JP7292213B2 - Ｃｒｉｓｐｒ／ｃｐｆ１を用いる、ｔ細胞における遺伝子編集のための組成物および方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願には、米国特許法第119（e）条（35 U.S.C. § 119（e））の下で、2017年5月4日に提出された米国仮特許出願第62／501,371号に対する優先権が与えられ、その出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

連邦政府の資金援助を受けて行われた研究または開発に関する言明
本発明は、米国国立衛生研究所による2R01CA120409号の下に政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

発明の背景
癌の治療に関するキメラ抗原受容体（CAR）T細胞の初期の臨床データは有望な結果を示しているが、癌および感染症に対するCAR免疫療法の進展には、すぐに利用可能で効力が強く、抗原および患者に対して特異的であるTリンパ球が無いことが妨げとなっている。高度に個別化されたCAR T細胞免疫療法による患者の治療は、費用および時間がかなりかかる恐れがある。進行疾患を有する患者由来の自己T細胞は、機能が損なわれていて所望の抗原に対して寛容である可能性があり、そのため同種ドナー由来T細胞の改変が余儀なくされる。さらに、注入された同種T細胞上の内在性αβT細胞受容体は、レシピエントにおいて主要組織適合性抗原および副組織適合性抗原を認識しうることから、移植片対宿主病（GVHD）を招く可能性がある。結果として、自己CAR T細胞を注入する現行の臨床試験の大半は、養子移入後に正常組織がTCR媒介性に有害に認識されることを防ぐのを免疫寛容に頼っている。このアプローチは初期の臨床的成果を上げてはいるものの、患者特異的なT細胞製品を製造するために必要な時間および費用が制約となっている。このため、患者特異的なT細胞製品を製造するための時間および費用を最小限に抑えながらT細胞を改変する、より安全な方法に対する需要が存在する。

TCR発現を妨害することによってGVHDを回避する汎用T細胞を作製することに成功したと主張している報告はいくつかあるが、同種T細胞はそれでもなお、HLA-A分子の認識を介して宿主の免疫系によって拒絶される可能性がある。複数の遺伝子を操作するターゲティング戦略の複雑さ、ならびにT細胞におけるZFNおよびTALENの効率の低さが理由で、GVHDおよび宿主対移植片反応を同時に予防するという目的を達成した研究は今までない。真に汎用性のあるCART細胞を作製するためには、TCR α鎖、β鎖およびβ-2ミクログロビンの完全な枯渇を達成する必要がある。

T細胞のゲノム操作は、癌、HIV、原発性免疫不全症および自己免疫疾患に対する細胞療法にとって非常に有望であるが、ヒトT細胞の遺伝子操作が難題となっている。CRISPR／Cas9技術は、T細胞を含む多くの細胞タイプでゲノム操作技術を容易にしているが、ヒトT細胞におけるCRISPR／Cpf1の遺伝子編集能力については依然として架空のものである。

初代ヒトT細胞における治療用ゲノム操作技術のための新規の組成物および方法に対する需要が存在する。本発明はこの需要に応える。

本明細書において述べるように、本発明は、遺伝子編集のための組成物および方法に関する。

本発明の1つの局面は、ステムループCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）RNA（st-crRNA）を含む外来性核酸およびCpf1酵素をコードする外来性核酸を細胞に投与する段階を含む、遺伝子編集の方法を含む。

本発明のもう1つの局面は、改変T細胞を遺伝子編集によって作製する方法を含む。本方法は、st-crRNAを含む外来性核酸およびCpf1酵素をコードする外来性核酸をT細胞に投与する段階を含む。

本発明のなおもう1つの局面は、st-crRNAをコードする外来性核酸およびCpf1酵素をコードする外来性核酸を含む、遺伝子改変細胞を含む。

本発明のさらにもう1つの局面は、養子細胞移入療法の方法を含む。本方法は、それを必要とする対象に、本発明の改変細胞を含む改変細胞の集団を投与する段階を含む。

もう1つの局面において、本発明は、対象における疾患または状態を治療する方法を含む。本方法は、それを必要とする対象に、本発明の改変細胞を含む改変細胞の集団を投与する段階を含む。

本明細書において描写される本発明の上記の局面および他の任意の局面のさまざまな態様において、細胞はT細胞である。1つの態様において、T細胞は初代T細胞である。

1つの態様において、投与する段階は、外来性核酸を細胞内にエレクトロポレーションすることを含む。1つの態様において、エレクトロポレーションは複数回行われる。

1つの態様において、Cpf1酵素はアシダミノコッカス属（Acidaminococcus）Cpf1（AsCpf1）を含む。1つの態様において、Cpf1酵素はラクノスピラ科（Lachnospiraceae）Cpf1（LbCpf1）を含む。

1つの態様において、st-crRNAは、crRNAの3'末端にステムループ構造を含む。1つの態様において、st-crRNAは、crRNAの5'末端にステムループ構造を含む。1つの態様において、ステムループ構造は、ステムループの5'末端に付加された3つのグリシン残基をさらに含む。1つの態様において、st-crRNAのプロトスペーサー領域は、部分的ホスホロチオエート化（PMS）修飾をさらに含む。

1つの態様において、遺伝子編集は、以下からなる群より選択される遺伝子を突然変異させることを含む：TCR α鎖定常領域（TRAC）、TCR β定常領域（TRBC）およびβ-2ミクログロブリン（B2m）。

1つの態様において、疾患または状態は、感染症、自己免疫疾患および癌からなる群より選択される。1つの態様において、本発明の方法は、疾患または状態に対する二次治療を施す段階をさらに含む。

1つの態様において、対象はヒトである。
[本発明1001]
ステムループCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）RNA（st-crRNA）を含む外来性核酸およびCpf1酵素をコードする外来性核酸を細胞に投与する段階を含む、遺伝子編集の方法。
[本発明1002]
細胞がT細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
T細胞が初代T細胞である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
投与する段階が、前記外来性核酸を細胞内にエレクトロポレーションすることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
エレクトロポレーションが複数回行われる、本発明1004の方法。
[本発明1006]
Cpf1酵素がアシダミノコッカス属（Acidaminococcus）Cpf1（AsCpf1）を含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
Cpf1酵素がラクノスピラ科（Lachnospiraceae）Cpf1（LbCpf1）を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
st-crRNAが、crRNAの3'末端にステムループ構造を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
st-crRNAが、crRNAの5'末端にステムループ構造を含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
ステムループ構造が、ステムループの5'末端に付加された3つのグリシン残基をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
st-crRNAのプロトスペーサー領域が、部分的ホスホロチオエート化（PMS）修飾をさらに含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
遺伝子編集が、
TCR α鎖定常領域（TRAC）、TCR β定常領域（TRBC）、およびβ-2ミクログロブリン（B2m）
からなる群より選択される遺伝子を突然変異させることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
改変T細胞を遺伝子編集によって作製する方法であって、st-crRNAを含む外来性核酸およびCpf1酵素をコードする外来性核酸をT細胞に投与する段階を含む、方法。
[本発明1014]
T細胞が初代T細胞である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
投与する段階が前記核酸をT細胞内にエレクトロポレーションすることを含む、本発明1013の方法。
[本発明1016]
エレクトロポレーションが複数回行われる、本発明1015の方法。
[本発明1017]
Cpf1酵素がアシダミノコッカス属Cpf1（AsCpf1）を含む、本発明1013の方法。
[本発明1018]
Cpf1酵素がラクノスピラ科Cpf1（LbCpf1）を含む、本発明1013の方法。
[本発明1019]
st-crRNAが、crRNAの3'末端にステムループ構造を含む、本発明1013の方法。
[本発明1020]
st-crRNAが、crRNAの5'末端にステムループ構造を含む、本発明1013の方法。
[本発明1021]
ステムループ構造が、ステムループの5'末端に付加された3つのグリシン残基をさらに含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
ステムループ構造が、部分的ホスホロチオエート化（PMS）修飾をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
遺伝子編集が、
TCR α鎖定常領域（TRAC）、TCR β定常領域（TRBC）、およびβ-2ミクログロブリン（B2m）
からなる群より選択される遺伝子を突然変異させることを含む、本発明1013の方法。
[本発明1024]
st-crRNAをコードする外来性核酸およびCpf1酵素をコードする外来性核酸を含む、遺伝子改変細胞。
[本発明1025]
T細胞である、本発明1024の遺伝子改変細胞。
[本発明1026]
T細胞が初代T細胞である、本発明1025の遺伝子改変細胞。
[本発明1027]
Cpf1酵素がアシダミノコッカス属Cpf1（AsCpf1）を含む、本発明1024の遺伝子改変細胞。
[本発明1028]
Cpf1酵素がラクノスピラ科Cpf1（LbCpf1）を含む、本発明1024の遺伝子改変細胞。
[本発明1029]
st-crRNAが、crRNAの5'末端にステムループ構造を含む、本発明1024の遺伝子改変細胞。
[本発明1030]
st-crRNAが、crRNAの3'末端にステムループ構造を含む、本発明1024の遺伝子改変細胞。
[本発明1031]
ステムループ構造が、ステムループの5'末端に付加された3つのグリシン残基をさらに含む、本発明1030の遺伝子改変細胞。
[本発明1032]
st-crRNAのプロトスペーサー領域が、部分的ホスホロチオエート化（PMS）修飾をさらに含む、本発明1031の遺伝子改変細胞。
[本発明1033]
養子細胞移入療法の方法であって、それを必要とする対象に、本発明1024～1032のいずれかの改変細胞を含む改変細胞の集団を投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1034]
対象における疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本発明1024～1032のいずれかの改変細胞を含む改変細胞の集団を投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1035]
疾患または状態が、感染症、自己免疫疾患および癌からなる群より選択される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
対象がヒトである、本発明1033～1034のいずれかの方法。
[本発明1037]
疾患または状態に対する二次治療を施す段階をさらに含む、本発明1033～1034のいずれかの方法。

本発明の具体的な態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことにより、より良く理解されるであろう。本発明を実例で説明するために、例示的な態様が図面に示されている。しかし、本発明は、図面に示された態様の厳密な配置および手段に限定されないことが理解されるべきである。
図1A～1Eは、crRNAの化学修飾およびステムループ構造が、Cpf1による効率的な遺伝子ターゲティングを可能にすることを説明している、一連のプロットおよび画像である。図1Aは、crRNA、sgRNAの構造、ならびにステムループおよび化学修飾部位の模式的なデザインを説明している。グレーの文字：ステムループ；星印：修飾。図1Bは、種々のステムループを有するcrRNAの遺伝子ターゲティング効率を描写している。No：crRNAなし；Un：非修飾crRNA；Lst：左ステムループ；Mst：中央ステムループ；Rst：右ステムループ。TRACおよびTRBCの破壊は、T細胞上のCD3発現をフローサイトメトリーによって測定することによって判定した。B2mの破壊は、T細胞上のB2mまたはHLA-Iの発現をフローサイトメトリーによって測定することによって判定した。図1Cは、化学修飾PMS-crRNAの説明図である。MS-crRNA：2'-O-メチル3'ホスホロチオエート化crRNA；PMS-crRNA：ホスホロチオエート化MS-crRNA。図1Dは、単回エレクトロポレーションを行った化学修飾crRNAの遺伝子ターゲティング効率を示している。FPMS-crRNA：完全ホスホロチオエート化PMS-crRNA。図1Eは、複数回エレクトロポレーションを行った化学修飾crRNAの遺伝子ターゲティング効率を示している。 図2A～2Bは、初代T細胞におけるCpf1のストリンジェントなガイド選択性を説明している一連のプロットである。図2Aは、種々のRGENに有利に働くガイドを示している。TRAC、TRBCおよびB2mという3つの遺伝子を、Cpf1および野生型Cas9および高忠実度Cas9（eSpCas9）を用いて、初代T細胞において編集した。10種類のガイドRNAを各遺伝子について調べた。遺伝子破壊（gene disruption）は、フローサイトメトリーによってタンパク質発現に基づいて測定した。図2Bは、種々のRGENのガイドの長さの要件を示している。TRAC、TRBCおよびB2mを、短縮型ガイドRNAを有する種々のRGENによってターゲティングした。遺伝子破壊は、フローサイトメトリーを用いてタンパク質発現に基づいて測定した。 図3A～3Cは、初代T細胞におけるCpf1による遺伝子ターゲティング特異性の強化を説明している一連のプロットである。TRAC、TRBC、B2mの遺伝子破壊（gene ablation）を、種々のRGENのオフターゲットイベントを測定するために行った。突然変異誘発の頻度を、T7E1アッセイによって測定した。遺伝子ターゲティングは、20merガイドRNA（図3A）または18merガイドRNA（図3B）のいずれかを用いて実施し、突然変異させたガイドRNAを用いて、種々のRGENのオフターゲット効果を調べた。標的部位およびオフターゲット部位での突然変異誘発の頻度を、T7E1アッセイによって計算した。図3Cは、突然変異させたガイドRNAを用いる遺伝子ターゲティングによって確かめられた、Cpf1のオフターゲット能力の低下を示している。単一塩基対を突然変異させたガイドRNAを用いて、Cpf1またはCas9の非特異的ガイディングについて調べた。PAM部位に隣接する10塩基対内での単一の突然変異はCas9のターゲティング効率を低下させたが、PAM部位の近位での単一の突然変異は遺伝子ターゲティング効率に有意には影響を及ぼさなかった。ガイドRNAの単一塩基対突然変異はCpf1の遺伝子破壊能力を大きく失わせ、このことはCpf1の標的認識がCas9よりも特異的であることを指し示している。 図4は、初代T細胞におけるステムループ-crRNAによる遺伝子破壊の強化を説明している一連のプロットである。図4Aは、複数回エレクトロポレーションプロトコールによる、初代T細胞におけるCas9、AsCpf1およびLbCpf1の遺伝子破壊効率の比較を示している。図4Bは、ステムループ-crRNAによるCpf1の遺伝子破壊の強化を示している。複数回エレクトロポレーションプロトコールでは、ステムループ-crRNAを用いると、野生型crRNAと比較して2倍近くの遺伝子破壊が観察された。 図5は、crRNAのハンドル構造に対する化学修飾によって、その機能が消失したことを説明しているプロットである。単回および複数回のエレクトロポレーションプロトコールによる、ハンドル「AA」化学修飾crRNAを用いたTRAC破壊を表示している。

詳細な説明
定義
別に定める場合を除き、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと同様または同等な任意の方法および材料を本発明の試験のために実地に用いることができるが、本明細書では好ましい材料および方法について説明する。本発明の説明および特許請求を行う上では、以下の専門用語を用いる。

また、本明細書中で用いる専門用語は、特定の態様を説明することのみを目的とし、限定的であることを意図しないことも理解される必要がある。

「1つの（a）」および「1つの（an）」という冠詞は、本明細書において、その冠詞の文法的目的語の1つまたは複数（すなわち、少なくとも1つ）を指して用いられる。一例として、「1つの要素」は、1つの要素または複数の要素を意味する。

量、時間的長さなどの測定可能な値に言及する場合に本明細書で用いる「約」は、特定された値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、いっそうより好ましくは±0.1％のばらつきを範囲に含むものとするが、これはそのようなばらつきが、開示された方法を実施する上で妥当であるためである。

「活性化」という用語は、本明細書で用いる場合、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたT細胞の状態のことを指す。また、活性化を、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能と関連づけることもできる。「活性化されたT細胞」という用語は、特に、細胞分裂を起こしているT細胞のことを指す。

「抗体」という用語は、本明細書で用いる場合、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子のことを指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来するインタクトな免疫グロブリンであってよく、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応部分であってもよい。抗体は典型的には、免疫グロブリン分子のテトラマーである。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab')₂、さらには単鎖抗体（scFv）、ヒト化抗体およびヒト抗体を含む、種々の形態で存在しうる（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。

「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部分のことを指しており、インタクトな抗体の抗原決定可変領域のことを指す。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、直鎖状抗体、ScFv抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が非限定的に含まれる。

「抗体重鎖」とは、本明細書で用いる場合、天然型高次構造にあるすべての抗体分子に存在する2種類のポリペプチドのうち、長い方のことを指す。

「抗体軽鎖」とは、本明書で用いる場合、天然型高次構造にあるすべての抗体分子に存在する2種類のポリペプチドのうち、短い方のことを指す。α軽鎖およびβ軽鎖とは、2種の主要な抗体軽鎖アイソタイプのことを指す。

「合成抗体」とは、本明細書で用いる場合、組換えDNA技術を用いて作製される抗体、例えば、本明細書に記載されたようなバクテリオファージによって発現される抗体などを意味する。この用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成によって作製される抗体であって、そのDNA分子が抗体タンパク質、またはその抗体を指定するアミノ酸配列を発現し、そのDNAまたはアミノ酸配列が、利用可能であって当技術分野において周知であるDNAまたはアミノ酸配列の合成技術を用いて得られているような抗体も意味するとみなされるべきである。

「抗原」または「Ag」という用語は、本明細書で用いる場合、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特異的免疫適格細胞の活性化のいずれかまたは両方が含まれうる。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原としての役を果たしうることを理解するであろう。その上、抗原が組換えDNAまたはゲノムDNAに由来してもよい。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、それ故に、本明細書中でその用語が用いられる通りの「抗原」をコードすることを理解するであろう。その上、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことも理解するであろう。本発明が複数の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を非限定的に含むこと、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を惹起するさまざまな組み合わせで並べられていることは直ちに明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことも理解するであろう。抗原を合成して作製することもでき、または生物試料から得ることもできることは直ちに明らかである。そのような生物試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または生体液が非限定的に含まれうる。

本明細書で用いる場合、「自己」という用語は、後にその個体に再び導入される、同じ個体に由来する任意の材料を指すものとする。

「同種」とは、同じ種の異なる動物に由来する任意の材料のことを指す。

「異種」とは、異なる種の動物に由来する任意の材料のことを指す。

「キメラ抗原受容体」または「CAR」という用語は、本明細書で用いる場合、免疫エフェクター細胞上に発現されて抗原と特異的に結合するように操作された人工的T細胞受容体のことを指す。CARは、養子細胞移入を伴う治療法として用いることができる。T細胞を患者から取り出して、それらが特定形態の抗原に対して特異的である受容体を発現するように改変する。いくつかの態様において、CARは、選択された標的、例えばB細胞表面受容体に対する特異性を有する。また、CARが、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、および腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含んでもよい。いくつかの局面において、CARは、抗B細胞結合ドメインを含む細胞外ドメインがCD3-ζ膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと融合されたものを含む。

「切断」という用語は、核酸分子の骨格などにおける共有結合の破断、またはペプチド結合の加水分解のことを指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解を非限定的に含む、種々の方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能である。二本鎖切断は2つの異なる一本鎖切断イベントの結果として起こりうる。DNA切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらしうる。ある態様においては、切断された二本鎖DNAのターゲティングのために融合ポリペプチドを用いることができる。

「疾患」とは、動物が恒常性を維持することができず、その疾患が改善しなければその動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態のことを指す。対照的に、動物における「障害」とは、その動物が恒常性を維持することはできるが、その動物の健康状態が、障害の非存在下でそうあると考えられるよりも不良である、健康状態のことである。治療されないままであっても、障害は必ずしもその動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。

「ダウンレギュレーション」という用語は、本明細書で用いる場合、1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の減少または消失のことを指す。

「有効量」または「治療的有効量」は、本明細書において互換的に用いられ、特定の生物学的結果を達成するため、または治療的もしくは予防的な恩恵をもたらすために有効な、本明細書に記載されるような化合物、製剤、材料または組成物の量のことを指す。そのような結果には、当技術分野における好適な任意の手段によって判定される抗腫瘍活性が非限定的に含まれうる。

「コードすること」とは、所定のヌクレオチド配列（すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA）または所定のアミノ酸配列のいずれか、およびそれに起因する生物学的特性を有する、生物過程において他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして働く、遺伝子、cDNAまたはmRNAなどのポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性のことを指す。すなわち、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、そのタンパク質をコードする。mRNA配列と同一であって通常は配列表として提示されるヌクレオチド配列を有するコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のためのテンプレートとして用いられる非コード鎖の両方を、タンパク質、またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードすると称することができる。

本明細書で用いる場合、「内在性」とは、生物体、細胞、組織もしくは系に由来するか、またはその内部で産生される任意の材料のことを指す。

本明細書で用いる場合、「外来性」という用語は、生物体、細胞、組織もしくは系に導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の材料のことを指す。

「増大する」という用語は、本明細書で用いる場合、T細胞の数の増加の場合のように、数が増えることを指す。1つの態様において、エクスビボで増大されるT細胞は、培養物中にもともと存在する数に比べて、数が増える。もう1つの態様において、エクスビボで増大されるT細胞は、培養物中の他の細胞タイプに比べて、数が増える。「エクスビボ」という用語は、本明細書で用いる場合、生きている生物体（例えば、ヒト）から取り出されて、生物体の外側（例えば、培養皿、試験管またはバイオリアクターの中）で増やされた細胞のことを指す。

「発現」という用語は、本明細書で用いる場合、そのプロモーターによって作動する特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と定義される。

「発現ベクター」とは、発現させようとするヌクレオチド配列と機能的に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターのことを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含む；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給されうる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み入れた、コスミド、プラスミド（例えば、裸のもの、またはリポソーム中に含まれるもの）およびウイルス（例えば、センダイウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）といった、当技術分野において公知であるすべてのものが含まれる。

「免疫応答」という用語は、本明細書で用いる場合、リンパ球が抗原分子を異質であると識別して、抗原を除去するために抗体の形成を誘導する場合、かつ／またはリンパ球を活性化する場合に起こる、抗原に対する細胞応答と定義される。

「免疫学的有効量」、「自己免疫疾患阻害有効量」、または「治療量」が指示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（対象）の状態の個体差を考慮して、医師または研究者が決定することができる。

本明細書で用いる場合、「説明材料」には、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために用いうる、刊行物、記録、略図、または他の任意の表現媒体が含まれる。本発明のキットの説明材料は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を含む容器に添付されてもよく、または核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を含む容器と一緒に出荷されてもよい。または、説明材料および化合物がレシピエントによって協同的に用いられることを意図して、説明材料が容器と別に出荷されてもよい。

「単離された」とは、天然の状態から変更されるかまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きた動物に天然のままで存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然の状態で共存する物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することもでき、または例えば、宿主細胞などの非ネイティブ性環境の中に存在することもできる。

「ノックダウン」という用語は、本明細書で用いる場合、1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の減少のことを指す。

「ノックアウト」という用語は、本明細書で用いる場合、1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の消失のことを指す。

「改変されたまたは修飾された（modified）」という用語は、本明細書で用いる場合、本発明の分子または細胞の、変化した状態または構造のことを意味する。分子は、化学的、構造的および機能的を含む、多くのやり方で改変または修飾することができる。細胞は核酸の導入によって改変することができる。

「モジュレートすること」という用語は、治療もしくは化合物の非存在下での対象における反応のレベルと比較して、および／または他の点では同一であるが治療を受けていない対象における反応のレベルと比較して、対象における反応のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、対象、好ましくはヒトにおいて、ネイティブ性のシグナルまたは反応を擾乱させるか、および／またはそれに影響を及ぼして、それにより、有益な治療反応を媒介することを範囲に含む。

本発明に関連して、一般的に存在する核酸塩基に関しては以下の略号を用いる。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。

別に指定する場合を除き、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、相互に縮重型であって、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチドが含まれる。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という語句には、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部の型においてイントロンを含みうる限り、イントロンも含まれうる。

免疫原性組成物の「非経口的」投与には、例えば、皮下（s.c）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）または胸骨内の注射法または注入法が含まれる。

「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で用いる場合、ヌクレオチドの連鎖と定義される。その上、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で用いる核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それらはモノマー性「ヌクレオチド」に加水分解されうるという一般知識を有する。モノマー性ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解されうる。本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドには、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCR（商標）などを用いて組換えライブラリーまたは細胞ゲノムから核酸配列をクローニングすること、および合成手段を非限定的に含む、当技術分野で利用可能な任意の手段によって得られる、すべての核酸配列が非限定的に含まれる。

本明細書で用いる場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基で構成される化合物のことを指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互に結合した2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で用いる場合、この用語は、例えば、当技術分野において一般的にはペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖、ならびに当技術分野において一般にタンパク質と称される長鎖の両方のことを指し、それらには多くの種類がある。「ポリペプチド」には、いくつか例を挙げると、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。

「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、TCR／CD3複合体）がそのコグネイトリガンドと結合して、それにより、TCR／CD3複合体を介するシグナル伝達などの、ただしこれには限定されないシグナル伝達イベントを媒介することによって誘導される、一次応答のことを意味する。刺激は、TGF-βのダウンレギュレーションなどの、ある特定の分子の発現の改変、および／または細胞骨格構造の再構築を媒介することができる。

「刺激分子」とは、この用語が本明細書で用いられる場合、抗原提示細胞上に存在するコグネイト刺激リガンドと特異的に結合する、T細胞上の分子のことを意味する。

「刺激リガンド」は、本明細書で用いる場合、抗原提示細胞（例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など）上に存在する場合に、T細胞上のコグネイト結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と称する）と特異的に結合して、それにより、活性化、免疫応答の開始、増殖などを非限定的に含む、T細胞による一次応答を媒介することができるリガンドのことを意味する。刺激リガンドは当技術分野において周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体、およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体を範囲に含む。

「対象」という用語は、免疫応答を惹起することができる、生きている生物（例えば、哺乳動物）を含むことを意図している。「対象」または「患者」は、その中で用いる場合、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であってよい。非ヒト哺乳動物には、例えば、家畜および愛玩動物、例えばヒツジ、ウシ科動物、ブタ、イヌ科動物、ネコ科動物およびネズミ科の哺乳動物などが含まれる。好ましくは、対象はヒトである。

本明細書で用いる場合、「実質的に精製された」細胞とは、他の細胞タイプを本質的に含まない細胞のことである。また、実質的に精製された細胞とは、その天然の状態に通常は付随する他の細胞タイプから分離された細胞のことも指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団とは、均一な細胞集団のことを指す。また別の場合には、この用語は、単に、その天然の状態に通常は付随する細胞から分離された細胞のことを指す。いくつかの態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロでは培養されない。

「標的部位」または「標的配列」とは、結合が起こるのに十分な条件下で結合分子が特異的に結合しうる核酸の部分を明確に定めるゲノム核酸配列のことを指す。

本明細書で用いる場合、「T細胞受容体」または「TCR」という用語は、抗原の提示に応答したT細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体のことを指す。TCRは、主要組織適合複合体分子と結合した抗原を認識する原因となる。TCRは、アルファ（a）およびベータ（β）鎖のヘテロダイマーで構成されるが、一部の細胞では、TCRはγおよびδ（γ／δ）鎖からなる。TCRはα／β形態およびγ／δ形態で存在することもあり、これらは構造的に類似しているが、解剖学的な部位および機能は異なる。各鎖は2つの細胞外ドメイン、1つの可変ドメインおよび1つの定常ドメインで構成される。いくつかの態様において、TCRは、例えば、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、調節性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、およびγδT細胞を含む、TCRを含む任意の細胞上で改変することができる。

「治療的」という用語は、本明細書で用いる場合、治療および／または予防を意味する。治療効果は、疾病状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。

「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、本明細書で用いる場合、外来性核酸が宿主細胞内に移入または導入される過程のことを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞とは、外来性核酸を用いてトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入されたもののことである。この細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。

ある疾患を「治療する」とは、この用語が本明細書で用いられる場合、対象が被っている疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を軽減することを意味する。

「ベクター」とは、単離された核酸を含み、かつその単離された核酸を細胞の内部に送達するために用いうる組成物のことである。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを非限定的に含む数多くのベクターが、当技術分野において公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律複製性のプラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、例えばポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性および非ウイルス性の化合物も含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが非限定的に含まれる。

範囲：本開示の全体を通じて、本発明のさまざまな局面を、範囲形式で提示することができる。範囲形式による記載は、単に便宜上かつ簡潔さのためであって、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定とみなされるべきではないことが理解される必要がある。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内におけるすべての可能な部分的範囲とともに、個々の数値も具体的に開示されていると考慮されるべきである。例えば、1～6などの範囲の記載は、1～3、1～4、1～5、2～4、2～6、3～6などの部分的範囲とともに、その範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6も、具体的に開示されていると考慮されるべきである。これは範囲の幅広さとは関係なく適用される。

説明
本発明は、遺伝子改変細胞の作製および使用のための組成物および方法を提供する。遺伝子改変細胞は、ステムループCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）RNA（st-crRNA）をコードする外来性核酸、およびCpf1酵素をコードする外来性核酸を含む。本発明のある局面は、細胞における遺伝子編集の方法、および改変細胞を作製する方法を含む。また、養子療法のため、および疾患または状態を治療するための改変細胞を含む方法および薬学的組成物も含まれる。

本明細書に開示するデータは、Cpf1およびcrRNAを用いる、ヒトT細胞における効率的なゲノム操作技術を実証している。CRISPR／Cpf1遺伝子編集により、TCR／CD3複合体の必須の構成要素であるTCR α鎖が消失した。Cpf1遺伝子編集は、細胞の最大80％で、TCRの高レベル細胞表面発現を失わせた。これらの結果は、初代ヒトT細胞における多様な実験用および治療用のゲノム操作技術の用途に用いるためのCRISPR／Cpf1の確証となるものである。

CRISPR／Cpf1
異質核酸に対する適応免疫を細菌に与える、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）およびCR1SPR関連（Cas）タンパク質は、ヒト細胞および他の種類の細胞における、さらには動物および植物における、標的化されたゲノム編集に用いるという別の目的に役立てられている。CRISPR／Cas9技術はII型CRISPR／Casシステムから始まっており、これは1つのDNAエンドヌクレアーゼタンパク質Cas9、ならびにCRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）という2つの小型RNAからなる。これらの小型RNAまたはキメラ性単一ガイドRNA（sgRNA）はCas9と結合し、それによってRNAガイド（RNA-guided）DNAエンドヌクレアーゼ（RGEN）複合体を形成して、特異的DNA標的を切断する。染色体の二本鎖平滑末端切断（DSB）は、続いて相同組換え（HR）または非相同末端結合（NHEJ）を介して修復されて、遺伝子改変が生じる。

Cpf1は、V型CRISPRシステムに由来する、もう1つの種類のRGENである。Cpf1は、Cas9とはいくつかの点で異なる。第一に、Cpf1の機能に必要なのは、crRNA／tracrRNAの対ではなく、crRNAのみである。第二に、Cas9切断では平滑DSBが生じるが、Cpf1切断では付着末端が生じる。第三に、Cpf1は、標的配列の5'末端にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）（例えば、5'-TTTN-3'）などのチミジンリッチDNA配列を認識する。Cpf1のこれらの特徴により、CRISPR-エンドヌクレアーゼにより編集可能なゲノム部位の範囲は、さまざまなCas9酵素によって認識されるグアノシンリッチ配列よりも広がる。Cpf1はcrRNAのみを必要としてtracrRNAを利用せず、Cpf1 crRNAはCas9によって必要とされるほぼ100ヌクレオチドのsgRNAよりも著しく短く、そのためガイドRNAの作製がより安価かつより簡単になる。この特性は、化学修飾されたガイドを用いる場合には特に有用である。化学修飾sgRNAは、ヒト初代細胞における遺伝子ターゲティング効率を強化することが最近示されている；しかし、本研究以前には、化学修飾crRNAがCpf1による遺伝子ターゲティングをどの程度補助しうるかについてはまだ検討されていなかった。

研究者らは、全ゲノムのオフターゲット分析に基づいて、ある特定の細胞タイプにおけるCpf1の遺伝子ターゲティング特異性はCas9よりも良好であることを報告している。T細胞におけるCpf1の特異性は解明されていない。

T細胞を標的とするゲノム編集は、T細胞を利用する癌免疫療法を容易にする上で大きな可能性がある。Cas9-sgRNAを用いた初代T細胞における遺伝子編集は広く研究されている。しかし、T細胞におけるCpf1の遺伝子編集能力はまだ調査されていない。本研究では、crRNAに対する構造的および化学的な修飾の効果、ならびにT細胞におけるCpf1-crRNAを用いた遺伝子編集の効率および特異性について検討した。

組成物
本発明のある局面は、遺伝子改変細胞を含む。1つの局面において、本発明は、st-crRNAをコードする外来性核酸およびCpf1酵素をコードする外来性核酸を含む、遺伝子改変細胞を含む。遺伝子改変細胞は、Tリンパ球、Bリンパ球、NK細胞、単球、マクロファージ、好中球、上皮細胞、造血幹細胞、および誘導多能性幹細胞（iPS）を非限定的に含む、任意の種類の細胞でありうる。

1つの態様において、遺伝子改変細胞はヒト細胞である。もう1つの態様において、細胞、遺伝子改変細胞は自己細胞である。

ある態様において、遺伝子改変細胞はT細胞である。T細胞は、CD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞、調節性T細胞（Treg）、ヘルパーT細胞（Th1およびTh2）、細胞傷害性T細胞（CTL）、ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）、γδT細胞、エフェクターT細胞、メモリーT細胞、およびナイーブT細胞を非限定的に含む、当技術分野において公知の任意の種類のT細胞でありうる。1つの態様において、遺伝子改変T細胞は初代T細胞である。もう1つの態様において、細胞、遺伝子改変細胞は、自己T細胞である。

本発明の遺伝子改変細胞は、Cpf1酵素をコードする外来性核酸を含む。Cpf1酵素は、パルクバクテリア（Parcubacteria）、ラクノスピラ科、ブチリビブリオ（Butyrivibrio）、ペレグリニバクテリア（Peregrinibacteria）、アシダミノコッカス属、ポルフィノモナス（Porphyromonas）、ラクノスピラ科、ポルフロモナス（Porphromonas）、プレボテラ（Prevotella）、モラクセラ（Moraxela）、スミセラ（Smithella）、レプトスピラ（Leptospira）、ラクノスピラ科、フランシセラ（Francisella）、カンジダツス（Candidatus）、およびユーバクテリウム（Eubacterium）を非限定的に含む、任意の属の微生物に由来しうる。1つの態様において、Cpf1は、アシダミノコッカス属の種に由来する（AsCpf1）。もう1つの態様において、Cpf1は、ラクノスピラ科の属の種に由来する（LbCpf1）。

本発明の遺伝子改変細胞は、少なくとも1つの付加的なステムループ構造が結びついたCRISPR RNA（st-crRNA）をコードする外来性核酸を含む。ネイティブ性crRNAは一般に、約42～44ヌクレオチド（19ヌクレオチド長の反復配列および23～15ヌクレオチドのスペーサー配列）、および「ハンドル」構造としても知られる単一のステムループ構造で構成される。本発明のcrRNAは、（ハンドルのほかに）少なくとも1つの付加的なステムループ構造を含み、本明細書においてステムループ-crRNA（st-crRNA）と称される。付加的なステムループ構造は、crRNAの5'末端および／またはcrRNAの3'末端と結びついていてよい。st-RNAは、1つの付加的なステムループ構造、または複数の付加的なステムループ構造を含みうる。1つの態様において、st-crRNAは、ハンドルに隣接したcrRNAの5'末端にステムループ構造を含む。もう1つの態様において、st-crRNAは、crRNAの3'末端にステムループ構造を含む。st-RNAは修飾をさらに含みうる。1つの態様において、st-RNAは、ステムループの5'末端に付加された3つのグリシン残基をさらに含む。もう1つの態様において、st-crRNAのプロトスペーサー領域は、部分的ホスホロチオエート化（PMS）修飾をさらに含む。さらにもう1つの態様において、st-RNAは、ステムループの5'末端に付加された3つのグリシン残基、およびプロトスペーサー領域における部分的ホスホロチオエート化（PMS）修飾をさらに含む。

本発明のst-crRNAは、関心対象の任意の遺伝子を標的とするように設計することができる。例えば、ある態様において、crRNAは、TCR α鎖定常領域（TRAC）および／またはTCR β定常領域（TRBC）、および／またはβ-2ミクログロブリン（B2m）遺伝子を標的とするように設計することができる。

方法
1つの局面において、本発明は、遺伝子編集の方法を含む。本方法は、ステムループCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）RNA（st-crRNA）を含む外来性核酸およびCpf1酵素を含む外来性核酸を細胞に投与する段階を含む。1つの態様において、編集しようとする細胞はT細胞である。もう1つの態様において、細胞は初代T細胞である。

本発明のもう1つの局面は、改変T細胞を作製する方法を含む。本方法は、st-crRNAを含む外来性核酸およびCpf1酵素を含む外来性核酸を細胞に投与する段階を含む。

本発明のある態様において、外来性核酸は、それを細胞内にエレクトロポレーションすることによって投与される。ある態様において、細胞は複数回のエレクトロポレーションを受ける。例えば、細胞に1回目は第1のst-crRNAをエレクトロポレーションして、続いて2回目に第2のst-crRNAをエレクトロポレーションしてもよい。

Cpf1酵素は、パルクバクテリア、ラクノスピラ科、ブチリビブリオ、ペレグリニバクテリア、アシダミノコッカス属、ポルフィノモナス、ラクノスピラ科、ポルフロモナス、プレボテラ、モラクセラ、スミセラ、レプトスピラ、ラクノスピラ科、フランシセラ、カンジダツス、およびユーバクテリウムを非限定的に含む、任意の属の微生物に由来しうる。1つの態様において、Cpf1はアシダミノコッカス属に由来する（AsCpf1）。もう1つの態様において、Cpf1はラクノスピラ科に由来する（LbCpf1）。

本発明のある局面は、ステムループが結びついたCRISPR-RNA（crRNA）（st-crCRNA）を含む。ステムループ構造は、crRNAの3'末端および／またはcrRNAの5'末端と結びついていてよい。ステムループは、付加的なステムループの5'末端に付加された3つのグリシン残基をさらに含みうる。st-crRNAのプロトスペーサー領域は、部分的ホスホロチオエート化（PMS）修飾をさらに含みうる。1つの態様において、st-RNAは、ステムループの5'末端に付加された3つのグリシン残基、およびプロトスペーサー領域における部分的ホスホロチオエート化（PMS）修飾をさらに含む。

本発明の遺伝子編集方法は、関心対象の任意の遺伝子を突然変異させるために用いることができる。例えば、本方法は、TCR α鎖定常領域（TRAC）および／またはTCR β定常領域（TRBC）および／またはβ-2ミクログロブリン（B2m）を突然変異させることができる。本方法は、他のCRISPRシステム、例えばI型またはII型CRISPRシステムと併せて用いることができる。1つの非制限的な例において、Cpf1／st-crRNA遺伝子編集システムは、CRISPR／Cas 9システムと併せて用いることができる。2つのシステムを多重様式で用いることにより、より幅広いスクリーニングおよび標的選択性が可能になると考えられる。

核酸の導入
核酸を細胞に導入する方法には、物理的、生物学的および化学的な方法が含まれる。宿主細胞にRNAなどのポリヌクレオチドを導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。RNAは、エレクトロポレーションを含む市販の方法を用いて、標的細胞に導入することができる（Amaxa Nucleofector-II（Amaxa Biosystems, Cologne, Germany））、（ECM 830（BTX）（Harvard Instruments, Boston, Mass.）またはGene Pulser II（BioRad, Denver, Colo.）、Multiporator（Eppendort, Hamburg Germany）。また、RNAを、リポフェクションを用いるカチオン性リポソーム媒介性トランスフェクションを用いて、ポリマーカプセル封入を用いて、ペプチド媒介性トランスフェクションを用いて、または「遺伝子銃」などのバイオリスティック粒子送達システムを非限定的に含む市販の方法（例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照）を用いて、細胞に導入することもできる。

関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAベクターおよびRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第5,350,674号および第5,585,362号を参照されたい。

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなど、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。インビトロおよびインビボで送達媒体として用いるための例示的なコロイド系の1つは、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

使用に適した脂質は、販売元から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）はSigma, St. Louis, MOから入手することができ；ジアセチルホスファート（「DCP」）はK & K Laboratories（Plainview, NY）から入手することができ；コレステロール（「Choi」）はCalbiochem-Behringから入手することができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.（Birmingham, AL）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中脂質貯蔵溶液は、約-20℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、それを唯一の溶媒として用いることが好ましい。「リポソーム」とは、閉じた脂質二重層または凝集物の生成によって形成される、種々の単層および多重層の脂質媒体を範囲に含む総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜による小胞構造および内部の水性媒質を有するものとして特徴づけることができる。多重層リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらはリン脂質を過剰量の水性溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分は自己再配列を起こし、その後に閉鎖構造の形成が起こり、水および溶解溶質を脂質二重層の間に封じ込める（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5:505-10）。しかし、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も想定している。例えば、脂質がミセル構造をとってもよく、または単に脂質分子の不均一な凝集物として存在してもよい。また、リポフェクタミン-核酸複合体も想定している。

宿主細胞に外来性核酸を導入するために用いられる方法にかかわらず、宿主細胞における核酸の存在を確かめる目的で、種々のアッセイを用いることができる。そのようなアッセイには、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、RT-PCRおよびPCRなど；「生化学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ELlSAおよびウエスタンブロット）または本発明の範囲内にある作用物質を同定するための本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの有無を検出すること、などが含まれる。

さらに、核酸を、細胞の形質導入、細胞のトランスフェクション、および細胞のエレクトロポレーションなどの任意の手段によって導入してもよい。1種類の核酸を1つの方法によって導入して、もう1種類の核酸を異なる方法によって導入してもよい。

RNA
1つの態様において、RNAが標的細胞に導入される。もう1つの態様において、RNAは、インビトロ転写されたRNAまたは合成RNAを含むmRNAである。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により生成されるテンプレートを用いるインビトロ転写によって生成される。任意の供給源からの関心対象のDNAを、PCRにより、適切なプライマーおよびRNAポリメラーゼを用いるインビトロmRNA合成のためのテンプレートに直接変換することができる。DNAの供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列、またはDNAの他の任意の適切な供給源でありうる。インビトロ転写のための所望のテンプレートは、キメラ性膜タンパク質である。一例を挙げると、テンプレートは、抗体、抗体の断片または抗体の一部分をコードする。もう1つの例を挙げると、テンプレートは、抗CD3などの抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外ドメインと、共刺激分子の細胞内ドメインとを含む。1つの態様において、RNAキメラ性膜タンパク質用のテンプレートは、共刺激分子に対する抗体に由来する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの一部分に由来する細胞内ドメインとを含むキメラ性膜タンパク質をコードする。

PCRは、mRNAのインビトロ転写のためのテンプレートを作製するために用いることができ、続いてそれが細胞に導入される。PCRを行うための方法は、当技術分野において周知である。PCRに用いるためのプライマーは、PCRのためのテンプレートとして用いようとするDNAの領域に対して実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的な」とは、本明細書で用いる場合、プライマー配列中の塩基の大半もしくはすべてが相補的であるか、または1つもしくは複数の塩基が非相補的もしくはミスマッチ性である、ヌクレオチドの配列のことを指す。実質的に相補的な配列は、PCRのために用いられるアニーリング条件下で、意図したDNA標的とアニールまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、DNAテンプレートの任意の部分に対して実質的に相補的であるように設計することができる。例えば、プライマーを、5' UTRおよび3' UTRを含めて、細胞において通常転写される遺伝子の部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計することができる。また、プライマーを、関心対象の特定のドメインをコードする遺伝子の一部分を増幅するように設計することもできる。1つの態様において、プライマーは、5' UTRおよび3' UTRの全体または部分を含めて、ヒトcDNAのコード領域を増幅するように設計される。PCRのために有用なプライマーは、当技術分野において周知である合成法によって作製される。「順方向プライマー」とは、増幅させようとするDNA配列の上流にある、DNAテンプレート上のヌクレオチドに対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーのことである。「上流」とは、本明細書において、コード鎖を基準として、増幅させようとするDNA配列の5'側にある場所を指して用いられる。「逆方向プライマー」とは、増幅させようとするDNA配列の下流にある、二本鎖DNAテンプレートに対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーのことである。「下流」とは、本明細書において、コード鎖を基準として、増幅させようとするDNA配列の3'側にある場所のことを指す。

RNAの安定性および／または翻訳効率を高める能力を有する化学構造を用いることもできる。RNAは5' UTRおよび3' UTRを有することが好ましい。1つの態様において、5' UTRは長さが0～3000ヌクレオチドである。コード領域に付加される5' UTR配列および3' UTR配列の長さは、UTRの異なる領域とアニールするPCR用のプライマーを設計することを非限定的に含む、種々の方法によって変化させることができる。このアプローチを用いて、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要な5' UTRおよび3' UTRの長さを改変することができる。

5' UTRおよび3' UTRは、関心対象の遺伝子の天然の内在性5' UTRおよび3' UTRであってよい。または、UTR配列を順方向プライマーおよび逆方向プライマーに組み入れることによって、またはテンプレートの他の任意の改変によって、関心対象の遺伝子にとって内在性でないUTR配列を付加することもできる。関心対象の遺伝子にとって内在性でないUTR配列の使用は、RNAの安定性および／または翻訳効率を改変するために有用な可能性がある。例えば、3' UTR配列中のAUリッチエレメントはmRNAの安定性を低下させうることが知られている。このため、当技術分野において周知であるUTRの特性に基づき、転写されたRNAの安定性が高まるように3' UTRを選択または設計することができる。

1つの態様において、5' UTRは内在性遺伝子のKozak配列を含みうる。または、関心対象の遺伝子にとって内在性でない5' UTRを上記のようにPCRによって付加する場合には、5' UTR配列を付加することによってコンセンサスKozak配列を設計し直すこともできる。Kozak配列は一部のRNA転写物の翻訳の効率を高めることができるが、すべてのRNAで効率的な翻訳を可能にするために必要なわけではないと思われる。多くのmRNAにとってのKozak配列の必要性は、当技術分野において公知である。他の態様においては、5' UTRを、そのRNAゲノムが細胞内で安定しているRNAウイルスから導き出すことができる。他の態様においては、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、さまざまなヌクレオチド類似体を3' UTRまたは5' UTRに用いることができる。

遺伝子クローニングと必要とせずにDNAテンプレートからのRNAの合成を可能にするためには、転写のプロモーターが、転写させようとする配列の上流でDNAテンプレートと結びつく必要がある。RNAポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの5'末端に付加すると、RNAポリメラーゼプロモーターが、転写させようとするオープンリーディングフレームの上流でPCR産物に組み入れられる。1つの態様において、本明細書の他所に記載したように、プロモーターはT7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、T3およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが非限定的に含まれる。T7、T3およびSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。

1つの態様において、mRNAは5'末端のキャップおよび3'ポリ（A）尾部の両方を有し、それらがリボソーム結合、翻訳の開始および細胞内でのmRNA安定性を決定づける。環状DNAテンプレート、例えばプラスミドDNA上で、RNAポリメラーゼは真核細胞における発現には適さない長いコンカテマー産物を生成させる。3' UTRの末端で線状化されたプラスミドDNAの転写では、転写後にポリアデニル化されたとしても真核生物トランスフェクションには有効でない、正常サイズのmRNAがもたらされる。

線状DNAテンプレート上で、ファージT7 RNAポリメラーゼは、転写物の3'末端をテンプレートの最終塩基を越えて伸長させることができる（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。

DNAテンプレートへのポリA／T連鎖の従来の組み込み方法は、分子クローニングである。しかし、プラスミドDNAに組み込まれたポリA／T配列はプラスミド不安定性を引き起こす恐れがあり、このことが、細菌細胞から得られたプラスミドDNAテンプレートに欠失および他の異常がしばしば高度に混入する理由となっている。このためにクローニング手順は面倒で時間がかかるだけでなく、往々にして信頼性も損なわれる。これが、ポリA／T 3'連鎖を有するDNAテンプレートの構築をクローニングを伴わずに可能にする方法が非常に望まれる理由である。

転写DNAテンプレートのポリA／Tセグメントは、ポリT尾部、例えば100T尾部など（サイズは50～5000 Tでありうる）を含む逆方向プライマーを用いることによってPCR中に、またはDNA連結もしくはインビトロ組換えを非限定的に含む他の任意の方法によってPCRの後に生成させることができる。ポリ（A）尾部はまた、RNAに安定性を与え、それらの分解も減少させる。一般に、ポリ（A）尾部の長さは、転写されたRNAの安定性と正の相関関係にある。1つの態様において、ポリ（A）尾部は100～5000個のアデノシンである。

RNAのポリ（A）尾部は、インビトロ転写後に、ポリ（A）ポリメラーゼ、例えば大腸菌ポリAポリメラーゼ（E-PAP）などを用いることによって、さらに伸長させることができる。1つの態様において、ポリ（A）尾部の長さを100ヌクレオチドから300～400ヌクレオチドに増やすことにより、RNAの翻訳効率は約2倍に高くなる。さらに、種々の化学基を3'末端に結びつけることによってmRNA安定性を高めることもできる。そのような付属物は、改変／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含みうる。例えば、ポリ（A）ポリメラーゼを用いて、ATP類似体をポリ（A）尾部に組み入れることができる。ATP類似体は、RNAの安定性をさらに高めることができる。

5'キャップもまた、RNA分子に安定性を与える。1つの好ましい態様において、本明細書に開示された方法によって生成されたRNAは5'キャップを含む。5'キャップは、当技術分野において公知であって本明細書に記載された手法を用いて付与される（Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)）。

本明細書で開示された方法によって生成されたRNAはまた、配列内リボソーム進入部位（IRES）配列も含みうる。IRES配列は、mRNAに対するキャップ非依存的なリボソーム結合を開始させて翻訳開始を助長する、任意のウイルス配列、染色体配列または人工的に設計された配列であってよい。細胞の透過性および生存能力を高める因子、例えば糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化物質および界面活性剤などを含みうる、細胞エレクトロポレーションのために適した任意の溶質を含めることができる。

いくつかの態様において、RNA、例えばインビトロ転写されたRNAなどは、細胞内にエレクトロポレーションされる。

開示される方法は、癌、幹細胞、急性および慢性感染症、ならびに自己免疫疾患の分野における、遺伝子改変T細胞が標的癌細胞を死滅させる能力の評価を含む、基礎研究および治療法において、T細胞活性のモジュレーションのために適用することができる。

本方法はまた、例えばプロモーターを、または投入RNAの量を変化させることによって、発現のレベルを広範囲にわたって制御する能力も提供し、そのため発現レベルを個別に調節することが可能になる。その上、PCRに基づくmRNA生成の手法は、種々の構造およびそれらのドメインの組み合わせを有するmRNAの設計を非常に容易にする。

本発明のRNAトランスフェクション法の1つの利点は、RNAトランスフェクションが本質的に一過性であり、かつベクターを用いないことである。RNA導入遺伝子をリンパ球に送達し、その中で、短時間のインビトロ細胞活性化の後に、いかなる別のウイルス配列も必要としない最小発現カセットとして発現させることができる。これらの条件下では、宿主細胞ゲノム中への導入遺伝子の組み込みが起こる可能性は低い。RNAのトランスフェクションの効率の高さ、およびそれがリンパ球集団全体を均質に改変させる能力があることから、細胞のクローニングは必要でない。

インビトロで転写されたRNA（IVT-RNA）を用いるT細胞の遺伝子改変では、両者ともにさまざまな動物モデルで継続的に検討されてきた2種類の戦略を利用する。細胞は、インビトロで転写されたRNAを用いて、リポフェクションまたはエレクトロポレーションによってトランスフェクトされる。移入されたIVT-RNAの長期間にわたる発現を達成するために、さまざまな改変を用いてIVT-RNAを安定化することが望ましい。

インビトロ転写のためのテンプレートとして標準化された様式で利用され、安定化されたRNA転写物が産生されるように遺伝子改変されている、いくつかのIVTベクターが文献で公知である。現在、当技術分野で用いられるプロトコールは、以下の構造を有するプラスミドベクターに基づく：RNA転写を可能にする5' RNAポリメラーゼプロモーター、それに続く、3'および／または5'側に非翻訳領域（UTR）が隣接している関心対象の遺伝子、ならびに50～70個のAヌクレオチドを含む3'ポリアデニルカセット。インビトロ転写の前に、環状プラスミドはII型制限酵素（認識配列は切断部位に対応する）によってポリアデニルカセットの下流で線状化される。したがって、ポリアデニルカセットは転写物における後のポリ（A）配列に対応する。この手順の結果として、いくつかのヌクレオチドは、線状化の後に酵素切断部位の一部として残存し、伸長するか、または3'末端でポリ（A）配列をマスクする。この非生理的な突出部が、そのような構築物から細胞内で産生されるタンパク質の量に影響を及ぼすか否かは不明である。

RNAには、より慣習的なプラスミドまたはウイルスによるアプローチを上回るいくつかの利点がある。RNA供給源からの遺伝子発現は転写を必要とせず、トランスフェクション後にタンパク質産物が迅速に産生される。さらに、RNAは核ではなく細胞質に到達しさえすればよく、そのため、典型的なトランスフェクション法によって、極めて高率のトランスフェクションがもたらされる。加えて、プラスミドに基づくアプローチは、関心対象の遺伝子の発現を作動させるプロモーターが、試験中の細胞において活性があることを必要とする。

もう1つの局面においては、RNA構築物をエレクトロポレーションによって細胞内に送達することができる。例えば、US 2004／0014645号、US 2005／0052630A1号、US 2005／0070841A1号、US 2004／0059285A1号、US 2004／0092907A1号に教示されているような、哺乳動物細胞への核酸構築物のエレクトロポレーションの処方および方法を参照されたい。任意の既知の細胞タイプのエレクトロポレーションのために必要な電場強度を含むさまざまなパラメーターは、関連研究文献ならびに当技術分野における数多くの特許および出願において一般に公知である。例えば、米国特許第6,678,556号、米国特許第7,171,264号および米国特許第7,173,116号を参照されたい。エレクトロポレーションの治療適用のための装置は市販されており、これには例えば、MedPulser（商標）DNA Electroporation Therapy System（Inovio／Genetronics, San Diego, Calif）があり、米国特許第6,567,694号；米国特許第6,516,223号、米国特許第5,993,434号、米国特許第6,181,964号、米国特許第6,241,701号および米国特許第6,233,482号などの特許に記載されている；また、エレクトロポレーションを、例えばUS20070128708A1号に記載されたように、インビトロでの細胞のトランスフェクションのために用いることもできる。また、エレクトロポレーションを、インビトロで細胞に核酸を送達するために利用することもできる。このように、当業者に公知の多くの利用可能なデバイスおよびエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用した、発現構築物を含む核酸の細胞へのエレクトロポレーションを介した投与は、関心対象のRNAを標的細胞に送達するための素晴らしい新たな手段となる。

治療法
本明細書に記載の改変細胞を、治療法のための組成物中に含めることができる。組成物は薬学的組成物を含むことができ、かつ、薬学的に許容される担体をさらに含む。改変細胞を含む薬学的組成物の治療的有効量を投与することができる。

1つの局面において、本発明は、養子細胞移入療法のための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の改変細胞を投与する段階を含む方法を含む。もう1つの態様において、本発明は、対象における疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、改変細胞の集団を投与する段階を含む方法を含む。

ある態様において、改変細胞はT細胞である。T細胞は初代T細胞であってよい。本明細書に記載された通りに作製された、改変T細胞は、T細胞機能を有する。

改変細胞を、哺乳動物、好ましくはヒトに対して、糖尿病、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、GVHDなどの自己免疫疾患、同種免疫寛容誘導の強化、移植拒絶反応などに共通するものなどの免疫反応を抑制するために投与することができる。加えて、本発明の細胞を、疾患を治療または軽減するために免疫応答、特に細胞媒介性免疫応答の減弱化または他の様式での阻害が望まれる任意の状態の治療のために用いることもできる。1つの局面において、本発明は、対象における状態、例えば自己免疫疾患などの治療であって、改変細胞の集団を含む薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む治療を含む。自己免疫疾患の例には、後天性免疫不全症候群（AIDS、これは自己免疫性要素を伴うウイルス性疾患である）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（AIED）、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ALPS）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、ベーチェット病、心筋症、セリアックスプルー・疱疹状皮膚炎；慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性炎症脱髄性多発ニューロパチー（CIPD）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、デゴス病、若年性皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症・線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性真性糖尿病、若年性慢性関節炎（スチル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎・皮膚筋炎、原発性ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（PSS）、これは全身性硬化症（SS）としても知られる）、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症が非限定的に含まれる。

また、本明細書に記載されたように作製された改変細胞を増大させて、炎症性障害を治療するために用いることもできる。炎症性障害の例には、慢性および急性の炎症性障害が非限定的に含まれる。炎症性障害の例には、アルツハイマー病、喘息、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム性動脈硬化、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、骨関節炎、敗血症、脳卒中、組織および臓器の移植、血管炎、糖尿病性網膜症および人工呼吸器誘発肺損傷が非限定的に含まれる。

もう1つの態様において、本明細書に記載の細胞を、免疫応答の治療をそれを必要とする対象において行うための医薬品の製造のために用いることもできる。もう1つの態様において、本発明は、免疫応答の治療をそれを必要とする対象において行う方法に用いるための、本明細書に記載の改変細胞を含む。

本発明の細胞は、癌を治療するために、動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくはヒトに対して投与することができる。加えて、疾患を治療または軽減することが望ましい場合、本発明の細胞を、癌と関連する任意の状態の治療のために、特に腫瘍細胞に対する細胞媒介性免疫応答のために用いることもできる。癌の例には、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌、甲状腺癌などが非限定的に含まれる。

ある態様において、対象には二次治療が提供される。二次治療には、化学療法、放射線照射、外科手術、および薬物療法が非限定的に含まれる。

本発明の細胞は、適切な前臨床的および臨床的な実験および治験で決定される投与量および経路ならびに回数で投与することができる。細胞組成物は、これらの範囲内にある投与量で複数回投与することができる。本発明の細胞の投与を、当業者による判断で、所望の疾患または状態を治療するために有用な他の方法と組み合わせてもよい。

投与される本発明の細胞は、治療法を受ける対象にとって、自己性、同種性または異種性であってよい。

本発明の細胞の投与は、当業者に公知である任意の好都合な様式で実施することができる。本発明の細胞は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸注、植え込みまたは移植によって対象に投与することができる。本明細書に記載の組成物は、患者に対して、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（i.v.）注射または腹腔内に投与することができる。また別の場合には、本発明の細胞は、対象における炎症の部位、対象における局所的疾患部位、リンパ節、臓器、腫瘍などに直接的に注射される。

また、本明細書に記載の細胞を、いくつかのマトリックスを用いて投与することもできる。本発明では、そのようなマトリックスを、典型的にはT細胞のモジュレーションを通じて免疫系を支援し、維持し、またはモジュレートするための人工リンパ系器官として作用させる新しい状況で利用する。したがって、本発明は、組織工学において有用性が実証されているそのようなマトリックス組成物および製剤を利用することができる。したがって、本発明の組成物、装置、および方法に用いうるマトリックスの種類は事実上制限がなく、生体マトリックスおよび合成マトリックスの両方が含まれてよい。1つの具体例では、米国特許第5,980,889号；第5,913,998号；第5,902,745号；第5,843,069号；第5,787,900号；または第5,626,561号によって記載された組成物および装置が利用され、そのためこれらの特許はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。マトリックスは、哺乳動物宿主に投与した場合に生体適合性であることに一般的に関連する特徴を含む。マトリックスは、天然材料および／または合成材料で形成してよい。マトリックスは、インプラントのように永続的構造または除去可能な構造を動物の体内に残すことが望ましい場合には非生分解性であってもよく；または生分解性であってもよい。マトリックスは、スポンジ、インプラント、管、テルファパッド（telfa pad）、繊維、中空糸、凍結乾燥成分、ゲル、粉末、多孔性組成物、またはナノ粒子の形態をとりうる。加えて、マトリックスを、播種された細胞または産生されたサイトカインもしくは他の活性物質の持続放出が可能になるように設計することもできる。ある態様において、本発明のマトリックスは可撓性および伸縮性であり、無機塩、水性液、および酸素を含む溶存気体状物質などの物質を透過させる半固体スカフォールドとして記載することもできる。

マトリックスは、本明細書において生体適合性物質の一例として用いられる。しかし、本発明はマトリックスには限定されないため、マトリックスという用語が出てきた場合、これらの用語はいずれも、細胞の保持または細胞の通過を可能にし、生体適合性であり、かつ、その物質自体が半透過性膜であるような、その物質中の直接の高分子の通過、または特定の半透過性物質とともに用いての高分子の通過を可能にする、装置または他の物質を含むと解釈されるべきである。

T細胞の供給源
ある態様においては、T細胞の供給源を対象から入手する。対象の非限定的な例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。好ましくは、対象はヒトである。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯血、および腫瘍を含む、数多くの供給源から入手することができる。ある態様においては、当技術分野において利用可能な任意のさまざまなT細胞株を用いることができる。ある態様において、T細胞は、フィコール分離などの、当業者に公知の任意のさまざまな手法を用いて対象から収集された血液ユニットから得ることができる。1つの好ましい態様において、個体の流血由来の細胞はアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス製剤は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含有する。アフェレーシスによって収集された細胞を、血漿画分を除去するために洗浄した上で、その後の処理段階のために細胞を適切な緩衝液もしくは培地、例えばリン酸緩衝食塩水（PBS）など、またはその後の処理段階のための、カルシウムを含まないか、もしくはマグネシウムを含まないか、もしくはすべてではないものの多くの二価カチオンを含まない洗浄液の中に入れることができる。洗浄の後に、細胞を、例えば、Ca非含有、Mg2非含有のPBSといった、種々の生体適合性緩衝液中に再懸濁させることができる。または、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去して、細胞を培養培地中に直接再懸濁させてもよい。

もう1つの態様においては、赤血球を溶解させて、および、例えば、PERCOLL（商標）勾配での遠心分離によって単球を枯渇させることによって、T細胞を末梢血から単離する。または、T細胞を臍帯血から単離することもできる。いずれの場合にも、陽性選択または陰性選択の手法によって、T細胞の特定の部分集団をさらに単離することができる。

そのようにして単離された臍帯血単核細胞から、CD34、CD8、CD14、CD19およびCD56を非限定的に含む、特定の抗原を発現する細胞を枯渇させることができる。これらの細胞の枯渇は、単離された抗体、抗体を含む生体試料、例えば腹水など、物理的支持体と結合した抗体、および細胞と結合させた抗体を用いて実現することができる。

陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に特有の表面マーカーを対象とする抗体の組み合わせを用いて達成することができる。1つの好ましい方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを用いる、負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞ソーティングおよび／または選択である。例えば、陰性選択によってCD4+細胞を濃縮するためのモノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。

陽性選択または陰性選択による望ましい細胞集団の単離のために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。ある態様においては、細胞とビーズの最大の接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される容積を著しく減らすこと（すなわち、細胞の濃度を高めること）が望ましいことがある。例えば、1つの態様においては、細胞20億個／mlの濃度を用いる。1つの態様において、細胞10億個／mlの濃度を用いる。さらなる態様においては、細胞1億個／mlよりも高いものを用いる。さらなる態様においては、1000万個／ml、1500万個／ml、2000万個／ml、2500万個／ml、3000万個／ml、3500万個／ml、4000万個／ml、4500万個／mlまたは5000万個／mlの細胞濃度を用いる。さらにもう1つの態様においては、7500万個／ml、8000万個／ml、8500万個／ml、9000万個／ml、9500万個／ml、または1億個／mlからの細胞濃度を用いる。さらなる態様においては、1億2500万個／mlまたは1億5000万個／mlの濃度を用いることができる。高濃度を用いることにより、細胞収量、細胞活性化および細胞増大の増加をもたらしうる。

また、T細胞を、単球除去段階を必要とせずに、洗浄段階の後に凍結することもできる。理論に拘束されることは望まないが、凍結段階およびそれに続く解凍段階は、細胞集団における顆粒球およびある程度の単球を除去することによって、より均一な製剤を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄段階の後に、これらの細胞を凍結液中に懸濁させてもよい。多くの凍結液およびパラメーターが当技術分野において公知であり、かつこの状況において有用であると考えられるが、1つの方法は、20％ DMSOおよび8％ヒト血清アルブミンを含有するPBS、または他の適した細胞凍結培地の使用を伴う。続いてこれらの細胞は、1分間に1℃の速度で-80℃に凍結され、液体窒素貯蔵タンク内で気相中に貯蔵される。その他の制御された凍結法に加えて、即時-20℃または液体窒素中での制御されない凍結を用いてもよい。

1つの態様において、T細胞の集団は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、T細胞の精製集団、およびT細胞株などの細胞内に含まれる。もう1つの態様において、末梢血単核細胞は、T細胞の集団を含む。さらにもう1つの態様において、精製されたT細胞は、T細胞の集団を含む。

T細胞の増大
ある態様においては、T細胞を増大させることができる。増大により、T細胞を、約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、またはそれを上回って、ならびにそれらの間の整数の全体および部分のいずれかおよびすべての倍数に増やすことができる。1つの態様において、T細胞は約20倍～約50倍の範囲に増大される。

培養の後に、T細胞を培養装置内において細胞培地中で、ある期間にわたって、または細胞が最適な継代のために集密もしくは高い細胞密度に達するまでインキュベートし、その後に別の培養装置への継代を行う。培養装置は、インビトロで細胞を培養するために一般的に用いられる任意の培養装置であってよい。好ましくは、細胞を別の培養装置に継代する前の集密のレベルは70％またはそれを上回る。より好ましくは、集密のレベルは90％またはそれを上回る。期間は、インビトロでの細胞の培養に適する任意の時間であってよい。T細胞培地の入れ替えは、T細胞の培養中にどの時点に行ってもよい。好ましくは、T細胞培地を約2～3日毎に入れ替える。続いてT細胞を培養装置から採取し、その上でT細胞を直ちに用いるか、または後に用いるための貯蔵のために凍結保存することができる。1つの態様において、本発明は、増大したT細胞を凍結保存することを含む。凍結保存されたT細胞は、T細胞に核酸を導入する前に解凍される。

もう1つの態様において、本方法は、T細胞を単離することおよびT細胞を増大させることを含む。もう1つの態様において、本発明は、増大の前にT細胞を凍結保存することをさらに含む。さらにもう1つの態様において、凍結保存されたT細胞は、キメラ性膜タンパク質をコードするRNAを用いたエレクトロポレーションのために解凍される。

細胞エクスビボ増大のためのもう1つの手順は、米国特許第5,199,942号に記載されている（これは参照により本明細書に組み入れられる）。米国特許第5,199,942号に記載されたような増大を別の選択肢としてもよく、または本明細書に記載の他の増大方法に加えてもよい。手短に述べると、T細胞のエクスビボ培養および増大は、米国特許第5,199,942号に記載されたものなどの細胞増殖因子の添加、または他の因子、例えばflt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドなどの添加を含む。1つの態様において、T細胞を増大させることは、T細胞を、flt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともに培養することを含む。

本明細書において記載されるような培養段階（本明細書において記載されるような作用物質との接触）は、極めて短くてもよく、例えば、24時間未満、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23時間未満などであってよい。本明細書において記載されるような培養段階（本明細書において記載されるような作用物質との接触）は、より長くてもよく、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日、またはそれを上回る日数であってもよい。

培養下にある細胞を記述するために、さまざまな用語を用いる。細胞培養物とは、一般に、生体から採取して、制御された条件下で増殖させた細胞のことを指す。初代細胞培養物とは、生物体から直接採取した、初回継代培養の前の細胞、組織または器官の培養物のことである。細胞は、それらが細胞の増殖および／または分裂を助長する条件下で増殖培地中に置かれた場合に、培養下で増大して、その結果、より大きな細胞集団となる。細胞が培養下で増大する場合、細胞増殖の速度は典型的には、細胞の数が2倍になるのに要する時間、別名では倍加時間としても知られる時間によって測定される。

継代培養の各回は継代と称される。細胞を継代培養する場合、それらは継代されたと称される。細胞または細胞株の特定の集団は、時に、それが継代された回数によって称されるか、または特徴付けられることがある。例えば、10回継代された培養細胞集団はP10培養物と称することができる。初代培養物、すなわち、組織からの細胞の単離後の最初の培養物はP0と名付けられる。初回の継代培養後に、細胞は二次培養物（P1または継代1）と記載される。2回目の継代培養後、細胞は三次培養物（P2または継代2）となり、以後も同様である。継代の期間中には集団の倍加が数多く起こりうることが当業者には理解されよう。したがって、培養物の集団の倍加回数は継代数よりも大きい。継代間の期間中の細胞の増大（すなわち、集団倍加の回数）は多くの要因に依存し、これには播種密度、基質、培地、および継代間の時間が非限定的に含まれる。

1つの態様においては、細胞を数時間（約3時間）～約14日間、またはその間の任意の整数値単位の時間にわたって培養することができる。T細胞の培養に適する条件には、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン-2（IL-2）、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-βおよびTNF-α、または当業者に公知である細胞増殖のための他の添加物を含む、増殖および生存のために必要な因子を含みうる適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640または、X-vivo 15（Lonza））が含まれる。細胞の増殖のための他の添加物には、界面活性剤、プラスマネート、および還元剤、例えばN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールなどが非限定的に含まれる。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加された、血清非含有であるか、またはT細胞の増殖および増大のために十分な、適量の血清（または血漿）もしくは規定されたホルモンのセットおよび／もしくは一定量のサイトカインが加えられた、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれうる。ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は実験培養物のみに含められ、対象に注入しようとする細胞の培養物には含められない。標的細胞は、増殖を支えるために必要な条件下、例えば適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％ CO₂）の下で維持される。

T細胞を培養するために用いられる培地は、T細胞を共刺激しうる作用物質を含んでもよい。例えば、CD3を刺激しうる作用物質はCD3に対する抗体であり、CD28を刺激しうる作用物質はCD28に対する抗体である。これこそが、本明細書において開示されるデータによって実証されているように、本明細書において開示される方法によって単離された細胞が、およそ10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、またはそれを上回って増大することができる理由である。1つの態様において、T細胞は、エレクトロポレーションを受けた集団を培養することによって、約20倍～約50倍の範囲で、またはそれを上回って増大する。

1つの態様において、T細胞を増大させる方法は、増大したT細胞をさらなる用途のために単離する段階をさらに含みうる。さらにもう1つの態様において、増大させる方法は、増大したT細胞の引き続いてのエレクトロポレーションとその後の培養をさらに含みうる。引き続いてのエレクトロポレーションは、増大したT細胞の集団内に、ある作用物質をコードする核酸を導入すること、例えば核酸を用いて、増大したT細胞に形質導入を行うこと、増大したT細胞をトランスフェクトすること、または増大したT細胞にエレクトロポレーションを行うことを含んでよく、ここでその作用物質は、T細胞をさらに刺激する。作用物質は、さらなる増大、エフェクター機能、または別のT細胞機能を刺激することなどによって、T細胞を刺激することができる。

薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載するような改変細胞を、1つまたは複数の薬学的または生理的に許容される担体、希釈剤または添加剤と組み合わせて含むことができる。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；酸化防止剤；EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに保存剤を含みうる。本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤化されることが好ましい。

本発明の薬学的組成物は、治療（または予防）しようとする疾患に適した様式で投与することができる。投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子によって決定されるが、適切な投与量は臨床試験によって決定されうる。

投与される本発明の細胞は、治療法を受ける対象にとって、自己性、同種性または異種性であってよい。

本発明の細胞は、適切な前臨床的および臨床的な実験および治験で決定される投与量および経路ならびに回数で投与することができる。細胞組成物は、これらの範囲内にある投与量で複数回投与することができる。本発明の細胞の投与を、当業者による判断で、所望の疾患または状態を治療するために有用な他の方法と組み合わせてもよい。

本明細書に記載の改変細胞を含む薬学的組成物は、細胞10⁴～10⁹個／kg体重、場合によっては細胞10⁵～10⁶個／kg体重であって、これらの範囲内のすべての整数値を含む投与量で投与することができる。また、細胞組成物をこれらの用量で複数回投与することもできる。細胞は、免疫療法において一般的に公知である輸注手法を用いることによって投与することができる（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照）。特定の患者に関する最適な投与量および治療レジメンは、疾患の徴候に関して患者をモニタリングして、それに応じて治療を調節することによって、医療の当業者によって容易に決定されうる。

本発明の改変細胞の投与は、当業者に公知の任意の好都合な様式で実施することができる。本発明の細胞を、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸液、植え込みまたは移植を含む、任意の好都合な様式で投与することができる。本明細書に記載された組成物は、患者に対して、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（i.v.）注射により、または腹腔内に投与することができる。また別の場合には、本発明の細胞は、対象における炎症の部位、対象における局所的疾患部位、リンパ節、臓器、腫瘍などに直接的に注射される。

本発明において有用であると考えられる方法および組成物は、実施例に示された特定の製剤に限定されないことが理解される必要がある。以下の実施例は、当業者に対して、本発明の細胞、増大および培養法、ならびに治療法をどのように作製および使用するかの徹底した開示および説明を行う目的で述べられ、本発明者らが自分たちの発明とみなしていることの範囲を限定することを意図するものではない。

本発明の実施には、別段の表示がある場合を除き、当技術分野の技能の範囲内にある分子生物学（組換え手法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の手法が用いられる。そのような手法は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", fourth edition (Sambrook, 2012)；"Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)；"Culture of Animal Cells" (Freshney, 2010)；"Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1997)；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)；"Short Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 2002)；"Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting", (Babar, 2011)；"Current Protocols in Immunology" (Coligan, 2002)などの文献中に十分に説明されている。これらの手法は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作製に適用可能であり、そのため、本発明の作製および実施において考慮されうる。特定の態様のために特に有用な手法について、以下の項において考察する。

実験例
本発明を、以下の実験例を参照することによってこれから説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供されるものであり、本発明はこれらの実施例に限定されず、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる全ての変動も包含する。

これらの実験に使用される材料および方法について以下に説明する。

初代ヒトリンパ球
初代ヒトCD4 T細胞およびCD8 T細胞を、健常志願者ドナーから、RosetteSepキット（Stem Cell Technologies, Vancouver BC, Canada）を用いた陰性選択により白血球アフェレーシス後に単離した。以前に記載された通りに（Barrett et al. (2011) Human Gene Therapy 22(12): 1575-1586）、初代リンパ球を、CD3およびCD28刺激性抗体でコーティングしたマイクロビーズ（Life Technologies, Grand Island, NY, Catalog）によって刺激した。第10日に、90％ウシ胎児血清および10％ジメチルスルホキシド（DMSO）の溶液中にあるT細胞を、細胞1×10⁸個／バイアルで凍結保存した。

初代T細胞の増殖
初代ヒトT細胞を、10％ FCS、100-U／mlペニシリン、100-g／ml硫酸ストレプトマイシン、10-mM Hepesを加えたRPMI 1640中で培養し、抗CD3／抗CD28でコーティングした磁気ビーズにより細胞 対 ビーズ比1：3で刺激した。2日毎に細胞の計数および栄養素添加を行い、増殖動態低下および細胞サイズの両方による判断でT細胞が休止状態に入ったと思われる時点で、T細胞を機能的アッセイのために用いるか、または凍結保存した。

CRISPRの設計および構築
NTTT PAM部位を有するNTTTN20によってCrRNAを選択した。Cpf1およびcrRNAが標的とする、TCR α、β鎖およびβ-2ミクログロビンの定常領域を、インビトロで転写させた。CrRNAを、TCR α定常領域のエクソン1中の配列、またはTCR β定常領域1および2の両方ならびにB2mのエクソン1に共通するコンセンサス配列のいずれかを標的とするように設計した。mRNAは、単回用途のヌクレアーゼ非含有バイアル中にて-80℃で保存した。

フローサイトメトリー
表記の特異性を有する以下のモノクローナル抗体および試薬を、適切なアイソタイプ対照とともに用いた。BD Biosciences（San Jose, CA）より：APC結合抗CD3（555335）、PE-抗β-2ミクログロビン（551337）、FITC-抗HLA（555552）。データは、FACS Accuri（BD Biosciences, San Jose, CA）によりCellQuestバージョン3.3（BD Biosciences, San Jose, CA）を用いて取得し、FCS Expressバージョン3.00（De Novo Software, Los Angeles, CA）またはFlowJoバージョン7.6.1（Tree Star, Inc. Ashland, OR）によって分析した。

CRISPRによる遺伝子破壊
エレクトロポレーションの前に、T細胞をCD3／CD28ダイナビーズによって3日間刺激した。1000万個の初代T細胞の脱ビーズ処理を行い、その後に、BTX830によって360V、1msのパラメーターで、20μgのCpf1種（Cas9またはeSpCas9）、10μgのcrRNA（またはsgRNA）種の細胞内へのエレクトロトランスファーを行い、その後に5μgのcrRNA（またはsgRNA）の2回目のエレクトロトランスファーを行った。またはT細胞に対して、20ug Cpf1 mRNA＋10ugの化学修飾crRNAを同時にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後に、細胞を直ちに2mLの予熱培地に入れて、37℃、5％ CO₂または32℃、5％ CO₂で1日培養し、続いて37℃、5％ CO₂に戻した。

CRISPRによる遺伝子編集
Cpf1およびCas9 mRNAを、mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRAキット（Life Technologies, AMI 345, Carlsbad, CA）により、インビトロで転写させた。SgRNAおよびcrRNAは、MEGAscript T7転写キットを用いてインビトロで転写させた。化学修飾crRNAは、Integrated DNA Technologiesから購入した。T細胞をCD3／CD28ダイナビーズで刺激した。第3日に、T細胞にCas9またはCpf1 mRNAをエレクトロポレーションした。手短に述べると、T細胞をOPTI-MEMで3回洗浄し、OPTI-MEM（Invitrogen）中に最終濃度1～3×10⁸個／mlで再懸濁させた。その後に、0.1mlの細胞懸濁液をIVT RNAと混合して、2mmキュベット内でエレクトロポレーションを行った。続いて、20μgのCas9またはCpf1 mRNAおよび5μgのガイドRNAを、BTX830システム（Harvard Apparatus BTX）を360Vおよび1msで用いて、細胞内にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後に、細胞を直ちに2mlの予熱培地に入れて、IL-2（100 IU／ml）の存在下で37℃、5％ CO₂で培養した。第4日に、さらに5μgのガイドRNAをT細胞内にエレクトロポレーションした。

T7E1アッセイを用いたアレル改変頻度の測定
T細胞におけるTRAC、TRBCおよびB2mのゲノム破壊のレベルを、T7E1 Nucleaseアッセイ（NEB）を用いて決定した。標的破壊率を濃度測定によって定量した。

実験の結果を以下に説明する。

実施例1：初代T細胞におけるステムループ-crRNAを用いたターゲティングされた突然変異誘発の強化
以前に、さまざまな属に由来するCpf1タンパク質が、哺乳動物細胞におけるゲノム編集効率に関して試験されている（Zetsche et al. Cell. 2015; 163(3): 759-771）。試験された8種のCpf1タンパク質のうち、それぞれアシダミノコッカス属（As）およびラクノスピラ科（Lb）の属に由来する2種のタンパク質、AsCpf1およびLbCpf1のみが、哺乳動物細胞において検出可能な突然変異を生じさせることが見いだされた。このことから、本明細書では、AsCpf1およびLbCpf1の遺伝子ターゲティング効率をT細胞において評価した。初代T細胞におけるCRISPR媒介性ゲノム編集の効率を、効率的なT細胞遺伝子破壊のために以前に開発されたプロトコール（Ren et al. (2016) Clinical Cancer Research (2016): clincanres-1300）を用いて、AsCpf1、LbCpf1またはCas9の間で比較した。Cas9またはCpf1を、ガイドRNAとともに、単回のエレクトロポレーションで初代T細胞に送達した。ターゲティングされた突然変異誘発を、TCR α鎖定常領域（TRAC）、TCR β定常領域（TRBC）およびβ-2ミクログロブリン（B2m）という3つの内在性標的部位で測定した。Cas9を用いると10％～20％のターゲティングされた突然変異誘発が観察されたが、AsCpf1およびLbCpf1のいずれも検出可能な突然変異誘発は観察されなかった。ガイドRNAの複数回の送達を用いた場合には、Cas9を用いると、3つの遺伝子座位すべてで80～90％の遺伝子破壊が達成された。AsCpf1を用いると50％を上回る遺伝子破壊が達成され、LbCpf1を用いるとおよそ30％が達成された（図4）。遺伝子破壊の有効性の向上は、Cas9およびCpf1エレクトロポレーションの後に、ガイドRNAの2回目の送達を遅らせて行ったことに付随してみられた。この知見により、sgRNAおよびcrRNAを含む小型ガイドRNAが、Cas9およびCpf1 mRNAよりも分解をはるかに受けやすいことが指し示された。AsCpf1は、LbCpf1よりも実質的に高い遺伝子破壊効率を示したことから、以後の実験ではAsCpf1に注目した。

Cpf1-crRNAによる遺伝子ターゲティングでは、T細胞における実質的な遺伝子破壊が達成されたものの、その効率はCas9-sgRNAの場合よりも低かった。sgRNAとcrRNAとの間の構造的な違いが、安定性の違いの理由であるかもしれない。興味深いことに、sgRNAはCas9と相互作用するさまざまなステムループ構造の点でcrRNAとは異なり、それ故にsgRNAをRNアーゼから保護することが見いだされた。ステムループは、RNアーゼの活性を低下させることによってRNAの安定性を強化することが報告されている。A-Uフリップ、およびステムループの延長は、sgRNAの安定性を高めることが示されている。そして、遺伝子破壊の効率は、sgRNAの構造を最適化することによって強化されることが示されている。本明細書では、ステムループをcrRNAに付加してステムループ-crRNA（st-crRNA）を生じさせることによって、遺伝子破壊効率を高めることができるか否かについて調べた（図1A）。標的化された3つの遺伝子のすべてで、crRNAの5'（Lst）末端または3'（Rst）末端のいずれかへのsgRNAの種々のステムループ構造の導入後に、およそ2倍の増加が観察された。5'末端ステムループ構造-3（Lst-3）は、遺伝子破壊の最大の増加をもたらし、それはTRACについては85％（83.6％±7.3、n＝5）、TRBCについては83％（81.7±5.7、n＝4）、そしてB2mについては81％（78.7±8.4、n＝4）に達した（図1B）。しかし、crRNAにおける当初のハンドルステムループの延長（Mst-crRNA）ではその機能が消失し、5'および3'末端の両方にステムループを付加するとターゲティング効率が低下し、これにより、Cpf1結合のためのcrRNAの構造的要件および長さの制約が明らかになった（図1B）。

実施例2：化学修飾ステムループ-crRNAによるターゲティングされた突然変異誘発の強化
sgRNAの安定性を高めるための化学修飾は、遺伝子破壊効率を強化することが示されている。crRNAの安定性をさらに高めるために、TRACを標的とする化学修飾crRNAを本明細書において作製した。また、単回エレクトロポレーションによって効率的な遺伝子破壊を達成することができ、それ故に第2のエレクトロポレーションによって引き起こされる毒性を減少させうるか否かについても判定した。化学修飾がcrRNAの機能を消失させないことを確かめるために、修飾crRNAを二通りのエレクトロポレーションプロトコールによって調べた。crRNAハンドルにおける尾部「AA」ヌクレオチドの修飾はその機能を消失させ、そのことは「AA」が適正なハンドル構造形成のために不可欠であることを指し示している（図5）。この影響を回避するために、ハンドル尾部に3つの「G」残基を付加し、続いてこの3つの「G」および3つの尾部プロトスペーサーヌクレオチドに対して2'-O-メチル3'ホスホロチオエート化（MS）を施した（図1C）。この場合には、修飾はcrRNAの機能を消失させなかったが、Cpf1およびMS-crRNAの単回エレクトロポレーション後に遺伝子破壊は依然として観察されなかった。部分的にホスホロチオエート化したプロトスペーサーMS-crRNA（PMS-crRNA）を用いると、TRACの9.1％（9.7±1.7、n＝3）の遺伝子破壊が達成された。しかし、crRNAの完全なホスホロチオエート化（FPMS-crRNA）ではその機能が消失し、このことはcrRNAがそのハンドル構造の修飾に対して脆弱であることを指し示している（図1D）。

crRNAに対するステムループ構造の機能を検証するために、TRACを標的とするPMS-Lst-3 crRNAを作製した。Cpf1および非修飾Lst-3-crRNAの単回エレクトロポレーション後に、遺伝子破壊は全く観察されなかった；しかし、Lst-3 crRNAのPMS修飾は61％を上回る（58.3±6.5、n＝3）TRAC破壊をもたらし、それはステムループを有しないPMS-crRNAで得られた破壊の7倍近くであった（図1D）。

PMS修飾とステムループがともに存在することにより、単回エレクトロポレーションプロトコールにおけるCpf1-crRNA遺伝子ターゲティング効率は大きく強化されたものの、それは2回エレクトロポレーションプロトコールにおいてステムループ-crRNAの遺伝子破壊効率をさらに改善することはなかった。このことは、一過性crRNA曝露のみが必要とされる実験ではステムループ構造がcrRNAの十分な保護を与えることを示唆する（図1E）。

実施例3：初代T細胞におけるCpf1のストリンジェントなガイド選択性
T細胞におけるCpf1の特徴について検討するために、初代T細胞においてCpf1およびst-crRNAを用いて遺伝子破壊を行った。sgRNAではなくcrRNAを用いることだけではなく、Cpf1はTTTNのよりストリンジェントなPAM配列も認識するが、一方、Cas9はNGGのPAM配列を認識するという点でも、Cpf1はCas9とは異なる。Cpf1はCas9と比較して、標的遺伝子を、効率については同等であるがよりストリンジェントな様式で破壊する。TRAC、TRBCおよびB2m遺伝子座位を標的とする10種類のcrRNAまたはsgRNAを用いて、T細胞におけるCpf1、Cas9、および高忠実度Cas9であるeSpCas9の成績について調べた。過半数で、sgRNAはCas9による効率的な遺伝子破壊を媒介したが、一方、Cpf1は10種のcrRNAのうち1～2種のみで同等の遺伝子破壊を達成する。これらの結果により、Cpf1によるcrRNAの選択はCas9による選択よりもストリンジェントであることが指し示された。興味深いことに、Cpf1のこの特徴は、同等の遺伝子破壊を示し、よりストリンジェントなsgRNA選択も示した、高忠実度Cas9であるeSpCas9のそれと同様であった（図2A）。より短い短縮型sgRNAの使用による特異性の強化が報告されている。このため、遺伝子ターゲティング特異性を高めるために同様の戦略をCpf1-crRNAによって用いうるかを調べた。16bpほどの短さのsgRNAを用いて遺伝子破壊効率が幾分低下しただけであったCas9とは対照的に、17bpに短縮したcrRNAでさえもCpf1の機能を完全に消失させ、これはeSpCas9に関して観察されたものと同様の結果であった（図2B）。このように、Cpf1はガイド選択性および短縮型RNAの両方の点でeSpCas9と同様に振る舞い、このことはCpf1を高忠実度遺伝子編集ツールとしてCas9の代わりに用いうることを実証している。

実施例4：初代T細胞における、Cas9と比較した、Cpf1の遺伝子ターゲティング特異性の強化
Cpf1の安全性をさらに調べるために、TRAC、TRBCおよびB2mをターゲティングする上で遺伝子破壊効率が最も高い3種のcrRNAを用いてオフターゲットイベントを測定した。各遺伝子について10個のオフターゲット部位を測定した。ストリンジェントなガイド選択性と一致して、野生型20bpまたは短縮型18bpのガイドRNAのいずれを用いても、Cpf1およびeSpCas9については、Cas9と比較して、はるかに低いレベル、およびより少ないオフターゲットイベントが観察された（図3A）。

Cpf1およびCas9がそれらのガイドRNAに対してどの程度忠実であるかを調べるために、TRACおよびTRBCを標的とするsgRNAまたはcrRNAの各ヌクレオチドを突然変異させた。Cas9 sgRNAのPAM部位に隣接する単一の点突然変異は、その機能に対して重大な影響を及ぼしたが、一方、突然変異部位がPAM部位から10塩基対隔たっていると影響はほとんどまたは全く観察されなかった。しかし、crRNAにおける単一の突然変異でさえも、突然変異部位がどこに位置するかに関係なく、Cpf1の機能を完全に消失させた。興味深いことに、TRBCを標的とするsgRNAの突然変異はeSpCas9の機能を消失させ、一方、TRACを標的とするsgRNAの突然変異はeSpCas9の機能の大半の保持をもたらした（図3B）。この知見により、Cpf1がeSpCas9よりもそのガイドRNAに対してはるかにより忠実である可能性が指し示された。

これらのデータはすべて、Cpf1およびCas9の標的DNA認識機構が異なることを指し示している。加えて、主としてエクソン中のコード配列に分布しているNGGとは対照的に、多くのTTTN配列は非翻訳領域内に位置しており、それ故にCpf1のオフターゲット関連の機能的影響がCas9よりも重大でないことにつながる。

実施例5：考察
CRISPRシステムの最も関心を引く用途の一つとして、高効率の遺伝子編集は、T細胞を利用する養子免疫療法を進展させる上で大いに有望である。しかし、Cas9ホモログであるCpf1およびそのガイドcrRNAの特徴はほとんど明らかになっていない。現在までに、Cpf1を用いたT細胞におけるターゲティングされたゲノム編集の可能性はまだ探究されていない。本研究は、Cpf1-crRNAを用いて効率的かつ特異的な遺伝子破壊を達成しうることを実証した。

40～50％を上回る遺伝子破壊を、crRNAの複数回送達によって成し遂げることができたが、この高い効率はT細胞に対する毒性も引き起こした。複数回のエレクトロポレーションに伴う毒性を最小限に抑えるために、crRNAの構造的および化学的な修飾を行った。ステムループ-crRNAの複数回の送達の使用を通じて、80％を上回る遺伝子破壊が達成された。しかし、単回エレクトロポレーション後には実質的な遺伝子破壊は観察されなかった。2'-O-メチル3'ホスホロチオエート化（MS）された化学修飾sgRNAの使用を通じての遺伝子破壊の強化が報告されているが、crRNAのMS修飾は、本明細書において、単回エレクトロポレーション後に検出可能な遺伝子破壊をもたらさなかった。crRNAの部分的ホスホロチオエート化を伴う遺伝子編集は9％遺伝子破壊のみをもたらしたが、保護性ステムループをcrRNAに組み入れることにより、7倍近くの遺伝子ターゲティングの増加が達成され、60％超に達した。

CrRNAは、尾部AAまたは内部ヌクレオチドのいずれかの修飾によってその機能が消失したことから、そのハンドル構造の修飾に対して極めて敏感であることが見いだされた。この知見により、crRNAの構造はその形成にとって決定的に重要であり、それ故にハンドル構造の修飾はCpf1とのその相互作用を破壊する可能性があることが示唆された。crRNAのハンドルステムループの延長によってその機能が消失し、このことは、crRNAとの複合体におけるCpf1の結晶構造において以前に解明されている、Cpf1結合ポケットの空間的制約を指し示している。

Cpf1による遺伝子編集は、Cas9と比較して、3種類の試験した内在性遺伝子のすべてについて、生じるオフターゲット突然変異誘発がより少なかった。ガイドRNAに対する忠実度を、crRNAおよびsgRNAにおける突然変異に対する寛容性に基づいて評価したところ、Cpf1がT細胞においてCas9よりも厳密であることが同じく実証された。Cas9およびCpf1は両方ともDSBを生成させたが、Cas9はそのRuvC様ドメインおよびHNH様ドメインを用いてシード配列内にスタガードカットを生じさせ、一方、Cpf1はRuvC様ドメインを用いてシード配列の外側にスタガードカットを生じさせた。結晶構造から指し示されるように、ターゲティングされた切断は、Cas9とPAM配列との相互作用によって引き起こされる、二本鎖標的DNAの解離を必要とする。この結果は、Cas9については、シード領域内での切断を通じて二本鎖DNAを解離させるために必要なエネルギーが、Cpf1がシード領域の外側の部位を切断するよりも少ない可能性があることを指し示している。この特性は結果として、Cas9の、Cpf1よりも高いオフターゲット可能性をもたらしうる。

以上をまとめると、CRISPR／Cpf1システムがT細胞における効率的でかつ高忠実度の遺伝子編集ツールであることが、本明細書において実証された。

他の態様
本明細書における変数の定義における要素のリストの記述は、単一の要素または列記された要素の組み合わせ（または部分的組み合わせ）としての、その変数の定義を含む。本明細書における態様の記述は、単一の態様としての、または他の態様もしくはその一部分と組み合わせられた、その態様を含む。

本明細書に引用された特許、特許出願および刊行物のそれぞれおよびすべての開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。具体的な態様を参照しながら本発明を開示してきたが、本発明の真の趣旨および範囲を逸脱することなく、本発明の他の態様および変形物も当業者によって考案されうることは明らかである。添付された特許請求の範囲は、そのようなすべての態様および等価な変形物を含むことを意図している。

Claims (31)

1. (a)ステムループCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）RNA（st-crRNA）を含む外来性核酸であって、該st-crRNAが、
   (i)細胞中の標的核酸配列にハイブリダイズする配列を含み、5’末端または3’末端にハンドルステムループ構造を含む、crRNA、および
   (ii)該crRNAの5’末端または3’末端に結合した追加のステムループ構造
   を含む、
   外来性核酸、ならびに
   (b)Cpf1酵素をコードする外来性核酸
   を細胞に導入する段階を含む、エクスビボの遺伝子編集の方法であって、
   該st-crRNAと該Cpf1酵素が、RNAガイド（RNA-guided)DNAエンドヌクレアーゼ(RGEN)複合体を形成して、標的核酸配列を編集する、
   方法。
2. 細胞がT細胞である、請求項1記載の方法。
3. T細胞が初代T細胞である、請求項2記載の方法。
4. 導入する段階が、前記外来性核酸を細胞内にエレクトロポレーションすることを含む、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
5. エレクトロポレーションが複数回行われる、請求項4記載の方法。
6. Cpf1酵素がアシダミノコッカス属（Acidaminococcus）Cpf1（AsCpf1）を含む、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
7. Cpf1酵素がラクノスピラ科（Lachnospiraceae）Cpf1（LbCpf1）を含む、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
8. st-crRNAが、crRNAの5'末端にステムループ構造を含む、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
9. st-crRNAが、crRNAの3'末端にステムループ構造を含まない、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
10. ステムループ構造が、ステムループの5'末端に付加された3つのグアノシン残基をさらに含む、請求項8または9記載の方法。
11. 3つのグアノシン残基がホスホロチオエート化によって修飾されている、請求項10記載の方法。
12. st-crRNAのプロトスペーサー領域が、部分的ホスホロチオエート化（PMS）修飾をさらに含む、請求項10または11記載の方法。
13. st-crRNAのハンドル構造が修飾されていない、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。
14. st-crRNAのcrRNA部分が少なくとも17bp長である、請求項1～13のいずれか一項記載の方法。
15. 標的核酸が、
    TCR α鎖定常領域（TRAC）、TCR β定常領域（TRBC）、およびβ-2ミクログロブリン（B2m）
    からなる群より選択される細胞中の遺伝子座位にハイブリダイズする、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
16. (a)
    (i)細胞中の標的核酸配列にハイブリダイズする配列を含み、5’末端または3’末端にハンドルステムループ構造を含む、crRNA、および
    (ii)5’末端または3’末端に結合した追加のステムループ構造
    を含むst-crRNAをコードする外来性核酸、ならびに
    (b)Cpf1酵素をコードする外来性核酸
    を含む、遺伝子改変細胞であって、該st-crRNAと該Cpf1酵素が、RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼ(RGEN)複合体を形成する、遺伝子改変細胞。
17. T細胞である、請求項16記載の遺伝子改変細胞。
18. T細胞が初代T細胞である、請求項17記載の遺伝子改変細胞。
19. Cpf1酵素がアシダミノコッカス属Cpf1（AsCpf1）を含む、請求項16～18のいずれか一項記載の遺伝子改変細胞。
20. Cpf1酵素がラクノスピラ科Cpf1（LbCpf1）を含む、請求項16～19のいずれか一項記載の遺伝子改変細胞。
21. st-crRNAが、crRNAの5'末端にステムループ構造を含む、請求項16～20のいずれか一項記載の遺伝子改変細胞。
22. st-crRNAが、crRNAの3'末端にステムループ構造を含まない、請求項16～21のいずれか一項記載の遺伝子改変細胞。
23. ステムループ構造が、ステムループの5'末端に付加された3つのグアノシン残基をさらに含む、請求項22記載の遺伝子改変細胞。
24. 3つのグアノシン残基がホスホロチオエート化によって修飾されている、請求項23記載の遺伝子改変細胞。
25. st-crRNAのプロトスペーサー領域が、部分的ホスホロチオエート化（PMS）修飾をさらに含む、請求項23または24記載の遺伝子改変細胞。
26. st-crRNAのハンドル構造が修飾されていない、請求項16～25のいずれか一項記載の遺伝子改変細胞。
27. st-crRNAのcrRNA部分が少なくとも17bp長である、請求項16～26のいずれか一項記載の遺伝子改変細胞。
28. 請求項16～27のいずれか一項記載の改変細胞を含む改変細胞の集団を含む、養子細胞移入療法のための医薬。
29. 請求項16～27のいずれか一項記載の改変細胞を含む改変細胞の集団を含む、疾患または状態を治療するための医薬。
30. 疾患または状態が、感染症、自己免疫疾患および癌からなる群より選択される、請求項29記載の医薬。
31. 疾患または状態に対する二次治療と組み合わせて用いられることを特徴とする、請求項29または30記載の医薬。

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