KR102452590B1 - CRISPR/Cas9 매개 체세포 핵 이식에 의한 개 디스트로핀병증 모델 생성 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 디스트로핀병증 모델용 형질전환 개 및 이의 제조방법, 그리고 이의 이용에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Dystrophin 유전자를 넉아웃(knock-out) 시킨 형질전환 개를 질환 동물 모델로 이용하는 것에 관한 것이다.

Description

CRISPR/Cas9 매개 체세포 핵 이식에 의한 개 디스트로핀병증 모델 생성 및 이의 용도{Generation of canine dystrophinopathy model by nuclear transfer using CRISPR/Cas9-mediated somatic cells and th Use thereof}
본 발명은 디스트로핀병증 질환 모델용 형질전환 개 및 이의 제조 방법, 그리고 이의 이용에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 디스트로핀(dystrophin) 유전자를 넉아웃(knock-out)시킨 형질전환 개를 디스트로핀병증 질환 모델로 이용하는 것이다.
Duchenne 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy, DMD) 및 Becker 근이영양증(Becker muscular dystrophy, BMD)은 진행성 근력저하를 보이고 성염색체 열성으로 유전되는 근육 질환이다. 1987-1988년에 근막에 존재하는 디스트로핀(dystrophin) 유전자와 Dystrophin 단백질이 발견되어 이 유전자 결손으로 Dystrophin 단백질이 완전 또는 부분 손실되어 근섬유의 괴사 및 재생을 보이면서 근력저하가 나타나는 근육병으로 밝혀져 DMD/BMD를 디스트로핀병증(dystrophinopathy) 또는 Dystrophin-결핍 근이영양증(dystrophin-deficient muscular dystrophy)이라고 한다.
이러한 디스트로핀병증의 임상 표현형은 대부분 DMD 및/또는 BMD로 발현되나 이 외에도 DMD와 BMD의 중간형, 그리고 낮은 발생률이지만 증상이 발현된 여자 유전자 보유자, X 연관 심근병증(X-linked cardiomyopathy) 등으로 발현되기도 한다. 발병률은 DMD의 경우 출생한 남아 약 3300명당 1명 정도로 매우 높아 유전성 근육질환의 약 90%를 차지한다.
Dystrophin 유전자의 변이는 결손(deletion)이 가장 흔하여 전체 환자의 55-65%에 달하고, 결손 부위가 mRNA의 번역 리딩 프래임(translational reading frame)을 이동시킬 경우(out of-frame deletion) 전사가 조기에 종식하게 되며 디스트로핀 단백질이 형성되지 않아 증상이 심한 DMD형이 발현되게 된다. 그러나 결손이 있더라도 reading frame이 보존될 경우(in-frame deletion)에는 분자량이 작거나, 비정상적인 단백질이 생성되어 DMD에 비해 증상이 경미한 BMD형이 발현하게 된다.
이러한 디스트로핀병증의 발생 및 치료 개발을 위한 연구를 위해 다양한 동물모델을 사용하고 있다. 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델은 Dystrophin-결핍 mdx 마우스로, DMD 연구에 많이 활용되고 있다. 하지만 Dystrophin-결핍 mdx 마우스 모델은 여러 가지 한계점을 가지고 있다. 예를 들어, Dystrophin-결핍 mdx 마우스는 평균적으로 75% 수명 감소를 보이는 DMD 환자와 다르게 25%의 수명 감소 및 최소한의 임상 증상만을 보인다. 또한, 비용, 안전성 및 신체 크기의 차이 등과 같은 여러 가지 이유로 마우스에서 인간으로 확장 적용하는 것이 어렵기 때문에, 마우스 모델에서의 치료 효과와 인간 환자에서 관찰되는 치료 효과 사이에 낮은 상관관계를 가진다. 따라서, 마우스는 디스트로핀병증 연구를 위한 동물 모델로 적합하지 않다. 이에 반해 개(canine) 모델은 현존하는 다른 Dystrophin-결핍 모델보다 인간 질병을 가장 유사하게 반영하므로 인간과 마우스 사이의 적절한 연결 다리가 될 수 있다.
그러나 최근 근이영양증을 가지는 골든 리트리버(Golden Retriever)가 인간 디스트로핀병증 연구에 유용한 동물 모델로 제시되고 있으나, 기존의 육종법을 사용하여 유전적 특징이 유지된 개체수를 증가시키는 데 어려움을 겪고 있다.
이에, 본 발명자들은 기존 문제점을 해결하고 보다 효율적인 디스트로핀병증 개 모델을 제작하기 위해, Dystrophin 유전자의 특이 서열을 인식하여 절단하는 뉴클레아제를 이용하여 형질전환시킨 체세포의 핵을 이식하는 기술을 적용함으로써, Dystrophin 유전자를 넉아웃 시켜 효과적인 디스트로핀병증 동물 모델을 제작할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Wayne, R.K. & Ostrander, E.A. Trends Genet 23, 557-567 (2007). Glickman, L.T. et al. J Am Vet Med Assoc 224, 1290-1297 (2004). Hoffman, E.P. et al. Cell 51, 919-928 (1987). Guiraud, S. et al. Annu Rev Genomics Hum Genet 16, 281-308 (2015). Shelton, G.D. & Engvall, E. Neuromuscul Disord 15, 127-138 (2005). Chamberlain, J.S. et al. FASEB J 21, 2195-2204 (2007). McGreevy, J.W. et al. Dis Model Mech 8, 195-213 (2015). Duan, D. Hum Gene Ther Clin Dev (2015). Duan, D. Res Rep Biol 2011, 31-42 (2011). Valentine, B.A. et al. J Neurol Sci 88, 69-81 (1988). Sharp, N.J. et al. Genomics 13, 115-121 (1992). Schatzberg, S.J. et al. Neuromuscul Disord 9, 289-295 (1999). Walmsley, G.L. et al. PLoS One 5, e8647 (2010). Kornegay, J.N. Skelet Muscle 7, 9 (2017). Shimatsu, Y. et al. Exp Anim 52, 93-97 (2003). Aartsma-Rus, A. et al. Muscle Nerve 34, 135-144 (2006). Kornegay, J.N. et al. Neuromuscul Disord 13, 493-500 (2003). Rowland, L.P. Muscle Nerve 3, 3-20 (1980). Diaz-Manera, J. et al. Acta Myol 34, 95-108 (2015). Finanger, E.L. et al. Phys Med Rehabil Clin N Am 23, 1-10, ix (2012). Maron, B.J. et al. Circulation 113, 1807-1816 (2006). McNally, E.M. Heart 94, 976-977 (2008). Yugeta, N. et al. BMC Cardiovasc Disord 6, 47 (2006). Arahata, K. et al. Nature 333, 861-863 (1988). Monaco, A.P. et al. Genomics 2, 90-95 (1988).
본 발명의 목적은 디스트로핀병증 모델용 개 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 디스트로핀병증 모델용 개의 제조방법에 필요한, 인위적인 뉴클레아제 시스템을 이용하는 유전자 넉아웃 또는 넉다운 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 디스트로핀병증 모델용 개의 제조방법에 필요한 인위적인 뉴클레아제 시스템, 상기 인위적인 뉴클레아제 시스템으로 형질전환된 세포 및 핵 이식란을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 디스트로핀병증 모델용 개의 다양한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 디스트로핀병증 모델용 개를 이용하여 디스트로핀병증 예방 및 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
디스트로핀병증(Dystrophinopathy) 모델용 개의 생산을 위한, 디스트로핀(Dystrophin) 유전자의 인위적 조작 및 이의 이용을 제공한다. 보다 구체적으로, Dystrophin 유전자의 인위적인 조작 또는 변형을 이용하여 Dystrophin 결핍 표현형을 가지는 개를 생산하는 방법 및 이의 이용에 관한 것이다. 상기 Dystrophin 결핍 표현형은 디스트로핀병증으로 나타날 수 있으며, 디스트로핀병증은 Dystrophin-결핍 근이영양증으로, Duchenne 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy, DMD) 및 Becker 근이영양증(Becker muscular dystrophy, BMD)으로 나타날 수 있다.
그러므로, 본 발명은 디스트로핀병증, 즉, DMD 및/또는 BMD의 진행 및 병리학적 기전의 연구에 유용한 개 모델 및 이의 이용을 제공할 수 있다.
본 발명의 특정 목적을 위해 Dystrophin 유전자의 조작 또는 변형용 조성물 및 이를 이용한 방법을 제공한다.
일 구현예에서는, Dystrophin 유전자의 핵산서열 내 변형에 의해 Dystrophin 유전자가 넉아웃된, Dystrophin 단백질 발현이 불활성화된, 디스트로핀병증 개 모델을 제공한다.
Dystrophin은 근세포막 세포골격단백질의 일종으로, 3,685개의 아미노산으로 구성된 단백질이며, 가늘고 긴 구조로 N 말단측은 액틴계와, C 말단측은 디스트로핀결합단백질과 직간접으로 결합한다. Dystrophin 유전자는 X 염색체 상에 존재하며 3Mbp 염기서열로 구성된다.
상기 핵산서열 내 변형은 하나 이상의 핵산의 결실, 치환, 삽입 또는 역위를 포함할 수 있다.
일 구체예에서는, 상기 핵산의 변형은 Dystrophin 유전자의 엑손 6 영역에 일어난 것일 수 있다.
일 구체예에서는, 핵산서열 내 변형은 뉴클레아제 제제에 의해 인위적으로 일으킬 수 있다.
예를 들어, 상기 뉴클레아제 제제는 하기의 뉴클레아제 중 1 이상을 사용할 수 있다.:
(a) 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN);
(b) 전사 활성화 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN);
(c) 메가뉴클레아제; 또는
(d) RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)
일 실시예에서, 상기 핵산서열 내 변형은 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)에 의해 인위적으로 조작될 수 있다. 대상은 표적 핵산, 유전자, 염색체 또는 단백질일 수 있다.
상기 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 노카르디옵
시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)로부터 유래될 수 있다. Cas9 패밀리의 추가의 예는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2014/131833에 기재되어 있다. 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)유래의 Cas9 단백질일 수 있다.
예를 들어, 상기 Dystrophin 유전자는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제에 의해 유전적으로 조작될 수 있는데,
상기 Dystrophin 유전자를 구성하는 핵산서열 내 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열 중 또는 이의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 3bp 내지 25bp의 염기 서열 부위 내의
하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입;
야생형 유전자와 상이한 하나 이상의 뉴클레오타이드로의 치환;
외부 유래의 하나 이상의 뉴클레오타이드 삽입
중 하나 이상의 핵산의 변형을 포함할 수 있다.
상기 PAM 서열은 Cas 단백질의 유래 미생물에 따라 상이할 수 있다. 구체적인 설명은 이후 기술하기로 한다. 대표적인 예로서, 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제가 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질이고, 상기 PAM 서열이 NGG(N은 A, T, C 또는 G임)인 것을 이용할 수 있다.
상기 핵산의 변형은 염색체 전체 게놈 서열에서 2 이상의 복수 부위에서 일어날 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 적어도 한 부위 이상에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 Dystrophin 유전자 핵산서열에서 변화될 수 있다. 이에 의해 Dystrophin 유전자는 넉아웃(knock out) 또는 넉다운(knock down)될 수 있다.
상기 핵산의 변형은 유전자의 프로모터 영역에서 일어날 수 있다.
상기 핵산의 변형은 유전자의 엑손 영역에서 일어날 수 있다.
상기 핵산의 변형은 유전자의 인트론 영역에서 일어날 수 있다.
상기 핵산의 변형은 유전자의 인핸서 영역에서 일어날 수 있다.
또한, 다른 구현예에서, 본 발명은 Dystrophin 유전자의 핵산 서열 중 표적 서열에 각각 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산을 제공한다. 상기 표적 서열은 Dystrophin 유전자의 핵산 서열 중 1 이상의 부위일 수 있다.
상기 표적 서열은 비제한적으로, 18 내지 25 bp, 18 내지 24 bp, 18 내지 23 bp, 19 내지 23 bp, 19 내지 23 bp, 또는 20 내지 23 bp의 뉴클레오타이드일 수 있다.
예를 들어, 이하의 표적 서열 및 가이드 핵산을 제공할 수 있다:
표적 서열(서열번호 1)
5'-GAAATTAATACGACTCACTATAG-3'
가이드 핵산 (서열번호 2)
5'-GAAATTAATACGACTCACTATAG(Target Sequence 20bp)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT-3'
또한, 구현예에서, 본 발명은 상기 인위적으로 조작된 Dystrophin 유전자 및 이로부터 발현되는 산물 중 1 이상을 포함하는, 인위적으로 조작된 세포 또는 배아를 제공할 수 있다.
상기 세포 또는 배아는 핵산서열 내 변형이 일어난 불활성화된 Dystrophin 유전자를 포함하고, 이의 표현형을 가지는 개체로 발달할 수 있다.
또한, 구현예에서, 본 발명은 Dystrophin 유전자를 유전적으로 조작하기 위한 조성물 및 이의 이용을 제공할 수 있다.
일 실시예에서, Dystrophin 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산; 및 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 Dystrophin 유전자 조작용 조성물을 제공한다.
관련 구성 설명은 상기 기술한 바와 같다.
구현예에서, 본 발명은
Dystrophin 유전자 상의 표적 게놈 유전자좌를 포함하는 세포 또는 배아에,
(a) 상기 표적 게놈 유전자좌 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 가이드 RNA; 및
(b)RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)을
접촉시키는 단계를 포함하는, Dystrophin 유전자의 핵산 서열이 변경된 세포 또는 배아를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제는, 각각 핵산 서열의 형태로 1 이상의 벡터에 존재하거나, 또는 가이드 핵산과 RNA-가이드 엔도뉴클레아제의 결합으로 복합체를 형성하여 존재할 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 생체 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 접촉시키는 단계는 Cas9 단백질 및 가이드 RNA로 구성되는 RNP(ribonucleoprotein) 형태로 in vitro에서 개 세포에 도입될 수 있다.
접촉시키는 단계는 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 1 이상의 방법으로 수행될 수 있다.
상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.
구현예에서, 본 발명은
Dystrophin 유전자를 넉아웃(knock-out) 시키는 디스트로핀병증 개 모델 제작용 재조합 벡터 또는 인위적인 뉴클레아제 복합체으로 형질전환된 세포주, 및 이를 이용한 Dystrophin 유전자가 넉아웃된 디스트로핀병증 모델용 개를 제공한다. 이때, 상기 형질전환은 체세포 핵 이식 기술(somatic cell nuclear transfer, SCNT)에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명은 상기 디스트로핀병증 모델용 개의 제조방법의 과정에서 수득될 수 있는 디스트로핀병증 모델 제작에 필요한 형질전환 벡터, 형질전환을 위한 인위적인 뉴클레아제 복합체, 세포 및 핵 이식란 등을 모두 포함한다.
즉, 본 발명은 또 다른 구체예로서,
Dystrophin 유전자 특정 서열을 인식하여 절단하는 활성을 가지는 가이드 핵산 및 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 코딩하는 서열을 함유하는 디스트로핀병증 모델 제작용 재조합 벡터가 도입된, 형질전환 세포를 제공하거나, 또는
Dystrophin 유전자 특정 서열을 인식하여 절단하는 활성을 가지는 가이드 핵산 및 RNA-가이드 엔도뉴클레아제로 구성된 복합체, 즉, 인위적인 뉴클레아제 복합체가 도입된, 형질전환 세포를 제공할 수 있고,
상기 형질전환된 개 유래 세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 형성된 개의 핵 이식란도 제공할 수 있다.
구현예에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 개체를 수득하는 방법 및 그러한 개체를 제공할 수 있다.
상기 개체는 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 닭, 조류, 토끼, 염소, 개, 고양이 및 어류로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 동물일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 디스트로핀병증 모델용 개의 다양한 용도를 제공한다.
일 예로써, 다음을 포함하는, 디스트로핀병증 예방 및 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다:
상기 디스트로핀병증 모델용 개에 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 및
후보물질 투여 후, 상기 개의 조직을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 분석하는 단계.
이처럼, 본 발명은 사람과 가장 유사한 디스트로핀병증을 나타내는 동물인 개를 이용한 디스트로핀병증 동물모델 및 이의 다양한 용도를 제공한다.
본 발명의 디스트로핀병증 모델용 개는, 인간에게서 발생하는 디스트로핀병증과 가장 유사한 증상을 나타내고 유전적 분석이 유용하며 정확한 질병원인과 기전을 연구하기에 유용할 뿐 아니라 독성 및 안전성 평가에도 최적 동물모델로서, 디스트로핀병증 발병 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발 등에 다양하게 활용될 수 있으므로, 디스트로핀병증 동물 모델로서 매우 유용할 것이다.
도 1은 핵 이식란 및 이에 의해 생산된 Dystrophin 넉아웃 된 새끼(pup)의 수를 정리하여 나타낸다.
도 2는 CRISPR/Cas9에 의해 Dystrophin 넉아웃되어 생산된 개의 타겟한Dystrophin 유전자 위치의 핵산서열을 보여준다.
도 3은 CRISPR/Cas9에 의해 Dystrophin 넉아웃되어 생산된 개와 대조군의 각각 2주부터 8주까지의 혈청 크레아틴 키나아제(CK) 값을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 CRISPR/Cas9에 의해 Dystrophin 넉아웃되어 생산된 개와 대조군의 운동 후 혈청 크레아틴 키나아제(CK) 값을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 CRISPR/Cas9에 의해 Dystrophin 넉아웃되어 생산된 개의 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)이다.
도 6은 CRISPR/Cas9에 의해 Dystrophin 넉아웃되어 생산된 개와 대조군의 각각 뒷다리 근육의 T2 값을 나타낸다.
도 7은 CRISPR/Cas9에 의해 Dystrophin 넉아웃되어 생산된 개와 대조군의 나이가 각각 4주령 및 10월령일 때 심전도(Electrocardiogram, ECG)를 측정한 결과이다.
도 8은 CRISPR/Cas9에 의해 Dystrophin 넉아웃되어 생산된 개의 근육 병리 조직 검사, 즉, 면역 조직 염색법(Immunohistochemical staining), 웨스턴 블롯(Western blot)을 통한 조직 병변을 보여준다.
본 발명에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"유전자 가위(engineered nuclease)"는 임의의 유전자에 결합해 특정 핵산 부위, 예를 들어 특정 DNA부위를 절단하여 손상 또는 파괴할 수 있는 인공적 뉴클라아제 및/또는 이를 포함하는 시스템을 통칭하는 용어이다. "표적화 (엔도)뉴클레아제(target-specific (endo)nuclease)" 또는 "인공 뉴클레아제(engineered nuclease)"로 표현하기도 한다. 상기 유전자 가위는 서열-특이적 엔도뉴클레아제이다. '서열-특이적 엔도뉴클레아제' 또는 '서열-특이적 뉴클레아제'는, 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 특정 뉴클레오티드 서열에서 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 표적 유전자를 인식하고 결합하여, 상기 폴리뉴클레오티드에서의 단일- 또는 이중-가닥 파손을 촉매하는 단백질을 가리킨다. 특정 서열을 특이적으로 인식하여 핵산을 절단할 수 있으므로 유전자 편집 (Genome Editing) 기술에 매우 유용하다. 예를 들어, ZFN(Zinc finger protein), TALEN(transcription activator-like effector protein), CRISPR/Cas system을 포함하는 RGEN(RNA-guided endonuclease) 등이 있다.
"세포", "숙주 세포", "변형 숙주 세포" 등은 특정 대상 세포뿐만 아니라 이런 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 의미한다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경 영향에 의해 후대에서 일어날 수 있기 때문에, 이런 자손은, 사실상, 부모 세포와 동일하지 않을 것이나 본 발명에 사용된 용어와 범위 내에 여전히 포함된다.
핵산에 대해 적용된 용어 "변형된" 또는 "조작된"은 본 발명에서 교환적으로 사용되며, 이는 유전자를 구성하는 핵산서열 내 인위적인 변경을 가한 것을 의미한다. 상기 변경은 하나 이상의 핵산의 결실, 치환, 삽입 또는 역위 등을 포함할 수 있다. 변형된 또는 조작된 핵산 서열은 이들 핵산 또는 이의 발현 생성물의 발현 및/또는 기능적 활성의 변경, 예를 들어, 증가, 촉진, 감소 또는 소실 등의 양태로나타날 수 있다.
핵산에 대해 적용된 용어 "손상" 및 "파괴"는 본 발명에서 교환적으로 사용되어 핵산 또는 이의 발현 생성물의 발현 및/또는 기능적 활성을 감소 또는 제거하는 임의의 유전자 변형을 의미한다. 예를 들어, 유전자의 파괴는 유전자의 발현 및/또는 상응하는 유전자 생성물(예를 들어, mRNA 및/또는 단백질)의 기능적 활성을 감소 또는 제거하는 임의의 유전자 변형의 범위 내에 포함된다. 유전자 변형은 핵산(예를 들어, 유전자)의 완전 또는 부분 불활성화, 억제, 결실, 방해, 봉쇄 또는 하강 조절을 포함한다.
핵산에 대해 적용된 용어 "절단"은 유전자의 뉴클레오티드 분자의 공유결합된 백본의 연결을 해제하는 것을 의미한다.
'질환 모델 동물'이란 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환 모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.
'동물' 또는 '실험동물'은 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다. 이런 동물들은 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류(예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 소, 양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위), 영장류(예를 들어, 침팬지, 원숭이, 붉은털원숭이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직한 동물은 개이다.
'녹아웃(knock-out)'은 표적 유전자의 기능 저하를 가져다 주는 유전자 서열 상의 변형을 의미하는데, 바람직하게는 이로써 표적 유전자 발현이 탐지 가능하지 않거나 무의미하다. 본 발명에서 Dystrophin 유전자의 녹아웃은 Dystrophin 유전자의 기능이 실질적으로 저하되어 발현이 탐지될 수 없거나 또는 무의미한 수준으로만 존재하는 것을 의미한다. 녹아웃 형질전환체는 Dystrophin 유전자의 이형 접합성 녹아웃 또는 Dystrophin 유전자의 동형 접합성 녹아웃을 갖는 형질전환성 동물일 수 있다. 녹아웃에는 예를 들어, 표적 유전자 변형을 증진시키는 물질에 해당동물을 노출시키거나, 표적 유전자 부위에서 재조합을 증진시키는 효소를 도입시키거나 또는 출생 후에 표적 유전자 변형을 지시하는 기타 방법시, 표적 유전자의 변형이 일어날 수 있는 조건적 녹아웃이 또한 포함된다.
'표적 유전자'는, 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 세포 내 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 가리킨다. "표적 서열"은, 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 표적 유전자의 일부분, 예를 들어, 표적 유전자의 하나 이상의 엑손 서열, 표적 유전자의 인트론 서열 또는 조절 서열, 또는 표적 유전자의 엑손 및 인트론 서열, 인트론 및 조절 서열, 엑손 및 조절 서열, 또는 엑손, 인트론 및 조절 서열의 조합을 가리킨다.
'서열 상동성'은, 공여체 및 표적 유전자 폴리뉴클레오티드 서열들과 관련하여, 서열들을 배열하고, 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위해 간격을 도입한 후, 표적 유전자 서열 중의 뉴클레오티드 잔기와 비교한 공여체 서열 중의 뉴클레오티드 잔기의 동일성 백분율로 정의된다. 백분율 뉴클레오티드 서열 상동성을 결정하기 위한 정렬은 당해기술에 해당하는 다양한 방식으로 달성될 수 있는데, 예를 들면 상용화된 컴퓨터 소프트웨어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어 등을 사용할 수 있다. 당해기술의 숙련가들은 서열의 정렬을 위한 적절한 매개변수들, 예를 들면 비교될 서열들의 전장에 걸친 최대 정렬을 달성하기에 필요한 모든 알고리즘 등을 결정할 수 있다.
'핵 이식'은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.'핵 이식란'은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.
'복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 개의 체세포, 배아 세포, 태아 유래 세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다. 본 발명은 핵 이식 기술을 이용하여 개를 복제하는 기술을 이용한다. 특히, 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.
'핵 공여 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다. '난자'는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다. 본 발명에서 상기 핵 공여 세포로는 개의 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있다.
'체세포(somatic cell)'란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포이며, 어떤 목적으로 특화하여 그 이외의 세포는 되지 않는 분화된 세포와, 몇종류인가의 다른 기능을 갖는 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포를 포함한다.
'줄기세포(stem cell)'는 어떤 조직으로든 발달할 수 있는 세포를 의미한다. 기본적인 특징으로는 두 가지가 있는데, 우선 반복 분열하여 자신을 만들어 내는 자기 재생산(self-renewal), 그리고 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는다.
'배양'은 생물체나 생물체의 일부(기관 ·조직 ·세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일로써, 이 경우 외적 조건으로 온도 ·습도 ·빛 ·기체상의 조성(이산화탄소나 산소의 분압) 등이 중요하며, 그 밖에 배양되는 생물체에 가장 중요한 직접적인 영향을 주는 것은 배지(배양기)로, 그 생물체의 직접적인 환경인 동시에 생존이나 증식에 필요한 각종 영양소의 공급장이다.
'체외배양'이란 세포 등이 체내에서 자라는 상태와 구분되는 방법으로 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내의 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하는 것이다.
'배지' 또는 '배지 조성물'은 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다.
'산자(living offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다.
'치료'는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. '치료'는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 '완화(Palliating)'하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
'약'이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "함유하다" 및 "포함하다"란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 디스트로핀병증 동물 모델에 관한 것이다.
보다 구체적으로, Dystrophin 유전자의 핵산서열을 인위적으로 변형시키는 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.
[디스트로핀병증 개 모델]
디스트로핀병증 모델 동물로서의 Dystrophin 결핍 개는 사람의 근이영양증에서 나타나는 크레아틴 키나아제(CK) 수치 상승, Dystrophin 결핍, 골격 결손, 비정상적인 심전도 및 보행 방해와 같은 전형적인 질환의 표현형이 나타나기때문에 디스트로핀병증에 대한 연구를 위한 가장 적합한 동물 종이라고 할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 인간과 유사한 병증을 보이는 개를 이용하여 설치류 모델을 뛰어넘는 질환 모델의 생산, 행동을 통해 보다 신뢰성있는 디스트로핀병증 질환 동물 모델을 개발하고 이를 활용하고자 하였다. 예를 들어, Duchenne 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy, DMD) 및/또는 Becker 근이영양증(Becker muscular dystrophy, BMD) 질환 동물모델일 수 있다.
디스트로핀병증은 Dystrophin 유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 질환으로, 진행성 근육 변성 및 괴사로 인해 결국 죽음을 초래하는 질환이다. 또한 디스트로핀병증은 Dystrophin-결핍 근이영양증으로도 불리며, Duchenne 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy, DMD) 및 Becker 근이영양증(Becker muscular dystrophy, BMD)으로 나타날 수 있다.
Duchenne 근이영양증(DMD) 및 Becker 근이영양증(BMD)은 Dystrophin 유전자의 돌연변이로 인한 Dystrophin-glycoprotein 복합체의 결손으로 인해 발생하는 가장 흔한 X 연관 열성 근이영양증이다.
근이영양증(muscular dystrophy, MD)은 운동기를 약화시키고 운동 능력을 방해하는 근육병증으로, 근육퇴행위축이라고도 한다. 점진적으로 골격근이 약화되고, 근육 단백질이 겹핍되며, 근육세포와 조직이 괴사하는 특징을 보인다.
Duchenne 근이영양증(DMD)은 진행성 근이영양증 중 가장 빈도가 높은 유전성 질환으로, 유전 양식은 반성 열성(sex-linked recessive) 유전이며, 1/3정도는 돌연변이에 의하여 남아에서 발생하나 드물게 여아에서도 발생한다. 유전자위(gene locus)는 X 염색체의 p21이며, DNA에 암호화 된 Dystrophin이란 단백질의 결핍에 기인한다. DMD는 매우 빠르게 증상이 진행되고, 12세 이전에 휠체어에 의존하게 되고, 심근병증이 18세 이후에 나타난다. DMD는 대부분 호흡기 합병증과 심근병증에 의해 사망하게 되며, 증상이 경한 경우에는 혈중 CK의 증가와 마이오글로빈뇨를 동반한 근경련과 사두근 부위의 근병증이 나타날 수 있다.
원인 유전자는 X 염색체의 p21에 존재하는 Dystrophin 유전자로서, Dystrophin 유전자의 결함 때문에 Dystrophin 단백질의 결핍이 초래된다. 전체 환자의 65%는 Dystrophin 유전자 내의 결실 때문에 생기고 5 ~ 10%는 유전자의 중복, 나머지는 점돌연변이(point mutation)나 미세결실(microdeletion)이 원인이다. Dystrophin 단백질의 결핍으로 인해 주로 골격근에 진행성의 변성이 일어나 근육 자체가 결합 조직이나 지방으로 대치되어 근육의 가성비대(pseudohypertrophy)가 출현하고 근력이 저하된다. 최근 병인의 가설로서 근세포막의 Dystrophin 결손으로 Ca2+이 세포 내로 유입되어 근육 내에 존재하는 Ca-activated neutral protease(CANP)를 활성화시켜 근세포의 괴사를 일으키는 것으로 알려져 있다. 손상입은 섬유들은 시간이 경과하면서 약해지고 파괴되어, 이는 DMD에서 나타나는 근육 약화나 심질환의 증상으로 나타나게 된다.
Becker 근이영양증(BMD)은 유전 양식과 임상 증상의 특징이 DMD와 유사하나, 발병 연령이 늦고, 병의 경과도 서서히 진행되는 양성질환이다. DMD와 달리 스스로 보행이 가능한 20세부터 근골격계 증상이 나타나기 시작하며, BMD의 주요 사망원인은 심부전이다. 유전자위는 DMD와 같으며, 반성 열성 유전이고, DMD와 BMD에서 유전자 이상의 차이점은 "리딩 프래임 가설(reading frame hypothesis)"라는 가설로 설명되는데, DMD의 경우에는 유전자 이상이 리딩 프래임을 침범하여 Dystrophin 단백질이 전혀 생성되지 않는데 비해, BMD는 리딩 프래임의 침범은 없이 유전자 이상이 생기므로 비정상이기는 하지만 어느 정도 기능을 하는 Dystrophin 단백질이 생성되므로 증상이 DMD에 비해 경미하다.
원인 유전자는 DMD와 마찬가지로 X 염색체의 p21에 존재하는 Dystrophin 유전자의 결함이지만, BMD 환자의 90% 이상이 Dystrophin 유전자의 결실 때문이고 소수에서 점돌연변이(point mutation)가 원인이다.
이러한 디스트로핀병증의 발생 및 치료 개발을 위한 연구를 위해 다양한 동물모델을 사용하고 있다. 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델은 Dystrophin-결핍 mdx 마우스로, DMD 연구에 많이 활용되고 있지만 Dystrophin-결핍 mdx 마우스 모델은 비용, 안전성 및 신체 크기의 차이 등과 같은 여러 가지 이유로 마우스에서 인간으로 확장 적용하는 것이 어렵기 때문에, 마우스 모델에서의 치료 효과와 인간 환자에서 관찰되는 치료 효과 사이에 낮은 상관관계를 가진다. 따라서, 마우스는 디스트로핀병증 연구를 위한 동물 모델로 적합하지 않다. 이에 반해 개(canine) 모델은 현존하는 다른 Dystrophin-결핍 모델보다 인간 질병을 가장 유사하게 반영하므로 인간과 마우스 사이의 적절한 연결 다리가 될 수 있다.
개 X 연관 근이영양증 모델은 지난 50년간 보고되었다. 일반적으로, 개 디스트로핀병증 모델의 임상적 표현형은 설치류 모델과 비교하여 중증도 및 선택적 근육 손상도가 인간 환자와 유사하다. 개의 Dystrophin 유전자의 돌연변이는 골든 리드리버(Golden Retriever), 독일 쇼트 헤어 포인터(German Short-Hair Pointer) 및 카발리에 킹 찰스 스패니엘(Cavalier King Charles Spaniel)에서 확인되었다.
특히, 골든 리트리버 근이영양증(Golden Retriever muscular dystrophy, GRMD)은 인간 DMD에 대한 연구를 위해 가장 광범위하게 연구되어지고 있다. 하지만 골든 리트리버의 큰 크기로 인해 동물 복지, 유지 보수 및 치료와 관련된 상당히 높은 비용이 든다는 문제점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 일본에서는 GRMD의 돌연변이를 비글(Beagle)에 도입하여 개 X 연관 근이영양증(canine X-linked muscular dystrophy, CXMD)를 보이는 개체를 유지하고 있다. 이러한 CXMD는 임상적 유사성외에도 인간 환자와 유사한 조직 병변도 나타난다. 그러나 기존 품종을 사용하여 CXMD의 유전적 배경을 유지하고 실용 가능한 개체수를 늘리는 것이 어렵다는 한계점이 있다.
따라서, 이러한 한계점을 극복하고 개 디스트로핀병증 모델의 유용성을 높이기 위해, 원하는 유전자, 즉, Dystrophin 유전자의 특정 부위에 특이적 돌연변이를 유발하여 기능 상실을 초래할 수 있는 기술이 필요한 실정이다. 이에 본 발명자들은 인위적인 뉴클레아제 시스템을 이용한 Dystrophin 유전자의 변형을 통해 보다 신뢰성있으며 효율적인 디스트로핀병증 동물 모델을 개발하고 이를 활용하고자 하였다.
본 발명은 일 관점에서, Dystrophin 유전자를 넉아웃 시킨 유전자 변형 동물 모델, 바람직하게는 디스트로핀병증 개 모델에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 유전적으로 변형된 동물, 그 중에서도 Dystrophin 유전자를 넉아웃 시킨 재조합 개에 관한 것이다.
개는 디스트로핀병증 모델 동물로서의 사람의 근이영양증에서 나타나는 크레아틴 키나아제(CK) 수치 상승, Dystrophin 결핍, 골격 결손, 비정상적인 심전도 및 보행 방해와 같은 전형적인 질환의 표현형이 나타나기 때문에 디스트로핀병증에 대한 연구를 위한 가장 적합한 동물 종이라고 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 개는 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있는, 공지된 임의의 종류를 사용할 수 있다.
개(Canis lupus familiaris)는 식육목 개과에 속하는 동물로, 회색늑대(Canis lupus)의 아종이다. 개는 인간의 질병을 조사하기 위한 모델로 상당한 관심을 받고 있다. 이는 개에서 자연적으로 발생하는 450가지 이상의 질병 중 약 360가지의 질병이 인간 질병과 유사하기 때문이다. 또한, 개의 크기, 생물학적 특성, 행동 평가를 통한 의사소통 및 쉬운 취급으로 인해 개는 좋은 동물 모델로 평가된다. 더불어 인간과 개는 공통된 환경, 식품 및 발암성 부하를 공유하기 때문에, 인간 질병을 위한 유용한 모델로 사용될 수 있다.
[Dystrophin 유전자 조작 또는 변형]
본 발명의 디스트로핀병증 개 모델은 Dystrophin 유전자를 넉아웃하도록 형질전환 시켜 사용하는 것을 특징으로 한다.
Dystrophin은 근세포막 세포골격단백질의 일종으로, 3,685개의 아미노산으로 구성된 단백질이며, 가늘고 긴 구조로 N 말단측은 액틴계와, C 말단측은 디스트로핀결합단백질과 직간접으로 결합한다. Dystrophin 유전자는 X 염색체 상에 존재하며 3Mbp 염기서열로 구성된다.
상기 Dystrophin을 암호화하는 각 핵산은 당업계에 공지된 Dystrophin을 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다.
또한, 상기 Dystrophin을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예컨대, 게놈으로부터 핵산을 증폭시키기 위한 PCR 증폭, 화학적 합성법 또는 cDNA 서열을 제조하는 기술 등이 있다.
또한, 상기 핵산은 Dystrophin의 각 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다.
상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 야생형(wildtype)의 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 80％, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 Dystrophin과 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.
이때, 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해있다.
공지의 임의의 방법을 이용하여 Dystrophin 유전자를 넉아웃할 수 있고, 예를 들어, 공지의 유전자 가위를 이용할 수 있다. 예를 들어, ZFN(Zinc finger protein), TALEN(transcription activator-like effector protein), CRISPR/Cas system을 포함하는 RGEN(RNA-guided endonuclease) 등을 이용할 수 있다.
다른 구체예에서, Dystrophin 유전자의 조작은 불활성화시키기 위해 세포 또는 배아에 적용될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 세포 또는 배아는 세포 또는 배아의 염색체 표적부위에 특이적으로 결합하여, 이중가닥 DNA 파괴를 일으켜서 표적 유전자를 변형시켜 야생형(wildtype) 세포 또는 배아와 일부 유전 정보가 변형된 세포 또는 배아를 형성할 수 있도록하는 제제를 포함하는 시험관 내 세포 또는 배아이며, 상기 제제는 공지의 유전자 가위(표적화 엔도뉴클레아제) 및 재조합효소 융합 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
다른 구체예에서, Dystrophin 유전자의 조작은
예를 들어, Dystrophin 유전자의 표적화된 변화 또는 다른 원하는 폴리뉴클레오티드의 표적화된 변화를 비롯한 대상으로 하는 폴리뉴클레오티드의 표적화된 변화를 포함할 수 있다.
이러한 표적화된 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 대상으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분의 녹아웃, 대상으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분의 녹인, 내인성 핵산 서열의 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 그 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 구체적인 실시 형태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 변화되어 표적화된 게놈 변형을 형성한다.
예시적 예에서, 표적 서열은 유전자의 뉴클레오티드 서열에 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 상동성을 나타낸다.
본 발명의 Dystrophin 유전자 조작은 유전자 발현 조절 과정을 고려하여 이루어질 수 있다.
구현예에서, 전사조절, RNA 가공 조절, RNA 수송 조절, RNA 분해 조절, 번역 조절 또는 단백질 변형 조절 단계에서 각 단계에 적합한 조작수단을 선택하여 이루어질 수 있다.
구현예에서, RNAi (RNA 간섭 or RNA silencing)을 이용하여, small RNA(sRNAs)가 mRNA를 방해하거나 안정성을 저하시키며, 경우에 따라서는 파괴하여 단백질 합성정보가 중간에서 전달되지 못하게 함으로써 유전정보의 발현을 제어할 수 있다. 예시적 예에서, 발현 생성물은 Dystrophin 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적 지역을 포함하며 Dystrophin 유전자의 발현을 약화 또는 파괴하는 RNA 분자(예를들어, siRNA, shRNA, miRNA, dsRNA 등)이다.
구현예에서, DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자 내 핵산들 사이의 결합들(bonds)의 가수분해(절단(cleavage))을 촉매화할 수 있는 야생형 또는 변종(variant) 효소를 이용할 수 있다.
임의의 구체예로서, 메가뉴클레아제(meganuclease); 징크핑거(Zinc finger) 뉴클레아제;　TALE-뉴클레아제; RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN), 예를 들어, CRISPR/Cas9 (Cas9 단백질), CRISPR-Cpf1(Cpf1 단백질) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레아제를 이용하여 유전자를 조작하여 유전정보의 발현을 제어할 수 있다.
일 양태에서, Dystrophin 유전자의 비 암호 또는 암호 영역의 일부 또는 전부를 타겟팅하여 유전자 조작하는 조성물 및 방법을 제공할 수 있다.
상기 조성물 및 방법은
구현예에서, 목적하는 Dystrophin 불활성화를 위해, 이에 관여하는 Dystrophin 유전자 핵산 서열 중 일부를 조작하거나 변형시킬 수 있다. 조작 결과로서, 넉다운(knock down), 넉아웃(knock out), 넉인(knock in) 형태를 모두 포함한다.
구현예에서, 프로모터 영역, 또는 전사 서열, 예를 들어 인트론 또는 엑손 서열을 타겟으로 할 수 있다. 암호 서열, 예를 들어 암호 영역, 초기 암호 영역은 발현의 변경 및 넉아웃을 위해 표적화될 수 있다.
구현예에서, 핵산 변형은 하나 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30bp, 1 내지 27bp, 1 내지 25bp, 1 내지 23bp, 1 내지 20bp, 1 내지 15bp, 1 내지 10bp, 1 내지 5bp, 1 내지 3bp, 또는 1bp의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 및/또는 삽입일 수 있다.
구현예에서, Dystrophin 유전자 중 하나 이상 영역에서의 결실 또는 돌연변이를 포함하도록 표적화될 수 있다.
구현예에서, 유전자 넉다운은 원치않는 Dystrophin 유전자의 전사 부위가 표적화될 수 있다.
임의의 구체예에서, 엑손 영역을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 엑손 6 영역을 표적화할 수 있다.
구현예에서, 프로모터, 인핸서, 인트론, 3'UTR, 및/또는 폴리아데닐화 신호의 비 암호 서열을 표적화함으로써 Dystrophin 유전자의 발현 또는 활성을 변경할 수 있다.
상기 유전자 변형은 유전자의 전부 또는 일부 (예컨대, 하나 이상의 뉴클레오타이드)의 결실, 치환, 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입에 의한 유전자의 활성 조절, 예컨대, 불활성화를 의미하는 것일 수 있다. 상기 유전자 불활성화는 유전자의 발현 억제 또는 발현 감소 (downregulation) 또는 본래의 기능을 상실한 단백질을 코딩하도록 변형된 것을 의미한다. 또한, 유전자 조절은 타겟 유전자의 하나 이상의 엑손을 둘러싸고 있는 양쪽 인트론 부위를 동시에 타겟팅(targeting)함으로 인한 엑손 부위의 결실로 인해 얻어지는 단백질의 구조 변형, Dominant negative 형태의 단백질 발현, soluble 형태로 분비되는 경쟁적 저해제 발현 등의 결과에 의한 유전자의 기능 변화를 의미하는 것일 수 있다.
상기 유전자 변형은 유전자를 불활성화시킴으로써 이 유전자로부터 코딩되는 단백질이 본래의 기능을 갖는 단백질 형태로 발현되지 않도록 하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 유전자 변형은 표적화 엔도뉴클레아제를 포함하는 유전체 교정 시스템에 의하여 타겟된 유전자 내의 특정 부위의 단일가닥 또는 이중가닥 절단(cleavage)을 촉매화하여 타겟된 유전자를 불활성화시키는 것일 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제에 의하여 촉매되는 핵산 가닥 손상(breaks)은 상동(homologous) 재조합(recombination) 또는 비상동 말단 연결(nonhomologous end joining; NHEJ) 등의 메커니즘들을 통하여 수선될 수 있다. 이 경우, NHEJ 메커니즘이 일어나면, 절단 위치(cleavage site)에서 DNA 서열에 변화가 유발되고, 이에 의하여 유전자가 불활성화될 수 있다.
이 경우, NHEJ 메커니즘이 일어나면, 절단 위치(cleavage site)에서 DNA 서열에 변화가 유발되고, 이에 의하여 유전자가 불활성화될 수 있다. NHEJ을 통한 수선은 짧은 유전자 단편의 치환들, 삽입들 또는 결실을 야기하고, 해당 유전자 넉아웃(knockouts)의 유도에 사용될 수 있다.
상기 Dystrophin 유전자의 변형은 다음 중 하나 이상에 의하여 유도된 것일 수 있다:
1) 변형 대상 유전자 (이하, '타겟 유전자')의 전부 또는 일부 결실, 예컨대, 타겟 유전자의 1bp 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 27개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오타이드의 결실,
2) 타겟 유전자의 1bp 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 27개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오타이드의 원래(야생형)와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환, 및
3) 하나 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 7개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오타이드 (각각 독립적으로 A, T, C 및 G 중에 서 선택됨)의 타겟 유전자의 임의의 위치에의 삽입.
상기 타겟 유전자의 변형되는 일부 ('타겟 부위')는 상기 유전자 중의 1bp 이상, 3bp 이상, 5bp 이상, 7bp 이상, 10bp 이상, 12bp 이상, 15bp 이상, 17bp 이상, 20bp 이상, 예컨대, 1bp 내지 30bp, 3bp 내지 30bp, 5bp 내지 30bp, 7bp 내지 30bp, 10bp 내지 30bp, 12bp 내지 30bp, 15bp 내지 30bp, 17bp 내지 30bp, 20bp 내지 30bp, 1bp 내지 27bp, 3bp 내지 27bp, 5bp 내지 27bp, 7bp 내지 27bp, 10bp 내지 27bp, 12bp 내지 27bp, 15bp 내지 27bp, 17bp 내지 27bp, 20bp 내지 27bp, 1bp 내지 25bp, 3bp 내지 25bp, 5bp 내지 25bp, 7bp 내지 25bp, 10bp 내지 25bp, 12bp 내지 25bp, 15bp 내지 25bp, 17bp 내지 25bp, 20bp 내지 25bp, 1bp 내지 23bp, 3bp 내지 23bp, 5bp 내지 23bp, 7bp 내지 23bp, 10bp 내지 23bp, 12bp 내지 23bp, 15bp 내지 23bp, 17bp 내지 23bp, 20bp 내지 23bp, 1bp 내지 20bp, 3bp 내지 20bp, 5bp 내지 20bp, 7bp 내지 20bp, 10bp 내지 20bp, 12bp 내지 20bp, 15bp 내지 20bp, 17bp 내지 20bp, 21bp 내지 25bp, 18bp 내지 22bp, 또는 21bp 내지 23bp의 연속하는 염기서열 부위일 수 있다.
상기 Dystrophin 유전자 변형이 Cas9 단백질에 의하여 유도되는 경우, 상기 유전자 변형은 각 유전자의 염기서열 중 유래 미생물에 따른 Cas9 단백질 고유의 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 25bp, 20bp 내지 25bp, 17bp 내지 23bp, 20bp 내지 23bp, 17bp 내지 20bp, 21bp 내지 25bp, 18bp 내지 22bp, 또는 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위의 절단, 예컨대, 단일가닥 또는 이중가닥 절단, 또는 상기 절단이 수선되는 과정에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및/또는 삽입일 수 있다.
일 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NGG-3' (N은 A,T, G, 또는 C임)이다.
다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNAGAAW-3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임)이다.
다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNNNGATT-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임)이다.
다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNGRR(T)-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, (T)는 임의로 포함가능한 서열을 의미함)이다.
다른 예에서, Cpf1 단백질이 사용되는 경우, 상기 PAM 서열은 5'-TTN-3'(N은 A, T, C 또는 G임)이다.
그러므로, 본 발명의 대표적인 구현예에서는,
Dystrophin 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위를 타겟 서열 부위, 즉, 핵산 변형이 일어날 수 있는 부위를 유전적으로 변형 또는 조작함으로써, Dystrophin 유전자의 기능을 감소 또는 제거한다.
상기 타겟 서열은 Dystrophin 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 2 이상의 부위를 동시에 타겟으로 할 수 있다.
일 실시예에서는 1종의 가이드 RNA를 이용하여 Dystrophin 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위를 타겟으로 할 수 있다. 이에 의해 Dystrophin 유전자를 넉아웃 또는 넉다운할 수 있다.
일 실시예에서는 2종 이상의 가이드 RNA를 이용하여 Dystrophin 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위를 타겟으로 할 수 있다. 이에 의해 Dystrophin 유전자를 넉아웃 또는 넉다운할 수 있다.
일 구체예에서, Dystrophin 유전자의 레벨 및/또는 활성 저하는 Dystrophin 유전자를 구성하는 핵산서열의 변형, 예를 들어, 비암호화 영역, 암호화 영역, 및/또는 인트론 등에서의 변형 등에 기인할 수 있다.
이러한 Dystrophin 유전자 핵산서열 변형은 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 게놈으로의 치환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
Dystrophin 유전자 핵산서열로의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입,
Dystrophin 유전자 핵산서열로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실,
Dystrophin 유전자 핵산서열에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환,
Dystrophin 유전자 핵산서열 또는 이의 부분의 녹아웃,
Dystrophin 유전자 핵산서열 또는 이의 부분의 녹인, 내인성 핵산 서열의 이종 핵산 서열로의 치환, 또는
그 조합을 포함한 Dystrophin 유전자 핵산서열 변화를 포함할 수 있다.
따라서, 구체적인 실시 형태에서, Dystrophin 유전자의 레벨 및/또는 활성은 Dystrophin 유전자의 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 등을 파괴함으로써 저하되거나 제거될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 적어도 한 부위 이상에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 Dystrophin 유전자 핵산서열에서 변화된다. 다양한 방법을 사용하여, 추가의 표적화된 변형을 일으킬 수 있다.
임의의 구체예에서, Dystrophin 단백질의 레벨 및/또는 활성 저하는 Dystrophin 유전자의 유전자 변형(즉, 조절 영역, 암호화 영역, 및/또는 인트론 등에서의 유전자 변형)에 기인할 수 있다.
이러한 유전자 변형은 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 게놈으로의 치환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이러한 유전자 변형은 예를 들어,
Dystrophin 유전자로의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입,
Dystrophin 유전자로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실,
Dystrophin 유전자에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환,
Dystrophin 유전자 또는 이의 부분의 녹아웃,
Dystrophin 유전자 또는 이의 부분의 녹인, 내인성 핵산 서열의 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 그 조합을 포함한 Dystrophin 유전자 변화를 포함할 수 있다.
따라서, 구체적인 실시 형태에서, Dystrophin 폴리펩티드의 활성은 Dystrophin 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 파괴함으로써 저하되거나 제거될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 Dystrophin 유전자에서 변화된다. 다양한 방법을 사용하여, 추가의 표적화된 유전자 변형을 일으킬 수 있다.
[뉴클레아제 시스템]
본 발명의 대표적인 구현예에서, Dystrophin 유전자의 게놈을 변형시키기 위해 절단 뉴클레아제 시스템 또는 이러한 시스템의 성분을 이용할 수 있다. 뉴클레아제 제제로 총칭힌다. 바람직한 예에서, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN) 시스템을 이용할 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템
본 발명의 대표적인 구현예는 CRISPR 관련 뉴클레아제(nuclease) Cas9 및 서열 특이적 가이드(guide) RNA(gRNA)를 비롯한 CRISPR 시스템의 성분을 세포 내로 도입함으로써, 서열-유도된 이중 가닥 절단을 유도하는 CRISPR 시스템의 능력을 이용하여 상기 절단을 유도하는 단계를 포함한다.
CRISPR 관련 뉴클레아제 Cas9 및 서열 특이적 가이드 RNA(gRNA)를 비롯한 CRISPR 시스템의 성분은 하나 이상의 벡터, 예컨대, 플라스미드 상에 코딩된 상태로 세포 내로 도입될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템은 Cas 유전자의 발현 또는 활성 유도에 관여하는 전사물 및 다른 요소를 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은 타입 I, 타입 II 또는 타입 III 시스템일 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 핵산의 부위 특이적 절단을 위해 CRISPR 복합체(Cas 단백질과 복합체를 형성한 가이드RNA(gRNA)를 포함함)를 이용함으로써 CRISPR/Cas 시스템을 사용한다.
RNA 가이드 엔도뉴클레아제
Cas 단백질은 일반적으로 적어도 하나의 RNA 인식 또는 결합 도메인을 포함한다. 이러한 도메인은 가이드 RNA(gRNA, 이하에 더욱 상세히 기술됨)와 상호작용할 수 있다.
뉴클레아제 도메인은 핵산 절단을 위한 촉매 활성을 갖는다. 절단은 핵산 분자의 공유 결합의 파괴를 포함한다. 절단은 평활 말단 또는 스태거된 말단을 생성할 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥으로 될 수 있다.
Cas 단백질의 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e(CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9(Csn1 또는 Csx12), Cas10, Casl0d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1(CasA), Cse2(CasB), Cse3(CasE), Cse4(CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1 및 Cu1966, 및 이들의 상동체 또는 변형된 버전(modified version)을 들 수 있다.
Cas 단백질은 타입 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래 될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 Cas9 단백질이거나, Cas9 단백질로부터 유래 될 수 있다.
Cas9 단백질은 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 노카르디옵
시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스
킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)로부터 유래될 수 있다. Cas9 패밀리의 추가의 예는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2014/131833에 기재되어 있다. 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)유래의 Cas9 단백질 또는 이의 유도체는 바람직한 효소이다.
Cpf1 단백질은 Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Lachnospiraceae bacterium (MC2017), Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Smiihella sp. (SC_KO8D17), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens 등의 미생물 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, 또는 Eubacterium eligens 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Cas 단백질은 야생형 단백질(즉, 천연에서 발생하는 것), 변형된 Cas 단백질(즉, Cas 단백질 변이체) 또는 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 단편일 수 있다. Cas 단백질은 또한 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 활성 변이체 또는 단편일 수 있다. 활성 변이체 또는 단편은 야생형 또는 변형된 Cas 단백질 또는 이의 부분에 대하여, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 여기서 활성 변이체는 원하는 절단 부위에서 절단하는 능력을 보유하므로, 닉 유도 또는 이중가닥 절단 유도 활성을 보유한다. 닉 유도 또는 이중 가닥 절단 유도 활성의 측정법은 공지되어 있다.
Cas 단백질은 핵산 결합 친화성, 핵산 결합 특이성 및/또는 효소 활성을 증가시키거나 감소시키도록 변형될 수 있다. Cas 단백질은 또한 단백질의 다른 활성이나 특성, 예를 들어 안정성을 변화시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인을 변형, 결실 또는 불활성화시킬 수 있거나, Cas 단백질을 절단하여 단백질의 기능에 필수적이지 않은 도메인을 제거하거나 Cas 단백질의 활성을 최적화시킬 수 있다.
1개 또는 2개의 뉴클레아제 도메인이 결실되거나 돌연변이 되어, 더이상 기능적이지 않거나 뉴클레아제 활성 저하를 가져올 수 있다.
1개의 뉴클레아제 도메인이 결실되거나 돌연변이 되는 경우, 생성된 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)은 닉카아제(nickase)로 지칭될 수 있으며, 이중 가닥 DNA 내의 CRISPR RNA 인식 서열에서 단일 가닥 절단을 생성할 수 있다.
2개의 뉴클레아제 도메인이 결실되거나 돌연변이 되는 경우, 생성된 Cas 단백질(예를들어, Cas9)은 이중 가닥 DNA의 두 가닥을 절단하는 능력이 저하될 것이다. Cas9를 닉카아제로 전환시키는 돌연변이의 예로는 sp.Cas9의 RuvC 도메인에서의 D10A 또는 H939A 또는 H840A가 있을 수 있다.
Cas 단백질은 또한 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 절단 도메인, 후성적 변형 도메인, 전사활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인에 융합될 수 있다. 융합된 도메인 또는 이종 폴리 펩티드는 N 말단, C 말단, 또는 Cas 단백질 내부에 위치할 수 있다.
또한, Cas 단백질은 이종 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 이종 펩티드는 예를 들어, 핵을 표적화하기 위한 SV40 NLS와 같은 핵 국재화 시그널 (NLS), 미토콘드리아를 표적화하기 위한 미토콘드리아 국재화 시그널, ER 보류 시그널(retention signal) 등을 포함한다. 이러한 시그널은 N 말단, C 말단 또는 Cas 단백질 내의 어디에도 위치할 수 있다.
Cas 단백질은 또한 세포 투과성 도메인에 연결될 수 있다. 예를 들어, 세포 투과성 도메인은 HIV-1 TAT 단백질, 인간 B형 간염 바이러스 유래의 TLM 세포 투과성 모티프, MPG, Pep-1, VP22, 단순 헤르페스 바이러스 유래의 세포 투과성 펩티드, 또는 폴리아르기닌 펩티드 서열로부터 유래 될 수 있다.
Cas 단백질은 또한 추적 또는 정제를 용이하게 하기 위한 이종 폴리펩티드, 예를 들어 형광 단백질, 정제 태그 또는 에피토프 태그를 포함할 수 있다.
Cas 단백질은 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 gRNA와 복합체를 형성한 Cas 단백질과 같은 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 RNA(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA)) 또는 DNA와 같은, Cas 단백질을 암호화하는 핵산의 형태로 제공될 수 있다. 임의로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 특정 세포 또는 유기체에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있으며, 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 발현 구축물의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
가이드 RNA(gRNA)
"가이드 핵산", 즉, "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 Cas 단백질에 결합하고, 표적 DNA 내의 특정 위치의 Cas 단백질을 표적으로 하는 RNA 분자를 포함한다. 가이드 RNA는 2개의 세그먼트, 즉, "DNA 표적 세그먼트"와 "단백질 결합 세그먼트"를 포함할 수 있다. "세그먼트"는 RNA의 뉴클레오티드의 연속 스트레치와 같은, 분자의 세그먼트, 섹션 또는 영역을 포함한다. 일부 gRNA는 2개의 분리된 RNA 분자, 즉, "활성화(activator)-RNA"인 crRNA와 "표적화(targeter)-RNA"인 tracrRNA를 포함한다. 다른 gRNA는 "단일 분자 gRNA", "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로도 지칭되는 단일 RNA 분자(단일 RNA 폴리뉴클레오티드)이다.
crRNA와 대응하는 tracrRNA는 혼성화하여, gRNA를 형성한다. crRNA는 CRISPR RNA 인식 서열에 혼성화하는 단일 가닥 DNA 표적화 세그먼트를 제공한다.세포 내에서의 변형에 사용된다면, 주어진 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 완전 서열은 RNA 분자가 사용될 종류에 특이적이도록 설계될 수 있다.
주어진 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트(crRNA)는 표적 DNA의 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
gRNA의 DNA 표적화 세그먼트는 혼성화를 통해 서열 특이적으로 표적 DNA와 상호 작용한다(즉, 염기쌍 형성). 이와 같이, DNA 표적화 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 달라질 수 있으며, gRNA 및 표적 DNA가 상호 작용할 표적 DNA 내의 위치를 결정한다. 대상 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트는 표적 DNA 내의 원하는 서열에 혼성화되도록 변형될 수 있다.
DNA 표적화 세그먼트는 약 12개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 예를들어, DNA 표적화 세그먼트는 약 12개의 뉴클레오티드(nt) 내지 약 80개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 50개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 40개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 30개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 25개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 20개의 nt, 또는 약 12개의 nt 내지 약 19개의 nt의 길이를 가질 수 있다.
tracrRNA는 임의의 형태(예를 들어, 전장 tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA) 및 다양한 길이로 될 수 있다.
표적 DNA 내의 DNA 표적화 서열과 CRISPR RNA 인식 서열 사이의 상보성 비율은 적어도 60%(예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)일 수 있다.
가이드 RNA는 추가의 바람직한 특징, 예를 들어, 변형되거나 조절된 안정성; 세포내 표적화; 형광 표지를 이용한 추적; 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 결합 부위 등을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다.
이러한 변형의 예로는 예를 들어, 5' 캡(예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡(m7G)); 3' 폴리아데닐화된 테일(즉, 3' 폴리(A) 테일); 리보스위치(riboswitch) 서열(예를 들어, 단백질 및/또는 단백질 복합체에 의한 조절된 안정성 및/또는 조절된 접근성을 고려함); 안정성 제어 서열; dsRNA 이중 나선 구조(즉, 헤어핀)를 형성하는 서열 등을 포함할 수 있다.
가이드 RNA는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 2개의 분자(분리된 crRNA 및 tracrRNA) 또는 1개의 분자(sgRNA)로서의 RNA 형태 및 임의로 Cas 단백질과의 복합체 형태로 제공될 수 있다. gRNA는 또한 RNA를 암호화하는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. gRNA를 암호화하는 DNA는 단일 RNA 분자(sgRNA) 또는 분리된 RNA 분자(예를 들어, 분리된 crRNA 및 tracrRNA)를 암호화할 수 있다.
gRNA를 암호화하는 DNA는 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있으며, 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, gRNA를 암호화하는 DNA는 발현 구축물의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 인간 U6 프로모터를 이용할 수 있다.
핵산의 절단
Cas 단백질은 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트가 결합할 표적 DNA에 존재하는 핵산 서열의 내부 또는 외부의 부위에서 핵산을 절단할 수 있다.
"절단 부위"는 Cas 단백질이 단일 가닥 절단 또는 이중 가닥 절단을 일으키는 핵산위치를 포함한다. 예를 들어, CRISPR 복합체 형성은 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트가 결합될 표적 DNA 내에 존재하는 핵산 서열 또는 그 부근에(예를 들어, 상기 핵산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 이상의 염기쌍 내에) 한 가닥 또는 두 가닥의 절단을 일으킬 수 있다.
절단 부위는 핵산의 한 가닥에만 또는 두 가닥에 있을 수 있다. 절단 부위는 핵산의 두 가닥의 동일한 위치에 있을 수 있거나(평활 말단을 생성함), 각 가닥의 상이한 부위에 있을 수 있다(스태거된 말단을 생성함).
Cas9에 의한 표적 DNA의 부위 특이적 절단은 표적 DNA에서, (i) gRNA와 표적 DNA 사이의 염기쌍 형성 상보성과 (ii) PAM으로 지칭되는 짧은 모티프에 의해 결정되는 위치에서 발생할 수 있다.
PAM(Protospacer adjacent motif)은 CRISPR RNA 인식 서열에 나란히 위치할 수 있다. 임의로, CRISPR RNA 인식 서열은 PAM이 나란히 위치할 수 있다. 예를 들어, Cas9의 절단 부위는 PAM 서열의 상류 또는 하류에 약 1 내지 약 10개, 또는 약 2 내지 약 5개의 염기쌍(예를 들어, 3개의 염기쌍)으로 될 수 있다.
Dystrophin 유전자 조작을 위한 가이드 RNA
본 발명의 일 구체예에서, Dystrophin 유전자의 유전적인 조작을 위한 가이드 RNA 서열이 제공된다. 예를 들어, Dystrophin 유전자 타겟서열에 상응하는 가이드 RNA 서열이 제공된다. 예를 들어, 서열 번호 1에 기재하고 있는 가이드 RNA 서열을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, Dystrophin 유전자의 유전적 조작을 위해 타겟서열에 상응하는 가이드 RNA와 상호작용하는, 예를 들어 복합체를 형성하는 CRISPR 관련 뉴클레아제가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, Dystrophin 유전자의 상기 타겟서열 부위에서 인위적인 유전적 조작이 일어난 각 핵산 변형 산물 및 이의 발현 산물이 제공된다.
또한, 일 구체예에서, 본 발명은 Dystrophin 유전자의 타겟 부위에서의 핵산 변형을 위해 사용되는 '가이드 RNA - CRISPR 관련 뉴클레아제'의 복합체(complex)를 제공한다.
특히, 유전자로부터의 표적 부위와 상보적 결합을 할 수 있는 도메인을 포함하는 gRNA 분자, 예를 들어 단리된 또는 비천연 유래 gRNA 분자 및 이를 암호화하는 DNA를 제공할 수 있다.
또한, 2개 이상의 gRNA가 표적 핵산에서 2개 이상의 절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손을 위치시키기 위해 사용될 때, 2개 이상의 절단 사건이 동일 또는 상이한 Cas9 단백질에 의해 생성될 수 있다.
상기 gRNA 는 예를 들어,
Dystrophin 유전자에서 2 이상의 부위를 타겟으로 할 수 있고,
Dystrophin 유전자 각각에 대하여 2 이상의 부위를 타겟으로 할 수 있고,
Dystrophin 유전자의 이중 가닥 및/또는 단일 가닥 절단을 독립적으로 유도할 수 있고,
Dystrophin 유전자의 절단 부위에 하나 외부 유래 뉴클레오타이드의 삽입을 유도할 수도 있다.
또한, 본 발명의 다른 구체예로서 '가이드 RNA - CRISPR 관련 뉴클레아제'의 복합체(complex)를 구성하는 핵산은
(a) 본 명세서에 개시된 바와 같은 Dystrophin 유전자에서 타겟 부위 서열에 상보성인 gRNA 분자를 암호화하는 서열; 및
(b) CRISPR 관련 뉴클레아제를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
이때, 상기 (a)는 타겟 부위에 따라 2 이상 존재할 수 있고, (b)는 동종 또는 2종 이상의 뉴클레아제를 사용할 수 있다.
구현예에서, 핵산은 Dystrophin 유전자의 기능 또는 발현을 감소시키거나, 줄이거나 또는 억제하기 위해 넉다운 표적 위치에 충분히 가까운 효소적으로 불활성인 에디터단백질 또는 이의 융합단백질(예를 들어, 전사 리프레서 도메인 융합)을 표적화하도록 구성할 수 있다.
TALEN 시스템
TALEN은 전사 활성인자-유사(TAL) 이펙터 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인을 포함하는 단백질을 의미하며, 그 자체로 기능성인 모노머 TALEN 뿐만 아니라, 다른 모노머 TALEN과의 다이머화를 요구하는 다른 것들을 포함한다.
TALEN은 동일한 부위에서 DNA를 제거하기 위해 함께 작업하도록 조작된 한 TALEN 또는 한쌍의 TALEN들을 의미하도록 사용된다. 함께 작업하는 TALEN은 왼쪽-TALEN 및 오른쪽-TALEN으로 언급될 수 있으며, DNA 또는 TALEN-쌍의 잘쓰는 손(handedness)을 참조한다.
TALEN은 2개의 주요 진핵 DNA 수선 경로들, 비-상동 단부 결합(NHEJ) 및 상동직통 수선에 의해, 불멸의 사람 세포들의 유전자 조작을 유도한다.
일부 구현예에서, TAL 이펙터는 특정 뉴클레오티드 서열에 대하여 다른 단백질 도메인들(예를 들면, 비-뉴클레아제 단백질 도메인)을 타겟팅하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, TAL 이펙터는 제한없이, DNA 20 상호작용 효소(예를 들면, 메틸라제, 토포아이소머라제, 인테그라아제, 트란스포사제 또는 리가아제), 전사 활성인자 또는 억제인자, 또는 히스톤과 같은 다른 단백질들과 상호작용하거나 변형시키는 단백질로부터의 단백질 도메인에 결합될 수 있다. 상기 TAL 이펙터 융합의 적용예는 예를 들면 후생적 조절요소들을 생산 또는 변형시키는 것, DNA내 부위-특이적 삽입, 결실, 또는 수선을 하는 것, 유전자 발현을 조절하는 것, 및 크로마틴 구조를 변경시키는 것을 포함한다.
아연 핑거 뉴클레아제 시스템
아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)는 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 융합시킴으로써 생성된 인공 제한효소이다. 아연 핑거 도메인은 원하는 DNA 서열들을 타겟팅하기 위해 조작될 수 있으며, 이것은 아연-핑거 뉴클레아제가 복합 게놈내 특별한 서열들을 타겟팅할 수 있게 한다. 내인성 DNA 수선 기계의 잇점을 취하여, 상기 시약들은 고등 유기체의 게놈을 변형시키기 위해 사용될 수 있다. ZFN은 유전자들을 불활성화시키는 방법에 사용될 수 있다.
아연 핑거 DNA-결합 도메인은 약 30개의 아미노산들을 가지며, 안정한 구조로 접힌다. 각 핑거는 DNA 기질내에서 1차적으로 삼중체에 결합한다. 중요한 위치에서의 아미노산 잔기들은 DNA 부위와의 서열-특이적 상호작용의 대부분에 기여한다. 이들 아미노산들은 필수 구조를 보존하기 위해 남은 아미노산들을 유지하면서 변화될 수 있다.
더 긴 DNA 서열들에 결합하는 것은 여러 도메인들을 동시에 결합시킴으로써 이루어진다. 비-특이적 FokI 분열 도메인(N), 전사활성인자 도메인(A), 전사 억제인자 도메인(R) 및 메틸라아제(M)와 같은 다른 작용기들은 ZFP에 융합되어, 각각 ZFN, 아연 핑거 전사 활성인자(ZFA), 아연 핑거 전사 억제인자(ZFR), 및 아연 핑거 메틸라아제(ZFM)를 형성할 수 있다.
유전자조작 동물을 생산하기 위해 아연 핑거 및 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하기 위한 물질 및 방법들은 예를 들면, 미국특허 제8,106,255호, 미국특허 제2012/0192298호, 미국특허 2011/0023159, 및 미국특허 제2011/0281306호에 개시되어 있다.
유전자 조작용 조성물
본 발명의 일 구현예에서, Dystrophin 유전자의 유전적 조작 또는 변형용 조성물 및 이의 이용방법을 제공한다.
일 구체예에서, Dystrophin 유전자의 유전적 조작 또는 변형용 조성물은 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN) 시스템의 구성성분을 포함할 수 있다.
예를 들어, 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산 분자와 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN) 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 유전체 조작용 조성물을 제공한다.
예를 들어, (i) 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자, 또는 (ii) 상기 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자 및 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자를 포함하는, Dystrophin 유전자 불활성화 조성물을 제공한다.
예를 들어, (i) 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자,
또는 (ii) 상기 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자 및 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 발현 카세트 형태로 제공될 수 있다.
Dystrophin 유전자 넉아웃용 재조합벡터
본 발명은 일 구현예에서, Dystrophin 유전자 넉아웃시키는 디스트로핀병증 동물모델 제작용, 가장 바람직하게는 디스트로핀병증 개 모델 제작용 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 '벡터' 또는 '발현벡터'라 함은 구조유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 플라스미드벡터일 수 있다.
본 발명의 벡터는 세포 내에 도입하여 본 발명의 Dystrophin 유전자를 넉아웃시키기 위한 수단으로서 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 발현벡터를 사용할 수 있으며, 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 벡터는 Dystrophin 유전자 특정 서열을 인식하여 절단하는 활성을 가지는 유전자가위를 포함하고, 이때, 상기 유전자가위로서, Zinc finger nuclease(ZFN),Transcription activator-like effector nuclease(TALEN; 탈렌), RNA-guided engineered nuclease (RGEN) 등을 이용할 수 있지만, 가장 바람직하게는, RGEN(RNA-guided engineered nuclease)을 이용할 수 있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 유전자를 발현하는 당 분야의 프로모터를 사용할 수 있다.
'프로모터'는 전사 개시 및 속도가 조절되는 핵산 서열 영역인 조절 서열이다. 이들 프로모터는, RNA 폴리머라제 및 기타 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합하여 핵산 서열의 특이적인 전사를 개시할 수 있는 유전자 요소를 함유할 수 있다. '유효하게 배치된', '유효하게 결합된', '조절 하에' 및 '전사 조절 하에'란 용어는, 프로모터가 서열의 전사 개시 및 발현을 조절하는 핵산 서열과 관련하여 올바른 작용 위치 및/또는 배향으로 배치됨을 의미한다.
한편, 상기 Dystrophin 유전자 넉아웃 벡터는 리포터(reporter) 유전자를 포함할 수 있으며, 상기 리포터 유전자에는 리포터 시스템을 포함할 수 있다.
리포터 시스템에는 일 예로 대리 리포터가 있을 수 있으며, 대리 리포터는 유세포분리(Flow cytometry)용 대리 리포터, 자석분리(Magnetic seperation)용 대리 리포터, 항생제분리(Antibiotic selection)용 대리 리포터가 있다. 대리 리포터의 기본 구조는 CMV 프로모터를 시작으로 mRFP 유전자, 표적 염기서열, 종결 코돈(Stop codon)까지 공통 구성을 지닌다. 종결 코돈 뒤에는 대리 리포터 별로 eGFP 유전자, H-2kk 유전자, 하이그로마이신 내성(Hygromycin resistance) 유전자가 각각 삽입되어있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 선택 마커를 포함할 수 있으며, 상기 선택 마커에는 카나마이신 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자와 같은 항생제 저항성 유전자 및 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질과 같은 형광 단백질 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 벡터 내에는 단백질 분리 정제 또는 확인용 태그 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 태그 서열의 예로는 GFP, GST (Glutathione S-transferase)-tag, HA, His-tag, Myc-tag, T7-tag 등이 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 태그 서열이 제한되는 것은 아니다.
상기 Dystrophin 유전자 넉아웃용 재조합 벡터는, 개 세포에서 Dystrophin 유전자를 넉아웃시키는 돌연변이를 야기하여 디스트로핀병증을 유발할 수 있다.
핵 공여 세포로의 도입
본 발명의 일 구체예는, Dystrophin 유전자의 유전적 조작 또는 변형용 조성물을 개의 세포에 도입하는 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAEDextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 형질전환 동물 제작을 위한 세포 내로 도입할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전적 조작 또는 변형을 위해, 예를 들어, 넉아웃, 유전자 불활성화, 또는 특정 유전자의 발현을 얻기 위해, 또는 다른 목적을 위해, 세포에 다양한 핵산들이 도입될 수 있다.
핵산은 예를 들면, cDNA, 게놈 DNA, 합성(예를 들면, 화학합성된) DNA 뿐만 아니라, 자연발생 및 화학변형 핵산들, 예를 들면 합성 염기 또는 교대 백본들을 포함하는 RNA 및 DNA 둘 다 의미한다. 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다.
상기 핵산은 벡터에 포함될 수 있다.
벡터는 발현 벡터 또는 벡터 시스템을 의미할 수 있으며, 에피솜, 플라스미드, 또는 심지어 바이러스/파지 DNA 세그먼트와 같은, 게놈 또는 다른 타겟팅되는 DNA 서열로 DNA 삽입을 일으키는 데 필요한 성분들의 세트이다.
동물에서 유전자 전달을 위해 사용되는 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 비-바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
많은 다른 종류의 벡터들이 알려져 있다. 예를 들면, 플라스미드 및 바이러스 벡터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터가 알려져 있다. 포유류 발현 플라스미드는 전형적으로, 복제기원, 적당한 프로모터, 및 선택적인 인핸서, 및 임의의 필수 리보솜 결합부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 수용체 부위, 전사종결서열, 및 5'플랭킹 비-전사서열을 가진다. 벡터들의 예들은: 플라스미드(벡터의 다른 타입의 담체일 수도 있음), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스(예를 들면, 변형된 HIV-1, SIV 또는 FIV), 레트로바이러스(예를 들면, ASV, ALV 또는 MoMLV), 및 트랜스포손(예를 들면, Sleeping Beauty, P-elements, Tol-2, Frog Prince, piggyBac)을 포함한다.
일 구체예에서, 표적 핵산서열은 프로모터와 같은 조절영역에 조작가능하게 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 추가의 조절영역들을 함께 도입할 수 있다. 폴리아세틸화 서열, 해독조절서열들(예를 들면, 내부 리보솜 유입 세그먼트, IRES), 인핸서, 유도성 요소들 또는 인트론들을 포함하며, 여기에 국한되지 않는다.
일 구체예에서, 신호 펩티드 또는 선택가능한 마커들을 인코딩하는 핵산 구조물들이 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 외인성 핵산은 폴리펩티드를 인코딩한다. "tag"를 인코딩하는 tag 서열을 포함할 수 있다.
상기 핵산은 non-viral 벡터 전달 방식으로 전달될 수 있다.
예를 들어, mRNA형태의 Cas9과 sgRNA를 지질 나노 입자에 패키지하여 전달할 수 있다. 음이온을 띠는 CRISPR/Cas9을 이루는 DNA 혹은 핵산은 양이온을 띠는 물질들과 electrostatic하게 결합(electrostatically complexed)하여 나노입자 (nanoparticles)를 형성할 수 있고, 이는 세포로 receptor-mediated endocytosis 혹은 phagocytosis 등으로 침투할 수 있다. 핵산을 전달함에 있어 가장 널리 알려진 양이온 물질에는 천연 폴리머(naturally-occurring polymer), 합성 폴리머(synthetic polymer) 그리고 지질(lipids)이 있다.
예를 들어, Cas9/sgRNA 복합체(Complex)의 형태로 전달할 수 있다.
Cas9 단백질과 sgRNA를 투여 전에 RNP(ribonucleoprotein)형태로 만든 후에 리포좀(liposome)과 같은 전달물질을 이용하여 원하는 세포로 전달하는 방법이다. RNP 형태는 세포 내로 전달과 동시에 발현하여 앞서 말한 mRNA 형태로 전달하였을 때 단백질로 translate 되기까지의 지체가 없고 발현이 일시적인 장점이 있다. sgRNA와 Cas9 단백질을 RNP complex 형태로 세포에 도입함으로써 Active Cas9 protein 상태로 도입하게 되므로, 보다 빠르고 오프 타겟 효과(off-target effect)를 최소화한 에디팅(editing)이 가능한 장점이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 sgRNA와 Cas9 단백질을 RNP(Ribonucleoprotein) 복합체 형태로 개의 세포에 도입하였다.
일 구체예에서, 본 발명은 불활성화된 또는 제거된 Dystrophin 유전자를 가진 개 세포를 제공할 수 있다.
예를 들어, Dystrophin 넉아웃용 조성물을 포함하는 재조합 벡터를 핵 공여 세포로 도입하는 방법 및 상기 재조합 벡터가 도입된 세포에 관한 것이다.
예를 들어, Dystrophin 넉아웃용 조성물을 포함하는 RNP 복합체를 핵 공여 세포로 도입하는 방법 및 상기 RNP 복합체가 도입된 세포에 관한 것이다.
일 구체예에서, 상기 세포는 개의 배아세포, 체세포 또는 줄기세포일 수 있다.
임의의 구체예에서, 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 또한, 다양한 기원 조직으로부터 유래된 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 자궁, 골수, 근육, 태반, 제대혈 또는 피부(상피) 등의 조직 유래 줄기세포를 사용할 수 있다. 비-인간 숙주 배아는 일반적으로 2-세포 단계, 4-세포 단계, 8-세포 단계, 16-세포 단계, 32-세포 단계, 64-세포 단계, 상실배, 또는 배반포를 포함하는 배아일 수 있다.
보다 바람직하게는, 태아 유래 세포 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있다. 가장 바람직하게는, 개의 태아 및 성체에서 분리한 섬유아세포를 이용한다. 이 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다.
핵 공여 세포로서 제공되는 상기 배아세포, 체세포 또는 줄기세포는 당업계에 공지되어 있는 통상적인 방법을 사용하여 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 Dystrophin 유전자가 결핍된 디스트로핀병증 개 모델 제작용의 Dystrophin 유전자 넉아웃용 RNP 복합체로 형질전환된 핵 공여 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.
적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용 가능한 배지를 사용할 수 있다.
상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 일반적으로 배양에 이용되는 기본 배지로는 MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)이 있으며, 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지라면 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게는, α-MEM 배지(GIBCO), K-SFM 배지, DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), DMEM/F12 배지, PCM 배지, M199/F12(mixture)(GIBCO), 및 MSC 확장배지(Chemicon)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
이러한 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다.
당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 적합한 배지를 선택 또는 조합하여 공지의 방법으로 적절히 배양할 수 있음은 자명할 것이다. 또한, 이 분야의 통상의 지식에 기초하여 적합한 배양 환경, 시간, 온도 등의 조건을 조절하면서 배양할 수 있음은 자명하다.
[형질전환 동물]
본 발명은 일 구체예로서, Dystrophin 유전자 넉아웃용 RNP 복합체가 도입된 핵 공여 세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 산자를 생산함으로써, Dystrophin 유전자을 넉아웃 시킨 디스트로핀병증 모델용 형질전환 개의 제조방법 및 이에 의해 제조된 디스트로핀병증 모델용 개에 관한 것이다.
임의의 구현예에서, Dystrophin 단백질 발현이 불활성화된 개를 생산하기 위해, 적합한 조건하에서 배아를 임신시킬 수 있다.
예를 들어, 형질전환된 개의 체세포를 사용하여 상기의 체세포핵 이식법(SCNT)을 이용할 수 있다.
임의의 구체예에서, 본 발명은, Dystrophin 유전자를 넉아웃시킨 형질전환 세포주를 이용하여 체세포 핵이식 방법(somatic cell nuclear transfer, SCNT)으로 본 발명의 디스트로핀병증 모델 복제동물을 생산한다.
일 구체예를 들어, 본 발명의 디스트로핀병증 모델용 개 생산방법은,
(a) 개의 조직으로부터 분리한 체세포 또는 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 핵 공여 세포 제조단계;
(b) Dystrophin 표적화 뉴클레아제(유전자가위)를 상기 핵 공여 세포에 도입하는 단계;
(c) 개의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 탈핵 난자에 (b) 단계의 핵 공여 세포의 핵을 미세주입하고 융합시키는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 단계;및
(f) 상기 활성화된 난자를 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함할 수 있다.
각 단계에 관한 통상적 기술 내용은 당업계에 공지되어 있는 종래의 체세포 핵이식 기술을 이용한 복제 동물의 제조방법 등을 참조하여 이해할 수 있을 것이다.
일 구체예로서, Dystrophin 유전자를 넉아웃시키는 조성물로 형질전환된 개 유래 체세포, 배아세포 또는 줄기세포의 핵을, 탈핵된 난자에 이식하여 형성된 개의 핵 이식란 제조방법 및 이에 의해 제조된 핵 이식란을 제공할 수 있다.
다른 구체예로서, 상기 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하여 산자를 생산하는 단계를 포함하는 Dystrophin 유전자를 넉아웃 시킨 디스트로핀병증 모델용 형질전환 개의 제조방법 및 이에 의해 제조된 Dystrophin 유전자가 넉아웃 된 것을 특징으로 하는 디스트로핀병증, 예를 들어 DMD 및/또는 BMD 질환 모델용 개를 제공한다.
임의의 구체예에서, 본 발명은 유전자조작 동물의 생산방법을 포함하며,
상기 방법은 배아 또는 세포를 타겟팅 뉴클레아제(예를 들면, 메가뉴클레아제, 아연 핑거, TALEN, RGEN, 재조합효소 융합 분자들)에 노출시키는 단계,
대리모내 세포를 클로닝하거나, 대리모내 배아들을 이식하는 단계를 포함하며, 상기 타겟팅 뉴클레아제는 배아 또는 세포내 표적 염색체 부위에 특이적으로 결합하여 세포 염색체에 변화를 일으키며, 대리모는 표적 염색체 부위에서 유전자조작된 동물을 임신시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에서의 Dystrophin 유전자 넉아웃 된 형질전환 개의 유전자 발현 분석을 통해 뉴클레오티드의 손실, 삽입 또는 point 돌연변이가 일어난 것을 확인하였다.
상기의 Dystrophin 유전자 넉아웃이 확인된 형질전환 개의 세포를 이용하여 재복제를 통해 모두 Dystrophin 유전자가 넉아웃된 디스트로핀병증 모델용 개를 생산한다.
재복제의 방법은 제한이 없으나, 예를 들어, 형질전환 된 개의 체세포를 사용하여 상기의 체세포핵 이식법(SCNT)을 이용할 수 있다.
[용도]
본 발명의 일 구체예는 Dystrophin 유전자의 핵산서열 내 변형에 의해 Dystrophin 유전자가 넉아웃된, Dystrophin 단백질 발현이 불활성화된 개의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 Dystrophin 유전자 넉아웃 된 디스트로핀병증 모델용 형질전환 개는 교배를 통해 산자 생산이 가능하며, 후대로 상기 외부 유전자의 전달이 가능하다.
그러므로, 본 발명의 Dystrophin 유전자가 넉아웃 된 것을 특징으로 하는 개는 용이한 재현 가능성을 장점으로 가지고 있는 바, 디스트로핀병증 동물 모델로서 매우 유용하다.
즉, 본 발명의 디스트로핀병증 모델 개를 이용하여 디스트로핀병증 유발여부를 확인할 수 있으며, 디스트로핀병증 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발 등 다양한 활용이 가능할 것이다.
그러므로, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제작한 디스트로핀병증 모델용 개의 다양한 용도를 포함한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 동물모델은 디스트로핀병증을 치료하거나 예방하는데 필요한 연구에, 예를 들어 피험 약제를 스크리닝하는 방법으로 사용될 수 있다.
일 구체예로서, 본 발명의 상기 스크리닝 방법은
1) 디스트로핀병증 모델 개에 디스트로핀병증 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계;
2) 후보물질 투여 후, 상기 개의 조직을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물,세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 화합물은 신규 화합물이어도 되고, 널리 알려진 화합물이어도 된다. 이러한 후보 물질은 염을 형성하고 있어도 된다.
상기와 같은 후보 물질을 투여하는 방법으로는 예를 들면, 경구투여, 정맥주사, 피하투여, 피내투여 또는 복강 투여 등 중에서 대상 동물의 증상, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다. 또한, 후보 물질의 투여량은 투여 방법 또는 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다.
이처럼, 본 발명은 디스트로핀병증에 대해 인간 환자와 가장 유사한 병리적 특징을 보이는 개를 이용한 디스트로핀병증 동물 모델 및 이의 다양한 용도를 제공함으로써 디스트로핀병증 치료기술 개발 및 실용화에 매우 유용할 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
재료 및 방법
1. 동물
본 발명에서는 2 ~ 4년생의 암컷 잡종된(mixed) 개들을 난자공여자와 배아 수령자로 사용하였다. 개들은 실내에서 생활하였고 하루에 한번 물을 자유롭게 먹게 하였다. 모든 동물 실험과 수술 과정은 서울대학교에서 출판된 "실험 동물의 관리와 사용 안내서"에 따라 수행되었다.
2. CRISPR / Cas9의 생성
His 태그된 Cas9을 코딩하는 pET 플라스미드를 BL21(DE3)으로 형질전환시켰다. Cas9의 발현은 25℃에서 4시간 동안 0.5mM IPTG를 사용하여 유도하였다. Cas9 단백질은 Ni-NTA 아가로스 수지(Qiagen)를 사용하여 정제하였고 20mM HEPES(pH 7.5), 150 mM KCl, 1 mM DTT 및 10 % 글리세롤에 대해 투석하였다. RNA는 T7 RNA 중합효소에 의한 run-off 반응을 통해 생체외에서 전사되었다. sgRNA의 주형은 2 개의 상보적인 올리고 뉴클레오타이드의 풀림과 연장에 의해 생성되었다. 전사된 sgRNA를 DNase I와 사전배양하여 주형 DNA를 제거한 후, PCR 정제키트 (Macrogen)를 사용하여 정제하였다. 정제된 RNA를 분광법으로 정량화하였다.
3. 세포배양 및 형질감염
개 태아 섬유아세포는 27일 태아 기저부의 몸통에서 유래되었으며, 10% FBS가 함유된 DMEM(Gibco)에서 배양하였다. Cas9 및 sgRNA를 전기천공법을 사용하여 개 태아 섬유아세포에 공동 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 12웰 플레이트로 옮기고, 추가로 증식시켰다.
4. In vivo 성숙 난모세포 수집
질 출혈이 처음 나타난 후, 두부 정맥에서 매일 혈액을 채취하고 10분 동안 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 프로게스테론 농도는 IMMULITE 1000(Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Flanders, NJ, USA)으로 모니터링 하였다. 프로게스테론 농도가 4.0 ng/ml에서 10.0 ng/ml에 도달한 날을 배란일로 간주하였다. 배란 72시간 후, 생체 내 성숙 난모세포는 10% 소혈청 알부민과 2mM NaHCO3가 들어간 HEPES-완충된 조직 배양액-199 (TCM, Invitrogen)을 사용하여 난관 플러싱하여 수집하였다.
5. 체세포 핵 이식과 배아 이식
난구세포(Cumulus cells)는 0.1% 히알루로니다아제가 포함된 조직 배양액-199에서 부드러운 피펫팅으로 채취한 성숙한 난모세포로부터 제거하였다. 중기 염색체와 압출된 첫번째 극체를 자외선 하에서 사이토칼라신 B와 Hoechst 33442가 포함된 HEPES-완충된 TCM 용액에 흡인함으로써 제거하였다. 단일 공여세포를 난모세포의 난황 주위공간(perivitelline space)에 삽입 하였다. 각각의 공여세포-세포질 간 한 쌍은 Electro-Cell Fusion 장치(NEPA GENE Co., Chiba, Japan)를 사용하여 15㎲동안 DC 72 V의 두 펄스와 융합시켰다. 융합된 배아는 10μM 칼슘 이오노포어(Sigma-Aldrich Corp)가 포함된 변형된 합성 난관 배양액(modified synthetic oviductal fluid, mSOF)에서 활성화시켰다. 4분 동안 화학 활성화 후, 복제된 배아를 1.9mM 6-디메틸아미노퓨린(dimethylaminopurine)이 포함된 40㎕ mSOF로 이동시켜 2시간 동안 유지하였다. 재구성된 복제 배아는 동기화된(synchronized) 수령자의 난관으로 옮겨졌다. 전신 마취하에 개복술 후 3.5 Fr Tom-Cat 카테터 (Sherwood, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 난관의 팽대부에 배아를 위치시켰다.
6. T7 엔도뉴클레아제 I 시험 및 시퀀싱
게놈 DNA는 게놈 분리키트(Promega, Madison, USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 분리하였다. PCR 증폭물을 95℃에서 변성시킨 후 thermocycler를 이용하여 16℃에서 재조합하여 heteroduplex DNA를 만들고 37℃에서 20분 동안 T7 엔도뉴클레아제 1(New England Biolabs, Ipswich, MA)의 5 유닛과 함께 다이제스트한 후 아가로스 젤 전기영동으로 분석하였다.
7. 딥 시퀀싱 분석
게놈 DNA는 복제된 강아지의 형질전환된 세포와 꼬리 조직으로부터 분리하였다. 표적 부위는 Phusion polymerase(New England Biolabs)를 사용하여 증폭시켰다. PCR 증폭물의 동량을 Bio Medical Laboratories의 Illumina MiSeq을 사용하여 페어드 엔드 리드 시퀀싱(paired-end read sequencing)을 수행하였다. RGEN 절단 부위 주변(PAM의 3bp 상류)에 삽입 또는 결실된 것들은 RGEN에 의해 유도된 돌연변이로 간주하였다.
8. 크레아틴 키나아제( Creatinine kinase , CK)
CK 분석을 위한 혈액 샘플은 출생 10일 후 경정맥에서 수득하였다. 샘플은 8주까지 1주 간격으로 수집하였다. 샘플링 전에 운동을 제한하지 않았다. 생화학 분석은 IDEXX Catalyst Dx(IDEXX VetLab Analyzers, Westbrook, Maine, USA)으로 수행하였다. 정상적인 기준 범위는 99- 436U/L이다.
9. 자기공명영상(Magnetic Resonance Imaging)
1) 마취
개를 배등 양면의(ventrodorsal) 횡와(recumbency)에 위치시키고 글리코피롤레이트(glycopyrrolate)(Mobinul, Myungmoon Pharmaceutical Co., Seoul, Korea) 0.05 mg/kg을 미리 약물 투여하였다. 마취제는 0.06mg/kg 프로포폴(Provive, Myungmoon Pharmaceutical Co.)을 정맥 내로 투여하고 기관 내 삽관으로 100% 산소에 1.5% 아이소플루레인(isoflurane)(Foran 용액, 중외 제약, 서울)과 함께 마취시켰다. 심박수, 호흡수 및 호흡종기(end-tidal) CO2 농도를 모니터링(MRI 환자 모니터, GE Medical System, Milwaukee, WI, USA) 하였다.
2) 비정량 (기존) MR 영상(Non-quantitative (conventional) MR imaging)
MRI 검사는 8 채널 수신기 코일(HD Knee PA 코일, GE Medical Systems)을 사용하는 1.5 테슬라 스캐너 (Signa HDx, GE Medical Systems, Milwaukee, USA)로 수행되었다. MRI 획득 평면(plane)과 매개 변수는 하단의 표 1(이때, CE는 contrast enhanced, FSE는 fast spin echo, FOV는 field of view)에 정리하였다. 지방이 억제되어 있는 T1-가중 영상(T1-weighted images)과 T2-가중 영상(T2-weighted images)을 해부학적 기준과 뒷다리 근육의 손상을 각각 측정하였다. T1-가중 시퀀스(T1-weighted sequence)의 대조 연구를 위해 정맥주사로 0.1 mmol/kg Gadolinium(Magnevist, Bayer Korea, Seoul, Korea)을 주입하였다.
MRI 시퀀스의 매개변수
T1 Axial T1 Axial CE T2 Coronal T2 Axial T2 IDEAL
Sequence FSE FSE FSE FSE FSE
FOV(cm) 18×18 18×18 18×18 18×18 18×18
Slice thickness(mm) 3 3 3 3 3
Interslice gap(mm) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Relaxation time(ms) 759 1478 4315 5313 7313
Echo time(ms) 10.1 10.1 71.6 71.8 66.6
Matrix 256×192 256×192 256×192 256×192 256×224
Nex 4.00 4.00 4.00 4.00 3.00
3) 정량적 (T2 맵핑 ) MR 영상(Quantitative (T2 mapping) MR imaging)
축 방향 T2 맵은 다중에코(multiecho) 시퀀스에 의해 획득되었다. 영상 파라미터는 다음과 같다 : FOV, 18 × 18 mm; 슬라이스 두께, 5 mm; 절편간 간격 (interslice gap), 0.3mm; 휴식 시간, 1000 ms; 에코 시간(ms), 7.4, 14.8, 22.2, 29.6, 37, 44.4, 51.7, 59.1; 매트릭스, 256 × 192; 넥스(Nex), 2. 두 명의 방사선과 의사(JH Kim 및 KD Eom)가 대퇴골 중간 정도에서 각 뒷다리 근육의 T2 값을 계산하였다. ROI의 크기는 개별 근육 크기를 고려하여 약 5 mm2로 고정하였다. 대퇴 직근(rectus femoris), 외측광근(vastus lateralis), 내측광근(vastus medialis), 대퇴이두근(biceps femoris), 반힘줄근(semitendinosus), 반막양근(semimembranosus) 및 대내전근(adductor magnus)을 포함한 7개의 근육 각각의 T2 값의 평균 및 표준 편차를 얻었다.
10. 부검 및 조직 병리학적 분석(Necropsy and histopathological analysis)
대퇴이두근(biceps femoris) 근육의 생검을 위해, Dystrophin 넉아웃 개와 대조견에 케타민(ketamine)과 실라진(xylazine)을 정맥주사하여 마취시키고, 마취는 이소플루란(isoflureane)으로 유지하였다. 개를 좌측면 횡와(recumbency)에 위치시키고, 생검 부위를 무균 상태로 준비하였다. 3cm로 피부절개 후 오른쪽 대퇴이두근 근육 (1cm × 1cm × 0.5cm) 샘플을 각가의 개에서 얻었다. 즉시, 생검물은 액체 질소로 사전 냉각된 이소펜탄(isopentane)에서 급속 냉동시켰다. 조직 화학 염색 및 반응의 표준 패널은 5 ㎛로 근육 냉동절편(cryosection)을 만들었다. 추가적인 냉동절편은 Dystrophin의 카르복시 말단, 로드(rod) 도메인 및 utrophin Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, UK)에 대한 단일클론항체를 사용하여 면역조직화학 염색(IHC)을 위해 사용하였다.
11. 웨스턴 블로팅
Dystropin 넉아웃 개와 대조견의 각 근육 샘플에서 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질 농도를 측정한 후, 동량의 단백질을 10% SDS-PAGE로 분해하고 니트로 셀룰로오스 멤브레인(Hybond; Amersham Biosciences)으로 옮겼다. 멤브레인은 5% 분말 탈지유가 포함된 Tris-완충 식염수 Tween(TBST)에서 1 시간 동안 블로킹하고, 1차 항체, 즉, anti-dystrophin NCL-DYS1 (1:500, Novocastra Laboratories, Newcastle, UK), anti-dystrophin NCL-DYS2 (1:100, Novocastra Laboratories), and anti-utrophin NCL-DRP (1:100, Novocastra Laboratories)와 함께 밤새도록 인큐베이션하였다. FUSION-Solo(6x, Vilber Lourmat, France)의 이미징 시스템을 사용하여 결합된 항체를 검출하기 위해 HRP(Horseradish peroxidase) 콘쥬게이티드 2차 항체(1:3000, Santa Cruz Biotechnologies, Piscataway, NJ)를 사용하였다.
실시예 1. sgRNA 설계
디스트로핀병증 개 모델을 제조하기 위해, 먼저 개 Dystrophin 유전자를 표적하는 sgRNA를 설계하였다. 개 Dystrophin 유전자의 엑손 6을 표적하도록 sgRNA를 설계하였다. Dystrophin 유전자 돌연변이는 엑손 2 - 20에서 가장 흔하게 나타나며, Dystrophin 유전자 돌연변이의 나머지 약 7%는 단일 또는 다중 엑손 중복에 의해 유발된다. GRMD와 CXMD 모델은 엑손 6의 스플라이스 수용체에 돌연변이가 발생하여 프래임 시프트가 일어나 엑손 7을 파괴하므로, 엑손 6에서 유발된 돌연변이는 개 디스트로핀병증 모델에 치료 효과를 줄 수 있을 것으로 사료된다.
sgRNA가 표적하는 Dystrophin 유전자의 특정 서열(서열번호 1)은 다음과 같다.
표적 서열(서열번호 1)
5'-GAAATTAATACGACTCACTATAG-3'
가이드 핵산(서열번호 2)
5'-GAAATTAATACGACTCACTATAG(Target Sequence 20bp)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT-3'
sgRNA의 효율은 수컷 개 태아 섬유아세포에 Cas9 벡터와 함께 형질 감염시켜 확인하였다. 일시적으로 GFP를 발현하는 섬유아세포를 공여세포로 사용했다.
실시예 2. 체세포 핵 이식을 통한 Dystrophin 넉아웃 개 생성
앞서 Cas9/sgRNA가 배양된 세포에서 높은 활성을 확인한 후, Dystrophin 넉아웃 개의 생성을 위해 체세포 핵 이식(SCNT)을 수행하였다. 생체 내에서 성숙된 난모세포를 적출하여 공여세포를 주입하고 전기자극으로 융합시켰다. 융합된 한쌍ckouplet)은 10μM 칼슘 이오노포아(ionophore)와 6-DMAP로 활성화되었으며, 총 26개의 재건된 난모세포가 자연적으로 동기화된(synchronized) 3명의 대리모로 전달되었다. 대리모 중 한 마리가 임신(33.33 %)하였고, 강아지 한 마리를 (3.85 %)을 출산하였다(도 1). T7E1 분석을 위한 표적 dystrophin 유전자 좌(locus)의 게놈 돌연변이를 검출하기 위하여 복제된 강아지의 꼬리조직은 수집하였고, 출생 후 이틀 후에 딥 시퀀싱을 수행하였다. 이 강아지의 게놈으로부터 증폭된 PCR 산물은 딥 시퀀싱으로 동정하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 강아지의 Dystrophin 유전자에서 표적 위치의 57 bp 결실이 발생하였음을 확인하였다.
실시예 3. Dystrophin 넉아웃 개의 크레아틴 키나아제(CK) 활성 평가
다음으로, Dystrophin 넉아웃 개가 디스트로핀병증 환자와 유사한 임상 결과를 공유하는지 측정하였다.
일반적으로 사람 DMD 환자와 GRMD 개는 혈청 크레아틴 키나아제(CK) 활성이 현저히 증가한다고 알려져 있다. CK의 증가는 근본적인 근육질환의 조기지표가 될 수 있기 때문에 CK 측정은 어린 개의 사전 중성평가에 중요하다. 이에 Dystrophin 넉아웃 개의 CK 수준을 출생 후 2주부터 8주까지 측정하였고, 이때, 연령 일치 대조군의 CK 수준도 동일하게 측정하였다. 그 결과, 수컷 대조군은 정상범위(300U/L) 수준의 CK 값을 보인 반면에, Dystrophin 넉아웃 개의 경우 급격히 증가한 5,200U/L 수준의 CK 값 보였다(도 3).
또한, 운동 30분 후, Dystrophin 넉아웃 개의 CK 수준이 300배 이상 증가하였다. 이에 비해 운동 전후 대조군은 약간의 변화만 있었다(도 4).
실시예 4. Dystrophin 넉아웃 개의 자기공명영상(MRI)
앞선 실시예를 통해 CK 수준의 증가가 확인된 Dystrophin 넉아웃 개를 자기공명영상(MRI)을 촬영하여 디스트로핀병증 임상 양상을 조사하였다. 골격근을 확인하기 위해, 5개월된 Dystrophin 넉아웃 개의 MRI를 획득하였다(도 5).
그 결과, T2-가중(T2-weighted) 및 T2 지방 억제 시퀀스에서 넓게 퍼진 심각한 손상 부위가 확인되었고, 특히 대퇴 직근(rectus femoris) 및 대내전근(adductor magnus)에서 발견되었다. T1-가중(T1-weighted) 영상에서, 대퇴 직근에서 대퇴 위축과 강한 조영 증강(contrast enhancement)이 관찰되었다. 그에 반해 대퇴이두근(biceps femoris), 반힘줄근(semitendinosus) 및 반막양근(semimembranosus)은 상대적으로 연관성이 없는 경향을 보였다. T2 값은 대조군과 Dystrophin 넉아웃 개의 T2 맵핑을 이용하여 획득하였다(도 6). Dystrophin 넉아웃 개의 평균 T2 값은 38.7±1.9로 대조군(38.7±1.9)보다 현저하게 높았다. 특히, 대퇴 직근(대조군 38.1, Dystrophin 넉아웃 개 62.7)과 대내전근(대조군 40.3, Dystrophin 넉아웃 개 49.3)을 포함하는 전 내측 뒷다리 근육(anterior-medial hindlimb muscle)에서 대조군과 Dystrophin 넉아웃 개 사이에 유의한 차이를 확인하였다. 대조적으로 대퇴이두근, 반힘줄근 및 반막양근을 포함하는 뒷다리 근육은 유의한 차이를 보이지 않았다.
이와 같은 MRI 결과는 허벅지 근육에 최소한의 지방 대체를 포함하는 부종성 병변 및 뚜렷한 염증 존재와 관련하여 디스트로핀병증을 가지는 환자와 유사한 결과로, 특히 DMD를 가진 어린 소년의 결과와 유사하다. MRI 분포와 패턴이 초기 DMD 소년의 것과 매우 유사하기 때문에 질병이 진행됨에 따라 근육위축과 지방침투가 발생할 수 있다.
실시예 5. 디스트로핀병증 모델로서의 Dystrophin 넉아웃 개
일반적으로 디스트로핀병증 환자는 종종 비정상적인 ECG가 관찰되며, 말기 환자의 경우 확장된 심근 병증을 가지며 이로 인해 심장 마비로 사망한다.
효과적인 디스트로핀병증 모델로서 Dystrophin 넉아웃 개를 확립하기 위해, 대조군과 Dystrophin 넉아웃 개에서 심전도(electrocardiogram, ECG) 분석을 수행하였다. 그 결과, 5개월 된 Dystrophin 넉아웃 개와 연령 일치 대조군은 유사한 ECG 패턴을 보였다. 하지만 5개월 후의 심전도 결과에서 Q 웨이브는 대조군에 비해 Dystrophin 넉아웃 개에서 더 깊게 나타났다(도 7). 이러한 ECG 변화는 인간 디스트로핀병증에서는 잘 나타났지만, Dystrophin 넉아웃 개 연구에서는 거의 보고되지 않았다.
또한, 5개월 된 Dystrophin 넉아웃 개의 걷기 또는 운동 관련 변화를 관찰하였다. 그 결과, Dystrophin 넉아웃 개는 6개월부터 "토끼 뛰기(bunny hopping)"를 보여주기 시작했지만, 시간이 지남에 따라 다리가 뻣뻣해지고 관절 움직임의 범위가 감소하였으며 강한 토끼 뛰기, 계단 오르기 어려움 및 운동 회피가 관찰되었다.
일반적으로 치료받지 않은 DMD 환자에서 보행 장애는 대개 10대 초반에 발생한다. 인간 DMD와 달리, 보행의 완전한 상실은 어린 DMD 개에서는 임상적인 특징이 아니다. 본 연구에서도 10개월 된 Dystrophin 넉아웃 개는 운동을 꺼려하고 다리 근육위축을 보였으나 보행의 완전한 상실을 보이지 않았으나 향후 지속적인 관찰을 통해 보행의 완전한 상실 여부를 확인고자 한다.
실시예 6. 디스트로핀병증 모델로서의 Dystrophin 넉아웃 개의 병리학적 특징
앞서 Dystrophin 넉아웃 개가 디스트로핀병증 환자와 유사한 임상 증상을 보이는 것을 확인하였다. 이에 Dystrophin 넉아웃 개가 디스트로핀병증 환자와 유사한 병리학적 특징을 보이는지 확인하고자 하였다. 이를 위해 6개월 된 Dystrophin 넉아웃 개와 대조군의 대퇴이두근을 검사하였다. 그 결과, 근육 병리 조직 검사에서 경미한 섬유 크기의 변화, 근섬유 괴사 및 국소 근육의 재생산을 확인하였다(도 8). 또한, Western blots 결과 Dystrophin 1과 Dystrophin 2는 대조군의 근육조직에서는 발현되었지만 Dystrophin 넉아웃 개에서는 거의 발현되지 않음을 확인하였다(도 8). Utrophin은 대조군에 비해 Dystrophin 넉아웃 개에서 확연히 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 인간 디스트로핀병증의 병리학적 특징과 유사하다.
이와 같이 상기의 결과는 Dystrophin 넉아웃 개의 임상 및 병리적 특징이 인간 디스트로핀병증 진단과 일치함을 보여준다. 따라서, 본 발명을 통해 CRISPR/Cas9에 의해 형질전환된 공여세포의 핵 이식을 통해 Dystrophin 넉아웃 개를 효율적으로 생산할 수 있음을 증명하였고, 또한 Dystrophin 넉아웃 개의 CK상승, Dystrophin 결핍, 골격 결함, 비정상적인 ECG 및 보행의 회피와 같은 많은 특징이 인간 디스트로핀병증과 일치함을 확인하였다. 그러므로 Dystrophin 넉아웃 개는 디스트로핀병증을 연구하기 위한 적합한 동물 모델로서 디스트로핀병증의 새로운 치료 및/또는 치료제 개발을 위한 디스트로핀병증 동물 모델로 유용하게 이용될 수 있다.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION <120> Generation of canine dystrophinopathy model by nuclear transfer using CRISPR/Cas9-mediated somatic cells and th Use thereof <130> CP17-232 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Canidae <400> 1 gaaattaata cgactcacta tag 23 <210> 2 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> guide nucleic acid <400> 2 gaaattaata cgactcacta taggttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 60 gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct ttttt 105

Claims (18)

  1. Dystrophin 유전자의 엑손 6 영역 핵산서열 내에서 서열번호 1로 표시되는 염기서열 및/또는 이에 상보적인 염기서열의 변형에 의해 Dystrophin 유전자가 넉아웃된,
    Dystrophin 단백질 발현이 불활성화된, 디스트로핀병증(Dystrophinopathy) 개 모델.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 핵산서열 내 변형은 하나 이상의 핵산의 결실, 치환, 삽입 또는 역위를 포함하는 것을 특징으로 하는 디스트로핀병증 개 모델.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 핵산서열 내 변형은 뉴클레아제 제제에 의해 인위적으로 일어난 것을 특징으로 하는 디스트로핀병증 개 모델.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 뉴클레아제 제제는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)인 것을 특징으로 하는 디스트로핀병증 개 모델.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 Dystrophin 유전자는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제에 의해 유전적으로 조작되고,
    상기 Dystrophin 유전자를 구성하는 핵산서열 내 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열 중 또는 이의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 3bp 내지 25bp의 염기 서열 부위 내의
    하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입;
    야생형 유전자와 상이한 하나 이상의 뉴클레오타이드로의 치환;
    외부 유래의 하나 이상의 뉴클레오타이드 삽입
    중 하나 이상의 핵산의 변형
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 디스트로핀병증 개 모델.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제가 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질이고, 상기 PAM 서열이 NGG(N은 A, T, C 또는 G임)인 것을 특징으로 하는 디스트로핀병증 개 모델.
  8. 제1항에 있어서,
    디스트로핀병증은 디스트로핀-결핍 근이영양증(dystrophin-deficient muscular dystrophy)인 것을 특징으로 하는 디스트로핀병증 개 모델.
  9. 제1항에 있어서,
    디스트로핀병증은 Duchenne 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy, DMD) 및/또는 Becker 근이영양증(Becker muscular dystrophy, BMD)인 것을 특징으로 하는 디스트로핀병증 개 모델.
  10. Dystrophin 유전자를 구성하는 핵산서열 중 1 이상의 부위에 상보적인 결합을 형성할 수 있으며, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 가이드핵산 또는 이를 암호화하는 핵산; 및
    RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 핵산
    을 포함하는 Dystrophin 유전자 넉아웃용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제는
    스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptococcus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 Dystrophin 유전자 넉아웃용 조성물.
  12. 삭제
  13. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 Cas9 단백질 및 sgRNA로 구성되는 RNP(ribonucleoprotein) 형태 또는 Cas9을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 sgRNA를 포함하는 형태인 것을 특징으로 하는 Dystrophin 유전자 넉아웃용 조성물.
  14. Dystrophin 유전자 상의 표적 게놈 유전자좌를 포함하는 개 세포 또는 배아에,
    (a) 상기 표적 게놈 유전자좌 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 가이드 RNA; 및
    (b)RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)을 접촉시키는 단계를 포함하는,
    Dystrophin 유전자의 핵산 서열이 변경된 세포 또는 배아를 제조하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 접촉시키는 단계는 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 1 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 접촉시키는 단계는 Cas9 단백질 및 가이드 RNA로 구성되는 RNP(ribonucleoprotein) 형태로 in vitro에서 개 세포에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스(AAV)로 구성된 군에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 방법은 체세포 핵 이식 기술(somatic cell nuclear transfer, SCNT)에 의해 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.












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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3087362A1 (en) * 2018-01-29 2019-08-01 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based diagnostics

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070093436A1 (en) 2003-04-03 2007-04-26 Deutsches Kresforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts Drop1, a novel marker for carcinogenesis
US20120077860A1 (en) 2004-08-17 2012-03-29 Genethon Adeno-Associated Viral Vector for Exon Skipping in a Gene Encoding a Dispensable Domain Protein

Non-Patent Citations (1)

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