CN114807132A - 一种低免疫原性的CRISPR-Cas9核酸蛋白复合物的制备方法及其应用 - Google Patents

一种低免疫原性的CRISPR-Cas9核酸蛋白复合物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低免疫原性的CRISPR‑Cas9核酸蛋白复合物的制备方法及其应用，其中，适用于临床的低免疫原性的重组Cas9RNP制备方法，通过将Cas9RNP表达载体和碱性磷酸酶表达载体共转到大肠杆菌，进行双抗性标记筛选和诱导表达，并通过亲和纯化制备Cas9RNP。本发明制备的Cas9核酸蛋白复合物具有较强的稳定性和优异的细胞内基因编辑活性，相较于传统的体外重组生产Cas9RNP的方法，本发明方法在大肠杆菌细胞内直接获得5’‑OH的gRNA，省去了合成gRNA昂贵的生产成本，因而更加经济、简便，为实现Cas9RNP的大规模生产奠定了基础。

Description

一种低免疫原性的CRISPR-Cas9核酸蛋白复合物的制备方法 及其应用
技术领域
本发明涉及一种低免疫原性的CRISPR-Cas9核酸蛋白复合物的制备方法及其应用，属于重组蛋白领域。
背景技术
CRISPR系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源遗传物质。CRISPR/Cas9基因编辑系统包含Cas9核酸蛋白酶以及引导RNA(guide RNA，gRNA)。两者形成的RNP复合物(Cas9 ribonucleoprotein)具有核酸内切酶活性，可以切割原核或真核生物的基因组，造成目标DNA的双链断裂。该技术通过非同源末端重组的方式(non-homologous end joining，NHEJ)实现目标基因的敲除，或者通过同源重组的方式(homologous directed recombination，HDR)实现特定基因片段的插入(图1)。CRISPR/Cas9技术已经被广泛用于疾病的基因治疗研究，例如CRISPR-Cas9系统在体外成功编辑造血干细胞，然后输入病人体内，用于镰刀型细胞贫血症等遗传疾病的细胞治疗。另外，CRISPR-Cas9系统还可以依赖腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV) 载体或者纳米颗粒包装的方式递送至人体内，针对病人的特定细胞进行活体基因编辑，例如治疗色素性视网膜炎和肌肉萎缩症。
当前，CRISPR/Cas9基因编辑主要依赖病毒包装或质粒转染的方式将Cas9基因递送至机体并持续表达，故外源DNA的介入会不可避免地刺激机体产生天然免疫应答，造成过度炎症反应。因此，设计一款低免疫原性的CRISPR-Cas9核酸蛋白复合物是十分必要的。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是获得一种利用大肠杆菌底盘细胞作为微生物细胞工厂快速、简便制备适用于临床应用的低免疫原性的CRISPR-Cas9核酸蛋白复合物的制备方法及其应用。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的制备低免疫原性的CRISPR-Cas9核酸蛋白复合物的方法技术方案如下：
本发明提供的方法将Cas9蛋白和gRNA在大肠杆菌细胞内共表达，并在细胞内完成自组装制备Cas9 RNP。
进一步所述共表达过程包括采用碱性磷酸酶将gRNA的5’-ppp去磷酸化，然后经一步亲和纯化即可获得含5’-OH gRNA的Cas9 RNP。
制备步骤如下：
a)采用Cas9基因和gRNA基因序列构建氨苄青霉素抗性原核表达载体 PLY-Cas9-gRNA；
b)构建卡那霉素抗性不带标签的质粒PLY-ALP；
c)将质粒PLY-Cas9-gRNA与质粒PLY-ALP共转化进入宿主细胞中双表达；
d)诱导表达获得种子菌，扩大培养种子菌；
e)将步骤d)中扩大培养的种子菌进行破菌纯化，获得结合了5’端去磷酸化gRNA的Cas9 RNP。
优选的，所述制备方法还包括纯化及验证步骤，所述纯化及验证步骤包括：
i.体外重组制备Cas9 RNP；
ii.分别将大肠杆菌体内自组装的RNP和体外组装的RNP通过Lipo3000转染进HeLa、3T3细胞并检测基因编辑效率以及免疫原性。
进一步具体的，制备步骤包括：
(1)构建如图2b所示的氨苄抗性带有6×His标签的质粒PLY-Cas9-gRNA，使之在大肠杆菌细胞内共表达Cas9蛋白和gRNA，实现细胞内自组装成Cas9 RNP；
(2)构建如图2a所示的卡纳霉素抗性不带标签的质粒PLY-ALP；
(3)将质粒PLY-Cas9-gRNA与质粒PLY-ALP共转化进表达菌株中双表达；
(4)进行小量诱导表达来筛选出表达效果最好的菌落，并保存标记为种子菌，
(5)将种子菌扩大培养进行大量表达纯化；
(6)将收集得到的菌体进行破菌纯化，最终获得携带了5’-OH gRNA的Cas9 RNP；
(7)表达纯化Cas9蛋白；
(8)体外转录Cas9蛋白结合的gRNA并标记为G4；
(9)体外重组制备Cas9 RNP；
(10)分别将大肠杆菌体内自组装的RNP和体外组装的RNP通过Lip3000转染进HeLa、 3T3细胞并检测基因编辑效率以及免疫原性。
优选的，PLY-Cas9-gRNA质粒是pCold-Cas9-His-gRNA，是一步法制备Cas9 RNP，将Cas9蛋白和gRNA在大肠杆菌细胞内共表达，并在细胞内完成自组装。
优选的，所述PLY-ALP质粒是将大肠杆菌来源的碱性磷酸酶(GI:748128881)插入至表达载体pET-28a，并去除6×His标签。
优选的，共转化是将质粒PLY-Cas9-gRNA和PLY-ALP同时转化到大肠杆菌细胞BL21(DE3)中(图3)，进行双抗性标记筛选目的菌落。
优选的，Cas9蛋白对应的gRNA分别标记为G4。
优选的，免疫原性检测I型干扰素介导的天然免疫应答通路中炎症因子IFNB1、DDX58、 OAS2水平。
本发明的另一个目的在于提供一种上述表达方法的应用，即获得的表达产物，一种低免疫原性的CRISPR-Cas9核酸蛋白复合物，所述核酸蛋白复合物采用上述的制备方法得到。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体为一种包含有Cas9蛋白序列和gRNA序列的表达载体。
本发明还提供了一种包含所述重组Cas9 RNP表达载体和碱性磷酸酶表达载体的宿主细胞。
Cas9 RNP递送至机体内之后可以迅速地切割靶DNA并在细胞内快速代谢，其脱靶率和嵌合率都有所降低。不同于质粒的方式，RNP的递送不涉及外源DNA随机插入宿主的威胁，不会触发由环状GMP-AMP合成酶(cGAS)激活的、用来对抗外源DNA入侵的机体天然免疫反应。因此，将Cas9 RNP用于基因治疗具有一定的优势。与现有技术相比，本发明利用在大肠杆菌细胞内共表达Cas9重组蛋白和gRNA，并通过细胞内自组装方式制备 Cas9 RNP。体外酶切实验证明该方法制备的Cas9 RNP稳定性极强，能在-20℃条件保存半年仍然具有核酸酶活性。将上述Cas9 RNP通过脂质体转染或纳米颗粒包装的方式递送至人体细胞，结果显示其具有优异的细胞内基因编辑的活性。相较于传统的体外重组生产Cas9 RNP的方法，该方法在大肠杆菌细胞内直接转录生的RNA，省去了gRNA昂贵的生产成本，因而更加经济、简便，为实现Cas9 RNP的大规模生产奠定了基础。
在上述研究基础上，为了进一步减少人体免疫系统对Cas9 RNP蛋白的免疫反应，本发明在大肠杆菌细胞内共表达Cas9蛋白、gRNA和碱性磷酸酶，并经过一步亲和纯化制备含有5’-OH gRNA的Cas9 RNP。然后将上述获得的低免疫原性的Cas9 RNP与体外转录得到的gRNA以及Cas9蛋白分别转染至HeLa细胞和3T3细胞，分别检测炎症因子IFNB1、 DDX58、OAS2在细胞内水平，结果证明本发明方法制备的Cas9 RNP相比于传统体外组装的RNP极大的降低了(约1000倍)细胞对CRISPR/Cas系统免疫反应水平。Cas9 RNP中gRNA的5’端磷酸基团会被机体识别为来源于病毒感染的非自身RNA，在多种细胞内激活I型干扰素介导的天然免疫反应，导致炎症因子上调和细胞死亡。本发明Cas9 RNP的制备过程中便同步除去5’端的磷酸基团，从而降低对机体天然免疫应答的刺激，为实现Cas9 RNP在基因治疗领域的大规模应用提供理论指导和技术支撑。
与现有技术相比，本发明能产生的有益效果包括：
1.整个Cas9 RNP的制备过程在3天内即可完成，可大幅缩短生产时间。此外，该方法由于省去了昂贵的gRNA生产步骤，且全程不需要添加任何RNase抑制剂，可大幅降低生产成本。再者，经过大肠杆菌体内自组装形成的Cas RNP预计比体外重组得到的RNP稳定性更好。
2.本发明制备的Cas9 RNP由于去除了gRNA的5’磷酸基团，其激活机体天然免疫应答的能力将大幅度减弱。实验证明该Cas9 RNP相对于体外重组制备的Cas9 RNP，其对 I型干扰素介导的天然免疫应答通路的刺激降低了约1000倍。在细胞和动物实验水平上检测I型干扰素介导的天然免疫应答通路中炎症因子水平(包含的炎症因子有IFNB1、DDX58、OAS2)已经得到了验证。
3.本发明进一步揭示Cas9 RNP诱发机体免疫反应的分子机制，拟通过运用基因资源挖掘、蛋白质理性设计的方法筛选获得适用于基因治疗的低免疫原性Cas9蛋白，并进一步使用本发明的方法制备gRNA 5’磷酸基团被去磷酸化的Cas RNP。
4.本发明将为实现Cas9 RNP在基因治疗领域的大规模应用提供理论指导和技术支撑。
附图说明
图1为CRISPR/Cas9系统在人体中的两种DNA修复机制，分别为同源重组定向修复(homology-directed repair，HDR)和非同源末端连接修复机制(non-homologous endjoining，NHEJ)；
图2为Cas9-RNP表达载体、碱性磷酸酶表达载体结构示意图：图2(a)大肠杆菌来源的碱性磷酸酶基因序列构建在pET-28a载体上并去除His标签；图2(b)Cas9 基因和gRNA基因序列构建在pColdⅠ载体上，转入BL21(DE3)大肠杆菌体内表达并自组装成Cas9-RNP，然后通过镍柱亲和纯化得到Cas9-RNP；
图3为将带Kana抗性的质粒PLY-Cas9-gRNA与带Amp抗性的质粒PLY-ALP共转化进E.coli BL21(DE3)细胞中，采用双抗性筛选挑取同时含有两个质粒的菌株；
图4为使用RT-PCR检测三种RNP对人体细胞的天然免疫反应的刺激作用：图4A为免疫因子DDX58的表达情况；图4B为免疫因子IFNB1的表达情况；图4C为免疫因子OAS2的表达情况；
图5为Cas9 RNP的制备与纯化及其活性验证，5a是Cas9蛋白及另外两种Cas 蛋白(GeoCas9、CasΦ)体外组装的RNP与本发明方法制备的RNP离体活性验证，结果显示两种方法制备的RNP都具有核酸内切酶活性，可以在体外有效的切割靶质粒；图5b是Cas9蛋白和低免疫原性的Cas9 RNP的亲和纯化SDS-PAGE检测图；
图6A为使用T7E1法检测本发明制备的Cas9 RNP与传统体外重组的Cas9 RNP 在HeLa细胞中的编辑效率，图6B、6C和6D为电泳结果图，其中Cas9 RNP为本发明方法制备的RNP，Cas9+gRNA为传统体外组装方法制备的RNP，T7E1酶会将编辑过的基因片段裂解成大小两段。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的低免疫原性的CRISPR-Cas9核酸蛋白复合物的制备方法及其应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
本发明实施例涉及的主要材料如下：E.coli BL21(DE3)(Merck公司)、pColdⅠ质粒(Merck公司)、PET28a质粒(Merck公司)，由本实验室保存；Pfu DNA Polymerase、PhantaSuper-Fidelity DNA Polymerase、Proteinase K，由本实验室保存提供；T5核酸外切酶、限制性核酸内切酶(NEB公司)、引物购自上海生物工程有限公司、T4 DNA LigaseⅠ(NEB公司)、RNase R(Biosearch technologies)、pNPP(Merck公司)；HeLa细胞、3T3细胞，由本实验室保存提供、人血清由武汉大学人民医院提供；
本发明实施例涉及的试剂及缓冲液如下：Cas9蛋白裂解缓冲液(Tris-HCL 20mMpH 8.0、 NaCl 500mM、TCEP 0.5mM)、Cas9蛋白洗脱缓冲液(Tris-HCL 20mM pH 8.0、NaCl250mM、 TCEP 0.5mM)、Cas9蛋白贮存缓冲液(Tris-HCL 20mM pH 8.0、NaCl 150mM、TCEP1mM、 10％甘油)、咪唑缓冲液(10-500mM浓度梯度)、GeoCas9蛋白裂解洗脱缓冲液(Tris-HCL 50mM pH 7.5、NaCl 500mM、TCEP 0.5mM)、GeoCas9蛋白贮存缓冲液(HEPE-Na 20mM pH7.5、NaCl 150mM、TCEP 1mM、5％甘油)、CasΦ蛋白裂解缓冲液(HEPE-Na 50mM pH 7.5、NaCl 1M、TCEP 0.5mM、5％甘油)、CasΦ蛋白贮存缓冲液(HEPE-Na 50mM pH 7.5、NaCl150mM、TCEP 1mM、5％甘油)、3.1 10×Buffer(NEB公司)，引物购自上海生物工程有限公司。
实施例1构建Cas9 RNP原核表达载体PLY-Cas9-gRNA
1.Cas9基因序列从NCBI上查找，由上海生物工程公司合成并进行原核优化处理，设计引物通过PCR扩增在Cas9基因后添加6×His标签并装载在表达载体pColdⅠ上，如图2b。引物设计如下，引物序列如序列表SEQ ID NO:1～2所示：
F-Cas9：5’-TATTAAGAGGTAATACACCGAATTCATGGATAAGAAATACTC-3’
R-Cas9：5’-TAAGCAGAGATTACCTATTAGTGATGGTGGTGGTGATGCTTATC-3’
2.将所述的Cas9-6×His基因片段和pColdⅠ载体的线性片段用T5核酸外切酶在冰水浴中进行同源末端消化5min，产物进行常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行测序检测；
3.设计靶向PDRX4基因的gRNA，长度为96nt，与Target DNA结合配对序列如序列表SEQ ID NO:3所示，具体为5’-GCCGCGACAACTCCGGACCA-3’，本实施案例选择Sal Ⅰ为酶切位点，设计8条引物进行退火搭桥，并在两端设计与载体有18bp的同源序列，如图2b。引物设计如下，引物序列如序列表SEQ ID NO:4～11所示：
F1：5’-GTACTGAGAGTGCACCATAGTAATACGACTCACTATAGG-3’
R1：5’-TGGTCCGGAGTTGTCGCGGCCCTATAGTGAGTCGTATTACTATGGTGC-3’
F2：5’-GCCGCGACAACTCCGGACCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA-3’
R2：5’-TGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’
F3：5’-TAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC-3’
R3：5’-GGGTTATGCTAGAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’
F4：5’-TTTTTTCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTC-3’
R4：5’-ACGTCAAAGCAACCATAGTCCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGG CCCCAAG-3’
4.将所述的退火搭桥片段与PLY-Cas9载体的线性片段用T5核酸外切酶在冰水浴中进行同源末端消化5min，产物进行常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行测序检测。
5.构建载体PLY-ALP，在NCBI上查找大肠杆菌来源的碱性磷酸酶基因序列，设计引物，以大肠杆菌基因组为模板进行PCR，并在两端设计与pET-28a有18bp的同源臂，去除 6×His标签如图2a。引物设计如下，引物序列如序列表SEQ ID NO:12～13所示：
F-ALP：5’-CAGCAAATGGGTCGCGGATCCGTGAAACAAAGCACTATTGCA-3’
R-ALP：5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTTCAGCCCCAGAGC-3’
6.将ALP片段与pET-28a载体的线性片段用T5核酸外切酶在冰水浴中进行同源末端消化5min，产物进行常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行测序检测。
实施例2重组Cas9 RNP核糖核蛋白与碱性磷酸酶蛋白共诱导表达及表达条件优化
如图3所示，将实施例1中构建的重组质粒PLY-Cas9-gRNA与重组质粒PLY-ALP共转化进大肠杆菌BL21(DE3)细胞，采用氨苄青霉素和卡那霉素双抗筛选获得目的表达菌株。将表达菌株接种于含有双抗的LB培养基中，置于37℃，220rpm摇床上培养至菌液 OD600值为0.6时，将培养瓶置于冰水混合物中放置20min用来冷启动表达Cas9蛋白，然后向菌液中加入终浓度1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导ALP的表达，然后置于18℃摇床220rpm继续诱导培养18h后收集菌体，使用Cas9裂解缓冲液重悬洗涤菌体后进行超声波破菌，通过Ni珠亲和纯化(图2b)获得携带5’-OH gRNA的Cas9 RNP以及Cas9蛋白，然后经SDS-PAGE凝胶电泳检测重组蛋白表达情况，结果如图5b其中Cas9 蛋白大小为167kDa，ALP大小为52kDa，结果显示Cas9蛋白在80mM洗脱液处可以将杂蛋白洗干净，在500mM洗脱液处可以得到纯度较高的Cas9蛋白和Cas9 RNP。
本实施案例结果表明重组质粒PLY-Cas9-gRNA与重组质粒PLY-ALP共转化进大肠杆菌BL21(DE3)可以正确表达并可以通过Ni珠亲和纯化一步得到携带5’-OH gRNA的Cas9RNP核酸蛋白复合物。
实施例3检测Cas9 RNP和体外组装Cas9 RNP的离体活性
为了检测实施案例2中获得的蛋白是否有核酸酶活性，将本发明方法制备的Cas9RNP 和传统体外组装获得Cas9 RNP进行离体活性检测，使用超螺旋检测法，结果如图5a其中靶质粒为pET28a-PRDX4，大小～6000bp，M为1kb DNA Ladder、结果显示体外组装的RNP和体内自组装的RNP都有很好的核酸酶活性。
实施例4RT-PCR分析I型干扰素介导的天然免疫应答通路中炎症因子表达水平
1)将传统体外组装获得的Cas9 RNP、本发明方法获得的Cas9 RNP、Cas9蛋白、体外转录获得的gRNA分别通过脂质体Lipo3000转染3T3细胞；
2)放置于37℃的二氧化碳恒温培养箱中吸附培养24h；
3)收集细胞，抽提细胞总RNA，测定RNA浓度后取一定量RNA反转录成cDNA，进行RT-PCR分析。
结果如图4A、4B和4C所示，相比于传统体外组装获得的Cas9 RNP处理的细胞，本发明方法获得的Cas9 RNP处理的细胞经检测发现IFNB1、DDX58、OAS2因子的mRNA相对表达量显著下降，而转录获得的gRNA处理的细胞的三种炎症因子mRNA水平与传统体外组装RNP处理的相似，检测结果显示相比于传统体外组装制备的RNP，本发明制备的RNP对人体细胞天然免疫系统的刺激极其微弱，可忽略不计；表明本发明制备的 Cas9 RNP能够有效降低对细胞的免疫反应，对于临床治疗有重大作用和意义。
实施例5基因编辑活性实验
检测传统体外组装的RNP和本发明制备的Cas9 RNP的基因编辑效率
1)分别将传统体外组装的Cas9 RNP和本发明制备的Cas9 RNP通过脂质体Lipo3000 转染进HeLa细胞；
2)细胞置于37℃的二氧化碳恒温培养箱培养24h；
3)收集细胞，抽提细胞全基因组，测浓度；
4)将抽提得到的全基因组稀释至合适浓度范围，吸取一定量用高保真酶进行PCR；
5)吸取一定量的PCR产物加入到退火体系中进行DNA退火；
6)退火结束后加入适量T7E1酶，37℃孵育30min；
7)通过琼脂糖凝胶检测，分析结果如图6B、图6C、图6D；
使用Image J进行灰度扫描计算基因编辑效率结果如图6A所示，靶DNA被切割成2段小DNA片段，其中本发明制备的Cas9 RNP基因编辑效率为44％、传统体外组装的Cas9 RNP基因编辑效率为39％(其中Cas9 RNP为本发明方法制备，Cas9+gRNA为传统体外组装方法制备)。
综上所述，本发明构建的ALP蛋白和重组Cas9 RNP核糖核蛋白共表达系统，在E.coli BL21(DE3)中成功表达且Cas9 RNP的gRNA的5’-ppp被成功去磷酸化，本发明方法获制备的RNP不仅可大幅缩短生产时间，还省去了昂贵的gRNA生产步骤，且全程不需要添加任何RNase抑制剂，可大幅降低生产成本。再者，经过大肠杆菌体内自组装形成的RNP 复合物比体外重组得到的RNP复合物稳定性更好。同时经过RT-PCR分析，本发明制备的 Cas9 RNP由于gRNA的5’-ppp被去磷酸化，其激活机体天然免疫应答的能力大幅度减弱。最后本发明制备的Cas9 RNP在体内经过24h的培养，其基因编辑效率达到了传统方法制备的RNP，大大的缩短了治疗时间。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉博沃生物科技股份有限公司
<120> 一种低免疫原性的CRISPR-Cas9核酸蛋白复合物的制备方法及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(42)
<400> 1
tattaagagg taatacaccg aattcatgga taagaaatac tc 42
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(44)
<400> 2
taagcagaga ttacctatta gtgatggtgg tggtgatgct tatc 44
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(20)
<400> 3
gccgcgacaa ctccggacca 20
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(39)
<400> 4
gtactgagag tgcaccatag taatacgact cactatagg 39
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(48)
<400> 5
tggtccggag ttgtcgcggc cctatagtga gtcgtattac tatggtgc 48
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(49)
<400> 6
gccgcgacaa ctccggacca gttttagagc tagaaatagc aagttaaaa 49
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(48)
<400> 7
tgataacgga ctagccttat tttaacttgc tatttctagc tctaaaac 48
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
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<400> 8
taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgc 47
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> unsure
<222> (1)..(36)
<400> 9
gggttatgct agaaaaaagc accgactcgg tgccac 36
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(39)
<400> 10
ttttttctag cataacccct tggggcctct aaacgggtc 39
<210> 11
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(56)
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acgtcaaagc aaccatagtc caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaag 56
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(42)
<400> 12
cagcaaatgg gtcgcggatc cgtgaaacaa agcactattg ca 42
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(39)
<400> 13
gtggtggtgg tggtgctcga gttatttcag ccccagagc 39

Claims (10)

1.一种低免疫原性的CRISPR-Cas9核酸蛋白复合物的制备方法，其特征在于，所述方法将Cas9蛋白和gRNA在大肠杆菌细胞内共表达，并在细胞内完成自组装制备Cas9 RNP。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述共表达过程包括利用碱性磷酸酶将gRNA的5’-ppp去磷酸化，后经一步亲和纯化获得含有5’-OH gRNA的Cas9 RNP。
3.根据权利要求1或2任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a)采用Cas9基因和gRNA基因序列构建氨苄青霉素抗性原核表达载体PLY-Cas9-gRNA；
b)构建卡那霉素抗性不带标签的质粒PLY-ALP；
c)将质粒PLY-Cas9-gRNA与质粒PLY-ALP共转化进入宿主细胞中双表达；
d)诱导表达获得种子菌，扩大培养种子菌；
e)将步骤d)中扩大培养的种子菌进行破菌纯化，获得结合了5’端去磷酸化gRNA的Cas9RNP。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括纯化及验证步骤，所述纯化及验证步骤包括：
i.体外重组制备Cas9 RNP；
ii.分别将大肠杆菌体内自组装的RNP和体外组装的RNP通过Lipo3000转染进HeLa、3T3细胞并检测基因编辑效率以及免疫原性。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PLY-Cas9-gRNA质粒是pCold-Cas9-His-gRNA。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中的PLY-ALP质粒为将大肠杆菌来源的碱性磷酸酶插入至表达载体pET-28a，并去除6×His标签。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述免疫原性检测是检测I型干扰素介导的天然免疫应答通路中炎症因子IFNB1、DDX58、OAS2水平。
8.一种低免疫原性的CRISPR-Cas9核酸蛋白复合物，其特征在于，采用权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。
9.一种不带标签的包含大肠杆菌来源的碱性磷酸酶序列表达载体，其特征在于，如权利要求1～7任一项所述的表达载体为卡那霉素抗性不带标签的PLY-ALP。
10.一种宿主细胞，其特征在于，如权利要求1～7任一项所述的宿主细胞为包含所述重组Cas9 RNP表达载体和碱性磷酸酶表达载体的宿主细胞。
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李文强: "简单快速制备稳定的CRISPR/Cas9-sgRNA复合物及其应用", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 (基础科学辑) *

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