JP2002153273A - 酵母染色体に外来遺伝子を挿入する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 酵母染色体の任意の位置に、所望の外来遺伝
子を簡単な操作で効率良く挿入することのできる方法を
提供する。 【解決手段】 以下の工程を含むことを特徴とする酵母
染色体に外来遺伝子を挿入する方法： （１）ターゲット配列となるＤＮＡ断片の両側に、酵母
染色体の外来遺伝子を挿入する部位と相同な配列を有す
るＤＮＡ断片を作製する工程、（２）該ＤＮＡ断片と酵
母染色体の相同組み換えによって、ターゲット配列を導
入した酵母染色体を得る工程、（３）ターゲット配列と
相同組み換え可能なＤＮＡ断片とマルチクローニングサ
イトを有するプラスミドに、外来遺伝子を挿入する工
程、（４）ターゲット配列を導入した酵母染色体と外来
遺伝子を挿入したプラスミドの相同組み換えによって、
外来遺伝子を挿入した酵母染色体を得る工程。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医学、生物学にお
ける基礎研究に有用な、酵母染色体の任意の位置に外来
遺伝子を挿入する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵母は遺伝子工学を用いた解析が容易で
あり、しかもその細胞内の構造、機能などが人間などの
高等真核生物と類似点が多く、真核生物のあらゆる研究
のモデル生物として、医学、あるいは生物学の分野で広
く利用されている。酵母染色体に外来遺伝子を挿入して
染色体を改変する従来の方法は、挿入したいＤＮＡ断片
の両端に挿入したい染色体部位と同じ配列を持つＤＮＡ
断片を作製し、この断片を細胞内に導入し、細胞内の相
同組み換えを利用して任意の部位に挿入するというもの
である。そして、染色体と同じ配列を両端に持つＤＮＡ
断片を作製するには（１）酵素処理によって染色体と同
じ配列を持つ断片を結合させてプラスミドベクターに挿
入し、大腸菌等の宿主を用いて増やす、あるいは（２）
ＰＣＲ法のプライマーとして染色体と同じ配列を持つも
のを用いて挿入断片の両端に染色体の配列を持つものを
ＰＣＲ法を用いて増やし、それを酵母内に形質転換によ
って導入し、相同組み換えによって染色体の任意の部位
に挿入する方法が使用されている。（図１５参照）

【０００３】しかしながら、（１）の場合、外来遺伝子
を染色体のいろいろな部位に挿入したい場合にはその都
度、酵素処理を行ったあと、宿主で増やさなければなら
ない。このとき挿入断片が大きい、あるいは宿主内で組
み換えが起りやすく操作しづらい場合には、目的とする
外来遺伝子が挿入された染色体を得ることは非常に困難
である。また（２）の場合、挿入しようとするＤＮＡ断
片のサイズが大きかったり、反復配列を持つ断片ではＰ
ＣＲ法で増やすことは非常に難しい。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術の問題点を解消して、酵母染色体の任意の位置に、所
望の外来遺伝子を簡単な操作で効率良く挿入することの
できる方法を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明では、上記課題を
解決するために、次のような構成をとるものである。 １．以下の工程を含むことを特徴とする酵母染色体に外
来遺伝子を挿入する方法： （１）ターゲット配列となるＤＮＡ断片の両側に、酵母
染色体の外来遺伝子を挿入する部位と相同な配列を有す
るＤＮＡ断片を作製する工程、（２）該ＤＮＡ断片と酵
母染色体の相同組み換えによって、ターゲット配列を導
入した酵母染色体を得る工程、（３）ターゲット配列と
相同組み換え可能なＤＮＡ断片とマルチクローニングサ
イトを有するプラスミドに、外来遺伝子を挿入する工
程、（４）ターゲット配列を導入した酵母染色体と外来
遺伝子を挿入したプラスミドの相同組み換えによって、
外来遺伝子を挿入した酵母染色体を得る工程。 ２．ターゲット配列として、第１のマーカー遺伝子の部
分断片及び第２のマーカー遺伝子を使用し、第２のマー
カー遺伝子によってターゲット配列を導入した酵母染色
体を選別することを特徴とする１に記載の方法。 ３．ターゲット配列と相同組み換え可能なＤＮＡ断片と
して、第１のマーカー遺伝子を使用することを特徴とす
る２に記載の方法。 ４．酵母染色体が分裂酵母の染色体であることを特徴と
する１〜３にいずれかに記載の方法。 ５．第１のマーカー遺伝子が分裂酵母のura４遺伝子で
あり、第２のマーカー遺伝子がkanamycine耐性遺伝子で
あることを特徴とする４に記載の方法。 ６．工程（１）の酵母染色体の外来遺伝子を挿入する部
位と相同な配列を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲ法によっ
て作製することを特徴とする１〜５にいずれかに記載の
方法。 ７．１〜６のいずれかに記載の方法によって外来遺伝子
を挿入した酵母染色体。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明では、はじめにターゲット
配列となるＤＮＡ断片の両端に、外来遺伝子を挿入する
部位の染色体配列を持たせ、相同組み換えによって酵母
染色体にターゲット配列を導入する。つぎに、得られた
酵母染色体のターゲット配列に、所望の外来遺伝子の挿
入を行なうものである。すなわち、酵母染色体に挿入可
能なＤＮＡ断片を得るための大腸菌等の宿主での操作、
或いはＰＣＲ法による操作は、その操作が簡単なターゲ
ット配列に対して行うものである。そして、目的とする
外来遺伝子は、単にプラスミドのマルチクローニングサ
イトに組み込むことによって、相同組み換えによってタ
ーゲット配列を導入した酵母染色体に挿入することが可
能となる。したがって、本発明の方法によれば、ターゲ
ット配列の両側に設ける酵母染色体と相同な配列を選択
することによって、酵母染色体の任意の部位に外来遺伝
子を挿入することが可能となり、またその際に、従来技
術で生じる種々の問題点を解消することができる。

【０００７】つぎに、図に基づいて、本発明をさらに説
明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではな
い。図１は、本発明の方法における工程の概略を示す模
式図である。本発明では、２種類のプラスミドベクター
を使用する。プラスミド１は、酵母染色体に導入するタ
ーゲット配列を含むプラスミドであり、プラスミド２
は、ターゲット配列を導入した酵母染色体に目的とする
外来遺伝子を組み込むためのプラスミドである。この例
では、プラスミド１のターゲット配列として、第１のマ
ーカー遺伝子（図１のマーカー遺伝子Ｂ）の部分断片
と、これに接続する第２のマーカー遺伝子（図１のマー
カー遺伝子Ａ）を使用する。そして、例えばＰＣＲ法に
よって、このプラスミド１のターゲット配列の両側に、
酵母染色体の外来遺伝子を挿入する部位と相同な配列を
有するＤＮＡ断片を作製する。つぎに、得られたＤＮＡ
断片と酵母染色体の相同組み換えによって、ターゲット
配列を導入した酵母染色体を得る。その際に、目的とす
る酵母染色体はマーカー遺伝子Ａによって選別する。

【０００８】一方、プラスミド２は、マルチクローニン
グサイトと第１のマーカー遺伝子Ｂを有するものであ
り、マルチクローニングサイトに酵母染色体に挿入する
外来遺伝子を挿入する。この外来遺伝子を挿入したプラ
スミド２を、上記のターゲット配列を導入した酵母染色
体と、第１のマーカー遺伝子Ｂの部位で相同組み換えす
ることによって、目的とする外来遺伝子を挿入した酵母
染色体を得る。上記の工程をとることによって、酵母染
色体に挿入する外来遺伝子は、プラスミド２のマルチク
ローニングサイトに単にクローニングするだけで、それ
以上操作する必要はない。また、酵母染色体に導入可能
なターゲット配列を有するＤＮＡ断片を得るための、Ｐ
ＣＲ法や大腸菌等の宿主による操作は、小型のプラスミ
ド１に対して行なえばよく、操作が容易になる。したが
って、本発明の方法では、従来技術の問題点を解消し、
酵母染色体の任意の部位に、任意の外来遺伝子を挿入す
ることが可能となる。

【０００９】

【実施例】（実施例１）分裂酵母のade8遺伝子座へ外来
遺伝子としてlac operator反復配列を組み込む例につい
て、以下に説明する。 （pCT33-6の構築、およびその構造）分裂酵母のura4遺
伝子を持つpREP2ベクター（Maundrell, K. 1993. Thiam
ine-repressible expression vectors pREP and pRIP f
or fission yeast. Gene. 123:127-130）を鋳型とし、 プライマー１：CGCGGATCCGAATTGTTGGCTTTGATGGAAG（配
列番号１）及び プライマー２：CGCGGATCCTTAGTCGCTACATAAAATTTTACC
（配列番号２） をそれぞれ使用しura４遺伝子のC末側、２４２アミノ酸
を含み、両端にBamHIサイト（プライマー中の下線部）
を有するＤＮＡ断片を増幅、取得する。その後この断片
をBamHIで切断し、BamHI断片を得る。また、pFA6a-kanM
X6ベクター（Wach, et al. 1994. New heterologous mo
dules for classical or PCR-based gene disruptions
in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10:1793-180
8）をBglI（図２中、枠囲い）で切断する。その後、こ
のBamHI断片とpFA6a-kanMX6ベクターをライゲーション
してpCT33-6を取得する。pCT33-6を取得する手順を図２
に、また得られたpCT33-6の制限酵素地図を図３に示
す。図中、AmpRはアンピシリン耐性遺伝子、ura4-parti
alはura4代謝系遺伝子部分断片、kanRはカナマイシン耐
性遺伝子、PtefはA.gosypiiTEF遺伝子プロモーター、そ
してTtefはA.gosypiiTEF遺伝子ターミネーターを表す。
また、挿入されたura4遺伝子断片のＤＮＡ配列を図４及
び配列番号３に示す。

【００１０】（pCT30の構築およびその構造）pBluescri
ptKS＋ベクター（STRATAGENE社）をNaeIで（図５中、枠
囲い）消化後、BglIIリンカー（宝酒造製）を挿入す
る。その後BglIIで切断する。また、分裂酵母のura4遺
伝子を持つpREP2ベクターを鋳型とし、 プライマー３：CGGGATCCAAGCTTAGCTACAAATCCCACTG（配
列番号４） プライマー４：CGGGATCCAAACGCAAACAAGGCATCGAC（配列
番号５） をそれぞれ使用し、ＰＣＲ法によりura4遺伝子を含み、
両端にBamHIサイト（プライマー中の下線部）を有する
ＤＮＡ断片を増幅、取得する。その後この断片をBamHI
で切断し、このBamHI断片をBglIIで切断したベクターと
ライゲーションを行ってpCT30を取得する。pCT30を取得
する手順を図５に、そして、得られたpCT30の制限酵素
地図を図６に示す。また、挿入されたura4遺伝子を含む
断片のＤＮＡ配列を図７及び配列番号６に示す。

【００１１】（pCT31の構築およびその構造）pSV2dhfr
8.32プラスミド（Robinett, C.C. et al. 1996. In viv
o localization of DNA sequences and visualization
of large-scale chromatin organization using lac op
erator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135:16
85-1700.）より制限酵素XhoIおよびSalIでlac operator
配列が２５６コピーつながったＤＮＡ配列を持つ断片を
切り出す。pCT30をXhoI（図８中、枠囲い）で切断後、
この断片をライゲーションによって挿入し、pCT31を構
築する。プラスミドpCT31の構築手順を図８に示す。図
８において、ura4はウラシル代謝系遺伝子、MCSはマル
チクローニングサイト、そしてlac operator repeater
はlacオペレータ反復配列を表す。

【００１２】（分裂酵母のade8遺伝子座への組み込み）
分裂酵母のade8遺伝子領域と相同な配列を有する以下の
二つのプライマー５（配列番号７）及びプライマー６
（配列番号８）を用い、pCT33-6を鋳型としてＰＣＲ法
によって増幅する。これによって両端にade8遺伝子領域
と相同な配列を持ち、kanamycine耐性遺伝子とura４遺
伝子断片を有するＤＮＡ断片を取得する。以下のプライ
マーの下線部はade8領域と相同な配列を示し、下線のな
い配列はpCT33-6と相同な領域である。また、ade8領域
のＤＮＡ配列を図９及び配列番号９に示し、図９中の下
線部はプライマー５、６に使用した配列を示す。 primer5（配列番号７）：CAAATAATAAATCTGATGGTCTTCTCA
AGGTGGAGCATTTGTAGAGCACTACTTAGTGTTGGTTCCTCACTGTCCAT
TCACCACAACAGGTAG CGGATCCCCGGGTTAATTAA primer6（配列番号８）：TCTTCCTTGACTACTCGGCCAGCTTGA
TGAGACAAGACACGAATCTGCTCGTGACACTCATGACGACTAGCACCGTG
CTTAGTCATAGCC GAATTCGAGCTCGTTTAA

【００１３】得られたＤＮＡ断片をura4-D18というura4
遺伝子を欠失した変異をもつ分裂酵母の株に、リチウム
クロライド法（Moreno, S, et. al. 1991. Molecular g
enetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyc
es pombe. Methods Enzymol.194: 793-823.）による形
質転換によって導入した。kanamycineにより選別して得
られたkanamycine耐性形質転換株のうち、〜３０％がad
e8領域に正しくＤＮＡ断片が挿入されたものであった。
次にプラスミドpCT31をura4遺伝子内に存在するStuIで
切断し、直鎖状とした。この直鎖プラスミドをリチウム
クロライド法により、ade8遺伝子座にura4遺伝子断片と
kanamycine耐性遺伝子が組み込まれた分裂酵母の株に導
入した。相同組換えにより得られたura＋形質転換株の
〜１００％が、ade8遺伝子座にlac operator反復配列を
もつpCT31が正しく組み込まれたものであった。

【００１４】（実施例２）つぎに、分裂酵母のade6遺伝
子座へ外来遺伝子としてlac operator反復配列を組み込
む例について説明する。ade6遺伝子座への組み込みには
まず、kanamycine耐性遺伝子＋ura4遺伝子断片の両側に
ade6領域と相同なＤＮＡ配列をもつプラスミドpCT34を
作製し、そこからその断片を切り出して細胞へ導入する
ことによって行った。以下にpCT34の作製法、および組
み込み法を示す。

【００１５】（pCT34の作製）ade6-469の変異のあるade
6遺伝子（Szanski, P, et. al. 1988. DNA sequenceana
lysis of the ade6 gene of Scizosaccharomyces pombe
wild-type and mutant alleles including the recomb
ination hot spot allele ade6-M26. J. Mol. Biol. 20
4:917-925.）を持つプラスミド、pade6-469より、ade6
遺伝子領域をPvuII-SpeIで切り出す。切り出したＤＮＡ
の配列を図１０、１１及び配列番号１０に示す。図１
０、１１において、白四角はPvuIIあるいはSpeIサイト
を示し、＊は停止コドンを示す。また、括弧内は変異の
ないade6のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。切り出した
断片をpRS306（Sikorski, R. S. and Hieter, P. 1989.
System ofshyttle vectors and yeast host strains d
esingned for efficient manipulation of DNA in Sacc
haromyces cerevisiae. Genetics. 122: 19-27.）のEcl
136II-SpeIサイトにライゲーションによって挿入し、プ
ラスミドpCT32を得た。（図１２）。得られたプラスミ
ド、pCT32よりade6蛋白質のコード領域の約４分の３に
あたるBamHI-EcoRI断片を切り出して除く。（図１
３）。そしてpCT33-6より切り出したura4遺伝子断片とk
anamycine耐性遺伝子を含むBanHI-EcoRI断片をこの部分
にライゲーションによって挿入し、プラスミドpCT34を
作製した。pCT34を作製する手順を図１２及び図１３に
示す。

【００１６】（ade6遺伝子座への組み込み）pCT34よりa
de6の領域と相同な配列を両端に持ち、しかもura4遺伝
子断片とkanamycine耐性遺伝子を持つＤＮＡ断片をXhoI
によって切り出す。（図１４、枠囲い）。このXhoI断片
をリチウムクロライド法によってura4-D18の変異を持つ
分裂酵母の株に導入する。kanamycineにより選別して得
られたkanamycine耐性形質転換株のうち、〜９０％がad
e6領域に正しくＤＮＡ断片が挿入されたものであった。
次にade8への組み込みの時と同様に、プラスミドpCT31
をStuIで切断し、直鎖状とし、ade6遺伝子座にura4遺伝
子断片とkanamycine耐性遺伝子が組み込まれた分裂酵母
の株に導入した。相同組換えにより得られたura＋形質
転換株の〜１００％が、ade6遺伝子座にlac operator反
復配列をもつpCT31が正しく組み込まれたものであっ
た。

【００１７】上記の実施例では、本発明を分裂酵母の染
色体に適用した例について説明したが、本発明は出芽酵
母の染色体にも適用することができるものである。

【００１８】

【発明の効果】本発明では、酵母染色体への外来遺伝子
の組み込みを２段階で行うものであり、酵母染色体に挿
入可能なＤＮＡ断片を得るための大腸菌等の宿主での操
作、或いはＰＣＲ法による操作は、その操作が簡単なタ
ーゲット配列に対して行う。そして、目的とする外来遺
伝子は、単にプラスミドのマルチクローニングサイトに
組み込むことによって、相同組み換えによってターゲッ
ト配列を導入した酵母染色体に挿入するものである。し
たがって、本発明の方法によれば、ターゲット配列の両
側に設ける酵母染色体と相同な配列を選択することによ
って、酵母染色体の任意の部位に外来遺伝子を挿入する
ことが可能となり、またその際に、従来技術で生じる種
々の問題点を解消することができる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Communications Research Laboratory, Ministry of Posts and Telecomm unications YAMAMOTO Ayumu <120> Method for integration of DNA fragments into yeast chromosomes <130> CRL-00-AL <160> 10 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 1 cgcggatccg aattgttggc tttgatggaa g 31 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 2 cgcggatcct tagtcgctac ataaaatttt acc 33 <210> 3 <211> 873 <212> DNA <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 3 gaa ttg ttg gct ttg atg gaa gaa aag caa agc aac ttg tca gtc gcg 48 Glu Leu Leu Ala Leu Met Glu Glu Lys Gln Ser Asn Leu Ser Val Ala gtc gat ttg acg aag aaa tcc gaa atc tta gaa ttg gta gat aaa att 96 Val Asp Leu Thr Lys Lys Ser Glu Ile Leu Glu Leu Val Asp Lys Ile gga ccc tat gtc tgt gtt atc aag aca cat att gac gtt gtc gag gat 144 Gly Pro Tyr Val Cys Val Ile Lys Thr His Ile Asp Val Val Glu 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 5 cgggatccaa acgcaaacaa ggcatcgac 29 <210> 6 <211> 1391 <212> DNA <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 6 aagcttagct acaaatccca ctggctatat gtatgcattt gtgttaaaaa agtttgtata 60 attatttaa tctactcagc attctttctc taaataggaa tttgttactt aatggagaaa 120 aaaatgtttc gatttaccta gtgtatttgt ttgtatactc acgtttaatt tcaaacatcc 180 attctatctt gtgtaatttt tggcatggtg aaaaagataa tcagccttat aatctttaca 240 aaagtaagaa attctgtaaa taagccttaa tgcccttgct ttaaattaaa atggttcttt 300 ttcatgataa tgtttgcact ttgtgaatat attttagata gttctgtgag gtataattaa 360 gatgttttag agacttatac aattttgtct ttataaattc ttaattgatt ttaccatccc 420 agtttaacta tgcttcgtcg gcatctctgc acatgtcgtg ttttcttacc gtattgtcct 480 accaagaacc tcttttttgc ttggatcgaa attaaaggtt taaaagcaaa gtt atg 536 Met gat gct aga gta ttt caa agc tat tca gct aga gct gag ggg atg aaa 584 Asp Ala Arg Val Phe Gln Ser Tyr Ser Ala Arg Ala Glu Gly Met Lys aat ccc att gcc aag gaa ttg ttg gct ttg atg gaa gaa aag caa agc 632 Asn 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Leu Ser Gln tgg tct ttg cga tac aaa gac att cct act ctt ggg ttt aca cat tat 660 Trp Ser Leu Arg Tyr Lys Asp Ile Pro Thr Leu Gly Phe Thr His Tyr caa cca gct caa tta act acc gtt ggt aag cgt gcc act ctt tgg att 708 Gln Pro Ala Gln Leu Thr Thr Val Gly Lys Arg Ala Thr Leu Trp Ile caa gag ctt tta tgg gat ttg aga aat ttt gta aga gct aga aat gac 756 Gln Glu Leu Leu Trp Asp Leu Arg Asn Phe Val Arg Ala Arg Asn Asp att ggt ttc cgt ggt gtc aag ggt acc acc ggc act cag gct tcc ttc 804 Ile Gly Phe Arg Gly Val Lys Gly Thr Thr Gly Thr Gln Ala Ser Phe tta gcc ctt ttt gag ggc gat cat gcc aag gtt gag gaa ttg gat aaa 852 Leu Ala Leu Phe Glu Gly Asp His Ala Lys Val Glu Glu Leu Asp Lys ttg gtt gcc aag ctt tcc ggt ttt gat aac gtt tat cct gta acc ggc 900 Leu Val Ala Lys Leu Ser Gly Phe Asp Asn Val Tyr Pro Val Thr Gly caa acc tat gat cgt aag atc gat att gac gtt ttg caa cca tta gct 948 Gln Thr Tyr Asp Arg Lys Ile Asp Ile Asp Val Leu Gln Pro Leu Ala tct ttc ggt gct act gct cat aag att gca act gat atc cgt ctc ctt 996 Ser Phe Gly Ala Thr Ala His Lys Ile Ala Thr Asp Ile Arg Leu Leu gct aat ttg aaa gaa gta gaa gag cca ttt gag gct ggt caa att ggc 1044 Ala Asn Leu Lys Glu Val Glu Glu Pro Phe Glu Ala Gly Gln Ile Gly agt tct gct atg gct tac aag cgt aat cca atg cgt tgt gaa cgt att 1092 Ser Ser Ala Met Ala Tyr Lys Arg Asn Pro Met Arg Cys Glu Arg Ile tgt tct caa gct cgt tat att atg aac ttg att cct aat gct ctt aat 1140 Cys Ser Gln Ala Arg Tyr Ile Met Asn Leu Ile Pro Asn Ala Leu Asn act gct tct gtt caa tgg ttt gag cgt act ttg gat gat agc tct aac 1180 Thr Ala Ser Val Gln Trp Phe Glu Arg Thr Leu Asp Asp Ser Ser Asn cgt cgt tct ctg tta cct gaa gcc ttc ttg ttt aca gat agc gtt ctt 1236 Arg Arg Ser Leu Leu Pro Glu Ala Phe Leu Phe Thr Asp Ser Val Leu aag att cta ttg aac gtt att tct ggt atg gtc att tat cct aag gtt 1284 Lys Ile Leu Leu Asn Val Ile Ser Gly Met Val Ile Tyr Pro Lys Val att caa aaa cac att cgt gct gaa ttg ccc ttc atg gcc act gaa aac 1332 Ile Gln Lys His Ile Arg Ala Glu Leu Pro Phe Met Ala Thr Glu Asn 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tgcaaaactc aaataataaa ctgcgcacta 780 actcactaca ataaacaact ttgaaaaaaa gattcgtttt ttcaacattt accatctcat 840 taagctgagc tgccaaggta tatacatact tcatcgaat atg agc gaa aaa cag 894 Met Ser Glu Lys Gln gtt gta ggg atc ctt gga ggt ggt caa ttg ggc cga atg atg gta gag 942 Val Val Gly Ile Leu Gly Gly Gly Gln Leu Gly Arg Met Met Val Glu gca gcc cat cgc tta aac atc aaa tgc atc atc ttg gat gca gca aat 990 Ala Ala His Arg Leu Asn Ile Lys Cys Ile Ile Leu Asp Ala Ala Asn tct cct gcc aaa caa att gat gga gga cgt gag cac att gat gca tca 1038 Ser Pro Ala Lys Gln Ile Asp Gly Gly Arg Glu His Ile Asp Ala Ser ttt act gac ccc gat gca att gtt gaa ctg tct aag aag tgc acg tta 1086 Phe Thr Asp Pro Asp Ala Ile Val Glu Leu Ser Lys Lys Cys Thr Leu tta aca act gaa att gag cat att aac act gat gcc ttg gca gcc gtt 1134 Leu Thr Thr Glu Ile Glu His Ile Asn Thr Asp Ala Leu Ala Ala Val acg aaa tct gtt gct gtt gaa ccc tct cct gca act ctg cga tgc att 1182 Thr Lys Ser Val Ala Val Glu Pro Ser Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ile caa gac aaa tat ctt caa aaa cag cat tta cag gtt ttt aag att gca 1230 Gln Asp Lys Tyr Leu Gln Lys Gln His Leu Gln Val Phe Lys Ile Ala ctt cct gaa ttt tgc gat gca cct gac cag gaa agt gtt gaa aaa gca 1278 Leu Pro Glu Phe Cys Asp Ala Pro Asp Gln Glu Ser Val Glu Lys Ala ggc caa gag ttt ggt tat cct ttt gta ctg aaa agt aaa aca ttg gct 1326 Gly Gln Glu Phe Gly Tyr Pro Phe Val Leu Lys Ser Lys Thr Leu Ala tac gac ggt cgt gga aat tac gtt gtt cat caa cca tct gag att cct 1374 Tyr Asp Gly Arg Gly Asn Tyr Val Val His Gln Pro Ser Glu Ile Pro act gcc atc aaa gca ctt ggt gat cgt ccg ctt tat gtt gaa aag ttc 1422 Thr Ala Ile Lys Ala Leu Gly Asp Arg Pro Leu Tyr Val Glu Lys Phe gtt cct ttc tcc atg gaa att gca gtg atg gta gta cgc agt tta gac 1470 Val Pro Phe Ser Met Glu Ile Ala Val Met Val Val Arg Ser Leu Asp gga aaa gtt tat gct tat cct aca act gag acc att caa aag gat aat 1518 Gly Lys Val Tyr Ala Tyr Pro Thr Thr Glu Thr Ile Gln Lys Asp Asn gtt tgt cat tta gta tat gcc cct gct cgt ctt ccc ttc tca att caa 1566 Val Cys 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【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の工程の概略を示す模式図である。

【図２】プラスミドｐＣＴ３３−６を取得する手順を示
す図である。

【図３】プラスミドｐＣＴ３３−６の制限酵素地図を示
す図である。

【図４】ura４遺伝子断片のＤＮＡ配列を示す図であ
る。

【図５】プラスミドｐＣＴ３０を取得する手順を示す図
である。

【図６】プラスミドｐＴＣ３０の制限酵素地図を示す図
である。

【図７】ura４遺伝子を含む断片のＤＮＡ配列を示す図
である。

【図８】プラスミドｐＣＴ３１を取得する手順を示す図
である。

【図９】ade８領域のＤＮＡ配列を示す図である。

【図１０】ade６領域のＤＮＡ配列を示す図である。

【図１１】ade６領域（図１０の配列の続き）のＤＮＡ
配列を示す図である。

【図１２】プラスミドｐＣＴ３２を取得する手順を示す
図である。

【図１３】プラスミドｐＣＴ３４を取得する手順を示す
図である。

【図１４】ade６遺伝子座へ外来遺伝子を組み込む手順
を示す図である。

【図１５】染色体に外来遺伝子を挿入する従来の方法を
示す図である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の工程を含むことを特徴とする酵母
   染色体に外来遺伝子を挿入する方法： （１）ターゲット配列となるＤＮＡ断片の両側に、酵母
   染色体の外来遺伝子を挿入する部位と相同な配列を有す
   るＤＮＡ断片を作製する工程、（２）該ＤＮＡ断片と酵
   母染色体の相同組み換えによって、ターゲット配列を導
   入した酵母染色体を得る工程、（３）ターゲット配列と
   相同組み換え可能なＤＮＡ断片とマルチクローニングサ
   イトを有するプラスミドに、外来遺伝子を挿入する工
   程、（４）ターゲット配列を導入した酵母染色体と外来
   遺伝子を挿入したプラスミドの相同組み換えによって、
   外来遺伝子を挿入した酵母染色体を得る工程。
2. 【請求項２】 ターゲット配列として、第１のマーカー
   遺伝子の部分断片及び第２のマーカー遺伝子を使用し、
   第２のマーカー遺伝子によってターゲット配列を導入し
   た酵母染色体を選別することを特徴とする請求項１に記
   載の方法。
3. 【請求項３】 ターゲット配列と相同組み換え可能なＤ
   ＮＡ断片として、第１のマーカー遺伝子を使用すること
   を特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 酵母染色体が分裂酵母の染色体であるこ
   とを特徴とする請求項１〜３にいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】 第１のマーカー遺伝子が分裂酵母のura
   ４遺伝子であり、第２のマーカー遺伝子がkanamycine耐
   性遺伝子であることを特徴とする請求項４に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 工程（１）の酵母染色体の外来遺伝子を
   挿入する部位と相同な配列を有するＤＮＡ断片を、ＰＣ
   Ｒ法によって作製することを特徴とする請求項１〜５に
   いずれかに記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載の方法に
   よって外来遺伝子を挿入した酵母染色体。