JP3258635B2 - 相補性によるクローニングおよび関連方法 - Google Patents
相補性によるクローニングおよび関連方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、新規のク
ローニング方法、該方法により得られたDNA配列、該DNA
配列の対応発現生成物およびそれに対する抗体、ならび
にタンパク質活性に影響を及ぼす合成物のスクリーニン
グ方法に関する。 具体的には、本発明は、環状ヌクレ
オチドホスホジエステラーゼポリペプチド(PDEs)とRAS-
関連蛋白質をコードするDNAの単離に特に有用な、新規
の相補性スクリーニング方法に関する。
ローニング方法、該方法により得られたDNA配列、該DNA
配列の対応発現生成物およびそれに対する抗体、ならび
にタンパク質活性に影響を及ぼす合成物のスクリーニン
グ方法に関する。 具体的には、本発明は、環状ヌクレ
オチドホスホジエステラーゼポリペプチド(PDEs)とRAS-
関連蛋白質をコードするDNAの単離に特に有用な、新規
の相補性スクリーニング方法に関する。
【０００２】これらDNAは、関連DNAに対するハイブリダ
イゼーションプローブ、および適当な宿主細胞を形質転
換する際に用いるポリペプチド発現生成物を得る際に有
用な価値のある物質を提供する。 さらに、本発明が関
係する事項は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ
ポリペプチド(PDEs)とRAS-関連蛋白質に関連する以下の
議論にある。
イゼーションプローブ、および適当な宿主細胞を形質転
換する際に用いるポリペプチド発現生成物を得る際に有
用な価値のある物質を提供する。 さらに、本発明が関
係する事項は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ
ポリペプチド(PDEs)とRAS-関連蛋白質に関連する以下の
議論にある。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】RAS
遺伝子は、HarveyとKirstenによってネズミ肉腫ウィル
スの形質転換因子として初めて発見された［Ellis et a
l., Na tute, 292:506 (1981)］。 HarveyとKirstenの
ネズミ肉腫ウィルスの腫瘍遺伝子の細胞相同物(H-RASと
K-RAS)は、RAS遺伝子の２つの要素を構成する［Shimizu
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 8 0:2112 (198
3)］。 第３番目の要素はN-RASである［Shimizu et a
l., Proc . Natl. Acad. Sci., 80:2112 (1983)］。 こ
れら遺伝子は、RASにおける点変異により非ガン性細胞
をガン性細胞に形質転換できる遺伝子にすることから、
腫瘍遺伝子として知られている［Tabin et al., Natur
e, 300:143 (1982); Reddy et al.,N ature, 300:149 (1
982); Taparowsky et al., Natu re, 300:762 (1982)]。
多くの腫瘍細胞が、かような変異体と共にRAS遺伝子を
含んでいる［Capon et al.,Nature, 302:33 (1983);Cap
on et al., Nature, 304:507 (1983); Shimizu etal.,
Nature, 304:497 (1983); Taparowsky et al., Cell, 3
4:581 (1983);Taparowsky et al., Nature, 300:762 (1
982); Barbacid, Ann. Rev. Bi ochem.,56:779 (198
7)］。
遺伝子は、HarveyとKirstenによってネズミ肉腫ウィル
スの形質転換因子として初めて発見された［Ellis et a
l., Na tute, 292:506 (1981)］。 HarveyとKirstenの
ネズミ肉腫ウィルスの腫瘍遺伝子の細胞相同物(H-RASと
K-RAS)は、RAS遺伝子の２つの要素を構成する［Shimizu
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 8 0:2112 (198
3)］。 第３番目の要素はN-RASである［Shimizu et a
l., Proc . Natl. Acad. Sci., 80:2112 (1983)］。 こ
れら遺伝子は、RASにおける点変異により非ガン性細胞
をガン性細胞に形質転換できる遺伝子にすることから、
腫瘍遺伝子として知られている［Tabin et al., Natur
e, 300:143 (1982); Reddy et al.,N ature, 300:149 (1
982); Taparowsky et al., Natu re, 300:762 (1982)]。
多くの腫瘍細胞が、かような変異体と共にRAS遺伝子を
含んでいる［Capon et al.,Nature, 302:33 (1983);Cap
on et al., Nature, 304:507 (1983); Shimizu etal.,
Nature, 304:497 (1983); Taparowsky et al., Cell, 3
4:581 (1983);Taparowsky et al., Nature, 300:762 (1
982); Barbacid, Ann. Rev. Bi ochem.,56:779 (198
7)］。
【０００４】我々のガンに関する理解におけるRAS腫瘍
遺伝子の重要性にもかかわらず、RAS遺伝子の哺乳動物
における機能は知られていない。 RASタンパク質は、GT
PとCDPに結合した小さなタンパク質(哺乳動物にて21,00
0ダルトン)である［Papageorgeet al., J. Virol., 44:
509 (1982)］。 RASタンパク質はゆっくりとGTPを加水
分解し、ある細胞タンパク質はこの作用を加速できる
［McGrath et al., Nature,310:644 (1984); Trahey et
al., Science, 238:542 (1987)］。 RASタンパク質は
プラズマ細胞膜の内面に結合し［Willingham et al., C
ell, 19:1005 (1980)]、そのカルボキシ末端にて複合共
有結合修飾される［Hancock et al., Cell,57:1167 (19
89)]。 H-RASの結晶構造は知られている[DeVos et a
l., Science, 239:888 (1988)］。
遺伝子の重要性にもかかわらず、RAS遺伝子の哺乳動物
における機能は知られていない。 RASタンパク質は、GT
PとCDPに結合した小さなタンパク質(哺乳動物にて21,00
0ダルトン)である［Papageorgeet al., J. Virol., 44:
509 (1982)］。 RASタンパク質はゆっくりとGTPを加水
分解し、ある細胞タンパク質はこの作用を加速できる
［McGrath et al., Nature,310:644 (1984); Trahey et
al., Science, 238:542 (1987)］。 RASタンパク質は
プラズマ細胞膜の内面に結合し［Willingham et al., C
ell, 19:1005 (1980)]、そのカルボキシ末端にて複合共
有結合修飾される［Hancock et al., Cell,57:1167 (19
89)]。 H-RASの結晶構造は知られている[DeVos et a
l., Science, 239:888 (1988)］。
【０００５】酵母Saccharomyces cerevisia eは、哺乳動
物のRAS腫瘍遺伝子と構造的および機能的相同性を有す
る２つの遺伝子、RAS1とRAS2を構成する[Powers et a
l.,Cell, 36:607 (1984); Kataoka et al., Cell, 40:1
9 (1985); Defeo-Jones etal., Science, 228:179 (198
5); Dhar et al ., Nucl. Acids Res., 12:3611(198
4)］。 RAS1もRAS2双方共に、酵母プラスミドライブラ
リーからクローンされたものであり、それらがコードす
る領域の完全なヌクレオチド配列が決定されている[Pow
ers et al., Cell, 36:607 (1984); Defeo-Jones et a
l., Nature,306:707 (1983)]。 二つの遺伝子は、哺乳
動物RASタンパク質の最初の80個のアミノ酸の位置を90
％近くの同一性でコードし、次の80個のアミノ酸の位置
を50％近くの同一性でコードする。 酵母RAS1とRAS2タ
ンパク質は、最初の180個の位置が90％近く同一性であ
り、互いにより相同である。 この後、哺乳動物RASタ
ンパク質が互いに分岐し始めた位置とほとんど同一の位
置で、二つの酵母RASタンパク質は突然分岐する。 酵
母RASタンパク質は、哺乳動物の遺伝子によりコードさ
れたタンパク質と同様、Ａは脂肪族アミノ酸およびＸが
末端アミノ酸を意味する、配列cysAAXで終止する[Barba
cid, Ann Rev. Biochem., 56:779(1987)]。
物のRAS腫瘍遺伝子と構造的および機能的相同性を有す
る２つの遺伝子、RAS1とRAS2を構成する[Powers et a
l.,Cell, 36:607 (1984); Kataoka et al., Cell, 40:1
9 (1985); Defeo-Jones etal., Science, 228:179 (198
5); Dhar et al ., Nucl. Acids Res., 12:3611(198
4)］。 RAS1もRAS2双方共に、酵母プラスミドライブラ
リーからクローンされたものであり、それらがコードす
る領域の完全なヌクレオチド配列が決定されている[Pow
ers et al., Cell, 36:607 (1984); Defeo-Jones et a
l., Nature,306:707 (1983)]。 二つの遺伝子は、哺乳
動物RASタンパク質の最初の80個のアミノ酸の位置を90
％近くの同一性でコードし、次の80個のアミノ酸の位置
を50％近くの同一性でコードする。 酵母RAS1とRAS2タ
ンパク質は、最初の180個の位置が90％近く同一性であ
り、互いにより相同である。 この後、哺乳動物RASタ
ンパク質が互いに分岐し始めた位置とほとんど同一の位
置で、二つの酵母RASタンパク質は突然分岐する。 酵
母RASタンパク質は、哺乳動物の遺伝子によりコードさ
れたタンパク質と同様、Ａは脂肪族アミノ酸およびＸが
末端アミノ酸を意味する、配列cysAAXで終止する[Barba
cid, Ann Rev. Biochem., 56:779(1987)]。
【０００６】哺乳動物RAS蛋白質に対するモノクローナ
ル抗体は、酵母細胞中にRASタンパク質を免疫沈降させ
る［Powers et al., Cell, 47:413 (1986) ］。 この
ように、酵母RAS蛋白質は、哺乳動物RAS蛋白質に見られ
るのと全く同じ全体構造や相互関係を有する。
ル抗体は、酵母細胞中にRASタンパク質を免疫沈降させ
る［Powers et al., Cell, 47:413 (1986) ］。 この
ように、酵母RAS蛋白質は、哺乳動物RAS蛋白質に見られ
るのと全く同じ全体構造や相互関係を有する。
【０００７】RAS遺伝子はSchizo saccharomyces pombe、
Dictyostelium discoi diem、およびDrosophila melanog
asterを含む広範な真核性種において検出されている［F
ukuiet al., EMBO, 4:687 (1985); Reymond et al., Ce
ll, 39:141 (1984); Shiloet al., Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA), 78:6789 (1981);Neuman-Silberberg,Cell,
37:1027 (1984)]。 進化に伴うRAS遺伝子の広範な分布
は、単純真核生物におけるRASの研究が、哺乳動物にお
けるRASの典型的な細胞機能を解明することを示唆して
いる。
Dictyostelium discoi diem、およびDrosophila melanog
asterを含む広範な真核性種において検出されている［F
ukuiet al., EMBO, 4:687 (1985); Reymond et al., Ce
ll, 39:141 (1984); Shiloet al., Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA), 78:6789 (1981);Neuman-Silberberg,Cell,
37:1027 (1984)]。 進化に伴うRAS遺伝子の広範な分布
は、単純真核生物におけるRASの研究が、哺乳動物にお
けるRASの典型的な細胞機能を解明することを示唆して
いる。
【０００８】S. cerevisi aeのRAS1およびRAS2の広範な
遺伝子解析が実施されている。 選択可能な生化学標識
によって分裂したin vitro RAS遺伝子を構築し、それら
を遺伝子置換によって、RAS染色体座に導入することに
よって、RAS1およびRAS2は、単独では必須遺伝子ではな
いことが決定された。 しかしながら、二重ヘテロ接合
体の二重RAS欠乏（ras1- ras2-）芽胞は、植物的成長を
回復することができない。 それ故、少なくともある種
のRAS機能は、S. cerevisiaeの生育力のために求められ
る[Kataoka et al., Cell, 37:437 (1984)]。 RAS1は
染色体XV、ADE2からの7cMおよび、HIS3からの63cMに位
置し、RAS2は染色体XIV、MET4からの2cMに位置すること
も決定されている［Kataoka et al ., Cell, 37:437 (19
84)］。
遺伝子解析が実施されている。 選択可能な生化学標識
によって分裂したin vitro RAS遺伝子を構築し、それら
を遺伝子置換によって、RAS染色体座に導入することに
よって、RAS1およびRAS2は、単独では必須遺伝子ではな
いことが決定された。 しかしながら、二重ヘテロ接合
体の二重RAS欠乏（ras1- ras2-）芽胞は、植物的成長を
回復することができない。 それ故、少なくともある種
のRAS機能は、S. cerevisiaeの生育力のために求められ
る[Kataoka et al., Cell, 37:437 (1984)]。 RAS1は
染色体XV、ADE2からの7cMおよび、HIS3からの63cMに位
置し、RAS2は染色体XIV、MET4からの2cMに位置すること
も決定されている［Kataoka et al ., Cell, 37:437 (19
84)］。
【０００９】酵母中で発現された哺乳動物RASは、RAS1
とRAS2の双方の損失の結果である表現型欠陥を訂正する
機能を有する［Kataoka et al., Cell, 40:19 (198
5)］。
とRAS2の双方の損失の結果である表現型欠陥を訂正する
機能を有する［Kataoka et al., Cell, 40:19 (198
5)］。
【００１０】逆に、酵母RAS1は脊椎動物細胞の中で機能
することができる［De Feo-Jones etal., S cience, 22
8:179 (1985)]。 このように、酵母とヒトRASタンパク
質との間には、異種宿主細胞の中で互いに機能するため
に構造の十分な保護がある。
することができる［De Feo-Jones etal., S cience, 22
8:179 (1985)]。 このように、酵母とヒトRASタンパク
質との間には、異種宿主細胞の中で互いに機能するため
に構造の十分な保護がある。
【００１１】19位のアミノ酸位置でグリシンの代わりに
バリンをコードするミスセンス変異体、RAS2val19は、
哺乳動物RAS遺伝子のある種の腫瘍変異体に見られる類
と同程度の変異体を有する［Tabin et al., Nature, 30
0:143 (1982); Reddy et al.,N ature, 300:149 (1982);
Taparowsky et al., Nature, 300:762 (1982)］。
バリンをコードするミスセンス変異体、RAS2val19は、
哺乳動物RAS遺伝子のある種の腫瘍変異体に見られる類
と同程度の変異体を有する［Tabin et al., Nature, 30
0:143 (1982); Reddy et al.,N ature, 300:149 (1982);
Taparowsky et al., Nature, 300:762 (1982)］。
【００１２】この突然変異体を含む二倍体酵母細胞は、
たとえ野性型RAS対立遺伝子を含んでいても、胞子形成
はできない[Kataoka et a l., Cell, 37:437 (1984)]。
RAS2遺伝子の活性型（例えば、RAS2val19）が半数細胞
にある時、酵母細胞はグリコーゲンを合成できず、Glに
おいて生育ができず、栄養が欠乏次第直ちに死滅し、お
よび熱ショックに対して急性感受性である［Toda et a
l., Cell, 40:27 (1985);Sass et al., Proc. Natl. Ac
a d. Sci., 83:9303 (1986)］。
たとえ野性型RAS対立遺伝子を含んでいても、胞子形成
はできない[Kataoka et a l., Cell, 37:437 (1984)]。
RAS2遺伝子の活性型（例えば、RAS2val19）が半数細胞
にある時、酵母細胞はグリコーゲンを合成できず、Glに
おいて生育ができず、栄養が欠乏次第直ちに死滅し、お
よび熱ショックに対して急性感受性である［Toda et a
l., Cell, 40:27 (1985);Sass et al., Proc. Natl. Ac
a d. Sci., 83:9303 (1986)］。
【００１３】RAS2val19を含むS. cerevisiae株は、酵母
のcAMP経路を活性化するIACまたはbcyl突然変異体と著
しく類似する増殖特性と生化学的特性を有する［Uno et
al.,J . Biol. Chem., 257:14110 (1981)]。 IAC 変異
体を保有する酵母株は、向上したアデニル酸シクラーゼ
活性レベルを有している。 bcy1-細胞には、cAMP依存
タンパク質キナーゼの調製要素が欠落している［Uno et
al., J. Biol. Chem.,257:14110 (1982); Toda et a
l., Mol. Cell. Bi ol., 7:1371 (1987)］。 RAS機能が
不完全な酵母株は、アデニル酸シクラーゼ欠乏酵母と類
似の特性を示す[Toda et al., Cell, 40:27 (1985)］。
bcyl-変異体は、ras1 - ras2 - 酵母の死亡率を抑制す
る。 これら結果は、S. cerevisiae酵母において、cAM
Pシグナル経路におけるRASタンパク質機能を示唆してい
る。
のcAMP経路を活性化するIACまたはbcyl突然変異体と著
しく類似する増殖特性と生化学的特性を有する［Uno et
al.,J . Biol. Chem., 257:14110 (1981)]。 IAC 変異
体を保有する酵母株は、向上したアデニル酸シクラーゼ
活性レベルを有している。 bcy1-細胞には、cAMP依存
タンパク質キナーゼの調製要素が欠落している［Uno et
al., J. Biol. Chem.,257:14110 (1982); Toda et a
l., Mol. Cell. Bi ol., 7:1371 (1987)］。 RAS機能が
不完全な酵母株は、アデニル酸シクラーゼ欠乏酵母と類
似の特性を示す[Toda et al., Cell, 40:27 (1985)］。
bcyl-変異体は、ras1 - ras2 - 酵母の死亡率を抑制す
る。 これら結果は、S. cerevisiae酵母において、cAM
Pシグナル経路におけるRASタンパク質機能を示唆してい
る。
【００１４】アデニリルシクラーゼは、RASタンパク質
によって制御されることが示されている［Toda et al.,
Cell, 40:27 (1985)］。 酵母またはヒトからのRASタ
ンパク質は、in vitro生化学検定において、50倍のレベ
ルにまでアデニリルシクラーゼを刺激する。 RASタン
パク質は、GTPと結合した時のみ、アデニリルシクラー
ゼを刺激するであろう［Field et al., Mol. Cell. Bio
l., 8:2159 (1988)］。
によって制御されることが示されている［Toda et al.,
Cell, 40:27 (1985)］。 酵母またはヒトからのRASタ
ンパク質は、in vitro生化学検定において、50倍のレベ
ルにまでアデニリルシクラーゼを刺激する。 RASタン
パク質は、GTPと結合した時のみ、アデニリルシクラー
ゼを刺激するであろう［Field et al., Mol. Cell. Bio
l., 8:2159 (1988)］。
【００１５】熱ショックや欠乏に対する感受性も含んだ
RASの活性化による表現型は、主として、アデニリルシ
クラーゼを介してcAMPエフェクター経路の過剰発現もし
くは非制御活性化の結果である［Kataoka et al., Cel
l, 37:437 (1984); Kataokaet al., Ce ll, 43:493 (198
5); Toda et al., Cell, 40:27 (1985); Field etal.,
Mol. Cell. Biol., 8:2159 (1988)］。
RASの活性化による表現型は、主として、アデニリルシ
クラーゼを介してcAMPエフェクター経路の過剰発現もし
くは非制御活性化の結果である［Kataoka et al., Cel
l, 37:437 (1984); Kataokaet al., Ce ll, 43:493 (198
5); Toda et al., Cell, 40:27 (1985); Field etal.,
Mol. Cell. Biol., 8:2159 (1988)］。
【００１６】低親和性および高親和性cAMPフォスフォジ
エステラーゼをコード化する二つのS. cerevisiae酵母
遺伝子、PDE1とPDE2はそれぞれ単離されている[Sass et
al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 83:9303 (1986); Nikaw
a et al., Mol. Cell. Biol.,7:3629 (1987)]。 これ
らの遺伝子は、活性RAS2val19遺伝子を保有する酵母細
胞にて、それらの熱ショック感受性抑制能力に応じて酵
母ゲノムライブラリーからクローンされた。 PDE遺伝
子（例えば、pd e1 - pde2 - 酵母）を欠いている細胞は、
熱ショック感受性で、グリコーゲンの蓄積が不完全であ
り、酢酸炭素源で生育せず、さらに、一般的には、cAMP
シグナル経路の活性化がために欠陥を有する[Nikawa et
al., Mol. Cell. Biol., 7:3629 (1987)］。
エステラーゼをコード化する二つのS. cerevisiae酵母
遺伝子、PDE1とPDE2はそれぞれ単離されている[Sass et
al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 83:9303 (1986); Nikaw
a et al., Mol. Cell. Biol.,7:3629 (1987)]。 これ
らの遺伝子は、活性RAS2val19遺伝子を保有する酵母細
胞にて、それらの熱ショック感受性抑制能力に応じて酵
母ゲノムライブラリーからクローンされた。 PDE遺伝
子（例えば、pd e1 - pde2 - 酵母）を欠いている細胞は、
熱ショック感受性で、グリコーゲンの蓄積が不完全であ
り、酢酸炭素源で生育せず、さらに、一般的には、cAMP
シグナル経路の活性化がために欠陥を有する[Nikawa et
al., Mol. Cell. Biol., 7:3629 (1987)］。
【００１７】遺伝子解析は、RASタンパク質が、アデニ
リルシクラーゼを刺激するのに加えて、S. cerevisiae
中では他の機能も有することを明瞭に示唆している［To
da etal., Japan Sci. Soc. Press., Tokyo/VNU Sci. P
re ss. pp.253 (1987); Wigleret al., Cold Spring Har
bor Symposium, LIII:649 (1988); Michael et al.,EMB
O, 8:3039 (1989)]。 これら機能の正確な生化学的性
質は不明である。
リルシクラーゼを刺激するのに加えて、S. cerevisiae
中では他の機能も有することを明瞭に示唆している［To
da etal., Japan Sci. Soc. Press., Tokyo/VNU Sci. P
re ss. pp.253 (1987); Wigleret al., Cold Spring Har
bor Symposium, LIII:649 (1988); Michael et al.,EMB
O, 8:3039 (1989)]。 これら機能の正確な生化学的性
質は不明である。
【００１８】S. pombeとXe nopus laevis卵母細胞のよう
な他のシステムに関する実験では、アデニリルシクラー
ゼのRAS刺激は、進化の段階において、広範に行き渡ら
ないことを示した［Birchmeier et al., Cell, 43:615
(1985)]。 RASが、哺乳動物内のアデニリルシクラーゼ
を刺激しそうにもない［Beckner et al., Nature, 317:
1 (1985)］。
な他のシステムに関する実験では、アデニリルシクラー
ゼのRAS刺激は、進化の段階において、広範に行き渡ら
ないことを示した［Birchmeier et al., Cell, 43:615
(1985)]。 RASが、哺乳動物内のアデニリルシクラーゼ
を刺激しそうにもない［Beckner et al., Nature, 317:
1 (1985)］。
【００１９】フォスフォジエステラーゼ(PDEs)は、環状
AMP(cAMP)からAMP、cGMPからGMPへの溶解に関わる酵素
である。 環状AMPは細胞と、カルシトニン、絨毛性ゴ
ナドトロピン、コルチコトロピン、アドレナリン、卵胞
刺激性ホルモン、グルカゴン、ロイトナイジングホルモ
ン、リポトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、ノルア
ドレナリン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、
およびバソプレッシンを含む、様々なホルモンや神経伝
達物質への応答を介在する「第二メッセンジャー」であ
る。
AMP(cAMP)からAMP、cGMPからGMPへの溶解に関わる酵素
である。 環状AMPは細胞と、カルシトニン、絨毛性ゴ
ナドトロピン、コルチコトロピン、アドレナリン、卵胞
刺激性ホルモン、グルカゴン、ロイトナイジングホルモ
ン、リポトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、ノルア
ドレナリン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、
およびバソプレッシンを含む、様々なホルモンや神経伝
達物質への応答を介在する「第二メッセンジャー」であ
る。
【００２０】環状アデノシンモノフォスフェート(cAMP)
の細胞濃度は、アデニリルシクラーゼによるcAMP産生率
だけでなく、フォスフォジエステラーゼによるcAMP溶解
率により制御される。 ヒトにおいては、心理的機能、
平滑筋弛緩、心臓の収縮性強度、ヒスタミン及びその他
の免疫反応性分子の放出、リンパ球増殖、及び血小板凝
固を含む多くの重要な生理学的反応が、cAMPレベルによ
って制御される[Robinson et al., Cyclic AMP, Academ
ic Press, New York and London(1971)]。 このよう
に、cAMPレベルの代替物である薬品や薬剤化合物により
強く影響される疾病には、炎症 (例えば、関節炎、喘
息) 、心不全、平滑筋痙攣、高血圧、凝血、血栓症およ
び心身症が含まれる。
の細胞濃度は、アデニリルシクラーゼによるcAMP産生率
だけでなく、フォスフォジエステラーゼによるcAMP溶解
率により制御される。 ヒトにおいては、心理的機能、
平滑筋弛緩、心臓の収縮性強度、ヒスタミン及びその他
の免疫反応性分子の放出、リンパ球増殖、及び血小板凝
固を含む多くの重要な生理学的反応が、cAMPレベルによ
って制御される[Robinson et al., Cyclic AMP, Academ
ic Press, New York and London(1971)]。 このよう
に、cAMPレベルの代替物である薬品や薬剤化合物により
強く影響される疾病には、炎症 (例えば、関節炎、喘
息) 、心不全、平滑筋痙攣、高血圧、凝血、血栓症およ
び心身症が含まれる。
【００２１】様々な代謝過程の調節におけるcAMPの重要
性に鑑み、フォスフォジエステラーゼの阻害、ならびに
cAMP類似体の開発や評価に向けて多くの努力が払われて
きた。
性に鑑み、フォスフォジエステラーゼの阻害、ならびに
cAMP類似体の開発や評価に向けて多くの努力が払われて
きた。
【００２２】細胞中のcAMPレベルの調節方法の一つとし
て、cAMPフォスフォジエステラーゼ活性の調節による方
法がある。 心不全、喘息、鬱病および血栓症の治療に
有効なある種の薬剤は、cAMPフォスフォジエステラーゼ
阻害作用があることが判明した。 一部で効率的な薬剤
選抜手段が利用できないため、薬品工業界では、適当な
特異性のある薬剤を成功裏に知見するに到っていなかっ
た。 ほとんどの組織は、フォスフォジエステラーゼの
多くの異なるイソ体を含んでおり、粗組織抽出物の阻害
を含んだ従来の方法に基づく薬剤選抜手段では、フォス
フォジエステラーゼの全般作用型阻害剤以外のものを産
生するとは思われない。 テオフィリンのようなcAMPフ
ォスフォジエステラーゼの全般作用型阻害剤は、多くの
有害な副作用を有する。
て、cAMPフォスフォジエステラーゼ活性の調節による方
法がある。 心不全、喘息、鬱病および血栓症の治療に
有効なある種の薬剤は、cAMPフォスフォジエステラーゼ
阻害作用があることが判明した。 一部で効率的な薬剤
選抜手段が利用できないため、薬品工業界では、適当な
特異性のある薬剤を成功裏に知見するに到っていなかっ
た。 ほとんどの組織は、フォスフォジエステラーゼの
多くの異なるイソ体を含んでおり、粗組織抽出物の阻害
を含んだ従来の方法に基づく薬剤選抜手段では、フォス
フォジエステラーゼの全般作用型阻害剤以外のものを産
生するとは思われない。 テオフィリンのようなcAMPフ
ォスフォジエステラーゼの全般作用型阻害剤は、多くの
有害な副作用を有する。
【００２３】上記したように、PDE阻害剤の研究は、特
異性の高いPDE阻害剤の開発をその目標としている。
このPDE阻害剤特異性の欠如は、実際には、特定のタイ
プの組織を含む様々なタイプの細胞の中の、単一の組織
タイプに存在するPDEの数種の別個の分子形態の存在に
一部起因するものである。 これら様々な分子形態は、
基質特性 (cAMP対cGMP) 、細胞間位置 (可溶性対膜結
合) 、カルモジュリンに対する反応、そして場合によっ
ては、様々な治療薬品による選択的阻害によって区別で
きる。 PDEsに対して選択的に作用するであろう改良薬
品は、好ましくない効果、例えば、心拍数の増加あるい
は脂肪分解を向上せずに、環状ヌクレオチドの望ましい
効果、例えば、気管支膨張、心筋収縮性の増大、抗炎
症、を再生するものである。
異性の高いPDE阻害剤の開発をその目標としている。
このPDE阻害剤特異性の欠如は、実際には、特定のタイ
プの組織を含む様々なタイプの細胞の中の、単一の組織
タイプに存在するPDEの数種の別個の分子形態の存在に
一部起因するものである。 これら様々な分子形態は、
基質特性 (cAMP対cGMP) 、細胞間位置 (可溶性対膜結
合) 、カルモジュリンに対する反応、そして場合によっ
ては、様々な治療薬品による選択的阻害によって区別で
きる。 PDEsに対して選択的に作用するであろう改良薬
品は、好ましくない効果、例えば、心拍数の増加あるい
は脂肪分解を向上せずに、環状ヌクレオチドの望ましい
効果、例えば、気管支膨張、心筋収縮性の増大、抗炎
症、を再生するものである。
【００２４】PDE阻害剤としての有用性に関する薬品選
抜する手法、例えば、薬剤選抜手段は、PDE酵素の「動
力学的純粋」調製物を必要とする。 すなわち、ほとん
どの組織は、細胞タイプに関しては、異成分から構成さ
れており、その上、多くの細胞タイプは様々なPDEアイ
ゾザイムを含んでおるため、全ホモジェネートあるいは
全抽出物の使用は、個々のPDEイソ酵素に選択的な阻害
剤を同定しそうにもない。
抜する手法、例えば、薬剤選抜手段は、PDE酵素の「動
力学的純粋」調製物を必要とする。 すなわち、ほとん
どの組織は、細胞タイプに関しては、異成分から構成さ
れており、その上、多くの細胞タイプは様々なPDEアイ
ゾザイムを含んでおるため、全ホモジェネートあるいは
全抽出物の使用は、個々のPDEイソ酵素に選択的な阻害
剤を同定しそうにもない。
【００２５】少なくとも五つの異なるPDEsの科が、基質
特異性、動力学的特性、細胞の調節的制御、サイズ、場
合によっては、選択的阻害剤による調整、などの特性に
基づくことが記されている［Beavo, Adv. in Second Me
ss and Prot. Phosph. Res.22:1-38 (1988)］。
特異性、動力学的特性、細胞の調節的制御、サイズ、場
合によっては、選択的阻害剤による調整、などの特性に
基づくことが記されている［Beavo, Adv. in Second Me
ss and Prot. Phosph. Res.22:1-38 (1988)］。
【００２６】この五つの科とは、I．Ca2+/ カルモジュ
リン−刺激；II．cGMP−刺激；III．cGMP−阻害；IV．c
AMP−特異性；および、Ｖ．cGMP−特異性、である。
リン−刺激；II．cGMP−刺激；III．cGMP−阻害；IV．c
AMP−特異性；および、Ｖ．cGMP−特異性、である。
【００２７】各科には、密接に関連したPDEsの多数の形
態がある。 Cyclic NucleotidePhosphodies terases: S
tructure, Regulation and Drug Action, Brevo, J. an
dHouslay, M.D., Eds.;John Wiley & Sons, New York
(1990)の第３〜15頁にあるBrevo, "Multiple Phosphodi
esterases Isozymes Background, Nomenclatureand Imp
lications"を参照のこと。 Brevo, TIPS, 11:150 (199
0) も参照のこと。
態がある。 Cyclic NucleotidePhosphodies terases: S
tructure, Regulation and Drug Action, Brevo, J. an
dHouslay, M.D., Eds.;John Wiley & Sons, New York
(1990)の第３〜15頁にあるBrevo, "Multiple Phosphodi
esterases Isozymes Background, Nomenclatureand Imp
lications"を参照のこと。 Brevo, TIPS, 11:150 (199
0) も参照のこと。
【００２８】現在のところ、多くの異なるPDE酵素が認
識されており、ある種のPDEs特異性cGMPのみが、完全な
cDNA配列情報の利用が可能である。 すべてのPDEsの完
全な構造上の情報の取得に関しては、各PDEイソ酵素(の
細胞性および亜細胞性分布）を同定し、起源を特定する
ことは可能であろうし、またこれにより、厄介な副作用
を伴わない、特定の疾病に対する治療薬としてのイソ酵
素選択性PDE阻害剤も設計できるであろう。 しかしな
がら、PDEイソ酵素のある種に見られる、不均一性、不
安定性、およびその比較的少ない発生量は、これら酵素
を精製し、特性を付与する際の大きな障害となってい
る。
識されており、ある種のPDEs特異性cGMPのみが、完全な
cDNA配列情報の利用が可能である。 すべてのPDEsの完
全な構造上の情報の取得に関しては、各PDEイソ酵素(の
細胞性および亜細胞性分布）を同定し、起源を特定する
ことは可能であろうし、またこれにより、厄介な副作用
を伴わない、特定の疾病に対する治療薬としてのイソ酵
素選択性PDE阻害剤も設計できるであろう。 しかしな
がら、PDEイソ酵素のある種に見られる、不均一性、不
安定性、およびその比較的少ない発生量は、これら酵素
を精製し、特性を付与する際の大きな障害となってい
る。
【００２９】哺乳類遺伝子のクローニングのための、数
種類の方法が現在のところ利用できる。 哺乳類遺伝子
のクローニングの標準的な方法では、精製したタンパク
質の取得、精製したタンパク質の部分的アミノ酸配列の
決定、変性したオリゴヌクレオチド・プローブを作成す
るための部分的アミノ酸配列の使用、および該タンパク
質をコードするcDNAを得るために、これらプローブを用
いたcDNAライブラリーのスクリーニングが必要とされ
る。
種類の方法が現在のところ利用できる。 哺乳類遺伝子
のクローニングの標準的な方法では、精製したタンパク
質の取得、精製したタンパク質の部分的アミノ酸配列の
決定、変性したオリゴヌクレオチド・プローブを作成す
るための部分的アミノ酸配列の使用、および該タンパク
質をコードするcDNAを得るために、これらプローブを用
いたcDNAライブラリーのスクリーニングが必要とされ
る。
【００３０】この標準的な方法は時間を浪費し、さら
に、使用したプローブの変性のために、関心のあるタン
パク質をコードする配列とは別の配列を同定することに
なる。
に、使用したプローブの変性のために、関心のあるタン
パク質をコードする配列とは別の配列を同定することに
なる。
【００３１】多くの哺乳類遺伝子、例えば、網膜で発現
したcGMPホスホジエステラーゼをコードする遺伝子がこ
の方法でクローニングされている［Ovchinnikov et a
l., FEBS,223:169 (1987)]。
したcGMPホスホジエステラーゼをコードする遺伝子がこ
の方法でクローニングされている［Ovchinnikov et a
l., FEBS,223:169 (1987)]。
【００３２】関心のあるタンパク質をコードする遺伝子
をクローニングする第二の方法として、公知の遺伝子を
相同体を探すためのプローブとして用いる方法がある。
この方法は、遺伝子あるいは遺伝子の科の相同性が十
分であれば、非常に有用である。 例えば、ラットの相
同体をクローニングするために、Drosophila melanogas
terdunceホスホジエステラーゼ遺伝子が用いられてい
る。 Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),
86:3604 (1989);およびSwinnen et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. (USA), 86:5325 (1989)。 ホスホジエステ
ラーゼ遺伝子の一科のその他の遺伝子は、その科の遺伝
子が初めてクローニングされた時に一旦クローニングさ
れているものの、ホスホジエステラーゼ遺伝子の別の科
に属する遺伝子のヌクレオチド配列が、他の科の遺伝子
を同定するために、別の科から誘導したプローブを用い
て十分な相同性が認められるかどうかは、予め知見され
ているはずはなかった。
をクローニングする第二の方法として、公知の遺伝子を
相同体を探すためのプローブとして用いる方法がある。
この方法は、遺伝子あるいは遺伝子の科の相同性が十
分であれば、非常に有用である。 例えば、ラットの相
同体をクローニングするために、Drosophila melanogas
terdunceホスホジエステラーゼ遺伝子が用いられてい
る。 Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),
86:3604 (1989);およびSwinnen et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. (USA), 86:5325 (1989)。 ホスホジエステ
ラーゼ遺伝子の一科のその他の遺伝子は、その科の遺伝
子が初めてクローニングされた時に一旦クローニングさ
れているものの、ホスホジエステラーゼ遺伝子の別の科
に属する遺伝子のヌクレオチド配列が、他の科の遺伝子
を同定するために、別の科から誘導したプローブを用い
て十分な相同性が認められるかどうかは、予め知見され
ているはずはなかった。
【００３３】相補性として知られている遺伝子をクロー
ニングするための方法がその他にある。 多くの研究者
が、他の酵母の対応遺伝子の変異／欠損と相補する能力
による、酵母遺伝子の単離が報告されている。 例え
ば、McKnight et al., EMBO J.,4:2093 (1985)-Aspergi
llus nidulans gene encoding alcohol dehydrogenasei
solated by its ability to complement an adh l mutat
ion in S. cerev isiae;Sass et al., PNAS (USA), 83:9
303 (1986)-S. cerevisiae PDE2 gene isolatedby its
ability to complement a RASval19 allele in S. cere
visiae strainTK161-R2V; Nikawa et al., Mol. Cell.
Biol., 7:3629 (1987)-S. cerevisiaePDE1 gene isolat
ed by transforming S. cerevisiae strain TK161-R2V;
および Wilson, Molec. Cell. Biol., 8:505 (1988)-
S. cerevisiae SRA5 geneisolated by virtue of its a
bility to rescue a RAS+ sra 5-5 S. cerevisiaestrai
n RW60-12C を参照のこと。
ニングするための方法がその他にある。 多くの研究者
が、他の酵母の対応遺伝子の変異／欠損と相補する能力
による、酵母遺伝子の単離が報告されている。 例え
ば、McKnight et al., EMBO J.,4:2093 (1985)-Aspergi
llus nidulans gene encoding alcohol dehydrogenasei
solated by its ability to complement an adh l mutat
ion in S. cerev isiae;Sass et al., PNAS (USA), 83:9
303 (1986)-S. cerevisiae PDE2 gene isolatedby its
ability to complement a RASval19 allele in S. cere
visiae strainTK161-R2V; Nikawa et al., Mol. Cell.
Biol., 7:3629 (1987)-S. cerevisiaePDE1 gene isolat
ed by transforming S. cerevisiae strain TK161-R2V;
および Wilson, Molec. Cell. Biol., 8:505 (1988)-
S. cerevisiae SRA5 geneisolated by virtue of its a
bility to rescue a RAS+ sra 5-5 S. cerevisiaestrai
n RW60-12C を参照のこと。
【００３４】酵母は、非酵母遺伝子を単離するためにも
用いられてきた。 例えば、Henikoff et al., Natu re,
289:33 (1981)では、酵母変異体の相補性によるD. mel
anogas ter遺伝子の単離が、またLee et al ., Nature, 3
27:31 (1987)では、S. pombeのcdc2遺伝子の変異を相補
する能力によるヒト遺伝子の単離が報告されている。
発現ベクターには、ウィルス性(SV40)プロモーターを含
んだものを採用している。
用いられてきた。 例えば、Henikoff et al., Natu re,
289:33 (1981)では、酵母変異体の相補性によるD. mel
anogas ter遺伝子の単離が、またLee et al ., Nature, 3
27:31 (1987)では、S. pombeのcdc2遺伝子の変異を相補
する能力によるヒト遺伝子の単離が報告されている。
発現ベクターには、ウィルス性(SV40)プロモーターを含
んだものを採用している。
【００３５】つい最近では、相補性スクリーニング法
が、ホスホジエステラーゼ(PDEs)のとあるタイプをコー
ドする哺乳類cDNAを検出して、単離するために、本出願
人によって用いられている。 Colicelli et a l., PNAS
(USA), 86:3599 (1989)は、Saccha romyces cerevisiae
発現ベクターにおけるラット脳cDNAライブラリーの構築
と、ヒトH-ras遺伝子の腫瘍形成変異体へのRAS2遺伝子
類似体の変異形態である、RAS2val19の表現型効果を酵
母中で抑制する機能を有する遺伝子の該ライブラリーか
らの単離を報告している。 クローニングされ、DPD（d
unce様ホスホジエステラーゼ）と称されたラット種cDNA
は、酵母株TK161-R2Vに保有された活性化RAS2val19遺伝
子と関連した増殖調節の欠如と相補する能力を有する。
高親和性cAMP特異性ホスホジエステラーゼをコードす
る遺伝子は、D. melanogasterのdunce座によってコード
されるcAMPホスホジエステラーゼと高い相同性を示す。
が、ホスホジエステラーゼ(PDEs)のとあるタイプをコー
ドする哺乳類cDNAを検出して、単離するために、本出願
人によって用いられている。 Colicelli et a l., PNAS
(USA), 86:3599 (1989)は、Saccha romyces cerevisiae
発現ベクターにおけるラット脳cDNAライブラリーの構築
と、ヒトH-ras遺伝子の腫瘍形成変異体へのRAS2遺伝子
類似体の変異形態である、RAS2val19の表現型効果を酵
母中で抑制する機能を有する遺伝子の該ライブラリーか
らの単離を報告している。 クローニングされ、DPD（d
unce様ホスホジエステラーゼ）と称されたラット種cDNA
は、酵母株TK161-R2Vに保有された活性化RAS2val19遺伝
子と関連した増殖調節の欠如と相補する能力を有する。
高親和性cAMP特異性ホスホジエステラーゼをコードす
る遺伝子は、D. melanogasterのdunce座によってコード
されるcAMPホスホジエステラーゼと高い相同性を示す。
【００３６】今日までに、比較的わずかなPDE遺伝子し
かクローニングされていない。 クローニングされたも
ののほとんどが、ホスホジエステラーゼのcAMP−特異性
科(cAMP-PDEs)に属している。 Davis, "Molecular Gen
etics of the CyclicNucleotide Phosphodiesterase",
pp. 227-241 in Cyc lic NucleotidePhosphodiesterase:
Structu re, Regulation, and Drug Action, Brevo, J.
andHouslay, M.D., Eds.; John Wiley & Sons, New Yo
rk;1990を参照のこと。 また、例えば、Faura et al.,
PNAS (USA), 85:8076 (1988)-D. discoideum; Sass eta
l., supra-S. cerev isiae, PDE class IV, designated
PDE2; Nikawa et al.,su pra-S. cerevis iae, PDE class
IV, designated PDE1; Wilson et al., supra-S. cere
visiae, designated SRA5; Chen et a l., PNAS (USA),
83:9313 (1986)-D. mela nogaster, designated dnc+;
Ovchinnikov, et al., supra-bovineretina, designate
d cGMP PDE; Davis et al., s upra-rat liver, designa
tedrat dnc-1; Colicelli, et al., supra-rat brain,
designated DPD; Swinnen,et al., PNAS (USA), 86:532
5 (1989)-rat testis, rat PDE1, PDE2, PDE3 andPDE4;
および Livi et al., Mol. Cell. Biol., 10:2678 (199
0)-human monocyte,designated hPDE1も参照のこと。
ウシ副腎cGMP刺激PDEの断片をコードするDNAのクローニ
ングを報告したLeTrong et al., Biochemistry, 29:102
80 (1990)、およびラット褐色細胞腫細胞からの「タイ
プII PDE」のクローニングを報告したThompson et al.,
FASEBJ ., 5(6):A1592 (Abstract No.7092, 1991) も参
照のこと。
かクローニングされていない。 クローニングされたも
ののほとんどが、ホスホジエステラーゼのcAMP−特異性
科(cAMP-PDEs)に属している。 Davis, "Molecular Gen
etics of the CyclicNucleotide Phosphodiesterase",
pp. 227-241 in Cyc lic NucleotidePhosphodiesterase:
Structu re, Regulation, and Drug Action, Brevo, J.
andHouslay, M.D., Eds.; John Wiley & Sons, New Yo
rk;1990を参照のこと。 また、例えば、Faura et al.,
PNAS (USA), 85:8076 (1988)-D. discoideum; Sass eta
l., supra-S. cerev isiae, PDE class IV, designated
PDE2; Nikawa et al.,su pra-S. cerevis iae, PDE class
IV, designated PDE1; Wilson et al., supra-S. cere
visiae, designated SRA5; Chen et a l., PNAS (USA),
83:9313 (1986)-D. mela nogaster, designated dnc+;
Ovchinnikov, et al., supra-bovineretina, designate
d cGMP PDE; Davis et al., s upra-rat liver, designa
tedrat dnc-1; Colicelli, et al., supra-rat brain,
designated DPD; Swinnen,et al., PNAS (USA), 86:532
5 (1989)-rat testis, rat PDE1, PDE2, PDE3 andPDE4;
および Livi et al., Mol. Cell. Biol., 10:2678 (199
0)-human monocyte,designated hPDE1も参照のこと。
ウシ副腎cGMP刺激PDEの断片をコードするDNAのクローニ
ングを報告したLeTrong et al., Biochemistry, 29:102
80 (1990)、およびラット褐色細胞腫細胞からの「タイ
プII PDE」のクローニングを報告したThompson et al.,
FASEBJ ., 5(6):A1592 (Abstract No.7092, 1991) も参
照のこと。
【００３７】このように、当該技術分野においては、既
知および未知の機能双方に関する遺伝子の単離、免疫学
的特異性が改善された薬剤への使用に好適で、動力学的
に純粋な発現生成物、および動力学的に純粋なタンパク
質調製物を必要としない薬剤選抜手段のために有効的
な、改善されたクローニング手法が引き続き必要とされ
ているのである。
知および未知の機能双方に関する遺伝子の単離、免疫学
的特異性が改善された薬剤への使用に好適で、動力学的
に純粋な発現生成物、および動力学的に純粋なタンパク
質調製物を必要としない薬剤選抜手段のために有効的
な、改善されたクローニング手法が引き続き必要とされ
ているのである。
【００３８】
【課題を解決するための手段】本発明は、微生物、特
に、酵母において機能でき、さらに微生物における同定
可能な形質代替および特性に関連する遺伝子欠陥を修
飾、相補、および抑制できるタンパク質をコードする哺
乳類遺伝子のクローニング方法に関する。 本発明によ
って提供されるものは、本発明の方法によってクローニ
ングされた哺乳類遺伝子、ならびに該遺伝子によってコ
ードされた生成物、さらには、該コードされた生成物と
免疫学的反応性を有する抗体である。
に、酵母において機能でき、さらに微生物における同定
可能な形質代替および特性に関連する遺伝子欠陥を修
飾、相補、および抑制できるタンパク質をコードする哺
乳類遺伝子のクローニング方法に関する。 本発明によ
って提供されるものは、本発明の方法によってクローニ
ングされた哺乳類遺伝子、ならびに該遺伝子によってコ
ードされた生成物、さらには、該コードされた生成物と
免疫学的反応性を有する抗体である。
【００３９】具体的には、本発明は、cAMPが関与する生
化学的経路あるいはRASタンパク質（例えば、RAS-関連
タンパク質）が関与する生化学的経路における遺伝子欠
陥を修飾、相補、および抑制できるタンパク質をコード
する哺乳類遺伝子を検出する方法、かようにクローニン
グされた遺伝子、R ASタンパク質と相互作用するタンパ
ク質、例えば、cAMPホスホジエステラーゼをコードする
新規の哺乳類遺伝子を含む、クローニングされた哺乳類
遺伝子によってコードされた生成物（核酸、タンパク
質）、および細胞増殖および細胞維持の上で影響を与え
る他のタンパク質に関する。
化学的経路あるいはRASタンパク質（例えば、RAS-関連
タンパク質）が関与する生化学的経路における遺伝子欠
陥を修飾、相補、および抑制できるタンパク質をコード
する哺乳類遺伝子を検出する方法、かようにクローニン
グされた遺伝子、R ASタンパク質と相互作用するタンパ
ク質、例えば、cAMPホスホジエステラーゼをコードする
新規の哺乳類遺伝子を含む、クローニングされた哺乳類
遺伝子によってコードされた生成物（核酸、タンパク
質）、および細胞増殖および細胞維持の上で影響を与え
る他のタンパク質に関する。
【００４０】
【発明の実施の形態】本発明の方法は、微生物において
機能し、遺伝子変換あるいは遺伝子欠陥を訂正するため
に、（変換微生物を）所定の方法で遺伝子的に変換さ
れ、あるいは遺伝子的に欠陥があり、結果として、（正
常もしくは非変換微生物の表現型とより同等の表現型を
生成する）遺伝子変換あるいは遺伝子欠陥に関連する同
定可能な形質変換あるいは形質特性を修飾する、関心の
ある哺乳類遺伝子の検出に用いることができる。 本発
明の方法の実施において有用な変換微生物として、S. c
erevisiae株TK161-R2V、10DABならびにSKN37、およびS.
pomb e株SP65がある。
機能し、遺伝子変換あるいは遺伝子欠陥を訂正するため
に、（変換微生物を）所定の方法で遺伝子的に変換さ
れ、あるいは遺伝子的に欠陥があり、結果として、（正
常もしくは非変換微生物の表現型とより同等の表現型を
生成する）遺伝子変換あるいは遺伝子欠陥に関連する同
定可能な形質変換あるいは形質特性を修飾する、関心の
ある哺乳類遺伝子の検出に用いることができる。 本発
明の方法の実施において有用な変換微生物として、S. c
erevisiae株TK161-R2V、10DABならびにSKN37、およびS.
pomb e株SP65がある。
【００４１】本発明は、（酵母変異体もしくは哺乳類宿
主細胞などの）遺伝子変換微生物において、遺伝子変換
と関連のある形質変換を修飾できる哺乳類遺伝子の新規
検出方法を提供する。 この新規方法は、(a)遺伝子変
換された微生物において、哺乳類cDNAを発現することが
できる発現ベクター(好ましいベクターは、cDNAと機能
的に関連している内因性宿主細胞プロモーターDNA配列
を含む)中に哺乳類cDNAを入れ、(b)遺伝子変換された微
生物に発現ベクターを導入し、(c)適切な増殖条件下
に、該発現ベクターを含む遺伝子変換された微生物を置
き、および(d)微生物における遺伝子変換と関連する形
質変換が修飾されている遺伝子変換された微生物を同定
する、工程を含む。 工程(d)で同定された微生物に挿
入されたcDNAを単離する工程が、任意に含まれる。
主細胞などの）遺伝子変換微生物において、遺伝子変換
と関連のある形質変換を修飾できる哺乳類遺伝子の新規
検出方法を提供する。 この新規方法は、(a)遺伝子変
換された微生物において、哺乳類cDNAを発現することが
できる発現ベクター(好ましいベクターは、cDNAと機能
的に関連している内因性宿主細胞プロモーターDNA配列
を含む)中に哺乳類cDNAを入れ、(b)遺伝子変換された微
生物に発現ベクターを導入し、(c)適切な増殖条件下
に、該発現ベクターを含む遺伝子変換された微生物を置
き、および(d)微生物における遺伝子変換と関連する形
質変換が修飾されている遺伝子変換された微生物を同定
する、工程を含む。 工程(d)で同定された微生物に挿
入されたcDNAを単離する工程が、任意に含まれる。
【００４２】哺乳類遺伝子をクローニングするこの方法
の、cAMPホスホジエステラーゼおよび、RASタンパク質
に相互作用を及ぼすタンパク質への使用に関しては詳細
に記載したが、遺伝変換を訂正、相補、あるいは補足す
るために適切に選択された変換微生物において機能し、
結果として、関連する形質変換を訂正する他の哺乳類遺
伝子のクローニングならびに同定にも使用できる。 本
発明にて記した酵母細胞の形質変換は、熱ショック感受
性、窒素欠乏、標準量グリコーゲン不合成、酢酸塩での
成長不全、および胞子不形成が含まれる。
の、cAMPホスホジエステラーゼおよび、RASタンパク質
に相互作用を及ぼすタンパク質への使用に関しては詳細
に記載したが、遺伝変換を訂正、相補、あるいは補足す
るために適切に選択された変換微生物において機能し、
結果として、関連する形質変換を訂正する他の哺乳類遺
伝子のクローニングならびに同定にも使用できる。 本
発明にて記した酵母細胞の形質変換は、熱ショック感受
性、窒素欠乏、標準量グリコーゲン不合成、酢酸塩での
成長不全、および胞子不形成が含まれる。
【００４３】目下のところ、好ましい形態はcDNAを含む
新規DNA配列であるが、ゲノミックDNA、ヌクレオチドか
ら部分的あるいは全体的に化学合成により調製されたDN
A、ならびに欠失あるいは変異を伴うDNAなどの、他のDN
A形態も本発明の範疇にある。
新規DNA配列であるが、ゲノミックDNA、ヌクレオチドか
ら部分的あるいは全体的に化学合成により調製されたDN
A、ならびに欠失あるいは変異を伴うDNAなどの、他のDN
A形態も本発明の範疇にある。
【００４４】本発明により提供されたDNA配列と、相同
体あるいはプロモータ、オペレーター、レギュレーター
等の異種発現調節DNA配列との会合は、本発明のタンパ
ク質の生成のための転写に感受的で、そして、大量のポ
リ−ならびにオリゴ−ペプチドと関連するメッセンジャ
ーRNAを形成するためのin vivoならびにin vitro転写を
可能にする。 現在のところ、本発明の実用において好
ましいベクターは、プラスミドpADNS、pADANS、pAAUNお
よびpAAUN-ATGである。
体あるいはプロモータ、オペレーター、レギュレーター
等の異種発現調節DNA配列との会合は、本発明のタンパ
ク質の生成のための転写に感受的で、そして、大量のポ
リ−ならびにオリゴ−ペプチドと関連するメッセンジャ
ーRNAを形成するためのin vivoならびにin vitro転写を
可能にする。 現在のところ、本発明の実用において好
ましいベクターは、プラスミドpADNS、pADANS、pAAUNお
よびpAAUN-ATGである。
【００４５】本発明によって特に提供されたものは、環
状ヌクレオチドホスホジエステラーゼおよびその断片を
コードする哺乳類DNA配列、ならびに米国特許商標庁な
らびにブダペスト条約の規定に従って、米国 20582 メ
リーランド州 ロックヴィルパークローン ドライブ 1
2301に所在のAmerican Type Culture Collectionに、19
91年４月15日に寄託した、細菌プラスミドに挿入した哺
乳類DNAとして提出されたRASタンパク質関連DNA配列で
ある。 寄託の対象となった哺乳類PDE DNAsは； １．dunce様PDEをコードする、ラット脳cDNA挿入体を含
んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68586)にあるプラスミド
pRATDPD; ２．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト多形性神膠細胞c
DNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68603)に
あるプラスミドpJC44x; ３．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト多形性神膠細胞c
DNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68600)に
あるプラスミドpTM3; ４．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト多形性神膠細胞c
DNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68602)に
あるプラスミドpTM72; ５．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト側頭皮質細胞cDN
A挿入体を含んだ大腸菌(A.T.C.C.受託 No.68595)にある
プラスミドpPDE21; ６．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト側頭皮質細胞cDN
A挿入体を含んだ大腸菌(A.T.C.C.受託 No.68596)にある
プラスミドpGB18ARR; ７．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト側頭皮質細胞cDN
A挿入体を含んだ大腸菌(A.T.C.C.受託 No.68594)にある
プラスミドpGB25;および ８．分類不可能な科のPDEをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
601)にあるプラスミドpTM22、である。
状ヌクレオチドホスホジエステラーゼおよびその断片を
コードする哺乳類DNA配列、ならびに米国特許商標庁な
らびにブダペスト条約の規定に従って、米国 20582 メ
リーランド州 ロックヴィルパークローン ドライブ 1
2301に所在のAmerican Type Culture Collectionに、19
91年４月15日に寄託した、細菌プラスミドに挿入した哺
乳類DNAとして提出されたRASタンパク質関連DNA配列で
ある。 寄託の対象となった哺乳類PDE DNAsは； １．dunce様PDEをコードする、ラット脳cDNA挿入体を含
んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68586)にあるプラスミド
pRATDPD; ２．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト多形性神膠細胞c
DNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68603)に
あるプラスミドpJC44x; ３．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト多形性神膠細胞c
DNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68600)に
あるプラスミドpTM3; ４．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト多形性神膠細胞c
DNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68602)に
あるプラスミドpTM72; ５．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト側頭皮質細胞cDN
A挿入体を含んだ大腸菌(A.T.C.C.受託 No.68595)にある
プラスミドpPDE21; ６．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト側頭皮質細胞cDN
A挿入体を含んだ大腸菌(A.T.C.C.受託 No.68596)にある
プラスミドpGB18ARR; ７．cAMP特異性PDEをコードする、ヒト側頭皮質細胞cDN
A挿入体を含んだ大腸菌(A.T.C.C.受託 No.68594)にある
プラスミドpGB25;および ８．分類不可能な科のPDEをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
601)にあるプラスミドpTM22、である。
【００４６】寄託の対象となった哺乳類RAS関連DNAs
は； ９．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
599)にあるプラスミドpJC99; 10．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
598)にあるプラスミドpJC265; 11．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
597)にあるプラスミドpJC310; 12．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
593)にあるプラスミドpML5; 13．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
592)にあるプラスミドpATG16; および 14．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
591)にあるプラスミドpATG29、である。
は； ９．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
599)にあるプラスミドpJC99; 10．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
598)にあるプラスミドpJC265; 11．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
597)にあるプラスミドpJC310; 12．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
593)にあるプラスミドpML5; 13．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
592)にあるプラスミドpATG16; および 14．RAS関連ポリペプチドをコードする、ヒト多形性神
膠細胞cDNA挿入体を含んだ大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68
591)にあるプラスミドpATG29、である。
【００４７】本発明の関連で寄託された酵母発現プラス
ミドは； 15．大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68590)にあるプラスミド
pAAUN; 16．大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68589)にあるプラスミド
pAAUN-ATG; 17．大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68587)にあるプラスミド
pADANS;および 18．大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68588)にあるプラスミド
pADNSである。
ミドは； 15．大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68590)にあるプラスミド
pAAUN; 16．大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68589)にあるプラスミド
pAAUN-ATG; 17．大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68587)にあるプラスミド
pADANS;および 18．大腸菌 (A.T.C.C.受託 No.68588)にあるプラスミド
pADNSである。
【００４８】本発明の関連で寄託の対象となった酵母宿
主細胞は； 19．S. pombe SP565 (A.T.C.C.受託 No.74047); 20．S. cerevisiae SKN37 (A.T.C.C. 受託 No.74048); 21．S. cerevisiae 10DAB (A.T.C.C. 受託 No.74049);
および 22．S. cerevisiae TK161-R2V (A.T.C.C. 受託 No.7405
0)である。
主細胞は； 19．S. pombe SP565 (A.T.C.C.受託 No.74047); 20．S. cerevisiae SKN37 (A.T.C.C. 受託 No.74048); 21．S. cerevisiae 10DAB (A.T.C.C. 受託 No.74049);
および 22．S. cerevisiae TK161-R2V (A.T.C.C. 受託 No.7405
0)である。
【００４９】本発明の新規タンパク質生成物は、ホスホ
ジエステラーゼ・タンパク質の一次構造配座（すなわ
ち、アミノ酸配列）ならびに非ホスホジエステラーゼ・
タンパク質、そのペプチド断片、およびそのアミノ酸配
列の複製を構築する合成ペプチドの一次構造配座を有す
るポリペプチドを含む。 本発明のタンパク質、タンパ
ク断片、および合成ペプチドは、治療、診断、および予
後への用途を含む様々な用途を計画しており、さらにこ
れらタンパク質に特異的に免疫反応性を示すモノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体の調製の基礎を提供する
ものである。 好ましいタンパク質断片および合成ペプ
チドは、基質結合機能を有さないタンパク質の複製領域
であり、そして、最も好ましくは、本発明のタンパク質
と少なくとも一つの抗原性エピトープを有する領域であ
る。
ジエステラーゼ・タンパク質の一次構造配座（すなわ
ち、アミノ酸配列）ならびに非ホスホジエステラーゼ・
タンパク質、そのペプチド断片、およびそのアミノ酸配
列の複製を構築する合成ペプチドの一次構造配座を有す
るポリペプチドを含む。 本発明のタンパク質、タンパ
ク断片、および合成ペプチドは、治療、診断、および予
後への用途を含む様々な用途を計画しており、さらにこ
れらタンパク質に特異的に免疫反応性を示すモノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体の調製の基礎を提供する
ものである。 好ましいタンパク質断片および合成ペプ
チドは、基質結合機能を有さないタンパク質の複製領域
であり、そして、最も好ましくは、本発明のタンパク質
と少なくとも一つの抗原性エピトープを有する領域であ
る。
【００５０】本発明のDNAsの発現のための哺乳類宿主細
胞の使用は、本発明の組み換え発現生成物に関する至適
生物学的活性を参照する必要に迫られるため、翻訳的修
飾（例えば、先端削除、脂質化、糖タンパク質化、チロ
シン、セリン、もしくはスレオニン燐酸化）の後になる
ものと考えられる。
胞の使用は、本発明の組み換え発現生成物に関する至適
生物学的活性を参照する必要に迫られるため、翻訳的修
飾（例えば、先端削除、脂質化、糖タンパク質化、チロ
シン、セリン、もしくはスレオニン燐酸化）の後になる
ものと考えられる。
【００５１】本発明によって、タンパク質およびその断
片ならびにペプチドに対して高い免疫学的特異性で結合
し、他のタンパク質とは共通しない、特に、ホスホジエ
ステラーゼ独特のエピトープを認識する能力によって特
徴付けられる、（ポリクローナルおよびモノクローナル
抗体、キメラ抗体、および一本鎖抗体を含む）抗体基質
も提供される。
片ならびにペプチドに対して高い免疫学的特異性で結合
し、他のタンパク質とは共通しない、特に、ホスホジエ
ステラーゼ独特のエピトープを認識する能力によって特
徴付けられる、（ポリクローナルおよびモノクローナル
抗体、キメラ抗体、および一本鎖抗体を含む）抗体基質
も提供される。
【００５２】本発明によって、正常、不正常、あるいは
変異形態のタンパク質、ならびに該タンパク質と関連す
る核酸（例えば、DNAおよびmRNA）の検出および／また
は定量化のための新規の手法も提供される。 例えば、
本発明の抗体は、流体および組織試料中のタンパク質の
定量検出のための公知の免疫学的手法において採用され
るであろうし、また本発明のDNAは、適切に標識付けさ
れて、これらタンパク質をコードするmRNAの定量検出に
おいて用いられるであろう。
変異形態のタンパク質、ならびに該タンパク質と関連す
る核酸（例えば、DNAおよびmRNA）の検出および／また
は定量化のための新規の手法も提供される。 例えば、
本発明の抗体は、流体および組織試料中のタンパク質の
定量検出のための公知の免疫学的手法において採用され
るであろうし、また本発明のDNAは、適切に標識付けさ
れて、これらタンパク質をコードするmRNAの定量検出に
おいて用いられるであろう。
【００５３】それ故、本発明の数々の態様は、(a)環状
核酸ホスホジエステラーゼポリペプチドおよび後述する
RAS-関連タンパク質をコードする新規の核酸配列、およ
び(b)下記する条件とほとんど同等あるいはそれ以上の
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該
配列とハイブリダイズし、本発明の特定のcDNAの最初の
単離において使用されるDNA配列、ならびに(c)変性コド
ンを少なくとも一部用いた、同一物、あるいは対立性変
異体、あるいは類似ポリペプチドをコードするDNA配
列、を提供する。 対応して提供されるのは、該DNA配
列を組み込んだウィルス性ベクターあるいは環状プラス
ミドDNAベクター、および該DNA配列およびベクターで形
質転換あるいは形質変換された原核および真核宿主細
胞、ならびに該宿主細胞の培養増殖時における該DNA配
列によってコードされたタンパク質の組み換え生成のた
めの新規手法、および該宿主細胞あるいは培養培地から
のこれらタンパク質の単離である。
核酸ホスホジエステラーゼポリペプチドおよび後述する
RAS-関連タンパク質をコードする新規の核酸配列、およ
び(b)下記する条件とほとんど同等あるいはそれ以上の
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該
配列とハイブリダイズし、本発明の特定のcDNAの最初の
単離において使用されるDNA配列、ならびに(c)変性コド
ンを少なくとも一部用いた、同一物、あるいは対立性変
異体、あるいは類似ポリペプチドをコードするDNA配
列、を提供する。 対応して提供されるのは、該DNA配
列を組み込んだウィルス性ベクターあるいは環状プラス
ミドDNAベクター、および該DNA配列およびベクターで形
質転換あるいは形質変換された原核および真核宿主細
胞、ならびに該宿主細胞の培養増殖時における該DNA配
列によってコードされたタンパク質の組み換え生成のた
めの新規手法、および該宿主細胞あるいは培養培地から
のこれらタンパク質の単離である。
【００５４】本発明は、さらに、酵母などの微生物にお
いて発現された該哺乳類遺伝子のタンパク質生成物の活
性を変更または変換（すなわち、還元もしくは刺激）す
る要因を同定する方法に関する。 かような要因の同定
は、二種類のスクリーニング手段を用いて実行できる。
一つは、哺乳類タンパク質の既知の酵素機能に関する
生化学的分析法を基礎としたものであり、もう一つは、
タンパク質の決定済の機能もしくは未決定機能に関する
形質分析法を基礎としたものである。 前者の場合、コ
ードされたタンパク質がホスホジエステラーゼであれ
ば、例えば、ホスホジエステラーゼ活性を変換（すなわ
ち、還元もしくは刺激）する化学要因に関する分析法を
含む薬理学的選抜手段である。 後者の場合、コードさ
れたタンパク質がRASタンパク質と相互作用するのであ
れば、例えば、RASタンパク質と相互作用を還元もしく
は刺激する要因に関する分析法を含む薬理学的選抜手段
である。 これら選抜手段は、全細胞調製物あるいは細
胞抽出物のいずれを用いても使用でき、酵素精製を必要
としない。
いて発現された該哺乳類遺伝子のタンパク質生成物の活
性を変更または変換（すなわち、還元もしくは刺激）す
る要因を同定する方法に関する。 かような要因の同定
は、二種類のスクリーニング手段を用いて実行できる。
一つは、哺乳類タンパク質の既知の酵素機能に関する
生化学的分析法を基礎としたものであり、もう一つは、
タンパク質の決定済の機能もしくは未決定機能に関する
形質分析法を基礎としたものである。 前者の場合、コ
ードされたタンパク質がホスホジエステラーゼであれ
ば、例えば、ホスホジエステラーゼ活性を変換（すなわ
ち、還元もしくは刺激）する化学要因に関する分析法を
含む薬理学的選抜手段である。 後者の場合、コードさ
れたタンパク質がRASタンパク質と相互作用するのであ
れば、例えば、RASタンパク質と相互作用を還元もしく
は刺激する要因に関する分析法を含む薬理学的選抜手段
である。 これら選抜手段は、全細胞調製物あるいは細
胞抽出物のいずれを用いても使用でき、酵素精製を必要
としない。
【００５５】
【実施例】本発明を、その好適な実施例に基づいて、以
下に具体的に説明するが、本発明は、これら実施例の開
示に基づいて限定的に解釈されるべきでない。
下に具体的に説明するが、本発明は、これら実施例の開
示に基づいて限定的に解釈されるべきでない。
【００５６】以下の実施例は、本発明の実例を例証する
ものである。 実施例１は、酵母における相補性による
哺乳類遺伝子のクローニングと同定に関する。 実施例
２は、相補性によりクローニングされた哺乳類遺伝子を
用いたハイブリダイゼーションによる哺乳類遺伝子のク
ローニングと同定に関する。 実施例３は、相補性能力
によりクローニングされた遺伝子の特性に関する。 実
施例４は、ヌクレオチド配列解析による、さらなるクロ
ーニングされた遺伝子の特性に関する。 実施例５は、
ホスホジエステラーゼ酵素活性を変換する要因のスクリ
ーニングと同定に関する。
ものである。 実施例１は、酵母における相補性による
哺乳類遺伝子のクローニングと同定に関する。 実施例
２は、相補性によりクローニングされた哺乳類遺伝子を
用いたハイブリダイゼーションによる哺乳類遺伝子のク
ローニングと同定に関する。 実施例３は、相補性能力
によりクローニングされた遺伝子の特性に関する。 実
施例４は、ヌクレオチド配列解析による、さらなるクロ
ーニングされた遺伝子の特性に関する。 実施例５は、
ホスホジエステラーゼ酵素活性を変換する要因のスクリ
ーニングと同定に関する。
【００５７】実施例１：酵母での相補性による哺乳類遺
伝子のクローニング 最も一般的な態様での本発明の方法は以下の表１に記載
の通りである。
伝子のクローニング 最も一般的な態様での本発明の方法は以下の表１に記載
の通りである。
【００５８】
【表１】
【００５９】まず、哺乳類mRNAsのcDNAライブラリー
は、周知の技術で作成された。 このライブラリーは、
二本鎖cDNAを発現ベクターにクローニングすることによ
って作成できる。 cDNAはすでにあるcDNAライブラリー
から調製でき、あるいは組織もしくは細胞系の選択から
精製されたmRNAの逆転写酵素により、標準的な手法を用
いて調製できる。 Watson et al., In: DNA Cl oning,a
Practical Approach,IRL Press Oxford (1984) 。
は、周知の技術で作成された。 このライブラリーは、
二本鎖cDNAを発現ベクターにクローニングすることによ
って作成できる。 cDNAはすでにあるcDNAライブラリー
から調製でき、あるいは組織もしくは細胞系の選択から
精製されたmRNAの逆転写酵素により、標準的な手法を用
いて調製できる。 Watson et al., In: DNA Cl oning,a
Practical Approach,IRL Press Oxford (1984) 。
【００６０】このようにして得たcDNAは、選択された宿
主細胞、例えば、S. pombe SP565 (ras1::Leu2/ras1::L
eu2) (A.T.C.C. 74047)、S. cerevisiae SKN37 (cap::H
1S3)(A.T.C.C. 74048)、S. cerevisiae 10DAB (p de1 -,
pde2 -) (A.T.C.C.74049); およびS. cerevisiae TK161-
R2V (RAS2val19) (A.T.C.C. 74050)の様な変換酵母、に
て次々にタンパク質に翻訳できるmRNAとして哺乳類cDNA
を発現できる発現ベクターにクローニングされる。 こ
の目的で使用された発現ベクターは、下記実施例に記し
ており、pAAUN (A.T.C.C. 68590)、pAAUN-ATG (A.T.C.
C.68589)、pADNS (A.T.C.C. 68587)およびpADANS (A.T.
C.C. 68588)が含まれる。
主細胞、例えば、S. pombe SP565 (ras1::Leu2/ras1::L
eu2) (A.T.C.C. 74047)、S. cerevisiae SKN37 (cap::H
1S3)(A.T.C.C. 74048)、S. cerevisiae 10DAB (p de1 -,
pde2 -) (A.T.C.C.74049); およびS. cerevisiae TK161-
R2V (RAS2val19) (A.T.C.C. 74050)の様な変換酵母、に
て次々にタンパク質に翻訳できるmRNAとして哺乳類cDNA
を発現できる発現ベクターにクローニングされる。 こ
の目的で使用された発現ベクターは、下記実施例に記し
ており、pAAUN (A.T.C.C. 68590)、pAAUN-ATG (A.T.C.
C.68589)、pADNS (A.T.C.C. 68587)およびpADANS (A.T.
C.C. 68588)が含まれる。
【００６１】好ましい発現ベクターは、そのベクターが
導入される宿主細胞に特異的な転写プロモーター、たと
えば、S. cerev isiaeの発現に特異なプロモーターを含
む。転写したmRNAは、cDNA挿入物のATGを 「開始」 コド
ンとして利用できるし、あるいはcDNA生成物を融合タン
パク質として発現できる。
導入される宿主細胞に特異的な転写プロモーター、たと
えば、S. cerev isiaeの発現に特異なプロモーターを含
む。転写したmRNAは、cDNA挿入物のATGを 「開始」 コド
ンとして利用できるし、あるいはcDNA生成物を融合タン
パク質として発現できる。
【００６２】cDNAライブラリー（選択発現ベクターにて
cDNA挿入物として存在する）は、適切な宿主細胞に導入
される。 この宿主細胞は、宿主細胞を、同定可能な形
質変換、あるいは遺伝子変換に関連する異常性を引き起
こす遺伝子変換を含む。 宿主細胞は、酵母S. cerevis
iaeあるいは哺乳類細胞のような、真核性微生物でもよ
い。
cDNA挿入物として存在する）は、適切な宿主細胞に導入
される。 この宿主細胞は、宿主細胞を、同定可能な形
質変換、あるいは遺伝子変換に関連する異常性を引き起
こす遺伝子変換を含む。 宿主細胞は、酵母S. cerevis
iaeあるいは哺乳類細胞のような、真核性微生物でもよ
い。
【００６３】リチウム酢酸塩誘導形質転換のような周知
の方法は、発現ベクターを含むcDNAの導入に用いられ
る。 以下の実施例では、酵母細胞の転写はリチウム酢
酸塩によってなされた。 酵母細胞は濃厚な培地(YP
D)、あるいは、適切な栄養要求補給した合成培地(SC)で
も成長した。 Mortimer et al., In: The Yeast,1:385
(1969). Ito et al., J. Bacteriol., 153:163 (1983)
。
の方法は、発現ベクターを含むcDNAの導入に用いられ
る。 以下の実施例では、酵母細胞の転写はリチウム酢
酸塩によってなされた。 酵母細胞は濃厚な培地(YP
D)、あるいは、適切な栄養要求補給した合成培地(SC)で
も成長した。 Mortimer et al., In: The Yeast,1:385
(1969). Ito et al., J. Bacteriol., 153:163 (1983)
。
【００６４】選択された宿主細胞の遺伝子変換は、例え
ば、RASタンパク質により制御された代謝経路の欠陥を
導くかもしれず、また、容易に識別できる関連表現型
は、熱ショック、もしくは窒素欠乏に対する感受性、正
常値のグリコーゲン合成不能、特定に炭素源上での成長
不能、胞子形成不能、交配不能、RASタンパク質に制御
され、もしくは制御する経路における欠陥に関連するそ
の他の特性に表れるかもしれない。 例えば、遺伝子変
換は、RAS2 val19遺伝子の存在でありうる。 このよう
な変換を含む酵母は、哺乳類遺伝子の発現により克服さ
れうる熱ショック感受性を示す。 以下の実施例では、
55℃で10分間、冷却、30℃で24〜48時間に維持して、前
加熱したSC平板上でのレプリカ培養によって、熱ショッ
ク実験を行った。
ば、RASタンパク質により制御された代謝経路の欠陥を
導くかもしれず、また、容易に識別できる関連表現型
は、熱ショック、もしくは窒素欠乏に対する感受性、正
常値のグリコーゲン合成不能、特定に炭素源上での成長
不能、胞子形成不能、交配不能、RASタンパク質に制御
され、もしくは制御する経路における欠陥に関連するそ
の他の特性に表れるかもしれない。 例えば、遺伝子変
換は、RAS2 val19遺伝子の存在でありうる。 このよう
な変換を含む酵母は、哺乳類遺伝子の発現により克服さ
れうる熱ショック感受性を示す。 以下の実施例では、
55℃で10分間、冷却、30℃で24〜48時間に維持して、前
加熱したSC平板上でのレプリカ培養によって、熱ショッ
ク実験を行った。
【００６５】その他の遺伝子変換した宿主細胞は、S. c
erevisiaeのPDE1およびPDE2遺伝子の分裂、もしくは、
S. pombeのras1の活性対立遺伝子の分裂または存在とい
うような選択ができる。 その他の宿主細胞での遺伝子
変換は、哺乳類cDNA遺伝子の異る部分集合によって訂正
可能であろう。
erevisiaeのPDE1およびPDE2遺伝子の分裂、もしくは、
S. pombeのras1の活性対立遺伝子の分裂または存在とい
うような選択ができる。 その他の宿主細胞での遺伝子
変換は、哺乳類cDNA遺伝子の異る部分集合によって訂正
可能であろう。
【００６６】cDNA挿入物保有発現ベクターの導入後、宿
主細胞は宿主細胞増殖に適した条件下に置かれた。 表
現型変換に応じて訂正されたそれら宿主細胞は、選択、
さもなくば同定され、例えば、宿主細胞から単離された
DNAを用いた大腸菌の形質転換によって、宿主細胞が発
現できる、哺乳類遺伝子が再現されうる。 以下の実施
例での分離分析は、YPDで２〜３日間、酵母形質転換体
を増殖させ、YPD平板に置き、YPD平板でレプリカ培養、
SC-ロイシン（プラスミド選択）、およびYPD熱ショック
平板によって行われた。 大腸菌株HB101はプラズミド
繁殖および単離に用い、株SCS1（Stratagene）はcDNAラ
イブラリーの転写および維持のために用いられた。 Ma
ndel et al., Mol. Biol., 53:159 (1970); Hanahan,
J.Mol. Biol., 166:557 (1983)。
主細胞は宿主細胞増殖に適した条件下に置かれた。 表
現型変換に応じて訂正されたそれら宿主細胞は、選択、
さもなくば同定され、例えば、宿主細胞から単離された
DNAを用いた大腸菌の形質転換によって、宿主細胞が発
現できる、哺乳類遺伝子が再現されうる。 以下の実施
例での分離分析は、YPDで２〜３日間、酵母形質転換体
を増殖させ、YPD平板に置き、YPD平板でレプリカ培養、
SC-ロイシン（プラスミド選択）、およびYPD熱ショック
平板によって行われた。 大腸菌株HB101はプラズミド
繁殖および単離に用い、株SCS1（Stratagene）はcDNAラ
イブラリーの転写および維持のために用いられた。 Ma
ndel et al., Mol. Biol., 53:159 (1970); Hanahan,
J.Mol. Biol., 166:557 (1983)。
【００６７】もし所望ならば、哺乳類遺伝子を単離し
て、配列決定ができる。 あるいは、次工程での使用の
ために、遺伝子によりコードされたタンパク質を同定
し、培養細胞中で発現することもできる。
て、配列決定ができる。 あるいは、次工程での使用の
ために、遺伝子によりコードされたタンパク質を同定
し、培養細胞中で発現することもできる。
【００６８】下記Ａ、ＢおよびＣは、酵母での相補性に
よる哺乳類遺伝子の単離、およびそれらの生化学的特性
について記している。
よる哺乳類遺伝子の単離、およびそれらの生化学的特性
について記している。
【００６９】Ａ：ホスホジエステラーゼをコードするラ
ット脳cDNAの単離および生化学特性 ラット脳cDNAライブラリーは作成され、酵母発現ベクタ
ー、pADNSにクローニングされた。 RNAは、公開された
手順によって、Spraque-Dawleyラット脳から精製され
た。 Chirgwin et al., Biochem., 18:5294 (1979); L
izardi,Methods Enzymol., 96:24 (1983); Watson et a
l., I n: DNA Cloning, apartical approach, IRL, Pres
s Oxford (1984) 。 pADNSは、YEp213からのS. cerevis
iae LEU2遺伝子を含む2.2kbpのHpaI-Bg1II断片［Sherma
n et al.,Laboratory Manual for Methods in Yeast Ge
netics, Sherman, F., Fink, G.R.およびHicks, J.B.,
eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHa
rbor NY (1986)］、複製起源を含むS. cerevisiae ２μ
プラズミドの1.6kpbのHpaI-HindIII断片、およびプラズ
ミドpUC18からのアンピシリン耐性遺伝子を含む2.1kbp
のSspI-EcoRI断片からなる。 また、修飾したS. cerev
isiaeアルコール脱水酵素(ADH1)プロモーターの1.5kbp
の BamHI-HindIII断片［Bennetzen etal., J. Biol. Ch
em., 257:3018 (1982); Ammerer, Meth. Enzymol., 10
1:192 (1983)］、およびADH1終止配列を含む0.6kbpのHi
ndIII-BamHI断片も含む。 プロモーターと終止配列
は、HindIIIとSacI部位の間に制限エンドヌクレアーゼ
部位NotI、SacIIおよびSfiIを含む、ポリリンカーによ
り分離される。
ット脳cDNAの単離および生化学特性 ラット脳cDNAライブラリーは作成され、酵母発現ベクタ
ー、pADNSにクローニングされた。 RNAは、公開された
手順によって、Spraque-Dawleyラット脳から精製され
た。 Chirgwin et al., Biochem., 18:5294 (1979); L
izardi,Methods Enzymol., 96:24 (1983); Watson et a
l., I n: DNA Cloning, apartical approach, IRL, Pres
s Oxford (1984) 。 pADNSは、YEp213からのS. cerevis
iae LEU2遺伝子を含む2.2kbpのHpaI-Bg1II断片［Sherma
n et al.,Laboratory Manual for Methods in Yeast Ge
netics, Sherman, F., Fink, G.R.およびHicks, J.B.,
eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHa
rbor NY (1986)］、複製起源を含むS. cerevisiae ２μ
プラズミドの1.6kpbのHpaI-HindIII断片、およびプラズ
ミドpUC18からのアンピシリン耐性遺伝子を含む2.1kbp
のSspI-EcoRI断片からなる。 また、修飾したS. cerev
isiaeアルコール脱水酵素(ADH1)プロモーターの1.5kbp
の BamHI-HindIII断片［Bennetzen etal., J. Biol. Ch
em., 257:3018 (1982); Ammerer, Meth. Enzymol., 10
1:192 (1983)］、およびADH1終止配列を含む0.6kbpのHi
ndIII-BamHI断片も含む。 プロモーターと終止配列
は、HindIIIとSacI部位の間に制限エンドヌクレアーゼ
部位NotI、SacIIおよびSfiIを含む、ポリリンカーによ
り分離される。
【００７０】二本鎖cDNAが調製され、NotIリンカーに連
結され、NotI制限酵素で開裂され、アルコール脱水酵素
プロモーターとベクターの終止配列の間に位置するNotI
部位にて、pADNSへクローニングされた。 稀なNotI切
断を用いたことにより、cDNAクローニングにおいては、
通常用いられる制限部位メチル化酵素の必要性を回避し
た。 cDNAsは、 NotIリンカーオリゴヌクレチドに連結
された。
結され、NotI制限酵素で開裂され、アルコール脱水酵素
プロモーターとベクターの終止配列の間に位置するNotI
部位にて、pADNSへクローニングされた。 稀なNotI切
断を用いたことにより、cDNAクローニングにおいては、
通常用いられる制限部位メチル化酵素の必要性を回避し
た。 cDNAsは、 NotIリンカーオリゴヌクレチドに連結
された。
【００７１】 配列番号：１ 5'-aagcggccgc、および 配列番号：２ 5'-gcggccgctt。
【００７２】約1.5×105の独立cDNA挿入体は、ライブラ
リーに、1.5kbp平均サイズで含まれている。 cDNA発現
ライブラリーから調製されたDNAは、RAS2val19酵母株TK
161-R2Vを形質転換するために用いられた。 得られた5
0,000Leu+形質転換体は、その後、熱ショック感受性テ
ストに供された。 ただ一つの形質転換体のみが、発現
型プラスミド保有という条件下で、熱ショック耐性を示
した。 pRATDPDで示されるプラスミドは、この形質転
換体から単離され、2.17kbのNotI挿入体が、制限部位地
図およびヌオクレチド配列により分析された。 配列番
号：３および配列番号：４は、挿入体のヌオクレチド塩
基配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。 配列
解析は、チェインターミネーター法によって行った。
Sangeret al., Pro c. Natl. Acad. Sci. (USA), 7 4:546
3 (1977); Biggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U
SA), 80:3963 (1983)。 Genalignは、DPDおよびdunce
配列の整列のために用いた (GENELIGNは、Hugo Martine
z博士によって開発されたIntelliGenetics, Inc.が著作
権を有するソフトウェアーである) 。
リーに、1.5kbp平均サイズで含まれている。 cDNA発現
ライブラリーから調製されたDNAは、RAS2val19酵母株TK
161-R2Vを形質転換するために用いられた。 得られた5
0,000Leu+形質転換体は、その後、熱ショック感受性テ
ストに供された。 ただ一つの形質転換体のみが、発現
型プラスミド保有という条件下で、熱ショック耐性を示
した。 pRATDPDで示されるプラスミドは、この形質転
換体から単離され、2.17kbのNotI挿入体が、制限部位地
図およびヌオクレチド配列により分析された。 配列番
号：３および配列番号：４は、挿入体のヌオクレチド塩
基配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。 配列
解析は、チェインターミネーター法によって行った。
Sangeret al., Pro c. Natl. Acad. Sci. (USA), 7 4:546
3 (1977); Biggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U
SA), 80:3963 (1983)。 Genalignは、DPDおよびdunce
配列の整列のために用いた (GENELIGNは、Hugo Martine
z博士によって開発されたIntelliGenetics, Inc.が著作
権を有するソフトウェアーである) 。
【００７３】562コドンの読み取り枠が見つかった。
最初のATGは、コドン46に表れ、このコドンから始まる
タンパク質は、約60kDaの推定分子量を持つ。 このラ
ット遺伝子は、RATDPDと称する。 コンピューター解析
データバンクを用いて、同様の配列調査が行われ、D ros
ophila melanogaster dunce遺伝子が見つかった。 二
つの遺伝子は、空白部無しに、80％のアミノ酸同一性に
て、ラットDPD cDNAの中央に位置する252アミノ酸領域
上にわたってタンパク質をコードする。 dunce遺伝子
は、高親和性cAMPホスホジエステラーゼをコードするこ
とが示されている。
最初のATGは、コドン46に表れ、このコドンから始まる
タンパク質は、約60kDaの推定分子量を持つ。 このラ
ット遺伝子は、RATDPDと称する。 コンピューター解析
データバンクを用いて、同様の配列調査が行われ、D ros
ophila melanogaster dunce遺伝子が見つかった。 二
つの遺伝子は、空白部無しに、80％のアミノ酸同一性に
て、ラットDPD cDNAの中央に位置する252アミノ酸領域
上にわたってタンパク質をコードする。 dunce遺伝子
は、高親和性cAMPホスホジエステラーゼをコードするこ
とが示されている。
【００７４】Chen et al., Proc. Natl. Acad . Sci. (U
SA), 83:9313 (1986);Davis et al.,J. Cell Biol., 9
0:101 (1981); Waleter et al., J. Neurosc i., 4:494
(1984)。
SA), 83:9313 (1986);Davis et al.,J. Cell Biol., 9
0:101 (1981); Waleter et al., J. Neurosc i., 4:494
(1984)。
【００７５】大きな配列同一性領域の上流及び下流の配
列が、cDNAクローニング法の人工産物ではなく、むしろ
実際には、mRNAの領域に隣接することを立証するため
に、クローニングしたcDNAの構造と、別途調製されたオ
リゴdTプライマーで、全ラット脳ポリ(A)+RNAを逆転写
して得られた第一鎖状cDNA集団に含まれるDPD cDNA構造
とが比較された。 同一領域に位置する配列と、コード
鎖の5'または3'末端の近くの配列に対するオリゴヌクレ
オチドプライマーの相補性ができた。 クローニングさ
れたpRATDPD DNAあるいは鋳型としての第一全鎖cDNA物
質のいずれを用いる場合も、四つの異なるプライマーを
用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が行われ、反応生成
物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析さ
れた。
列が、cDNAクローニング法の人工産物ではなく、むしろ
実際には、mRNAの領域に隣接することを立証するため
に、クローニングしたcDNAの構造と、別途調製されたオ
リゴdTプライマーで、全ラット脳ポリ(A)+RNAを逆転写
して得られた第一鎖状cDNA集団に含まれるDPD cDNA構造
とが比較された。 同一領域に位置する配列と、コード
鎖の5'または3'末端の近くの配列に対するオリゴヌクレ
オチドプライマーの相補性ができた。 クローニングさ
れたpRATDPD DNAあるいは鋳型としての第一全鎖cDNA物
質のいずれを用いる場合も、四つの異なるプライマーを
用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が行われ、反応生成
物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析さ
れた。
【００７６】ポリメラーゼ連鎖反応(PCRs)は、サーモサ
イクラー (Perkin Elmer, Cetus)にて、公開された手法
に修正を加えた方法で行った。 Saiki et al., Scienc
e,239:487 (1988)。 反応混合物は、template DNA (ク
ローンDNA １ng、あるいは第一全鎖cDNA１μｇ)、オリ
ゴヌクレチド・プライマー25 pmoles、デオキシリボヌ
クレチド三燐酸 200μM、Tris HC1 (pH 8.4) 10mM、KC1
50mM、MgCl2 3mM、および0.01％(w/v)ゼラチンを含ん
でいた。 使用されたオリゴヌクレチド・プライマー
は、 配列番号: ５ A, 5'- caccctgctgacaaacct44; 配列番号: ６ B, 5'- atggagacgctggaggaa153; 配列番号: ７ C, 5'- atacgccacatcagaatg676; 配列番号: ８ D, 5'- taccagagtatgattccc1449; 配列番号: ９ E, 5'- gtgtcgatcagagacttg1668;およ
び 配列番号: 10 F, 5'- gcacacaggttggcagac2048 。
イクラー (Perkin Elmer, Cetus)にて、公開された手法
に修正を加えた方法で行った。 Saiki et al., Scienc
e,239:487 (1988)。 反応混合物は、template DNA (ク
ローンDNA １ng、あるいは第一全鎖cDNA１μｇ)、オリ
ゴヌクレチド・プライマー25 pmoles、デオキシリボヌ
クレチド三燐酸 200μM、Tris HC1 (pH 8.4) 10mM、KC1
50mM、MgCl2 3mM、および0.01％(w/v)ゼラチンを含ん
でいた。 使用されたオリゴヌクレチド・プライマー
は、 配列番号: ５ A, 5'- caccctgctgacaaacct44; 配列番号: ６ B, 5'- atggagacgctggaggaa153; 配列番号: ７ C, 5'- atacgccacatcagaatg676; 配列番号: ８ D, 5'- taccagagtatgattccc1449; 配列番号: ９ E, 5'- gtgtcgatcagagacttg1668;およ
び 配列番号: 10 F, 5'- gcacacaggttggcagac2048 。
【００７７】上付き数字は、pRATDPDに関する配列番
号：３における対応位置を示す。 プライマーＣ、Ｅお
よびＦは、非コード鎖列である。 30サイクル (94℃で
1.5分、55℃で３分、および72℃で７分) を実施し、反
応生成物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により
分析された。
号：３における対応位置を示す。 プライマーＣ、Ｅお
よびＦは、非コード鎖列である。 30サイクル (94℃で
1.5分、55℃で３分、および72℃で７分) を実施し、反
応生成物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により
分析された。
【００７８】各事例において、予期できる長さの断片
は、template DNAsのいずれかを用いて得られた。 バ
ンドの状態は、増幅DNA生成物中に認識部位を有する制
限エンドヌクレアーゼの開裂により確認した。 さら
に、各事例において、いずれかのtemplate源を用いて生
成したプライマリーPCR生成物は、予期できる大きさの
開裂生成物を産生した。 この結果は、クローンニング
したcDNAの配列が、ラットmRNAの構造を忠実に反映して
いることを示すものである。
は、template DNAsのいずれかを用いて得られた。 バ
ンドの状態は、増幅DNA生成物中に認識部位を有する制
限エンドヌクレアーゼの開裂により確認した。 さら
に、各事例において、いずれかのtemplate源を用いて生
成したプライマリーPCR生成物は、予期できる大きさの
開裂生成物を産生した。 この結果は、クローンニング
したcDNAの配列が、ラットmRNAの構造を忠実に反映して
いることを示すものである。
【００７９】pRATDPD遺伝子生成物の生化学的特性を分
析するために、pADNSまたはpRATDPDで形質転換された10
DAB酵母細胞の１ｌ培養液から粗細胞抽出物を調製し
た。
析するために、pADNSまたはpRATDPDで形質転換された10
DAB酵母細胞の１ｌ培養液から粗細胞抽出物を調製し
た。
【００８０】酵母株10DAB細胞は、pde1 -およびpde2 -で
あって、重要なレベルの内因性環状ヌクレオチド・ホス
ホジエステラーゼ活性は持っていない。 ホスホジエス
テラーゼ活性検定は、以下のように、cAMPを基質として
用いて行った。 酵母細胞は、合成培養液(SC-ロイシ
ン) １ｌ中で、30℃で36時間培養された。 細胞は回収
され、緩衝液Ｃ(20mM MES (pH6.2), 0.1mM MgCl2, 0.1m
M EGTA, 1mM β−メルカプトエタノール) で洗浄され、
50μl 1M PMSFと共に30ml緩衝液Ｃ中で再懸濁され、フ
レンチプレスで粉砕した。 抽出物は、10分間、1,600g
で遠心分離され、上清は、90分間、18,000g(４℃)で回
転した。 上清は、ホスホジエステラーゼ活性に関し
て、Collicelli et al., supra.により検定した。 す
べての反応物は、Tris-HCl(pH7.5)(100mM)、細胞抽出物
(50μgタンパク質/ml)、5'- ヌクレオチターゼ(Sigma,
20ng/ml)および、10mM Mg2+(もし特に言及していなけれ
ば)、および指標環状ヌクレチド濃度を有していた。 c
GMP加水分解の検定には、1.5μM cGMPを用いた。 阻害
試験には、500μMまでの濃度で、cGMPの量を変化させる
状態で、５μM cAMPを用いた。 [3H]cAMPおよび[3H]cG
MPは、NEN (New England Nuclear)から得た。 反応物
は、10分間、30℃でインキュベートし、５×停止液(250
mM EDTA、25mM AMP、100mM cAMP)で停止した。
あって、重要なレベルの内因性環状ヌクレオチド・ホス
ホジエステラーゼ活性は持っていない。 ホスホジエス
テラーゼ活性検定は、以下のように、cAMPを基質として
用いて行った。 酵母細胞は、合成培養液(SC-ロイシ
ン) １ｌ中で、30℃で36時間培養された。 細胞は回収
され、緩衝液Ｃ(20mM MES (pH6.2), 0.1mM MgCl2, 0.1m
M EGTA, 1mM β−メルカプトエタノール) で洗浄され、
50μl 1M PMSFと共に30ml緩衝液Ｃ中で再懸濁され、フ
レンチプレスで粉砕した。 抽出物は、10分間、1,600g
で遠心分離され、上清は、90分間、18,000g(４℃)で回
転した。 上清は、ホスホジエステラーゼ活性に関し
て、Collicelli et al., supra.により検定した。 す
べての反応物は、Tris-HCl(pH7.5)(100mM)、細胞抽出物
(50μgタンパク質/ml)、5'- ヌクレオチターゼ(Sigma,
20ng/ml)および、10mM Mg2+(もし特に言及していなけれ
ば)、および指標環状ヌクレチド濃度を有していた。 c
GMP加水分解の検定には、1.5μM cGMPを用いた。 阻害
試験には、500μMまでの濃度で、cGMPの量を変化させる
状態で、５μM cAMPを用いた。 [3H]cAMPおよび[3H]cG
MPは、NEN (New England Nuclear)から得た。 反応物
は、10分間、30℃でインキュベートし、５×停止液(250
mM EDTA、25mM AMP、100mM cAMP)で停止した。
【００８１】対照抽出物(pADNSを有する10DAB)では、cA
MPホスホジエステラーゼ活性は示されなかった。 対照
抽出物の結果は、０℃で行われた場合も、Mg2+が欠如し
ている場合でも変化せず、抽出物が添加しない場合に匹
敵するものであった。 これら結果は、非形質転換対照
株10DABには、検出可能なホスホジエステラーゼ活性の
背景が存在しないことを示すものである。
MPホスホジエステラーゼ活性は示されなかった。 対照
抽出物の結果は、０℃で行われた場合も、Mg2+が欠如し
ている場合でも変化せず、抽出物が添加しない場合に匹
敵するものであった。 これら結果は、非形質転換対照
株10DABには、検出可能なホスホジエステラーゼ活性の
背景が存在しないことを示すものである。
【００８２】これに対して、pRATDPDで形質転換した10A
B酵母株で、相当量のホスホジエステラーゼ活性が見ら
れた。 得られた形質転換体におけるcAMP加水分解率
は、cAMP濃度の機能として測定した。 cAMPの推定kmは
3.5μMであり、計算されたVmaxは、1.1nmol/min/mgであ
る。
B酵母株で、相当量のホスホジエステラーゼ活性が見ら
れた。 得られた形質転換体におけるcAMP加水分解率
は、cAMP濃度の機能として測定した。 cAMPの推定kmは
3.5μMであり、計算されたVmaxは、1.1nmol/min/mgであ
る。
【００８３】酵素の陽イオン選択性を確かめ、酵素活性
を刺激するカルシウムおよびカルモジュリンの能力を決
定するために、検定条件は変化させた。 これら検定に
おいては、Mg2+同様、Mn2+も利用でき、１mM最終濃度の
いずれの陽イオンであっても十分使用に供せる。 カル
シウム／カルモジュリンは、抽出物においては、測定し
たホスホジエステラーゼ活性を刺激することはできなか
った。 Beef Heartホスホジエステラーゼ（Boeringer
Mannheim) を用いた並行して行った検定では、カルシウ
ム／カルモジュリンの添加により、6.5倍の刺激が見ら
れた。 最後に、これら検定においては、cGMPホスホジ
エステラーゼ活性は検出されなかった。Beef Heartホス
ホジエステラーゼを、優性対照として、再度用いた。
さらに、基質濃度の100倍量のcGMPは、cAMPホスホジエ
ステラーゼ活性を阻害できなかった。
を刺激するカルシウムおよびカルモジュリンの能力を決
定するために、検定条件は変化させた。 これら検定に
おいては、Mg2+同様、Mn2+も利用でき、１mM最終濃度の
いずれの陽イオンであっても十分使用に供せる。 カル
シウム／カルモジュリンは、抽出物においては、測定し
たホスホジエステラーゼ活性を刺激することはできなか
った。 Beef Heartホスホジエステラーゼ（Boeringer
Mannheim) を用いた並行して行った検定では、カルシウ
ム／カルモジュリンの添加により、6.5倍の刺激が見ら
れた。 最後に、これら検定においては、cGMPホスホジ
エステラーゼ活性は検出されなかった。Beef Heartホス
ホジエステラーゼを、優性対照として、再度用いた。
さらに、基質濃度の100倍量のcGMPは、cAMPホスホジエ
ステラーゼ活性を阻害できなかった。
【００８４】酵母中で発現したpRATDPD cDNA生成物の生
化学的特性は、dunceのような、高親和性cAMP特異性ホ
スホジエステラーゼを示した。 Davis et al., J. Cel
l.Biol., 90:101 (1981);Walter et al., J. Neurosc
i., 4 (1984) 。 加えて、ホスホジエステラーゼ活性
は、カルシウム／カルモジュリンの存在によって刺激さ
れなかった。 この特性は、dunceと共通するものであ
り、他のホスホジエステラーゼとは異なるものである。
Beavo, In Advances in second messengerand phosph
oprotein research Greengard et al., eds., Raven Pr
ess (1988)。
化学的特性は、dunceのような、高親和性cAMP特異性ホ
スホジエステラーゼを示した。 Davis et al., J. Cel
l.Biol., 90:101 (1981);Walter et al., J. Neurosc
i., 4 (1984) 。 加えて、ホスホジエステラーゼ活性
は、カルシウム／カルモジュリンの存在によって刺激さ
れなかった。 この特性は、dunceと共通するものであ
り、他のホスホジエステラーゼとは異なるものである。
Beavo, In Advances in second messengerand phosph
oprotein research Greengard et al., eds., Raven Pr
ess (1988)。
【００８５】二つのタンパク質、pRATDPDとdunceには、
類似した生化学的特性が見られる。
類似した生化学的特性が見られる。
【００８６】しかしながら、pRATDPDは、先に記した高
度保存核心領域以外に、dunceに対して非常に僅かの相
同性(35％)しか示さないタンパク質生成物をコードする
ことも注意すべきである。 これら非保存配列は、この
哺乳類dunce相同物の変換あるいは精製された機能に帰
するものといえる。
度保存核心領域以外に、dunceに対して非常に僅かの相
同性(35％)しか示さないタンパク質生成物をコードする
ことも注意すべきである。 これら非保存配列は、この
哺乳類dunce相同物の変換あるいは精製された機能に帰
するものといえる。
【００８７】配列番号：３に記した pRATDPDヌクレオチ
ド配列は、46位でメチオニン・コドンをコードし、推定
分子量60kDaのタンパク質に対応する563位にまで延びる
読取枠を形成する。 しかしながら、同じ読取枠は、コ
ード鎖の5'末端以外では開いている。 現在のところ、
46位のメチオニン・コドンが、DPDタンパク質の開始コ
ドンであるかどうかは、わからない。 このコード配列
は、三つの密接に近接する終止コドンによって中断され
ている。 しかしながら、得られた読取枠は、別の終止
コドン、ポリアデニリル化コンセンサス・シグナル、お
よびポリアデニン領域に続く、116コドン部分を残して
いる。 この3'読取枠は、他のdunce様ホスホジエステ
ラーゼに、別の接合によって組み込まれる。
ド配列は、46位でメチオニン・コドンをコードし、推定
分子量60kDaのタンパク質に対応する563位にまで延びる
読取枠を形成する。 しかしながら、同じ読取枠は、コ
ード鎖の5'末端以外では開いている。 現在のところ、
46位のメチオニン・コドンが、DPDタンパク質の開始コ
ドンであるかどうかは、わからない。 このコード配列
は、三つの密接に近接する終止コドンによって中断され
ている。 しかしながら、得られた読取枠は、別の終止
コドン、ポリアデニリル化コンセンサス・シグナル、お
よびポリアデニン領域に続く、116コドン部分を残して
いる。 この3'読取枠は、他のdunce様ホスホジエステ
ラーゼに、別の接合によって組み込まれる。
【００８８】Ｂ．相補性によるヒト多形性神膠細胞 cDN
Asの クローニング cDNAライブラリーは、NotIリンカーを用いて、λZAPに
構築された。 この実施例では、mRNAから誘導されたcD
NAは、ヒト多形性神膠細胞系U118MGから精製された。
λベクターからの挿入体は、二つの酵母発現ベクターpA
DNSとpPADANSに移された。 プラスミドpPADANSは、転
写されたmRNAが、アルコールデヒドロゲナーゼ・タンパ
ク質から誘導されたＮ末端部と哺乳類cDNA挿入体からの
残余物を含む融合タンパク質の合成に関与するという点
で、プラスミドpADNSと異なる。
Asの クローニング cDNAライブラリーは、NotIリンカーを用いて、λZAPに
構築された。 この実施例では、mRNAから誘導されたcD
NAは、ヒト多形性神膠細胞系U118MGから精製された。
λベクターからの挿入体は、二つの酵母発現ベクターpA
DNSとpPADANSに移された。 プラスミドpPADANSは、転
写されたmRNAが、アルコールデヒドロゲナーゼ・タンパ
ク質から誘導されたＮ末端部と哺乳類cDNA挿入体からの
残余物を含む融合タンパク質の合成に関与するという点
で、プラスミドpADNSと異なる。
【００８９】構築された二つの哺乳類cDNA発現ライブラ
リーは、先の実施例のように、S. cerevisia e宿主TK161
-R2V の熱ショック感受性を訂正できるcDNAに関してス
クリーニングされた。 いくつかのcDNAs が単離され、
そして配列の解析が行われた。 挿入体として、プラス
ミドpJC44x、pJC99、pJC265およびpJC310を含んだ、四
つの異なるcDNAsが知見され、それらDNA配列と推定アミ
ノ酸配列を、配列番号：11および12、13および14、15お
よび16、および17および18、にそれぞれ示した。
リーは、先の実施例のように、S. cerevisia e宿主TK161
-R2V の熱ショック感受性を訂正できるcDNAに関してス
クリーニングされた。 いくつかのcDNAs が単離され、
そして配列の解析が行われた。 挿入体として、プラス
ミドpJC44x、pJC99、pJC265およびpJC310を含んだ、四
つの異なるcDNAsが知見され、それらDNA配列と推定アミ
ノ酸配列を、配列番号：11および12、13および14、15お
よび16、および17および18、にそれぞれ示した。
【００９０】pJC44の挿入体は、ラットpRATDPD遺伝子と
相同であることがコンピューター解析により判明し、細
胞分解物の生化学的分析によって、cAMPホスホジエステ
ラーゼをコードしていることが実証された。 pJC99、p
JC265およびpJC310への挿入体は、先に単離した遺伝子
との相同性を示さなかった。
相同であることがコンピューター解析により判明し、細
胞分解物の生化学的分析によって、cAMPホスホジエステ
ラーゼをコードしていることが実証された。 pJC99、p
JC265およびpJC310への挿入体は、先に単離した遺伝子
との相同性を示さなかった。
【００９１】Ｃ．相補性によるヒト多形性神膠細胞ホスホジエステラーゼcDNAsのクローニング 前記したヒト多形性神膠細胞cDNA発現ライブラリーを、
ホスホジエステラーゼ欠陥酵母株10DABの熱ショック感
受性を訂正できるcDNAsに関してスクリーニングを行っ
た。 単離されたいくつかのcDNAsは、ヌクレオチドお
よび制限エンドヌクレアーゼ配列地図によって分析され
た。 pTM22に挿入されたcDNAは、新規のヒト遺伝子を
コードした。 そのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配
列を、配列番号：19および20に示した。
ホスホジエステラーゼ欠陥酵母株10DABの熱ショック感
受性を訂正できるcDNAsに関してスクリーニングを行っ
た。 単離されたいくつかのcDNAsは、ヌクレオチドお
よび制限エンドヌクレアーゼ配列地図によって分析され
た。 pTM22に挿入されたcDNAは、新規のヒト遺伝子を
コードした。 そのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配
列を、配列番号：19および20に示した。
【００９２】pTM22のヌクレオチド配列のコンピュータ
ー解析から、挿入体は、ウシCa2+／カルモジュリン依存
cAMPホスホジエステラーゼおよび実施例１Ａに記したDP
Dホスホジエステラーゼのような、様々なcAMPホスホジ
エステラーゼとのタンパク質相同体を推定的にコードす
る。 生化学的分析は、単離したDNAが、新規のcAMPホ
スホジエステラーゼをコードしていることを証明してい
る。
ー解析から、挿入体は、ウシCa2+／カルモジュリン依存
cAMPホスホジエステラーゼおよび実施例１Ａに記したDP
Dホスホジエステラーゼのような、様々なcAMPホスホジ
エステラーゼとのタンパク質相同体を推定的にコードす
る。 生化学的分析は、単離したDNAが、新規のcAMPホ
スホジエステラーゼをコードしていることを証明してい
る。
【００９３】pTM22挿入体と関連する配列が、ヒトの心
臓において発現することが認められ、同様に、TM22の接
合変異体が、核酸ハイブリダイゼーションプローブとし
て、pTM22挿入体配列を用いたヒト心臓cDNAライブラリ
ーから単離された。
臓において発現することが認められ、同様に、TM22の接
合変異体が、核酸ハイブリダイゼーションプローブとし
て、pTM22挿入体配列を用いたヒト心臓cDNAライブラリ
ーから単離された。
【００９４】プラスミドpTM22は、TK161-R2VのRAS Val19
酵母株の熱ショック感受性を訂正することはできなかっ
た。 このことは、pde1 - pde2 - 酵母株10DABが、RAS
Val19酵母株よりも、哺乳類cAMPホスホジエステラーゼ
クローンによる形質復帰体に対してより感受的であるこ
とを示すものである。
酵母株の熱ショック感受性を訂正することはできなかっ
た。 このことは、pde1 - pde2 - 酵母株10DABが、RAS
Val19酵母株よりも、哺乳類cAMPホスホジエステラーゼ
クローンによる形質復帰体に対してより感受的であるこ
とを示すものである。
【００９５】pTM3およびpTM72と称されるプラスミドへ
の挿入体として単離された、いくつかの他のヒト多形性
神膠細胞cDNAは、同様に特性決定された。 これら二つ
の異なるcAMPホスホジエステラーゼcDNAsは、pRATDPD c
DNA挿入体およびpJC44x cDNA挿入体と非常に関連する
が、別異のものであることがわかった。 これらヌクレ
オチド配列と推定アミノ酸配列を、配列番号：21および
22(pTM3)、および23および24(pTM72)にそれぞれ示し
た。
の挿入体として単離された、いくつかの他のヒト多形性
神膠細胞cDNAは、同様に特性決定された。 これら二つ
の異なるcAMPホスホジエステラーゼcDNAsは、pRATDPD c
DNA挿入体およびpJC44x cDNA挿入体と非常に関連する
が、別異のものであることがわかった。 これらヌクレ
オチド配列と推定アミノ酸配列を、配列番号：21および
22(pTM3)、および23および24(pTM72)にそれぞれ示し
た。
【００９６】細胞溶解物の生化学的分析は、pTM3、pTM7
2、pJC44xおよびpRATDPDのcDNAsが、ロリプラム感受性c
AMPホスホジエステラーゼをコードすることを確認し
た。
2、pJC44xおよびpRATDPDのcDNAsが、ロリプラム感受性c
AMPホスホジエステラーゼをコードすることを確認し
た。
【００９７】Ｄ．pPDE cDNA 発現物質の動力学的分析 pJC44x、pTM3、(L22 Metと称し、pTM22由来の1.7kb断片
挿入体を含み、およびPDE活性をコードする）pTM22-様
プラスミド、およびpAD72 (TM22-様クローン）に挿入さ
れたヒトcDNAsを発現する形質転換した約1010個のS. ce
revisiae 10DAB細胞を2.5ml PBSに再懸濁し、４℃で、
ガラスビーズの存在する状態で、渦巻攪拌することによ
り粉砕した。 ５分間、12,000×gの遠心分離を経て得
られた上清画分は、この研究における酵素源とした。
挿入体を含み、およびPDE活性をコードする）pTM22-様
プラスミド、およびpAD72 (TM22-様クローン）に挿入さ
れたヒトcDNAsを発現する形質転換した約1010個のS. ce
revisiae 10DAB細胞を2.5ml PBSに再懸濁し、４℃で、
ガラスビーズの存在する状態で、渦巻攪拌することによ
り粉砕した。 ５分間、12,000×gの遠心分離を経て得
られた上清画分は、この研究における酵素源とした。
【００９８】ホスホジエステラーゼ活性は、Davis et a
l., J. Cyc. Nuc . Res., 5:65-74 (1979)にある方法に
若干の修正を加えて、決定した。 インキュベーション
混合物は、40mM Tris pH 8.0、1ml EGTA、5mM MgCl2、
0.1 mg/ml BSA、希釈酵母抽出物、[3H]cAMP、最終体積
が0.25mlとなるように変化させた量の非標識付環状ヌク
レオチドを含む。 0.5M炭酸塩pH 9.3、0.5M NaCl、お
よび0.1％ SDSを含む0.25mlの反応停止緩衝液を添加す
ることで、反応を止めた。 ヌクレオチド生成物および
未反応基質は、ボロン塩カラム（８×33mm) で分離し
た。 生成物は、ボロン塩カラムからソルビトールによ
って、トリチウム分析用シンチレーションガラス瓶に溶
出した。 初期速度の測定で表現されるすべての動力学
的データは、適切に希釈された酵素の、様々な時間間隔
でのインキュベーションによって決定される。 ミカエ
リス−メンテン動力学モデルのラインウィーバー−バー
ク変換による動力学的データの分析は、試験を行った各
酵素が単純動力学モデルであることを示す直線二重逆数
プロットを描いた。 環状ヌクレオチド濃度は、３×10
-8から１×10-4[cAMP]に変化した。 得られた結果を、
下記表２に示した。
l., J. Cyc. Nuc . Res., 5:65-74 (1979)にある方法に
若干の修正を加えて、決定した。 インキュベーション
混合物は、40mM Tris pH 8.0、1ml EGTA、5mM MgCl2、
0.1 mg/ml BSA、希釈酵母抽出物、[3H]cAMP、最終体積
が0.25mlとなるように変化させた量の非標識付環状ヌク
レオチドを含む。 0.5M炭酸塩pH 9.3、0.5M NaCl、お
よび0.1％ SDSを含む0.25mlの反応停止緩衝液を添加す
ることで、反応を止めた。 ヌクレオチド生成物および
未反応基質は、ボロン塩カラム（８×33mm) で分離し
た。 生成物は、ボロン塩カラムからソルビトールによ
って、トリチウム分析用シンチレーションガラス瓶に溶
出した。 初期速度の測定で表現されるすべての動力学
的データは、適切に希釈された酵素の、様々な時間間隔
でのインキュベーションによって決定される。 ミカエ
リス−メンテン動力学モデルのラインウィーバー−バー
ク変換による動力学的データの分析は、試験を行った各
酵素が単純動力学モデルであることを示す直線二重逆数
プロットを描いた。 環状ヌクレオチド濃度は、３×10
-8から１×10-4[cAMP]に変化した。 得られた結果を、
下記表２に示した。
【００９９】
【表２】
【０１００】Ｅ．酵母での相補性によるヒト多形性神膠
細胞RAS-関連cDNAのクローニング この実施例では、PDEsをコードしない四つのヒト多形性
神膠細胞cDNAが単離された。 それらは、遺伝子的に変
換されたS. ce revisiaeとS. pombe酵母株の相補性によ
り得られた。
細胞RAS-関連cDNAのクローニング この実施例では、PDEsをコードしない四つのヒト多形性
神膠細胞cDNAが単離された。 それらは、遺伝子的に変
換されたS. ce revisiaeとS. pombe酵母株の相補性によ
り得られた。
【０１０１】クローンS46は、S. cerevisiae株RS60.15B
の相補性により選択された。 この株は、RAS2、RAS2
val19ala15の変異対立遺伝子を含み、この細胞は、高め
られた温度ではRAS機能が不完全になるため、36℃では
生育できなくなる[Powers et al.,Mol. Cell. Biol.,
9:390-395 (1989)］。 ヒト多形性神膠細胞ライブラリ
ーからのヒトcDNAは、この欠陥を補足したものが選択さ
れる。 このようにして見つかったものが、S46と称す
るcDNAである。 そのヌクレオチド配列と推定アミノ酸
配列を配列番号：25および26に示した。 その推定アミ
ノ酸配列は、公知のタンパクキナーゼである、S6タンパ
クキナーゼをコードするXenopus leavis遺伝子との相同
物である。
の相補性により選択された。 この株は、RAS2、RAS2
val19ala15の変異対立遺伝子を含み、この細胞は、高め
られた温度ではRAS機能が不完全になるため、36℃では
生育できなくなる[Powers et al.,Mol. Cell. Biol.,
9:390-395 (1989)］。 ヒト多形性神膠細胞ライブラリ
ーからのヒトcDNAは、この欠陥を補足したものが選択さ
れる。 このようにして見つかったものが、S46と称す
るcDNAである。 そのヌクレオチド配列と推定アミノ酸
配列を配列番号：25および26に示した。 その推定アミ
ノ酸配列は、公知のタンパクキナーゼである、S6タンパ
クキナーゼをコードするXenopus leavis遺伝子との相同
物である。
【０１０２】プラスミドpML5は、S. cer evisiae株SKN37
における相補性により選択された。
における相補性により選択された。
【０１０３】この株は、CAP、cap::HIS13の粉砕した対
立遺伝子を含む。 CAPは、未決定機能のタンパク質と
関連するアデニリルシクラーゼをコードする。 [Field
et al.,Cell, 61:319-327 (1990)］。 この遺伝子粉砕
の結果として、SKN37は、富アミノ酸培地で生育しなく
なる [Gerst et al., Mol. Cell . Biol., 11:1248-1257
(1991)］。 この欠陥を補完するヒトcDNAが選択され
た。 このようにして見つかったものが、pML5である。
そのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を配列番
号：27および28に示した。 そのコード能力に関して
は、未だ明らかでない。
立遺伝子を含む。 CAPは、未決定機能のタンパク質と
関連するアデニリルシクラーゼをコードする。 [Field
et al.,Cell, 61:319-327 (1990)］。 この遺伝子粉砕
の結果として、SKN37は、富アミノ酸培地で生育しなく
なる [Gerst et al., Mol. Cell . Biol., 11:1248-1257
(1991)］。 この欠陥を補完するヒトcDNAが選択され
た。 このようにして見つかったものが、pML5である。
そのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を配列番
号：27および28に示した。 そのコード能力に関して
は、未だ明らかでない。
【０１０４】プラスミドpATG16とpATG29が、S. pombe二
倍体株SP565での相補性によって選択された。 この株
は、ras1 (ras1::LEU2) の粉砕とホモ接合する。 結果
として、この株は胞子形成不能となり [Fukui et al.,
Cell, 44:329-336 (1986)］、この欠陥を補完するヒトc
DNAが選択された。 pATG16とpATG29の挿入体のDNA配列
に関する情報を、配列番号：29および30、および31およ
び32に、それぞれ示した。 これら遺伝子は、未知の機
能を持っている。 S. pombeでのスクリーニングに用い
たベクターは、S. cerevisiaeでのスクリーニングに用
いたものとは異なる。 このベクター、pAAUN-ATGは、
S. pombe特異性プロモーター、adhプロモーターとして
実用され、下記のようにして構築された。 クローニン
グベクターpAAUNは、S. cerevisiae LE U2遺伝子をS. po
mbeからの1.8kbpのHindIII ura4断片と置換し、Viera e
t al., Metho ds in Enzymology, 153:3-11 (1987) から
誘導したポリリンカー(PL)のSmaI部位にNotIリンカーを
添加することにより、プラスミドpART1(McLeod et al.,
ENMO J., 6:729-736 (1987))から誘導された。
倍体株SP565での相補性によって選択された。 この株
は、ras1 (ras1::LEU2) の粉砕とホモ接合する。 結果
として、この株は胞子形成不能となり [Fukui et al.,
Cell, 44:329-336 (1986)］、この欠陥を補完するヒトc
DNAが選択された。 pATG16とpATG29の挿入体のDNA配列
に関する情報を、配列番号：29および30、および31およ
び32に、それぞれ示した。 これら遺伝子は、未知の機
能を持っている。 S. pombeでのスクリーニングに用い
たベクターは、S. cerevisiaeでのスクリーニングに用
いたものとは異なる。 このベクター、pAAUN-ATGは、
S. pombe特異性プロモーター、adhプロモーターとして
実用され、下記のようにして構築された。 クローニン
グベクターpAAUNは、S. cerevisiae LE U2遺伝子をS. po
mbeからの1.8kbpのHindIII ura4断片と置換し、Viera e
t al., Metho ds in Enzymology, 153:3-11 (1987) から
誘導したポリリンカー(PL)のSmaI部位にNotIリンカーを
添加することにより、プラスミドpART1(McLeod et al.,
ENMO J., 6:729-736 (1987))から誘導された。
【０１０５】pAAUNは、遺伝子発現のためのS. po mbe ad
hプロモーター、およびDNA複製のためのARS領域を含
む。 プラスミドpAAUN-ATGは、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤａｖｉｄ
Ｂｅａｃｈ氏から得たプラスミドpART8およびpAAUNか
ら誘導された。 pAAUNのBamHI-EcoRV断片は、ポリリン
カーのNdeI部位によって供給されるATG開始コドンを有
するpART8 のBamHIおよびEcoRV断片と置換された。
hプロモーター、およびDNA複製のためのARS領域を含
む。 プラスミドpAAUN-ATGは、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤａｖｉｄ
Ｂｅａｃｈ氏から得たプラスミドpART8およびpAAUNか
ら誘導された。 pAAUNのBamHI-EcoRV断片は、ポリリン
カーのNdeI部位によって供給されるATG開始コドンを有
するpART8 のBamHIおよびEcoRV断片と置換された。
【０１０６】実施例２：相補性によりクローニングされ
た哺乳類遺伝子を用いたハイブリダイゼーショ ンによる哺乳類遺伝子のクローニ
ングと同定 この実施例は、実施例１に記した遺伝子、すなわち、酵
母での相補性によりクローニングされた遺伝子から誘導
された配列を有するプローブへのハイブリダイゼーショ
ンによる他の哺乳類遺伝子のクローニングならびに同定
に関する。
た哺乳類遺伝子を用いたハイブリダイゼーショ ンによる哺乳類遺伝子のクローニ
ングと同定 この実施例は、実施例１に記した遺伝子、すなわち、酵
母での相補性によりクローニングされた遺伝子から誘導
された配列を有するプローブへのハイブリダイゼーショ
ンによる他の哺乳類遺伝子のクローニングならびに同定
に関する。
【０１０７】低ストリンジェントおよび高ストリンジェ
ントのハイブリダイゼーションを、標準濃度の６倍のク
エン酸ナトリウム(SSC)、標準濃度の５倍のDenhardt溶
液、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.05mg/mlの
変性サケ精子DNA、およびプローブを含む水溶液中で、6
5℃で、12〜16時間、同一条件下で行った。 ハイブリ
ダイゼーション後、ニトロセルロース・フィルターを、
５分間、室温にて、２×SSC、0.5％SDSで、そして、20
分間、60℃にて、新鮮な２×SSC、0.5％SDSでインキュ
ベートした。
ントのハイブリダイゼーションを、標準濃度の６倍のク
エン酸ナトリウム(SSC)、標準濃度の５倍のDenhardt溶
液、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.05mg/mlの
変性サケ精子DNA、およびプローブを含む水溶液中で、6
5℃で、12〜16時間、同一条件下で行った。 ハイブリ
ダイゼーション後、ニトロセルロース・フィルターを、
５分間、室温にて、２×SSC、0.5％SDSで、そして、20
分間、60℃にて、新鮮な２×SSC、0.5％SDSでインキュ
ベートした。
【０１０８】高ストリンジェントのハイブリダイゼーシ
ョンのみ、20分間、60℃にて、0.1×SSC、0.1％SDSで洗
浄した。 SSCの標準濃度は、0.15Mクエン酸ナトリウム
および0.15M塩化ナトリウムであり、Denhardt溶液の標
準濃度は、0.2g/l Ficoll、0.2g/lポリビニル／ピロリ
ドン、および0.2g/lウシ血清アルブミンである。
ョンのみ、20分間、60℃にて、0.1×SSC、0.1％SDSで洗
浄した。 SSCの標準濃度は、0.15Mクエン酸ナトリウム
および0.15M塩化ナトリウムであり、Denhardt溶液の標
準濃度は、0.2g/l Ficoll、0.2g/lポリビニル／ピロリ
ドン、および0.2g/lウシ血清アルブミンである。
【０１０９】プラスミドpPDE7、pPDE10X invおよびpPDE
2RRは、pRATDPD挿入体をプローブとして用いたヒト側頭
葉cDNAライブラリーの低ストリンジェントハイブリダイ
ゼーション・スクリーニングによって単離された。 ヌ
クレオチド配列（配列番号：33、34および35、それぞ
れ）比較では、その挿入体が、pPDE2RRの挿入体の推定
アミノ酸配列を示した配列番号：36のpTM72にある挿入
体と同じ遺伝子座と類似していることを示している。
2RRは、pRATDPD挿入体をプローブとして用いたヒト側頭
葉cDNAライブラリーの低ストリンジェントハイブリダイ
ゼーション・スクリーニングによって単離された。 ヌ
クレオチド配列（配列番号：33、34および35、それぞ
れ）比較では、その挿入体が、pPDE2RRの挿入体の推定
アミノ酸配列を示した配列番号：36のpTM72にある挿入
体と同じ遺伝子座と類似していることを示している。
【０１１０】プラスミドpGB14およびpGB18ARRも、同様
の方法で得られた。 DNA配列分析（配列番号：37およ
び39、それぞれ）は、その配列が、pTM3およびpJC44xに
ある挿入体と同じ遺伝子座と類似していることを示して
いる。 挿入体の推定アミノ酸配列を配列番号：38およ
び40に、それぞれ示した。
の方法で得られた。 DNA配列分析（配列番号：37およ
び39、それぞれ）は、その配列が、pTM3およびpJC44xに
ある挿入体と同じ遺伝子座と類似していることを示して
いる。 挿入体の推定アミノ酸配列を配列番号：38およ
び40に、それぞれ示した。
【０１１１】プラスミドpGB25も、プローブとしてpRATD
PD挿入体を用いた低ストリンジェントハイブリダイゼー
ションによって得た。 配列番号：41および42に示し
た、ヌクレオチドと推定アミノ酸配列から判断して、そ
れは、PDE科IVの新規物質であることを表している。
PD挿入体を用いた低ストリンジェントハイブリダイゼー
ションによって得た。 配列番号：41および42に示し
た、ヌクレオチドと推定アミノ酸配列から判断して、そ
れは、PDE科IVの新規物質であることを表している。
【０１１２】pGB25のcDNA挿入体を、pPDE18およびpPDE2
1を得るために、プローブとして用いた。 pPDE18（配
列番号：43）は、pGB25（配列番号：41）と同じ遺伝子
座を示し、pGB25 cDNAよりも多くの配列情報を持ってい
る。 pPDE21挿入体は、PDE科IVの四番目の物質であ
る。 そのDNAと推定アミノ酸配列を、配列番号：45お
よび46に示した。
1を得るために、プローブとして用いた。 pPDE18（配
列番号：43）は、pGB25（配列番号：41）と同じ遺伝子
座を示し、pGB25 cDNAよりも多くの配列情報を持ってい
る。 pPDE21挿入体は、PDE科IVの四番目の物質であ
る。 そのDNAと推定アミノ酸配列を、配列番号：45お
よび46に示した。
【０１１３】これらクローンの発現物質に関する生化学
的データは、未だ得られていない。
的データは、未だ得られていない。
【０１１４】単に、配列関連性を基にして、クラスIVと
した。
した。
【０１１５】実施例３：相補能力によりクローニングし
た遺伝子の特性 この実施例は、遺伝子をクローニングするために当初用
いた酵母株以外の酵母株の能力によって実施例１でクロ
ーニングした遺伝子の特性に、さらに関する。
た遺伝子の特性 この実施例は、遺伝子をクローニングするために当初用
いた酵母株以外の酵母株の能力によって実施例１でクロ
ーニングした遺伝子の特性に、さらに関する。
【０１１６】例えば、10DAB細胞(pde1 - pde2 -)は、DPD
発現プラスミド、 pRATDPDで形質転換され、熱ショック
感受性に関して分析された。 ラットDPD遺伝子の発現
は、実際のところ、宿主を熱ショック耐性にする。 同
様に、pJC44xも、pde1 - pde2 -酵母株形質的欠陥を訂正
できた。
発現プラスミド、 pRATDPDで形質転換され、熱ショック
感受性に関して分析された。 ラットDPD遺伝子の発現
は、実際のところ、宿主を熱ショック耐性にする。 同
様に、pJC44xも、pde1 - pde2 -酵母株形質的欠陥を訂正
できた。
【０１１７】これに対して、pJC99、pJC265およびpJC31
0は、そのようにはできなかった。
0は、そのようにはできなかった。
【０１１８】このことは、後者の挿入体のcDNAsが、cAM
Pホスホジエステラーゼをコードしないことを示唆する
ものである。 むしろ、これら遺伝子は、酵母株TK161-
R2Vを補足する能力によって反映された活性化RA Sタンパ
ク質を用いて、酵母の形質欠陥を訂正できると思われ
る、未決定機能を有するタンパク質をコードする。
Pホスホジエステラーゼをコードしないことを示唆する
ものである。 むしろ、これら遺伝子は、酵母株TK161-
R2Vを補足する能力によって反映された活性化RA Sタンパ
ク質を用いて、酵母の形質欠陥を訂正できると思われ
る、未決定機能を有するタンパク質をコードする。
【０１１９】下記手順は、遺伝子的に変換された宿主で
機能させるために、cDNAsが相補性（あるいは、相補性
によってクローニングにされたDNAsへのハイブリダイゼ
ーション）によってクローニングされる必要の無いよう
にするための方法である。
機能させるために、cDNAsが相補性（あるいは、相補性
によってクローニングにされたDNAsへのハイブリダイゼ
ーション）によってクローニングされる必要の無いよう
にするための方法である。
【０１２０】換言すれば、下記手順は、相補性手段によ
る関連DNAsの最初の直接あるいは間接クローニングを含
む必要のない、本発明による化学薬剤スクリーニング法
を実証するものである。
る関連DNAsの最初の直接あるいは間接クローニングを含
む必要のない、本発明による化学薬剤スクリーニング法
を実証するものである。
【０１２１】Ａ．ウシ脳CaM-PD E をコードするcDNAの発
現による酵母形質補完 A.T.C.C.受託No. 68567の大腸菌が保有するプラスミドp
CAM-40は、61kDaのCa2+／カルモジュリン刺激環状ヌク
レオチド・ホスホジエステラーゼをコードする、ウシ脳
cDNA挿入体を含む。
現による酵母形質補完 A.T.C.C.受託No. 68567の大腸菌が保有するプラスミドp
CAM-40は、61kDaのCa2+／カルモジュリン刺激環状ヌク
レオチド・ホスホジエステラーゼをコードする、ウシ脳
cDNA挿入体を含む。
【０１２２】酵母発現プラスミドpADNSおよびpADANSの
挿入に適用される2.2kbのcDNA断片は、ポリメラーゼ連
鎖反応によるプラスミドpCAM-40 から誘導された。 要
するに、以下のPCR増幅は、ベクターの中のADH1プロモ
ーターで適切に整列させるために、pCAM-40挿入体を変
換するために採用された。
挿入に適用される2.2kbのcDNA断片は、ポリメラーゼ連
鎖反応によるプラスミドpCAM-40 から誘導された。 要
するに、以下のPCR増幅は、ベクターの中のADH1プロモ
ーターで適切に整列させるために、pCAM-40挿入体を変
換するために採用された。
【０１２３】PCR反応に用いた、あるオリゴヌクレオチ
ドプライマー（オリゴA)は、 配列番号：47 5'- tacgaagctttgatggggtctactgctac -3' 塩基対位置100-116において、pCaM-40 cDNAクローンに
アニールし、開始メチオニンコドンの前のHindIII 部位
を含む。
ドプライマー（オリゴA)は、 配列番号：47 5'- tacgaagctttgatggggtctactgctac -3' 塩基対位置100-116において、pCaM-40 cDNAクローンに
アニールし、開始メチオニンコドンの前のHindIII 部位
を含む。
【０１２４】第二オリゴヌクレオチドプライマー（オリ
ゴB)は、 配列番号：48 5'- tacgaagctttgatggttggcttggcatatc -3' 520-538の位置にアニールするようにデザインされてお
り、メチオニンコドンの前のHindIII 部位の二つの塩基
を含む。
ゴB)は、 配列番号：48 5'- tacgaagctttgatggttggcttggcatatc -3' 520-538の位置にアニールするようにデザインされてお
り、メチオニンコドンの前のHindIII 部位の二つの塩基
を含む。
【０１２５】第三オリゴヌクレオチドプライマーは、 配列番号：49 5'- attaaccctcataaag -3' プラスミドの挿入体の3'の位置にアニールする。
【０１２６】ある反応のために、templateとしてのpCAM
-40と共に、オリゴＡとオリゴＣをプライマーとして用
いた。 この反応の核酸生成物は、全読取枠を含んでい
た。
-40と共に、オリゴＡとオリゴＣをプライマーとして用
いた。 この反応の核酸生成物は、全読取枠を含んでい
た。
【０１２７】template pCAM-40に関するオリゴＢとオリ
ゴＣをプライマーとして用いた第二反応では、カルモジ
ュリン結合領域をコードするcDNA配列の部分が欠けた核
酸生成物が産生された。 これら増幅生成物は、HindII
IおよびNotIで分解され、さらにHindIII/NotIで分解し
た酵母発現ベクターpADNSとpADANSに連結された。 挿
入体を含むプラスミド・クローンは、選択され、リチウ
ム酢酸塩形質転換により、S. cerevisiae株10DABに形質
転換された。
ゴＣをプライマーとして用いた第二反応では、カルモジ
ュリン結合領域をコードするcDNA配列の部分が欠けた核
酸生成物が産生された。 これら増幅生成物は、HindII
IおよびNotIで分解され、さらにHindIII/NotIで分解し
た酵母発現ベクターpADNSとpADANSに連結された。 挿
入体を含むプラスミド・クローンは、選択され、リチウ
ム酢酸塩形質転換により、S. cerevisiae株10DABに形質
転換された。
【０１２８】形質転換された酵母は、アミノ酸ロイシン
が欠けた合成培地(SC-ロイシン寒天) を入れた寒天プレ
ート上の布に縞を形成し、３日間、30℃で生長させた。
が欠けた合成培地(SC-ロイシン寒天) を入れた寒天プレ
ート上の布に縞を形成し、３日間、30℃で生長させた。
【０１２９】このプレートのレプリカとして、寒天プレ
ートの３種類を作った。 一つは、SC-ロイシン寒天レ
プリカ、一つは、室温でのYPD寒天レプリカ、そして、5
6℃に温められた三枚のYPD寒天レプリカである。 三枚
のYPD寒天レプリカを、56℃で、10、20および30分間維
持した。 これらレプリカは室温にまで冷却され、そし
てすべてのプレートが30℃に置かれた。 CaM-PDEを発
現するように構築されたプラスミドで形質転換された酵
母は、熱衝撃耐性であった。 具体的には、全読取枠を
発現するようにデザインされた構築物と、末端を削除し
た（カルモジュリン結合部位ではなく、触媒部位を含
む）タンパク質を発現するようにデザインされた構築物
双方共に、pADNSもしくはpADANSのいずれでも、10DAB宿
主細胞の熱ショック感受性形質、すなわち、56℃の温度
衝撃耐性を補完したのである。
ートの３種類を作った。 一つは、SC-ロイシン寒天レ
プリカ、一つは、室温でのYPD寒天レプリカ、そして、5
6℃に温められた三枚のYPD寒天レプリカである。 三枚
のYPD寒天レプリカを、56℃で、10、20および30分間維
持した。 これらレプリカは室温にまで冷却され、そし
てすべてのプレートが30℃に置かれた。 CaM-PDEを発
現するように構築されたプラスミドで形質転換された酵
母は、熱衝撃耐性であった。 具体的には、全読取枠を
発現するようにデザインされた構築物と、末端を削除し
た（カルモジュリン結合部位ではなく、触媒部位を含
む）タンパク質を発現するようにデザインされた構築物
双方共に、pADNSもしくはpADANSのいずれでも、10DAB宿
主細胞の熱ショック感受性形質、すなわち、56℃の温度
衝撃耐性を補完したのである。
【０１３０】Ｂ．発現生成物の生化学的分析 CaM-PDE 発現生成物も、酵母から細胞を含まない抽出物
を調製し、抽出物の生化学的ホスホジエステラーゼ活性
を測定することにより評価された。 この目的のため
に、形質転換した酵母の200ml培地は、１ml当たり約600
万個細胞の密度の液体SC-ロイシンにて生育させた。
細胞は遠心分離によって回収され、細胞ペレットは凍結
された。 抽出物は、氷上に凍結細胞を播き、１mlのPB
Sと等量のグラスビーズと共に細胞を混合し、酵母細胞
を粉砕するために、渦巻攪拌し、および不溶性細胞滓を
取り除くために、５分間、12,000×gで遠心分離するこ
とによって、調製された。 50μlまでの酵母細胞抽出
物は、10×75mmガラス試験管の中の、50mM Tris (pH 8.
0)、1.0ml EGTA、0.01 mg/ml（ウシ血清アルブミン）、
[3H]環状ヌクレオチド(4-10,000cpm/pmol)、および５mM
MgCl2を含む、最終体積250μlにて、30℃にて、ホスホ
ジエステラーゼ活性に関して検定を行った。 インキュ
ベーションは、0.5M炭酸ナトリウム(pH 9.3)、１M塩化
ナトリウム、および0.1％SDSの250μlを添加すること
で、終了した。 ホスホジエステラーゼ反応の生成物
は、BioRad Affi-Gel 601ホウ酸ゲルの８×33mmカラム
でのクロマトグラフィーによって、環状ヌクレオチドか
ら分離された。 カラムは、0.25Mジカルボン酸ナトリ
ウム(pH 9.3)および0.5M塩化ナトリウムで平衡化した。
反応物をカラムに適用した。 分析用チューブを0.25
Mジカルボン酸ナトリウム(pH9.3)および0.5M塩化ナトリ
ウムで濯ぎ、この濯ぎ液をカラムに適用した。 ホウ酸
カラムは、3.75mlの0.25Mジカルボン酸ナトリウム(pH
9.3)および 0.5M塩化ナトリウムで二回洗浄し、さらに
0.5mlの50mM酢酸ナトリウム(pH 4.5)で洗浄した。
を調製し、抽出物の生化学的ホスホジエステラーゼ活性
を測定することにより評価された。 この目的のため
に、形質転換した酵母の200ml培地は、１ml当たり約600
万個細胞の密度の液体SC-ロイシンにて生育させた。
細胞は遠心分離によって回収され、細胞ペレットは凍結
された。 抽出物は、氷上に凍結細胞を播き、１mlのPB
Sと等量のグラスビーズと共に細胞を混合し、酵母細胞
を粉砕するために、渦巻攪拌し、および不溶性細胞滓を
取り除くために、５分間、12,000×gで遠心分離するこ
とによって、調製された。 50μlまでの酵母細胞抽出
物は、10×75mmガラス試験管の中の、50mM Tris (pH 8.
0)、1.0ml EGTA、0.01 mg/ml（ウシ血清アルブミン）、
[3H]環状ヌクレオチド(4-10,000cpm/pmol)、および５mM
MgCl2を含む、最終体積250μlにて、30℃にて、ホスホ
ジエステラーゼ活性に関して検定を行った。 インキュ
ベーションは、0.5M炭酸ナトリウム(pH 9.3)、１M塩化
ナトリウム、および0.1％SDSの250μlを添加すること
で、終了した。 ホスホジエステラーゼ反応の生成物
は、BioRad Affi-Gel 601ホウ酸ゲルの８×33mmカラム
でのクロマトグラフィーによって、環状ヌクレオチドか
ら分離された。 カラムは、0.25Mジカルボン酸ナトリ
ウム(pH 9.3)および0.5M塩化ナトリウムで平衡化した。
反応物をカラムに適用した。 分析用チューブを0.25
Mジカルボン酸ナトリウム(pH9.3)および0.5M塩化ナトリ
ウムで濯ぎ、この濯ぎ液をカラムに適用した。 ホウ酸
カラムは、3.75mlの0.25Mジカルボン酸ナトリウム(pH
9.3)および 0.5M塩化ナトリウムで二回洗浄し、さらに
0.5mlの50mM酢酸ナトリウム(pH 4.5)で洗浄した。
【０１３１】生成物は、0.1Mソルビトールを含む2.5ml
の50mM酢酸ナトリウム(pH 4.5)で溶出し、シンチレーシ
ョン用ガラス瓶に回収した。 溶出物は、4.5ml Ecolit
eシンチレーション・カクテルと共に混合し、液体シン
チレーション分光測定法によって放射能測定した。
の50mM酢酸ナトリウム(pH 4.5)で溶出し、シンチレーシ
ョン用ガラス瓶に回収した。 溶出物は、4.5ml Ecolit
eシンチレーション・カクテルと共に混合し、液体シン
チレーション分光測定法によって放射能測定した。
【０１３２】全読取枠を発現するようにデザインされた
構築物と、末端を削除したタンパク質を発現するように
デザインされた構築物双方共に、pADNSもしくはpADANS
のいずれでも、cAMP基質を用いた細胞抽出物の生化学的
ホスホジエステラーゼ検定により決定されたように、活
性タンパク質を発現した。
構築物と、末端を削除したタンパク質を発現するように
デザインされた構築物双方共に、pADNSもしくはpADANS
のいずれでも、cAMP基質を用いた細胞抽出物の生化学的
ホスホジエステラーゼ検定により決定されたように、活
性タンパク質を発現した。
【０１３３】Ｃ．ウシ副腎cGS-P DE をコードするcDNAの
発現による酵母形質補完 ウシcGMP刺激環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ(c
GS-PDE)をコードする4.2kbのDNA断片を含むプラスミドp
3CGS-5(A.T.C.C. 68597)は、プラスミドへの挿入での使
用に適切な認識部位で、cDNAの最初の147塩基を置換す
ることによって、pADNSおよびpADANSへのクローニング
に適用した。 オリゴヌクレオチドBS1の配列は、 配列番号：50 5' - tacgaagctttgatgcgccgacagcctgc -3' HindIII 部位をコードし、cDNA挿入体の 148-165の位置
へアニールする。
発現による酵母形質補完 ウシcGMP刺激環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ(c
GS-PDE)をコードする4.2kbのDNA断片を含むプラスミドp
3CGS-5(A.T.C.C. 68597)は、プラスミドへの挿入での使
用に適切な認識部位で、cDNAの最初の147塩基を置換す
ることによって、pADNSおよびpADANSへのクローニング
に適用した。 オリゴヌクレオチドBS1の配列は、 配列番号：50 5' - tacgaagctttgatgcgccgacagcctgc -3' HindIII 部位をコードし、cDNA挿入体の 148-165の位置
へアニールする。
【０１３４】BS3 と称するオリゴヌクレオチドは、 配列番号：51 5' - ggtctcctgttgcagatattg -3' 唯一のNsiI部位の3'ちょうどの835-855の位置へアニー
ルする。 HindIIIおよびNsiIでの分解を経たPCR-調製
断片は、次に、HindIII-およびNsiI-分解p3CGS-5に連結
され、これにより、ウシcDNAの当初の5'末端が置換され
た。 この連結によって誘導されたプラスミドは、修飾
cDNA挿入体を放出するために、HindIIIおよびNotIで分
解された。 挿入体は、そのHindIIIおよびNotI部位
で、pADNSおよびpADANSへクローニングされた。 これ
らプラスミドは、リチウム酢酸塩法によって、酵母株10
DABへ形質転換され、形質転換された細胞は増殖され、
そして上記Ａ．で述べた高められた温度条件下に置かれ
た。 双方の形質転換は共に、10DAB宿主細胞の熱ショ
ック感受性形質を補完する結果となった。
ルする。 HindIIIおよびNsiIでの分解を経たPCR-調製
断片は、次に、HindIII-およびNsiI-分解p3CGS-5に連結
され、これにより、ウシcDNAの当初の5'末端が置換され
た。 この連結によって誘導されたプラスミドは、修飾
cDNA挿入体を放出するために、HindIIIおよびNotIで分
解された。 挿入体は、そのHindIIIおよびNotI部位
で、pADNSおよびpADANSへクローニングされた。 これ
らプラスミドは、リチウム酢酸塩法によって、酵母株10
DABへ形質転換され、形質転換された細胞は増殖され、
そして上記Ａ．で述べた高められた温度条件下に置かれ
た。 双方の形質転換は共に、10DAB宿主細胞の熱ショ
ック感受性形質を補完する結果となった。
【０１３５】Ｄ．発現生成物の生化学的分析 cGS-PDEの発現も、酵母から細胞を含まない抽出物を調
製し、抽出物の生化学的ホスホジエステラーゼ活性を測
定することにより評価された。 この目的のために、形
質転換した酵母の50ml培地は、１ml当たり約1000万個細
胞の密度の液体SC-ロイシンにて生育させた。 Sherman
et al., Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (198
6)。 細胞は、遠心分離によって回収され、細胞ペレッ
トは一度水洗いし、そして最終細胞ペレットは凍結し
た。 抽出物を調製するために、氷上に凍結細胞を播
き、１mlのPBSと等量のグラスビーズと共に細胞を混合
し、酵母細胞を粉砕するために、渦巻攪拌し、および細
胞滓を取り除くために、遠心分離した。 上清は、上記
Ｂ．にて述べたように、ホスホジエステラーゼ活性に関
して検定された。
製し、抽出物の生化学的ホスホジエステラーゼ活性を測
定することにより評価された。 この目的のために、形
質転換した酵母の50ml培地は、１ml当たり約1000万個細
胞の密度の液体SC-ロイシンにて生育させた。 Sherman
et al., Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (198
6)。 細胞は、遠心分離によって回収され、細胞ペレッ
トは一度水洗いし、そして最終細胞ペレットは凍結し
た。 抽出物を調製するために、氷上に凍結細胞を播
き、１mlのPBSと等量のグラスビーズと共に細胞を混合
し、酵母細胞を粉砕するために、渦巻攪拌し、および細
胞滓を取り除くために、遠心分離した。 上清は、上記
Ｂ．にて述べたように、ホスホジエステラーゼ活性に関
して検定された。
【０１３６】pADNSもしくはpADANSのいずれにある構築
物も、cGMPを用いた細胞抽出物の生化学的ホスホジエス
テラーゼ検定により決定されたように、活性タンパク質
を発現した。
物も、cGMPを用いた細胞抽出物の生化学的ホスホジエス
テラーゼ検定により決定されたように、活性タンパク質
を発現した。
【０１３７】実施例４：ヌクレオチド配列解析によるク
ローニングされた遺伝子の特性 この実施例では、先の実施例で記した様々なヒトPDEク
ローンの科−類縁を述べる。 これらクローンには、以
下の表３に記したように、相補性により得られるもの
と、ハイブリダイゼーションにより得られるものの双方
を含む。
ローニングされた遺伝子の特性 この実施例では、先の実施例で記した様々なヒトPDEク
ローンの科−類縁を述べる。 これらクローンには、以
下の表３に記したように、相補性により得られるもの
と、ハイブリダイゼーションにより得られるものの双方
を含む。
【０１３８】
【表３】
【０１３９】そのDNAの特徴は、本明細書でPDEクラスIV
1と称する座から誘導されるpPDE21cDNAで表される。
プラスミドpTM3、pJC44x、pGB18ARRおよびpGB14 cDNAは
すべて、本明細書でPDEクラスIV2と称する同じ遺伝子座
から誘導される。 この関連の証拠は、実際の配列同一
性を実証した図１〜４に示されている（なお、図中、小
文字は相同関係の欠如を、また空所は対応塩基位置の欠
落を示している）。
1と称する座から誘導されるpPDE21cDNAで表される。
プラスミドpTM3、pJC44x、pGB18ARRおよびpGB14 cDNAは
すべて、本明細書でPDEクラスIV2と称する同じ遺伝子座
から誘導される。 この関連の証拠は、実際の配列同一
性を実証した図１〜４に示されている（なお、図中、小
文字は相同関係の欠如を、また空所は対応塩基位置の欠
落を示している）。
【０１４０】同様に、 pTM22、 pPDE7、pPDE10Xinv、pP
DE2RR cDNAはすべて、本明細書にてPDEクラスIV4と称す
る遺伝子座から誘導される。 この関連の証拠は、実際
の配列同一性を実証した図５〜８に示されている（な
お、図中、小文字は相同関係の欠如を、また空所は対応
塩基位置の欠落を示している）。
DE2RR cDNAはすべて、本明細書にてPDEクラスIV4と称す
る遺伝子座から誘導される。 この関連の証拠は、実際
の配列同一性を実証した図５〜８に示されている（な
お、図中、小文字は相同関係の欠如を、また空所は対応
塩基位置の欠落を示している）。
【０１４１】pGB25およびpPDE18のcDNAsは、本明細書で
PDEクラスIV3と称する別異の遺伝子座から誘導される。
この関連の証拠は、実際の配列同一性を実証した図９
に示されている（なお、図中、小文字は相同関係の欠如
を、また空所は対応塩基位置の欠落を示している）。
この関連は、以下の表４に記した通りである。
PDEクラスIV3と称する別異の遺伝子座から誘導される。
この関連の証拠は、実際の配列同一性を実証した図９
に示されている（なお、図中、小文字は相同関係の欠如
を、また空所は対応塩基位置の欠落を示している）。
この関連は、以下の表４に記した通りである。
【０１４２】
【表４】
【０１４３】ここにある座から誘導された配列は、細部
にわたって同一ではない。 これら配列のずれは、配列
の誤り、ヒト個体の多様性、クローニング産生物、接合
パターンの相違を含む多数の相違点からもたらされる。
接合パターンの相違は、おそらく、pTM3とpJC44x挿入
体との大きな相違によるものであろう。 pJC44x挿入cD
NAも、クローニング産生物を保有しているであろう。
配列の誤りは、上記したクローニングだけでなく、発行
されたPDE配列についても言える。 自然に起こる配列
の変化あるいは多様性も、観察結果によるものであろ
う。 このことは、前出の座の生成物の推定アミノ酸配
列を、不明確なものにする。 従って、請求したヌクレ
オチド配列には、請求した特定の配列だけでなく、本明
細書で開示したクローニングされた関心のあるcDNAsと
実質的に同じDNA配列も、請求したヌクレオチド配列に
包含されることを望むものである。
にわたって同一ではない。 これら配列のずれは、配列
の誤り、ヒト個体の多様性、クローニング産生物、接合
パターンの相違を含む多数の相違点からもたらされる。
接合パターンの相違は、おそらく、pTM3とpJC44x挿入
体との大きな相違によるものであろう。 pJC44x挿入cD
NAも、クローニング産生物を保有しているであろう。
配列の誤りは、上記したクローニングだけでなく、発行
されたPDE配列についても言える。 自然に起こる配列
の変化あるいは多様性も、観察結果によるものであろ
う。 このことは、前出の座の生成物の推定アミノ酸配
列を、不明確なものにする。 従って、請求したヌクレ
オチド配列には、請求した特定の配列だけでなく、本明
細書で開示したクローニングされた関心のあるcDNAsと
実質的に同じDNA配列も、請求したヌクレオチド配列に
包含されることを望むものである。
【０１４４】PDE科IVクラス１〜４は、ラットDPDと関連
のある遺伝子科を含む。 この根拠は、この科の代表的
なコードされたアミノ酸配列の類似性を基にするもので
ある。
のある遺伝子科を含む。 この根拠は、この科の代表的
なコードされたアミノ酸配列の類似性を基にするもので
ある。
【０１４５】直示的には、PDE科IVのちょうど４物質が
ある。 従って、「ヒトdunce PDEs」なる用語は、科IV
のすべての物質、すなわち、Drosophila dunce PDEへの
ヌクレオチド配列相同性を示す遺伝子を指すものであ
る。
ある。 従って、「ヒトdunce PDEs」なる用語は、科IV
のすべての物質、すなわち、Drosophila dunce PDEへの
ヌクレオチド配列相同性を示す遺伝子を指すものであ
る。
【０１４６】遺伝子科の物質の部分集合のみが、前出の
組織にて発現されるであろう。 それ故、一つもしくは
二、三の組織からクローニングされたcDNAsを研究する
ことによって、遺伝子科を正確に見積もるという試み
は、科の物質の総数を過小評価しかねる。 しかしなが
ら、ゲノミックDNAの分析は、この問題を回避する。
組織にて発現されるであろう。 それ故、一つもしくは
二、三の組織からクローニングされたcDNAsを研究する
ことによって、遺伝子科を正確に見積もるという試み
は、科の物質の総数を過小評価しかねる。 しかしなが
ら、ゲノミックDNAの分析は、この問題を回避する。
【０１４７】ヒトゲノミックDNAは、並行して行われて
いるPCR反応における基質として用いられており、それ
ぞれが、科IV PDEsの様々な領域に対応する多くの異な
るオリゴヌクレオチド対の一つを含んでいる。 選ばれ
た領域は、進化過程において強く保存されていたもの、
および／または、このヒト遺伝子科のすべての公知の物
質中にあるものである。 オリゴヌクレオチドは、所望
のアミノ酸配列を特定するコドンの完全な変性を果たす
混合物に含まれていた。 試験した大多数のオリゴヌク
レオチド対は、長さの点においては不均一ではあるが、
対応cDNAから生成したオリゴヌクレオチド対と常に同等
もしくは長い、という数種の異なるPCR生成物を生成し
た。 しかしながら、生成した二つのオリゴヌクレオチ
ド対のみが、cDNAと同一長さのものを生成した。 オリ
ゴヌクレオチド対が長くなるほど、オリゴヌクレオチド
対のプライミングの結果としての生成物の不均一集団
は、二つの分離エクソンに位置する。 二つのオリゴヌ
クレオチド対は、同じエクソンから抜けた同一長さの生
成物を生成する。
いるPCR反応における基質として用いられており、それ
ぞれが、科IV PDEsの様々な領域に対応する多くの異な
るオリゴヌクレオチド対の一つを含んでいる。 選ばれ
た領域は、進化過程において強く保存されていたもの、
および／または、このヒト遺伝子科のすべての公知の物
質中にあるものである。 オリゴヌクレオチドは、所望
のアミノ酸配列を特定するコドンの完全な変性を果たす
混合物に含まれていた。 試験した大多数のオリゴヌク
レオチド対は、長さの点においては不均一ではあるが、
対応cDNAから生成したオリゴヌクレオチド対と常に同等
もしくは長い、という数種の異なるPCR生成物を生成し
た。 しかしながら、生成した二つのオリゴヌクレオチ
ド対のみが、cDNAと同一長さのものを生成した。 オリ
ゴヌクレオチド対が長くなるほど、オリゴヌクレオチド
対のプライミングの結果としての生成物の不均一集団
は、二つの分離エクソンに位置する。 二つのオリゴヌ
クレオチド対は、同じエクソンから抜けた同一長さの生
成物を生成する。
【０１４８】分離したエクソンから実際にプライミング
した不均一断片集団を確認するために、ヒト科IV PDEゲ
ノミックDNAクローンを対照PCR反応の基質として用い
た。これら実験において、これらクローンの各々が、ゲ
ノミックDNAから得た不均一な生成物の一つと常に同じ
長さの単一PCR 生成物を生成した。
した不均一断片集団を確認するために、ヒト科IV PDEゲ
ノミックDNAクローンを対照PCR反応の基質として用い
た。これら実験において、これらクローンの各々が、ゲ
ノミックDNAから得た不均一な生成物の一つと常に同じ
長さの単一PCR 生成物を生成した。
【０１４９】あるエクソンからプライムしたオリゴヌク
レオチド対を用いた反応の一つからの生成物をクローニ
ングし、配列決定した。
レオチド対を用いた反応の一つからの生成物をクローニ
ングし、配列決定した。
【０１５０】使用したオリゴヌクレオチドは、 配列番号：52 5' ttyaartctnytncargrnga、および 配列番号：53 5' acnatrtctratnaccatytt であり、ｎは四つのヌクレオチドのいずれかであり、ｙ
はｃあるいはｔであり、および、ｒはｇもしくはａであ
る。 これは、図４で囲んだ二つの保存領域で、四つの
有力なアミノ酸配列、 配列番号：54および55に示した FKLLQ(E/G)EN、および 配列番号：56および57に示した DMVID(M/I)V それぞれを特定する完全に変性したコドンに対応する。
これらプライマーを用いて、それぞれ公知のヒト科IV
PDEsの内の一つのヌクレオチド配列に対応する四つの
異なるPCRクローンを得た。 各カテゴリーに該当する
クローンの数は、以下の表５に記載の通りである。
はｃあるいはｔであり、および、ｒはｇもしくはａであ
る。 これは、図４で囲んだ二つの保存領域で、四つの
有力なアミノ酸配列、 配列番号：54および55に示した FKLLQ(E/G)EN、および 配列番号：56および57に示した DMVID(M/I)V それぞれを特定する完全に変性したコドンに対応する。
これらプライマーを用いて、それぞれ公知のヒト科IV
PDEsの内の一つのヌクレオチド配列に対応する四つの
異なるPCRクローンを得た。 各カテゴリーに該当する
クローンの数は、以下の表５に記載の通りである。
【０１５１】
【表５】
【０１５２】ヒト遺伝子それぞれが、（利用可能なゲノ
ミック・クローンのこの分析と一致している）単一コピ
ーとして存在すると仮定すれば、四つのPCR生成物は、
理想的には等頻度で得られるべきである。 ここで得ら
れるわずかに歪んだ頻度分布は、おそらく、PCRオリゴ
ヌクレオチドとのずれによる、PCR反応におけるこれら
生成物の生成での有効性の相違を反映したものであろ
う。 しかしながら、四つの公知の遺伝子すべてが、最
終PCR生成物において認められ、そして新規配列は同定
されなかった。 それ故、ヒトPDE科IVは、四つの物質
すべてから構成されていると思われる。 この方法が、
その科における新規物質を同定しておれば、PCRクロー
ンはcDNAクローンを単離するためのプローブとして用い
られていたであろう。 しかしながら、この科IVには、
図10での囲い部分のアミノ酸配列を特定するコドンにて
分岐した他の物質を有している（なお、図10と11におい
て、小文字は非相同残基を、また空所は整列した位置で
のいかなる残基も欠落していることを示している）。
ミック・クローンのこの分析と一致している）単一コピ
ーとして存在すると仮定すれば、四つのPCR生成物は、
理想的には等頻度で得られるべきである。 ここで得ら
れるわずかに歪んだ頻度分布は、おそらく、PCRオリゴ
ヌクレオチドとのずれによる、PCR反応におけるこれら
生成物の生成での有効性の相違を反映したものであろ
う。 しかしながら、四つの公知の遺伝子すべてが、最
終PCR生成物において認められ、そして新規配列は同定
されなかった。 それ故、ヒトPDE科IVは、四つの物質
すべてから構成されていると思われる。 この方法が、
その科における新規物質を同定しておれば、PCRクロー
ンはcDNAクローンを単離するためのプローブとして用い
られていたであろう。 しかしながら、この科IVには、
図10での囲い部分のアミノ酸配列を特定するコドンにて
分岐した他の物質を有している（なお、図10と11におい
て、小文字は非相同残基を、また空所は整列した位置で
のいかなる残基も欠落していることを示している）。
【０１５３】cDNA挿入体pTM22は、科IVの物質ではない
遺伝子座を意味する。 その証拠として、pTM22挿入体
の推定アミノ酸配列がcAMPホスホジエステラーゼに期待
される遺伝子的特徴を有している反面、この配列が、科
IV、科Ｉ、Ca2+／カルモジュリン・感受性PDEs、もしく
は他の公知のPDE科の物質の配列と特に密接な関連がな
いことが挙げられる。
遺伝子座を意味する。 その証拠として、pTM22挿入体
の推定アミノ酸配列がcAMPホスホジエステラーゼに期待
される遺伝子的特徴を有している反面、この配列が、科
IV、科Ｉ、Ca2+／カルモジュリン・感受性PDEs、もしく
は他の公知のPDE科の物質の配列と特に密接な関連がな
いことが挙げられる。
【０１５４】実施例５：酵素活性を変換する薬品のスク
リーニングおよび同定 最も一般的な形態において、本発明の薬理学的スクリー
ニング方法は、同定可能な形質変換に関連する遺伝子変
換で変換された微生物宿主細胞でのその存在あるいは発
現が、形質変換の訂正に帰する、いかなる哺乳類タンパ
ク質の活性も還元あるいは刺激する薬剤のスクリーニン
グを許容するものである。 二つの一般的なスクリーニ
ングが可能である。 両方法とも、生細胞、あるいは細
胞組織標本、あるいは細胞抽出物に適用できる。
リーニングおよび同定 最も一般的な形態において、本発明の薬理学的スクリー
ニング方法は、同定可能な形質変換に関連する遺伝子変
換で変換された微生物宿主細胞でのその存在あるいは発
現が、形質変換の訂正に帰する、いかなる哺乳類タンパ
ク質の活性も還元あるいは刺激する薬剤のスクリーニン
グを許容するものである。 二つの一般的なスクリーニ
ングが可能である。 両方法とも、生細胞、あるいは細
胞組織標本、あるいは細胞抽出物に適用できる。
【０１５５】Ａ．公知活性のタンパク質に影響を及ぼす
薬剤の同定 第一タイプの薬理学的選抜は、哺乳類遺伝子が公知の部
分をコードし、生化学的機能が検定できる時に適用でき
る。 哺乳類遺伝子は、すでに記したタイプの適切な宿
主発現ベクターを利用することにより、微生物宿主にお
いてまず発現される。 全細胞あるいは宿主細胞のいず
れでも使用できる。 周知の方法、すなわち、細胞を粉
砕し、その細胞性構成物を放出することによって、抽出
物が調製された。 精製哺乳類タンパク質の粗細胞抽出
物は、薬剤の存在下で、公知の生化学的機能について検
定され、そのタンパク質の効果が評価された。 このよ
うにして、哺乳類タンパク質の活性を阻害あるいは刺激
する薬剤が同定された。
薬剤の同定 第一タイプの薬理学的選抜は、哺乳類遺伝子が公知の部
分をコードし、生化学的機能が検定できる時に適用でき
る。 哺乳類遺伝子は、すでに記したタイプの適切な宿
主発現ベクターを利用することにより、微生物宿主にお
いてまず発現される。 全細胞あるいは宿主細胞のいず
れでも使用できる。 周知の方法、すなわち、細胞を粉
砕し、その細胞性構成物を放出することによって、抽出
物が調製された。 精製哺乳類タンパク質の粗細胞抽出
物は、薬剤の存在下で、公知の生化学的機能について検
定され、そのタンパク質の効果が評価された。 このよ
うにして、哺乳類タンパク質の活性を阻害あるいは刺激
する薬剤が同定された。
【０１５６】この種のタイプの手順は、哺乳類cAMPホス
ホジエステラーゼに関する選択された薬剤の効果を分析
するために実行できる。 例えば、内因性PD E1およびPD
E2遺伝子双方を欠いた酵母株は、その中で、哺乳類cAMP
ホスホジエステラーゼをコードするcDNAが適切な発現ベ
クターに導入され、そして発現される、宿主細胞として
使用できる。 かような宿主細胞には、内因性（背景）
cAMPホスホジエステラーゼ活性がないので、特に実用的
である。［Colicelli et al., Proc. Natl.Acad. Sci.
(USA), 86:3599 (1989) ］。 それ故、哺乳類酵素の活
性は、粗細胞抽出物であっても、明確に検定できる。
この手順は、ラットDPD遺伝子生成物の酵素活性が、薬
理学的薬剤RolipramおよびR020 1724によって容易に阻
害されるが、薬理学的薬剤テオフィリンによっては容易
に阻害されない旨の実証を以下に例示した。
ホジエステラーゼに関する選択された薬剤の効果を分析
するために実行できる。 例えば、内因性PD E1およびPD
E2遺伝子双方を欠いた酵母株は、その中で、哺乳類cAMP
ホスホジエステラーゼをコードするcDNAが適切な発現ベ
クターに導入され、そして発現される、宿主細胞として
使用できる。 かような宿主細胞には、内因性（背景）
cAMPホスホジエステラーゼ活性がないので、特に実用的
である。［Colicelli et al., Proc. Natl.Acad. Sci.
(USA), 86:3599 (1989) ］。 それ故、哺乳類酵素の活
性は、粗細胞抽出物であっても、明確に検定できる。
この手順は、ラットDPD遺伝子生成物の酵素活性が、薬
理学的薬剤RolipramおよびR020 1724によって容易に阻
害されるが、薬理学的薬剤テオフィリンによっては容易
に阻害されない旨の実証を以下に例示した。
【０１５７】先の実施例で記した遺伝子および細胞は、
公知の酵素、ラットD PDホスホジエステラーゼの活性を
阻害する化学薬品を同定するために用いることができ
る。
公知の酵素、ラットD PDホスホジエステラーゼの活性を
阻害する化学薬品を同定するために用いることができ
る。
【０１５８】公知の阻害化合物を試験するために、細胞
の無い抽出物を作成した。 内因性ホスホジエステラー
ゼ(10DAB)、および先に記した発現ベクターからのラッ
トDPDまたは酵母PDE2遺伝子の発現を欠く酵母細胞、が
用いられた。 １ｌの培養液が回収され、緩衝液Ｃ (20
mM MES (pH6.2)/0.1mM MgCl2/0.1mM EGTA/1mM 2-メカプ
トエタノール) で洗浄され、1.5 mMフェニルメチルスル
ホニルフルオリドを含む緩衝液Ｃ中で再懸濁され、フレ
ンチプレスで４℃で粉砕された。 細胞抽出物は、100g
で10分間、18000gで90分間で、不純物の除去が行われ
た。 PDE活性は、５０μｇの細胞タンパク質／ml、100
mM Tris (pH 7.5)、10mM Mg++、５μM cAMP、 5'-ヌク
レオチダーゼ、および[3H]cAMPを含む反応混合液中で、
公開された方法(Charbonneau et al., Proc. Natl. Ac a
d. Sci. (USA), 83:9308-9312 (1986);Tempel et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80:1482-1486 (198
3)］によって検定された。
の無い抽出物を作成した。 内因性ホスホジエステラー
ゼ(10DAB)、および先に記した発現ベクターからのラッ
トDPDまたは酵母PDE2遺伝子の発現を欠く酵母細胞、が
用いられた。 １ｌの培養液が回収され、緩衝液Ｃ (20
mM MES (pH6.2)/0.1mM MgCl2/0.1mM EGTA/1mM 2-メカプ
トエタノール) で洗浄され、1.5 mMフェニルメチルスル
ホニルフルオリドを含む緩衝液Ｃ中で再懸濁され、フレ
ンチプレスで４℃で粉砕された。 細胞抽出物は、100g
で10分間、18000gで90分間で、不純物の除去が行われ
た。 PDE活性は、５０μｇの細胞タンパク質／ml、100
mM Tris (pH 7.5)、10mM Mg++、５μM cAMP、 5'-ヌク
レオチダーゼ、および[3H]cAMPを含む反応混合液中で、
公開された方法(Charbonneau et al., Proc. Natl. Ac a
d. Sci. (USA), 83:9308-9312 (1986);Tempel et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80:1482-1486 (198
3)］によって検定された。
【０１５９】AMPは、Bio Rad社からのAG1-X8樹脂を用い
て、cAMPから分離された。 10分間の反応で、約104cpm
が得られ、背景（ホスホジエステラーゼ欠損−酵母ある
いは非抽出物) は、約300cpmであった。 阻害化合物の
存在もしくは欠乏下における、シトソル画分が検定され
た。 これらの検定では、アデノシン3',5'-環状アデノ
シンモノホスフェート(cAMP)のホスホジエステラーゼ触
媒加水分解によって生成された、アデノシン5'- モノホ
スフェート(AMP)の量を測定する。 各抽出物に関し
て、公知阻害剤の様々な濃度に対する阻害率を、表６に
示した。 阻害率は、阻害剤の欠乏下での測定値に関連
するホスホジエステラーゼ活性の低下を示す。Rolipra
m、および関連化合物R020 1724が、DPD活性の最も効果
的な阻害剤であった。
て、cAMPから分離された。 10分間の反応で、約104cpm
が得られ、背景（ホスホジエステラーゼ欠損−酵母ある
いは非抽出物) は、約300cpmであった。 阻害化合物の
存在もしくは欠乏下における、シトソル画分が検定され
た。 これらの検定では、アデノシン3',5'-環状アデノ
シンモノホスフェート(cAMP)のホスホジエステラーゼ触
媒加水分解によって生成された、アデノシン5'- モノホ
スフェート(AMP)の量を測定する。 各抽出物に関し
て、公知阻害剤の様々な濃度に対する阻害率を、表６に
示した。 阻害率は、阻害剤の欠乏下での測定値に関連
するホスホジエステラーゼ活性の低下を示す。Rolipra
m、および関連化合物R020 1724が、DPD活性の最も効果
的な阻害剤であった。
【０１６０】
【表６】
【０１６１】もちろん、この検定は、新規もしくは関連
化学化合物のPDE活性阻害する能力あるいはこの系内で
発現した他のホスホジエステラーゼ活性に関する試験に
も適用することができる。 明らかに、この検定形式
は、検定可能な酵素活性が存在する、類似の方法でクロ
ーニングされ、そして発現された他の遺伝子にも適用で
きる。
化学化合物のPDE活性阻害する能力あるいはこの系内で
発現した他のホスホジエステラーゼ活性に関する試験に
も適用することができる。 明らかに、この検定形式
は、検定可能な酵素活性が存在する、類似の方法でクロ
ーニングされ、そして発現された他の遺伝子にも適用で
きる。
【０１６２】表７にあるように、ホスホジエステラーゼ
活性は、pL22 MetおよびpJC44xそれぞれに、0.04μMと
1.0μM cAMPを用いて決定した。 これらcAMPの濃度
は、各酵素のKm値以下になるように、特に選択されたも
のである。 このように、EC50は、阻害定数あるいは各
酵素のKiと極めて近似になる。 全ての動力学的データ
は、酵素触媒作用の初期速度を示している。
活性は、pL22 MetおよびpJC44xそれぞれに、0.04μMと
1.0μM cAMPを用いて決定した。 これらcAMPの濃度
は、各酵素のKm値以下になるように、特に選択されたも
のである。 このように、EC50は、阻害定数あるいは各
酵素のKiと極めて近似になる。 全ての動力学的データ
は、酵素触媒作用の初期速度を示している。
【０１６３】
【表７】
【０１６４】全形質転換宿主細胞のスクリーニングに
は、以下の方法が適用された。 酵母株10DABは、ヒト
科IVホスホジエステラーゼ、つまり、cAMP特異性PDEを
発現する発現ベクターpAD72で形質転換された。 この
形質転換酵母株は、30℃で、３日間、SC-ロイシン培地
で培養された。 これら培養液は、１ml当たり、約5000
万の細胞密度に達した。 この培養液の一部(300μl)を
採取し、4.8μlの10％DMSO、または適当な濃度のホスホ
ジエステラーゼ阻害剤を含む10％DMSOと混合した。
は、以下の方法が適用された。 酵母株10DABは、ヒト
科IVホスホジエステラーゼ、つまり、cAMP特異性PDEを
発現する発現ベクターpAD72で形質転換された。 この
形質転換酵母株は、30℃で、３日間、SC-ロイシン培地
で培養された。 これら培養液は、１ml当たり、約5000
万の細胞密度に達した。 この培養液の一部(300μl)を
採取し、4.8μlの10％DMSO、または適当な濃度のホスホ
ジエステラーゼ阻害剤を含む10％DMSOと混合した。
【０１６５】処理した培養液を、30℃で、２時間インキ
ュベートした後、３μlの培養液二つが取り除かれ、SC
ロイシン寒天平板に移された。 その後、100μlの培養
液を、処理済培養液から取り除き、12×75mmのガラス性
試験管に移し、鉱油を含んだホット・ブロックで、50℃
で、30分間インキュベートした。 試験管を、ホット・
ブロックから取り出し、室温下に置いた。 ３μlの培
養液二つを取り除き、SCロイシン平板に移した。 寒天
平板は、30℃でインキュベートされ、種々の時間でのテ
ストを行い、成長を観察した。
ュベートした後、３μlの培養液二つが取り除かれ、SC
ロイシン寒天平板に移された。 その後、100μlの培養
液を、処理済培養液から取り除き、12×75mmのガラス性
試験管に移し、鉱油を含んだホット・ブロックで、50℃
で、30分間インキュベートした。 試験管を、ホット・
ブロックから取り出し、室温下に置いた。 ３μlの培
養液二つを取り除き、SCロイシン平板に移した。 寒天
平板は、30℃でインキュベートされ、種々の時間でのテ
ストを行い、成長を観察した。
【０１６６】10％DMSOだけで処理された酵母では、50℃
熱処理を経た生存細胞の数に僅かな減少が見られた。
100μM Rolipramで、約150,000の生存細胞の内、10細胞
以下というように、Rolipramを使用した細胞の処理で
は、生存細胞数が減少した。
熱処理を経た生存細胞の数に僅かな減少が見られた。
100μM Rolipramで、約150,000の生存細胞の内、10細胞
以下というように、Rolipramを使用した細胞の処理で
は、生存細胞数が減少した。
【０１６７】100μMまでのMilrinoneでは、培養液に
は、観察すべき効果はなかった。
は、観察すべき効果はなかった。
【０１６８】Ｂ．未特定機能のタンパク質に影響する薬
剤の同定 本実施例では、酵母で発現した、その機能が未だ特定さ
れていないものであっても、コードした哺乳類タンパク
質の機能に影響を与える化学化合物の同定のために用い
られる遺伝子および上記した方法の使用に関する。
剤の同定 本実施例では、酵母で発現した、その機能が未だ特定さ
れていないものであっても、コードした哺乳類タンパク
質の機能に影響を与える化学化合物の同定のために用い
られる遺伝子および上記した方法の使用に関する。
【０１６９】ホスホジエステラーゼ欠陥である10DAB細
胞は、熱ショック感受性である。
胞は、熱ショック感受性である。
【０１７０】すでに議論したように、これら細胞がpRAT
DPDのcDNAを発現する能力を得た場合、それら細胞は熱
ショック耐性になる。 pRATDPDのcDNAを発現する10DAB
細胞は、定常期で３日間、濃厚培地(YPD)に置いた。
これら培地は、公知のホスホジエステラーゼ阻害剤であ
る、最終濃度が100μMのRolipramで処理した。 対照培
地は、阻害剤処理を一切行わなかった。 これら培地
を、ガラス製試験管内で、50℃で、30分間、熱ショック
を与えた。 各培地の１μl をプレートに置いた。
DPDのcDNAを発現する能力を得た場合、それら細胞は熱
ショック耐性になる。 pRATDPDのcDNAを発現する10DAB
細胞は、定常期で３日間、濃厚培地(YPD)に置いた。
これら培地は、公知のホスホジエステラーゼ阻害剤であ
る、最終濃度が100μMのRolipramで処理した。 対照培
地は、阻害剤処理を一切行わなかった。 これら培地
を、ガラス製試験管内で、50℃で、30分間、熱ショック
を与えた。 各培地の１μl をプレートに置いた。
【０１７１】Rolipram処理した培地は、酵素機能の阻害
を反映して、熱ショックに対してより感受性であった。
を反映して、熱ショックに対してより感受性であった。
【０１７２】薬理学的第二タイプ選抜手段は、哺乳類遺
伝子が未決定機能を有するタンパク質をコードし、それ
故、生化学的活性を検定できない場合でも、適用するこ
とができる。 この方法において試験される薬剤は、哺
乳類タンパク質を発現する遺伝子的に変換された微生物
宿主に直接に適用、あるいは導入される。 哺乳類遺伝
子もしくは遺伝子生成物を阻害できる薬剤は、変換した
宿主での哺乳類タンパク質の発現により当初から訂正さ
れた形質を逆転させる能力によって同定される。
伝子が未決定機能を有するタンパク質をコードし、それ
故、生化学的活性を検定できない場合でも、適用するこ
とができる。 この方法において試験される薬剤は、哺
乳類タンパク質を発現する遺伝子的に変換された微生物
宿主に直接に適用、あるいは導入される。 哺乳類遺伝
子もしくは遺伝子生成物を阻害できる薬剤は、変換した
宿主での哺乳類タンパク質の発現により当初から訂正さ
れた形質を逆転させる能力によって同定される。
【０１７３】この手法は、環状ヌクレオチドホスホジエ
ステラーゼ、および宿主株としてのRAS2 val19を含む酵
母をコードする哺乳類cDNAsについて用いられてきた。
ラットDPD遺伝子が熱ショック感受性宿主に導入されて
発現した場合、宿主株は熱ショック耐性になる。 現耐
性細胞をRolipramでインキュベートした場合、それらは
再度、熱ショック感受性となり、RolipramがラットDPD
遺伝子生成物の活性を阻害していることを示す。 この
薬理学的選抜手段では、DPD遺伝子生成物の機能を判明
させておく必要はない。 これと同様の方法が、他の遺
伝子を評価するために適用できる。
ステラーゼ、および宿主株としてのRAS2 val19を含む酵
母をコードする哺乳類cDNAsについて用いられてきた。
ラットDPD遺伝子が熱ショック感受性宿主に導入されて
発現した場合、宿主株は熱ショック耐性になる。 現耐
性細胞をRolipramでインキュベートした場合、それらは
再度、熱ショック感受性となり、RolipramがラットDPD
遺伝子生成物の活性を阻害していることを示す。 この
薬理学的選抜手段では、DPD遺伝子生成物の機能を判明
させておく必要はない。 これと同様の方法が、他の遺
伝子を評価するために適用できる。
【０１７４】加えて、DPDホスホジエステラーゼ活性に
依存する他の形質は、阻害薬剤の存在によって影響を受
けると思われる。 薬剤もしくは薬品の効果は、上記し
たように、評価することができる。 最後に、最も一般
的な事例においては、酵母にて哺乳類cDNAsから発現し
た未知の機能を有するタンパク質のための阻害薬品は、
同様の方法で見つけることができる。 この方法は、タ
ンパク質の発現の結果生じる形質にのみ依存しており、
その機能に関する知見には依存していない。
依存する他の形質は、阻害薬剤の存在によって影響を受
けると思われる。 薬剤もしくは薬品の効果は、上記し
たように、評価することができる。 最後に、最も一般
的な事例においては、酵母にて哺乳類cDNAsから発現し
た未知の機能を有するタンパク質のための阻害薬品は、
同様の方法で見つけることができる。 この方法は、タ
ンパク質の発現の結果生じる形質にのみ依存しており、
その機能に関する知見には依存していない。
【０１７５】例えば、チロシン・キナーゼは、タンパク
質の非常に大きく多様な上科を包含する。 それらは、
細胞生長の調節において重要である。 あるチロシン・
キナーゼは、細胞中に偏在して発現される。 他のチロ
シン・キナーゼは、組織特異性分布を示す。 そのよう
なチロシン・キナーゼの真の特異的阻害剤は、不必要な
副作用を呈することなく、特異性と所望の治療効果を呈
することが期待される。 例えば、PDGF受容体チロシン
・キナーゼの特異的阻害剤は、アテローム性動脈硬化性
血小板の成長阻止、もしくは傷形成の阻止が期待でき、
ならびにCD4およびCD8 T-細胞受容体からのシグナルを
媒介するlckチロシン・キナーゼの特異的阻害剤は、細
胞毒性を呈さずに、抗炎症性に関して期待がもてる。
質の非常に大きく多様な上科を包含する。 それらは、
細胞生長の調節において重要である。 あるチロシン・
キナーゼは、細胞中に偏在して発現される。 他のチロ
シン・キナーゼは、組織特異性分布を示す。 そのよう
なチロシン・キナーゼの真の特異的阻害剤は、不必要な
副作用を呈することなく、特異性と所望の治療効果を呈
することが期待される。 例えば、PDGF受容体チロシン
・キナーゼの特異的阻害剤は、アテローム性動脈硬化性
血小板の成長阻止、もしくは傷形成の阻止が期待でき、
ならびにCD4およびCD8 T-細胞受容体からのシグナルを
媒介するlckチロシン・キナーゼの特異的阻害剤は、細
胞毒性を呈さずに、抗炎症性に関して期待がもてる。
【０１７６】酵母を、特異的チロシン・キナーゼの阻害
のための薬剤を薬理学的にスクリーニングするために用
いることも可能であろう。 Brugge et al., Mol. Cel
l.Biol., 7:2180-2187 (1987) は、酵母S. cerevisiae
での鳥類v-src遺伝子の発現は、成長を阻害することを
実証した。 ウィルス性遺伝子は、哺乳類および鳥類細
胞に偏在的に発現される細胞性src遺伝子と非常に似通
ったチロシン特異性タンパク質キナーゼをコードする。
もし、これが酵母で発現された活性型哺乳類チロシン
・キナーゼの一般的な特性であれば、薬理学的スクリー
ニングのための下記構想は、その有効性が期待される。
のための薬剤を薬理学的にスクリーニングするために用
いることも可能であろう。 Brugge et al., Mol. Cel
l.Biol., 7:2180-2187 (1987) は、酵母S. cerevisiae
での鳥類v-src遺伝子の発現は、成長を阻害することを
実証した。 ウィルス性遺伝子は、哺乳類および鳥類細
胞に偏在的に発現される細胞性src遺伝子と非常に似通
ったチロシン特異性タンパク質キナーゼをコードする。
もし、これが酵母で発現された活性型哺乳類チロシン
・キナーゼの一般的な特性であれば、薬理学的スクリー
ニングのための下記構想は、その有効性が期待される。
【０１７７】特異性哺乳類チロシン・キナーゼcDNA遺伝
子は、ガラクトース存在下およびグルコース欠乏下で導
入できるGAL10プロモーターなどの導入可能な酵母プロ
モーターの制御下で、酵母シャトルベクターへ挿入する
ことができる。 酵母細胞へのこのベクターの導入は、
かような条件下では、哺乳類チロシン・キナーゼは細胞
の損傷を発現するので、細胞の（グルコースが欠乏した
状態で、ガラクトースを含む）導入培地での生長を不可
能にする。 チロシン・キナーゼの阻害剤の存在下で
は、かような細胞は、導入培地で生長する。 このこと
は、哺乳類チロシン・キナーゼを阻害する薬理学的薬剤
のための単純選抜手段を提供する。 疑似物質として
は、キナーゼの発現の誘導を妨げる薬剤を含む。 かよ
うな疑似物質は、特異性抗体を用いた定量によって決定
される、包含されるべき哺乳類キナーゼの不足によって
区別できる。
子は、ガラクトース存在下およびグルコース欠乏下で導
入できるGAL10プロモーターなどの導入可能な酵母プロ
モーターの制御下で、酵母シャトルベクターへ挿入する
ことができる。 酵母細胞へのこのベクターの導入は、
かような条件下では、哺乳類チロシン・キナーゼは細胞
の損傷を発現するので、細胞の（グルコースが欠乏した
状態で、ガラクトースを含む）導入培地での生長を不可
能にする。 チロシン・キナーゼの阻害剤の存在下で
は、かような細胞は、導入培地で生長する。 このこと
は、哺乳類チロシン・キナーゼを阻害する薬理学的薬剤
のための単純選抜手段を提供する。 疑似物質として
は、キナーゼの発現の誘導を妨げる薬剤を含む。 かよ
うな疑似物質は、特異性抗体を用いた定量によって決定
される、包含されるべき哺乳類キナーゼの不足によって
区別できる。
【０１７８】配列表フリーテキスト <210> 21（配列番号：21） <223> リーディングフレーム中での転換が、この残基に
て起こり得る。
て起こり得る。
【０１７９】
【発明の効果】このように、本発明によれば、所期の目
的であった改善されたクローニング手法、すなわち、既
知および未知の機能に関する遺伝子の単離や、免疫学的
特異性が改善された薬剤へ好適に使用でき、動力学的に
純粋な発現生成物および動力学的に純粋なタンパク質調
製物を必要としない薬剤選抜手段において有用な、改善
されたクローニング手法の提供が実現される。
的であった改善されたクローニング手法、すなわち、既
知および未知の機能に関する遺伝子の単離や、免疫学的
特異性が改善された薬剤へ好適に使用でき、動力学的に
純粋な発現生成物および動力学的に純粋なタンパク質調
製物を必要としない薬剤選抜手段において有用な、改善
されたクローニング手法の提供が実現される。
【０１８０】また、特に、本発明によれば、哺乳類RAS-
関連タンパク質ポリペプチドをコードし、かつ、哺乳類
ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を含む、精製および単離されたＤ
ＮＡ配列が提供される。
関連タンパク質ポリペプチドをコードし、かつ、哺乳類
ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を含む、精製および単離されたＤ
ＮＡ配列が提供される。
【０１８１】SEQUENCE LISTING <110> Cold Spring Harbor Laboratory <120> Cloning by Complementation and Related Proce
sses <130> 981218P-2 <150> US 511,715 <151> 1990-04-20 <160> 57 <170> PatentIn release #1.0, version #1.25 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <400> 1 aagcggccgc 10 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <400> 2 gcggccgctt 10 <210> 3 <211> 2158 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (1)...(1688) <400> 3 agc ttg cga atc gta aga aac aat ttc acc ctg ctg aca aac ctt cac 48 Ser Leu Arg Ile Val Arg Asn Asn Phe Thr Leu Leu Thr Asn Leu His 1 5 10 15 gga gca ccg aac aag agg tcg cca gcg gct agt cag gct cca gtc acc 96 Gly Ala Pro Asn Lys Arg Ser Pro Ala Ala Ser Gln Ala Pro Val Thr 20 25 30 aga gtc agc ctg caa gaa gaa tca tat cag aaa cta gca atg gag acg 144 Arg Val Ser Leu Gln Glu Glu Ser Tyr Gln Lys Leu Ala Met Glu Thr 35 40 45 ctg gag gaa cta gac tgg tgc cta gac cag cta gag acc atc cag acc 192 Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Ile Gln Thr 50 55 60 tac cgc tct gtc agc gag atg gct tca aac aag ttc aaa agg atg ctg 240 Tyr Arg Ser Val Ser Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu 65 70 75 80 aac cgg gag ctg aca cac ctc tca gag atg agc aga tca ggg aac caa 288 Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln 85 90 95 gtg tct gaa tac att tcg aac acg ttc tta gac aag cag aac gat gtg 336 Val Ser Glu Tyr Ile Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln Asn Asp Val 100 105 110 gaa atc cca tct ccc acc cag aag gac agg gag aag aag aag aag cag 384 Glu Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys Asp Arg Glu Lys Lys Lys Lys Gln 115 120 125 cag ctc atg acc cag ata agt gga gtg aag aaa ctg atg cac agc tca 432 Gln Leu Met Thr Gln Ile Ser Gly Val Lys Lys Leu Met His Ser Ser 130 135 140 agc ctg aac aac aca agc atc tca cgc ttt gga gtc aac acg gaa aat 480 Ser Leu Asn Asn Thr Ser Ile Ser Arg Phe Gly Val Asn Thr Glu Asn 145 150 155 160 gag gat cat cta gcc aag gag ctg gaa gac ctg aac aaa tgg ggc ctt 528 Glu Asp His Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Trp Gly Leu 165 170 175 aac atc ttc aac gtg gct ggg tac tcc cat aat cgg ccc ctc aca tgc 576 Asn Ile Phe Asn Val Ala Gly Tyr Ser His Asn Arg Pro Leu Thr Cys 180 185 190 atc atg tac gcc att ttc cag gaa aga gac ctt cta aag acg ttt aaa 624 Ile Met Tyr Ala Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys 195 200 205 atc tcc tcc gac acc ttc gta acc tac atg atg act tta gaa gac cat 672 Ile Ser Ser Asp Thr Phe Val Thr Tyr Met Met Thr Leu Glu Asp His 210 215 220 tac cat tct gat gtg gcg tat cac aac agc ctg cac gct gct gac gtg 720 Tyr His Ser Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala Asp Val 225 230 235 240 gcc cag tca acg cac gtt ctc ctc tct acg cca gca ctg gat gct gtc 768 Ala Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Asp Ala Val 245 250 255 ttc aca gac ctg gaa atc ctg gct gcc att ttt gca gct gcc atc cat 816 Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ala Ala Ile His 260 265 270 gat gtt gat cat cct gga gtc tcc aat cag ttt ctc atc aat aca aat 864 Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn 275 280 285 tcc gaa ctt gct ttg atg tat aat gac gaa tct gtg ctg gaa aac cat 912 Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn His 290 295 300 cac ctc gct gtg gga ttc aag ctc ctt caa gag gaa cat tgc gac atc 960 His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu His Cys Asp Ile 305 310 315 320 ttt cag aat ctt acc aag aag caa cgc cag aca ctc agg aaa atg gtg 1008 Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Thr Leu Arg Lys Met Val 325 330 335 att gac atg gtg tta gca act gat atg tcc aag cac atg agc ctc ctg 1056 Ile Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Ser Leu Leu 340 345 350 gct gac ctt aaa acg atg gta gaa acc aaa aag gtg acg agc tcc ggt 1104 Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly 355 360 365 gtt ctc ctc ctg gac aac tat act gac cgg ata cag gtt ctt cgc aac 1152 Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Thr Asp Arg Ile Gln Val Leu Arg Asn 370 375 380 atg gta cat tgt gca gac ctg agc aac cct acc aag tcc ttg gag ttg 1200 Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Ser Leu Glu Leu 385 390 395 400 tat cgg caa tgg act gat cgc atc atg gag gag ttt ttc caa cag gga 1248 Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe Gln Gln Gly 405 410 415 gac aaa gaa cgg gag agg gga atg gag att agc cca atg tgt gat aaa 1296 Asp Lys Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys 420 425 430 cac aca gct tct gtg gaa aag tcc cag gtt ggt ttc att gac tac att 1344 His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile 435 440 445 gtc cat cca ttg tgg gag acc tgg gca gac ctg gtt cag cct gat gct 1392 Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val Gln Pro Asp Ala 450 455 460 caa gac att ttg gac aca cta gaa gat aac agg aac tgg tac cag agt 1440 Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asn Trp Tyr Gln Ser 465 470 475 480 atg att ccc cag agc ccc tct cca cca ctg gac gag agg agc agg gac 1488 Met Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Pro Leu Asp Glu Arg Ser Arg Asp 485 490 495 tgc caa ggc ctt atg gag aag ttt cag ttc gaa ctg acc ctt gaa gaa 1536 Cys Gln Gly Leu Met Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu 500 505 510 gag gat tct gaa gga ccg gaa aag gag gga gaa ggc ccc aac tat ttc 1584 Glu Asp Ser Glu Gly Pro Glu Lys Glu Gly Glu Gly Pro Asn Tyr Phe 515 520 525 agc agc aca aag aca ctt tgt gtg atc gat cca gag aac agg gat tct 1632 Ser Ser Thr Lys Thr Leu Cys Val Ile Asp Pro Glu Asn Arg Asp Ser 530 535 540 ctg gaa gag act gac ata gac att gcc aca gaa gac aag tct ctg atc 1680 Leu Glu Glu Thr Asp Ile Asp Ile Ala Thr Glu Asp Lys Ser Leu Ile 545 550 555 560 gac aca ta atctccctct gtgtggaggt gaacattcta tccttgacga gcatgccagc 1738 Asp Thr tgagtggtag ggcccaccta ccagagccaa ggcctgcaca aaacaaaggc cacctggctt 1798 tgcagttact tgagtttgga gccagaatgc aaggccgtga agcaaatagc agttccgtgc 1858 tgccttgcct tgccggcgag cttggcgaga cccgcagctg tagtagaagc cagttcccag 1918 cacagctaaa tggcttgaaa acagaggaca gaaagctgag agattgctct gcaataggtg 1978 ttgaggggct gtcccgacag gtgactgaac tcactaacaa cttcatctat aaatctcacc 2038 catcctgttg tctgccaacc tgtgtgcctt ttttgtaaaa tgttttcgtg tctttgaaat 2098 gcctgttgaa tatctagagt ttagtacctc cttctacaaa cttttttgag tctttctggg 2158 <210> 4 <211> 562 <212> PRT <400> 4 Ser Leu Arg Ile Val Arg Asn Asn Phe Thr Leu Leu Thr Asn Leu His 1 5 10 15 Gly Ala Pro Asn Lys Arg Ser Pro Ala Ala Ser Gln Ala Pro Val Thr 20 25 30 Arg Val Ser Leu Gln Glu Glu Ser Tyr Gln Lys Leu Ala Met Glu Thr 35 40 45 Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Ile Gln Thr 50 55 60 Tyr Arg Ser Val Ser Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu 65 70 75 80 Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln 85 90 95 Val Ser Glu Tyr Ile Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln Asn Asp Val 100 105 110 Glu Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys Asp Arg Glu Lys Lys Lys Lys Gln 115 120 125 Gln Leu Met Thr Gln Ile Ser Gly Val Lys Lys Leu Met His Ser Ser 130 135 140 Ser Leu Asn Asn Thr Ser Ile Ser Arg Phe Gly Val Asn Thr Glu Asn 145 150 155 160 Glu Asp His Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Trp Gly Leu 165 170 175 Asn Ile Phe Asn Val Ala Gly Tyr Ser His Asn Arg Pro Leu Thr Cys 180 185 190 Ile Met Tyr Ala Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys 195 200 205 Ile Ser Ser Asp Thr Phe Val Thr Tyr Met Met Thr Leu Glu Asp His 210 215 220 Tyr His Ser Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala Asp Val 225 230 235 240 Ala Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Asp Ala Val 245 250 255 Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ala Ala Ile His 260 265 270 Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn 275 280 285 Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn His 290 295 300 His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu His Cys Asp Ile 305 310 315 320 Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Thr Leu Arg Lys Met Val 325 330 335 Ile Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Ser Leu Leu 340 345 350 Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly 355 360 365 Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Thr Asp Arg Ile Gln Val Leu Arg Asn 370 375 380 Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Ser Leu Glu Leu 385 390 395 400 Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe Gln Gln Gly 405 410 415 Asp Lys Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys 420 425 430 His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile 435 440 445 Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val Gln Pro Asp Ala 450 455 460 Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asn Trp Tyr Gln Ser 465 470 475 480 Met Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Pro Leu Asp Glu Arg Ser Arg Asp 485 490 495 Cys Gln Gly Leu Met Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu 500 505 510 Glu Asp Ser Glu Gly Pro Glu Lys Glu Gly Glu Gly Pro Asn Tyr Phe 515 520 525 Ser Ser Thr Lys Thr Leu Cys Val Ile Asp Pro Glu Asn Arg Asp Ser 530 535 540 Leu Glu Glu Thr Asp Ile Asp Ile Ala Thr Glu Asp Lys Ser Leu Ile 545 550 555 560 Asp Thr <210> 5 <211> 18 <212> DNA <400> 5 caccctgctg acaaacct 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <400> 6 atggagacgc tggaggaa 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <400> 7 atacgccaca tcagaatg 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <400> 8 taccagagta tgattccc 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <400> 9 gtgtcgatca gagacttg 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <400> 10 gcacacaggt tggcagac 18 <210> 11 <211> 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Leu Val Leu His Ala Gly Ala Ala 100 105 110 acc agc cag cgc cgg gag tcc ttc ctg tac cgc tca gac agc gac tat 382 Thr Ser Gln Arg Arg Glu Ser Phe Leu Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr 115 120 125 gac atg tca ccc aag acc atg tcc cgg aac tca tcg gtc acc agc gag 430 Asp Met Ser Pro Lys Thr Met Ser Arg Asn Ser Ser Val Thr Ser Glu 130 135 140 gcg cac gct gaa gac ctc atc gta aca cca ttt gct cag gtg ctg gcc 478 Ala His Ala Glu Asp Leu Ile Val Thr Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala 145 150 155 agc ctc cgg agc gtc cgt agc aac ttc tca ctc ctg acc aat gtg ccc 526 Ser Leu Arg Ser Val Arg Ser Asn Phe Ser Leu Leu Thr Asn Val Pro 160 165 170 175 gtt ccc agt aac aag cgg tcc ccg ctg ggc ggc ccc acc cct gtc tgc 574 Val Pro Ser Asn Lys Arg Ser Pro Leu Gly Gly Pro Thr Pro Val Cys 180 185 190 aag gcc acg ctg tca gaa gaa acg tgt cag cag ttg gcc cgg gag act 622 Lys Ala Thr Leu Ser Glu Glu Thr Cys Gln Gln Leu Ala Arg Glu Thr 195 200 205 ctg gag gag ctg gac tgg tgt ctg gag cag ctg gag acc atg cag acc 670 Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu Glu Gln Leu Glu Thr Met Gln Thr 210 215 220 tat cgc tct gtc agc gag atg gcc tcg cac aag ttc aaa agg atg ttg 718 Tyr Arg Ser Val Ser Glu Met Ala Ser His Lys Phe Lys Arg Met Leu 225 230 235 aac cgt gag ctc aca cac ctg tca gaa atg agc agg tcc gga aac cag 766 Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln 240 245 250 255 gtc tca gag tac att tcc aca aca ttc ctg gac aaa cag aat gaa gtg 814 Val Ser Glu Tyr Ile Ser Thr Thr Phe Leu Asp Lys Gln Asn Glu Val 260 265 270 gag atc cca tca ccc acg atg aag gaa cga gaa aaa cag caa gcg ccg 862 Glu Ile Pro Ser Pro Thr Met Lys Glu Arg Glu Lys Gln Gln Ala Pro 275 280 285 cga cca aga ccc tcc cag ccg ccc ccg ccc cct gta cca cac tta cag 910 Arg Pro Arg Pro Ser Gln Pro Pro Pro Pro Pro Val Pro His Leu Gln 290 295 300 ccc atg tcc caa atc aca ggg ttg aaa aag ttg atg cat agt aac agc 958 Pro Met Ser Gln Ile Thr Gly Leu Lys Lys Leu Met His Ser Asn Ser 305 310 315 ctg aac aac tct aac att ccc cga ttt ggg gtg aag acc gat caa gaa 1006 Leu Asn Asn Ser Asn Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Asp Gln Glu 320 325 330 335 gag ctc ctg gcc caa gaa ctg gag aac ctg aac aag tgg ggc ctg aac 1054 Glu Leu Leu Ala Gln Glu Leu Glu Asn Leu Asn Lys Trp Gly Leu Asn 340 345 350 atc ttt tgc gtg tcg gat tac gct gga ggc cgc tca ctc acc tgc atc 1102 Ile Phe Cys Val Ser Asp Tyr Ala Gly Gly Arg Ser Leu Thr Cys Ile 355 360 365 atg tac atg ata ttc cag gag cgg gac ctg ctg aag aaa ttc cgc atc 1150 Met Tyr Met Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Lys Phe Arg Ile 370 375 380 cct gtg gac acg atg gtg aca tac atg ctg acg ctg gag gat cac tac 1198 Pro Val Asp Thr Met Val Thr Tyr Met Leu Thr Leu Glu Asp His Tyr 385 390 395 cac gct gac gtg gcc tac cat aac agc ctg cac gca gct gac gtg ctg 1246 His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala Asp Val Leu 400 405 410 415 cag tcc acc cac gta ctg ctg gcc acg cct tgg cca acc tta agg aat 1294 Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ala Thr Pro Trp Pro Thr Leu Arg Asn 420 425 430 gca gtg ttc acg gac ctg gag att ctc gcc gcc ctc ttc gcg gct gcc 1342 Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ala 435 440 445 atc cac gat gtg gat cac cct ggg gtc tcc aac cag ttc ctc atc aac 1390 Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn 450 455 460 acc aat tcg gag ctg gcg ctc atg tac aac gat gag tcg gtg ctc gag 1438 Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu 465 470 475 aat cac cac ctg gcc gtg ggc ttc aag ctg ctg cag gag gac aac tgc 1486 Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Asp Asn Cys 480 485 490 495 gac atc ttc cag aac ctc agc aag cgc cag cgg cag agc cta cgc aag 1534 Asp Ile Phe Gln Asn Leu Ser Lys Arg Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys 500 505 510 atg gtc atc gac atg gtg ctg gcc acg gac atg tcc aag cac atg acc 1582 Met Val Ile Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Thr 515 520 525 ctc ctg gct gac ctg aag acc atg gtg gag acc aag aaa gtg acc agc 1630 Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser 530 535 540 tca ggg gtc ctc ctg cta gat aac tac tcc gac cgc atc cag gtc ctc 1678 Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu 545 550 555 cgg aac atg gtg cac tgt gcc gac ctc agc aac ccc acc aag ccg ctg 1726 Arg Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu 560 565 570 575 gag ctg tac cgc cag tgg aca gac cgc atc atg gcc gag ttc ttc cag 1774 Glu Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Ala Glu Phe Phe Gln 580 585 590 cag ggt gac cga gag cgc gag cgt ggc atg gaa atc agc ccc atg tgt 1822 Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys 595 600 605 gac aag cac act gcc tcc gtg gag aag tct cag gtg ggt ttt att gac 1870 Asp Lys His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp 610 615 620 tac att gtg cac cca ttg tgg gag acc tgg gcg gac ctt gtc cac cca 1918 Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val His Pro 625 630 635 gat gcc cag gag atc ttg gac act ttg gag gac aac cgg gac tgg tac 1966 Asp Ala Gln Glu Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asp Trp Tyr 640 645 650 655 tac agc gcc atc cgg cag agc cca tct ccg cca ccc gag gag gag tca 2014 Tyr Ser Ala Ile Arg Gln Ser Pro Ser Pro Pro Pro Glu Glu Glu Ser 660 665 670 agg ggg cca ggc cac cca ccc ctg cct gac aag ttc cag ttt gag ctg 2062 Arg Gly Pro Gly His Pro Pro Leu Pro Asp Lys Phe Gln Phe Glu Leu 675 680 685 acg ctg gag gag gaa gag gag gaa gaa ata tca atg gcc cag ata ccg 2110 Thr Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Ser Met Ala Gln Ile Pro 690 695 700 tgc aca gcc caa gag gca ttg act gag cag gga ttg tca gga gtc gag 2158 Cys Thr Ala Gln Glu Ala Leu Thr Glu Gln Gly Leu Ser Gly Val Glu 705 710 715 gaa gct ctg gat gca acc ata gcc tgg gag gca tcc ccg gcc cag gag 2206 Glu Ala Leu Asp Ala Thr Ile Ala Trp Glu Ala Ser Pro Ala Gln Glu 720 725 730 735 tcg ttg gaa gtt atg gca cag gaa gca tcc ctg gag gcc gag ctg gag 2254 Ser Leu Glu Val Met Ala Gln Glu Ala Ser Leu Glu Ala Glu Leu Glu 740 745 750 gca gtg tat ttg aca cag cag gca cag tcc aca ggc agt gca cct gtg 2302 Ala Val Tyr Leu Thr Gln Gln Ala Gln Ser Thr Gly Ser Ala Pro Val 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Met 355 360 365 Tyr Met Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Lys Phe Arg Ile Pro 370 375 380 Val Asp Thr Met Val Thr Tyr Met Leu Thr Leu Glu Asp His Tyr His 385 390 395 400 Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala Asp Val Leu Gln 405 410 415 Ser Thr His Val Leu Leu Ala Thr Pro Trp Pro Thr Leu Arg Asn Ala 420 425 430 Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ala Ile 435 440 445 His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr 450 455 460 Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn 465 470 475 480 His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Asp Asn Cys Asp 485 490 495 Ile Phe Gln Asn Leu Ser Lys Arg Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met 500 505 510 Val Ile Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Thr Leu 515 520 525 Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser 530 535 540 Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Arg 545 550 555 560 Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu 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ctg cgg cgc cgg ctt gcc gca gac ggc tcc ctg ggc cgc cta gct gag 539 Leu Arg Arg Arg Leu Ala Ala Asp Gly Ser Leu Gly Arg Leu Ala Glu 145 150 155 160 ggc ctc cgc ctg gcc cgg gcc cag ggc ccc gga gcc ttc ggg tcc cac 587 Gly Leu Arg Leu Ala Arg Ala Gln Gly Pro Gly Ala Phe Gly Ser His 165 170 175 ctg agc ctg ccc tcc cca gta gag ttg gag caa gtg cgc cag aag ctg 635 Leu Ser Leu Pro Ser Pro Val Glu Leu Glu Gln Val Arg Gln Lys Leu 180 185 190 ctg cag ctc gtc cgc acc tac tca ccc agc gcc cag gtc aag cgg ctc 683 Leu Gln Leu Val Arg Thr Tyr Ser Pro Ser Ala Gln Val Lys Arg Leu 195 200 205 ctg cag gcc tgc aag ctg ctc tac atg gcc ctg agg acc cag gaa ggg 731 Leu Gln Ala Cys Lys Leu Leu Tyr Met Ala Leu Arg Thr Gln Glu Gly 210 215 220 gag ggc tcg ggt gcc gac ggg ttc ctg cct ctg ctg agc ctc gtc ttg 779 Glu Gly Ser Gly Ala Asp Gly Phe Leu Pro Leu Leu Ser Leu Val Leu 225 230 235 240 gcc cac tgt gac ctt cct gag ctg ctg ctg gag gcc gag tac atg tcg 827 Ala His Cys Asp Leu Pro Glu Leu Leu Leu Glu Ala Glu Tyr Met 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Lys Ile Lys Val Lys Phe Met Thr Met Gln Lys 220 225 230 atg tat tcg ccg gaa aag aag gtc atg ctg ctg ctg cgg gtc tgc aag 773 Met Tyr Ser Pro Glu Lys Lys Val Met Leu Leu Leu Arg Val Cys Lys 235 240 245 ctc att tac acg gtc atg gag aac aac tca ggg agg atg tat ggc gct 821 Leu Ile Tyr Thr Val Met Glu Asn Asn Ser Gly Arg Met Tyr Gly Ala 250 255 260 gat gac ttc ttg cca gtc ctg acc tat gtc ata gcc cag tgt gac atg 869 Asp Asp Phe Leu Pro Val Leu Thr Tyr Val Ile Ala Gln Cys Asp Met 265 270 275 280 ctt gaa ttg gac act gaa atc gag tac atg atg gag ctc cta gac cca 917 Leu Glu Leu Asp Thr Glu Ile Glu Tyr Met Met Glu Leu Leu Asp Pro 285 290 295 tcg ctg tta cat gga gaa gga ggc tat tac ttg aca agc gca tat gga 965 Ser Leu Leu His Gly Glu Gly Gly Tyr Tyr Leu Thr Ser Ala Tyr Gly 300 305 310 gca ctt tct ctg ata aag aat ttc caa gaa gaa caa gca gcg cga ctg 1013 Ala Leu Ser Leu Ile Lys Asn Phe Gln Glu Glu Gln Ala Ala Arg Leu 315 320 325 ctc agc tca gaa acc aga gac acc ctg agg cag tgg cac aaa cgg aga 1061 Leu Ser Ser Glu Thr Arg Asp Thr Leu Arg Gln Trp His Lys Arg Arg 330 335 340 acc acc aac cgg acc atc ccc tct gtg gac gac ttc cag aat tac ctc 1109 Thr Thr Asn Arg Thr Ile Pro Ser Val Asp Asp Phe Gln Asn Tyr Leu 345 350 355 360 cga gtt gca ttt cag gag gtc aac agt ggt tgc aca gga aag acc ctc 1157 Arg Val Ala Phe Gln Glu Val Asn Ser Gly Cys Thr Gly Lys Thr Leu 365 370 375 ctt gtg aga cct tac atc acc act gag gat gtg tgt cag atc tgc gct 1205 Leu Val Arg Pro Tyr Ile Thr Thr Glu Asp Val Cys Gln Ile Cys Ala 380 385 390 gag aag ttc aag gtg ggg gac cct gag gag tac agc ctc ttt ctc ttc 1253 Glu Lys Phe Lys Val Gly Asp Pro Glu Glu Tyr Ser Leu Phe Leu Phe 395 400 405 gtt gac gag aca tgg cag cag ctg gca gag gac act tac cct caa aaa 1301 Val Asp Glu Thr Trp Gln Gln Leu Ala Glu Asp Thr Tyr Pro Gln Lys 410 415 420 atc aag gcg gag ctg cac agc cga cca cag ccc cac atc ttc cac ttt 1349 Ile Lys Ala Glu Leu His Ser Arg Pro Gln Pro His Ile Phe His Phe 425 430 435 440 gtc tac aaa cgc atc aag aac gat cct tat ggc atc att ttc cag aac 1397 Val Tyr Lys Arg Ile Lys Asn Asp Pro Tyr Gly Ile Ile Phe Gln Asn 445 450 455 ggg gaa gaa gac ctc acc acc tcc tagaagacag gcgggacttc ccagtggtgc 1451 Gly Glu Glu Asp Leu Thr Thr Ser 460 atccaaaggg gagctggaag ccttgccttc ccgcttctac atgcttgagc ttgaaaagca 1511 gtcacctcct cggggacccc tcagtgtagt gactaagcca tccacaggcc aactcggcca 1571 agggcaactt tagccacgca aggtagctga ggtttgtgaa acagtaggat tctcttttgg 1631 caatggagaa ttgcatctga tggttcaagt gtcctgagat tgtttgctac ctacccccag 1691 tcaggttcta ggttggctta caggtatgta tatgtgcaga agaaacactt aagatacaag 1751 ttcttttgaa ttcaacagca gatgcttgcg atgcagtgcg tcaggtgatt ctcactcctg 1811 tggatggctt catccctg 1829 <210> 16 <211> 464 <212> PRT <400> 16 Met Ser Ile Ser Thr Ser Ser Ser Asp Ser Leu Glu Phe Asp Arg Ser 1 5 10 15 Met Pro Leu Phe Gly Tyr Glu Ala Asp Thr Asn Ser Ser Leu Glu Asp 20 25 30 Tyr Glu Gly Glu Ser Asp Gln Glu Thr Met Ala Pro Pro Ile Lys Ser 35 40 45 Lys Lys Lys Arg Ser Ser Ser Phe Val Leu Pro Lys Leu Val Lys Ser 50 55 60 Gln Leu Gln Lys 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acc gtg gtg aca atg gcc agc 384 Ser Ser Gln Asp Arg Leu Leu Pro Met Thr Val Val Thr Met Ala Ser 115 120 125 gcc agg gtg cag gac ctg atc ggg ctc atc tgc tgg cag tat aca agc 432 Ala Arg Val Gln Asp Leu Ile Gly Leu Ile Cys Trp Gln Tyr Thr Ser 130 135 140 gaa gga cgg gag ccg aag ctc aat gac aat gtc agt gcc tac tgc ctg 480 Glu Gly Arg Glu Pro Lys Leu Asn Asp Asn Val Ser Ala Tyr Cys Leu 145 150 155 160 cat att gct gag gat gat ggg gag gtg gac acc gat ttc ccc ccg ctg 528 His Ile Ala Glu Asp Asp Gly Glu Val Asp Thr Asp Phe Pro Pro Leu 165 170 175 gat tcc aat gag ccc att cat aag ttt ggc ttc agt act ttg gcc ctg 576 Asp Ser Asn Glu Pro Ile His Lys Phe Gly Phe Ser Thr Leu Ala Leu 180 185 190 gtt gaa aag tac tca tct cct ggt ctg aca tcc aaa gag tca ctc ttt 624 Val Glu Lys Tyr Ser Ser Pro Gly Leu Thr Ser Lys Glu Ser Leu Phe 195 200 205 gtt cga ata aat gct gct cat gga ttc tcc ctt att cag gtg gac aac 672 Val Arg Ile Asn Ala Ala His Gly Phe Ser Leu Ile Gln Val Asp Asn 210 215 220 aca aag gtt acc atg aag 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ata gac cct gtt acg aat cag aaa gcc agc act aag ttt tgg 1056 Val Glu Ile Asp Pro Val Thr Asn Gln Lys Ala Ser Thr Lys Phe Trp 340 345 350 att aag cag aaa ccc atc tca atc gat tcc gac ctg ctc tgt gcc tgt 1104 Ile Lys Gln Lys Pro Ile Ser Ile Asp Ser Asp Leu Leu Cys Ala Cys 355 360 365 gac ctt gct gaa gag aaa agc ccc agt cac gca ata ttt aaa ctc acg 1152 Asp Leu Ala Glu Glu Lys Ser Pro Ser His Ala Ile Phe Lys Leu Thr 370 375 380 tat cta agc aat cac gac tat aaa cac ctc tac ttt gaa tcg gac gct 1200 Tyr Leu Ser Asn His Asp Tyr Lys His Leu Tyr Phe Glu Ser Asp Ala 385 390 395 400 gct acc gtc aat gaa att gtg ctc aag gtt aac tac atc ctg gaa tcg 1248 Ala Thr Val Asn Glu Ile Val Leu Lys Val Asn Tyr Ile Leu Glu Ser 405 410 415 cga gct agc act gcc cgg gct gac tac ttt gct caa aaa aaa agc ggc 1296 Arg Ala Ser Thr Ala Arg Ala Asp Tyr Phe Ala Gln Lys Lys Ser Gly 420 425 430 cgc 1299 Arg <210> 18 <211> 433 <212> PRT <400> 18 Gly Arg Ile Ala Asp Pro Ala Arg Ser Val Glu Ala Ala Ser Ala Gln 1 5 10 15 Arg Leu 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Ala Ala Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser 220 225 230 aac cag ttc ctc atc aac acc aat tcg gag ctg gcg ctc atg tac aac 1492 Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn 235 240 245 250 gat gag tcg gtg ctc gag aat cac cac ctg gcc gtg ggc ttc aag ctg 1540 Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu 255 260 265 ctg cag gag gac aac tgc gac atc ttc cag aac ctc agc aag cgc cag 1588 Leu Gln Glu Asp Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Ser Lys Arg Gln 270 275 280 cgc aga gcc tac gca aga tgg tca tcg aca tgg tgc tgg cca cgg aca 1636 Arg Arg Ala Tyr Ala Arg Trp Ser Ser Thr Trp Cys Trp Pro Arg Thr 285 290 295 tgt cca agc aca tg acc ctc ctg gct gac ctg aag acc atg gtg gag 1683 Cys Pro Ser Thr Thr Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu 300 305 310 acc aag aaa gtg acc agc tca ggg gtc ctc ctg cta gat aac tac tcc 1731 Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser 315 320 325 gac cgc atc cag gtc ctc cgg aac atg gtg cac tgt gcc gac ctc agc 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agc cac agc agc ccc tct gcc ctg gct ctt caa 2451 Phe Val Val Ala Val Ser His Ser Ser Pro Ser Ala Leu Ala Leu Gln 555 560 565 agc ccc ctt ctc cct gct tgg agg acc ctg tct gtt tca gag cat gcc 2499 Ser Pro Leu Leu Pro Ala Trp Arg Thr Leu Ser Val Ser Glu His Ala 570 575 580 585 ccg ggc ctc ccg ggc ctc ccc tcc acg gcg gcc gag gtg gag gcc caa 2547 Pro Gly Leu Pro Gly Leu Pro Ser Thr Ala Ala Glu Val Glu Ala Gln 590 595 600 cga gag cac cag gct gcc aag agg gct tgc agt gcc tgc gca ggg aca 2595 Arg Glu His Gln Ala Ala Lys Arg Ala Cys Ser Ala Cys Ala Gly Thr 605 610 615 ttt ggg gag gac aca tcc gca ctc cca gct cct ggt ggc ggg ggg tca 2643 Phe Gly Glu Asp Thr Ser Ala Leu Pro Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser 620 625 630 ggt gga gac cct acc tgatccccag acctctgtcc ctgttcccct ccactcctcc 2698 Gly Gly Asp Pro Thr 635 cctcactccc ctgctccccc gaccacctcc tcctctgcct caaagactct tgtcctcttg 2758 tccctcctga gatttttttt tttttttttt tttttttttt ttttacaaca caaatgaatg 2818 ggccatttta ttgattttta cctcctaata gtggatacag gttgctgtgg tttccagcag 2878 gatctcagat gcaaagggaa gtgaagaaaa cagatgaatc cctagggtac cccgccatgg 2938 aaccaaacac cacgtcaact ggaactcttc ttgcaaacga aggctgaaga tcaagaatga 2998 cattctcaca ccacagcaca gcttaaatac ttctttgaca aaaataataa taaattatat 3058 ttgactcaga aaataaattc tgttcagcag agtgacagga ggtaaaaatc aaatgaatgg 3118 gcaatgcggc cgc 3131 <210> 22 <211> 638 <212> PRT <400> 22 Met Gln Thr Tyr Arg Ser Val Ser Glu Met Ala Ser His Lys Phe Lys 1 5 10 15 Arg Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Val Ser Glu Tyr Ile Ser Thr Thr Phe Leu Asp Lys Gln 35 40 45 Asn Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro Thr Met Lys Glu Arg Glu Lys Gln 50 55 60 Gln Ala Pro Arg Pro Arg Pro Ser Gln Pro Pro Pro Pro Pro Val Pro 65 70 75 80 His Leu Gln Pro Met Ser Gln Ile Thr Gly Leu Lys Lys Leu Met His 85 90 95 Ser Asn Ser Leu Asn Asn Ser Asn Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr 100 105 110 Asp Gln Glu Glu Leu Leu Ala Gln Glu Leu Glu Asn Leu Asn Lys Trp 115 120 125 Gly Leu Asn Ile Phe Cys Val Ser Asp Tyr Ala Gly 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Gly Arg 30 35 40 agg tgt tgc tca gga aac tta cag tta cca cca ctg tct caa aga cag 315 Arg Cys Cys Ser Gly Asn Leu Gln Leu Pro Pro Leu Ser Gln Arg Gln 45 50 55 agt gaa agg gca agg act cct gag gga gat ggt att tcc agg ccg acc 363 Ser Glu Arg Ala Arg Thr Pro Glu Gly Asp Gly Ile Ser Arg Pro Thr 60 65 70 75 aca ctg cct ttg aca acg ctt cca agc att gct att aca act gta agc 411 Thr Leu Pro Leu Thr Thr Leu Pro Ser Ile Ala Ile Thr Thr Val Ser 80 85 90 cag gag tgc ttt gat gtg gaa aat ggc cct tcc cca ggt cgg agt cca 459 Gln Glu Cys Phe Asp Val Glu Asn Gly Pro Ser Pro Gly Arg Ser Pro 95 100 105 ctg gat ccc cag gcc agc tct tcc gct ggg ctg gta ctt cac gcc acc 507 Leu Asp Pro Gln Ala Ser Ser Ser Ala Gly Leu Val Leu His Ala Thr 110 115 120 ttt cct ggg cac agc cag cgc aga gag tca ttt ctc tac aga tca gac 555 Phe Pro Gly His Ser Gln Arg Arg Glu Ser Phe Leu Tyr Arg Ser Asp 125 130 135 agc gac tat gac ttg tca cca aag gcg atg tcg aga aac tct tct ctt 603 Ser Asp Tyr Asp Leu Ser Pro Lys Ala Met Ser Arg Asn Ser 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1611 Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu His 480 485 490 tgt gac atc ttc atg aat ctc acc aag aag cag cgt cag aca ctc agg 1659 Cys Asp Ile Phe Met Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Thr Leu Arg 495 500 505 aag atg gtt att gac atg gtg tta gca act gat atg tct aaa cat atg 1707 Lys Met Val Ile Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met 510 515 520 agc ctg ctg gca gac ctg aag aca atg gta gaa acg aag aaa gtt aca 1755 Ser Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr 525 530 535 agt tca ggc gtt ctt ctc cta gac aac tat acc gat cgc att cag gtc 1803 Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Thr Asp Arg Ile Gln Val 540 545 550 555 ctt cgc aac atg gta cac tgt gca gac ctg agc aac ccc acc aag tcc 1851 Leu Arg Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Ser 560 565 570 ttg gaa ttg tat cgg caa tgg aca gac cgc atc atg gag gaa ttt ttc 1899 Leu Glu Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe 575 580 585 cag cag gga gac aaa gag cgg gag agg gga atg gaa att agc cca atg 1947 Gln Gln Gly Asp Lys Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met 590 595 600 tgt gat aaa cac aca gct tct gtg gaa aaa tcc cag gtt ggt ttc atc 1995 Cys Asp Lys His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile 605 610 615 gac tac att gtc cat cca ttg tgg gag aca tgg gca gat ttg gta cag 2043 Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val Gln 620 625 630 635 cct gat gct cag gac att ctc gat acc tta gaa gat aac agg aac tgg 2091 Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asn Trp 640 645 650 tat cag agc atg ata cct caa agt ccc tca cca cca ctg gac gag cag 2139 Tyr Gln Ser Met Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Pro Leu Asp Glu Gln 655 660 665 aac agg gac tgc cag ggt ctg atg gag aag ttt cag ttt gaa ctg act 2187 Asn Arg Asp Cys Gln Gly Leu Met Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr 670 675 680 ctc gat gag gaa gat tct gaa gga cct gag aag gag gga gag gga cac 2235 Leu Asp Glu Glu Asp Ser Glu Gly Pro Glu Lys Glu Gly Glu Gly His 685 690 695 agc tat ttc agc agc aca 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Ser Asn Ser Pro Gly Gln Pro Asn Ser Val Lys Arg Lys Lys Leu 110 115 120 125 cct gta gat agt gtc ttt aac aaa ttt gag gat gaa gac agt gat gac 914 Pro Val Asp Ser Val Phe Asn Lys Phe Glu Asp Glu Asp Ser Asp Asp 130 135 140 gta ccc cga aaa agg aaa ctg gtt ccc ttg gat tat ggt gaa gat gat 962 Val Pro Arg Lys Arg Lys Leu Val Pro Leu Asp Tyr Gly Glu Asp Asp 145 150 155 aaa aat gca acc aaa ggc act gta aac act gaa gaa aag cgt aaa cac 1010 Lys Asn Ala Thr Lys Gly Thr Val Asn Thr Glu Glu Lys Arg Lys His 160 165 170 att aag agt ctc att gag aaa atc cct aca gcc aaa cct gag ctc ttc 1058 Ile Lys Ser Leu Ile Glu Lys Ile Pro Thr Ala Lys Pro Glu Leu Phe 175 180 185 gct tat ccc ctg gat tgg tct att gtg gat tct ata ctg atg gaa cgt 1106 Ala Tyr Pro Leu Asp Trp Ser Ile Val Asp Ser Ile Leu Met Glu Arg 190 195 200 205 cga att aga cca tgg att aat aag aaa atc ata gaa tat ata ggt gaa 1154 Arg Ile Arg Pro Trp Ile Asn Lys Lys Ile Ile Glu Tyr Ile Gly Glu 210 215 220 gaa gaa gct aca tta gtt gat ttt gtt tgt tct aag gtt atg gct cat 1202 Glu Glu Ala Thr Leu Val Asp Phe Val Cys Ser Lys Val Met Ala His 225 230 235 agt tca ccc cag agc att tta gat gat gtt gcc atg gta ctt gat gaa 1250 Ser Ser Pro Gln Ser Ile Leu Asp Asp Val Ala Met Val Leu Asp Glu 240 245 250 gaa gca gaa gtt ttt ata gtc aaa atg tgg aga tta ttg ata tat gaa 1298 Glu Ala Glu Val Phe Ile Val Lys Met Trp Arg Leu Leu Ile Tyr Glu 255 260 265 aca gaa gcc aag aaa att ggt ctt gtg aag ta aaacttttta tatttagagt 1350 Thr Glu Ala Lys Lys Ile Gly Leu Val Lys 270 275 tccatttcag atttcttctt tgccaccctt ttaaggactt tgaatttttc tttgtctttg 1410 aagacattgt gagatctgta attttttttt tttgtagaaa atgtgaattt tttggtcctc 1470 taatttgttg ttgccctgtg tactcccttg gttgtaaagt catctgaatc cttggttctc 1530 tttatactca ccaggtacaa attactggta tgttttataa gccgcagcta ctgtacacag 1590 cctatctgat ataatcttgt tctgctgatt tgtttcttgt aaatattaaa acgactcccc 1650 aattaaaaaa aaaaaatgcg gccgc 1675 <210> 30 <211> 279 <212> PRT <400> 30 Met Glu Gln Glu Ala Glu Arg Arg Arg Gln Pro Gln Ile Lys Gln Glu 1 5 10 15 Pro Glu Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Gln Glu Lys Glu Glu Lys 20 25 30 Arg Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Glu Glu Pro Glu Gln Lys Pro Cys 35 40 45 Leu Lys Pro Thr Leu Arg Pro Ile Ser Ser Ala Pro Ser Val Ser Ser 50 55 60 Ala Ser Gly Asn Ala Thr Pro Asn Thr Pro Gly Asp Glu Ser Pro Cys 65 70 75 80 Gly Ile Ile Ile Pro His Glu Asn Ser Pro Asp Gln Gln Gln Pro Glu 85 90 95 Glu His Arg Pro Lys Ile Gly Leu Ser Leu Lys Leu Gly Ala Ser Asn 100 105 110 Ser Pro Gly Gln Pro Asn Ser Val Lys Arg Lys Lys Leu Pro Val Asp 115 120 125 Ser Val Phe Asn Lys Phe Glu Asp Glu Asp Ser Asp Asp Val Pro Arg 130 135 140 Lys Arg Lys Leu Val Pro Leu Asp Tyr Gly Glu Asp Asp Lys Asn Ala 145 150 155 160 Thr Lys Gly Thr Val Asn Thr Glu Glu Lys Arg Lys His Ile Lys Ser 165 170 175 Leu Ile Glu Lys Ile Pro Thr Ala Lys Pro Glu Leu Phe Ala Tyr Pro 180 185 190 Leu Asp Trp Ser Ile Val Asp Ser Ile Leu Met Glu Arg Arg Ile Arg 195 200 205 Pro Trp Ile Asn Lys Lys Ile Ile Glu Tyr Ile Gly Glu Glu Glu Ala 210 215 220 Thr Leu Val Asp Phe Val Cys Ser Lys Val Met Ala His Ser Ser Pro 225 230 235 240 Gln Ser Ile Leu Asp Asp Val Ala Met Val Leu Asp Glu Glu Ala Glu 245 250 255 Val Phe Ile Val Lys Met Trp Arg Leu Leu Ile Tyr Glu Thr Glu Ala 260 265 270 Lys Lys Ile Gly Leu Val Lys 275 <210> 31 <211> 3073 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (3)...(1111) <400> 31 gc ggc cgc gcg ccg cat tcg gag agc gga ccc cag aga gcc ctg agc 47 Gly Arg Ala Pro His Ser Glu Ser Gly Pro Gln Arg Ala Leu Ser 1 5 10 15 agc ccc acc gcc gcc gcc ggc cta gtt acc atc aca ccc cgg gag gag 95 Ser Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Val Thr Ile Thr Pro Arg Glu Glu 20 25 30 ccg cag ctg ccg cag ccg gcc cca gtc acc atc acc gca acc atg agc 143 Pro Gln Leu Pro Gln Pro Ala Pro Val Thr Ile Thr Ala Thr Met Ser 35 40 45 agc gag gcc gag acc cag cag ccg ccc gcc gcc ccc ccc gcc gcc ccc 191 Ser Glu Ala Glu Thr Gln Gln Pro Pro Ala Ala Pro Pro Ala Ala Pro 50 55 60 gcc ctc agc gcc gcc gac acc aag ccc ggc act acg ggc agc ggc gca 239 Ala Leu Ser Ala Ala Asp Thr Lys Pro Gly Thr Thr Gly Ser Gly Ala 65 70 75 ggg agc ggt ggc ccg ggc ggc ctc aca tcg gcg gcg cct gcc ggc ggg 287 Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gly Leu Thr Ser Ala Ala Pro Ala Gly Gly 80 85 90 95 gac aag aag gtc atc gca acg aag gtt ttg gga aca gta aaa tgg ttc 335 Asp Lys Lys Val Ile Ala Thr Lys Val Leu Gly Thr Val Lys Trp Phe 100 105 110 aat gta agg aac gga tat ggt ttc atc aac agg aat gac acc aag gaa 383 Asn Val Arg Asn Gly Tyr Gly Phe Ile Asn Arg Asn Asp Thr Lys Glu 115 120 125 gat gta ttt gta cac cag act gcc ata aag aag aat aac ccc agg aag 431 Asp Val Phe Val His Gln Thr Ala Ile Lys Lys Asn Asn Pro Arg Lys 130 135 140 tac ctt cgc agt gta gga gat gga gag act gtg gag ttt gat gtt gtt 479 Tyr Leu Arg Ser Val Gly Asp Gly Glu Thr Val Glu Phe Asp Val Val 145 150 155 gaa gga gaa aag ggt gcg gag gca gca aat gtt aca ggt cct ggt ggt 527 Glu Gly Glu Lys Gly Ala Glu Ala Ala Asn Val Thr Gly Pro Gly Gly 160 165 170 175 gtt cca gtt caa ggc agt aaa tat gca gca gac cgt aac cat tat aga 575 Val Pro Val Gln Gly Ser Lys Tyr Ala Ala Asp Arg Asn His Tyr Arg 180 185 190 cgc tat cca cgt cgt agg ggt cct cca cgc aat tac cag caa aat tac 623 Arg Tyr Pro Arg Arg Arg Gly Pro Pro Arg Asn Tyr Gln Gln Asn Tyr 195 200 205 cag aat agt gag agt ggg gaa aag aac gag gga tcg gag agt gct ccc 671 Gln Asn Ser Glu Ser Gly Glu Lys Asn Glu Gly Ser Glu Ser Ala Pro 210 215 220 gaa ggc cag gcc caa caa cgc cgg ccc tac cgc agg cga agg ttc cca 719 Glu Gly Gln Ala Gln Gln Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Arg Arg Phe Pro 225 230 235 cct tac tac atg cgg aga ccc tat ggg cgt cga cca cag tat tcc aac 767 Pro Tyr Tyr Met Arg Arg Pro Tyr Gly Arg Arg Pro Gln Tyr Ser Asn 240 245 250 255 cct cct gtg cag gga gaa gtg atg gag ggt gct gac aac cag ggt gca 815 Pro Pro Val Gln Gly Glu Val Met Glu Gly Ala Asp Asn Gln Gly Ala 260 265 270 gga gaa caa ggt aga cca gtg agg cag aat atg tat cgg gga tat aga 863 Gly Glu Gln Gly Arg Pro Val Arg Gln Asn Met Tyr Arg Gly Tyr Arg 275 280 285 cca cga ttc cgc agg ggc cct cct cgc caa aga cag cct aga gag gac 911 Pro Arg Phe Arg Arg Gly Pro Pro Arg Gln Arg Gln Pro Arg Glu Asp 290 295 300 ggc aat gaa gaa gat aaa gaa aat caa gga gat gag acc caa ggt cag 959 Gly Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Gln Gly Asp Glu Thr Gln Gly Gln 305 310 315 cag cca cct caa cgt cgg tac cgc cgc aac ttc aat tac cga cgc aga 1007 Gln Pro Pro Gln Arg Arg Tyr Arg Arg Asn Phe Asn Tyr Arg Arg Arg 320 325 330 335 cgc cca gaa aac cct aaa cca caa gat ggc aaa gag aca aaa gca gcc 1055 Arg Pro Glu Asn Pro Lys Pro Gln Asp Gly Lys Glu Thr Lys Ala Ala 340 345 350 gat cca cca gct gag aat tcg tcc gct ccc gag gct gag cag ggc ggg 1103 Asp Pro Pro Ala Glu Asn Ser Ser Ala Pro Glu Ala Glu Gln Gly Gly 355 360 365 gct gag ta aatgccggct taccatctct accatcatcc ggtttagtca tccaacaaga 1161 Ala Glu agaaatatga aattccagca ataagaaatg aacaaaagat tggagctgaa gacctaaagt 1221 gcttgctttt tgcccgttga ccagataaat agaactatct gcattatcta tgcagcatgg 1281 ggtttttatt atttttacct aaagacgtct ctttttggta ataacaaacg tgttttttaa 1341 aaaagcctgg tttttctcaa tacgccttta aaggttttta aattgtttca tatctggtca 1401 agttgagatt tttaagaact tcatttttaa tttgtaataa aagtttacaa cttgattttt 1461 tcaaaaaagt caacaaactg caagcacctg ttaataaagg tcttaaataa ttgtctttgt 1521 gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag cttggtattc attacttcat 1581 gtatatcaag cacagcagta aaacaaaaac ccatgtattt aacttttttt taggattttt 1641 gcttttgtga tttttttttt tttttttttg atacttgcct aacatgcatg tgctgtaaaa 1701 atagttaaca gggaaataac ttgagatgat ggctagcttt gtttaatgtc ttatgaaatt 1761 ttcatgaaca atccaagcat aattgttaag aacacgtgta ttaaattcat gtaagtggaa 1821 taaaagtttt atgaatggac ttttcaacta ctttctctac agcttttcat gtaaattagt 1881 cttggttctg aaacttctct aaaggaaatt gtacattttt tgaaatttat tccttattcc 1941 ctcttggcag ctaatgggct cttaccaagt ttaaacacaa aatttatcat aacaaaaata 2001 ctactaatat aactactgtt tccatgtccc atgatcccct ctcttcctcc ccaccctgaa 2061 aaaaatgagt tcctattttt tctgggagag ggggggattg attagaaaaa aatgtagtgt 2121 gttccattta aaattttggc atatggcatt ttctaactta ggaagccaca atgttcttgg 2181 cccatcatga cattgggtag cattaactgt aagttttgtg cttccaaatc actttttggt 2241 ttttaagaat ttcttgatac tcttatagcc tgccttcaat tttgatcctt tattctttct 2301 atttgtcagg tgcacaagat taccttcctg ttttagcctt ctgtcttgtc accaaccatt 2361 cttacttggt ggccatgtac ttggaaaaag gccgcatgat ctttctggct ccactcagtg 2421 tctaaggcac cctgcttcct ttgcttgcat cccacagact atttccctca tcctatttac 2481 tgcagcaaat ctctccttag ttgatgagac tgtgtttatc tccctttaaa accctaccta 2541 tcctgaatgg tctgtcattg tctgccttta aaatccttcc tctttcttcc tcctctattc 2601 tctaaataat gatggggcta agttataccc aaagctcact ttacaaaata tttcctcagt 2661 actttgcaga aaacaccaaa caaaaatgcc attttaaaaa aggtgtattt tttcttttag 2721 aatgtaagct cctcaagagc agggacaatg ttttctgtat gttctattgt gcctagtaca 2781 ctgtaaatgc tcaatgaata ttatccctaa tacctgccac cccactctta atcagtggtg 2841 gaagaacggt ctcagaactg tttgtttcaa ttggccattt aagtttagta gtaaaagact 2901 ggttaatgat aacaatgcat cgtaaaacct tcagaaggaa aggagaatgt tttgtggacc 2961 actttggttt tcttttttgc gtgtggcagt tttaagttat tagtttttaa aatcagtact 3021 ttttaatgga aacaacttga ccaaaaattt gtcacagaat tttggcggcc gc 3073 <210> 32 <211> 369 <212> PRT <400> 32 Gly Arg Ala Pro His Ser Glu Ser Gly Pro Gln Arg Ala Leu Ser Ser 1 5 10 15 Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Val Thr Ile Thr Pro Arg Glu Glu Pro 20 25 30 Gln Leu Pro Gln Pro Ala Pro Val Thr Ile Thr Ala Thr Met Ser Ser 35 40 45 Glu Ala Glu Thr Gln Gln Pro Pro Ala Ala Pro Pro Ala Ala Pro Ala 50 55 60 Leu Ser Ala Ala Asp Thr Lys Pro Gly Thr Thr Gly Ser Gly Ala Gly 65 70 75 80 Ser Gly Gly Pro Gly Gly Leu Thr Ser Ala Ala Pro Ala Gly Gly Asp 85 90 95 Lys Lys Val Ile Ala Thr Lys Val Leu Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn 100 105 110 Val Arg Asn Gly Tyr Gly Phe Ile Asn Arg Asn Asp Thr Lys Glu Asp 115 120 125 Val Phe Val His Gln Thr Ala Ile Lys Lys Asn Asn Pro Arg Lys Tyr 130 135 140 Leu Arg Ser Val Gly Asp Gly Glu Thr Val Glu Phe Asp Val Val Glu 145 150 155 160 Gly Glu Lys Gly Ala Glu Ala Ala Asn Val Thr Gly Pro Gly Gly Val 165 170 175 Pro Val Gln Gly Ser Lys Tyr Ala Ala Asp Arg Asn His Tyr Arg Arg 180 185 190 Tyr Pro Arg Arg Arg Gly Pro Pro Arg Asn Tyr Gln Gln Asn Tyr Gln 195 200 205 Asn Ser Glu Ser Gly Glu Lys Asn Glu Gly Ser Glu Ser Ala Pro Glu 210 215 220 Gly Gln Ala Gln Gln Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Arg Arg Phe Pro Pro 225 230 235 240 Tyr Tyr Met Arg Arg Pro Tyr Gly Arg Arg Pro Gln Tyr Ser Asn Pro 245 250 255 Pro Val Gln Gly Glu Val Met Glu Gly Ala Asp Asn Gln Gly Ala Gly 260 265 270 Glu Gln Gly Arg Pro Val Arg Gln Asn Met Tyr Arg Gly Tyr Arg Pro 275 280 285 Arg Phe Arg Arg Gly Pro Pro Arg Gln Arg Gln Pro Arg Glu Asp Gly 290 295 300 Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Gln Gly Asp Glu Thr Gln Gly Gln Gln 305 310 315 320 Pro Pro Gln Arg Arg Tyr Arg Arg Asn Phe Asn Tyr Arg Arg Arg Arg 325 330 335 Pro Glu Asn Pro Lys Pro Gln Asp Gly Lys Glu Thr Lys Ala Ala Asp 340 345 350 Pro Pro Ala Glu Asn Ser Ser Ala Pro Glu Ala Glu Gln Gly Gly Ala 355 360 365 Glu <210> 33 <211> 1811 <212> DNA <400> 33 gaattcctgg tagggccagc ccaccatggg ggccaagacc tgcacaggac aagggccacc 60 tggcctttca gttacttgag tttggagtca gaaagcaaga ccaggaagca aatagcagct 120 caggaaatcc cacggttgac ttgccttgat ggcaagcttg gtggagaggg ctgaagctgt 180 tgctgggggc cgattctgat caagacacat ggcttgaaaa tggaagacac aaaactgaga 240 gatcattctg cactaagttt cgggaactta tccccgacag tgactgaact cactgactaa 300 taacttcatt tatgaatctt ctcccttgtc cctttgtctg ccaacctgtg tgcctttttt 360 gtaaaacatt ttcatgtctt taaaatgcct gttgaatacc tggagtttag tatcaacttc 420 tacacagata agctttcaaa gttgacaaac ttttttgact ctttctggaa aagggaaaga 480 aaatagtctt ccttctttct tgggcaatat ccttcacttt actacagtta cttttgcaaa 540 cagacagaaa ggatacactt ctaaccacat tttacttcct tcccctgttg tccagtccaa 600 ctccacagtc actcttaaaa cttctctctg tttgcctgcc tccaacagta cttttaactt 660 tttgctgtaa acagaataaa attgaacaaa ttagggggta gaaaggagca gtggtgtcgt 720 tcaccgtgag agtctgcata gaactcagca gtgtgccctg ctgtgtcttg gaccctgccc 780 cccacaggag ttgtacagtc cctggccctg ttccctacct cctctcttca ccccgttagg 840 ctgttttcaa tgtaatgctg ccgtccttct cttgcactgc cttctgcgct aacacctcca 900 ttcctgttta taaccgtgta tttattactt aatgtatata atgtaatgtt ttgtaagtta 960 ttaatttata tatctaacat tgcctgccaa tggtggtgtt aaatttgtgt agaaaactct 1020 gcctaagagt tacgactttt tcttgtaatg ttttgtattg tgtattatat aacccaaacg 1080 tcacttagta gagacatatg gcccccttgg cagagaggac aggggtgggc ttttgttcaa 1140 agggtctgcc ctttccctgc ctgagttgct acttctgcac aaccccttta tgaaccagtt 1200 ttggaaacaa tattctcaca ttagatacta aatggtttat actgagcttt tacttttgta 1260 tagcttgata ggggcagggg gcaatgggat gtagttttta cccaggttct atccaaatct 1320 atgtgggcat gagttgggtt ataactggat cctactatca ttgtggcttt ggttcaaaag 1380 gaaacactac atttgctcac agatgattct tctgaatgct cccgaactac tgactttgaa 1440 gaggtagcct cctgcctgcc attaagcagg aatgtcatgt tccagttcat tacaaaagaa 1500 aacaataaaa caatgtgaat ttttataata aaatgtgaac tgatgtagca aattacgcaa 1560 atgtgaagcc tcttctgata acacttgtta ggcctcttac tgatgtcagt ttcagtttgt 1620 aaaatatgtt tcatgctttc agttcagcat tgtgactcag taattacaga aaatggcaca 1680 aatgtgcatg accaatgggt ttgtatgtct atgaacactg cattgtttca ggtggacatt 1740 ttatcatttt caaatgtttc tcacaatgta tgttatagta ttattattat atattgtgtt 1800 caaatgcatt c 1811 <210> 34 <211> 1672 <212> DNA <400> 34 gaattcccca ccatgggggc caagacctgc acaggacaag gccacctggc ctttcagtta 60 cttgagtttg gagtcagaaa gcaagaccag gaagcaaata gcagctcagg aaatcccacg 120 gttgacttgc cttgatggca agcttggtgg agagggctga agctgttgct gggggccgtt 180 ctgatcaaga cacatggctt gaaaatggaa gacacaaaac tgagagatca ttctgcacta 240 agtttcggga acttatcccc gacagtgact gaactcactg actaataact tcatttatga 300 atcttctccc ttgtcccttt gtctgccaac ctgtgtgcct tttttgtaaa acatttcagt 360 ctttaaaatg cctgttgaat acctggagtt agatcaactt ctacacagat aagctttcaa 420 agttgacaaa cttttttgac tcttctggaa aagggaaaga aaatagtctt ccttctttct 480 tgggcaatat ccttcacttt actacagtta cttttgcaaa cagacagaaa ggatacactt 540 ctaaccacat tttacttcct tcccctgttg tccagtccaa ctccacagtc actcttaaaa 600 cttctctctg tttgcctgcc tccaacagta cttttaactt ttaacttttt gctgtaaaca 660 gaataaaatt gaacaaatta gggggtagaa aggagcagtg gtgtcgttca ccgtgagagt 720 ctgcatagaa ctcagcagtg tgccctgctg tgtcttggac cctgcccccc acaggagttg 780 tacagtccct ggccctgttc cctacctcct ctcttcaccc cgttaggctg ttttcaatgt 840 aatgctgccg tccttctctt gcactgcctt ctgcgctaac acctccattc ctgtttataa 900 ccgtgtattt attacttaat gtatataatg taatgttttg taagttatta atttatatat 960 ctaacattgc ctgccaatgg tggtgttaaa tttgtgtaga aaactctgcc taagagttac 1020 gactttttct tgtaatgttt tgtattgtgt attatataac ccaaacgtca cttagtagag 1080 acatatggcc cccttggcag agaggacagg ggtgggcttt tgttcaaagg gtctgccctt 1140 tccctgcctg agttgctact tctgcacaac ccctttatga accagttttg gaaacaatat 1200 tctcacatta gatactaaat ggtttatact gagcttttac ttttgtatag cttgataggg 1260 gcagggggca atgggatgta gtttttaccc aggttctatc caaatctatg tgggcatgag 1320 ttgggttata actggatcct actatcattg tggctttggt tcaaaaggaa acactacatt 1380 tgctcacaga tgattcttct gaatgctccc gaactactga ctttgaagag gtagcctcct 1440 gcctgccatt aagcaggaat gtcatgttcc agttcattac aaaagaaaac aataaaacaa 1500 tgtgaatttt tataataaaa tgtgaactga tgtagcaaat tacgcaaatg tgaagcctct 1560 tctgataaca cttgttaggc ctcttactga tgtcagtttc agtttgtaaa atatgtttca 1620 tgctttcagt tcagcattgt gactcagtaa ttacagaaaa aaaaaagaat tc 1672 <210> 35 <211> 1649 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (210)...(1018) <400> 35 gaattccttc tgacgtggca tatcacaaca gcctgcacgc tgctgatgta gcccagtcga 60 cccatgttct cctttctaca ccagcattag acgctgtctt cacagatttg gaaatcctgg 120 ctgccatttt tgcagctgcc atccatgacg ttgatcatcc tggagtctcc aatcagtttc 180 tcatcaacac aaattcagaa cttgctttg atg tat aat gat gaa tct gtg ttg 233 Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu 1 5 gaa aat cat cac ctt gct gtg ggt ttc aaa ctg ctg caa gaa gaa cac 281 Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu His 10 15 20 tgt gac atc ttc atg aat ctc acc aag aag cag cgt cag aca ctc agg 329 Cys Asp Ile Phe Met Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Thr Leu Arg 25 30 35 40 aag atg gtt att gac atg gtg tta gca act gat atg tct aaa cat atg 377 Lys Met Val Ile Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met 45 50 55 agc ctg ctg gca gac ctg aag aca atg gta gaa acg aag aaa gtt aca 425 Ser Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr 60 65 70 agt tca ggc gtt ctt ctc cta gac aac tat acc gat cgc att cag gtc 473 Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Thr Asp Arg Ile Gln Val 75 80 85 ctt cgc aac atg gta cac tgt gca gac ctg agc aac ccc acc aag tcc 521 Leu Arg Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Ser 90 95 100 ttg gaa ttg tat cgg caa tgg aca gac cgc atc atg gag gaa ttt ttc 569 Leu Glu Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe 105 110 115 120 cag cag gga gac aaa gag cgg gag agg gga atg gaa att agc cca atg 617 Gln Gln Gly Asp Lys Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met 125 130 135 tgt gat aaa cac aca gct tct gtg gaa aaa tcc cag gtt ggt ttc atc 665 Cys Asp Lys His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile 140 145 150 gac tac att gtc cat cca ttg tgg gag aca tgg gca gat ttg gta cag 713 Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val Gln 155 160 165 cct gat gct cag gac att ctc gat acc tta gaa gat aac agg aac tgg 761 Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asn Trp 170 175 180 tat cag agc atg ata cct caa agt ccc tca cca cca ctg gac gag cag 809 Tyr Gln Ser Met Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Pro Leu Asp Glu Gln 185 190 195 200 aac agg gac tgc cag ggt ctg atg gag aag ttt cag ttt gaa ctg act 857 Asn Arg Asp Cys Gln Gly Leu Met Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr 205 210 215 ctc gat gag gaa gat tct gaa gga cct gag aag gag gga gag gga cac 905 Leu Asp Glu Glu Asp Ser Glu Gly Pro Glu Lys Glu Gly Glu Gly His 220 225 230 agc tat ttc agc agc aca aag acg ctt tgt gtg att gat cca gaa aac 953 Ser Tyr Phe Ser Ser Thr Lys Thr Leu Cys Val Ile Asp Pro Glu Asn 235 240 245 aga gat tcc ctg gga gag act gac ata gac att gca aca gaa gac aag 1001 Arg Asp Ser Leu Gly Glu Thr Asp Ile Asp Ile Ala Thr Glu Asp Lys 250 255 260 tcc ccc gtg gat aca ta atccccctct ccctgtggag atgaacattc 1048 Ser Pro Val Asp Thr 265 tatccttgat gagcatgcca gctatgtggt agggccagcc caccatgggg gccaagacct 1108 gcacaggaca agggccacct ggcctttcag ttacttgagt ttggagtcag aaagcaagac 1168 caggaagcaa atagcagctc aggaaatccc acggttgact tgccttgatg gcaagcttgg 1228 tggagagggc tgaagctgtt gctgggggcc gattctgatc aagacacatg gcttgaaaat 1288 ggaagacaca aaaccgagag atcattctgc actaagtttc gggaacttat ccccgacagt 1348 gactgaactc actgactaat aacttcattt atgaatcttc tcccttgtcc ctttgtctgc 1408 caacctgtgt gccttttttg taaaacattt tcatgtcttt aaaatgcctg ttgaatacct 1468 ggagtttagt atcaacttct acacagataa gctttcaaag ttgacaaact tttttgactc 1528 tttctggaaa agggaaagaa aatagtcttc cttctttctt gggcaatatc cttcacttta 1588 ctacagttac ttttgcaaac agacagaaag gatacacttc taaccacatt ttacggaatt 1648 c 1649 <210> 36 <211> 269 <212> PRT <400> 36 Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly 1 5 10 15 Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu His Cys Asp Ile Phe Met Asn Leu Thr 20 25 30 Lys Lys Gln Arg Gln Thr Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Met Val Leu 35 40 45 Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Ser Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr 50 55 60 Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp 65 70 75 80 Asn Tyr Thr Asp Arg Ile Gln Val Leu Arg Asn Met Val His Cys Ala 85 90 95 Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Ser Leu Glu Leu Tyr Arg Gln Trp Thr 100 105 110 Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe Gln Gln Gly Asp Lys Glu Arg Glu 115 120 125 Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Thr Ala Ser Val 130 135 140 Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp 145 150 155 160 Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val Gln Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp 165 170 175 Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asn Trp Tyr Gln Ser Met Ile Pro Gln Ser 180 185 190 Pro Ser Pro Pro Leu Asp Glu Gln Asn Arg Asp Cys Gln Gly Leu Met 195 200 205 Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Asp Glu Glu Asp Ser Glu Gly 210 215 220 Pro Glu Lys Glu Gly Glu Gly His Ser Tyr Phe Ser Ser Thr Lys Thr 225 230 235 240 Leu Cys Val Ile Asp Pro Glu Asn Arg Asp Ser Leu Gly Glu Thr Asp 245 250 255 Ile Asp Ile Ala Thr Glu Asp Lys Ser Pro Val Asp Thr 260 265 <210> 37 <211> 609 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (2)...(606) <400> 37 g aat tcc aac att ccc cga ttt ggg gtg aag acc gat caa gaa gag 46 Asn Ser Asn Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Asp Gln Glu Glu 1 5 10 15 ctc ctg gcc caa gaa ctg gag aac ctg aac aag tgg ggc ctg aac atc 94 Leu Leu Ala Gln Glu Leu Glu Asn Leu Asn Lys Trp Gly Leu Asn Ile 20 25 30 ttt tgc gtg tcg gat tac gct gga ggc cgc tca ctc acc tgc atc atg 142 Phe Cys Val Ser Asp Tyr Ala Gly Gly Arg Ser Leu Thr Cys Ile Met 35 40 45 tac atg ata ttc cag gag cgg gac ctg ctg aag aaa ttc cgc atc cct 190 Tyr Met Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Lys Phe Arg Ile Pro 50 55 60 gtg gac acg atg gtg aca tac atg ctg acg ctg gag gat cac tac cac 238 Val Asp Thr Met Val Thr Tyr Met Leu Thr Leu Glu Asp His Tyr His 65 70 75 gct gac gtg gcc tac cat aac agc ctg cac gca gct gac gtg ctg cag 286 Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala Asp Val Leu Gln 80 85 90 95 tcc acc cac gta ctg ctg gcc acg cct gca cta gat gca gtg ttc acg 334 Ser Thr His Val Leu Leu Ala Thr Pro Ala Leu Asp Ala Val Phe Thr 100 105 110 gac ctg gag att ctc gcc gcc ctc ttc gcg gct gcc atc cac gat gtg 382 Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ala Ile His Asp Val 115 120 125 gat cac cct ggg gtc tcc aac cag ttc ctc atc aac acc aat tcg gag 430 Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu 130 135 140 ctg gcg ctc atg tac aac gat gag tcg gtg ctc gag aat cac cac ctg 478 Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn His His Leu 145 150 155 gcc gtg ggc ttc aag ctg ctg cag gag gac aac tgc gac atc ttc cag 526 Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Asp Asn Cys Asp Ile Phe Gln 160 165 170 175 aac ctc agc aag cgc cag cgg cag agc tac gca aga tgg tca tcg aca 574 Asn Leu Ser Lys Arg Gln Arg Gln Ser Tyr Ala Arg Trp Ser Ser Thr 180 185 190 tgg tgc tgg cca cgg aca tgt cca agc aca tg acc 609 Trp Cys Trp Pro Arg Thr Cys Pro Ser Thr 195 200 <210> 38 <211> 201 <212> PRT <400> 38 Asn Ser Asn Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Asp Gln Glu Glu Leu 1 5 10 15 Leu Ala Gln Glu Leu Glu Asn Leu Asn Lys Trp Gly Leu Asn Ile Phe 20 25 30 Cys Val Ser Asp Tyr Ala Gly Gly Arg Ser Leu Thr Cys Ile Met Tyr 35 40 45 Met Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Lys Phe Arg Ile Pro Val 50 55 60 Asp Thr Met Val Thr Tyr Met Leu Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala 65 70 75 80 Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala Asp Val Leu Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Leu Leu Ala Thr Pro Ala Leu Asp Ala Val Phe Thr Asp 100 105 110 Leu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ala Ile His Asp Val Asp 115 120 125 His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu 130 135 140 Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala 145 150 155 160 Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Asp Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn 165 170 175 Leu Ser Lys Arg Gln Arg Gln Ser Tyr Ala Arg Trp Ser Ser Thr Trp 180 185 190 Cys Trp Pro Arg Thr Cys Pro Ser Thr 195 200 <210> 39 <211> 1230 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (3)...(1156) <400> 39 ac atg gtg cac tgt gcc gac ctc agc aac ccc acc aag ccg ctg gag 47 Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Glu 1 5 10 15 ctg tac cgc cag tgg aca gac cgc atc atg gcc gag ttc ttc cag cag 95 Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Ala Glu Phe Phe Gln Gln 20 25 30 ggt gac cga gag cgc gag cgt ggc atg gaa atc agc ccc atg tgt gac 143 Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp 35 40 45 aag cac act gcc tcc gtg gag aag tct cag gtg ggt ttt att gac tac 191 Lys His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr 50 55 60 att gtg cac cca ttg tgg gag acc tgg gcg gac ctt gtc cac cca gat 239 Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp 65 70 75 gcc cag gag atc ttg gac act ttg gag gac aac cgg gac tgg tac tac 287 Ala Gln Glu Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asp Trp Tyr Tyr 80 85 90 95 agc gcc atc cgg cag agc cca tct ccg cca ccc gag gag gag tca agg 335 Ser Ala Ile Arg Gln Ser Pro Ser Pro Pro Pro Glu Glu Glu Ser Arg 100 105 110 ggg cca ggc cac cca ccc ctg cct gac aag ttc cag ttt gac gtg acg 383 Gly Pro Gly His Pro Pro Leu Pro Asp Lys Phe Gln Phe Asp Val Thr 115 120 125 ctg gag gag gaa gag gag gaa gaa ata tca atg gcc cag ata ccg tgc 431 Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Ser Met Ala Gln Ile Pro Cys 130 135 140 aca gcc caa gag gca ttg act gcg cag gga ttg tca gga gtc gag gaa 479 Thr Ala Gln Glu Ala Leu Thr Ala Gln Gly Leu Ser Gly Val Glu Glu 145 150 155 gct ctg gat gca acc ata gcc tgg gag gca tcc ccg gcc cag gag tcg 527 Ala Leu Asp Ala Thr Ile Ala Trp Glu Ala Ser Pro Ala Gln Glu Ser 160 165 170 175 ttg gaa gtt atg gca cag gaa gca tcc ctg gag gcc gag ctg gag gca 575 Leu Glu Val Met Ala Gln Glu Ala Ser Leu Glu Ala Glu Leu Glu Ala 180 185 190 gng tat ttg aca cag cag gca cag tcc aca ggc agt gca cct gtg gct 623 Val Tyr Leu Thr Gln Gln Ala Gln Ser Thr Gly Ser Ala Pro Val Ala 195 200 205 ccg gat gag ttc tcg tcc cgg gag gaa ttc gtg gtt gct gta agc cac 671 Pro Asp Glu Phe Ser Ser Arg Glu Glu Phe Val Val Ala Val Ser His 210 215 220 agc agc ccc tct gcc ctg gct ctt caa agc ccc ctt ctc cct gct tgg 719 Ser Ser Pro Ser Ala Leu Ala Leu Gln Ser Pro Leu Leu Pro Ala Trp 225 230 235 agg acc ctg tct gtt tca gag cat gcc ccg ggc ctc ccg gcc tcc cct 767 Arg Thr Leu Ser Val Ser Glu His Ala Pro Gly Leu Pro Ala Ser Pro 240 245 250 255 cca cgg cgg cct agg tgg aac gag agc acc agg ctg cca aga ggg ctt 815 Pro Arg Arg Pro Arg Trp Asn Glu Ser Thr Arg Leu Pro Arg Gly Leu 260 265 270 gca gtg cct gcg cag gga cat ttg ggg agg aca cat ccg cac tcc cag 863 Ala Val Pro Ala Gln Gly His Leu Gly Arg Thr His Pro His Ser Gln 275 280 285 ctc ctg gtg gcg ggg ggt cag gtg gag acc cta cct gat ccc cag acc 911 Leu Leu Val Ala Gly Gly Gln Val Glu Thr Leu Pro Asp Pro Gln Thr 290 295 300 tct gtc cct gtt ccc ctc cac tcc tcc cct cac tcc cct gct ccc ccg 959 Ser Val Pro Val Pro Leu His Ser Ser Pro His Ser Pro Ala Pro Pro 305 310 315 acc acc tcc tcc tct gcc tca aag act ctt gtc ctc ttg tcc ctc ctg 1007 Thr Thr Ser Ser Ser Ala Ser Lys Thr Leu Val Leu Leu Ser Leu Leu 320 325 330 335 aga aaa aag aaa acg aaa agt ggg gtt ttt ttc tgt ttt ctt ttt ttc 1055 Arg Lys Lys Lys Thr Lys Ser Gly Val Phe Phe Cys Phe Leu Phe Phe 340 345 350 ccc ttt ccc cct gcc ccc acc cac ggg gcc ttt ttt tgg agg tgg ggg 1103 Pro Phe Pro Pro Ala Pro Thr His Gly Ala Phe Phe Trp Arg Trp Gly 355 360 365 ctg ggg aat gag ggg ctg agg tcc cgg aag gga ttt tat ttt ttt gaa 1151 Leu Gly Asn Glu Gly Leu Arg Ser Arg Lys Gly Phe Tyr Phe Phe Glu 370 375 380 ttt ta attgtaacat ttttagaaaa agaacaaaaa aagaaaaaaa aaagaaagaa 1206 Phe acacaaaaaa aaaaaaagga attc 1230 <210> 40 <211> 384 <212> PRT <400> 40 Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Glu Leu 1 5 10 15 Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Ala Glu Phe Phe Gln Gln Gly 20 25 30 Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys 35 40 45 His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile 50 55 60 Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala 65 70 75 80 Gln Glu Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asp Trp Tyr Tyr Ser 85 90 95 Ala Ile Arg Gln Ser Pro Ser Pro Pro Pro Glu Glu Glu Ser Arg Gly 100 105 110 Pro Gly His Pro Pro Leu Pro Asp Lys Phe Gln Phe Asp Val Thr Leu 115 120 125 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Ser Met Ala Gln Ile Pro Cys Thr 130 135 140 Ala Gln Glu Ala Leu Thr Ala Gln Gly Leu Ser Gly Val Glu Glu Ala 145 150 155 160 Leu Asp Ala Thr Ile Ala Trp Glu Ala Ser Pro Ala Gln Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Val Met Ala Gln Glu Ala Ser Leu Glu Ala Glu Leu Glu Ala Val 180 185 190 Tyr Leu Thr Gln Gln Ala Gln Ser Thr Gly Ser Ala Pro Val Ala Pro 195 200 205 Asp Glu Phe Ser Ser Arg Glu Glu Phe Val Val Ala Val Ser His Ser 210 215 220 Ser Pro Ser Ala Leu Ala Leu Gln Ser Pro Leu Leu Pro Ala Trp Arg 225 230 235 240 Thr Leu Ser Val Ser Glu His Ala Pro Gly Leu Pro Ala Ser Pro Pro 245 250 255 Arg Arg Pro Arg Trp Asn Glu Ser Thr Arg Leu Pro Arg Gly Leu Ala 260 265 270 Val Pro Ala Gln Gly His Leu Gly Arg Thr His Pro His Ser Gln Leu 275 280 285 Leu Val Ala Gly Gly Gln Val Glu Thr Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ser 290 295 300 Val Pro Val Pro Leu His Ser Ser Pro His Ser Pro Ala Pro Pro Thr 305 310 315 320 Thr Ser Ser Ser Ala Ser Lys Thr Leu Val Leu Leu Ser Leu Leu Arg 325 330 335 Lys Lys Lys Thr Lys Ser Gly Val Phe Phe Cys Phe Leu Phe Phe Pro 340 345 350 Phe Pro Pro Ala Pro Thr His Gly Ala Phe Phe Trp Arg Trp Gly Leu 355 360 365 Gly Asn Glu Gly Leu Arg Ser Arg Lys Gly Phe Tyr Phe Phe Glu Phe 370 375 380 <210> 41 <211> 798 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (3)...(798) <400> 41 ga att cct ctg act aat tca agt atc cca agg ttt gga gtt aaa act 47 Ile Pro Leu Thr Asn Ser Ser Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr 1 5 10 15 gaa caa gaa gat gtc ctt gcc aag gaa cta gaa gat gtg aac aaa tgg 95 Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Val Asn Lys Trp 20 25 30 ggt ctt cat gtt ttc aga ata gca gag ttg tct ggt aac cgg ccc ttg 143 Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu Leu Ser Gly Asn Arg Pro Leu 35 40 45 act gtt atc atg cac acc att ttt cag gaa cgg gat tta tta aaa aca 191 Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr 50 55 60 ttt aaa att cca gta gat act tta att aca tat ctt atg act ctc gaa 239 Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu 65 70 75 gac cat tac cat gct gat gtg gcc tat cac aac aat atc cat gct gca 287 Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn Ile His Ala Ala 80 85 90 95 gat gtt gtc cag tct act cat gtg cta tta tct aca cct gct ttg gag 335 Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu 100 105 110 gct gtg ttt aca gat ttg gag att ctt gca gca att ttt gcc agt gca 383 Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala 115 120 125 ata cat gat gta gat cat cct ggt gtg tcc aat caa ttt ctg atc aat 431 Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn 130 135 140 aca aac tct gaa ctt gcc ttg atg tac aat gat tcc tca gtc tta gag 479 Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu 145 150 155 aac cat cat ttg gct gtg ggc ttt aaa ttg ctt cag gaa gaa aac tgt 527 Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys 160 165 170 175 gac att ttc cag aat ttg acc aaa aaa caa aga caa tct tta agg aaa 575 Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys 180 185 190 atg gtc att gac atc gta ctt gca aca gat atg tca aaa cac atg aat 623 Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Asn 195 200 205 cta ctg gct gat ttg aag act atg gtt gaa act aag aaa gtg aca agc 671 Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser 210 215 220 tct gga gtt ctt ctt ctt gat aat tat tcc gat agg att cag gtt ctt 719 Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu 225 230 235 cag aat atg gtg cac tgt gca gat ctg agc aac cca aca aag cct ctc 767 Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu 240 245 250 255 cag ctg tac cgc cag tgg acg gac gga att c 798 Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Gly Ile 260 265 <210> 42 <211> 265 <212> PRT <400> 42 Ile Pro Leu Thr Asn Ser Ser Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Glu 1 5 10 15 Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Val Asn Lys Trp Gly 20 25 30 Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu Leu Ser Gly Asn Arg Pro Leu Thr 35 40 45 Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe 50 55 60 Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp 65 70 75 80 His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn Ile His Ala Ala Asp 85 90 95 Val Val Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala 100 105 110 Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile 115 120 125 His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr 130 135 140 Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn 145 150 155 160 His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp 165 170 175 Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met 180 185 190 Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu 195 200 205 Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser 210 215 220 Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln 225 230 235 240 Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln 245 250 255 Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Gly Ile 260 265 <210> 43 <211> 1902 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (97)...(1256) <400> 43 gaattccttt gttcacatct tctagttcct tggcaaggac atcttcatgt 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ttg gct gtg ggc ttt aaa 450 Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys 105 110 115 ttg ctt cag gaa gaa aac tgt gac att ttc cag aat ttg acc aaa aaa 498 Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys 120 125 130 caa aga caa tct tta agg aaa atg gtc att gac atc gta ctt gca aca 546 Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr 135 140 145 150 gat atg tca aaa cac atg aat cta ctg gct gat ttg aag act atg gtt 594 Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val 155 160 165 gaa act aag aaa gtg aca agc tct gga gtt ctt ctt ctt gat aat tat 642 Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr 170 175 180 tcc gat agg att cag gtt ctt cag aat atg gtg cac tgt gca gat ctg 690 Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu 185 190 195 agc aac cca aca aag cct ctc cag ctg tac cgc cag tgg acg gac cgg 738 Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg 200 205 210 ata atg gag gag ttc ttc cgc caa gga gac cga gag agg gaa cgt ggc 786 Ile Met Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly 215 220 225 230 atg gag ata agc ccc atg tgt gac aag cac aat gct tcc gtg gaa aaa 834 Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys 235 240 245 tca cag gtg ggc ttc ata gac tat att gtt cat ccc ctc tgg gag aca 882 Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr 250 255 260 tgg gca gac ctc gtc cac cct gac gcc cag gat att ttg gac act ttg 930 Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu 265 270 275 gag gac aat cgt gaa tgg tac cag agc aca atc cct cag agc ccc tct 978 Glu Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser 280 285 290 cct gca cct gat gac cca gag gag ggc cgg cag ggt caa act gag aaa 1026 Pro Ala Pro Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys 295 300 305 310 ttc cag ttt gaa cta act tta gag gaa gat ggt gag tca gac acg gaa 1074 Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu 315 320 325 aag gac agt ggc agt caa gtg gaa gaa gac act agc tgc agt gac tcc 1122 Lys Asp Ser Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser 330 335 340 aag act ctt tgt act caa gac tca gag tct act gaa att ccc ctt gat 1170 Lys Thr Leu Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp 345 350 355 gaa cag gtt gaa gag gag gca gta ggg gaa gaa gag gaa agc cag cct 1218 Glu Gln Val Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro 360 365 370 gaa gcc tgt gtc ata gat gat cgt tct cct gac acg ta acagtgcaaa 1266 Glu Ala Cys Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro Asp Thr 375 380 385 aactttcatg cctttttttt ttttaagtag aaaaattgtt tccaaagtgc atgtcacatg 1326 ccacaaccac ggtcacacct cactgtcatc tgccaggacg tttgttgaac aaaactgacc 1386 ttgactactc agtccagcgc tcaggaatat cgtaaccagt tttttcacct ccatgtcatc 1446 cgagcaaggt ggacatcttc acgaacagcg tttttaacaa gatttcagct tggtagagct 1506 gacaaagcag ataaaatcta ctccaaatta ttttcaagag agtgtgactc atcaggcagc 1566 ccaaaagttt attggacttg gggtttctat tcctttttat ttgtttgcaa tattttcaga 1626 agaaaggcat tgcacagagt gaacttaatg gacgaagcaa caaatatgtc aagaacagga 1686 catagcacga atctgttacc agtaggagga ggatgagcca cagaaattgc ataattttct 1746 aatttcaagt cttcctgata catgactgaa tagtgtggtt cagtgagctg cactgacctc 1806 tacattttgt atgatatgta aaacagattt tttgtagagc ttacttttat tattaaatgt 1866 attgaggtat tatatttaaa aaaaaaaaag gaattc 1902 <210> 44 <211> 386 <212> PRT <400> 44 Met His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile 1 5 10 15 Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp His Tyr 20 25 30 His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn Ile His Ala Ala Asp Val Val 35 40 45 Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe 50 55 60 Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile His Asp 65 70 75 80 Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His 100 105 110 Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe 115 120 125 Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Ser Leu Arg 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sses <130> 981218P-2 <150> US 511,715 <151> 1990-04-20 <160> 57 <170> PatentIn release #1.0, version #1.25 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <400> 1 aagcggccgc 10 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <400> 2 gcggccgctt 10 <210> 3 <211> 2158 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (1)...(1688) <400> 3 agc ttg cga atc gta aga aac aat ttc acc ctg ctg aca aac ctt cac 48 Ser Leu Arg Ile Val Arg Asn Asn Phe Thr Leu Leu Thr Asn Leu His 1 5 10 15 gga gca ccg aac aag agg tcg cca gcg gct agt cag gct cca gtc acc 96 Gly Ala Pro Asn Lys Arg Ser Pro Ala Ala Ser Gln Ala Pro Val Thr 20 25 30 aga gtc agc ctg caa gaa gaa tca tat cag aaa cta gca atg gag acg 144 Arg Val Ser Leu Gln Glu Glu Ser Tyr Gln Lys Leu Ala Met Glu Thr 35 40 45 ctg gag gaa cta gac tgg tgc cta gac cag cta gag acc atc cag acc 192 Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Ile Gln Thr 50 55 60 tac cgc tct gtc agc gag atg gct tca aac aag ttc aaa agg atg ctg 240 Tyr Arg Ser Val Ser Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu 65 70 75 80 aac cgg gag ctg 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tac gcc att ttc cag gaa aga gac ctt cta aag acg ttt aaa 624 Ile Met Tyr Ala Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys 195 200 205 atc tcc tcc gac acc ttc gta acc tac atg atg act tta gaa gac cat 672 Ile Ser Ser Asp Thr Phe Val Thr Tyr Met Met Thr Leu Glu Asp His 210 215 220 tac cat tct gat gtg gcg tat cac aac agc ctg cac gct gct gac gtg 720 Tyr His Ser Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala Asp Val 225 230 235 240 gcc cag tca acg cac gtt ctc ctc tct acg cca gca ctg gat gct gtc 768 Ala Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Asp Ala Val 245 250 255 ttc aca gac ctg gaa atc ctg gct gcc att ttt gca gct gcc atc cat 816 Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ala Ala Ile His 260 265 270 gat gtt gat cat cct gga gtc tcc aat cag ttt ctc atc aat aca aat 864 Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn 275 280 285 tcc gaa ctt gct ttg atg tat aat gac gaa tct gtg ctg gaa aac cat 912 Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn His 290 295 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Leu Val Leu His Ala Gly Ala Ala 100 105 110 acc agc cag cgc cgg gag tcc ttc ctg tac cgc tca gac agc gac tat 382 Thr Ser Gln Arg Arg Glu Ser Phe Leu Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr 115 120 125 gac atg tca ccc aag acc atg tcc cgg aac tca tcg gtc acc agc gag 430 Asp Met Ser Pro Lys Thr Met Ser Arg Asn Ser Ser Val Thr Ser Glu 130 135 140 gcg cac gct gaa gac ctc atc gta aca cca ttt gct cag gtg ctg gcc 478 Ala His Ala Glu Asp Leu Ile Val Thr Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala 145 150 155 agc ctc cgg agc gtc cgt agc aac ttc tca ctc ctg acc aat gtg ccc 526 Ser Leu Arg Ser Val Arg Ser Asn Phe Ser Leu Leu Thr Asn Val Pro 160 165 170 175 gtt ccc agt aac aag cgg tcc ccg ctg ggc ggc ccc acc cct gtc tgc 574 Val Pro Ser Asn Lys Arg Ser Pro Leu Gly Gly Pro Thr Pro Val Cys 180 185 190 aag gcc acg ctg tca gaa gaa acg tgt cag cag ttg gcc cgg gag act 622 Lys Ala Thr Leu Ser Glu Glu Thr Cys Gln Gln Leu Ala Arg Glu Thr 195 200 205 ctg gag gag ctg gac tgg tgt ctg gag cag ctg gag acc atg cag acc 670 Leu Glu Glu Leu Asp 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Asn Ser Asn Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Asp Gln Glu 320 325 330 335 gag ctc ctg gcc caa gaa ctg gag aac ctg aac aag tgg ggc ctg aac 1054 Glu Leu Leu Ala Gln Glu Leu Glu Asn Leu Asn Lys Trp Gly Leu Asn 340 345 350 atc ttt tgc gtg tcg gat tac gct gga ggc cgc tca ctc acc tgc atc 1102 Ile Phe Cys Val Ser Asp Tyr Ala Gly Gly Arg Ser Leu Thr Cys Ile 355 360 365 atg tac atg ata ttc cag gag cgg gac ctg ctg aag aaa ttc cgc atc 1150 Met Tyr Met Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Lys Phe Arg Ile 370 375 380 cct gtg gac acg atg gtg aca tac atg ctg acg ctg gag gat cac tac 1198 Pro Val Asp Thr Met Val Thr Tyr Met Leu Thr Leu Glu Asp His Tyr 385 390 395 cac gct gac gtg gcc tac cat aac agc ctg cac gca gct gac gtg ctg 1246 His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala Asp Val Leu 400 405 410 415 cag tcc acc cac gta ctg ctg gcc acg cct tgg cca acc tta agg aat 1294 Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ala Thr Pro Trp Pro Thr Leu Arg Asn 420 425 430 gca gtg ttc acg gac ctg gag att ctc gcc gcc ctc ttc gcg gct gcc 1342 Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ala 435 440 445 atc cac gat gtg gat cac cct ggg gtc tcc aac cag ttc ctc atc aac 1390 Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn 450 455 460 acc aat tcg gag ctg gcg ctc atg tac aac gat gag tcg gtg ctc gag 1438 Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu 465 470 475 aat cac cac ctg gcc gtg ggc ttc aag ctg ctg cag gag gac aac tgc 1486 Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Asp Asn Cys 480 485 490 495 gac atc ttc cag aac ctc agc aag cgc cag cgg cag agc cta cgc aag 1534 Asp Ile Phe Gln Asn Leu Ser Lys Arg Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys 500 505 510 atg gtc atc gac atg gtg ctg gcc acg gac atg tcc aag cac atg acc 1582 Met Val Ile Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Thr 515 520 525 ctc ctg gct gac ctg aag acc atg gtg gag acc aag aaa gtg acc agc 1630 Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser 530 535 540 tca ggg gtc ctc ctg cta gat aac tac tcc gac cgc atc cag gtc ctc 1678 Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu 545 550 555 cgg aac atg gtg cac tgt gcc gac ctc agc aac ccc acc aag ccg ctg 1726 Arg Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu 560 565 570 575 gag ctg tac cgc cag tgg aca gac cgc atc atg gcc gag ttc ttc cag 1774 Glu Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Ala Glu Phe Phe Gln 580 585 590 cag ggt gac cga gag cgc gag cgt ggc atg gaa atc agc ccc atg tgt 1822 Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys 595 600 605 gac aag cac act gcc tcc gtg gag aag tct cag gtg ggt ttt att gac 1870 Asp Lys His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp 610 615 620 tac att gtg cac cca ttg tgg gag acc tgg gcg gac ctt gtc cac cca 1918 Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val His Pro 625 630 635 gat gcc cag gag atc ttg gac act ttg gag gac aac cgg gac tgg tac 1966 Asp Ala Gln Glu Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asp Trp Tyr 640 645 650 655 tac agc gcc atc cgg cag agc cca tct ccg cca ccc gag gag gag tca 2014 Tyr Ser Ala Ile Arg Gln Ser Pro Ser Pro Pro Pro Glu Glu Glu Ser 660 665 670 agg ggg cca ggc cac cca ccc ctg cct gac aag ttc cag ttt gag ctg 2062 Arg Gly Pro Gly His Pro Pro Leu Pro Asp Lys Phe Gln Phe Glu Leu 675 680 685 acg ctg gag gag gaa gag gag gaa gaa ata tca atg gcc cag ata ccg 2110 Thr Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Ser Met Ala Gln Ile Pro 690 695 700 tgc aca gcc caa gag gca ttg act gag cag gga ttg tca gga gtc gag 2158 Cys Thr Ala Gln Glu Ala Leu Thr Glu Gln Gly Leu Ser Gly Val Glu 705 710 715 gaa gct ctg gat gca acc ata gcc tgg gag gca tcc ccg gcc cag gag 2206 Glu Ala Leu Asp Ala Thr Ile Ala Trp Glu Ala Ser Pro Ala Gln Glu 720 725 730 735 tcg ttg gaa gtt atg gca cag gaa gca tcc ctg gag gcc gag ctg gag 2254 Ser Leu Glu Val Met Ala Gln Glu Ala Ser Leu Glu Ala Glu Leu Glu 740 745 750 gca gtg tat ttg aca cag cag gca cag tcc aca ggc agt gca cct gtg 2302 Ala Val Tyr Leu Thr Gln Gln Ala Gln Ser Thr Gly Ser Ala Pro Val 755 760 765 gct ccg gat gag ttc tcg tcc cgg gag gaa ttc gtg gtt gct gta agc 2350 Ala Pro Asp Glu Phe Ser Ser Arg Glu Glu Phe Val Val Ala Val Ser 770 775 780 cac agc agc ccc tct gcc ctg gct ctt caa agc ccc ctt ctc cct gct 2398 His Ser Ser Pro Ser Ala Leu Ala Leu Gln Ser Pro Leu Leu Pro Ala 785 790 795 tgg agg acc ctg tct gtt tca gag cat gcc cgg cct ccc ggg cct ccc 2446 Trp Arg Thr Leu Ser Val Ser Glu His Ala Arg Pro Pro Gly Pro Pro 800 805 810 815 ctc cac ggc ggc cga ggt gga ggc cca acg aga gca cca ggc tgc caa 2494 Leu His Gly Gly Arg Gly Gly Gly Pro Thr Arg Ala Pro Gly Cys Gln 820 825 830 gag ggc ttg cag tgc ctg cgc agg gac att tgg gga gga cac atc cgc 2542 Glu Gly Leu Gln Cys Leu Arg Arg Asp Ile Trp Gly Gly His Ile Arg 835 840 845 act ccc agc tcc tgg tgg cgg ggg gtc agg tgg aga ccc tac ctg atc 2590 Thr Pro Ser Ser Trp Trp Arg Gly Val Arg Trp Arg Pro Tyr Leu Ile 850 855 860 ccc aga cct ctg tcc ctg ttc ccc tcc act cct ccc ctc act ccc ctg 2638 Pro Arg Pro Leu Ser Leu Phe Pro Ser Thr Pro Pro Leu Thr Pro Leu 865 870 875 ctc ccc cga cca cct cct cct ctg cct caa aga ctc ttg tcc tct tgt 2686 Leu Pro Arg Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Cys 880 885 890 895 ccg cgg ccg caa gct t 2702 Pro Arg Pro Gln Ala 900 <210> 12 <211> 900 <212> PRT <400> 12 Ser Leu Arg Pro Arg Gly Leu Gly Arg Ile Pro Glu Leu Gln Leu Val 1 5 10 15 Ala Phe Pro Val Ala Val Ala Ala Glu Asp Glu Ala Phe Leu Pro Glu 20 25 30 Pro Leu Ala Pro Arg Ala Pro Arg Arg Arg Val Arg Arg Pro Pro Arg 35 40 45 Pro Ser Ser Ser Pro Ala Arg Pro Gln Leu Ser Ala Asp Ala Phe Gly 50 55 60 Phe Ser Ala Ala Ala Arg Ile Trp Ala Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu 65 70 75 80 Ala Ser Arg Gln Arg Met Gly Arg His His Leu Leu Ala Ala Ala Pro 85 90 95 Gly Leu Gln Ala Ser Pro Gly Leu Val Leu His Ala Gly Ala Ala Thr 100 105 110 Ser Gln Arg Arg Glu Ser Phe Leu Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr Asp 115 120 125 Met Ser Pro Lys Thr Met Ser Arg Asn Ser Ser Val Thr Ser Glu Ala 130 135 140 His Ala Glu Asp Leu Ile Val Thr Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Val Arg Ser Asn Phe Ser Leu Leu Thr Asn Val Pro Val 165 170 175 Pro Ser Asn Lys Arg Ser Pro Leu Gly Gly Pro Thr Pro Val Cys Lys 180 185 190 Ala Thr Leu Ser Glu Glu Thr Cys Gln Gln Leu Ala Arg Glu Thr Leu 195 200 205 Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu Glu Gln Leu Glu Thr Met Gln Thr Tyr 210 215 220 Arg Ser Val Ser Glu Met Ala Ser His Lys Phe Lys Arg Met Leu Asn 225 230 235 240 Arg Glu Leu Thr His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val 245 250 255 Ser Glu Tyr Ile Ser Thr Thr Phe Leu Asp Lys Gln Asn Glu Val Glu 260 265 270 Ile Pro Ser Pro Thr Met Lys Glu Arg Glu Lys Gln Gln Ala Pro Arg 275 280 285 Pro Arg Pro Ser Gln Pro Pro Pro Pro Pro Val Pro His Leu Gln Pro 290 295 300 Met Ser Gln Ile Thr Gly Leu Lys Lys Leu Met His Ser Asn Ser Leu 305 310 315 320 Asn Asn Ser Asn Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Asp Gln Glu Glu 325 330 335 Leu Leu Ala Gln Glu Leu Glu Asn Leu Asn Lys Trp Gly Leu Asn Ile 340 345 350 Phe Cys Val Ser Asp Tyr Ala Gly Gly Arg Ser Leu Thr Cys Ile Met 355 360 365 Tyr Met Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Lys Phe Arg Ile Pro 370 375 380 Val Asp Thr Met Val Thr Tyr Met Leu Thr Leu Glu Asp His Tyr His 385 390 395 400 Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala Asp Val Leu Gln 405 410 415 Ser Thr His Val Leu Leu Ala Thr Pro Trp Pro Thr Leu Arg Asn Ala 420 425 430 Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ala Ile 435 440 445 His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr 450 455 460 Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn 465 470 475 480 His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Asp Asn Cys Asp 485 490 495 Ile Phe Gln Asn Leu Ser Lys Arg Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met 500 505 510 Val Ile Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Thr Leu 515 520 525 Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser 530 535 540 Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Arg 545 550 555 560 Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu 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770 775 780 Ser Ser Pro Ser Ala Leu Ala Leu Gln Ser Pro Leu Leu Pro Ala Trp 785 790 795 800 Arg Thr Leu Ser Val Ser Glu His Ala Arg Pro Pro Gly Pro Pro Leu 805 810 815 His Gly Gly Arg Gly Gly Gly Pro Thr Arg Ala Pro Gly Cys Gln Glu 820 825 830 Gly Leu Gln Cys Leu Arg Arg Asp Ile Trp Gly Gly His Ile Arg Thr 835 840 845 Pro Ser Ser Trp Trp Arg Gly Val Arg Trp Arg Pro Tyr Leu Ile Pro 850 855 860 Arg Pro Leu Ser Leu Phe Pro Ser Thr Pro Pro Leu Thr Pro Leu Leu 865 870 875 880 Pro Arg Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Cys Pro 885 890 895 Arg Pro Gln Ala 900 <210> 13 <211> 1721 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (60)...(1274) <400> 13 aagcttgcgg ccgcattggg taccgcgtgc cagcaggcag tggccctagc cttccgcct 59 atg ccc tcc ctc caa gag gtg gac tgc ggc tcc ccc agc agc tcc gag 107 Met Pro Ser Leu Gln Glu Val Asp Cys Gly Ser Pro Ser Ser Ser Glu 1 5 10 15 gag gag ggg gtg cca ggg tcc cgg ggg agc cca gcg acc tca ccc cac 155 Glu Glu Gly Val Pro Gly Ser Arg Gly Ser Pro Ala Thr Ser Pro His 20 25 30 ctg ggc cgc cga cga cct ctg ctt cgg tcc atg agc gcc gcc ttc tgc 203 Leu Gly Arg Arg Arg Pro Leu Leu Arg Ser Met Ser Ala Ala Phe Cys 35 40 45 tcc cta ctg gca ccg gag cgg cag gtg ggc cgg gct gcg gca gca ctg 251 Ser Leu Leu Ala Pro Glu Arg Gln Val Gly Arg Ala Ala Ala Ala Leu 50 55 60 atg cag gac cga cac aca gcc gcg ggc cag ctg gtg cag gac cta ctg 299 Met Gln Asp Arg His Thr Ala Ala Gly Gln Leu Val Gln Asp Leu Leu 65 70 75 80 acc cag gtg cgg gat ggg cag agg ccc cag gag ctc gag ggc atc cgt 347 Thr Gln Val Arg Asp Gly Gln Arg Pro Gln Glu Leu Glu Gly Ile Arg 85 90 95 cag gcg ctg agc cgg gcc cgg gcc atg ctg agt gcg gag ctg ggc cct 395 Gln Ala Leu Ser Arg Ala Arg Ala Met Leu Ser Ala Glu Leu Gly Pro 100 105 110 gag aag ctc gtg tcg cct aag agg ctg gaa cat gtc ctg gag aag tca 443 Glu Lys Leu Val Ser Pro Lys Arg Leu Glu His Val Leu Glu Lys Ser 115 120 125 ttg cat tgc tct gtg ctc aag cct ctc cgg ccc atc ctg gca gcc cgc 491 Leu His Cys Ser Val Leu Lys Pro Leu Arg Pro Ile Leu Ala Ala Arg 130 135 140 ctg cgg cgc cgg ctt gcc gca gac ggc tcc ctg ggc cgc cta gct gag 539 Leu Arg Arg Arg Leu Ala Ala Asp Gly Ser Leu Gly Arg Leu Ala Glu 145 150 155 160 ggc ctc cgc ctg gcc cgg gcc cag ggc ccc gga gcc ttc ggg tcc cac 587 Gly Leu Arg Leu Ala Arg Ala Gln Gly Pro Gly Ala Phe Gly Ser His 165 170 175 ctg agc ctg ccc tcc cca gta gag ttg gag caa gtg cgc cag aag ctg 635 Leu Ser Leu Pro Ser Pro Val Glu Leu Glu Gln Val Arg Gln Lys Leu 180 185 190 ctg cag ctc gtc cgc acc tac tca ccc agc gcc cag gtc aag cgg ctc 683 Leu Gln Leu Val Arg Thr Tyr Ser Pro Ser Ala Gln Val Lys Arg Leu 195 200 205 ctg cag gcc tgc aag ctg ctc tac atg gcc ctg agg acc cag gaa ggg 731 Leu Gln Ala Cys Lys Leu Leu Tyr Met Ala Leu Arg Thr Gln Glu Gly 210 215 220 gag ggc tcg ggt gcc gac ggg ttc ctg cct ctg ctg agc ctc gtc ttg 779 Glu Gly Ser Gly Ala Asp Gly Phe Leu Pro Leu Leu Ser Leu Val Leu 225 230 235 240 gcc cac tgt gac ctt cct gag ctg ctg ctg gag gcc gag tac atg tcg 827 Ala His Cys Asp Leu Pro Glu Leu Leu Leu Glu Ala Glu Tyr Met Ser 245 250 255 gag ctg ctg gag ccc agc ctg ctt act gga gag ggt ggc tac tac ctg 875 Glu Leu Leu Glu Pro Ser Leu Leu Thr Gly Glu Gly Gly Tyr Tyr Leu 260 265 270 acc agc ctc tct gcc agc ctg gcc ctg ctg agt ggc ctg ggt cag gcc 923 Thr Ser Leu Ser Ala Ser Leu Ala Leu Leu Ser Gly Leu Gly Gln Ala 275 280 285 cac acc ctc cca ctg agc ccc gtg cag gag cta cgg cgc tcc ctc agc 971 His Thr Leu Pro Leu Ser Pro Val Gln Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ser 290 295 300 ctc tgg gag cag cgc cgc ctg cct gcc acc cac tgc ttc cag cac ctc 1019 Leu Trp Glu Gln Arg Arg Leu Pro Ala Thr His Cys Phe Gln His Leu 305 310 315 320 ctc cga gta gcc tat cag gat ccc agc agt ggc tgc acc tcc aag acc 1067 Leu Arg Val Ala Tyr Gln Asp Pro Ser Ser Gly Cys Thr Ser Lys Thr 325 330 335 ctg gcc gtg ccc cca gag gcc tcg att gcc acc ctg aac cag ctc tgt 1115 Leu Ala Val Pro Pro Glu Ala Ser Ile Ala Thr Leu Asn Gln Leu Cys 340 345 350 gcc acc aag ttc cga gtg acc cag ccc aac act ttt ggc ctc ttc ctg 1163 Ala Thr Lys Phe Arg Val Thr Gln Pro Asn Thr Phe Gly Leu Phe Leu 355 360 365 tac aag gag cag ggc tac cac cgc ctg ccc cct ggg ccc tgg ccc aca 1211 Tyr Lys Glu Gln Gly Tyr His Arg Leu Pro Pro Gly Pro Trp Pro Thr 370 375 380 ggc tgc cca cca ctg gct acc tcg tct acc gcc ggg cag agt ggc ctg 1259 Gly Cys Pro Pro Leu Ala Thr Ser Ser Thr Ala Gly Gln Ser Gly Leu 385 390 395 400 aga ccc agg ggg ctg tgacagagga ggagggcagt gggcagtcag aggcaagaag 1314 Arg Pro Arg Gly Leu 405 cagaggggag gagcaagggt gccagggaga tggggatgct ggggtcaaag ccagccccag 1374 ggacattcgg gaacagtctg agacaactgc tgaagggggc cagggtcaag cccaggaagg 1434 ccctgctcag ccaggggaac cagaggcaga gggaagccgg gcagcagagg agtagcttga 1494 agtggccaga agggtcattc ggggcgggag accctgagcc tgctgagaaa tccttttagc 1554 gccagcaagc cccacccagg gccctgtcct gtgtctgcca ccacctttgt ctgatacttg 1614 tttccaggga agctggggga actgccacat ctgaggaact ggaataaaga tgaggggcct 1674 tcgggggcca atgcggccgc cgcggccttt ttggccagct cgaattc 1721 <210> 14 <211> 405 <212> PRT <400> 14 Met Pro Ser Leu Gln Glu Val Asp Cys Gly Ser Pro Ser Ser Ser 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Gly Ser Gly Ala Asp Gly Phe Leu Pro Leu Leu Ser Leu Val Leu 225 230 235 240 Ala His Cys Asp Leu Pro Glu Leu Leu Leu Glu Ala Glu Tyr Met Ser 245 250 255 Glu Leu Leu Glu Pro Ser Leu Leu Thr Gly Glu Gly Gly Tyr Tyr Leu 260 265 270 Thr Ser Leu Ser Ala Ser Leu Ala Leu Leu Ser Gly Leu Gly Gln Ala 275 280 285 His Thr Leu Pro Leu Ser Pro Val Gln Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ser 290 295 300 Leu Trp Glu Gln Arg Arg Leu Pro Ala Thr His Cys Phe Gln His Leu 305 310 315 320 Leu Arg Val Ala Tyr Gln Asp Pro Ser Ser Gly Cys Thr Ser Lys Thr 325 330 335 Leu Ala Val Pro Pro Glu Ala Ser Ile Ala Thr Leu Asn Gln Leu Cys 340 345 350 Ala Thr Lys Phe Arg Val Thr Gln Pro Asn Thr Phe Gly Leu Phe Leu 355 360 365 Tyr Lys Glu Gln Gly Tyr His Arg Leu Pro Pro Gly Pro Trp Pro Thr 370 375 380 Gly Cys Pro Pro Leu Ala Thr Ser Ser Thr Ala Gly Gln Ser Gly Leu 385 390 395 400 Arg Pro Arg Gly Leu 405 <210> 15 <211> 1829 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (30)...(1421) <400> 15 gcggccgcgg ccggcagcgg ctgagcgac atg agc att tct act tcc tcc tcc 53 Met Ser Ile Ser Thr Ser Ser Ser 1 5 gac tcg ctg gag ttc gac cgg agc atg cct ctg ttt ggc tac gag gcg 101 Asp Ser Leu Glu Phe Asp Arg Ser Met Pro Leu Phe Gly Tyr Glu Ala 10 15 20 gac acc aac agc agc ctg gag gac tac gag ggg gaa agt gac caa gag 149 Asp Thr Asn Ser Ser Leu Glu Asp Tyr Glu Gly Glu Ser Asp Gln Glu 25 30 35 40 acc atg gcg ccc ccc atc aag tcc aaa aag aaa agg agc agc tcc ttc 197 Thr Met Ala Pro Pro Ile Lys Ser Lys Lys Lys Arg Ser Ser Ser Phe 45 50 55 gtg ctg ccc aag ctc gtc aag tcc cag ctg cag aag gtg agc ggg gtg 245 Val Leu Pro Lys Leu Val Lys Ser Gln Leu Gln Lys Val Ser Gly Val 60 65 70 ttc agc tcc ttc atg acc ccg gag aag cgg atg gtc cgc agg atc gcc 293 Phe Ser Ser Phe Met Thr Pro Glu Lys Arg Met Val Arg Arg Ile Ala 75 80 85 gag ctt tcc cgg gac aaa tgc acc tac ttc ggg tgc tta gtg cag gac 341 Glu Leu Ser Arg Asp Lys Cys Thr Tyr Phe Gly Cys Leu Val Gln Asp 90 95 100 tac gtg agc ttc ctg cag gag aac aag gag tgc cac gtg tcc agc acc 389 Tyr Val Ser Phe Leu Gln Glu Asn Lys Glu Cys His Val Ser Ser Thr 105 110 115 120 gac atg ctg cag acc atc cgg cag ttc atg acc cag gtc aag aac tat 437 Asp Met Leu Gln Thr Ile Arg Gln Phe Met Thr Gln Val Lys Asn Tyr 125 130 135 ttg tct cag agc tcg gag ctg gac ccc ccc atc gag tcg ctg atc cct 485 Leu Ser Gln Ser Ser Glu Leu Asp Pro Pro Ile Glu Ser Leu Ile Pro 140 145 150 gaa gac caa ata gat gtg gtg ctg gaa aaa gcc atg cac aag tgc atc 533 Glu Asp Gln Ile Asp Val Val Leu Glu Lys Ala Met His Lys Cys Ile 155 160 165 ttg aag ccc ctc aag ggg cac gtg gag gcc atg ctg aag gac ttt cac 581 Leu Lys Pro Leu Lys Gly His Val Glu Ala Met Leu Lys Asp Phe His 170 175 180 atg gcc gat ggc tca tgg aag caa ctc aag gag aac ctg cag ctt gtg 629 Met Ala Asp Gly Ser Trp Lys Gln Leu Lys Glu Asn Leu Gln Leu Val 185 190 195 200 cgg cag agg aat ccg cag gag ctg ggg gtc ttc gcc ccg acc cct gat 677 Arg Gln Arg Asn Pro Gln Glu Leu Gly Val Phe Ala Pro Thr Pro Asp 205 210 215 ttt gtg gat gtg gag aaa atc aaa gtc aag ttc atg acc atg cag aag 725 Phe Val Asp Val Glu 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Ser Ser Glu Thr Arg Asp Thr Leu Arg Gln Trp His Lys Arg Arg 330 335 340 acc acc aac cgg acc atc ccc tct gtg gac gac ttc cag aat tac ctc 1109 Thr Thr Asn Arg Thr Ile Pro Ser Val Asp Asp Phe Gln Asn Tyr Leu 345 350 355 360 cga gtt gca ttt cag gag gtc aac agt ggt tgc aca gga aag acc ctc 1157 Arg Val Ala Phe Gln Glu Val Asn Ser Gly Cys Thr Gly Lys Thr Leu 365 370 375 ctt gtg aga cct tac atc acc act gag gat gtg tgt cag atc tgc gct 1205 Leu Val Arg Pro Tyr Ile Thr Thr Glu Asp Val Cys Gln Ile Cys Ala 380 385 390 gag aag ttc aag gtg ggg gac cct gag gag tac agc ctc ttt ctc ttc 1253 Glu Lys Phe Lys Val Gly Asp Pro Glu Glu Tyr Ser Leu Phe Leu Phe 395 400 405 gtt gac gag aca tgg cag cag ctg gca gag gac act tac cct caa aaa 1301 Val Asp Glu Thr Trp Gln Gln Leu Ala Glu Asp Thr Tyr Pro Gln Lys 410 415 420 atc aag gcg gag ctg cac agc cga cca cag ccc cac atc ttc cac ttt 1349 Ile Lys Ala Glu Leu His Ser Arg Pro Gln Pro His Ile Phe His Phe 425 430 435 440 gtc tac aaa cgc atc aag aac gat cct tat ggc atc att ttc cag aac 1397 Val Tyr Lys Arg Ile Lys Asn Asp Pro Tyr Gly Ile Ile Phe Gln Asn 445 450 455 ggg gaa gaa gac ctc acc acc tcc tagaagacag gcgggacttc ccagtggtgc 1451 Gly Glu Glu Asp Leu Thr Thr Ser 460 atccaaaggg gagctggaag ccttgccttc ccgcttctac atgcttgagc ttgaaaagca 1511 gtcacctcct cggggacccc tcagtgtagt gactaagcca tccacaggcc aactcggcca 1571 agggcaactt tagccacgca aggtagctga ggtttgtgaa acagtaggat tctcttttgg 1631 caatggagaa ttgcatctga tggttcaagt gtcctgagat tgtttgctac ctacccccag 1691 tcaggttcta ggttggctta caggtatgta tatgtgcaga agaaacactt aagatacaag 1751 ttcttttgaa ttcaacagca gatgcttgcg atgcagtgcg tcaggtgatt ctcactcctg 1811 tggatggctt catccctg 1829 <210> 16 <211> 464 <212> PRT <400> 16 Met Ser Ile Ser Thr Ser Ser Ser Asp Ser Leu Glu Phe Asp Arg Ser 1 5 10 15 Met Pro Leu Phe Gly Tyr Glu Ala Asp Thr Asn Ser Ser Leu Glu Asp 20 25 30 Tyr Glu Gly Glu Ser Asp Gln Glu Thr Met Ala Pro Pro Ile Lys Ser 35 40 45 Lys Lys Lys Arg Ser Ser Ser Phe Val Leu Pro Lys Leu Val Lys Ser 50 55 60 Gln Leu Gln Lys Val Ser Gly Val Phe Ser Ser Phe Met Thr Pro Glu 65 70 75 80 Lys Arg Met Val Arg Arg Ile Ala Glu Leu Ser Arg Asp Lys Cys Thr 85 90 95 Tyr Phe Gly Cys Leu Val Gln Asp Tyr Val Ser Phe Leu Gln Glu Asn 100 105 110 Lys Glu Cys His Val Ser Ser Thr Asp Met Leu Gln Thr Ile Arg Gln 115 120 125 Phe Met Thr Gln Val Lys Asn Tyr Leu Ser Gln Ser Ser Glu Leu Asp 130 135 140 Pro Pro Ile Glu Ser Leu Ile Pro Glu Asp Gln Ile Asp Val Val Leu 145 150 155 160 Glu Lys Ala Met His Lys Cys Ile Leu Lys Pro Leu Lys Gly His Val 165 170 175 Glu Ala Met Leu Lys Asp Phe His Met Ala Asp Gly Ser Trp Lys Gln 180 185 190 Leu Lys Glu Asn Leu Gln Leu Val Arg Gln Arg Asn Pro Gln Glu Leu 195 200 205 Gly Val Phe Ala Pro Thr Pro Asp Phe Val Asp Val Glu Lys Ile Lys 210 215 220 Val Lys Phe Met Thr Met Gln Lys Met Tyr Ser Pro Glu Lys Lys Val 225 230 235 240 Met Leu Leu Leu Arg Val Cys Lys Leu Ile Tyr Thr Val Met Glu Asn 245 250 255 Asn Ser Gly Arg Met Tyr Gly Ala Asp Asp Phe Leu Pro Val Leu Thr 260 265 270 Tyr Val Ile Ala Gln Cys Asp Met Leu Glu Leu Asp Thr Glu Ile Glu 275 280 285 Tyr Met Met Glu Leu Leu Asp Pro Ser Leu Leu His Gly Glu Gly Gly 290 295 300 Tyr Tyr Leu Thr Ser Ala Tyr Gly Ala Leu Ser Leu Ile Lys Asn Phe 305 310 315 320 Gln Glu Glu Gln Ala Ala Arg Leu Leu Ser Ser Glu Thr Arg Asp Thr 325 330 335 Leu Arg Gln Trp His Lys Arg Arg Thr Thr Asn Arg Thr Ile Pro Ser 340 345 350 Val Asp Asp Phe Gln Asn Tyr Leu Arg Val Ala Phe Gln Glu Val Asn 355 360 365 Ser Gly Cys Thr Gly Lys Thr Leu Leu Val Arg Pro Tyr Ile Thr Thr 370 375 380 Glu Asp Val Cys Gln Ile Cys Ala Glu Lys Phe Lys Val Gly Asp Pro 385 390 395 400 Glu Glu Tyr Ser Leu Phe Leu Phe Val Asp Glu Thr Trp Gln Gln Leu 405 410 415 Ala Glu Asp Thr Tyr Pro Gln Lys Ile Lys Ala Glu Leu His Ser Arg 420 425 430 Pro Gln Pro His Ile Phe His Phe Val Tyr Lys Arg Ile Lys Asn Asp 435 440 445 Pro Tyr Gly Ile Ile Phe Gln Asn Gly Glu Glu Asp Leu Thr Thr Ser 450 455 460 <210> 17 <211> 1299 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (1)...(1299) <400> 17 ggc cgc att gcc gac ccg gcc cgt agt gtg gaa gca gct tca gct caa 48 Gly Arg Ile Ala Asp Pro Ala Arg Ser Val Glu Ala Ala Ser Ala Gln 1 5 10 15 aga tta gaa cga ctc cga aaa gag aga caa aac cag atc aaa tgc aaa 96 Arg Leu Glu Arg Leu Arg Lys Glu Arg Gln Asn Gln Ile Lys Cys Lys 20 25 30 aat att cag tgg aaa gaa aga aat tct aag caa tca gcc cag gag tta 144 Asn Ile Gln Trp Lys Glu Arg Asn Ser Lys Gln Ser Ala Gln Glu Leu 35 40 45 aag tca ctg ttt gaa aaa aaa tct ctc aaa gag aag cct cca att tct 192 Lys Ser Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu Lys Glu Lys Pro Pro Ile Ser 50 55 60 ggg aag cag tcg ata tta tct gta cgc cta gaa cag tgc cct ctg cag 240 Gly Lys Gln Ser Ile Leu Ser Val Arg Leu Glu Gln Cys Pro Leu Gln 65 70 75 80 ctg aat aac cct ttt aac gag tat tcc aaa ttt gat ggc aag ggt cat 288 Leu Asn Asn Pro Phe Asn Glu Tyr Ser Lys Phe Asp Gly Lys Gly His 85 90 95 gta ggt aca aca gca acc aag aag atc gat gtc tac ctc cct ctg cac 336 Val Gly Thr Thr Ala Thr Lys Lys Ile Asp Val Tyr Leu Pro Leu His 100 105 110 tcg agc cag gac aga ctg ctg cca atg acc gtg gtg aca atg gcc agc 384 Ser Ser Gln Asp Arg Leu Leu Pro Met Thr Val Val Thr Met Ala Ser 115 120 125 gcc agg gtg cag gac ctg atc ggg ctc atc tgc tgg cag tat aca agc 432 Ala Arg Val Gln Asp Leu Ile Gly Leu Ile Cys Trp Gln Tyr Thr Ser 130 135 140 gaa gga cgg gag ccg aag ctc aat gac aat gtc agt gcc tac tgc ctg 480 Glu Gly Arg Glu Pro Lys Leu Asn Asp Asn Val Ser Ala Tyr Cys Leu 145 150 155 160 cat att gct gag gat gat ggg gag gtg gac acc gat ttc ccc ccg ctg 528 His Ile Ala Glu Asp Asp Gly Glu Val Asp Thr Asp Phe Pro Pro Leu 165 170 175 gat tcc aat gag ccc att cat aag ttt ggc ttc agt act ttg gcc ctg 576 Asp Ser Asn Glu Pro Ile His Lys Phe Gly Phe Ser Thr Leu Ala Leu 180 185 190 gtt gaa aag tac tca tct cct ggt ctg aca tcc aaa gag tca ctc ttt 624 Val Glu Lys Tyr Ser Ser Pro Gly Leu Thr Ser Lys Glu Ser Leu Phe 195 200 205 gtt cga ata aat gct gct cat gga ttc tcc ctt att cag gtg gac aac 672 Val Arg Ile Asn Ala Ala His Gly Phe Ser Leu Ile Gln Val Asp Asn 210 215 220 aca aag gtt acc atg aag gaa atc tta ctg aag gca gtg aag cga aga 720 Thr Lys Val Thr Met Lys Glu Ile Leu Leu Lys Ala Val Lys Arg Arg 225 230 235 240 aaa gga tcc cag aaa gtt tca ggc cct cag tac cgc ctg gag aag cag 768 Lys Gly Ser Gln Lys Val Ser Gly Pro Gln Tyr Arg Leu Glu Lys Gln 245 250 255 agc gag ccc aat gtc gcc gtt gac ctg gac agc act ttg gag agc cag 816 Ser Glu Pro Asn Val Ala Val Asp Leu Asp Ser Thr Leu Glu Ser Gln 260 265 270 agc gca tgg gag ttc tgc ctg gtc cgc gag aac agt tca agg gca gac 864 Ser Ala Trp Glu Phe Cys Leu Val Arg Glu Asn Ser Ser Arg Ala Asp 275 280 285 ggg gtt ttt gag gag gat tcg caa att gac ata gcc aca gta cag gat 912 Gly Val Phe Glu Glu Asp Ser Gln Ile Asp Ile Ala Thr Val Gln Asp 290 295 300 atg ctt agc agc cac cat tac aag tca ttc aaa gtc agc atg atc cac 960 Met Leu Ser Ser His His Tyr Lys Ser Phe Lys Val Ser Met Ile His 305 310 315 320 aga ctg cga ttc aca acc gac gta cag cta ggt atc tct gga gac aaa 1008 Arg Leu Arg Phe Thr Thr Asp Val Gln Leu Gly Ile Ser Gly Asp Lys 325 330 335 gta gag ata gac cct gtt acg aat cag aaa gcc agc act aag ttt tgg 1056 Val Glu Ile Asp Pro Val Thr Asn Gln Lys Ala Ser Thr Lys Phe Trp 340 345 350 att aag cag aaa ccc atc tca atc gat tcc gac ctg ctc tgt gcc tgt 1104 Ile Lys Gln Lys Pro Ile Ser Ile Asp Ser Asp Leu Leu Cys Ala Cys 355 360 365 gac ctt gct gaa gag aaa agc ccc agt cac gca ata ttt aaa ctc acg 1152 Asp Leu Ala Glu Glu Lys Ser Pro Ser His Ala Ile Phe Lys Leu Thr 370 375 380 tat cta agc aat cac gac tat aaa cac ctc tac ttt gaa tcg gac gct 1200 Tyr Leu Ser Asn His Asp Tyr Lys His Leu Tyr Phe Glu Ser Asp Ala 385 390 395 400 gct acc gtc aat gaa att gtg ctc aag gtt aac tac atc ctg gaa tcg 1248 Ala Thr Val Asn Glu Ile Val Leu Lys Val Asn Tyr Ile Leu Glu Ser 405 410 415 cga gct agc act gcc cgg gct gac tac ttt gct caa aaa aaa agc ggc 1296 Arg Ala Ser Thr Ala Arg Ala Asp Tyr Phe Ala Gln Lys Lys Ser Gly 420 425 430 cgc 1299 Arg <210> 18 <211> 433 <212> PRT <400> 18 Gly Arg Ile Ala Asp Pro Ala Arg Ser Val Glu Ala Ala Ser Ala Gln 1 5 10 15 Arg Leu 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tggatcatcc aggtgttaat caacctttcc 840 ttattaaaac taaccattac ttggcaactt tatacaagaa tacctcagta ctggaaaatc 900 accactggag atctgcagtg ggcttattga gagaatcagg cttattctca catctgccat 960 tagaaagcag gcaacaaatg gagacacaga taggtgctct gatactagcc acagacatca 1020 gtcgccagaa tgagtatctg tctttgttta ggtcccattt ggatagaggt gatttatgcc 1080 tagaagacac cagacacaga catttggttt tacagatggc tttgaaatgt gctgatattt 1140 gtaacccatg tcggacgtgg gaattaagca agcagtggag tgaaaaagta acggaggaat 1200 tcttccatca aggagatata gaaaaaaaat atcatttggg tgtgagtcca ctttgcgatc 1260 gtcacactga atctattgcc aacatccaga ttggttttat gacttaccta gtggagcctt 1320 tatttacaga atgggccagg ttttccaata caaggctatc ccagacaatg cttggacacg 1380 tggggctgaa taaagccagc tggaagggac tgcagagaga acagtcgagc agtgaggaca 1440 ctgatgctgc atttgagttg aactcacagt tattacctca ggaaaatcgg ttatcataac 1500 ccccagaacc agtgggacaa actgcctcct ggaggttttt agaaatgtga aatggggtct 1560 tgaggtgaga gaacttaact cttgactgcc aaggtttcca agtgagtgat gccagccagc 1620 attatttatt tccaagattt cctctgttgg atcatttgaa cccacttgtt aattgcaaga 1680 cccgaacata cagcaatatg aatttggctt tcatgtgaaa ccttgaatat nnaaagccca 1740 gcaggagaga atccgaaagg agtaacaaag gaagttttga tatgtgccac gactttttca 1800 aagcatctaa tcttcaaaac gtcaaacttg aattgttcag caacaatctc ttggaattta 1860 accagtctga tgcaacaatg tgtatcttgt accttccact aagttctctc tgagaaaatg 1920 gaaatgtgaa gtgcccagcc tctgcntgcc tctggcaaga caatgtttac aaatcaactc 1980 tgaaaatatt ggttctaaat tgccttggag catgattgtg aaggaaccac tcaaacaaat 2040 ttaaagatca aactttagac tgcagctctt tccccctggt ttgccttttt cttctttgga 2100 tgccaccaaa gcctcccatt tgctatagtt ttatttcatg cactggaaac tgagcattta 2160 tcgtagagta ccgccaagct ttcactccag tgccgtttgg caatgcaatt ttttttagca 2220 attagttttt aatttggggt gggaggggaa gaacaccaat gtcctagctg tattatgatt 2280 ctgcactcaa gacattgcat gttgttttca ctactgtaca cttgacctgc acatgcgaga 2340 aaaaggtgga atgtttaaaa caccataatc agctcagngt atttgccaat ctgaaataaa 2400 agtgggatgg gagagcgtgt ccttcagatc aagggtacta aagtcccttt cgctgcagtg 2460 agtgagaggt atgttgtgtg tgaatgtacg 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Tyr Ala Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys 365 370 375 aca ttc aga atc tca tct gac aca ttt ata acc tac atg atg act tta 1323 Thr Phe Arg Ile Ser Ser Asp Thr Phe Ile Thr Tyr Met Met Thr Leu 380 385 390 395 gaa gac cat tac cat tct gac gtg gca tat cac aac agc ctg cac gct 1371 Glu Asp His Tyr His Ser Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala 400 405 410 gct gat gta gcc cag tcg acc cat gtt ctc ctt tct aca cca gca tta 1419 Ala Asp Val Ala Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu 415 420 425 gac gct gtc ttc aca gat ttg gag atc ctg gct gcc att ttt gca gct 1467 Asp Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ala 430 435 440 gcc atc cat gac gtt gat cat cct gga gtc tcc aat cag ttt ctc atc 1515 Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile 445 450 455 aac aca aat tca gaa ctt gct ttg atg tat aat gat gaa tct gtg ttg 1563 Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu 460 465 470 475 gaa aat cat cac ctt gct gtg ggt ttc aaa ctg ctg caa gaa gaa cac 1611 Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu His 480 485 490 tgt gac atc ttc atg aat ctc acc aag aag cag cgt cag aca ctc agg 1659 Cys Asp Ile Phe Met Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Thr Leu Arg 495 500 505 aag atg gtt att gac atg gtg tta gca act gat atg tct aaa cat atg 1707 Lys Met Val Ile Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met 510 515 520 agc ctg ctg gca gac ctg aag aca atg gta gaa acg aag aaa gtt aca 1755 Ser Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr 525 530 535 agt tca ggc gtt ctt ctc cta gac aac tat acc gat cgc att cag gtc 1803 Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Thr Asp Arg Ile Gln Val 540 545 550 555 ctt cgc aac atg gta cac tgt gca gac ctg agc aac ccc acc aag tcc 1851 Leu Arg Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Ser 560 565 570 ttg gaa ttg tat cgg caa tgg aca gac cgc atc atg gag gaa ttt ttc 1899 Leu Glu Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe 575 580 585 cag cag gga gac aaa gag cgg gag agg gga atg gaa att agc cca atg 1947 Gln Gln Gly Asp Lys Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met 590 595 600 tgt gat aaa cac aca gct tct gtg gaa aaa tcc cag gtt ggt ttc atc 1995 Cys Asp Lys His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile 605 610 615 gac tac att gtc cat cca ttg tgg gag aca tgg gca gat ttg gta cag 2043 Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val Gln 620 625 630 635 cct gat gct cag gac att ctc gat acc tta gaa gat aac agg aac tgg 2091 Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asn Trp 640 645 650 tat cag agc atg ata cct caa agt ccc tca cca cca ctg gac gag cag 2139 Tyr Gln Ser Met Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Pro Leu Asp Glu Gln 655 660 665 aac agg gac tgc cag ggt ctg atg gag aag ttt cag ttt gaa ctg act 2187 Asn Arg Asp Cys Gln Gly Leu Met Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr 670 675 680 ctc gat gag gaa gat tct gaa gga cct gag aag gag gga gag gga cac 2235 Leu Asp Glu Glu Asp Ser Glu Gly Pro Glu Lys Glu Gly Glu Gly His 685 690 695 agc tat ttc agc agc aca aag acg ctt tgt gtg att gat cca gaa aac 2283 Ser Tyr Phe Ser Ser Thr Lys Thr Leu Cys Val Ile Asp Pro Glu Asn 700 705 710 715 aga gat tcc ctg gga gag act gac ata gac att gca aca gaa gac aag 2331 Arg Asp Ser Leu Gly Glu Thr Asp Ile Asp Ile Ala Thr Glu Asp Lys 720 725 730 tcc ccc gtg gat aca ta atccccctct ccctgtggag atgaacattc 2378 Ser Pro Val Asp Thr 735 tatccttgat gagcatgcca gctatgtggt agggccagcc caccatgggg gccaagacct 2438 gcacaggaca agggccacct ggcctttcag ttacttgagt ttggagtcag aaagcaagac 2498 caggaagcaa atagcagctc aggaaatccc acggttgact tgccttgatg gcaagcttgg 2558 tggagagggc tgaagctgtt gctgggggcc gattctgatc aagacacatg gcttgaaaat 2618 ggaagacaca aaactgagag atcattctgc actaagtttc gggaacttat ccccgacagt 2678 gactgaactc actgactaat aacttcattt atgaatcttc tcacttgtcc ctttgtctgc 2738 caacctgtgt gccttttttg taaaacattt tcatgtcttt aaaatgcctg ttgaatacct 2798 ggagtttagt atcaacttct acacagataa gctttcaaag ttgacaaact tttttgactc 2858 tttctggaaa agggaaagaa aatagtcttc cttctttctt gggcaatatc cttcacttta 2918 ctacagttac ttttgcaaac agacagaaag gatacacttc taaccacatt ttacttcctt 2978 cccctgttgt ccagtccaac tccacagtca ctcttaaaac ttctctctgt ttgcctgcct 3038 ccaacagtac ttttaacttt ttgctgtaaa cagaataaaa ttgaacaaat tagggggtag 3098 aaaggagcag tggtgtcgtt caccgtgaga gtctgcatag aactcagcag tgtgccctgc 3158 tgtgtcttgg accctgcaat gcggccgc 3186 <210> 24 <211> 736 <212> PRT <400> 24 Met Lys Lys Ser Arg Ser Val Met Thr Val Met Ala Asp Asp Asn Val 1 5 10 15 Lys Asp Tyr Phe Glu Cys Ser Leu Ser Lys Ser Tyr Ser Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Thr Leu Gly Ile Asp Leu Trp Arg Gly Arg Arg Cys Cys Ser Gly 35 40 45 Asn Leu Gln Leu Pro Pro Leu Ser Gln Arg Gln Ser Glu Arg Ala Arg 50 55 60 Thr Pro Glu Gly Asp Gly Ile Ser Arg Pro Thr Thr Leu Pro Leu Thr 65 70 75 80 Thr Leu Pro Ser Ile Ala Ile Thr Thr Val Ser Gln Glu Cys Phe Asp 85 90 95 Val Glu Asn Gly Pro Ser Pro Gly Arg Ser Pro Leu Asp Pro Gln Ala 100 105 110 Ser Ser Ser Ala Gly Leu Val Leu His Ala Thr Phe Pro Gly His Ser 115 120 125 Gln Arg Arg Glu Ser Phe Leu Tyr Arg Ser Asp Ser 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Asn Met Val 545 550 555 560 His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Ser Leu Glu Leu Tyr Arg 565 570 575 Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe Gln Gln Gly Asp Lys 580 585 590 Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Thr 595 600 605 Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His 610 615 620 Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val Gln Pro Asp Ala Gln Asp 625 630 635 640 Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asn Trp Tyr Gln Ser Met Ile 645 650 655 Pro Gln Ser Pro Ser Pro Pro Leu Asp Glu Gln Asn Arg Asp Cys Gln 660 665 670 Gly Leu Met Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Asp Glu Glu Asp 675 680 685 Ser Glu Gly Pro Glu Lys Glu Gly Glu Gly His Ser Tyr Phe Ser Ser 690 695 700 Thr Lys Thr Leu Cys Val Ile Asp Pro Glu Asn Arg Asp Ser Leu Gly 705 710 715 720 Glu Thr Asp Ile Asp Ile Ala Thr Glu Asp Lys Ser Pro Val Asp Thr 725 730 735 <210> 25 <211> 1276 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (2)...(504) <400> 25 gcggccgcat tgcgtggtgg cggcggccga gcctcgcttt gagagacaga 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caaacagatt aggtgcagga ccagatggag ttgaagaaat taaaagacat tcatttttct 960 caacgataga ctggaataaa ctgtatagag agaaattcat ccgccattta aacctgcaac 1020 gggcaggcct gaagatacat tctattttga tcctgagttt actgcaaaaa ctcccaaaga 1080 ttcacctggc attccaccta gtgctaatgc acatcagctt tttcgggggt ttagttttgt 1140 tgctattacc tcagatgatg aaagccaagc tatgcagaca gttggtgtac attcaattgt 1200 tcagcagtta cacaggaaca gtatncagtt tactgatgga tatgaagtaa aagaagatat 1260 tggagttggc tcctac 1276 <210> 26 <211> 167 <212> PRT <400> 26 Arg Pro His Cys Val Val Ala Ala Ala Glu Pro Arg Phe Glu Arg Gln 1 5 10 15 Asn Gly Gln Gln Ile Met Asp Glu Pro Met Gly Glu Glu Glu Ile Asn 20 25 30 Pro Gln Thr Glu Glu Val Ser Ile Lys Glu Ile Ala Ile Thr His His 35 40 45 Val Lys Glu Gly His Glu Lys Ala Asp Pro Ser Gln Phe Glu Leu Leu 50 55 60 Lys Val Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Lys Val Phe Leu Val Lys Lys 65 70 75 80 Ile Ser Gly Ser Asp Ala Arg Gln Leu Tyr Ala Met Lys Val Leu Lys 85 90 95 Lys Ala Thr Leu Lys Val Arg Asp Arg Val Arg Thr Lys Met Glu Arg 100 105 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acg gcc atc tcc 576 Leu Ile Val Leu Ile Cys Cys Cys Cys Thr Leu Leu Thr Ala Ile Ser 180 185 190 atg agt gcc atc gcc acc aac ggt gtg gtt cca gct ggg ggc tcc tat 624 Met Ser Ala Ile Ala Thr Asn Gly Val Val Pro Ala Gly Gly Ser Tyr 195 200 205 ttc atg atc tct cgt tca ctg ggg cca gaa ttt gga ggt gct gtg ggc 672 Phe Met Ile Ser Arg Ser Leu Gly Pro Glu Phe Gly Gly Ala Val Gly 210 215 220 ctg tgc ttc tac ctg gga aca aca ttc gca gca gcc atg tac atc ctg 720 Leu Cys Phe Tyr Leu Gly Thr Thr Phe Ala Ala Ala Met Tyr Ile Leu 225 230 235 240 ggg gcc atc gag atc ttg ctg acc tac att gcc cca cca gct gcc att 768 Gly Ala Ile Glu Ile Leu Leu Thr Tyr Ile Ala Pro Pro Ala Ala Ile 245 250 255 ttt tac cca tcg ggt gct cat gac acg tcg aat gcc act ttg aac aat 816 Phe Tyr Pro Ser Gly Ala His Asp Thr Ser Asn Ala Thr Leu Asn Asn 260 265 270 atg cgt gtg tat ggg acc att ttc ctg gcc ttc atg acc ctg gtg gtg 864 Met Arg Val Tyr Gly Thr Ile Phe Leu Ala Phe Met Thr Leu Val Val 275 280 285 ttt gtg ggg gtc aag tat gtg aac aaa ttt gcc tcg ctc ttc ctg gcc 912 Phe Val Gly Val Lys Tyr Val Asn Lys Phe Ala Ser Leu Phe Leu Ala 290 295 300 tgt gtg atc atc tcc atc ctc tcc atc tat gct ggg ggc ata aag tct 960 Cys Val Ile Ile Ser Ile Leu Ser Ile Tyr Ala Gly Gly Ile Lys Ser 305 310 315 320 ata ttt gac cct ccc gtg ttt ccg gta tgc atg ctg ggc aac agg acc 1008 Ile Phe Asp Pro Pro Val Phe Pro Val Cys Met Leu Gly Asn Arg Thr 325 330 335 ctg tcc cgg gac cag ttt gac atc tgt gcc aag aca gct gta gtg gac 1056 Leu Ser Arg Asp Gln Phe Asp Ile Cys Ala Lys Thr Ala Val Val Asp 340 345 350 aat gag aca gtg gcc acc cag cta tgg agt ttc ttc tgc cac agc ccc 1104 Asn Glu Thr Val Ala Thr Gln Leu Trp Ser Phe Phe Cys His Ser Pro 355 360 365 aac ctt acg acc gac tcc tgt gac ccc tac ttc atg ctc aac aat gtg 1152 Asn Leu Thr Thr Asp Ser Cys Asp Pro Tyr Phe Met Leu Asn Asn Val 370 375 380 acc gag atc cct ggc atc ccc ggg gca gct gct ggt gtg ctc cag gaa 1200 Thr Glu Ile Pro Gly Ile Pro Gly Ala Ala Ala Gly Val Leu Gln Glu 385 390 395 400 aac ctg tgg agc gcc tac ctg gag aag ggt gac atc gtg gag aag cat 1248 Asn Leu Trp Ser Ala Tyr Leu Glu Lys Gly Asp Ile Val Glu Lys His 405 410 415 ggg ctg ccc tcc gca gat gcc ccg agc ctg aag gag agc ctg cct ctg 1296 Gly Leu Pro Ser Ala Asp Ala Pro Ser Leu Lys Glu Ser Leu Pro Leu 420 425 430 tac gtg gtc gct gac atc gcc aca tcc ttc acc gtg ctg gtc ggc atc 1344 Tyr Val Val Ala Asp Ile Ala Thr Ser Phe Thr Val Leu Val Gly Ile 435 440 445 ttc ttc cct tct gta aca ggt atg gcg atg gtg tca gca gga act tgg 1392 Phe Phe Pro Ser Val Thr Gly Met Ala Met Val Ser Ala Gly Thr Trp 450 455 460 tgg tgg gca cac tgg cct ggc ctt cac cct ggg tca tcg tca tcg gct 1440 Trp Trp Ala His Trp Pro Gly Leu His Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ala 465 470 475 480 cct tct ttt caa cgt gtg gcg ctg gcc tcc aga gcc tca cag ggg cac 1488 Pro Ser Phe Gln Arg Val Ala Leu Ala Ser Arg Ala Ser Gln Gly His 485 490 495 cac gcc tat tgc agg cca ttg cca agg aca aca tca tcc cct tcc tcc 1536 His Ala Tyr Cys Arg Pro Leu Pro Arg Thr Thr Ser Ser Pro Ser Ser 500 505 510 ggg tgagcccctc tgcactcccc catggcctgg ctgctcccag gccctcgccc 1589 Gly ggctggggag agagataggg aacacagatg cagcacgtcc tgcccttatt gcccccgggc 1649 caggcggcca tccatgagga gctactgaga agtgccctgg gcctggcact cacctgggcc 1709 tggagctgcc tggacccaga atcttcatgg cctgtttagg gctcatccaa aggagagagg 1769 cctggtgagg tggaatcagg gagactggtg acacccatag ggatagacac aggggcggcc 1829 tgagccccca aggcgggccc tgggggtga ggg agg cca ggc tgg ggt ctg ggg 1882 Gly Arg Pro Gly Trp Gly Leu Gly 515 520 ccc aag gtg tgg aat ggg ggt gac agg acc cag ctt cct tcc tgg tgc 1930 Pro Lys Val Trp Asn Gly Gly Asp Arg Thr Gln Leu Pro Ser Trp Cys 525 530 535 aca cag gtg ttt ggc cac ggg aag gtg aat ggt gaa ccc aca tgg gca 1978 Thr Gln Val Phe Gly His Gly Lys Val Asn Gly Glu Pro Thr Trp Ala 540 545 550 ctc ctc ctg acg gca ctc atc gcc gag ctg ggc atc ctc atc gcc tcc 2026 Leu Leu Leu Thr Ala Leu Ile Ala Glu Leu Gly Ile Leu Ile Ala Ser 555 560 565 ctc gac atg gtg gcc ccc atc tta tcc atg ttc ttt ctg atg tgc tac 2074 Leu Asp Met Val Ala Pro Ile Leu Ser Met Phe Phe Leu Met Cys Tyr 570 575 580 585 ctg ttc gtg aac ctc gcc tgt gcg gtg cag aca ctc ctg agg acc ccc 2122 Leu Phe Val Asn Leu Ala Cys Ala Val Gln Thr Leu Leu Arg Thr Pro 590 595 600 aac tgg cgg ccc cgg ttc aag tac tat cac tgg gcg ctg tcc ttc ctg 2170 Asn Trp Arg Pro Arg Phe Lys Tyr Tyr His Trp Ala Leu Ser Phe Leu 605 610 615 ggc atg agt ctc tgc ctg gcc ctt atg ttt gtc tcc tcc tgg tac tat 2218 Gly Met Ser Leu Cys Leu Ala Leu Met Phe Val Ser Ser Trp Tyr Tyr 620 625 630 gcc ctg gtg gcc atg ctc atc gcc ggc atg atc tac aaa tac atc gag 2266 Ala Leu Val Ala Met Leu Ile Ala Gly Met Ile Tyr Lys Tyr Ile Glu 635 640 645 tac caa ggg gct gag aag gag tgg ggt gac ggg atc cga ggc ctg tcc 2314 Tyr Gln Gly Ala Glu Lys Glu Trp Gly Asp Gly Ile Arg Gly Leu Ser 650 655 660 665 ctg agc gct gcc cgc tac gcg ctg ttg cgg ctg gag gag ggg cct cct 2362 Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Ala Leu Leu Arg Leu Glu Glu Gly Pro Pro 670 675 680 cac acc aag aac tgg cgg ccg c 2384 His Thr Lys Asn Trp Arg Pro 685 <210> 28 <211> 688 <212> PRT <400> 28 Ala Ala Ala Phe Gly Asp Ser Gly Gly Arg Leu Gly Arg Arg Val Arg 1 5 10 15 Arg Gly Arg Ala Arg Thr Met Pro His Phe Thr Val Val Pro Val Asp 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Asp Tyr Asp Asn Leu Glu Gly Leu Ser Trp Val 35 40 45 Asp Tyr Gly Glu Arg Ala Glu Leu Asp Asp Ser Asp Gly His Gly Asn 50 55 60 His Arg Glu Ser Ser Pro Phe Leu Ser Pro Leu Glu Ala Ser Arg Gly 65 70 75 80 Ile Asp Tyr Tyr Asp Arg Asn Leu Ala Leu Phe Glu Glu Glu Leu Asp 85 90 95 Ile Arg Pro Lys Val Ser Ser Leu Leu Gly Lys Leu Val Ser Tyr Thr 100 105 110 Asn Leu Thr Gln Gly Ala Lys Glu His Glu Glu Ala Glu Ser Gly Glu 115 120 125 Gly Thr Arg Arg Arg Ala Ala Glu Ala Pro Ser Met Gly Thr Leu Met 130 135 140 Gly Val Tyr Leu Pro Cys Leu Gln Asn Ile Phe Gly Val Ile Leu Phe 145 150 155 160 Leu Arg Leu Thr Trp Met Val Gly Thr Ala Gly Val Leu Gln Ala Leu 165 170 175 Leu Ile Val Leu Ile Cys Cys Cys Cys Thr Leu Leu Thr Ala Ile Ser 180 185 190 Met Ser Ala Ile Ala Thr Asn Gly Val Val Pro Ala Gly Gly Ser Tyr 195 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620 Leu Met Phe Val Ser Ser Trp Tyr Tyr Ala Leu Val Ala Met Leu Ile 625 630 635 640 Ala Gly Met Ile Tyr Lys Tyr Ile Glu Tyr Gln Gly Ala Glu Lys Glu 645 650 655 Trp Gly Asp Gly Ile Arg Gly Leu Ser Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Ala 660 665 670 Leu Leu Arg Leu Glu Glu Gly Pro Pro His Thr Lys Asn Trp Arg Pro 675 680 685 <210> 29 <211> 1675 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (492)...(1330) <400> 29 aagcttgcgg ccgcattgcg agaacgagaa cgggagcgag agagagagcg agagagggaa 60 cgggagcgag aaagagaaaa agacaaaaaa cgggaccgag aagaagatga agaagatgca 120 tacgaacgaa gaaaacttga aagaaaactc cgagagaaag aagctgctta tcaagagcgc 180 cttaagaatt gggaaatcag agaacgaaag aaaacccggg aatatgagaa agaagctgaa 240 agagaagaag aaagaagaag agaaatggcc aaagaagcta aacgactaaa agaattctta 300 gaagactatg atgatgatag agatgacccc aaatattaca gaggaagtgc tcttcagaaa 360 aggttgcgtg atagagaaaa ggaaatggaa gcagatgaac gagataggaa gagagagaag 420 gaggagcttg aggaaatcag gcagcgcttc tggcagaagg gcatccagat ccagatgcag 480 agctccagag g atg gaa caa gag gct gag agg cgc agg cag cca caa ata 530 Met Glu Gln Glu Ala Glu Arg Arg Arg Gln Pro Gln Ile 1 5 10 aag caa gag cca gaa tca gaa gag gag gaa gaa gaa aag caa gaa aaa 578 Lys Gln Glu Pro Glu Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Gln Glu Lys 15 20 25 gaa gaa aaa cga gaa gaa ccc atg gaa gag gaa gag gag cca gag caa 626 Glu Glu Lys Arg Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Glu Glu Pro Glu Gln 30 35 40 45 aag cct tgt ctg aaa cct act ctg agg ccc atc agc tct gct cca tct 674 Lys Pro Cys Leu Lys Pro Thr Leu Arg Pro Ile Ser Ser Ala Pro Ser 50 55 60 gtt tcc tct gcc agt ggc aat gca aca cct aac act cct ggg gat gag 722 Val Ser Ser Ala Ser Gly Asn Ala Thr Pro Asn Thr Pro Gly Asp Glu 65 70 75 tct ccc tgt ggt att att att cct cat gaa aac tca cca gat caa cag 770 Ser Pro Cys Gly Ile Ile Ile Pro His Glu Asn Ser Pro Asp Gln Gln 80 85 90 caa cct gag gag cat agg cca aaa ata gga cta agt ctt aaa ctg ggt 818 Gln Pro Glu Glu His Arg Pro Lys Ile Gly Leu Ser Leu Lys Leu Gly 95 100 105 gct tcc aat agt cct ggt cag cct aat tct gtg aag aga aag aaa cta 866 Ala Ser Asn Ser Pro Gly Gln Pro Asn Ser Val Lys Arg Lys Lys Leu 110 115 120 125 cct gta gat agt gtc ttt aac aaa ttt gag gat gaa gac agt gat gac 914 Pro Val Asp Ser Val Phe Asn Lys Phe Glu Asp Glu Asp Ser Asp Asp 130 135 140 gta ccc cga aaa agg aaa ctg gtt ccc ttg gat tat ggt gaa gat gat 962 Val Pro Arg Lys Arg Lys Leu Val Pro Leu Asp Tyr Gly Glu Asp Asp 145 150 155 aaa aat gca acc aaa ggc act gta aac act gaa gaa aag cgt aaa cac 1010 Lys Asn Ala Thr Lys Gly Thr Val Asn Thr Glu Glu Lys Arg Lys His 160 165 170 att aag agt ctc att gag aaa atc cct aca gcc aaa cct gag ctc ttc 1058 Ile Lys Ser Leu Ile Glu Lys Ile Pro Thr Ala Lys Pro Glu Leu Phe 175 180 185 gct tat ccc ctg gat tgg tct att gtg gat tct ata ctg atg gaa cgt 1106 Ala Tyr Pro Leu Asp Trp Ser Ile Val Asp Ser Ile Leu Met Glu Arg 190 195 200 205 cga att aga cca tgg att aat aag aaa atc ata gaa tat ata ggt gaa 1154 Arg Ile Arg Pro Trp Ile Asn Lys Lys Ile Ile Glu Tyr Ile Gly Glu 210 215 220 gaa gaa gct aca tta gtt gat ttt gtt tgt tct aag gtt 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Pro Glu Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Gln Glu Lys Glu Glu Lys 20 25 30 Arg Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Glu Glu Pro Glu Gln Lys Pro Cys 35 40 45 Leu Lys Pro Thr Leu Arg Pro Ile Ser Ser Ala Pro Ser Val Ser Ser 50 55 60 Ala Ser Gly Asn Ala Thr Pro Asn Thr Pro Gly Asp Glu Ser Pro Cys 65 70 75 80 Gly Ile Ile Ile Pro His Glu Asn Ser Pro Asp Gln Gln Gln Pro Glu 85 90 95 Glu His Arg Pro Lys Ile Gly Leu Ser Leu Lys Leu Gly Ala Ser Asn 100 105 110 Ser Pro Gly Gln Pro Asn Ser Val Lys Arg Lys Lys Leu Pro Val Asp 115 120 125 Ser Val Phe Asn Lys Phe Glu Asp Glu Asp Ser Asp Asp Val Pro Arg 130 135 140 Lys Arg Lys Leu Val Pro Leu Asp Tyr Gly Glu Asp Asp Lys Asn Ala 145 150 155 160 Thr Lys Gly Thr Val Asn Thr Glu Glu Lys Arg Lys His Ile Lys Ser 165 170 175 Leu Ile Glu Lys Ile Pro Thr Ala Lys Pro Glu Leu Phe Ala Tyr Pro 180 185 190 Leu Asp Trp Ser Ile Val Asp Ser Ile Leu Met Glu Arg Arg Ile Arg 195 200 205 Pro Trp Ile Asn Lys Lys Ile Ile Glu Tyr Ile Gly Glu Glu Glu Ala 210 215 220 Thr Leu Val Asp Phe 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Asn His Tyr Arg 180 185 190 cgc tat cca cgt cgt agg ggt cct cca cgc aat tac cag caa aat tac 623 Arg Tyr Pro Arg Arg Arg Gly Pro Pro Arg Asn Tyr Gln Gln Asn Tyr 195 200 205 cag aat agt gag agt ggg gaa aag aac gag gga tcg gag agt gct ccc 671 Gln Asn Ser Glu Ser Gly Glu Lys Asn Glu Gly Ser Glu Ser Ala Pro 210 215 220 gaa ggc cag gcc caa caa cgc cgg ccc tac cgc agg cga agg ttc cca 719 Glu Gly Gln Ala Gln Gln Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Arg Arg Phe Pro 225 230 235 cct tac tac atg cgg aga ccc tat ggg cgt cga cca cag tat tcc aac 767 Pro Tyr Tyr Met Arg Arg Pro Tyr Gly Arg Arg Pro Gln Tyr Ser Asn 240 245 250 255 cct cct gtg cag gga gaa gtg atg gag ggt gct gac aac cag ggt gca 815 Pro Pro Val Gln Gly Glu Val Met Glu Gly Ala Asp Asn Gln Gly Ala 260 265 270 gga gaa caa ggt aga cca gtg agg cag aat atg tat cgg gga tat aga 863 Gly Glu Gln Gly Arg Pro Val Arg Gln Asn Met Tyr Arg Gly Tyr Arg 275 280 285 cca cga ttc cgc agg ggc cct cct cgc caa aga cag cct aga gag gac 911 Pro Arg Phe Arg Arg Gly Pro Pro Arg Gln Arg Gln Pro Arg Glu Asp 290 295 300 ggc aat gaa gaa gat aaa gaa aat caa gga gat gag acc caa ggt cag 959 Gly Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Gln Gly Asp Glu Thr Gln Gly Gln 305 310 315 cag cca cct caa cgt cgg tac cgc cgc aac ttc aat tac cga cgc aga 1007 Gln Pro Pro Gln Arg Arg Tyr Arg Arg Asn Phe Asn Tyr Arg Arg Arg 320 325 330 335 cgc cca gaa aac cct aaa cca caa gat ggc aaa gag aca aaa gca gcc 1055 Arg Pro Glu Asn Pro Lys Pro Gln Asp Gly Lys Glu Thr Lys Ala Ala 340 345 350 gat cca cca gct gag aat tcg tcc gct ccc gag gct gag cag ggc ggg 1103 Asp Pro Pro Ala Glu Asn Ser Ser Ala Pro Glu Ala Glu Gln Gly Gly 355 360 365 gct gag ta aatgccggct taccatctct accatcatcc ggtttagtca tccaacaaga 1161 Ala Glu agaaatatga aattccagca ataagaaatg aacaaaagat tggagctgaa gacctaaagt 1221 gcttgctttt tgcccgttga ccagataaat agaactatct gcattatcta tgcagcatgg 1281 ggtttttatt atttttacct aaagacgtct ctttttggta ataacaaacg tgttttttaa 1341 aaaagcctgg tttttctcaa tacgccttta aaggttttta aattgtttca tatctggtca 1401 agttgagatt tttaagaact tcatttttaa tttgtaataa aagtttacaa cttgattttt 1461 tcaaaaaagt caacaaactg caagcacctg ttaataaagg tcttaaataa ttgtctttgt 1521 gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag cttggtattc attacttcat 1581 gtatatcaag cacagcagta aaacaaaaac ccatgtattt aacttttttt taggattttt 1641 gcttttgtga tttttttttt tttttttttg atacttgcct aacatgcatg tgctgtaaaa 1701 atagttaaca gggaaataac ttgagatgat ggctagcttt gtttaatgtc ttatgaaatt 1761 ttcatgaaca atccaagcat aattgttaag aacacgtgta ttaaattcat gtaagtggaa 1821 taaaagtttt atgaatggac ttttcaacta ctttctctac agcttttcat gtaaattagt 1881 cttggttctg aaacttctct aaaggaaatt gtacattttt tgaaatttat tccttattcc 1941 ctcttggcag ctaatgggct cttaccaagt ttaaacacaa aatttatcat aacaaaaata 2001 ctactaatat aactactgtt tccatgtccc atgatcccct ctcttcctcc ccaccctgaa 2061 aaaaatgagt tcctattttt tctgggagag ggggggattg attagaaaaa aatgtagtgt 2121 gttccattta aaattttggc atatggcatt ttctaactta ggaagccaca atgttcttgg 2181 cccatcatga cattgggtag cattaactgt aagttttgtg cttccaaatc actttttggt 2241 ttttaagaat ttcttgatac tcttatagcc tgccttcaat tttgatcctt tattctttct 2301 atttgtcagg tgcacaagat taccttcctg ttttagcctt ctgtcttgtc accaaccatt 2361 cttacttggt ggccatgtac ttggaaaaag gccgcatgat ctttctggct ccactcagtg 2421 tctaaggcac cctgcttcct ttgcttgcat cccacagact atttccctca tcctatttac 2481 tgcagcaaat ctctccttag ttgatgagac tgtgtttatc tccctttaaa accctaccta 2541 tcctgaatgg tctgtcattg tctgccttta aaatccttcc tctttcttcc tcctctattc 2601 tctaaataat gatggggcta agttataccc aaagctcact ttacaaaata tttcctcagt 2661 actttgcaga aaacaccaaa caaaaatgcc attttaaaaa aggtgtattt tttcttttag 2721 aatgtaagct cctcaagagc agggacaatg ttttctgtat gttctattgt gcctagtaca 2781 ctgtaaatgc tcaatgaata ttatccctaa tacctgccac cccactctta atcagtggtg 2841 gaagaacggt ctcagaactg tttgtttcaa ttggccattt aagtttagta gtaaaagact 2901 ggttaatgat aacaatgcat cgtaaaacct tcagaaggaa aggagaatgt tttgtggacc 2961 actttggttt tcttttttgc gtgtggcagt tttaagttat tagtttttaa aatcagtact 3021 ttttaatgga aacaacttga ccaaaaattt gtcacagaat tttggcggcc gc 3073 <210> 32 <211> 369 <212> 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Glu Ser Gly Glu Lys Asn Glu Gly Ser Glu Ser Ala Pro Glu 210 215 220 Gly Gln Ala Gln Gln Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Arg Arg Phe Pro Pro 225 230 235 240 Tyr Tyr Met Arg Arg Pro Tyr Gly Arg Arg Pro Gln Tyr Ser Asn Pro 245 250 255 Pro Val Gln Gly Glu Val Met Glu Gly Ala Asp Asn Gln Gly Ala Gly 260 265 270 Glu Gln Gly Arg Pro Val Arg Gln Asn Met Tyr Arg Gly Tyr Arg Pro 275 280 285 Arg Phe Arg Arg Gly Pro Pro Arg Gln Arg Gln Pro Arg Glu Asp Gly 290 295 300 Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Gln Gly Asp Glu Thr Gln Gly Gln Gln 305 310 315 320 Pro Pro Gln Arg Arg Tyr Arg Arg Asn Phe Asn Tyr Arg Arg Arg Arg 325 330 335 Pro Glu Asn Pro Lys Pro Gln Asp Gly Lys Glu Thr Lys Ala Ala Asp 340 345 350 Pro Pro Ala Glu Asn Ser Ser Ala Pro Glu Ala Glu Gln Gly Gly Ala 355 360 365 Glu <210> 33 <211> 1811 <212> DNA <400> 33 gaattcctgg tagggccagc ccaccatggg ggccaagacc tgcacaggac aagggccacc 60 tggcctttca gttacttgag tttggagtca gaaagcaaga ccaggaagca aatagcagct 120 caggaaatcc cacggttgac ttgccttgat ggcaagcttg gtggagaggg 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gcctaagagt tacgactttt tcttgtaatg ttttgtattg tgtattatat aacccaaacg 1080 tcacttagta gagacatatg gcccccttgg cagagaggac aggggtgggc ttttgttcaa 1140 agggtctgcc ctttccctgc ctgagttgct acttctgcac aaccccttta tgaaccagtt 1200 ttggaaacaa tattctcaca ttagatacta aatggtttat actgagcttt tacttttgta 1260 tagcttgata ggggcagggg gcaatgggat gtagttttta cccaggttct atccaaatct 1320 atgtgggcat gagttgggtt ataactggat cctactatca ttgtggcttt ggttcaaaag 1380 gaaacactac atttgctcac agatgattct tctgaatgct cccgaactac tgactttgaa 1440 gaggtagcct cctgcctgcc attaagcagg aatgtcatgt tccagttcat tacaaaagaa 1500 aacaataaaa caatgtgaat ttttataata aaatgtgaac tgatgtagca aattacgcaa 1560 atgtgaagcc tcttctgata acacttgtta ggcctcttac tgatgtcagt ttcagtttgt 1620 aaaatatgtt tcatgctttc agttcagcat tgtgactcag taattacaga aaatggcaca 1680 aatgtgcatg accaatgggt ttgtatgtct atgaacactg cattgtttca ggtggacatt 1740 ttatcatttt caaatgtttc tcacaatgta tgttatagta ttattattat atattgtgtt 1800 caaatgcatt c 1811 <210> 34 <211> 1672 <212> DNA <400> 34 gaattcccca ccatgggggc caagacctgc acaggacaag gccacctggc ctttcagtta 60 cttgagtttg gagtcagaaa gcaagaccag gaagcaaata gcagctcagg aaatcccacg 120 gttgacttgc cttgatggca agcttggtgg agagggctga agctgttgct gggggccgtt 180 ctgatcaaga cacatggctt gaaaatggaa gacacaaaac tgagagatca ttctgcacta 240 agtttcggga acttatcccc gacagtgact gaactcactg actaataact tcatttatga 300 atcttctccc ttgtcccttt gtctgccaac ctgtgtgcct tttttgtaaa acatttcagt 360 ctttaaaatg cctgttgaat acctggagtt agatcaactt ctacacagat aagctttcaa 420 agttgacaaa cttttttgac tcttctggaa aagggaaaga aaatagtctt ccttctttct 480 tgggcaatat ccttcacttt actacagtta cttttgcaaa cagacagaaa ggatacactt 540 ctaaccacat tttacttcct tcccctgttg tccagtccaa ctccacagtc actcttaaaa 600 cttctctctg tttgcctgcc tccaacagta cttttaactt ttaacttttt gctgtaaaca 660 gaataaaatt gaacaaatta gggggtagaa aggagcagtg gtgtcgttca ccgtgagagt 720 ctgcatagaa ctcagcagtg tgccctgctg tgtcttggac cctgcccccc acaggagttg 780 tacagtccct ggccctgttc cctacctcct ctcttcaccc cgttaggctg ttttcaatgt 840 aatgctgccg tccttctctt gcactgcctt ctgcgctaac acctccattc ctgtttataa 900 ccgtgtattt attacttaat gtatataatg taatgttttg taagttatta atttatatat 960 ctaacattgc ctgccaatgg tggtgttaaa tttgtgtaga aaactctgcc taagagttac 1020 gactttttct tgtaatgttt tgtattgtgt attatataac ccaaacgtca cttagtagag 1080 acatatggcc cccttggcag agaggacagg ggtgggcttt tgttcaaagg gtctgccctt 1140 tccctgcctg agttgctact tctgcacaac ccctttatga accagttttg gaaacaatat 1200 tctcacatta gatactaaat ggtttatact gagcttttac ttttgtatag cttgataggg 1260 gcagggggca atgggatgta gtttttaccc aggttctatc caaatctatg tgggcatgag 1320 ttgggttata actggatcct actatcattg tggctttggt tcaaaaggaa acactacatt 1380 tgctcacaga tgattcttct gaatgctccc gaactactga ctttgaagag gtagcctcct 1440 gcctgccatt aagcaggaat gtcatgttcc agttcattac aaaagaaaac aataaaacaa 1500 tgtgaatttt tataataaaa tgtgaactga tgtagcaaat tacgcaaatg tgaagcctct 1560 tctgataaca cttgttaggc ctcttactga tgtcagtttc agtttgtaaa atatgtttca 1620 tgctttcagt tcagcattgt gactcagtaa ttacagaaaa aaaaaagaat tc 1672 <210> 35 <211> 1649 <212> DNA <220> <221> CDS 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Leu Leu Asp Asn Tyr Thr Asp Arg Ile Gln Val 75 80 85 ctt cgc aac atg gta cac tgt gca gac ctg agc aac ccc acc aag tcc 521 Leu Arg Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Ser 90 95 100 ttg gaa ttg tat cgg caa tgg aca gac cgc atc atg gag gaa ttt ttc 569 Leu Glu Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe 105 110 115 120 cag cag gga gac aaa gag cgg gag agg gga atg gaa att agc cca atg 617 Gln Gln Gly Asp Lys Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met 125 130 135 tgt gat aaa cac aca gct tct gtg gaa aaa tcc cag gtt ggt ttc atc 665 Cys Asp Lys His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile 140 145 150 gac tac att gtc cat cca ttg tgg gag aca tgg gca gat ttg gta cag 713 Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val Gln 155 160 165 cct gat gct cag gac att ctc gat acc tta gaa gat aac agg aac tgg 761 Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asn Trp 170 175 180 tat cag agc atg ata cct caa agt ccc tca cca cca ctg gac gag cag 809 Tyr Gln Ser Met Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Pro Leu Asp Glu Gln 185 190 195 200 aac agg gac tgc cag ggt ctg atg gag aag ttt cag ttt gaa ctg act 857 Asn Arg Asp Cys Gln Gly Leu Met Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr 205 210 215 ctc gat gag gaa gat tct gaa gga cct gag aag gag gga gag gga cac 905 Leu Asp Glu Glu Asp Ser Glu Gly Pro Glu Lys Glu Gly Glu Gly His 220 225 230 agc tat ttc agc agc aca aag acg ctt tgt gtg att gat cca gaa aac 953 Ser Tyr Phe Ser Ser Thr Lys Thr Leu Cys Val Ile Asp Pro Glu Asn 235 240 245 aga gat tcc ctg gga gag act gac ata gac att gca aca gaa gac aag 1001 Arg Asp Ser Leu Gly Glu Thr Asp Ile Asp Ile Ala Thr Glu Asp Lys 250 255 260 tcc ccc gtg gat aca ta atccccctct ccctgtggag atgaacattc 1048 Ser Pro Val Asp Thr 265 tatccttgat gagcatgcca gctatgtggt agggccagcc caccatgggg gccaagacct 1108 gcacaggaca agggccacct ggcctttcag ttacttgagt ttggagtcag aaagcaagac 1168 caggaagcaa atagcagctc aggaaatccc acggttgact tgccttgatg gcaagcttgg 1228 tggagagggc tgaagctgtt gctgggggcc gattctgatc aagacacatg gcttgaaaat 1288 ggaagacaca aaaccgagag atcattctgc actaagtttc gggaacttat ccccgacagt 1348 gactgaactc actgactaat aacttcattt atgaatcttc tcccttgtcc ctttgtctgc 1408 caacctgtgt gccttttttg taaaacattt tcatgtcttt aaaatgcctg ttgaatacct 1468 ggagtttagt atcaacttct acacagataa gctttcaaag ttgacaaact tttttgactc 1528 tttctggaaa agggaaagaa aatagtcttc cttctttctt gggcaatatc cttcacttta 1588 ctacagttac ttttgcaaac agacagaaag gatacacttc taaccacatt ttacggaatt 1648 c 1649 <210> 36 <211> 269 <212> PRT <400> 36 Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly 1 5 10 15 Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu His Cys Asp Ile Phe Met Asn Leu Thr 20 25 30 Lys Lys Gln Arg Gln Thr Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Met Val Leu 35 40 45 Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Ser Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr 50 55 60 Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp 65 70 75 80 Asn Tyr Thr Asp Arg Ile Gln Val Leu Arg Asn Met Val His Cys Ala 85 90 95 Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Ser Leu Glu Leu Tyr Arg Gln Trp Thr 100 105 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aac aag tgg ggc ctg aac atc 94 Leu Leu Ala Gln Glu Leu Glu Asn Leu Asn Lys Trp Gly Leu Asn Ile 20 25 30 ttt tgc gtg tcg gat tac gct gga ggc cgc tca ctc acc tgc atc atg 142 Phe Cys Val Ser Asp Tyr Ala Gly Gly Arg Ser Leu Thr Cys Ile Met 35 40 45 tac atg ata ttc cag gag cgg gac ctg ctg aag aaa ttc cgc atc cct 190 Tyr Met Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Lys Phe Arg Ile Pro 50 55 60 gtg gac acg atg gtg aca tac atg ctg acg ctg gag gat cac tac cac 238 Val Asp Thr Met Val Thr Tyr Met Leu Thr Leu Glu Asp His Tyr His 65 70 75 gct gac gtg gcc tac cat aac agc ctg cac gca gct gac gtg ctg cag 286 Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala Asp Val Leu Gln 80 85 90 95 tcc acc cac gta ctg ctg gcc acg cct gca cta gat gca gtg ttc acg 334 Ser Thr His Val Leu Leu Ala Thr Pro Ala Leu Asp Ala Val Phe Thr 100 105 110 gac ctg gag att ctc gcc gcc ctc ttc gcg gct gcc atc cac gat gtg 382 Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ala Ile His Asp Val 115 120 125 gat cac cct ggg gtc tcc aac cag ttc ctc atc aac acc aat tcg gag 430 Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu 130 135 140 ctg gcg ctc atg tac aac gat gag tcg gtg ctc gag aat cac cac ctg 478 Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn His His Leu 145 150 155 gcc gtg ggc ttc aag ctg ctg cag gag gac aac tgc gac atc ttc cag 526 Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Asp Asn Cys Asp Ile Phe Gln 160 165 170 175 aac ctc agc aag cgc cag cgg cag agc tac gca aga tgg tca tcg aca 574 Asn Leu Ser Lys Arg Gln Arg Gln Ser Tyr Ala Arg Trp Ser Ser Thr 180 185 190 tgg tgc tgg cca cgg aca tgt cca agc aca tg acc 609 Trp Cys Trp Pro Arg Thr Cys Pro Ser Thr 195 200 <210> 38 <211> 201 <212> PRT <400> 38 Asn Ser Asn Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Asp Gln Glu Glu Leu 1 5 10 15 Leu Ala Gln Glu Leu Glu Asn Leu Asn Lys Trp Gly Leu Asn Ile Phe 20 25 30 Cys Val Ser Asp Tyr Ala Gly Gly Arg Ser Leu Thr Cys Ile Met Tyr 35 40 45 Met Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Lys Phe Arg Ile Pro Val 50 55 60 Asp Thr Met Val Thr Tyr Met Leu Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala 65 70 75 80 Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala Asp Val Leu Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Leu Leu Ala Thr Pro Ala Leu Asp Ala Val Phe Thr Asp 100 105 110 Leu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ala Ile His Asp Val Asp 115 120 125 His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu 130 135 140 Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala 145 150 155 160 Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Asp Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn 165 170 175 Leu Ser Lys Arg Gln Arg Gln Ser Tyr Ala Arg Trp Ser Ser Thr Trp 180 185 190 Cys Trp Pro Arg Thr Cys Pro Ser Thr 195 200 <210> 39 <211> 1230 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (3)...(1156) <400> 39 ac atg gtg cac tgt gcc gac ctc agc aac ccc acc aag ccg ctg gag 47 Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Glu 1 5 10 15 ctg tac cgc cag tgg aca gac cgc atc atg gcc gag ttc ttc cag cag 95 Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Ala Glu Phe Phe Gln Gln 20 25 30 ggt gac cga gag cgc gag cgt ggc atg gaa atc agc ccc atg tgt gac 143 Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp 35 40 45 aag cac act gcc tcc gtg gag aag tct cag gtg ggt ttt att gac tac 191 Lys His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr 50 55 60 att gtg cac cca ttg tgg gag acc tgg gcg gac ctt gtc cac cca gat 239 Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp 65 70 75 gcc cag gag atc ttg gac act ttg gag gac aac cgg gac tgg tac tac 287 Ala Gln Glu Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asp Trp Tyr Tyr 80 85 90 95 agc gcc atc cgg cag agc cca tct ccg cca ccc gag gag gag tca agg 335 Ser Ala Ile Arg Gln Ser Pro Ser Pro Pro Pro Glu Glu Glu Ser Arg 100 105 110 ggg cca ggc cac cca ccc ctg cct gac aag ttc cag ttt gac gtg acg 383 Gly Pro Gly His Pro Pro Leu Pro Asp Lys Phe Gln Phe Asp Val Thr 115 120 125 ctg gag gag gaa gag gag gaa gaa ata tca atg gcc cag ata ccg tgc 431 Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Ser Met Ala Gln Ile Pro Cys 130 135 140 aca gcc caa gag gca ttg act gcg cag gga ttg tca gga gtc gag gaa 479 Thr Ala Gln Glu Ala Leu Thr Ala Gln Gly Leu Ser Gly Val Glu Glu 145 150 155 gct ctg gat gca acc ata gcc tgg gag gca tcc ccg gcc cag gag tcg 527 Ala Leu Asp Ala Thr Ile Ala Trp Glu Ala Ser Pro Ala Gln Glu Ser 160 165 170 175 ttg gaa gtt atg gca cag gaa gca tcc ctg gag gcc gag ctg gag gca 575 Leu Glu Val Met Ala Gln Glu Ala Ser Leu Glu Ala Glu Leu Glu Ala 180 185 190 gng tat ttg aca cag cag gca cag tcc aca ggc agt gca cct gtg gct 623 Val Tyr Leu Thr Gln Gln Ala Gln Ser Thr Gly Ser Ala Pro Val Ala 195 200 205 ccg gat gag ttc tcg tcc cgg gag gaa ttc gtg gtt gct gta agc cac 671 Pro Asp Glu Phe Ser Ser Arg Glu Glu Phe Val Val Ala Val Ser His 210 215 220 agc agc ccc tct gcc ctg gct ctt caa agc ccc ctt ctc cct gct tgg 719 Ser Ser Pro Ser Ala Leu Ala Leu Gln Ser Pro Leu Leu Pro Ala Trp 225 230 235 agg acc ctg tct gtt tca gag cat gcc ccg ggc ctc ccg gcc tcc cct 767 Arg Thr Leu Ser Val Ser Glu His Ala Pro Gly Leu Pro Ala Ser Pro 240 245 250 255 cca cgg cgg cct agg tgg aac gag agc acc agg ctg cca aga ggg ctt 815 Pro Arg Arg Pro Arg Trp Asn Glu Ser Thr Arg Leu Pro Arg Gly Leu 260 265 270 gca gtg cct gcg cag gga cat ttg ggg agg aca cat ccg cac tcc cag 863 Ala Val Pro Ala Gln Gly His Leu Gly Arg Thr His Pro His Ser Gln 275 280 285 ctc ctg gtg gcg ggg ggt cag gtg gag acc cta cct gat ccc cag acc 911 Leu Leu Val Ala Gly Gly Gln Val Glu Thr Leu Pro Asp Pro Gln Thr 290 295 300 tct gtc cct gtt ccc ctc cac tcc tcc cct cac tcc cct gct ccc ccg 959 Ser Val Pro Val Pro Leu His Ser Ser Pro His Ser Pro Ala Pro Pro 305 310 315 acc acc tcc tcc tct gcc tca aag act ctt gtc ctc ttg tcc ctc ctg 1007 Thr Thr Ser Ser Ser Ala Ser Lys Thr Leu Val Leu Leu Ser Leu Leu 320 325 330 335 aga aaa aag aaa acg aaa agt ggg gtt ttt ttc tgt ttt ctt ttt ttc 1055 Arg Lys Lys Lys Thr Lys Ser Gly Val Phe Phe Cys Phe Leu Phe Phe 340 345 350 ccc ttt ccc cct gcc ccc acc cac ggg gcc ttt ttt tgg agg tgg ggg 1103 Pro Phe Pro Pro Ala Pro Thr His Gly Ala Phe Phe Trp Arg Trp Gly 355 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Leu Ser Gly Val Glu Glu Ala 145 150 155 160 Leu Asp Ala Thr Ile Ala Trp Glu Ala Ser Pro Ala Gln Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Val Met Ala Gln Glu Ala Ser Leu Glu Ala Glu Leu Glu Ala Val 180 185 190 Tyr Leu Thr Gln Gln Ala Gln Ser Thr Gly Ser Ala Pro Val Ala Pro 195 200 205 Asp Glu Phe Ser Ser Arg Glu Glu Phe Val Val Ala Val Ser His Ser 210 215 220 Ser Pro Ser Ala Leu Ala Leu Gln Ser Pro Leu Leu Pro Ala Trp Arg 225 230 235 240 Thr Leu Ser Val Ser Glu His Ala Pro Gly Leu Pro Ala Ser Pro Pro 245 250 255 Arg Arg Pro Arg Trp Asn Glu Ser Thr Arg Leu Pro Arg Gly Leu Ala 260 265 270 Val Pro Ala Gln Gly His Leu Gly Arg Thr His Pro His Ser Gln Leu 275 280 285 Leu Val Ala Gly Gly Gln Val Glu Thr Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ser 290 295 300 Val Pro Val Pro Leu His Ser Ser Pro His Ser Pro Ala Pro Pro Thr 305 310 315 320 Thr Ser Ser Ser Ala Ser Lys Thr Leu Val Leu Leu Ser Leu Leu Arg 325 330 335 Lys Lys Lys Thr Lys Ser Gly Val Phe Phe Cys Phe Leu Phe Phe Pro 340 345 350 Phe Pro Pro Ala Pro Thr His Gly Ala Phe Phe Trp Arg Trp Gly Leu 355 360 365 Gly Asn Glu Gly Leu Arg Ser Arg Lys Gly Phe Tyr Phe Phe Glu Phe 370 375 380 <210> 41 <211> 798 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (3)...(798) <400> 41 ga att cct ctg act aat tca agt atc cca agg ttt gga gtt aaa act 47 Ile Pro Leu Thr Asn Ser Ser Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr 1 5 10 15 gaa caa gaa gat gtc ctt gcc aag gaa cta gaa gat gtg aac aaa tgg 95 Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Val Asn Lys Trp 20 25 30 ggt ctt cat gtt ttc aga ata gca gag ttg tct ggt aac cgg ccc ttg 143 Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu Leu Ser Gly Asn Arg Pro Leu 35 40 45 act gtt atc atg cac acc att ttt cag gaa cgg gat tta tta aaa aca 191 Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr 50 55 60 ttt aaa att cca gta gat act tta att aca tat ctt atg act ctc gaa 239 Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu 65 70 75 gac cat tac cat gct gat gtg gcc tat cac aac aat atc cat gct gca 287 Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn Ile His Ala Ala 80 85 90 95 gat gtt gtc cag tct act cat gtg cta tta tct aca cct gct ttg gag 335 Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu 100 105 110 gct gtg ttt aca gat ttg gag att ctt gca gca att ttt gcc agt gca 383 Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala 115 120 125 ata cat gat gta gat cat cct ggt gtg tcc aat caa ttt ctg atc aat 431 Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn 130 135 140 aca aac tct gaa ctt gcc ttg atg tac aat gat tcc tca gtc tta gag 479 Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu 145 150 155 aac cat cat ttg gct gtg ggc ttt aaa ttg ctt cag gaa gaa aac tgt 527 Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys 160 165 170 175 gac att ttc cag aat ttg acc aaa aaa caa aga caa tct tta agg aaa 575 Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys 180 185 190 atg gtc att gac atc gta ctt gca aca gat atg tca aaa cac atg aat 623 Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Asn 195 200 205 cta ctg gct gat ttg aag act atg gtt gaa act aag aaa gtg aca agc 671 Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser 210 215 220 tct gga gtt ctt ctt ctt gat aat tat tcc gat agg att cag gtt ctt 719 Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu 225 230 235 cag aat atg gtg cac tgt gca gat ctg agc aac cca aca aag cct ctc 767 Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu 240 245 250 255 cag ctg tac cgc cag tgg acg gac gga att c 798 Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Gly Ile 260 265 <210> 42 <211> 265 <212> PRT <400> 42 Ile Pro Leu Thr Asn Ser Ser Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Glu 1 5 10 15 Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Val Asn Lys Trp Gly 20 25 30 Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu Leu Ser Gly Asn Arg Pro Leu Thr 35 40 45 Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe 50 55 60 Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp 65 70 75 80 His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn Ile His Ala Ala Asp 85 90 95 Val Val Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala 100 105 110 Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile 115 120 125 His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr 130 135 140 Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn 145 150 155 160 His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp 165 170 175 Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met 180 185 190 Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu 195 200 205 Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser 210 215 220 Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln 225 230 235 240 Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln 245 250 255 Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Gly Ile 260 265 <210> 43 <211> 1902 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (97)...(1256) <400> 43 gaattccttt gttcacatct tctagttcct tggcaaggac atcttcatgt tttcagaata 60 gcagagttgt ctggtaaccg gcccttgact gttatc atg cac acc att ttt cag 114 Met His Thr Ile Phe Gln 1 5 gaa cgg gat tta tta aaa aca ttt aaa att cca gta gat act tta att 162 Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile 10 15 20 aca tat ctt atg act ctc gaa gac cat tac cat gct gat gtg gcc tat 210 Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr 25 30 35 cac aac aat atc cat gct gca gat gtt gtc cag tct act cat gtg cta 258 His Asn Asn Ile His Ala Ala Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu 40 45 50 tta tct aca cct gct ttg gag gct gtg ttt aca gat ttg gag att ctt 306 Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu 55 60 65 70 gca gca att ttt gcc agt gca ata cat gat gta gat cat cct ggt gtg 354 Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val 75 80 85 tcc aat caa ttt ctg atc aat aca aac tct gaa ctt gcc ttg atg tac 402 Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr 90 95 100 aat gat tcc tca gtc tta gag aac cat cat ttg gct gtg ggc ttt aaa 450 Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys 105 110 115 ttg ctt cag gaa gaa aac tgt gac att ttc cag aat ttg acc aaa aaa 498 Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys 120 125 130 caa aga caa tct tta agg aaa atg gtc att gac atc gta ctt gca aca 546 Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr 135 140 145 150 gat atg tca aaa cac atg aat cta ctg gct gat ttg aag act atg gtt 594 Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val 155 160 165 gaa act aag aaa gtg aca agc tct gga gtt ctt ctt ctt gat aat tat 642 Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr 170 175 180 tcc gat agg att cag gtt ctt cag aat atg gtg cac tgt gca gat ctg 690 Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu 185 190 195 agc aac cca aca aag cct ctc cag ctg tac cgc cag tgg acg gac cgg 738 Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg 200 205 210 ata atg gag gag ttc ttc cgc caa gga gac cga gag agg gaa cgt ggc 786 Ile Met Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly 215 220 225 230 atg gag ata agc ccc atg tgt gac aag cac aat gct tcc gtg gaa aaa 834 Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys 235 240 245 tca cag gtg ggc ttc ata gac tat att gtt cat ccc ctc tgg gag aca 882 Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr 250 255 260 tgg gca gac ctc gtc cac cct gac gcc cag gat att ttg gac act ttg 930 Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu 265 270 275 gag gac aat cgt gaa tgg tac cag agc aca atc cct cag agc ccc tct 978 Glu Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser 280 285 290 cct gca cct gat gac cca gag gag ggc cgg cag ggt caa act gag aaa 1026 Pro Ala Pro Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys 295 300 305 310 ttc cag ttt gaa cta act tta gag gaa gat ggt gag tca gac acg gaa 1074 Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu 315 320 325 aag gac agt ggc agt caa gtg gaa gaa gac act agc tgc agt gac tcc 1122 Lys Asp Ser Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser 330 335 340 aag act ctt tgt act caa gac tca gag tct act gaa att ccc ctt gat 1170 Lys Thr Leu Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp 345 350 355 gaa cag gtt gaa gag gag gca gta ggg gaa gaa gag gaa agc cag cct 1218 Glu Gln Val Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro 360 365 370 gaa gcc tgt gtc ata gat gat cgt tct cct gac acg ta acagtgcaaa 1266 Glu Ala Cys Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro Asp Thr 375 380 385 aactttcatg cctttttttt ttttaagtag aaaaattgtt tccaaagtgc atgtcacatg 1326 ccacaaccac ggtcacacct cactgtcatc tgccaggacg tttgttgaac aaaactgacc 1386 ttgactactc agtccagcgc tcaggaatat cgtaaccagt tttttcacct ccatgtcatc 1446 cgagcaaggt ggacatcttc acgaacagcg tttttaacaa gatttcagct tggtagagct 1506 gacaaagcag ataaaatcta ctccaaatta ttttcaagag agtgtgactc atcaggcagc 1566 ccaaaagttt attggacttg gggtttctat tcctttttat ttgtttgcaa tattttcaga 1626 agaaaggcat tgcacagagt gaacttaatg gacgaagcaa caaatatgtc aagaacagga 1686 catagcacga atctgttacc agtaggagga ggatgagcca cagaaattgc ataattttct 1746 aatttcaagt cttcctgata catgactgaa tagtgtggtt cagtgagctg cactgacctc 1806 tacattttgt atgatatgta aaacagattt tttgtagagc ttacttttat tattaaatgt 1866 attgaggtat tatatttaaa aaaaaaaaag gaattc 1902 <210> 44 <211> 386 <212> PRT <400> 44 Met His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile 1 5 10 15 Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp His Tyr 20 25 30 His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn Ile His Ala Ala Asp Val Val 35 40 45 Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe 50 55 60 Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile His Asp 65 70 75 80 Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His 100 105 110 Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe 115 120 125 Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met Val Ile 130 135 140 Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala 145 150 155 160 Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val 165 170 175 Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Met 180 185 190 Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr 195 200 205 Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp 210 215 220 Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His 225 230 235 240 Asn Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val 245 250 255 His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln 260 265 270 Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr 275 280 285 Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Ala Pro Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg 290 295 300 Gln Gly Gln Thr Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp 305 310 315 320 Gly Glu Ser Asp Thr Glu Lys Asp Ser Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp 325 330 335 Thr Ser Cys Ser Asp Ser Lys Thr Leu Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser 340 345 350 Thr Glu Ile Pro Leu Asp Glu Gln Val Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu 355 360 365 Glu Glu Glu Ser Gln Pro Glu Ala Cys Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro 370 375 380 Asp Thr 385 <210> 45 <211> 1155 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (95)...(762) <400> 45 gaattccctg gctgtgggct tcaagctgct gcaggcagag aactgcgata tcttccagaa 60 cctcagcgcc aagcagcgac tgagtctgcg cagg atg gtc att gac atg gtg 112 Met Val Ile Asp Met Val 1 5 ctg gcc aca gac atg tcc aaa cac atg aac ctc ctg gcc gac ctc aag 160 Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys 10 15 20 acc atg gtg gag acc aag aag gtg aca agc ctc ggt gtc ctc ctc ctg 208 Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Leu Gly Val Leu Leu Leu 25 30 35 gac aac tat tcc gac cga atc cag gtc ttg cag aac ctg gtg cac tgt 256 Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Leu Val His Cys 40 45 50 gct gat ctg agc aac ccc acc aag ccg ctg ccc ctg tac cgc cag tgg 304 Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Pro Leu Tyr Arg Gln Trp 55 60 65 70 acg gac cgc atc atg gcc gag ttc ttc cag cag gga gac cgc gag cgt 352 Thr Asp Arg Ile Met Ala Glu Phe Phe Gln Gln Gly Asp Arg Glu Arg 75 80 85 gag tcg ggc ctg gac atc agt ccc atg tgt gac aag cat acg gcc tca 400 Glu Ser Gly Leu Asp Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Thr Ala Ser 90 95 100 gtg gag aag tcc cag gtg ggt ttc att gac tac att gct cac cca ctg 448 Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Ala His Pro Leu 105 110 115 tgg gag act tgg gct gac ctg gtc cac cca gat gca cag gac ctg ctg 496 Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Leu Leu 120 125 130 gac acg ctg gag gac aat cga gag tgg tac cag agc aag atc ccc cga 544 Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Lys Ile Pro Arg 135 140 145 150 agt ccc tca gac ctc acc aac ccc gag cgg gac ggg cct gac aga ttc 592 Ser Pro Ser Asp Leu Thr Asn Pro Glu Arg Asp Gly Pro Asp Arg Phe 155 160 165 cag ttt gaa ctg act ctg gag gag gca gag gaa gag gat gag gag gaa 640 Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu 170 175 180 gaa gag gag ggg gaa gag aca gct tta gcc aaa gag gcc ttg gag ttg 688 Glu Glu Glu Gly Glu Glu Thr Ala Leu Ala Lys Glu Ala Leu Glu Leu 185 190 195 cct gac act gaa ctc ctg tcc cct gaa gcc ggc cca gac cct ggg gac 736 Pro Asp Thr Glu Leu Leu Ser Pro Glu Ala Gly Pro Asp Pro Gly Asp 200 205 210 tta ccc ctc gac aac cag agg act ta gggccagccc tgcgtgaact 782 Leu Pro Leu Asp Asn Gln Arg Thr 215 220 gcaggggcaa tggatggtaa agccctttgg ctcttggcag gcagactttc caggaagagg 842 ctccatgtgg ctcctgcttc actttcccac ccatttaggg agacaatcaa gctcttagtt 902 ataggtggct cccagggtct aattggaggc acctggctgg ggtccactct gaccctagac 962 ttgcctaaaa gagctctcta aggggcagcc tcttacgatg ccctggtgtc tttctcctgg 1022 gcttctatcc ctgtgaggag aggtgctgtc tgctggagcc tctagtccac cctctccagt 1082 ggtcactctt gagtcacatc tgtcacttaa ttatttcctt ctttatcaaa tatttattgc 1142 tcatctggaa ttc 1155 <210> 46 <211> 222 <212> PRT <400> 46 Met Val Ile Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Asn 1 5 10 15 Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser 20 25 30 Leu Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu 35 40 45 Gln Asn Leu Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu 50 55 60 Pro Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Ala Glu Phe Phe Gln 65 70 75 80 Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Ser Gly Leu Asp Ile Ser Pro Met Cys 85 90 95 Asp Lys His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp 100 105 110 Tyr Ile Ala His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val His Pro 115 120 125 Asp Ala Gln Asp Leu Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Glu Trp Tyr 130 135 140 Gln Ser Lys Ile Pro Arg Ser Pro Ser Asp Leu Thr Asn Pro Glu Arg 145 150 155 160 Asp Gly Pro Asp Arg Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Ala Glu 165 170 175 Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Glu Thr Ala Leu Ala 180 185 190 Lys Glu Ala Leu Glu Leu Pro Asp Thr Glu Leu Leu Ser Pro Glu Ala 195 200 205 Gly Pro Asp Pro Gly Asp Leu Pro Leu Asp Asn Gln Arg Thr 210 215 220 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <400> 47 tacgaagctt tgatggggtc tactgctac 29 <210> 48 <211> 31 <212> DNA <400> 48 tacgaagctt tgatggttgg cttggcatat c 31 <210> 49 <211> 16 <212> DNA <400> 49 attaaccctc ataaag 16 <210> 50 <211> 29 <212> DNA <400> 50 tacgaagctt tgatgcgccg acagcctgc 29 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <400> 51 ggtctcctgt tgcagatatt g 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <400> 52 ttyaartctn ytncargrng a 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <400> 53 acnatrtctr atnaccatyt t 21 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <210> 55 <211> 8 <212> PRT <210> 56 <211> 7 <212> PRT <210> 57 <211> 7 <212> PRT
【図１】 プラスミドpJC44X、pTM3、pGB14およびpGB18
ARRでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相対関係
を示す第一の図である。
ARRでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相対関係
を示す第一の図である。
【図２】 プラスミドpJC44X、pTM3、pGB14およびpGB18
ARRでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相対関係
を示す第二の図である。
ARRでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相対関係
を示す第二の図である。
【図３】 プラスミドpJC44X、pTM3、pGB14およびpGB18
ARRでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相対関係
を示す第三の図である。
ARRでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相対関係
を示す第三の図である。
【図４】 プラスミドpJC44X、pTM3、pGB14およびpGB18
ARRでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相対関係
を示す第四の図である。
ARRでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相対関係
を示す第四の図である。
【図５】 プラスミドpPDE2RR、pTM72、pPDE7および pP
DE 10x-INVでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相
対関係を示す第一の図である。
DE 10x-INVでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相
対関係を示す第一の図である。
【図６】 プラスミドpPDE2RR、pTM72、pPDE7および pP
DE 10x-INVでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相
対関係を示す第二の図である。
DE 10x-INVでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相
対関係を示す第二の図である。
【図７】 プラスミドpPDE2RR、pTM72、pPDE7および pP
DE 10x-INVでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相
対関係を示す第三の図である。
DE 10x-INVでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相
対関係を示す第三の図である。
【図８】 プラスミドpPDE2RR、pTM72、pPDE7および pP
DE 10x-INVでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相
対関係を示す第四の図である。
DE 10x-INVでのヒトcDNA挿入体のヌクレオチド配列の相
対関係を示す第四の図である。
【図９】 プラスミドpPDE18およびpGB25でのヒトcDNA
挿入体のヌクレオチド配列の相対関係を示す図である。
挿入体のヌクレオチド配列の相対関係を示す図である。
【図１０】 プラスミドpPDE18および pGB25でのヒトcD
NA挿入体のヌクレオチド配列の相対関係を示す第一の図
である。
NA挿入体のヌクレオチド配列の相対関係を示す第一の図
である。
【図１１】 プラスミドpPDE18および pGB25でのヒトcD
NA挿入体のヌクレオチド配列の相対関係を示す第二の図
である。
NA挿入体のヌクレオチド配列の相対関係を示す第二の図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コリセリ， ジョン， ジェイ アメリカ合衆国 11743 ニューヨーク ハンチングトン ジャコブソン スト リート 26 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ
Claims (9)
- 【請求項１】 精製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡであ
って、該ＤＮＡが、プラスミドpJC99（A.T.C.C. 受託番
号 68599）が保有するＤＮＡ挿入体からなり、かつ配列
番号：13に記載の塩基配列、すなわち、 aagcttgcgg ccgcattggg taccgcgtgc cagcaggcag tggccctagc cttccgcct atg ccc tcc ctc caa gag gtg gac tgc ggc tcc ccc agc agc tcc gag gag gag ggg gtg cca ggg tcc cgg ggg agc cca gcg acc tca ccc cac ctg ggc cgc cga cga cct ctg ctt cgg tcc atg agc gcc gcc ttc tgc tcc cta ctg gca ccg gag cgg cag gtg ggc cgg gct gcg gca gca ctg atg cag gac cga cac aca gcc gcg ggc cag ctg gtg cag gac cta ctg acc cag gtg cgg gat ggg cag agg ccc cag gag ctc gag ggc atc cgt cag gcg ctg agc cgg gcc cgg gcc atg ctg agt gcg gag ctg ggc cct gag aag ctc gtg tcg cct aag agg ctg gaa cat gtc ctg gag aag tca ttg cat tgc tct gtg ctc aag cct ctc cgg ccc atc ctg gca gcc cgc ctg cgg cgc cgg ctt gcc gca gac ggc tcc ctg ggc cgc cta gct gag ggc ctc cgc ctg gcc cgg gcc cag ggc ccc gga gcc ttc ggg tcc cac ctg agc ctg ccc tcc cca gta gag ttg gag caa gtg cgc cag aag ctg ctg cag ctc gtc cgc acc tac tca ccc agc gcc cag gtc aag cgg ctc ctg cag gcc tgc aag ctg ctc tac atg gcc ctg agg acc cag gaa ggg gag ggc tcg ggt gcc gac ggg ttc ctg cct ctg ctg agc ctc gtc ttg gcc cac tgt gac ctt cct gag ctg ctg ctg gag gcc gag tac atg tcg gag ctg ctg gag ccc agc ctg ctt act gga gag ggt ggc tac tac ctg acc agc ctc tct gcc agc ctg gcc ctg ctg agt ggc ctg ggt cag gcc cac acc ctc cca ctg agc ccc gtg cag gag cta cgg cgc tcc ctc agc ctc tgg gag cag cgc cgc ctg cct gcc acc cac tgc ttc cag cac ctc ctc cga gta gcc tat cag gat ccc agc agt ggc tgc acc tcc aag acc ctg gcc gtg ccc cca gag gcc tcg att gcc acc ctg aac cag ctc tgt gcc acc aag ttc cga gtg acc cag ccc aac act ttt ggc ctc ttc ctg tac aag gag cag ggc tac cac cgc ctg ccc cct ggg ccc tgg ccc aca ggc tgc cca cca ctg gct acc tcg tct acc gcc ggg cag agt ggc ctg aga ccc agg ggg ctg tgacagagga ggagggcagt gggcagtcag aggcaagaag cagaggggag gagcaagggt gccagggaga tggggatgct ggggtcaaag ccagccccag ggacattcgg gaacagtctg agacaactgc tgaagggggc cagggtcaag cccaggaagg ccctgctcag ccaggggaac cagaggcaga gggaagccgg gcagcagagg agtagcttga agtggccaga agggtcattc ggggcgggag accctgagcc tgctgagaaa tccttttagc gccagcaagc cccacccagg gccctgtcct gtgtctgcca ccacctttgt ctgatacttg tttccaggga agctggggga actgccacat ctgaggaact ggaataaaga tgaggggcct tcgggggcca atgcggccgc cgcggccttt ttggccagct cgaattc の塩基配列からなるＤＮＡである、ことを特徴とする精
製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡ。 - 【請求項２】 精製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡであ
って、該ＤＮＡが、プラスミドpJC265(A.T.C.C. 受託番
号 68598）が保有するＤＮＡ挿入体からなり、かつ配列
番号：15に記載の塩基配列、すなわち、 gcggccgcgg ccggcagcgg ctgagcgac atg agc att tct act tcc tcc tcc gac tcg ctg gag ttc gac cgg agc atg cct ctg ttt ggc tac gag gcg gac acc aac agc agc ctg gag gac tac gag ggg gaa agt gac caa gag acc atg gcg ccc ccc atc aag tcc aaa aag aaa agg agc agc tcc ttc gtg ctg ccc aag ctc gtc aag tcc cag ctg cag aag gtg agc ggg gtg ttc agc tcc ttc atg acc ccg gag aag cgg atg gtc cgc agg atc gcc gag ctt tcc cgg gac aaa tgc acc tac ttc ggg tgc tta gtg cag gac tac gtg agc ttc ctg cag gag aac aag gag tgc cac gtg tcc agc acc gac atg ctg cag acc atc cgg cag ttc atg acc cag gtc aag aac tat ttg tct cag agc tcg gag ctg gac ccc ccc atc gag tcg ctg atc cct gaa gac caa ata gat gtg gtg ctg gaa aaa gcc atg cac aag tgc atc ttg aag ccc ctc aag ggg cac gtg gag gcc atg ctg aag gac ttt cac atg gcc gat ggc tca tgg aag caa ctc aag gag aac ctg cag ctt gtg cgg cag agg aat ccg cag gag ctg ggg gtc ttc gcc ccg acc cct gat ttt gtg gat gtg gag aaa atc aaa gtc aag ttc atg acc atg cag aag atg tat tcg ccg gaa aag aag gtc atg ctg ctg ctg cgg gtc tgc aag ctc att tac acg gtc atg gag aac aac tca ggg agg atg tat ggc gct gat gac ttc ttg cca gtc ctg acc tat gtc ata gcc cag tgt gac atg ctt gaa ttg gac act gaa atc gag tac atg atg gag ctc cta gac cca tcg ctg tta cat gga gaa gga ggc tat tac ttg aca agc gca tat gga gca ctt tct ctg ata aag aat ttc caa gaa gaa caa gca gcg cga ctg ctc agc tca gaa acc aga gac acc ctg agg cag tgg cac aaa cgg aga acc acc aac cgg acc atc ccc tct gtg gac gac ttc cag aat tac ctc cga gtt gca ttt cag gag gtc aac agt ggt tgc aca gga aag acc ctc ctt gtg aga cct tac atc acc act gag gat gtg tgt cag atc tgc gct gag aag ttc aag gtg ggg gac cct gag gag tac agc ctc ttt ctc ttc gtt gac gag aca tgg cag cag ctg gca gag gac act tac cct caa aaa atc aag gcg gag ctg cac agc cga cca cag ccc cac atc ttc cac ttt gtc tac aaa cgc atc aag aac gat cct tat ggc atc att ttc cag aac ggg gaa gaa gac ctc acc acc tcc tagaagacag gcgggacttc ccagtggtgc atccaaaggg gagctggaag ccttgccttc ccgcttctac atgcttgagc ttgaaaagca gtcacctcct cggggacccc tcagtgtagt gactaagcca tccacaggcc aactcggcca agggcaactt tagccacgca aggtagctga ggtttgtgaa acagtaggat tctcttttgg caatggagaa ttgcatctga tggttcaagt gtcctgagat tgtttgctac ctacccccag tcaggttcta ggttggctta caggtatgta tatgtgcaga agaaacactt aagatacaag ttcttttgaa ttcaacagca gatgcttgcg atgcagtgcg tcaggtgatt ctcactcctg tggatggctt catccctg の塩基配列からなるＤＮＡである、ことを特徴とする精
製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡ。 - 【請求項３】 精製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡであ
って、該ＤＮＡが、プラスミドpJC310(A.T.C.C. 受託番
号 68597）が保有するＤＮＡ挿入体からなり、かつ配列
番号：17に記載の塩基配列、すなわち ggc cgc att gcc gac ccg gcc cgt agt gtg gaa gca gct tca gct caa aga tta gaa cga ctc cga aaa gag aga caa aac cag atc aaa tgc aaa aat att cag tgg aaa gaa aga aat tct aag caa tca gcc cag gag tta aag tca ctg ttt gaa aaa aaa tct ctc aaa gag aag cct cca att tct ggg aag cag tcg ata tta tct gta cgc cta gaa cag tgc cct ctg cag ctg aat aac cct ttt aac gag tat tcc aaa ttt gat ggc aag ggt cat gta ggt aca aca gca acc aag aag atc gat gtc tac ctc cct ctg cac tcg agc cag gac aga ctg ctg cca atg acc gtg gtg aca atg gcc agc gcc agg gtg cag gac ctg atc ggg ctc atc tgc tgg cag tat aca agc gaa gga cgg gag ccg aag ctc aat gac aat gtc agt gcc tac tgc ctg cat att gct gag gat gat ggg gag gtg gac acc gat ttc ccc ccg ctg gat tcc aat gag ccc att cat aag ttt ggc ttc agt act ttg gcc ctg gtt gaa aag tac tca tct cct ggt ctg aca tcc aaa gag tca ctc ttt gtt cga ata aat gct gct cat gga ttc tcc ctt att cag gtg gac aac aca aag gtt acc atg aag gaa atc tta ctg aag gca gtg aag cga aga aaa gga tcc cag aaa gtt tca ggc cct cag tac cgc ctg gag aag cag agc gag ccc aat gtc gcc gtt gac ctg gac agc act ttg gag agc cag agc gca tgg gag ttc tgc ctg gtc cgc gag aac agt tca agg gca gac ggg gtt ttt gag gag gat tcg caa att gac ata gcc aca gta cag gat atg ctt agc agc cac cat tac aag tca ttc aaa gtc agc atg atc cac aga ctg cga ttc aca acc gac gta cag cta ggt atc tct gga gac aaa gta gag ata gac cct gtt acg aat cag aaa gcc agc act aag ttt tgg att aag cag aaa ccc atc tca atc gat tcc gac ctg ctc tgt gcc tgt gac ctt gct gaa gag aaa agc ccc agt cac gca ata ttt aaa ctc acg tat cta agc aat cac gac tat aaa cac ctc tac ttt gaa tcg gac gct gct acc gtc aat gaa att gtg ctc aag gtt aac tac atc ctg gaa tcg cga gct agc act gcc cgg gct gac tac ttt gct caa aaa aaa agc ggc cgc の塩基配列からなるＤＮＡである、ことを特徴とする精
製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡ。 - 【請求項４】 精製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡであ
って、該ＤＮＡが、プラスミドpML5 (A.T.C.C. 受託番
号 68593）が保有するＤＮＡ挿入体からなり、かつ配列
番号：27に記載の塩基配列、すなわち gcg gcc gca ttc ggg gac agc ggc ggg cgg ctg gga cgg cgg gtg cgg cgg ggc cga gcc cgc acg atg cct cac ttc acc gtg gtg cca gtg gac ggg ccg agg cgc ggc gac tat gac aac ctc gag ggg ctc agt tgg gtg gac tac ggg gag cgc gcc gag ctg gat gac tcg gac gga cat ggc aac cac aga gag agc agc cct ttt ctt tcc ccc ttg gag gct tcc aga gga att gac tac tat gac agg aac ctg gca ctg ttt gag gaa gag ctg gac atc cgc cca aag gta tcg tct ctt ctg gga aag ctc gtc agc tac acc aac ctc acc cag ggc gcc aaa gag cat gag gag gcc gag agt ggg gag ggc acc cgc cgg agg gca gcc gag gca ccc agc atg ggc acc ctc atg ggg gtg tac ctg ccc tgc ctg cag aat atc ttt ggg gtt atc ctc ttc ctg cgg ctg acc tgg atg gtg ggc aca gca ggt gtg cta cag gcc ctc ctc atc gtg ctt atc tgc tgc tgt tgt acc ctg ctg acg gcc atc tcc atg agt gcc atc gcc acc aac ggt gtg gtt cca gct ggg ggc tcc tat ttc atg atc tct cgt tca ctg ggg cca gaa ttt gga ggt gct gtg ggc ctg tgc ttc tac ctg gga aca aca ttc gca gca gcc atg tac atc ctg ggg gcc atc gag atc ttg ctg acc tac att gcc cca cca gct gcc att ttt tac cca tcg ggt gct cat gac acg tcg aat gcc act ttg aac aat atg cgt gtg tat ggg acc att ttc ctg gcc ttc atg acc ctg gtg gtg ttt gtg ggg gtc aag tat gtg aac aaa ttt gcc tcg ctc ttc ctg gcc tgt gtg atc atc tcc atc ctc tcc atc tat gct ggg ggc ata aag tct ata ttt gac cct ccc gtg ttt ccg gta tgc atg ctg ggc aac agg acc ctg tcc cgg gac cag ttt gac atc tgt gcc aag aca gct gta gtg gac aat gag aca gtg gcc acc cag cta tgg agt ttc ttc tgc cac agc ccc aac ctt acg acc gac tcc tgt gac ccc tac ttc atg ctc aac aat gtg acc gag atc cct ggc atc ccc ggg gca gct gct ggt gtg ctc cag gaa aac ctg tgg agc gcc tac ctg gag aag ggt gac atc gtg gag aag cat ggg ctg ccc tcc gca gat gcc ccg agc ctg aag gag agc ctg cct ctg tac gtg gtc gct gac atc gcc aca tcc ttc acc gtg ctg gtc ggc atc ttc ttc cct tct gta aca ggt atg gcg atg gtg tca gca gga act tgg tgg tgg gca cac tgg cct ggc ctt cac cct ggg tca tcg tca tcg gct cct tct ttt caa cgt gtg gcg ctg gcc tcc aga gcc tca cag ggg cac cac gcc tat tgc agg cca ttg cca agg aca aca tca tcc cct tcc tcc ggg tgagcccctc tgcactcccc catggcctgg ctgctcccag gccctcgccc ggctggggag agagataggg aacacagatg cagcacgtcc tgcccttatt gcccccgggc caggcggcca tccatgagga gctactgaga agtgccctgg gcctggcact cacctgggcc tggagctgcc tggacccaga atcttcatgg cctgtttagg gctcatccaa aggagagagg cctggtgagg tggaatcagg gagactggtg acacccatag ggatagacac aggggcggcc tgagccccca aggcgggccc tgggggtga ggg agg cca ggc tgg ggt ctg ggg ccc aag gtg tgg aat ggg ggt gac agg acc cag ctt cct tcc tgg tgc aca cag gtg ttt ggc cac ggg aag gtg aat ggt gaa ccc aca tgg gca ctc ctc ctg acg gca ctc atc gcc gag ctg ggc atc ctc atc gcc tcc ctc gac atg gtg gcc ccc atc tta tcc atg ttc ttt ctg atg tgc tac ctg ttc gtg aac ctc gcc tgt gcg gtg cag aca ctc ctg agg acc ccc aac tgg cgg ccc cgg ttc aag tac tat cac tgg gcg ctg tcc ttc ctg ggc atg agt ctc tgc ctg gcc ctt atg ttt gtc tcc tcc tgg tac tat gcc ctg gtg gcc atg ctc atc gcc ggc atg atc tac aaa tac atc gag tac caa ggg gct gag aag gag tgg ggt gac ggg atc cga ggc ctg tcc ctg agc gct gcc cgc tac gcg ctg ttg cgg ctg gag gag ggg cct cct cac acc aag aac tgg cgg ccg c の塩基配列からなるＤＮＡである、ことを特徴とする精
製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡ。 - 【請求項５】 精製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡであ
って、該ＤＮＡが、プラスミドpATG16(A.T.C.C. 受託番
号 68592）が保有するＤＮＡ挿入体からなり、かつ配列
番号：29に記載の塩基配列、すなわち aagcttgcgg ccgcattgcg agaacgagaa cgggagcgag agagagagcg agagagggaa cgggagcgag aaagagaaaa agacaaaaaa cgggaccgag aagaagatga agaagatgca tacgaacgaa gaaaacttga aagaaaactc cgagagaaag aagctgctta tcaagagcgc cttaagaatt gggaaatcag agaacgaaag aaaacccggg aatatgagaa agaagctgaa agagaagaag aaagaagaag agaaatggcc aaagaagcta aacgactaaa agaattctta gaagactatg atgatgatag agatgacccc aaatattaca gaggaagtgc tcttcagaaa aggttgcgtg atagagaaaa ggaaatggaa gcagatgaac gagataggaa gagagagaag gaggagcttg aggaaatcag gcagcgcttc tggcagaagg gcatccagat ccagatgcag agctccagag g atg gaa caa gag gct gag agg cgc agg cag cca caa ata aag caa gag cca gaa tca gaa gag gag gaa gaa gaa aag caa gaa aaa gaa gaa aaa cga gaa gaa ccc atg gaa gag gaa gag gag cca gag caa aag cct tgt ctg aaa cct act ctg agg ccc atc agc tct gct cca tct gtt tcc tct gcc agt ggc aat gca aca cct aac act cct ggg gat gag tct ccc tgt ggt att att att cct cat gaa aac tca cca gat caa cag caa cct gag gag cat agg cca aaa ata gga cta agt ctt aaa ctg ggt gct tcc aat agt cct ggt cag cct aat tct gtg aag aga aag aaa cta cct gta gat agt gtc ttt aac aaa ttt gag gat gaa gac agt gat gac gta ccc cga aaa agg aaa ctg gtt ccc ttg gat tat ggt gaa gat gat aaa aat gca acc aaa ggc act gta aac act gaa gaa aag cgt aaa cac att aag agt ctc att gag aaa atc cct aca gcc aaa cct gag ctc ttc gct tat ccc ctg gat tgg tct att gtg gat tct ata ctg atg gaa cgt cga att aga cca tgg att aat aag aaa atc ata gaa tat ata ggt gaa gaa gaa gct aca tta gtt gat ttt gtt tgt tct aag gtt atg gct cat agt tca ccc cag agc att tta gat gat gtt gcc atg gta ctt gat gaa gaa gca gaa gtt ttt ata gtc aaa atg tgg aga tta ttg ata tat gaa aca gaa gcc aag aaa att ggt ctt gtg aag ta aaacttttta tatttagagt tccatttcag atttcttctt tgccaccctt ttaaggactt tgaatttttc tttgtctttg aagacattgt gagatctgta attttttttt tttgtagaaa atgtgaattt tttggtcctc taatttgttg ttgccctgtg tactcccttg gttgtaaagt catctgaatc cttggttctc tttatactca ccaggtacaa attactggta tgttttataa gccgcagcta ctgtacacag cctatctgat ataatcttgt tctgctgatt tgtttcttgt aaatattaaa acgactcccc aattaaaaaa aaaaaatgcg gccgc の塩基配列からなるＤＮＡである、ことを特徴とする精
製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡ。 - 【請求項６】 精製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡであ
って、該ＤＮＡが、プラスミドpATG29(A.T.C.C. 受託番
号 68591）が保有するＤＮＡ挿入体からなり、かつ配列
番号：31に記載の塩基配列、すなわち gc ggc cgc gcg ccg cat tcg gag agc gga ccc cag aga gcc ctg agc agc ccc acc gcc gcc gcc ggc cta gtt acc atc aca ccc cgg gag gag ccg cag ctg ccg cag ccg gcc cca gtc acc atc acc gca acc atg agc agc gag gcc gag acc cag cag ccg ccc gcc gcc ccc ccc gcc gcc ccc gcc ctc agc gcc gcc gac acc aag ccc ggc act acg ggc agc ggc gca ggg agc ggt ggc ccg ggc ggc ctc aca tcg gcg gcg cct gcc ggc ggg gac aag aag gtc atc gca acg aag gtt ttg gga aca gta aaa tgg ttc aat gta agg aac gga tat ggt ttc atc aac agg aat gac acc aag gaa gat gta ttt gta cac cag act gcc ata aag aag aat aac ccc agg aag tac ctt cgc agt gta gga gat gga gag act gtg gag ttt gat gtt gtt gaa gga gaa aag ggt gcg gag gca gca aat gtt aca ggt cct ggt ggt gtt cca gtt caa ggc agt aaa tat gca gca gac cgt aac cat tat aga cgc tat cca cgt cgt agg ggt cct cca cgc aat tac cag caa aat tac cag aat agt gag agt ggg gaa aag aac gag gga tcg gag agt gct ccc gaa ggc cag gcc caa caa cgc cgg ccc tac cgc agg cga agg ttc cca cct tac tac atg cgg aga ccc tat ggg cgt cga cca cag tat tcc aac cct cct gtg cag gga gaa gtg atg gag ggt gct gac aac cag ggt gca gga gaa caa ggt aga cca gtg agg cag aat atg tat cgg gga tat aga cca cga ttc cgc agg ggc cct cct cgc caa aga cag cct aga gag gac ggc aat gaa gaa gat aaa gaa aat caa gga gat gag acc caa ggt cag cag cca cct caa cgt cgg tac cgc cgc aac ttc aat tac cga cgc aga cgc cca gaa aac cct aaa cca caa gat ggc aaa gag aca aaa gca gcc gat cca cca gct gag aat tcg tcc gct ccc gag gct gag cag ggc ggg gct gag ta aatgccggct taccatctct accatcatcc ggtttagtca tccaacaaga agaaatatga aattccagca ataagaaatg aacaaaagat tggagctgaa gacctaaagt gcttgctttt tgcccgttga ccagataaat agaactatct gcattatcta tgcagcatgg ggtttttatt atttttacct aaagacgtct ctttttggta ataacaaacg tgttttttaa aaaagcctgg tttttctcaa tacgccttta aaggttttta aattgtttca tatctggtca agttgagatt tttaagaact tcatttttaa tttgtaataa aagtttacaa cttgattttt tcaaaaaagt caacaaactg caagcacctg ttaataaagg tcttaaataa ttgtctttgt gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag cttggtattc attacttcat gtatatcaag cacagcagta aaacaaaaac ccatgtattt aacttttttt taggattttt gcttttgtga tttttttttt tttttttttg atacttgcct aacatgcatg tgctgtaaaa atagttaaca gggaaataac ttgagatgat ggctagcttt gtttaatgtc ttatgaaatt ttcatgaaca atccaagcat aattgttaag aacacgtgta ttaaattcat gtaagtggaa taaaagtttt atgaatggac ttttcaacta ctttctctac agcttttcat gtaaattagt cttggttctg aaacttctct aaaggaaatt gtacattttt tgaaatttat tccttattcc ctcttggcag ctaatgggct cttaccaagt ttaaacacaa aatttatcat aacaaaaata ctactaatat aactactgtt tccatgtccc atgatcccct ctcttcctcc ccaccctgaa aaaaatgagt tcctattttt tctgggagag ggggggattg attagaaaaa aatgtagtgt gttccattta aaattttggc atatggcatt ttctaactta ggaagccaca atgttcttgg cccatcatga cattgggtag cattaactgt aagttttgtg cttccaaatc actttttggt ttttaagaat ttcttgatac tcttatagcc tgccttcaat tttgatcctt tattctttct atttgtcagg tgcacaagat taccttcctg ttttagcctt ctgtcttgtc accaaccatt cttacttggt ggccatgtac ttggaaaaag gccgcatgat ctttctggct ccactcagtg tctaaggcac cctgcttcct ttgcttgcat cccacagact atttccctca tcctatttac tgcagcaaat ctctccttag ttgatgagac tgtgtttatc tccctttaaa accctaccta tcctgaatgg tctgtcattg tctgccttta aaatccttcc tctttcttcc tcctctattc tctaaataat gatggggcta agttataccc aaagctcact ttacaaaata tttcctcagt actttgcaga aaacaccaaa caaaaatgcc attttaaaaa aggtgtattt tttcttttag aatgtaagct cctcaagagc agggacaatg ttttctgtat gttctattgt gcctagtaca ctgtaaatgc tcaatgaata ttatccctaa tacctgccac cccactctta atcagtggtg gaagaacggt ctcagaactg tttgtttcaa ttggccattt aagtttagta gtaaaagact ggttaatgat aacaatgcat cgtaaaacct tcagaaggaa aggagaatgt tttgtggacc actttggttt tcttttttgc gtgtggcagt tttaagttat tagtttttaa aatcagtact ttttaatgga aacaacttga ccaaaaattt gtcacagaat tttggcggcc gc の塩基配列からなるＤＮＡである、ことを特徴とする精
製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡ。 - 【請求項７】 精製単離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡであ
って、該ＤＮＡが、請求項１乃至６のいずれかに記載の
哺乳類RAS-関連ＤＮＡとストリンジェント条件下でハイ
ブリダイズするＤＮＡである、ことを特徴とする精製単
離した哺乳類RAS-関連ＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項１乃至７のいずれかに記載の哺乳
類RAS-関連ＤＮＡによってコードされたポリペプチドを
コードする、ことを特徴とする変性コドンの手段によっ
て調製されたＤＮＡ。 - 【請求項９】 請求項１乃至８のいずれかに記載の哺乳
類RAS-関連ＤＮＡの原核細胞または真核細胞での発現生
成物である、ことを特徴とするポリペプチド生成物。
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