃｒａｓｓａ変
異株ｍｕｓ−１８中で欠失しているものとの結論を出し
た。我々はクローン化された遺伝子をｍｕｓ−１８遺伝
子と称する。
関係 クローン化された遺伝子とＮ. ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−
１８変異との関係を調べた。Ｎ. ｃｒａｓｓａのゲノム
ライブラリーに由来する全ｃＤＮＡ領域にわたるＤＮＡ
を単離し、このゲノムフラグメントをｍｕｓ−１８変異
細胞に導入した。２種の形質転換体はＵＶに対して同じ
耐性を示した（図４）。さらに、我々は反復誘導点突然
変異誘発（repeat-enduced point mutation：ＲＩＰ）
を使用して野生型株のｍｕｓ−１８遺伝子を不活化し
た。ＲＩＰは重複ＤＮＡ配列を減数分裂前（premeiotic
ally）に不活化するようなＮ. ｃｒａｓｓａの一般的な
応答を利用する（Selker et al，１９８７，Cell, ５
１，７４１−７５２；Selker and Garrett，１９８８，
Proc. Natl. Acad. Sci USA，８５，６８７０−６８７
４）。野生型細胞とクローン化ゲノム遺伝子で形質転換
した野生型細胞との間の交雑からの２つの子孫はｍｕｓ
−１８変異株と同様なＵＶ感受性を示した（図５）。こ
れらのクローン中では内因性遺伝子と導入ｍｕｓ−１８
遺伝子のどちらもＲＩＰによって不活化されたことを示
す。最後に、野生型とｍｕｓ−１８変異株のゲノムＤＮ
Ａのサザンハイブリダイゼーション分析は、変異株ゲノ
ムに欠失を含む変化を示す（図６）。これらの結果か
ら、前記クローン化された遺伝子はＮ. ｃｒａｓｓａ変
異株ｍｕｓ−１８中で欠失しているものとの結論を出し
た。我々はクローン化された遺伝子をｍｕｓ−１８遺伝
子と称する。
【００２２】Ｅ. ｃｏｌｉからのｍｕｓ−１８蛋白質の
精製 ８個のアミノ酸残基をコードする標識（tag）を３′末
端でｍｕｓ−１８遺伝子に融合させ、修復欠失ＳＹ２宿
主細胞で発現させた。この組換え遺伝子は前記宿主に標
識をもたない遺伝子と同等のＵＶ耐性を付与した。組換
え蛋白質を、標識に対する抗体を利用し、そしてＵＶ照
射プラスミドに対するニック（切断）活性を指標に精製
した。クローン化ｃＤＮＡのＯＲＦにおける堆定アミノ
酸配列は連続するヒスチジン配列を数ケ所含んでる。従
って、まず、細胞抽出物をＮｉ2+ニトリロ三酢酸（Ｎｉ
−ＮＴＡ）アガロースカラムにかけた。次いで、ホスホ
セルロース、さらにヘパリンセファロースのアフィニテ
ィークロマトグラフィーで精製した。ＵＶ照射プラスミ
ドに対してニック活性を有する画分のＳＤＳ−ゲル電気
泳動を図７のａとｂに示す。ベクタープラスミドで形質
転換された細胞由来の同様な溶離画分は、このような活
性を示さなかった（図７のａ）。ゲル電気泳動から判断
すると、最終的な画分は９５％を超える純度であった。
ＦＬＡＧに対する抗体は図７のｃに示される約７４ＫＤ
の精製蛋白質を認識した。こうして、ｍｕｓ−１８だけ
の遺伝子産物がＵＶ照射ＤＮＡにニックを導入するもの
と判断した。精製蛋白質はＵＶ照射プラスミドに対する
ニック反応に際してＭｇ++だけでなくＡＴＰも必要とす
る（図７のｄ）。
精製 ８個のアミノ酸残基をコードする標識（tag）を３′末
端でｍｕｓ−１８遺伝子に融合させ、修復欠失ＳＹ２宿
主細胞で発現させた。この組換え遺伝子は前記宿主に標
識をもたない遺伝子と同等のＵＶ耐性を付与した。組換
え蛋白質を、標識に対する抗体を利用し、そしてＵＶ照
射プラスミドに対するニック（切断）活性を指標に精製
した。クローン化ｃＤＮＡのＯＲＦにおける堆定アミノ
酸配列は連続するヒスチジン配列を数ケ所含んでる。従
って、まず、細胞抽出物をＮｉ2+ニトリロ三酢酸（Ｎｉ
−ＮＴＡ）アガロースカラムにかけた。次いで、ホスホ
セルロース、さらにヘパリンセファロースのアフィニテ
ィークロマトグラフィーで精製した。ＵＶ照射プラスミ
ドに対してニック活性を有する画分のＳＤＳ−ゲル電気
泳動を図７のａとｂに示す。ベクタープラスミドで形質
転換された細胞由来の同様な溶離画分は、このような活
性を示さなかった（図７のａ）。ゲル電気泳動から判断
すると、最終的な画分は９５％を超える純度であった。
ＦＬＡＧに対する抗体は図７のｃに示される約７４ＫＤ
の精製蛋白質を認識した。こうして、ｍｕｓ−１８だけ
の遺伝子産物がＵＶ照射ＤＮＡにニックを導入するもの
と判断した。精製蛋白質はＵＶ照射プラスミドに対する
ニック反応に際してＭｇ++だけでなくＡＴＰも必要とす
る（図７のｄ）。
【００２３】ＵＶ照射プラスミドおよび合成オリゴヌク
レオチドにおける精製ｍｕｓ−１８蛋白質の基質および
ニック活性部位の決定 ｍｕｓ −１８蛋白質（Ｍｕｓ−１８）によって切断（ニ
ック）されるヌクレオチド配列を同定する目的で、Ｍｕ
ｓ−１８により線状化プラスミドを処理した。このプラ
スミドがＵＶを照射されている場合に限って前記蛋白質
はニック（切れ目）を導入した（図８）。Ｍｕｓ−１８
によるＵＶ照射ＤＮＡの処理によってＴＣ、ＴＴ、ＣＣ
およびＣＴ配列において異なる濃度のＤＮＡバンドを形
成した。図８のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡ
ＧＥ）でのＤＮＡフラグメントの移動速度を見ると、Ｍ
ｕｓ−１８により生成したものは、配列マーカーより遅
く移動している。矢印ａおよびｂによって示されるＴＣ
およびＴＴ配列のバンドの位置は、ＰＡＧＥの上部にお
けるジピリミジン配列マーカーの最初のヌクレオチド配
列付近にあり、そしてｃおよびｄにより示されるＰＡＧ
Ｅの下部における二番目のヌクレオチドより後ろにあ
る。これは、化学的な塩基の分解で得られた３′リン酸
を有するＤＮＡとは対照的に、Ｍｕｓ−１８は前記ジピ
リミジンの５′に隣接した部位でＤＮＡを切断し、３′
−ＯＨを放出させることを意味する。
レオチドにおける精製ｍｕｓ−１８蛋白質の基質および
ニック活性部位の決定 ｍｕｓ −１８蛋白質（Ｍｕｓ−１８）によって切断（ニ
ック）されるヌクレオチド配列を同定する目的で、Ｍｕ
ｓ−１８により線状化プラスミドを処理した。このプラ
スミドがＵＶを照射されている場合に限って前記蛋白質
はニック（切れ目）を導入した（図８）。Ｍｕｓ−１８
によるＵＶ照射ＤＮＡの処理によってＴＣ、ＴＴ、ＣＣ
およびＣＴ配列において異なる濃度のＤＮＡバンドを形
成した。図８のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡ
ＧＥ）でのＤＮＡフラグメントの移動速度を見ると、Ｍ
ｕｓ−１８により生成したものは、配列マーカーより遅
く移動している。矢印ａおよびｂによって示されるＴＣ
およびＴＴ配列のバンドの位置は、ＰＡＧＥの上部にお
けるジピリミジン配列マーカーの最初のヌクレオチド配
列付近にあり、そしてｃおよびｄにより示されるＰＡＧ
Ｅの下部における二番目のヌクレオチドより後ろにあ
る。これは、化学的な塩基の分解で得られた３′リン酸
を有するＤＮＡとは対照的に、Ｍｕｓ−１８は前記ジピ
リミジンの５′に隣接した部位でＤＮＡを切断し、３′
−ＯＨを放出させることを意味する。
【００２４】Ｍｕｓ−１８によって切断されたＤＮＡの
損傷を同定し、損傷を受けた部位へどのようにニック
（切れ目）が導入されるかを分析するために、ＴＣとＴ
Ｔの２種のジピリミジン配列だけを含む５４ｍｅｒの合
成オリゴヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで使用
した。標識プラスミドで得られた上記結果を考慮する
と、ＮｓｉＩおよびＮｌａＩＩＩの２種の制限酵素に対
する開裂部位が、それぞれＴＣおよびＴＴ配列の５′に
隣接した位置に導入されている。５′または３′末端で
標識されそしてその相補オリゴヌクレオチドとアニール
するこのオリゴヌクレオチドが、ＵＶ照射後Ｍｕｓ−１
８に対する基質として使用された。５′末端標識ＤＮＡ
（Ｍｕｓ−１８によりＴＣまたはＴＴ部位にニックを入
れた）は、Ｔ４ｅｎｄｏで開裂したものより早く泳動し
た（図９のｂ、レーン１および２）。（６−４）ＰＰま
たはＣＰＤに対するフォトリアーゼを用いるＰＨＲは、
それぞれＴＣ（レーン３）またはＴＴ（レーン５）にお
けるバンドを殆ど消失するが、Ｔ４ｅｎｄｏによって生
成したバンドはＣＰＤに対するフォトリアーゼを用いる
ＰＨＲによって完全に消失した（レーン６）。Ｍｕｓ−
１８で切断された３′末端標識ＤＮＡは、Ｔ４ｅｎｄｏ
で切断されたものよりわずかに遅く泳動した（図９の
ｃ、レーン１および２）。これは５′末端標識ＤＮＡを
用いて得られたものに相当し、Ｍｕｓ−１８がＴ４ｅｎ
ｄｏで切断された部位の５′部位で単一のニックを導入
することを示す。
損傷を同定し、損傷を受けた部位へどのようにニック
（切れ目）が導入されるかを分析するために、ＴＣとＴ
Ｔの２種のジピリミジン配列だけを含む５４ｍｅｒの合
成オリゴヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで使用
した。標識プラスミドで得られた上記結果を考慮する
と、ＮｓｉＩおよびＮｌａＩＩＩの２種の制限酵素に対
する開裂部位が、それぞれＴＣおよびＴＴ配列の５′に
隣接した位置に導入されている。５′または３′末端で
標識されそしてその相補オリゴヌクレオチドとアニール
するこのオリゴヌクレオチドが、ＵＶ照射後Ｍｕｓ−１
８に対する基質として使用された。５′末端標識ＤＮＡ
（Ｍｕｓ−１８によりＴＣまたはＴＴ部位にニックを入
れた）は、Ｔ４ｅｎｄｏで開裂したものより早く泳動し
た（図９のｂ、レーン１および２）。（６−４）ＰＰま
たはＣＰＤに対するフォトリアーゼを用いるＰＨＲは、
それぞれＴＣ（レーン３）またはＴＴ（レーン５）にお
けるバンドを殆ど消失するが、Ｔ４ｅｎｄｏによって生
成したバンドはＣＰＤに対するフォトリアーゼを用いる
ＰＨＲによって完全に消失した（レーン６）。Ｍｕｓ−
１８で切断された３′末端標識ＤＮＡは、Ｔ４ｅｎｄｏ
で切断されたものよりわずかに遅く泳動した（図９の
ｃ、レーン１および２）。これは５′末端標識ＤＮＡを
用いて得られたものに相当し、Ｍｕｓ−１８がＴ４ｅｎ
ｄｏで切断された部位の５′部位で単一のニックを導入
することを示す。
【００２５】図９のｄは、ＴＣまたはＴＴ配列でＭｕｓ
−１８により切断された５′末端ＤＮＡが、ＮｓｉＩま
たはＮｌａＩＩＩによる消化後に生じたものと、それぞ
れ同じ位置まで泳動した（レーン１〜３）。切断された
ＤＮＡはｄｄＴＴＰと共に末端デオキシトランスフェラ
ーゼに対する基質として働き、追加のヌクレオチドをも
たらし（レーン４〜６）、３′ＯＨ末端の存在を示す。
３′標識されそしてＭｕｓ−１８切断ＤＮＡフラグメン
トの移動度も前記制限酵素により生成されたものと同じ
であった（図９のｃ、レーン１〜３）。ウシ腸フォスフ
ァターゼ（ＣＩＰ）により切断されたＤＮＡの後処理は
すべてのＤＮＡの移動をわずかに遅らせた。Ｍｕｓ−１
８により切断されたＤＮＡの５′末端にリン酸が存在す
ることを示す。
−１８により切断された５′末端ＤＮＡが、ＮｓｉＩま
たはＮｌａＩＩＩによる消化後に生じたものと、それぞ
れ同じ位置まで泳動した（レーン１〜３）。切断された
ＤＮＡはｄｄＴＴＰと共に末端デオキシトランスフェラ
ーゼに対する基質として働き、追加のヌクレオチドをも
たらし（レーン４〜６）、３′ＯＨ末端の存在を示す。
３′標識されそしてＭｕｓ−１８切断ＤＮＡフラグメン
トの移動度も前記制限酵素により生成されたものと同じ
であった（図９のｃ、レーン１〜３）。ウシ腸フォスフ
ァターゼ（ＣＩＰ）により切断されたＤＮＡの後処理は
すべてのＤＮＡの移動をわずかに遅らせた。Ｍｕｓ−１
８により切断されたＤＮＡの５′末端にリン酸が存在す
ることを示す。
【００２６】Ｎ. ｃｒａｓｓａ ＵＶ感受性変異株にお
けるｍｕｓ−１８遺伝子と突然変異 上述のように、Ｎ. ｃｒａｓｓａ由来のｃＤＮＡライブ
ラリーとＵＶ感受性Ｅ. ｃｏｌｉの補足性により、新規
な真核ＤＮＡ修復遺伝子が単離された。ｍｕｓ−１８遺
伝子は高度に親水性のカルボキシ末端を有する蛋白質を
コード化する。特に興味深いのは、図２の下線を引いた
太字で示される配列４ｘＬｙｓ−２ｘＧｌｙ−２ｘ（Ｌ
ｙｓ Ａｒｇ）である。この配列は、ＤＮＡと密接に相
互作用するペプチドであるプロタミンのカルボキシ末端
で見い出された配列［ニジマスのプロタミンＩＡにおけ
る６ｘＡｒｇ−２ｘＧｌｙ−４ｘＡｒｇ（Ando and Wat
anabe,１９６９，Int. J. Protein Res.,１，２２１−
２２４）］に類似する。この配列中に各種の欠失を伴う
ｍｕｓ−１８遺伝子は、Ｅ. ｃｏｌｉ ＳＹ２宿主細胞
のＵＶ感受性の補足活性に影響を及ぼし、遺伝子産物の
酵素的機能においてその配列が重要な役割を担うことを
示唆する。
けるｍｕｓ−１８遺伝子と突然変異 上述のように、Ｎ. ｃｒａｓｓａ由来のｃＤＮＡライブ
ラリーとＵＶ感受性Ｅ. ｃｏｌｉの補足性により、新規
な真核ＤＮＡ修復遺伝子が単離された。ｍｕｓ−１８遺
伝子は高度に親水性のカルボキシ末端を有する蛋白質を
コード化する。特に興味深いのは、図２の下線を引いた
太字で示される配列４ｘＬｙｓ−２ｘＧｌｙ−２ｘ（Ｌ
ｙｓ Ａｒｇ）である。この配列は、ＤＮＡと密接に相
互作用するペプチドであるプロタミンのカルボキシ末端
で見い出された配列［ニジマスのプロタミンＩＡにおけ
る６ｘＡｒｇ−２ｘＧｌｙ−４ｘＡｒｇ（Ando and Wat
anabe,１９６９，Int. J. Protein Res.,１，２２１−
２２４）］に類似する。この配列中に各種の欠失を伴う
ｍｕｓ−１８遺伝子は、Ｅ. ｃｏｌｉ ＳＹ２宿主細胞
のＵＶ感受性の補足活性に影響を及ぼし、遺伝子産物の
酵素的機能においてその配列が重要な役割を担うことを
示唆する。
【００２７】Ｎ. ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−１８変異株に
おける変異を以下の３種の方法で同定した。一つは、野
生型遺伝子（ＲＩＰ）の導入によるｍｕｓ−１８株にお
けるＵＶ感受性の補足性であり、もう一つは、野生型Ｄ
ＮＡと変異ゲノムＤＮＡを用いるサザン分析の比較であ
る。サザン分析から、その変異はｍｕｓ−１８遺伝子を
含有するゲノムフラグメントの一部に欠失を伴うことが
わかる。
おける変異を以下の３種の方法で同定した。一つは、野
生型遺伝子（ＲＩＰ）の導入によるｍｕｓ−１８株にお
けるＵＶ感受性の補足性であり、もう一つは、野生型Ｄ
ＮＡと変異ゲノムＤＮＡを用いるサザン分析の比較であ
る。サザン分析から、その変異はｍｕｓ−１８遺伝子を
含有するゲノムフラグメントの一部に欠失を伴うことが
わかる。
【００２８】精製Ｍｕｓ−１８により生じるニック ｍｕｓ −１８遺伝子は、ＣＰＤと（６−４）ＰＰの両者
に対してニック活性を有する蛋白質をコード化する。Ｍ
ｕｓ−１８は、ＵＶ誘発ＣＰＤおよび（６−４）ＰＰに
隣接した５′位にニックを導入し、損傷を有するＤＮＡ
鎖の一本鎖の破壊をもたらすことを示す（図１０）。Ｍ
ｕｓ−１８の基質はＴＴ、ＴＣ、ＣＣおよびＣＴ配列に
おいて生じたピリミジンダイマー類を包含する。図８に
示されるニックバンドの強度変化は、ＵＶによる損傷の
程度の相違および／またはＭｕｓ−１８による修復の選
択性の相違に起因すると思われる。高ＵＶ用量（３ｋＪ
／ｍ2）をそれぞれ前記プラスミドおよびオリゴヌクレ
オチドに照射するとＴＣ配列において比較的多量の（６
−４）ＰＰを生成する。ＤＮＡに低用量のＵＶ照射を行
った後、前記蛋白質によってＴＴ部位が優先的に切断さ
れる。前記蛋白質によるＵＶ誘導ダイマー類間のニック
活性の優先性は確認していないが、ＣＰＤと（６−４）
ＰＰ間で前記蛋白質による認識に差があるものと思われ
る。チミン−チミンダイマーにおけるニックの導入のた
めには、種々の鎖長の合成ＤＮＡを用いた分析から判断
すると、Ｍｕｓ−１８は（６−４）ＰＰに対するよりも
損傷に対してより長いフランキング配列を必要とする。
これは、Ｍｕｓ−１８は異なる化学構造をもつ各種のＵ
Ｖ誘導ダイマーをどの程度まで認識するか、ということ
が次の解明すべき問題点となることを示唆する。
に対してニック活性を有する蛋白質をコード化する。Ｍ
ｕｓ−１８は、ＵＶ誘発ＣＰＤおよび（６−４）ＰＰに
隣接した５′位にニックを導入し、損傷を有するＤＮＡ
鎖の一本鎖の破壊をもたらすことを示す（図１０）。Ｍ
ｕｓ−１８の基質はＴＴ、ＴＣ、ＣＣおよびＣＴ配列に
おいて生じたピリミジンダイマー類を包含する。図８に
示されるニックバンドの強度変化は、ＵＶによる損傷の
程度の相違および／またはＭｕｓ−１８による修復の選
択性の相違に起因すると思われる。高ＵＶ用量（３ｋＪ
／ｍ2）をそれぞれ前記プラスミドおよびオリゴヌクレ
オチドに照射するとＴＣ配列において比較的多量の（６
−４）ＰＰを生成する。ＤＮＡに低用量のＵＶ照射を行
った後、前記蛋白質によってＴＴ部位が優先的に切断さ
れる。前記蛋白質によるＵＶ誘導ダイマー類間のニック
活性の優先性は確認していないが、ＣＰＤと（６−４）
ＰＰ間で前記蛋白質による認識に差があるものと思われ
る。チミン−チミンダイマーにおけるニックの導入のた
めには、種々の鎖長の合成ＤＮＡを用いた分析から判断
すると、Ｍｕｓ−１８は（６−４）ＰＰに対するよりも
損傷に対してより長いフランキング配列を必要とする。
これは、Ｍｕｓ−１８は異なる化学構造をもつ各種のＵ
Ｖ誘導ダイマーをどの程度まで認識するか、ということ
が次の解明すべき問題点となることを示唆する。
【００２９】ｍｕｓ−１８遺伝子による宿主細胞におけ
るＵＶ感受性の補足 Ｍｕｓ−１８の研究から生じる他の興味ある問題点は、
どの程度のニック部位が細胞中でその後処理されるかに
ある。大腸菌、酵母およびヒト細胞に導入されたｍｕｓ
−１８遺伝は、これらの宿主細胞のＵＶ生存率を同じよ
うに高める。この点で、Ｍｕｓ−１８は、酵母ｒａｄ突
然変異体およびヒトＸＰ細胞にＵＶ耐性を付与しうるＴ
４ｅｎｄｏと似ている（Valerie et al.,１９８６，Mol
e. Cell.Biol.，６，３５５９−３５６２）。各種の修
復欠失宿主細胞におけるＵＶ感受性補足は、ほんの部分
的であって、野生型細胞のＵＶ耐性には到達しなかっ
た。酵母細胞では、完全なＮＥＲ活性を有する複製後修
復欠損ｒａｄ１８変異株、ならびに２種のＮＥＲ変異株
（ｒａｄ１およびｒａｄ２）［これらはそれぞれＤＮＡ
損傷の５′および３′位におけるニック活性を欠いてい
る（Bardwell et al.,１９９４，Science，265，２０８
２−２０８５；Harrington and Lieber,１９９４，Gene
s Dev., ８，１３４４−１３５５）］は、ｍｕｓ−１８
遺伝子によって同じ程度にＵＶ耐性を高める（図３）。
これらの結果は、これらの生物における切断機構と独立
した修復経路によってさらに処理されることを示唆す
る。
るＵＶ感受性の補足 Ｍｕｓ−１８の研究から生じる他の興味ある問題点は、
どの程度のニック部位が細胞中でその後処理されるかに
ある。大腸菌、酵母およびヒト細胞に導入されたｍｕｓ
−１８遺伝は、これらの宿主細胞のＵＶ生存率を同じよ
うに高める。この点で、Ｍｕｓ−１８は、酵母ｒａｄ突
然変異体およびヒトＸＰ細胞にＵＶ耐性を付与しうるＴ
４ｅｎｄｏと似ている（Valerie et al.,１９８６，Mol
e. Cell.Biol.，６，３５５９−３５６２）。各種の修
復欠失宿主細胞におけるＵＶ感受性補足は、ほんの部分
的であって、野生型細胞のＵＶ耐性には到達しなかっ
た。酵母細胞では、完全なＮＥＲ活性を有する複製後修
復欠損ｒａｄ１８変異株、ならびに２種のＮＥＲ変異株
（ｒａｄ１およびｒａｄ２）［これらはそれぞれＤＮＡ
損傷の５′および３′位におけるニック活性を欠いてい
る（Bardwell et al.,１９９４，Science，265，２０８
２−２０８５；Harrington and Lieber,１９９４，Gene
s Dev., ８，１３４４−１３５５）］は、ｍｕｓ−１８
遺伝子によって同じ程度にＵＶ耐性を高める（図３）。
これらの結果は、これらの生物における切断機構と独立
した修復経路によってさらに処理されることを示唆す
る。
【００３０】Ｍｕｓ−１８の役割とその分布 本発明者らが分析した限りでは、ＵＶ誘発損傷以外のＤ
ＮＡ損傷部にＭｕｓ−１８がニックを導入するとの根拠
は得られなかった。これはＵＶに選択的な感受性である
ｍｕｓ−１８変異株の表現型とよく一致する。Ｎ. ｃｒ
ａｓｓａは存在するとしてもＵＶ損傷に対して非常に効
率の悪いＮＥＲはもたない。（Ishi etal.,１９９１，M
ol. Gen. Genet.，２２８，３３−３９）。従って、こ
の生物体では、ｍｕｓ−１８遺伝子がＵＶ誘発損傷、特
に（６−４）ＰＰに対するＮＥＲに代って働く可能性が
ある（下記参照）。最近、ＮＥＲの完全に欠失したスキ
ゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccharomyces pomb
e）は、ＤＮＡ中のＣＰＤおよび（６−４）光化学反応
物の相当な修復能を依然として維持していることが報告
された（MaCready et al.,１９９３，Mol. Microbio
l.，１０，８８５−８９０）。より最近になって、Ｓ.
ｐｏｍｂｅの細胞抽出物の酵素活性がＭｕｓ−１８と同
様な様式でＴＴおよびＴＣダイマーにニックを導入する
ことが報告された（Bowman et al.,１９９４，Nucleic
Acids Res.，２２，３０２６−３０３２）。非常に効率
よくＣＰＤフォトリアーゼ活性を獲得するＮ. ｃｒａｓ
ｓａ（Yajima et al.,１９９１，Nucleic Acids Res.，
１９，５３５９−５３６２；Ekeret al.,１９９４，Pho
tochem. Photobiol.，６０，１２５−１３３）とは対照
的に、Ｓ. ｐｏｍｂｅはそのような活性をまったくもた
ない（Yasui et al.,１９８９，Mutat. Res.，２１７，
３−１０）ので、Ｍｕｓ−１８の相同蛋白質はＵＶ誘発
ＣＰＤの修復をサポートする可能性がある。従って、Ｍ
ｕｓ−１８とその相同蛋白質は進化上密接な関係を有す
る生物Ｎ. ｃｒａｓｓａとＳ. ｐｏｍｂｅのＵＶ誘発Ｄ
ＮＡ損傷の除去またはＰＨＲの欠損をそれぞれ償うもの
と思われる。同様な酵素が他の生物にも分布している可
能性はある。
ＮＡ損傷部にＭｕｓ−１８がニックを導入するとの根拠
は得られなかった。これはＵＶに選択的な感受性である
ｍｕｓ−１８変異株の表現型とよく一致する。Ｎ. ｃｒ
ａｓｓａは存在するとしてもＵＶ損傷に対して非常に効
率の悪いＮＥＲはもたない。（Ishi etal.,１９９１，M
ol. Gen. Genet.，２２８，３３−３９）。従って、こ
の生物体では、ｍｕｓ−１８遺伝子がＵＶ誘発損傷、特
に（６−４）ＰＰに対するＮＥＲに代って働く可能性が
ある（下記参照）。最近、ＮＥＲの完全に欠失したスキ
ゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccharomyces pomb
e）は、ＤＮＡ中のＣＰＤおよび（６−４）光化学反応
物の相当な修復能を依然として維持していることが報告
された（MaCready et al.,１９９３，Mol. Microbio
l.，１０，８８５−８９０）。より最近になって、Ｓ.
ｐｏｍｂｅの細胞抽出物の酵素活性がＭｕｓ−１８と同
様な様式でＴＴおよびＴＣダイマーにニックを導入する
ことが報告された（Bowman et al.,１９９４，Nucleic
Acids Res.，２２，３０２６−３０３２）。非常に効率
よくＣＰＤフォトリアーゼ活性を獲得するＮ. ｃｒａｓ
ｓａ（Yajima et al.,１９９１，Nucleic Acids Res.，
１９，５３５９−５３６２；Ekeret al.,１９９４，Pho
tochem. Photobiol.，６０，１２５−１３３）とは対照
的に、Ｓ. ｐｏｍｂｅはそのような活性をまったくもた
ない（Yasui et al.,１９８９，Mutat. Res.，２１７，
３−１０）ので、Ｍｕｓ−１８の相同蛋白質はＵＶ誘発
ＣＰＤの修復をサポートする可能性がある。従って、Ｍ
ｕｓ−１８とその相同蛋白質は進化上密接な関係を有す
る生物Ｎ. ｃｒａｓｓａとＳ. ｐｏｍｂｅのＵＶ誘発Ｄ
ＮＡ損傷の除去またはＰＨＲの欠損をそれぞれ償うもの
と思われる。同様な酵素が他の生物にも分布している可
能性はある。
【００３１】ここに、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａのＵＶダイ
マー エンドヌクレアーゼと命名したｍｕｓ−１８の精
製蛋白質は、Ｔ４エンドヌクレアーゼが哺乳類細胞に残
存するＣＰＤの分析に使用されるように、細胞のＵＶ損
傷を同定する道具としても有用であろう。すべてのピリ
ミジン ダイマーまたはＣＰＤフォトリアーゼとの組み
合わせ使用によって、未修復（６−４）ＰＰを同定する
こともできる。
マー エンドヌクレアーゼと命名したｍｕｓ−１８の精
製蛋白質は、Ｔ４エンドヌクレアーゼが哺乳類細胞に残
存するＣＰＤの分析に使用されるように、細胞のＵＶ損
傷を同定する道具としても有用であろう。すべてのピリ
ミジン ダイマーまたはＣＰＤフォトリアーゼとの組み
合わせ使用によって、未修復（６−４）ＰＰを同定する
こともできる。
【００３２】
【実施例】材料および方法 菌株および細胞系 発現のために、Ｎ. ｃｒａｓｓａのｃＤＮＡを、Ｅ. ｃ
ｏｌｉ ＳＹ２株（ＪＭ１０７ △ｐｈｒ：：Ｃｍr △ｕ
ｖｒ Ａ：：Ｋｍr △ｒｅｃ Ａ：：Ｙｅｔr）（Yasuhir
a and Yasui,１９９２，J. Biol. Chem.，２６７，２５
６４４−２５６４７）へのクローニングに使用した。Ｓ
Ｙ１株（△ｐｈｒ：：Ｃｍr △ｕｖｒＡ：：Ｋｍr）、
ＫＹ２９（△ｐｈｒ：：Ｃｍr △ｒｅｃ Ａ：：Ｔｅ
ｔr）およびＫＹ２０（△ｐｈｒ：：Ｃｍr）も、クロー
ン化遺伝子で形質転換した。ＫＹ２０およびＫＹ２９
は、K. Yamamoto 博士（東北大理学部）より得た。使用
した酵母サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）は、ＧＲＦ１８（野生型、ｌｅｕ２）、
ｙａ１０３１（ｒａｄ１ ｌｅｕ２）、ｙａ２−２（ｒ
ａｄ２ ｌｅｕ２）およびｙａ１８−１（ｒａｄ１８
ｌｅｕ２）であった。これらの菌株はＧＲＦ（Dr. G.
R. Fink，マサチューセッツ工科大学より得た）以外
は、本発明者らによって樹立された。ＸＰＡ細胞系、Ｘ
Ｐ１２ＲＯＳＶは、Dr. K. Tanaka（大坂大学細胞工学
センター：田中亀代次博士）より得た。
ｏｌｉ ＳＹ２株（ＪＭ１０７ △ｐｈｒ：：Ｃｍr △ｕ
ｖｒ Ａ：：Ｋｍr △ｒｅｃ Ａ：：Ｙｅｔr）（Yasuhir
a and Yasui,１９９２，J. Biol. Chem.，２６７，２５
６４４−２５６４７）へのクローニングに使用した。Ｓ
Ｙ１株（△ｐｈｒ：：Ｃｍr △ｕｖｒＡ：：Ｋｍr）、
ＫＹ２９（△ｐｈｒ：：Ｃｍr △ｒｅｃ Ａ：：Ｔｅ
ｔr）およびＫＹ２０（△ｐｈｒ：：Ｃｍr）も、クロー
ン化遺伝子で形質転換した。ＫＹ２０およびＫＹ２９
は、K. Yamamoto 博士（東北大理学部）より得た。使用
した酵母サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）は、ＧＲＦ１８（野生型、ｌｅｕ２）、
ｙａ１０３１（ｒａｄ１ ｌｅｕ２）、ｙａ２−２（ｒ
ａｄ２ ｌｅｕ２）およびｙａ１８−１（ｒａｄ１８
ｌｅｕ２）であった。これらの菌株はＧＲＦ（Dr. G.
R. Fink，マサチューセッツ工科大学より得た）以外
は、本発明者らによって樹立された。ＸＰＡ細胞系、Ｘ
Ｐ１２ＲＯＳＶは、Dr. K. Tanaka（大坂大学細胞工学
センター：田中亀代次博士）より得た。
【００３３】ｃＤＮＡおよびゲノムのライブラリー ラムダＺＡＰ（Orbach et al.,１９９０，J. Biol. Che
m.，２６５，１０９８１−１０９８７）に構築された
Ｎ. ｃｒａｓｓａのｃＤＮＡライブラリーは、Dr. M.
S. Sachs上記文献を参照のことより入手した。Ｅ. ｃｏ
ｌｉ用発現ライブラリーにｉｎ ｖｉｔｒｏ切断によっ
て転換した。ゲノムライブラリーは、λ ＥＭＢＬ３に
Ｅｃｏ ＲＩ消化ＤＮＡを導入することにより野生型Ｎ.
ｃｒａｓｓａから作製した。
m.，２６５，１０９８１−１０９８７）に構築された
Ｎ. ｃｒａｓｓａのｃＤＮＡライブラリーは、Dr. M.
S. Sachs上記文献を参照のことより入手した。Ｅ. ｃｏ
ｌｉ用発現ライブラリーにｉｎ ｖｉｔｒｏ切断によっ
て転換した。ゲノムライブラリーは、λ ＥＭＢＬ３に
Ｅｃｏ ＲＩ消化ＤＮＡを導入することにより野生型Ｎ.
ｃｒａｓｓａから作製した。
【００３４】Ｎ. ｃｒａｓｓａ ｃＤＮＡおよびゲノム
ＤＮＡのクローニングおよび配列決定 ＳＹ２細胞における相補性によるフォトリアーゼ遺伝子
の単離方法（Yasuhiraおよび Yasui,１９９２，J. Bio
l. Chem.，２６７，２５６４４−２５６４７）を改良し
て使用した。既述すれば、ｃＤＮＡライブラリーで形質
転換したＳＹ２細胞の一昼夜培養物１００μｌを、４種
の抗生物質（アンピシリン、カナマイシン、クロムフェ
ニコールおよびテトラサイクリン）を含むＬＢプレート
上で０.１Ｊ／ｍ2の用量でＵＶ照射し、一昼夜インキュ
ベートした。生存しているコロニーを、抗生物質添加Ｌ
Ｂ培地中に集め、さらに培養した。細胞懸濁液をＬＢプ
レートに塗布し、さらなるＵＶ照射に供した。３度の選
択後、数個の生存コロニーを、ＵＶ耐性について試験し
た。
ＤＮＡのクローニングおよび配列決定 ＳＹ２細胞における相補性によるフォトリアーゼ遺伝子
の単離方法（Yasuhiraおよび Yasui,１９９２，J. Bio
l. Chem.，２６７，２５６４４−２５６４７）を改良し
て使用した。既述すれば、ｃＤＮＡライブラリーで形質
転換したＳＹ２細胞の一昼夜培養物１００μｌを、４種
の抗生物質（アンピシリン、カナマイシン、クロムフェ
ニコールおよびテトラサイクリン）を含むＬＢプレート
上で０.１Ｊ／ｍ2の用量でＵＶ照射し、一昼夜インキュ
ベートした。生存しているコロニーを、抗生物質添加Ｌ
Ｂ培地中に集め、さらに培養した。細胞懸濁液をＬＢプ
レートに塗布し、さらなるＵＶ照射に供した。３度の選
択後、数個の生存コロニーを、ＵＶ耐性について試験し
た。
【００３５】クローン化ｃＤＮＡプローブでゲノムライ
ブラリーをスクリーニングし、クローン化ｃＤＮＡの全
配列を含む４.７ｋｂ Ｅｃｏ ＲＩフラグメントを単離
した。２４２２ｂｐを含む完全ｃＤＮＡとＯＲＦの上流
配列を含む１ｋｂ鎖長にゲノムフラグメントのヌクレオ
チド配列を決定した。
ブラリーをスクリーニングし、クローン化ｃＤＮＡの全
配列を含む４.７ｋｂ Ｅｃｏ ＲＩフラグメントを単離
した。２４２２ｂｐを含む完全ｃＤＮＡとＯＲＦの上流
配列を含む１ｋｂ鎖長にゲノムフラグメントのヌクレオ
チド配列を決定した。
【００３６】大腸菌、酵母およびヒトＸＰＡ細胞系にお
けるクローン化遺伝子の発現のためのプラスミドの構築
およびトランスフォーメーション Ｅ. ｃｏｌｉでのｍｕｓ−１８遺伝子の発現のために、
前記クローン化ｃＤＮＡ由来のコーディング配列をｐＫ
Ｋ２３３−２（Pharmacia）のｔａｃプロモーターの後
に導入した。
けるクローン化遺伝子の発現のためのプラスミドの構築
およびトランスフォーメーション Ｅ. ｃｏｌｉでのｍｕｓ−１８遺伝子の発現のために、
前記クローン化ｃＤＮＡ由来のコーディング配列をｐＫ
Ｋ２３３−２（Pharmacia）のｔａｃプロモーターの後
に導入した。
【００３７】酵母でのｍｕｓ−１８遺伝子の発現のため
に、ＬＥＵ２選択マーカーを有するｐＫＴ１０プラスミ
ド（Dr. M. Nakafuku，東京大学）のグリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモ
ーターの後に導入した。酵母細胞を Hinnen et al（１
９７８）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７５，１９２９
−１９３３に記載の方法で形質転換した。
に、ＬＥＵ２選択マーカーを有するｐＫＴ１０プラスミ
ド（Dr. M. Nakafuku，東京大学）のグリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモ
ーターの後に導入した。酵母細胞を Hinnen et al（１
９７８）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７５，１９２９
−１９３３に記載の方法で形質転換した。
【００３８】ヒトの細胞で発現するために、ｐｃＤＮＡ
Ｉ（INVITROGEN）のＣＭＶプロモーターの後に導入し
た。Ｇ４１８耐性マーカーを担持するプラスミドと一緒
にＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（GIBCOBRL）によって細胞をト
ランスフェクションした。選択はＧ４１８（WAKO）を用
いて行った。各種用量でのＵＶ照射後のコロニー形成能
を形質転換された大腸菌、酵母およびヒト細胞について
測定した。データは、最低２回の独立した実験の平均値
によった。ｍｕｓ−１８遺伝子産物の精製用として、８
個のアミノ酸残基の標識［ＦＬＡＧ（KODAK）］を停止
コドンの前のコーディング配列の末端へＰＣＲによって
結合した。前記標識を有するｃＤＮＡをｐＫＫＥＮＳ
［ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia）の誘導体］のｔａｃ
プロモーターの後に導入し、ｐＫｍｕｓ−１８ＦＬＡＧ
を得た。
Ｉ（INVITROGEN）のＣＭＶプロモーターの後に導入し
た。Ｇ４１８耐性マーカーを担持するプラスミドと一緒
にＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（GIBCOBRL）によって細胞をト
ランスフェクションした。選択はＧ４１８（WAKO）を用
いて行った。各種用量でのＵＶ照射後のコロニー形成能
を形質転換された大腸菌、酵母およびヒト細胞について
測定した。データは、最低２回の独立した実験の平均値
によった。ｍｕｓ−１８遺伝子産物の精製用として、８
個のアミノ酸残基の標識［ＦＬＡＧ（KODAK）］を停止
コドンの前のコーディング配列の末端へＰＣＲによって
結合した。前記標識を有するｃＤＮＡをｐＫＫＥＮＳ
［ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia）の誘導体］のｔａｃ
プロモーターの後に導入し、ｐＫｍｕｓ−１８ＦＬＡＧ
を得た。
【００３９】Ｎ．ｃｒａｓｓａのトランスフェクション
および反復誘発点突然変異（ＲＩＰ） 全ｍｕｓ−１８遺伝子を担持する４.５ｋｂのＥｃｏ Ｒ
ＩゲノムＤＮＡフラグメントを、ハイグロマイシン耐性
マーカー（ＨｙｇＢ）と結合し、ｍｕｓ−１８変異細胞
に導入した。通常、数コピーのＤＮＡがＮ．ｃｒａｓｓ
ａのゲノム中へ組込まれる。反復誘発点突然変異（ＲＩ
Ｐ）によりｍｕｓ−１８遺伝子を不活化するために、２
つのｍｕｓ−１８遺伝子をもつＮ. ｃｒａｓｓａ野生型
株を逆の接合型を有する野生型株と交雑させた。既に報
告されている方法（Selker and Garrett,１９８８，Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA，８５，６８７０−６８７
４）を使用した。
および反復誘発点突然変異（ＲＩＰ） 全ｍｕｓ−１８遺伝子を担持する４.５ｋｂのＥｃｏ Ｒ
ＩゲノムＤＮＡフラグメントを、ハイグロマイシン耐性
マーカー（ＨｙｇＢ）と結合し、ｍｕｓ−１８変異細胞
に導入した。通常、数コピーのＤＮＡがＮ．ｃｒａｓｓ
ａのゲノム中へ組込まれる。反復誘発点突然変異（ＲＩ
Ｐ）によりｍｕｓ−１８遺伝子を不活化するために、２
つのｍｕｓ−１８遺伝子をもつＮ. ｃｒａｓｓａ野生型
株を逆の接合型を有する野生型株と交雑させた。既に報
告されている方法（Selker and Garrett,１９８８，Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA，８５，６８７０−６８７
４）を使用した。
【００４０】Ｎ．ｃｒａｓｓａの野生型株のおよびｍｕ
ｓ−１８変異株のＤＮＡのサザン分析 野生型株およびｍｕｓ−１８変異株由来のゲノムＤＮＡ
を常法により単離し、制限酵素で消化し、そしてニトロ
セルロースフィルター上にブロットした。ＤＮＡプロー
ブを、Ｅｃｏ ＲＩで消化することにより全ｍｕｓ−１
８遺伝子を含有するクローン化ゲノムＤＮＡから調製し
た。ハイブリダイゼーションは非放射性ＤＮＡ標識化と
検出キット（Boehringer）を用い、製造業者の説明書に
従って行った。
ｓ−１８変異株のＤＮＡのサザン分析 野生型株およびｍｕｓ−１８変異株由来のゲノムＤＮＡ
を常法により単離し、制限酵素で消化し、そしてニトロ
セルロースフィルター上にブロットした。ＤＮＡプロー
ブを、Ｅｃｏ ＲＩで消化することにより全ｍｕｓ−１
８遺伝子を含有するクローン化ゲノムＤＮＡから調製し
た。ハイブリダイゼーションは非放射性ＤＮＡ標識化と
検出キット（Boehringer）を用い、製造業者の説明書に
従って行った。
【００４１】大腸菌宿主細胞からのｍｕｓ−１８遺伝子
産物の精製 ＰＫｍｕｓ−１８ＦＬＡＧまたはベクタープラスミドを
含むＳＹ２細胞を、カルベニシリンを強化したＬＢ培地
１ｌ中のＯＤが０.５になるまで増殖させた。３７℃で
５時間１ｍＭのＩＰＩＧで発現を誘導した後、細胞を音
波処理緩衝液（３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ
Ｈ2ＰＯ4、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームおよび１ｍＭのＰ
ＭＳＦ、ｐＨ８.０）２０ｍｌ中に集め、０℃で５分間
音波処理して崩壊させた。細胞残滓を遠心（４℃、２０
分間４３０００×ｇ）により除去した。粗抽出物を３ｍ
ｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen）カラムにかけ、
０.３ＭのＮａＣｌを含有する１５ｍＭのイミダゾール
から溶出する画分を集めた。この画分をバッファーＡ
（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ７.５および１ｍＭ
のＥＤＴＡ）で希釈しＮａＣｌ濃度を０.２Ｍに調節
し、次いで０.２Ｍ ＮａＣｌ−バッファーＡで平衡化し
たホスホ−セルロースカラム（ベッド容積１.５ｍｌ）
にのせた。Ｍｕｓ−１８は０.３５Ｍ ＮａＣｌ−バッフ
ァーＡで溶離した。次に、その画分を予め０.２Ｍ Ｎａ
Ｃｌ−バッファーＡで平衡化したヘパリンセファロース
カラム（ベッド容積０.３ｍｌ）にのせた。ｍｕｓ−１
８−ＦＬＡＧ蛋白質は、０.４Ｍ ＮａＣｌ−バッファー
Ａで溶離した。９７％均等性を有するｍｕｓ−１８−Ｆ
ＬＡＧ蛋白質７２μｇが得られた（図７のａ）。この精
製蛋白質を−２０℃において２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７.５）、０.５ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭの
ＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ
および４０％グリセロール中で保存し、特記しない限
り、この溶液をすべての実験で使用した。
産物の精製 ＰＫｍｕｓ−１８ＦＬＡＧまたはベクタープラスミドを
含むＳＹ２細胞を、カルベニシリンを強化したＬＢ培地
１ｌ中のＯＤが０.５になるまで増殖させた。３７℃で
５時間１ｍＭのＩＰＩＧで発現を誘導した後、細胞を音
波処理緩衝液（３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ
Ｈ2ＰＯ4、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームおよび１ｍＭのＰ
ＭＳＦ、ｐＨ８.０）２０ｍｌ中に集め、０℃で５分間
音波処理して崩壊させた。細胞残滓を遠心（４℃、２０
分間４３０００×ｇ）により除去した。粗抽出物を３ｍ
ｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen）カラムにかけ、
０.３ＭのＮａＣｌを含有する１５ｍＭのイミダゾール
から溶出する画分を集めた。この画分をバッファーＡ
（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ７.５および１ｍＭ
のＥＤＴＡ）で希釈しＮａＣｌ濃度を０.２Ｍに調節
し、次いで０.２Ｍ ＮａＣｌ−バッファーＡで平衡化し
たホスホ−セルロースカラム（ベッド容積１.５ｍｌ）
にのせた。Ｍｕｓ−１８は０.３５Ｍ ＮａＣｌ−バッフ
ァーＡで溶離した。次に、その画分を予め０.２Ｍ Ｎａ
Ｃｌ−バッファーＡで平衡化したヘパリンセファロース
カラム（ベッド容積０.３ｍｌ）にのせた。ｍｕｓ−１
８−ＦＬＡＧ蛋白質は、０.４Ｍ ＮａＣｌ−バッファー
Ａで溶離した。９７％均等性を有するｍｕｓ−１８−Ｆ
ＬＡＧ蛋白質７２μｇが得られた（図７のａ）。この精
製蛋白質を−２０℃において２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７.５）、０.５ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭの
ＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ
および４０％グリセロール中で保存し、特記しない限
り、この溶液をすべての実験で使用した。
【００４２】プラスミド切断アッセイおよび精製Ｍｕｓ
−１８の単位の定義 閉環プラスミドＤＮＡを０.２μｇ／μｌのＤＮＡ濃度
で０.１ｋＪ／ｍ2または１ｋＪ／ｍ2のＵＶ照射を行
い、これらをそれぞれ標準アッセイまたは単位の定義に
使用した。３７℃で３０分間、前記ｍｕｓ−１８含有画
分を総量１０μｌの至適反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉ
ｓ ＨＣｌ、ｐＨ７.９、０.１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭ
のＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌ
のＢＳＡ）中０.１μｇのＤＮＡと混合した。反応を１
０分間６５℃で加熱することにより停止し、０.７５％
アガロースゲルで分析した。ｍｕｓ−１８ニック活性の
１単位は、１００μｌの反応容積中で３７℃にて６０分
以内にＵＶ照射ｃｃＤＮＡ（１ｋＪ／ｍ2）をｏｃＤＮ
Ａへ変換するのに必要な量として定義した。精製Ｍｕｓ
−１８の比活性は１μｇ当り７８０単位であった。Ｔ４
ｅｎｄｏでは、２０ｍＭのＥＤＴＡを含むがＭｇＣｌ2
を含まないＭｕｓ−１８に使用した緩衝液を使用した。
−１８の単位の定義 閉環プラスミドＤＮＡを０.２μｇ／μｌのＤＮＡ濃度
で０.１ｋＪ／ｍ2または１ｋＪ／ｍ2のＵＶ照射を行
い、これらをそれぞれ標準アッセイまたは単位の定義に
使用した。３７℃で３０分間、前記ｍｕｓ−１８含有画
分を総量１０μｌの至適反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉ
ｓ ＨＣｌ、ｐＨ７.９、０.１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭ
のＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌ
のＢＳＡ）中０.１μｇのＤＮＡと混合した。反応を１
０分間６５℃で加熱することにより停止し、０.７５％
アガロースゲルで分析した。ｍｕｓ−１８ニック活性の
１単位は、１００μｌの反応容積中で３７℃にて６０分
以内にＵＶ照射ｃｃＤＮＡ（１ｋＪ／ｍ2）をｏｃＤＮ
Ａへ変換するのに必要な量として定義した。精製Ｍｕｓ
−１８の比活性は１μｇ当り７８０単位であった。Ｔ４
ｅｎｄｏでは、２０ｍＭのＥＤＴＡを含むがＭｇＣｌ2
を含まないＭｕｓ−１８に使用した緩衝液を使用した。
【００４３】プラスミドＤＮＡおよび合成オリゴヌクレ
オチドを基質として使用する除去アッセイおよびニック
部位の決定 ＣＰＤに対するアナシスティス ニデュランス（Anacyst
is nidulans）フォトリアーゼ（Eker et al.,１９９
０，J. Biol. Chem., ２６５，８００９−８０１５）お
よび（６−４）ＰＰに対するドロソフィラ メラノガス
ター（Drosophilamelanogaster）フォトリアーゼ（Todo
et al.,１９９３，Nature, ３６１，３７１−３７４）
は、それぞれ Dr. A. P. M. Eker および Dr. Todo か
ら入手した。Ｔ４ｅｎｄｏは、Dr. K. Valerie および
Dr. K. de Riel から入手したｔａｃプロモーターの後
にｄｅｎ Ｖ遺伝子をもつ大腸菌から精製した。ＰＨＲ
は、室温で１.５時間１０ｃｍからの蛍光を用いる透明
チュ−ブで行った。Ｍｕｓ−１８蛋白質およびＴ４ｅｎ
ｄｏは１時間３７℃で使用した。図８に示されるニック
部位の分析のために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミ
ドをＸｂａＩで消化し、脱リン酸化し、次いでγ−32ｐ
−ＡＴＰで標識した。標識されたＤＮＡをＳａｃＩで消
化し、ＰＡＧＥ後５％の中和ゲルから単離した。ＤＮＡ
の半分に３ＫＪ／ｍ2のＵＶ（２５４ｎｍ、５Ｊ／ｍ
2ｓ）を照射し、次いでＭｕｓ−１８で処理した。マキ
サム・ギルバート法（Maxam and Gilbert,１９７７，Me
thods Enzymol.，６５，４９９−５６０）後、塩基の化
学的破壊を標識されたＤＮＡの別の半分に行った。
オチドを基質として使用する除去アッセイおよびニック
部位の決定 ＣＰＤに対するアナシスティス ニデュランス（Anacyst
is nidulans）フォトリアーゼ（Eker et al.,１９９
０，J. Biol. Chem., ２６５，８００９−８０１５）お
よび（６−４）ＰＰに対するドロソフィラ メラノガス
ター（Drosophilamelanogaster）フォトリアーゼ（Todo
et al.,１９９３，Nature, ３６１，３７１−３７４）
は、それぞれ Dr. A. P. M. Eker および Dr. Todo か
ら入手した。Ｔ４ｅｎｄｏは、Dr. K. Valerie および
Dr. K. de Riel から入手したｔａｃプロモーターの後
にｄｅｎ Ｖ遺伝子をもつ大腸菌から精製した。ＰＨＲ
は、室温で１.５時間１０ｃｍからの蛍光を用いる透明
チュ−ブで行った。Ｍｕｓ−１８蛋白質およびＴ４ｅｎ
ｄｏは１時間３７℃で使用した。図８に示されるニック
部位の分析のために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミ
ドをＸｂａＩで消化し、脱リン酸化し、次いでγ−32ｐ
−ＡＴＰで標識した。標識されたＤＮＡをＳａｃＩで消
化し、ＰＡＧＥ後５％の中和ゲルから単離した。ＤＮＡ
の半分に３ＫＪ／ｍ2のＵＶ（２５４ｎｍ、５Ｊ／ｍ
2ｓ）を照射し、次いでＭｕｓ−１８で処理した。マキ
サム・ギルバート法（Maxam and Gilbert,１９７７，Me
thods Enzymol.，６５，４９９−５６０）後、塩基の化
学的破壊を標識されたＤＮＡの別の半分に行った。
【００４４】２種のジピリミジン配列（下線部）を有す
るオリゴヌクレオチド（配列番号：３） ５′−ＧＴＡ ＴＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＧＴＡ ＴＧ
Ｃ ＡＴＣ ＡＴＧ ＴＴＡ ＴＡＣ ＧＣＡ ＣＡＣ
ＣＡＣ ＡＧＴ ＧＣＡ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＡＴ
ＡＧＣ−３′ を合成し、１５％アクリルアミドゲルを用いるＰＡＧＥ
で精製した。５′または３′部位を、それぞれポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造）を用いるγ−32ｐ−ＡＴＰ
またはターミナル デオキシトランスフェラーゼ（TdT，
Boehringer)を用いるα−32ｐ−ｄｄＡＴＰで標識し
た。
るオリゴヌクレオチド（配列番号：３） ５′−ＧＴＡ ＴＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＧＴＡ ＴＧ
Ｃ ＡＴＣ ＡＴＧ ＴＴＡ ＴＡＣ ＧＣＡ ＣＡＣ
ＣＡＣ ＡＧＴ ＧＣＡ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＡＴ
ＡＧＣ−３′ を合成し、１５％アクリルアミドゲルを用いるＰＡＧＥ
で精製した。５′または３′部位を、それぞれポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造）を用いるγ−32ｐ−ＡＴＰ
またはターミナル デオキシトランスフェラーゼ（TdT，
Boehringer)を用いるα−32ｐ−ｄｄＡＴＰで標識し
た。
【００４５】適正な大きさのＤＮＡを再度ＰＡＧＥ（１
５％ゲル）で精製し、相補鎖にアニールさせた。ＵＶ照
射（３ｋＪ／ｍ2）後、Ｍｕｓ−１８で処理し、制限酵
素で消化した未照射ＤＮＡと共にＰＡＧＥ（１５％ゲ
ル）で分析した。ＴｄＴまたはウシ腸フォスファターゼ
（宝酒造）を使用して、それぞれコールドｄｄＴＴＰを
有する３′末端にヌクレオチドを加えるかまたはニツク
ＤＮＡの５′未満のリン酸を除去した。実験では、１０
ｆｍｏｌのＤＮＡに対して３５ｕ（単位）のＭｕｓ−１
８を常に使用した。配列およびニツク部位を、ＰＡＧＥ
後、ＢＡＳ ２０００ Image Analyzer（富士フィルム）
によって分析した。
５％ゲル）で精製し、相補鎖にアニールさせた。ＵＶ照
射（３ｋＪ／ｍ2）後、Ｍｕｓ−１８で処理し、制限酵
素で消化した未照射ＤＮＡと共にＰＡＧＥ（１５％ゲ
ル）で分析した。ＴｄＴまたはウシ腸フォスファターゼ
（宝酒造）を使用して、それぞれコールドｄｄＴＴＰを
有する３′末端にヌクレオチドを加えるかまたはニツク
ＤＮＡの５′未満のリン酸を除去した。実験では、１０
ｆｍｏｌのＤＮＡに対して３５ｕ（単位）のＭｕｓ−１
８を常に使用した。配列およびニツク部位を、ＰＡＧＥ
後、ＢＡＳ ２０００ Image Analyzer（富士フィルム）
によって分析した。
【００４６】
【発明の効果】皮膚ガンの予防や治療の目的で使用しう
る新規ＤＮＡ修復酵素およびその製造方法が提供され
る。本酵素の具体的な使用態様としては、日焼け止めク
リームなどに混合使用すること等が期待される。
る新規ＤＮＡ修復酵素およびその製造方法が提供され
る。本酵素の具体的な使用態様としては、日焼け止めク
リームなどに混合使用すること等が期待される。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
【表４】
【００５１】
【表５】
【図１】Ｎ．ｃｒａｓｓａからクローン化されたｃＤＮ
Ａの発現により各種大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株における
ＵＶ耐性の向上を示すグラフである。ＵＶ照射後のベク
タープラスミド（白ぬき印）またはｐＵＶＧ３１（黒ぬ
り印）で形質転換したＥ. Ｃｏｌｉ ＳＹ２（ｐｈｒ ｕ
ｖｒＡ ｒｅｃＡ）株（三角印）、ＳＹ１（ｐｈｒ ｕｖ
ｒＡ）株（四角印）、ＫＹ２９（ｐｈｒ ｒｅｃＡ）株
（逆三角印）およびＫＹ２０（ｐｈｒ）（丸印）の生存
曲線。
Ａの発現により各種大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株における
ＵＶ耐性の向上を示すグラフである。ＵＶ照射後のベク
タープラスミド（白ぬき印）またはｐＵＶＧ３１（黒ぬ
り印）で形質転換したＥ. Ｃｏｌｉ ＳＹ２（ｐｈｒ ｕ
ｖｒＡ ｒｅｃＡ）株（三角印）、ＳＹ１（ｐｈｒ ｕｖ
ｒＡ）株（四角印）、ＫＹ２９（ｐｈｒ ｒｅｃＡ）株
（逆三角印）およびＫＹ２０（ｐｈｒ）（丸印）の生存
曲線。
【図２】クローン化された遺伝子の堆定アミノ酸配列を
一文字表記で示す。１９８６ｂｐ ＯＲＦから堆定され
る堆定アミノ酸配列が示される。下線を引いた太字のア
ミノ酸配列は、プロタミンで見い出されたものと同一の
配列を示す。
一文字表記で示す。１９８６ｂｐ ＯＲＦから堆定され
る堆定アミノ酸配列が示される。下線を引いた太字のア
ミノ酸配列は、プロタミンで見い出されたものと同一の
配列を示す。
【図３】酵母とヒト細胞系の生存曲線を示すグラフであ
る。ａはサッカロマイセス セレビジエ（Saccharomyces
cerevisiae）のＵＶ照射後に、ベクタープラスミドｐ
ＫＴ１０−ＬＥＵ２（黒ぬり印）またはそのベクター中
にクローン化したｃＤＮＡを有するプラスミド（白ぬき
印）で形質転換したＧＲＦ１８（野生型）株（逆三角
印）、ｙａ１０３１（ｒａｄ１）株（丸印）、ｙａ２−
２（ｒａｄ２）株（三角印）およびｙａ１８−１（ｒａ
ｄ１８）株（四角印）。ｂはベクターｐｃＤＮＡ（白ぬ
き印）またはそのベクターのＣＭＶプロモーターの後に
クローン化したｃＤＮＡを有するプラスミドで形質転換
したＸＰＡ細胞系。ＵＶ耐性レベルは、白ぬき三角印に
よる前記ベクタープラスミドで形質転換したヘラ（Ｈｅ
Ｌａ）細胞に関して示す。
る。ａはサッカロマイセス セレビジエ（Saccharomyces
cerevisiae）のＵＶ照射後に、ベクタープラスミドｐ
ＫＴ１０−ＬＥＵ２（黒ぬり印）またはそのベクター中
にクローン化したｃＤＮＡを有するプラスミド（白ぬき
印）で形質転換したＧＲＦ１８（野生型）株（逆三角
印）、ｙａ１０３１（ｒａｄ１）株（丸印）、ｙａ２−
２（ｒａｄ２）株（三角印）およびｙａ１８−１（ｒａ
ｄ１８）株（四角印）。ｂはベクターｐｃＤＮＡ（白ぬ
き印）またはそのベクターのＣＭＶプロモーターの後に
クローン化したｃＤＮＡを有するプラスミドで形質転換
したＸＰＡ細胞系。ＵＶ耐性レベルは、白ぬき三角印に
よる前記ベクタープラスミドで形質転換したヘラ（Ｈｅ
Ｌａ）細胞に関して示す。
【図４】ＵＶ生存性に対するＮ. ｃｒａｓｓａのｍｕｓ
−１８変異株または野生型細胞へのクローン化遺伝子導
入の影響を示すグラフである。クローン化ｃＤＮＡをカ
バーするＮ. ｃｒａｓｓａのゲノムフラグメントの導入
によるｍｕｓ−１８変異株のＵＶ感受性の相補性を表
す。クローン化されたゲノム遺伝子は、ハイグロマイシ
ン耐性マーカー（ｈｙｇ Ｂ）を担持するｐＵＶＥＥ１
誘導体のトランスフェクションまたはｈｙｇ Ｂを担持
するプラスミドｐＣＳＮ４４とｐＵＶＥＥ１の同時トラ
ンスフェクションによって導入された。前者（黒ぬり四
角印）または後者（黒ぬり逆三角印）の方法によって得
られたハイグロマイシン耐性形質転換体、ならびに野生
型（白ぬき丸印）細胞およびｍｕｓ−１８変異株（印ぬ
き三角印）細胞のＵＶ感受性を示す。
−１８変異株または野生型細胞へのクローン化遺伝子導
入の影響を示すグラフである。クローン化ｃＤＮＡをカ
バーするＮ. ｃｒａｓｓａのゲノムフラグメントの導入
によるｍｕｓ−１８変異株のＵＶ感受性の相補性を表
す。クローン化されたゲノム遺伝子は、ハイグロマイシ
ン耐性マーカー（ｈｙｇ Ｂ）を担持するｐＵＶＥＥ１
誘導体のトランスフェクションまたはｈｙｇ Ｂを担持
するプラスミドｐＣＳＮ４４とｐＵＶＥＥ１の同時トラ
ンスフェクションによって導入された。前者（黒ぬり四
角印）または後者（黒ぬり逆三角印）の方法によって得
られたハイグロマイシン耐性形質転換体、ならびに野生
型（白ぬき丸印）細胞およびｍｕｓ−１８変異株（印ぬ
き三角印）細胞のＵＶ感受性を示す。
【図５】ＵＶ生存性に対するＮ. ｃｒａｓｓａのｍｕｓ
−１８変異株または野生型細胞へのクローン化遺伝子導
入の影響を示すグラフである。ＲＩＰによって不活化さ
れたｍｕｓ−１８遺伝子を有する細胞のＵＶ感受性を示
す。野生型細胞を、ｐＵＶＥＥ１で形質転換した細胞と
交雑した。交雑から得られた、２種の子孫を試験した。
野生形（白ぬき丸印）細胞、ｐＵＶＥＥ１で形質転換さ
れた野生型（黒ぬり四角印）、ｍｕｓ−１８変異株（白
ぬき三角印）および２種の子孫（黒ぬり逆三角印）のＵ
Ｖ感受性を示す。
−１８変異株または野生型細胞へのクローン化遺伝子導
入の影響を示すグラフである。ＲＩＰによって不活化さ
れたｍｕｓ−１８遺伝子を有する細胞のＵＶ感受性を示
す。野生型細胞を、ｐＵＶＥＥ１で形質転換した細胞と
交雑した。交雑から得られた、２種の子孫を試験した。
野生形（白ぬき丸印）細胞、ｐＵＶＥＥ１で形質転換さ
れた野生型（黒ぬり四角印）、ｍｕｓ−１８変異株（白
ぬき三角印）および２種の子孫（黒ぬり逆三角印）のＵ
Ｖ感受性を示す。
【図６】図４と図５に関連するｍｕｓ−１８変異細胞に
おけるゲノムＤＮＡの転位を示すものであり、サザンハ
イブリダイゼーションの結果を示すゲル電気泳動図であ
る。前記クローン化遺伝子をカバーするＥｃｏ ＲＩ
（レーン１および２）およびＨｉｎｄＩＩＩ（レーン３
および４）で消化したゲノムＤＮＡに対する野生型（レ
ーン１および３）およびｍｕｓ−１８変異株（レーン２
および４）から、それぞれ調製したゲノムＤＮＡのサザ
ンハイブリダイゼーションである。
おけるゲノムＤＮＡの転位を示すものであり、サザンハ
イブリダイゼーションの結果を示すゲル電気泳動図であ
る。前記クローン化遺伝子をカバーするＥｃｏ ＲＩ
（レーン１および２）およびＨｉｎｄＩＩＩ（レーン３
および４）で消化したゲノムＤＮＡに対する野生型（レ
ーン１および３）およびｍｕｓ−１８変異株（レーン２
および４）から、それぞれ調製したゲノムＤＮＡのサザ
ンハイブリダイゼーションである。
【図７】Ｅ. ｃｏｌｉ形質転換体由来のｍｕｓ−１８遺
伝子産物の精製の各段階におけるドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）
による分析結果を示す図に代わる写真である（ａ）。ｂ
はニック活性分析による同図に代わる写真である。Ｅ.
ｃｏｌｉ形質転換体由来のｍｕｓ−１８遺伝子産物のＦ
ＬＡＧに対する抗体を用いた精製画分の各段階における
ウェスタンブロットの結果を示す電気泳動図に代わる写
真である（ｃ）。図中のＶおよびＭは、それぞれベクタ
ープラスミドおよびｍｕｓ−１８遺伝子を含む細胞抽出
物由来の画分を示す。粗抽出物からの上澄（Ｓ）または
Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎ）、フォスフォセルロース（Ｐ）およ
びヘパリンセファロース（Ｈ）カラム由来のＭについて
のニック活性を有する画分およびＶについての同画分の
分析結果である。ｄは、Ｍｕｓ−１８のフォスフォセル
ロース画分におけるニック活性のＭｇ++依存性を示す電
気泳動図に代わる写真である。この反応混合物中には、
ＡＴＰは含まれていない。
伝子産物の精製の各段階におけるドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）
による分析結果を示す図に代わる写真である（ａ）。ｂ
はニック活性分析による同図に代わる写真である。Ｅ.
ｃｏｌｉ形質転換体由来のｍｕｓ−１８遺伝子産物のＦ
ＬＡＧに対する抗体を用いた精製画分の各段階における
ウェスタンブロットの結果を示す電気泳動図に代わる写
真である（ｃ）。図中のＶおよびＭは、それぞれベクタ
ープラスミドおよびｍｕｓ−１８遺伝子を含む細胞抽出
物由来の画分を示す。粗抽出物からの上澄（Ｓ）または
Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎ）、フォスフォセルロース（Ｐ）およ
びヘパリンセファロース（Ｈ）カラム由来のＭについて
のニック活性を有する画分およびＶについての同画分の
分析結果である。ｄは、Ｍｕｓ−１８のフォスフォセル
ロース画分におけるニック活性のＭｇ++依存性を示す電
気泳動図に代わる写真である。この反応混合物中には、
ＡＴＰは含まれていない。
【図８】Ｍｕｓ−１８のニック活性に対する基質の決定
を示すための電気泳動（ＰＡＧＥ）図に代わる写真であ
る。Ｍｕｓ−１８で処理した５′末端標識プラスミド
（ＵＶ照射または未照射）のＰＡＧＥである。一試行実
験のＰＡＧＥはパネルの左側から右側に示されている。
ａ、ｂ、ｃおよびｄについては、発明の詳細な説明を参
照されたい。
を示すための電気泳動（ＰＡＧＥ）図に代わる写真であ
る。Ｍｕｓ−１８で処理した５′末端標識プラスミド
（ＵＶ照射または未照射）のＰＡＧＥである。一試行実
験のＰＡＧＥはパネルの左側から右側に示されている。
ａ、ｂ、ｃおよびｄについては、発明の詳細な説明を参
照されたい。
【図９】基質決定およびＭｕｓ−１８により導入された
ニックの性質を示す電気泳動（ＰＡＧＥ）図に代わる写
真である。ａは、２種のジピリミジン配列を含有する合
成オリゴヌクレオチドＮＮ３の構造である。ＮｓｉＩと
ＮｌａＩＩＩ酵素の認識配列およびニック部位を、それ
ぞれ下線および矢印によって示す。上部にはヌクレオチ
ドの数を示している。ｂはＰＨＲと共にそしてＰＨＲを
伴わずＭｕｓ−１８（Ｍｕｓ）またはＴ４ｅｎｄｏ（Ｔ
４）で切断した５′標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果を示
す。相補性オリゴマーとアニールさせたＮＮ３をＵＶ照
射し、そしてＭｕｓ−１８（レーン１）またはＴ４ｅｎ
ｄ（レーン２）で処理した。ＵＶ照射しそしてアニール
化したＤＮＡを（６−４）フォトリアーゼ（レーン３お
よびレーン４）またはＣＰＤフォトリアーゼ（レーン５
およびレーン６）で光回復させ、次いでＭｕｓ−１８
（レーン３およびレーン５）またはＴ４ｅｎｄ（レーン
４およびレーン６）で処理した。ｃはＭｕｓ−１８また
はＴ４ｅｎｄｏで切断した３′末端標識ＮＮ３のＰＡＧ
Ｅ分析結果を示す。ＵＶ照射後、ＤＮＡをＭｕｓ−１８
（レーン１）またはＴ４ｅｎｄｏ（レーン２）で処理し
た。ｄはＭｕｓ−１８または制限酵素で切断した５′末
端標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果を示す。ＵＶ照射ＤＮ
ＡをＭｕｓ−１８（レーン２）で切断し、ｄｄＴＴＰの
存在下でＴｄＴで処理した（レーン５）。ＰＡＧＥにお
ける移動度を比較する目的で、未損傷ＤＮＡをＮｓｉＩ
（レーン１）またはＮｌａＩＩＩ（レーン３）で消化
し、そしてｄｄＴＴＰを組み入れたもの（それぞれ、レ
ーン４およびレーン６）である。ｅはｍｕｓ−１８蛋白
質で切断した３′標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果であ
る。ＵＶ照射ＤＮＡをｍｕｓ−１８蛋白質（レーン２）
で、次いでＣＩＰ（レーン５）で処理した。移動度を比
較する目的で、未損傷ＤＮＡをＮｓｉＩ（レーン１）ま
たはＮｌａＩＩＩ（レーン３）で処理し、次いで脱リン
酸化した（それぞれレーン４およびレーン６）。
ニックの性質を示す電気泳動（ＰＡＧＥ）図に代わる写
真である。ａは、２種のジピリミジン配列を含有する合
成オリゴヌクレオチドＮＮ３の構造である。ＮｓｉＩと
ＮｌａＩＩＩ酵素の認識配列およびニック部位を、それ
ぞれ下線および矢印によって示す。上部にはヌクレオチ
ドの数を示している。ｂはＰＨＲと共にそしてＰＨＲを
伴わずＭｕｓ−１８（Ｍｕｓ）またはＴ４ｅｎｄｏ（Ｔ
４）で切断した５′標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果を示
す。相補性オリゴマーとアニールさせたＮＮ３をＵＶ照
射し、そしてＭｕｓ−１８（レーン１）またはＴ４ｅｎ
ｄ（レーン２）で処理した。ＵＶ照射しそしてアニール
化したＤＮＡを（６−４）フォトリアーゼ（レーン３お
よびレーン４）またはＣＰＤフォトリアーゼ（レーン５
およびレーン６）で光回復させ、次いでＭｕｓ−１８
（レーン３およびレーン５）またはＴ４ｅｎｄ（レーン
４およびレーン６）で処理した。ｃはＭｕｓ−１８また
はＴ４ｅｎｄｏで切断した３′末端標識ＮＮ３のＰＡＧ
Ｅ分析結果を示す。ＵＶ照射後、ＤＮＡをＭｕｓ−１８
（レーン１）またはＴ４ｅｎｄｏ（レーン２）で処理し
た。ｄはＭｕｓ−１８または制限酵素で切断した５′末
端標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果を示す。ＵＶ照射ＤＮ
ＡをＭｕｓ−１８（レーン２）で切断し、ｄｄＴＴＰの
存在下でＴｄＴで処理した（レーン５）。ＰＡＧＥにお
ける移動度を比較する目的で、未損傷ＤＮＡをＮｓｉＩ
（レーン１）またはＮｌａＩＩＩ（レーン３）で消化
し、そしてｄｄＴＴＰを組み入れたもの（それぞれ、レ
ーン４およびレーン６）である。ｅはｍｕｓ−１８蛋白
質で切断した３′標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果であ
る。ＵＶ照射ＤＮＡをｍｕｓ−１８蛋白質（レーン２）
で、次いでＣＩＰ（レーン５）で処理した。移動度を比
較する目的で、未損傷ＤＮＡをＮｓｉＩ（レーン１）ま
たはＮｌａＩＩＩ（レーン３）で処理し、次いで脱リン
酸化した（それぞれレーン４およびレーン６）。
【図１０】ＵＶ誘発ピリミジンダイマーにおけるＭｕｓ
−１８で誘導される除去モデルを示す概念図である。
−１８で誘導される除去モデルを示す概念図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (5)
- 【請求項１】 紫外線によってＤＮＡ中のＴＴ配列およ
びＴＣ配列からそれぞれ誘発されたシクロブタン型ダイ
マーおよび（６−４）結合生成物をＤＮＡ中で特異的に
認識し、そしてそれらを５′側で切断することのできる
酵素活性を有する蛋白質。 - 【請求項２】 配列表の配列番号：１のＤＮＡ配列がコ
ード化する蛋白質またはその誘導体である請求項１記載
の蛋白質。 - 【請求項３】 請求項２に記載する蛋白質をコードする
ＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項３に記載するＤＮＡを発現ベクタ
ーに導入したベクタープラスミド。 - 【請求項５】 請求項３に記載するＤＮＡを発現できる
状態で含む宿主細胞を、栄養培地で培養し、前記ＤＮＡ
の発現によって産生した蛋白質を採取することを特徴と
する請求項２記載の蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09413795A JP3638657B2 (ja) | 1995-03-29 | 1995-03-29 | Ｄｎａ修復酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09413795A JP3638657B2 (ja) | 1995-03-29 | 1995-03-29 | Ｄｎａ修復酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08266275A true JPH08266275A (ja) | 1996-10-15 |
| JP3638657B2 JP3638657B2 (ja) | 2005-04-13 |
Family
ID=14102012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09413795A Expired - Fee Related JP3638657B2 (ja) | 1995-03-29 | 1995-03-29 | Ｄｎａ修復酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3638657B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1153600A2 (de) * | 2000-05-12 | 2001-11-14 | Stada Arzneimittel Ag | Lichtschutz- bzw. Pflegezubereitungen mit einem Gehalt an DNA-Reparaturenzymen |
| JP2007145859A (ja) * | 1997-05-02 | 2007-06-14 | Kobo Products Inc | 局所的に施される活性剤用の抗光化学作用化粧品組成物 |
| JP2010046080A (ja) * | 1997-12-22 | 2010-03-04 | Koninkl Dsm Nv | 糸状菌での発現クローニング |
| CN103212066A (zh) * | 2013-03-14 | 2013-07-24 | 曹毅 | 一种环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备方法 |
-
1995
- 1995-03-29 JP JP09413795A patent/JP3638657B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007145859A (ja) * | 1997-05-02 | 2007-06-14 | Kobo Products Inc | 局所的に施される活性剤用の抗光化学作用化粧品組成物 |
| JP2007176945A (ja) * | 1997-05-02 | 2007-07-12 | Kobo Products Inc | 局所的に施される活性剤用の日焼け止め組成物 |
| JP2010046080A (ja) * | 1997-12-22 | 2010-03-04 | Koninkl Dsm Nv | 糸状菌での発現クローニング |
| EP1153600A2 (de) * | 2000-05-12 | 2001-11-14 | Stada Arzneimittel Ag | Lichtschutz- bzw. Pflegezubereitungen mit einem Gehalt an DNA-Reparaturenzymen |
| EP1153600A3 (de) * | 2000-05-12 | 2003-05-07 | Stada Arzneimittel Ag | Lichtschutz- bzw. Pflegezubereitungen mit einem Gehalt an DNA-Reparaturenzymen |
| CN103212066A (zh) * | 2013-03-14 | 2013-07-24 | 曹毅 | 一种环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备方法 |
| CN103212066B (zh) * | 2013-03-14 | 2016-01-06 | 曹毅 | 一种环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3638657B2 (ja) | 2005-04-13 |
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