CN114729325A

CN114729325A - 在培养物中具有改善的持久性的基因工程化t细胞

Info

Publication number: CN114729325A
Application number: CN202080067648.4A
Authority: CN
Inventors: J.A.特雷特; D.卡莱齐迪斯; H.瓦尔德纳
Original assignee: CRISPR Therapeutics AG
Current assignee: CRISPR Therapeutics AG
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2022-07-08
Also published as: AU2020343516A1; MX2022002763A; US20210079347A1; JP2022547865A; BR112022003891A2; KR20220051401A; CO2022002355A2; CA3150151A1; WO2021044378A1; EP4025689A1; IL290795A

Abstract

包含基因工程化T细胞的T细胞库，与非工程化T细胞对应物相比，这些基因工程化T细胞具有一个或多个以下特征：(a)在培养物中增强的扩增能力，(b)增强的增殖能力，(c)减少的凋亡，以及(d)增强的激活频率。此类基因工程化T细胞可包含(i)突变的参与细胞自我更新的基因；(ii)破坏的参与凋亡的基因；(iii)破坏的参与T细胞耗竭调节的基因；或者(iv)(i)‑(iii)中任一项的组合。

Description

在培养物中具有改善的持久性的基因工程化T细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年9月6日提交的美国临时专利申请号62/897,016、2019年10月30日提交的美国临时专利申请号62/927,764和2020年6月4日提交的美国临时专利申请号63/034,646的优先权权益。上述申请中的每一项特此通过援引以其全文并入。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法使用经基因修饰的T细胞来更特异性和有效地靶向和杀伤癌细胞。从血液中收集T细胞后，对细胞进行工程化，使其表面上包含CAR。可使用CRISPR/Cas9基因编辑技术将CAR引入T细胞中。将这些同种异体CAR T细胞注射到患者体内时，受体使T细胞能够杀伤癌细胞。

CAR-T疗法需要在培养物中具有改善的持久性的T细胞。此类T细胞在体外和体内都存活得更久，从而在CAR T细胞制备和临床应用中带来益处。然而，改善培养物中T细胞的持久性仍然具有挑战性。

发明内容

本披露至少部分地基于T细胞库的开发，该T细胞库包含对某些基因(例如，参与细胞自我更新的基因，诸如TET2；参与凋亡的基因，诸如FAS；参与T细胞耗竭或复制性衰老的基因，诸如CD70；或它们的组合)进行基因编辑的T细胞，以改善T细胞在细胞培养中的持久性。本文披露的经基因编辑的T细胞表现出在培养物中增强的细胞扩增和增殖能力、减少的凋亡(例如，由FAS配体诱导)、增强的激活频率(例如，增强的细胞毒性)，以及增强的动物模型CAR-T功效(经由例如更长的持久性)。例如，具有破坏的TET2基因的CAR-T细胞在体外表现出生长优势和CAR-T富集效应，并且允许CAR-T细胞在具有液体肿瘤和实体肿瘤的动物模型中持续更长时间。此外，具有破坏的TET2基因的经基因编辑的T细胞表现出细胞因子依赖性生长，这表明是安全的。这种T细胞库(例如，具有破坏的TET2基因)可用于制备治疗性T细胞，例如CAR-T细胞。

因此，本披露的一个方面提供了一种基因工程化T细胞群体(T细胞库)，该群体包含：(i)突变的参与细胞自我更新的基因；(ii)破坏的参与凋亡的基因；(iii)破坏的参与T细胞耗竭或复制性衰老调节的基因；或者(iv)(i)-(iii)中任一项的组合。与非工程化T细胞对应物相比，基因工程化T细胞群体具有一个或多个以下优越特征：(a)在培养物中增强的扩增能力，(b)增强的增殖能力，(c)降低的凋亡水平，以及(d)增强的激活频率。如本文披露的T细胞库可源自一个或多个供体(例如，一个或多个人类供体)的原代T细胞。

在一些实施例中，参与细胞自我更新的基因可包括TET2基因。突变的TET2基因可以是破坏的TET2基因，其不表达功能性TET2蛋白。替代性地，突变的TET2基因可以是经调节的TET2基因，其表达TET2的截短形式(例如，分子量为约170kDa的截短形式)。可例如使用靶向TET2基因(编码区或非编码区)中所需位点的引导RNA(gRNA)通过CRISPR/Cas介导的基因编辑对任何突变的TET2基因进行基因编辑。在一些实例中，突变的TET2基因可在外显子1、外显子3、外显子4、外显子5和外显子6中的一个或多个中具有一个或多个基因编辑事件。在具体实例中，使用包含SEQ ID NO:14、18、22、26、112、116或120的gRNA对突变的TET2基因进行基因编辑。

在一些实施例中，参与凋亡的基因可包括FAS，和/或参与T细胞耗竭的基因可包括CD70。可例如经由CRISPR/Cas介导的基因编辑破坏此类基因。靶向FAS的示例性gRNA可包含SEQ ID NO:69、73、77、81或85。靶向CD70的示例性gRNA可包含SEQ ID NO:34、38、42、46、50、54或58。

在一些实施例中，本文所述的基因工程化T细胞群体可包含至少一种突变的参与细胞自我更新的基因(例如，TET2)、至少一种参与凋亡的基因(例如，FAS)和/或至少一种参与T细胞耗竭的基因(例如，CD70)的组合。

如本文披露的任何基因工程化T细胞群体可进一步包含破坏的β-2-微球蛋白(β2M)基因、破坏的T细胞受体α链恒定区(TRAC)基因或它们的组合。在一些实施例中，T细胞可进一步被工程化为表达例如包含编码CAR的核酸的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实例中，核酸插入T细胞的基因组中。在具体实例中，基因工程化T细胞可具有破坏的TRAC基因，可在其中插入编码嵌合抗原受体的核苷酸。在一些实施例中，CAR可靶向肿瘤抗原。实例包括CD19、B细胞成熟抗原(BCMA)或CD70。

在另一个方面，本披露提供了一种用于制备如本文披露的T细胞库的方法。这种方法可包括(a)提供多个细胞，这些细胞是T细胞或其前体细胞；(b)对至少一种参与细胞自我更新的基因(例如，TET2)、至少一种参与凋亡的基因(例如，FAS)和/或至少一种参与T细胞耗竭调节的基因(例如，CD70)进行基因编辑；以及(c)产生基因工程化T细胞群体。

在一些实施例中，步骤(a)的T细胞可源自一个或多个合适的供体，例如一个或多个人类供体。在一些实施例中，T细胞表现出细胞因子依赖性生长。

在一些实施例中，步骤(b)可以通过向(a)的细胞递送一种或多种RNA引导的核酸酶和一种或多种对本文披露的一种或多种靶基因具有特异性的gRNA来进行。在一些实例中，RNA引导的核酸酶可以是Cas9核酸酶，例如酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶。在一些实例中，RNA引导的核酸酶和一种或多种gRNA可以复合在核糖核蛋白颗粒(RNP)中。步骤(b)可通过单次电穿孔事件来进行。替代性地，步骤(b)可通过两次连续电穿孔事件来进行。

在一些实施例中，靶基因包括TET2。靶向TET2的示例性gRNA可对TET2基因的外显子1、外显子3、外显子4、外显子5和/或外显子6具有特异性。此类gRNA可包含SEQ ID NO:14、18、22或26的核苷酸序列。替代性地或另外，靶基因可包括FAS和/或CD70。靶向FAS的示例性gRNA可包含SEQ ID NO:69、73、77、81或85的核苷酸序列。靶向CD70的示例性gRNA可包含SEQID NO:34、38、42、46、50、54或58的核苷酸序列。

在又一个方面，本披露提供了一种使用来自本文披露的任何T细胞库的基因工程化T细胞制备表达嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的方法。这种方法可包括：(a)提供来自T细胞库的多个T细胞，该T细胞库可包含具有至少一种参与细胞自我更新的基因(例如，TET2)、至少一种参与凋亡的基因(例如，FAS)和/或至少一种参与T细胞耗竭调节的基因(例如，CD70)的基因工程化T细胞；(b)向多个T细胞递送编码CAR的核酸；以及(c)产生表达CAR的基因工程化T细胞。

在一些实施例中，来自T细胞库的多个T细胞进一步包含破坏的β2M基因。在其他实施例中，该方法可进一步包括对β2M基因进行基因编辑，例如向多个T细胞递送靶向β2M基因的gRNA。

在一些实施例中，来自T细胞库的多个T细胞进一步包含破坏的TRAC基因。在其他实施例中，该方法可进一步包括对TRAC基因进行基因编辑，例如向多个T细胞递送靶向TRAC基因的gRNA。

在本文披露的任何方法中，可向来自T细胞库的多个T细胞递送RNA引导的核酸酶。在一些实例中，RNA引导的核酸酶可以是Cas9核酸酶，例如酿脓链球菌Cas9核酸酶。在一些实例中，RNA引导的核酸酶和gRNA可以复合在核糖核蛋白颗粒(RNP)中。

通过本文披露的任何制备方法制备的经基因编辑的T细胞也在本披露的范围内。

本文披露的任何CAR-T细胞可以低于CAR-T疗法的标准剂量的剂量用于治疗目的(例如，消除CAR-T细胞上的CAR多肽靶向的疾病细胞)，该标准剂量是指表达相同CAR多肽并且缺乏如本文披露的用于增强T细胞持久性的基因编辑(例如，没有对TET2、FAS和/或CD70进行基因编辑)的CAR-T细胞的剂量。

靶向TET2基因的引导RNA(gRNA)也在本披露的范围内。在一些实施例中，gRNA包含对TET2基因的外显子外显子5具有特异性的核苷酸序列。在一些实例中，由gRNA编辑的TET2基因可表达TET2的截短形式。这种gRNA可靶向TET2基因的外显子5中的GGGATGTCCTATTGCTAAGT(SEQ ID NO:125)。在一个实例中，gRNA可包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列。替代性地，gRNA可靶向TET2基因的外显子5中的AGGGATGTCCTATTGCTAAG(SEQ IDNO:126)。在一个实例中，gRNA可包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列。

在其他实施例中，gRNA可包含靶向TET2基因的外显子3的核苷酸序列。例如，gRNA可包含靶向TET2基因的外显子3中的GATTCCGCTTGGTGAAAACG(SEQ ID NO:129)的核苷酸序列。替代性地，gRNA可包含靶向TET2基因的外显子3中的CAGGACTCACACGACTATTC(SEQ IDNO:131)的核苷酸序列。在另一个实例中，gRNA可包含靶向TET2基因的外显子3中的TTCCGCTTGGTGAAAACGAG(SEQ ID NO:133)的核苷酸序列。示例性gRNA可包含SEQ ID NO:112、116或120的核苷酸序列。

在一些实施例中，gRNA可包含靶向TET2基因的外显子4的核苷酸序列。例如，gRNA可包含靶向TET2基因的外显子4中的CATTAGGACCTGCTCCTAGA(SEQ ID NO:124)的核苷酸序列。在一个实例中，gRNA可包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。

在一些实施例中，gRNA可包含靶向TET2基因的外显子6的核苷酸序列。例如，gRNA可包含靶向TET2基因的外显子6中的ACGGCACGCTCACCAATCGC(SEQ ID NO:127)的核苷酸序列。在一个实例中，gRNA可包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列。

如本文披露的任何gRNA可进一步包含支架序列。在一些情况下，gRNA可包含一个或多个修饰的核苷酸，例如gRNA的5’和/或3’末端的一个或多个2’-O-甲基硫代磷酸酯残基。靶向TET2的示例性gRNA在表3(包括未修饰的序列和修饰的序列)中提供，所有这些都在本披露的范围内并且可以用于本文披露的任何方法中以在宿主细胞诸如T细胞中对TET2基因进行基因编辑。

本发明的一个或多个实施例的细节在以下说明书中阐述。根据以下附图和对若干实施例的详细描述，并且还根据所附权利要求书，本发明的其他特征或优点将变得显而易见。

附图说明

图1A-1D包括显示导致TET2基因敲除(KO)或蛋白截短的突变增加了原代人类T细胞的增殖和扩增的图。图1A：图片显示在由靶向TET2基因的外显子5的gRNA编辑的原代人类T细胞中存在TET2蛋白，如通过蛋白印迹测定所确定。在用包括TET2外显子5_T1和TET2外显子5_T2的gRNA中的一种转染的细胞中没有检测到蛋白。TET2外显子5_T1 gRNA产生了TET2蛋白的截短形式。图1B：图片显示在由靶向TET2基因的外显子4或外显子6的gRNA编辑的原代人类T细胞中存在TET2蛋白，如通过蛋白印迹测定所确定。在用TET2外显子4_BG4和TET2外显子6_BG5转染的细胞中没有检测到全长蛋白。TET2外显子6_BG5处理也产生了截短的TET2蛋白种类。图1C：图显示TET2的调节显著增强了培养物中的T细胞增殖和扩增。与模拟组相比，通过TET2外显子5_T1和TET2外显子5_T2缺失TET2增加了T细胞增殖。与所有其他组相比，具有截短的TET2(TET2外显子5_T1)的T细胞具有更大的增殖。图1D：图显示TET2的调节显著增强了培养物中的T细胞增殖。与未接受Cas9:sgRNA RNP的细胞相比，通过TET2外显子4_BG4(BG4)或TET2外显子6_BG5(BG5)缺失TET2增加T细胞增殖和扩增。

图2A-2C包括显示FAS敲除(KO)在体外在抗BCMA CAR T细胞中增加了细胞因子驱动的增殖并拯救了凋亡的图。图2A：图显示原代人类T细胞中的高效FAS基因编辑。FMO-FAS组代表荧光减一组，即FAS信号的阴性对照。图2B：图显示FAS的敲除在体外在抗BCMA CAR T细胞中改善了IL-2/IL-7驱动的增殖。图2C：图显示FAS的敲除拯救了抗BCMA CAR+T细胞免于由抗FAS抗体诱导的凋亡。

图3A和图3B包括显示三重敲除(FAS/TET2/CD70敲除)T细胞中增加的细胞杀伤和细胞增殖的图。图3A：图显示FAS/TET2/CD70三重敲除增加了抗CD19 CAR T细胞的细胞杀伤功能(48小时)。图3B：图显示在培养四周后三重敲除T细胞中的细胞增殖继续。

图4包括显示CAR-T细胞在患有急性淋巴细胞白血病的小鼠中扩增的图。用具有破坏的TRAC和B2M基因的抗CD19 CAR-T细胞处理小鼠，并任选地与所示的破坏的TET2、CD70和/或FAS组合。

图5A-5B包括显示CAR-T细胞在患有急性淋巴细胞白血病的小鼠中增加存活率和肿瘤抑制的图。图5A：图显示在CAR T细胞中添加TET2 KO增加了存活率。图5B：图显示添加TET2 KO进一步降低了用CAR T细胞处理的小鼠中的肿瘤负荷。

图6A-6E包括显示当暴露于肿瘤再攻击时含有TET2 KO的CAR T细胞的保护作用的图。图6A：图显示TET2 KO在被肿瘤再攻击的抗CD19 CAR T细胞中的保护作用。图6B：图显示TET2 KO在抗BCMA CAR T细胞中的保护作用。图6C：图显示TET2 KO在被肿瘤再攻击的抗BCMA CAR T细胞中的保护作用。图6D：图显示TET2 KO在抗CD70 CAR T细胞中的保护作用。图6E：图显示TET2 KO在被肿瘤再攻击的抗CD70 CAR T细胞中的保护作用。

图7包括显示TRAC-/B2M-/TET2-CAR T细胞的细胞因子非依赖性生长的图。

图8A-8D包括显示与TET WT抗BCMA CAR-T细胞相比，TET KO在抗BCMA CAR-T细胞中赋予的有利特征的图。图8A：图显示3轮MM.1S靶细胞刺激后抗BCMA CAR-T细胞+/-TET2KO的扩增生长曲线。图8B：图显示3轮MM.1S靶细胞刺激后抗BCMA CAR-T细胞+/-TET2 KO的活力曲线。图8C：图显示3轮MM.1S靶细胞刺激后抗BCMA CAR-T细胞+/-TET2 KO的FACS表面表达曲线。图8D：图表显示MM1S刺激抗BCMA CAR-T细胞+/-TET2 KO后的细胞因子分泌(IFNγ)应答。

图9A-9E包括显示具有破坏的TET2、FAS和CD70基因的同种异体人抗CD19 CAR-T细胞的持久性的图。图9A：图表显示细胞因子依赖性的持续细胞增殖。图9B：图表显示脾分离后一个月同种异体人抗CD19 CAR-T细胞的细胞杀伤活性。图9C：图显示同种异体人抗CD19CAR-T细胞的干扰素γ分泌。图9D：图显示同种异体人抗CD19 CAR-T细胞的白细胞介素2(IL-2)分泌。图9E：图表显示同种异体人抗CD19 CAR-T细胞在Nalm6/NOG小鼠模型中的存活率。

具体实施方式

本披露旨在建立包含具有改善的持久性(CAR-T疗法中的长期需求)的T细胞的T细胞库。这种T细胞库可使用真正的T细胞作为原材料，例如，非转化T细胞、终末分化T细胞、具有稳定基因组的T细胞和/或依赖于细胞因子和生长因子进行增殖和扩增的T细胞。替代性地，这种T细胞库可使用从前体细胞诸如造血干细胞(例如，iPSC)(例如，体外培养)产生的T细胞。本文披露的T细胞库可在CAR-T细胞制备和临床应用中带来一个或多个益处。

产生常规的同种异体CAR T细胞，其中在大多数情况下编辑单个供体leukopak，使得细胞可以避免患者免疫系统的组分，因而不会引起GvHD。扩增这些CAR T细胞的过程可以产生数十个至数百个瓶装药物产品。患者可接受单个剂量或多个剂量。在制备过程中，这些CAR T细胞由于各种机制例如凋亡、耗竭、复制性衰老和细胞变得不太适合的其他过程而失去潜力。

本文披露的经编辑的T细胞库可提供单个leukopak能够由此产生数十个至数百个细胞“瓶”的细胞库的过程，每一个瓶可以用于产生同种异体CAR T细胞的多个瓶装药物产品。预计库存细胞以及由它们产生的CAR T细胞比通过标准(非细胞库)过程(没有本文披露的一个或多个基因编辑事件)产生的CAR T细胞保留更多的潜力。

本文中提供的T细胞库的其他无限有利特征包括：

(a)药物产品诸如CAR-T产品具有改进的质量和一致性。

(b)由T细胞库细胞产生的CAR-T细胞在人类患者中具有更大的效力和更长期的效力。

(c)剂量需求减少。因为本文披露的T细胞具有增强的增殖和扩增能力，所以它们可以在体内存活得更久。因此，相对于标准CAR-T疗法的较低剂量可以实现与不具有本文披露的基因编辑(例如，TET2的破坏)的常规CAR-T细胞基本上类似的治疗效果。

(d)安全性增加。发现本文披露的基因工程化T细胞的生长依赖于细胞因子，这表明没有转化。此外，由于较低剂量可能是足够的，因此预计使用本文披露的CAR-T细胞将减少通常与CART-T疗法相关的副作用，例如细胞因子释放综合征(CRS)、巨噬细胞激活综合征(MAS)、肿瘤溶解综合征(TLS)和/或神经毒性作用。

(e)由本文披露的CAR-T细胞的增殖和扩增增强、细胞毒性增强和体内持久性延长而引起功效增加。此外，如上所述，T细胞库将为患者提供可滴定给药的益处以优化安全性和功效。

(f)由于T细胞耗竭和/或复制性衰老减少以及在体外和体内在T细胞库中的持久性都延长，治疗效果也延长。

(g)增加可以从合适的天然来源(诸如单个leukopak)产生的瓶装药物产品(诸如同种异体CAR T细胞产品)的数量。

因此，本文提供了包含在培养物中具有改善的持久性的T细胞的T细胞库、产生此类T细胞库的方法以及使用此类T细胞库产生治疗性T细胞诸如CAR-T细胞的方法。用于制备本文披露的T细胞库的组分和过程(例如，用于基因编辑的CRISPR/Cas介导的方法和其中使用的组分)也在本披露的范围内。

I.具有增强的持久性的T细胞库

本文披露的T细胞库包含在培养物中具有增强的持久性的基因工程化T细胞。此类基因工程化T细胞可对一种或多种参与细胞自我更新的基因、一种或多种参与凋亡的基因和/或一种或多种参与T细胞耗竭的基因进行基因编辑。如本文披露的研究所示，相对于未编辑的T对应物，此类基因工程化T细胞显示出一个或多个以下优越特征：在培养物中增强的扩增能力(例如，在培养物中可扩增至少4周，例如至少6周；和/或相对于未编辑的对应物，可扩增至少10倍，例如可扩增至少15倍)，增强的增殖能力，更大的T细胞激活，以及降低的凋亡水平。

(i)T细胞库中的基因工程化T细胞

本文披露的T细胞库中的基因工程化T细胞包含与培养物中T细胞持久性相关的一种或多种基因的基因编辑。如本文所用的“T细胞持久性”是指T细胞在培养物中继续生长、增殖、自我更新、扩增和维持健康活性的倾向。在一些情况下，T细胞持久性可以用T细胞可在体外生长和扩增的寿命来表示，寿命可通过本文所述的常规方法和/或测定法来测量。在其他情况下，T细胞持久性可以用细胞死亡(例如凋亡)的减少或以衰竭或复制性衰老为特征的细胞状态的减少来表示。在其他情况下，T细胞持久性可通过培养物中T细胞激活能力的维持来呈现。

基因工程化T细胞的T细胞持久性可通过对在经由各种途径调节细胞持久性(例如，调节细胞自我更新、凋亡和/或细胞耗竭)中起作用的一种或多种基因进行基因编辑来实现。在一些实施例中，基因工程化T细胞可包括对参与调节细胞持久性的多种途径的多种基因进行基因编辑。此类基因工程化T细胞可在培养物中具有增加的生长寿命。此外，源自此类基因工程化T细胞的CAR-T细胞也可具有增强的体内治疗功效。

基因工程化T细胞可源自从合适的来源(例如，一个或多个哺乳动物供体)获得的亲本T细胞(例如，未编辑的野生型T细胞)。在一些实例中，亲本T细胞是从一个或多个人类供体获得的原代T细胞(例如，未转化的和终末分化的T细胞)。替代性地，亲本T细胞可分化自从一个或多个合适供体获得的前体T细胞或者可在体外培养的干细胞诸如造血干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。

在一些实施例中，基因工程化T细胞包含一种或多种突变的参与细胞自我更新的基因、一种或多种破坏的参与凋亡的基因以及/或者一种或多种破坏的参与细胞耗竭的基因。此类T细胞可通过基因编辑(包括基因组编辑)产生，基因编辑是一类基因工程化，其中在DNA序列中(诸如在靶细胞的基因组中)，进行一个或多个核苷酸/核酸的插入、缺失和/或取代。靶向基因编辑使得能够在靶细胞的基因组中的预选位点(例如，在靶基因或靶DNA序列中)实现插入、缺失和/或取代。当例如通过一个或多个核苷酸/一个或多个核酸的缺失、插入或取代来编辑内源基因的序列时，包含受影响序列的内源基因可能由于序列修饰而被敲除或敲低。因此，靶向编辑可用于破坏内源基因表达。“靶向整合”是指涉及在插入位点缺失或不缺失内源序列情况下，一个或多个外源序列的插入的过程。当存在包含外源序列的供体模板时，靶向整合可以由靶向基因编辑产生。

如本文所用，“突变的基因”包括引入靶基因的任何类型的基因突变。在一些情况下，“突变的基因”可以包括导致突变的基因产物(例如，截短的基因产物)表达的基因突变。在其他情况下，“突变的基因”可以是破坏的基因，其可含有基本上或完全消除基因产物表达的基因突变。

如本文所用，“被破坏的基因”是指相对于内源基因包含插入、缺失或取代的基因，使得来自内源基因的功能蛋白的表达被减少或抑制。如本文所用，“破坏基因”是指在内源基因中插入、缺失或取代至少一个核苷酸/核酸，从而减少或抑制来自内源基因的功能蛋白的表达的方法。破坏基因的方法是本领域技术人员已知的并且在本文中描述。

在一些实施例中，包含被破坏的基因的细胞不表达(例如，在细胞表面)由该基因编码的可检测水平(例如，在使用与所编码的蛋白结合的抗体的免疫测定中或通过流式细胞术)的蛋白。不表达可检测水平的蛋白的细胞可以称为敲除细胞。

在一些实施例中，本文披露的T细胞库的基因工程化T细胞可包含突变的TET2基因、破坏的FAS基因、破坏的CD70基因或它们的组合。在一些情况下，还可包括对另外的基因(例如，β2M和/或TRAC)进行基因编辑。

Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2基因(TET2)编辑

自我更新是细胞(例如，T细胞)分裂并保持相同细胞状态/身份的过程。参与细胞自我更新的基因是指正向调节或负向调节细胞自我更新的基因。本文披露的基因工程化T细胞可包括对正向调节细胞自我更新以增强其表达和/或编码的蛋白产物的生物活性的基因进行基因编辑。替代性地或另外，基因工程化T细胞可包括对负向调节细胞自我更新以破坏其表达的基因进行基因编辑。

在一些实施例中，基因工程化T细胞可包含突变的参与细胞自我更新的基因。这种基因可以是TET2(10/11易位-2)，一种甲基胞嘧啶双加氧酶。Tet2是一种催化修饰的基因组碱基甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶并进一步转化为导致胞嘧啶脱甲基化的中间体的双加氧酶。这种酶参与骨髓细胞生成，据报道TET2缺陷与几种骨髓增殖性疾病有关。TET2基因的结构是本领域已知的。例如，人TET2基因位于染色体4q24上。其他信息可以在GenBank中的Gene ID：54790或NCBI参考序列：NM_001127208.2中找到。

在一些实例中，基因工程化T细胞可包含破坏的TET2基因，使得T细胞中TET2的表达大幅降低或完全消除。破坏的TET2基因可在破坏TET2基因表达的一个或多个合适的靶位点(例如，在编码区或非编码调节区诸如启动子区中)包含一个或多个基因编辑。此类靶位点可基于用于制备基因工程化T细胞的基因编辑方法来鉴定。用于基因编辑的示例性靶位点可包括外显子1、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6或它们的组合。在一些实例中，一个或多个基因编辑可发生在外显子3、外显子4、外显子5或外显子6中。此类基因编辑可通过CRISPR/Cas技术使用合适的引导RNA(例如，表3中列出的那些)来诱导。使用表3中列出的gRNA得到的经编辑的TET2基因可包含下表15-21中提供的一个或多个经编辑的序列。

在其他实例中，基因工程化T细胞可包含表达截短形式的TET2蛋白的突变TET2基因，其可以是TET2的功能获得变体。这种突变TET2基因可在外显子5中具有基因编辑并产生分子量为约170kDa(其可以通过常规方法诸如SDS-PAGE来测定)的截短的TET2变体。

如本文所用的术语“约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在可接受的标准偏差内。替代性地，“约”可以意指给定值的至多±20％，优选至多±10％，更优选至多±5％，且更优选至多±1％的范围。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”是隐含的并且在该上下文中意指在特定值的可接受误差范围内。

在一些实例中，如本文披露的T细胞库可包含基因工程化T细胞，其中至少50％包含破坏的TET2基因(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或以上)。在一些实例中，如本文披露的T细胞库可包含基因工程化T细胞，其中至少50％包含突变的TET2基因(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或以上)，其可表达截短形式的TET2，诸如上文披露的。

FAS基因编辑

凋亡是一种发生在多细胞生物中的程序性细胞死亡过程。参与凋亡的基因是指正向调节或负向调节该生物过程的基因。本文披露的基因工程化T细胞可包括对正向细胞调节凋亡以破坏其表达的基因进行基因编辑。替代性地或另外，基因工程化T细胞可包括对负向调节细胞凋亡以增强其表达和/或基因产物的生物学活性的基因进行基因编辑。

在一些实施例中，基因工程化T细胞可包含参与细胞凋亡(例如，正向调节凋亡的基因的破坏)的经编辑的基因。这种基因可以是FAS基因，也称为FAS受体、CD95或凋亡抗原1(APO-1)。FAS基因编码细胞表面上的死亡受体，当被FAS配体触发时，该死亡受体导致凋亡。FASL-FAS诱导的凋亡是细胞中多种凋亡途径之一(另一种主要途径是线粒体途径)。FAS基因的结构是本领域已知的。例如，人FAS基因位于染色体10q24.1上。其他信息可以在GenBank中的Gene ID：355中找到。

在一些实例中，基因工程化T细胞可包含破坏的FAS基因，使得T细胞中FAS的表达大幅降低或完全消除。破坏的FAS基因可在破坏FAS基因表达的一个或多个合适的靶位点(例如，在编码区或非编码调节区诸如启动子区中)包含一个或多个基因编辑。此类靶位点可基于用于制备基因工程化T细胞的基因编辑方法来鉴定。用于基因编辑的示例性靶位点可包括外显子2、外显子3或它们的组合。

在一些实例中，如本文披露的T细胞库可包含基因工程化T细胞，其中至少50％包含破坏的FAS基因(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或以上)。

CD70基因编辑

T细胞耗竭是T细胞功能逐步和渐进性丧失的过程，该过程可由延长的抗原刺激或其他因素诱导。在T细胞耗竭中涉及的基因是指正向调控或负向调控该生物过程的基因。本文披露的基因工程化T细胞可包含对正向调控T细胞耗竭的基因的基因编辑以破坏其表达。替代性地或另外，基因工程化T细胞可包含对负向调控T细胞耗竭的基因的基因编辑以增强其表达和/或基因产物的生物活性。

在一些实施例中，基因工程化T细胞可包含经过编辑的在T细胞耗竭中涉及的基因，例如，正向调控T细胞耗竭的基因的破坏。此类基因可以是分化簇70(CD70)基因。CD70是肿瘤坏死因子超家族的成员，并且其表达限于激活的T和B淋巴细胞以及成熟的树突状细胞。CD70通过与其配体CD27相互作用而参与肿瘤细胞和调节性T细胞的存活。CD70及其受体CD27在包括T细胞(激活的和T_reg细胞)和B细胞在内的多种细胞类型的免疫功能中具有多种作用。

还发现破坏被工程化为表达抗原靶向部分的免疫细胞中的CD70基因增强了对大肿瘤的抗肿瘤功效并诱导了持久的抗癌记忆应答。具体而言，抗癌记忆反应在再攻击时阻止了肿瘤生长。此外，已证明破坏CD70基因会导致被工程化为表达抗原靶向部分的免疫细胞的细胞毒性在工程化免疫细胞与靶细胞的比率较低的情况下增强，这表明低剂量的工程化免疫细胞具有潜在功效。参见例如WO 2019/215500，其相关披露内容通过援引并入以用于本文提及的目的和主题。

CD70基因的结构是本领域已知的。例如，人CD70基因位于染色体19p13.3上。该基因含有四个蛋白编码外显子。其他信息可以在GenBank中的Gene ID：970中找到。

在一些实例中，基因工程化T细胞可包含破坏的CD70基因，使得T细胞中CD70的表达大幅降低或完全消除。被破坏的CD70基因可以在破坏CD70基因表达的一个或多个合适的靶位点(例如，在编码区或非编码调节区诸如启动子区中)包含一处或多处基因编辑。此类靶位点可基于用于制备基因工程化T细胞的基因编辑方法来鉴定。用于基因编辑的示例性靶位点可包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4或其组合。还参见WO 2019/215500，其相关披露内容通过援引并入以用于本文提及的目的和主题。

在一些实例中，如本文披露的T细胞库可包含基因工程化T细胞，其中至少50％包含破坏的CD70基因(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或以上)。

β2M基因编辑

在一些实施例中，如本文披露的T细胞库中的基因工程化T细胞可进一步包含破坏的β2M基因。β2M是MHC I复合物的常见(不变)组分。通过基因编辑破坏其表达将阻止宿主抗治疗性同种异体T细胞反应，从而导致同种异体T细胞持久性增加。在一些实施例中，内源性β2M基因的表达被消除以防止宿主抗移植物反应。

在一些实施例中，T细胞库中至少50％(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或以上)的基因工程化T细胞不表达可检测水平的β2M表面蛋白。

在一些实施例中，经编辑的β2M基因可包含选自表1中以下序列的核苷酸序列。本领域技术人员已知，经编辑的基因(诸如经编辑的β2M基因)中的不同核苷酸序列(例如，表1中的那些)可由单个gRNA产生。还参见WO 2019097305，其相关披露内容通过援引并入以用于本文提及的主题和目的。

表1.靶向β2M的示例性gRNA的序列

本文披露的T细胞库中的基因工程化T细胞可进一步包括一种或多种另外的基因编辑(例如，基因敲入或敲除)以改善T细胞功能。实例包括用于改善靶细胞裂解的敲入或敲除基因、用于增强治疗性T细胞(诸如由T细胞库的细胞制备的CAR-T细胞)的性能的敲入或敲除基因。实例包括免疫检查点基因诸如PD-1的敲除。

TRAC基因编辑

在一些实施例中，如本文披露的T细胞库中的基因工程化T细胞可进一步包含破坏的TRAC基因。这种破坏导致TCR功能的丧失，并使工程化T细胞无同种异体反应性并适合于同种异体移植，从而最小化移植物抗宿主疾病的风险。在一些实施例中，内源性TRAC基因的表达被消除以防止移植物抗宿主反应。还参见WO 2019097305，其相关披露内容通过援引并入本文以用于本文提及的目的和主题。

应当理解，多于一个合适的靶位点/gRNA可用于本文披露的每个靶基因，例如本领域已知的或本文披露的那些。例如在WO 2019097305中可以找到另外的实例，其相关披露内容通过援引并入本文以用于本文提及的目的和主题。

T细胞库中的示例性基因工程化T细胞

在一些实施例中，本文披露的T细胞库包含基因工程化T细胞群体，该群体包含破坏的TET2基因。这种基因工程化T细胞可进一步包含破坏的FAS基因、破坏的CD70基因或两者。在一些实施例中，本文披露的T细胞库可包含基因工程化T细胞群体，该群体包含选自突变的TET2基因、破坏的FAS基因和破坏的CD70基因的经基因编辑的基因中的至少两种的组合。这种基因工程化T细胞任选地可进一步包含破坏的β2M基因、破坏的TRAC基因或两者。

在一些实例中，本文披露的T细胞库包含基因工程化T细胞群体，该群体包含如本文披露的破坏的TET2基因。在一些情况下，T细胞库中至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或95％)的基因工程化T细胞不以如通过常规测定法测量的可检测水平表达表面TET2。

在一些实例中，本文披露的T细胞库包含基因工程化T细胞群体，该群体包含破坏的TET2基因和破坏的FAS基因。在一些情况下，T细胞库中至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或95％)的基因工程化T细胞包含破坏的TET2基因和破坏的FAS基因。

在一些实例中，本文披露的T细胞库包含基因工程化T细胞群体，该群体包含破坏的TET2基因和破坏的CD70基因。在一些情况下，T细胞库中至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或95％)的基因工程化T细胞包含突变或破坏的TET2基因和破坏的CD70基因。

在具体实例中，本文披露的T细胞库包含基因工程化T细胞群体，该群体包含破坏的TET2基因、破坏的FAS基因和破坏的CD70基因。在一些情况下，T细胞库中至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或95％)的基因工程化T细胞包含突变或破坏的TET2基因、破坏的FAS基因和破坏的CD70基因。

在一些实例中，本文披露的T细胞库包含基因工程化T细胞群体，该群体包含表达如本文披露的任何截短TET2多肽的突变的TET2基因以及破坏的FAS基因。在一些情况下，T细胞库中至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或95％)的基因工程化T细胞包含突变的TET2基因和破坏的FAS基因。

在一些实例中，本文披露的T细胞库包含基因工程化T细胞群体，该群体包含表达如本文披露的截短TET2多肽的突变的TET2基因以及破坏的CD70基因。在一些情况下，T细胞库中至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或95％)的基因工程化T细胞包含突变的TET2基因和破坏的CD70基因。

在具体实例中，本文披露的T细胞库包含基因工程化T细胞群体，该群体包含破坏的TET2基因、破坏的FAS基因和破坏的CD70基因。在一些情况下，T细胞库中至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或95％)的基因工程化T细胞包含破坏的TET2基因、破坏的FAS基因和破坏的CD70基因。

在具体实例中，本文披露的T细胞库包含基因工程化T细胞群体，该群体包含表达如本文披露的任何截短TET2多肽的突变的TET2基因、破坏的FAS基因和破坏的CD70基因。在一些情况下，T细胞库中至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或95％)的基因工程化T细胞包含突变的TET2基因、破坏的FAS基因和破坏的CD70基因。

在一些实施例中，T细胞库中的基因工程化T细胞(其可包含突变的TET2基因(例如，被破坏或突变以表达如本文披露的截短形式的TET2)、破坏的FAS基因和破坏的CD70中的一种或多种)可在培养物中扩增超过4周，例如超过5周、超过6周、超过8周和超过10周。在一些实例中，T细胞库中的基因工程化T细胞包含表达如本文披露的截短TET2多肽的突变的TET2基因(任选地在FAS和/或CD70中被破坏)，并且在培养物中6周后(例如，7周后、8周后、9周后或10周后)可扩增。此类基因工程化T细胞可在培养物中6周后(例如，7周后、8周后、9周后或10周后)保持被激活的能力。此外，此类基因工程化T细胞具有增加的扩增能力，其可以比非工程化对应物高至少10倍(例如，至少15倍)。非工程化对应物是指具有相同遗传背景的T细胞，除了如本文披露的参与细胞自我更新的基因(例如，TET2)、参与凋亡的基因(例如，FAS)和/或参与T细胞耗竭的基因(例如，CD70)，即与野生型相比被破坏/突变。

在一些实施例中，T细胞库中的基因工程化T细胞可包含破坏的FAS基因(任选地突变的TET2基因(例如，被破坏或表达如本文披露的截短TET2多肽)和/或破坏的CD70基因)，相对于非工程化对应物可具有减少的凋亡倾向。例如，培养物中基因工程化T细胞的FAS/FAS配体诱导的凋亡的水平可小于非工程化对应物中FAS/FAS配体诱导的凋亡的50％(例如，小于40％、小于30％、小于20％或更低)。

在一些实施例中，使用T细胞库中的基因工程化T细胞产生的CAR-T细胞包含破坏的CD70基因(任选地突变的TET2基因(例如，被破坏或表达如本文披露的截短TET2多肽)和/或破坏的FAS基因)，相对于非工程化对应物在体外和体内均可具有改善的效力(例如，高至少50％、高至少1倍、高至少2倍、高至少5倍或高至少10倍)。

在一些实施例中，T细胞库中的T细胞可进一步被工程化为表达嵌合抗原受体(CAR)，这在下文详细描述。

(ii)制备T细胞库的方法

本文披露的T细胞库的基因工程化T细胞可以经由常规基因编辑方法或本文所述的方法通过对亲本T细胞或其前体细胞进行基因编辑来制备。

(a)T细胞

在一些实施例中，用于制备T细胞库的T细胞可以源自一种或多种合适的哺乳动物，例如一个或多个人类供体。T细胞可以从多种来源获得，包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在某些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的许多技术诸如沉降(例如，FICOLLTM分离)从收集自受试者的血液单元中获得T细胞。

在一些实例中，可以从免疫细胞(例如，本文所述的那些)的混合物中分离T细胞以产生分离的T细胞群体，该群体可以用于制备本文披露的T细胞库。例如，在分离外周血单核细胞(PBMC)之后，可以在激活、扩增和/或基因修饰之前或之后，将细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞分类为原初、记忆和效应T细胞亚群。

T细胞的特定亚群(其表达以下一种或多种细胞表面标志物：TCRab、CD3、CD4、CD8、CD27 CD28、CD38 CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD122、CD95、CD197、CCR7、KLRG1、MCH-I蛋白和/或MCH-II蛋白)可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。在一些实施例中，通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，该特定亚群表达选自由TCRab、CD4和/或CD8组成的组中的标志物中的一种或多种。在一些实施例中，可以在基因工程化之前和/或基因工程化之后通过阳性或阴性选择来分离T细胞的亚群。

用于制备T细胞库的分离的T细胞群体可表达一种或多种T细胞标志物，包括但不限于CD3+、CD4+、CD8+或它们的组合。在一些实施例中，从供体或受试者分离T细胞，并在进行基因编辑之前首先激活和刺激其体外增殖。

在一些情况下，用于制备T细胞库的T细胞群体包含从一个或多个人类供体分离的原代T细胞。此类T细胞是终末分化的、未转化的，依赖于细胞因子和/或生长因子进行生长，和/或具有稳定的基因组。

替代性地，用于制备T细胞库的T细胞可通过体外分化源自干细胞(例如HSC或iPSC)。

为了获得足够量的T细胞来制备T细胞库，可以对来自合适来源的T细胞进行一轮或多轮刺激、激活和/或扩增。通常可以使用例如以下美国专利中所述的方法来激活和扩增T细胞：美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；和6,867,041。在一些实施例中，在将基因组编辑组合物引入T细胞之前，T细胞可以激活并扩增约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约3天、约2天至约4天、约3天至约4天或约1天、约2天、约3天或约4天。

在一些实施例中，在将基因编辑组合物引入T细胞之前，T细胞被激活并扩增约4小时、约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时或约72小时。在一些实施例中，在将基因组编辑组合物引入T细胞的同时激活T细胞。在一些情况下，可以在如本文披露的基因编辑之后扩增和/或激活T细胞群体。通过本文所述的任何基因编辑方法产生的T细胞群或分离的T细胞也在本披露的范围内。

(b)基因编辑方法

任何基因工程化T细胞都可以使用常规基因编辑方法或本文所述的那些方法来制备，以编辑本文披露的一种或多种靶基因(靶向编辑)。靶向编辑可以通过不依赖核酸酶的方法或依赖于核酸酶的方法来实现。在不依赖核酸酶的靶向编辑方法中，同源重组是由在外源多核苷酸侧翼的同源序列进行引导，该外源多核苷酸通过宿主细胞的酶促机制引入内源序列中。外源多核苷酸可以在内源序列中引入核苷酸的缺失、插入或替换。

替代性地，依赖于核酸酶的方法可以通过特异性稀有切割核酸酶(例如，内切核酸酶)特异性引入双链断裂(DSB)来实现更高频率的靶向编辑。这种依赖核酸酶的靶向编辑还利用DNA修复机制，例如非同源末端连接(NHEJ)，它响应于DSB而发生。NHEJ修复DNA通常会导致少量内源核苷酸的随机插入或缺失(插缺)。与NHEJ介导的修复相比，修复也可以通过同源定向修复(HDR)进行。当存在包含侧翼是一对同源臂的外源遗传物质的供体模板时，可通过HDR将外源遗传物质引入基因组，这导致外源遗传物质的靶向整合。

在一些实施例中，基因破坏可通过使用两个引导RNA缺失基因组序列而发生。使用CRISPR-Cas基因编辑技术在细胞中产生基因组缺失(例如，敲除细胞中的基因)的方法是已知的(Bauer DE等人,Vis.Exp.[视频实验]2015；95；e52118)。

能够引入特异性和靶向DSB的可用核酸内切酶包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和RNA引导的核酸酶诸如CRISPR/Cas(例如，规律成簇的间隔短回文重复序列相关蛋白9或CRISPR/Cas9)。另外，利用phiC31和Bxb1整合酶的DICE(双整合酶盒交换)系统也可以用于靶向整合。下面详细披露了一些示例性方法。

CRISPR-Cas9基因编辑系统

CRISPR-Cas9系统是原核生物中天然存在的防御机制，其已被重新用作用于基因编辑的RNA引导的DNA靶向平台。它依赖于DNA核酸酶Cas9和两个非编码RNA(crisprRNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA))来靶向DNA的切割。CRISPR是规律间隔成簇短回文重复序列的缩写，是在细菌和古细菌基因组中发现的DNA序列家族，其包含与先前暴露于细胞(例如病毒)的外源DNA(例如，由感染或攻击原核生物的病毒暴露于细胞的外源DNA)相似的DNA片段(间隔子DNA)。这些DNA片段被原核生物用来在重新引入后，例如在随后的攻击中从相似的病毒中检测和破坏相似的外源DNA。CRISPR基因座的转录导致包含间隔子序列的RNA分子的形成，该RNA分子缔合并靶向Cas(CRISPR相关)蛋白以能够识别和剪切外源(外源DNA)。已经描述了许多类型和种类的CRISPR/Cas系统(参见例如，Koonin等人,(2017)CurrOpin Microbiol[微生物学当前观点]37:67-78)。

crRNA通过典型地与靶DNA中的20个核苷酸(nt)序列的沃森-克里克碱基配对来驱动CRISPR-Cas9复合物的序列识别和特异性。改变crRNA中5’20nt的序列可将CRISPR-Cas9复合物靶向特定基因座。如果靶序列后面是特定的短DNA序列(序列为NGG)作为原型间隔子相邻基序(PAM)，CRISPR-Cas9复合物仅结合包含与crRNA的前20nt序列匹配的DNA序列。

TracrRNA与crRNA的3’末端杂交形成RNA双链体结构，该双链体结构与Cas9内切核酸酶结合形成催化活性的CRISPR-Cas9复合物，其然后可以切割靶DNA。

一旦CRISPR-Cas9复合物在靶位点与DNA结合，Cas9酶内的两个独立的核酸酶结构域各自切割PAM位点上游的DNA链之一，从而留下双链断裂(DSB)，在这里DNA的两条链以碱基对(平末端)终止。

CRISPR-Cas9复合物在特定靶位点处与DNA结合并形成位点特异性DSB之后，下一个关键步骤是修复DSB。细胞使用两种主要的DNA修复途径来修复DSB：非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。

NHEJ是一种稳健的修复机制，在包括非分裂细胞在内的大多数细胞类型中显现出高活性。NHEJ容易出错，并且通常会在DSB的位点导致在一个到几百个核苷酸之间的去除或添加，尽管此类修饰典型地<20nt。产生的插入和缺失(插缺)可以破坏基因的编码或非编码区域。替代性地，HDR使用内源性或外源性提供的长段同源供体DNA来以高保真度修复DSB。HDR仅在分裂的细胞中有效，并且在大多数细胞类型中以相对较低的频率发生。在本披露的许多实施例中，NHEJ被作为自发的修复来利用。

用于CRISPR的核酸内切酶

在一些实施例中，Cas9(CRISPR相关蛋白9)核酸内切酶用于CRISPR方法中，该方法用于制备本文披露的基因工程化T细胞。Cas9酶可以是酿脓链球菌中的一种，尽管也可以使用其他Cas9同源物。应当理解，如本文所提供的，可以使用野生型Cas9或可以使用Cas9的修饰版本(例如，Cas9的进化版本，或Cas9直向同源物或变体)。在一些实施例中，Cas9可以被另一种RNA引导的内切核酸酶诸如(II类CRISPR/Cas系统的)Cpf1取代。

在一些实施例中，CRISPR/Cas系统包含源自I型、II型或III型系统的组分。CRISPR/Cas基因座的更新分类方案定义了1类和2类CRISPR/Cas系统，其具有I型至V型或VI型(Makarova等人,(2015)Nat Rev Microbiol[自然综述微生物学],13(11):722-36；Shmakov等人,(2015)Mol Cell[分子细胞],60:385-397)。2类CRISPR/Cas系统具有单蛋白效应子。II、V和VI型的Cas蛋白是单蛋白的、RNA引导的核酸内切酶，在本文中称为“2类Cas核酸酶”。2类Cas核酸酶包括，例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2和C2c3蛋白。Cpf1核酸酶(Zetsche等人,(2015)Cell[细胞]163:1-13)与Cas9同源，并且包含RuvC样核酸酶结构域。

在一些实施例中，Cas核酸酶来自II型CRISPR/Cas系统(例如，来自CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白)。在一些实施例中，Cas核酸酶来自2类CRISPR/Cas系统(单蛋白Cas核酸酶，例如Cas9蛋白或Cpf1蛋白)。Cas9和Cpf1蛋白家族是具有DNA核酸内切酶活性的酶，并且可以通过设计合适的引导RNA来指导它们切割所期望的核酸靶，如本文进一步所述。

在一些实施例中，Cas核酸酶可包含一个以上的核酸酶结构域。例如，Cas9核酸酶可包含至少一个RuvC样核酸酶结构域(例如Cpf1)和至少一个HNH样核酸酶结构域(例如Cas9)。在一些实施例中，Cas9核酸酶在靶序列中引入DSB。在一些实施例中，将Cas9核酸酶修饰为仅包含一个功能性核酸酶结构域。例如，修饰Cas9核酸酶，使得核酸酶结构域之一突变或全部或部分缺失以降低其核酸切割活性。在一些实施例中，Cas9核酸酶被修饰为包含无功能性RuvC样核酸酶结构域。在其他实施例中，Cas9核酸酶被修饰为包含无功能性HNH样核酸酶结构域。在一些其中仅一个核酸酶结构域起功能的实施例中，Cas9核酸酶是能够将单链断裂(“切口”)引入靶序列的切口酶。在一些实施例中，Cas9核酸酶核酸酶结构域内的保守氨基酸被取代以减少或改变核酸酶活性。在一些实施例中，Cas核酸酶切口酶在RuvC样核酸酶结构域中包含氨基酸取代。RuvC样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括D10A(基于酿脓链球菌Cas9核酸酶)。在一些实施例中，切口酶在HNH样核酸酶结构域中包含氨基酸取代。HNH样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A和D986A(基于酿脓链球菌Cas9核酸酶)。

在一些实施例中，Cas核酸酶来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，Cas核酸酶是I型CRISPR/Cas系统的Cascade复合物的组分。例如，Cas核酸酶是Cas3核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶衍生自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，Cas核酸酶衍生自IV型CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，Cas核酸酶衍生自V型CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，Cas核酸酶衍生自VI型CRISPR/Cas系统。

引导RNA(gRNA)

CRISPR技术涉及靶向基因组的核酸的使用，该靶向基因组的核酸可以将核酸内切酶引导至靶基因内的特定靶序列以在该特定靶序列处进行基因编辑。靶向基因组的核酸可以是RNA。靶向基因组的RNA在本文中称为“引导RNA”或“gRNA”。引导RNA至少包含与靶基因内用于进行编辑的靶核酸序列杂交的间隔子序列，以及CRISPR重复序列。

在II型系统中，gRNA还包含称为tracrRNA序列的第二RNA。在II型gRNA中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交形成双链体。在V型gRNA中，crRNA形成双链体。在这两个系统中，双链体都结合定点多肽，使得引导RNA和定点多肽形成复合物。在一些实施例中，靶向基因组的核酸由于其与定点多肽的缔合而为复合物提供了靶特异性。因此，靶向基因组的核酸定向定点多肽的活性。

如本领域普通技术人员所理解的，每个定向RNA设计为包括与其基因组靶序列互补的间隔子序列。参见Jinek等人,Science[科学],337,816-821(2012)和Deltcheva等人,Nature[自然],471,602-607(2011)。

在一些实施例中，靶向基因组的核酸(例如，gRNA)是双分子引导RNA。在一些实施例中，靶向基因组的核酸(例如，gRNA)是单分子引导RNA。

双分子引导RNA包含两条链的RNA分子。第一条链在5'至3'方向上包含任选的间隔子延伸序列、间隔子序列和最小CRISPR重复序列。第二条链包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。

II型系统中的单分子引导RNA(称为“sgRNA”)在5'至3'方向上包含任选的间隔子延伸序列、间隔子序列、最小CRISPR重复序列、单分子引导接头、最小tracrRNA序列、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸序列可以包含为引导RNA贡献另外的功能(例如，稳定性)的元件。单分子引导接头将最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列连接起来以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸包括一个或多个发夹。V型系统中的单分子引导RNA在5'至3'方向上包含最小CRISPR重复序列和间隔子序列。

gRNA中的间隔子序列是定义目标靶基因的靶序列(例如，DNA靶序列，诸如基因组靶序列)的序列(例如，20个核苷酸的序列)。在一些实施例中，间隔子序列为15至30个核苷酸。例如，间隔子序列可以含有15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列含有20个核苷酸。

“靶序列”在PAM序列相邻的靶基因中，并且是要被RNA引导的核酸酶(例如，Cas9)修饰的序列。“靶序列”在“靶核酸”中的所谓的PAM链上，该靶核酸是包含PAM链和互补的非PAM链的双链分子。本领域技术人员认识到，gRNA间隔子序列与位于目的靶核酸的非PAM链中的互补序列杂交。因此，gRNA间隔子序列是靶序列的RNA等同物。例如，如果靶序列是5′-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3′(SEQ ID NO:7)，则gRNA间隔子序列是5′-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3′(SEQ ID NO:8)。gRNA的间隔子经由杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与目的靶核酸相互作用。因此，间隔子的核苷酸序列根据目的靶核酸的靶序列而变化。

在本文的CRISPR/Cas系统中，将间隔子序列设计成与靶核酸的区域杂交，该区域位于该系统中使用的Cas9酶可识别的PAM的5'。间隔子可以与靶序列完全匹配或可以有错配。每个Cas9酶都有特定的PAM序列，使得该酶识别靶DNA。例如，酿脓链球菌识别靶核酸中的包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由间隔子序列靶向的靶核酸序列的3'。

在一些实施例中，靶核酸序列的长度是20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸的长度小于20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸的长度超过20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸具有至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸长度。在一些实施例中，靶核酸至多具有：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸长度。在一些实施例中，靶核酸序列具有20个紧邻PAM第一个核苷酸的5'的碱基。例如，在包含5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'的序列中，靶核酸可以是对应于该多个N的序列，其中N可以是任何核苷酸，并且该加下划线的NRG序列是酿脓链球菌PAM。

本文披露的引导RNA可以经由crRNA中的间隔子序列靶向任何目的序列。在一些实施例中，引导RNA的间隔子序列与靶基因中的靶序列之间的互补程度可以是约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，引导RNA的间隔子序列与靶基因中的靶序列是100％互补的。在其他实施例中，引导RNA的间隔子序列和靶基因中的靶序列可以包含多达10个错配，例如，多达9个、多达8个、多达7个、多达6个、多达5个、多达4个、多达3个、多达2个或多达1个错配。

可如本文提供那样使用的gRNA的非限制性实例在WO 2019097305中提供，其相关披露内容通过援引并入本文以用于本文提及的目的和主题。对于本文提供的任何gRNA序列，未明确指示修饰的那些意在包括未修饰的序列和具有任何合适的修饰的序列。

本文披露的任何gRNA中的间隔子序列的长度可以取决于CRISPR/Cas9系统和用于编辑本文披露的任何靶基因的组分。例如，来自不同细菌物种的不同Cas9蛋白具有不同的最佳间隔子序列长度。因此，间隔子序列的长度可以具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、或超过50个的核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列的长度可以具有18-24个核苷酸。在一些实施例中，靶向序列的长度可以具有19-21个核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列的长度可包含20个核苷酸。

在一些实施例中，gRNA可以是sgRNA，其可以在sgRNA序列的5’末端包含20个核苷酸间隔子序列。在一些实施例中，sgRNA可以在sgRNA序列的5’末端包含少于20个核苷酸的间隔子序列。在一些实施例中，sgRNA可以在sgRNA序列的5’末端包含大于20个核苷酸的间隔子序列。在一些实施例中，sgRNA在sgRNA序列的5’末端包含具有17-30个核苷酸的可变长度的间隔子序列。实例在下表2中提供。在这些示例性序列中，“n”的片段是指5’末端的间隔子序列。

表2.示例性sgRNA式

在一些实施例中，sgRNA在sgRNA序列的3’末端不包含尿嘧啶。在其他实施例中，sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含一个或多个尿嘧啶。例如，sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含1-8个尿嘧啶残基，例如，在sgRNA序列的3’末端包含1、2、3、4、5、6、7或8个尿嘧啶残基。

本文披露的任何gRNA，包括任何sgRNA，可以是未修饰的。替代性地，它可以包含一个或多个经修饰的核苷酸和/或经修饰的主链。例如，经修饰的gRNA(例如sgRNA)可以包含一个或多个2'-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸，其可以位于5’末端、3’末端或这两个末端。

在某些实施例中，一种以上的引导RNA可以与CRISPR/Cas核酸酶系统一起使用。每种引导RNA可包含不同的靶向序列，以使CRISPR/Cas系统切割一种以上的靶核酸。在一些实施例中，一种或多种引导RNA可以在Cas9 RNP复合物中具有相同或不同的性质，例如活性或稳定性。当使用一种以上引导RNA时，每种引导RNA可以在相同或不同的载体上编码。用于驱动一种以上引导RNA表达的启动子是相同或不同的。

在一些实施例中，本文披露的gRNA靶向TET2基因，例如靶向TET2基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或外显子6内的位点。此类gRNA可以包含与TET2基因的外显子3或外显子5中的靶序列或其片段互补(完全或部分互补)的间隔子序列。TET2的示例性靶序列以及示例性gRNA序列在下表3中提供：

表3.示例性TET2 gRNA序列/靶序列

*：2'-O-甲基硫代磷酸酯残基

在一些实施例中，靶向TET2的外显子3中的位点的gRNA(例如，上表3中列出的那些)可用于编辑TET2基因。例如，可使用靶向GATTCCGCTTGGTGAAAACG(SEQ ID NO:129)位点的gRNA，例如包含SEQ ID NO:112(未修饰)或SEQ ID NO:113(修饰)的间隔子的gRNA。这种gRNA可包含SEQ ID NO:114(未修饰)或SEQ ID NO:115(修饰)的核苷酸序列(例如，由其组成)。由靶向SEQ ID NO:129位点的gRNA编辑的T细胞可包含具有下表15中列出的至少一种修饰的经修饰的TET2基因。

在另一个具体实例中，可使用靶向CAGGACTCACACGACTATTC(SEQ ID NO:131)位点的gRNA，例如包含SEQ ID NO:116(未修饰)或SEQ ID NO:117(修饰)的间隔子的gRNA。这种gRNA可包含SEQ ID NO:118(未修饰)或SEQ ID NO:119(修饰)的核苷酸序列(例如，由其组成)。由靶向SEQ ID NO:131位点的gRNA编辑的T细胞可包含具有下表16中列出的至少一种修饰的经修饰的TET2基因。

在另一个具体实例中，可使用靶向TTCCGCTTGGTGAAAACGAG(SEQ ID NO:133)位点的gRNA，例如包含SEQ ID NO:120(未修饰)或SEQ ID NO:121(修饰)的间隔子的gRNA。这种gRNA可包含SEQ ID NO:122(未修饰)或SEQ ID NO:123(修饰)的核苷酸序列(例如，由其组成)。由靶向SEQ ID NO:133位点的gRNA编辑的T细胞可包含具有下表17中列出的至少一种修饰的经修饰的TET2基因。

在其他实施例中，对TET2基因具有特异性的gRNA可靶向外显子5内的位点。例如，可使用靶向外显子5中的GGGATGTCCTATTGCTAAGT(SEQ ID NO:125)位点的gRNA，例如包含SEQ ID NO:18(未修饰)或SEQ ID NO:19(修饰)的间隔子的gRNA。这种gRNA可包含SEQ IDNO:16(未修饰)或SEQ ID NO:17(修饰)的核苷酸序列(例如，由其组成)。由靶向SEQ ID NO:125位点的gRNA编辑的T细胞可包含具有下表19中列出的至少一种修饰的经修饰的TET2基因。在一些情况下，使用这种gRNA对TET2基因进行基因编辑可导致TET2蛋白的截短形式的表达，其可具有约170kDa的分子量。

在其他实例中，可使用靶向外显子5中的AGGGATGTCCTATTGCTAAG(SEQ ID NO:126)位点的gRNA，例如包含SEQ ID NO:22(未修饰)或SEQ ID NO:23(修饰)的间隔子的gRNA。这种gRNA可包含SEQ ID NO:20(未修饰)或SEQ ID NO:21(修饰)的核苷酸序列(例如，由其组成)。由靶向SEQ ID NO:126位点的gRNA编辑的T细胞可包含具有下表20中列出的至少一种修饰的经修饰的TET2基因。

在其他实施例中，对TET2基因具有特异性的gRNA可靶向外显子4内的位点。例如，可使用靶向外显子4中的CATTAGGACCTGCTCCTAGA(SEQ ID NO:124)位点的gRNA，例如包含SEQ ID NO:14(未修饰)或SEQ ID NO:15(修饰)的间隔子的gRNA。这种gRNA可包含SEQ IDNO:12(未修饰)或SEQ ID NO:13(修饰)的核苷酸序列(例如，由其组成)。由靶向SEQ ID NO:124位点的gRNA编辑的T细胞可包含具有下表21中列出的至少一种修饰的经修饰的TET2基因。

在其他实施例中，对TET2基因具有特异性的gRNA可靶向外显子6内的位点。例如，可使用靶向外显子6中的ACGGCACGCTCACCAATCGC(SEQ ID NO:127)位点的gRNA，例如包含SEQ ID NO:26(未修饰)或SEQ ID NO:27(修饰)的间隔子的gRNA。这种gRNA可包含SEQ IDNO:24(未修饰)或SEQ ID NO:25(修饰)的核苷酸序列(例如，由其组成)。由靶向SEQ ID NO:127位点的gRNA编辑的T细胞可包含具有下表18中列出的至少一种修饰的经修饰的TET2基因。

在一些实施例中，本文披露的gRNA靶向CD70基因，例如靶向CD70基因的外显子1或外显子3内的位点。这种gRNA可包含与CD70基因的外显子1或外显子3中的靶序列或其片段互补(完全或部分互补)的间隔子序列。CD70基因中的示例性靶序列和对CD70基因具有特异性的示例性gRNA在下表4中提供。

表4.示例性CD70 gRNA序列/靶序列

*：2'-O-甲基硫代磷酸酯残基

在一些实施例中，本文披露的gRNA靶向FAS基因，例如靶向FAS基因的外显子1、外显子2或外显子3内的位点。这种gRNA可包含与FAS基因的外显子1、外显子2或外显子3中的靶序列或其片段互补(完全或部分互补)的间隔子序列。FAS基因中的示例性靶序列和对FAS基因具有特异性的示例性gRNA在下表5中提供。

表5.示例性FAS gRNA序列/靶序列

*：2'-O-甲基硫代磷酸酯残基

在其他实施例中，对FAS基因具有特异性的gRNA可靶向外显子2内的位点。例如，可使用靶向FAS基因的外显子2中的SEQ ID NO:142位点的gRNA，例如包含SEQ ID NO:73(未修饰)或SEQ ID NO:74(修饰)的间隔子的gRNA。这种gRNA可包含SEQ ID NO:71(未修饰)或SEQID NO:72(修饰)的核苷酸序列(例如，FAS-外显子2-T2 gRNA)(例如，由其组成)。由靶向SEQID NO:142位点的gRNA编辑的T细胞可包含具有下表26中列出的至少一种修饰的经修饰的FAS基因。

在其他实施例中，对FAS基因具有特异性的gRNA可靶向外显子3内的位点。例如，可使用靶向FAS基因的外显子3中的SEQ ID NO:144位点的gRNA，例如包含SEQ ID NO:81(未修饰)或SEQ ID NO:82(修饰)的间隔子的gRNA。这种gRNA可包含SEQ ID NO:79(未修饰)或SEQID NO:80(修饰)的核苷酸序列(例如，FAS-外显子3-T1 gRNA)(例如，由其组成)。由靶向SEQID NO:144位点的gRNA编辑的T细胞可包含具有下表27中列出的至少一种修饰的经修饰的FAS基因。

在其他实施例中，对FAS基因具有特异性的gRNA可靶向外显子3内的位点。例如，可使用靶向FAS基因的外显子3中的SEQ ID NO:145位点的gRNA，例如包含SEQ ID NO:85(未修饰)或SEQ ID NO:86(修饰)的间隔子的gRNA。这种gRNA可包含SEQ ID NO:83(未修饰)或SEQID NO:84(修饰)的核苷酸序列(例如，FAS-外显子3-T2 gRNA)(例如，由其组成)。由靶向SEQID NO:145位点的gRNA编辑的T细胞可包含具有下表28中列出的至少一种修饰的经修饰的FAS基因。

在一些实施例中，本文披露的gRNA靶向β2M基因，例如靶向β2M基因内的合适位点。还参见2018年5月11日提交的国际申请号PCT/US 2018/032334，该国际申请的相关披露内容通过援引并入本文用于本文所引用的目的和主题。可使用位于第15号染色体上的β2M基因序列(GRCh38坐标：染色体15：44,711,477-44,718,877；Ensembl：ENSG00000166710)来设计其他gRNA序列。在一些实施例中，靶向β2M基因组区域的gRNA以及RNA引导的核酸酶在β2M基因组区域中产生断裂，导致β2M基因中的插缺破坏mRNA或蛋白的表达。

在一些实施例中，本文披露的gRNA靶向TRAC基因。还参见2018年5月11日提交的国际申请号PCT/US 2018/032334，该国际申请的相关披露内容通过援引并入本文用于本文所引用的主题和目的。可使用位于第14号染色体上的TRAC基因序列(GRCh38：染色体14：22,547,506-22,552,154；Ensembl；ENSG00000277734)来设计其他gRNA序列。在一些实施例中，靶向TRAC基因组区域的gRNA以及RNA引导的核酸酶在TRAC基因组区域中产生断裂，导致TRAC基因中的插缺破坏mRNA或蛋白的表达。

靶向β2M基因或TRAC基因的示例性间隔子序列和gRNA在下表6中提供。

表6.gRNA序列/靶序列

*：2'-O-甲基硫代磷酸酯残基

举例说明，用于CRISPR/Cas/Cpf1系统中的引导RNA或其他较小的RNA可以通过化学方法容易地合成，如下文所示和本领域所述。随着化学合成程序的不断发展，通过诸如高效液相色谱法(HPLC，其避免使用诸如PAGE等凝胶)等程序纯化此类RNA随着多核苷酸长度显著增加超过约一百个核苷酸而趋于更具挑战性。用于产生更大长度的RNA的一种方法是产生两个或更多个连接在一起的分子。更长的RNA(诸如编码Cas9或Cpf1内切核酸酶的那些)更容易酶促产生。如本领域所述，可以在RNA的化学合成和/或酶促生成期间或之后引入多种类型的RNA修饰，例如，增强稳定性、降低先天免疫反应的可能性或程度、和/或增强其他属性的修饰。

在一些实例中，本披露的gRNA可以是在体外转录(IVT)、合成和/或化学合成方法或其组合中产生的。使用了酶促(IVT)、固相、液相、组合合成方法、小区域合成和连接方法。在一个实施例中，使用IVT酶促合成方法制备gRNA。通过IVT制备多核苷酸的方法是本领域已知的，并且在WO 2013/151666中有描述。因此，本披露还包括多核苷酸，例如DNA、构建体和载体用于体外转录本文所述的gRNA。

如本领域所述，可以在RNA的化学合成和/或酶促生成期间或之后引入多种类型的RNA修饰，例如，增强稳定性、降低先天免疫反应的可能性或程度、和/或增强其他属性的修饰。在一些实施例中，可以在合成期间或合成后将非天然的经修饰的核碱基引入本文披露的任何gRNA中。在某些实施例中，修饰是在核苷间键、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。在一些实施例中，通过化学合成或聚合酶将修饰引入gRNA的末端。经修饰的核酸及其合成的实例在WO2013/052523中披露。经修饰的多核苷酸的合成也描述在Verma和Eckstein,Annual Reviewof Biochemistry[生物化学年鉴],卷76,99-134(1998)中。

在一些实施例中，酶促或化学连接方法可以用于将多核苷酸或它们的区域与不同的功能部分(诸如靶向或递送剂、荧光标记、液体、纳米颗粒等)缀合。多核苷酸和经修饰的多核苷酸的缀合物在Goodchild,Bioconjugate Chemistry[生物共轭化学],第1卷(3),165-187(1990)中综述。

在本披露的一些实施例中，用于基因编辑这里披露的任何靶基因的CRISPR/Cas核酸酶系统可以包括至少一种引导RNA。在一些实例中，CRISPR/Cas核酸酶系统可以含有多种gRNA，例如2、3或4种gRNA。此类多种gRNA可以靶向相同靶基因中的不同位点。替代性地，多种gRNA可以靶向不同的基因。在一些实施例中，引导RNA和Cas蛋白可以形成核糖核蛋白(RNP)，例如，CRISPR/Cas复合物。引导RNA可以将Cas蛋白引导到如本文所披露的那些的一个或多个靶基因上的靶序列，其中Cas蛋白在靶位点处切割靶基因。在一些实施例中，CRISPR/Cas复合物是Cpf1/引导RNA复合物。在一些实施例中，CRISPR复合物是II型CRISPR/Cas9复合物。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9蛋白。在一些实施例中，CRISPR/Cas9复合物是Cas9/引导RNA复合物。

在一些实施例中，包含一种或多种特定gRNA的特定CRISPR/Cas核酸酶系统的插缺频率(编辑频率)可以使用TIDE分析测定，TIDE分析可用于鉴定用于编辑靶基因的高效gRNA分子。在一些实施例中，高效gRNA产生高于80％的基因编辑频率。例如，如果gRNA产生至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的基因编辑频率，则被认为是高效。

引导RNA和核酸酶向T细胞的递送

包含一种或多种gRNA和至少一种RNA引导的核酸酶，任选地如下面披露的供体模板的本文披露的CRISPR/Cas核酸酶系统可以经由常规方法递送至靶细胞(例如，T细胞)进行靶基因的基因编辑。在一些实施例中，如本文所披露的CRISPR/Cas核酸酶系统的组分可以单独地，同时或依次递送至靶细胞。在其他实施例中，CRISPR/Cas核酸酶系统的组分可以一起，例如作为复合物递送至靶标。在一些情况下，gRNA和RNA引导的核酸酶可以预复合在一起以形成核糖核蛋白(RNP)，可以将该核糖核蛋白递送至靶细胞中。

RNP对基因编辑很有用，至少因为它们使在富含核酸的细胞环境中发生混杂相互作用的风险降到最低，并使RNA免于降解。形成RNP的方法是本领域已知的。在一些实施例中，可以将含有RNA引导的核酸酶(例如Cas核酸酶，诸如Cas9核酸酶)和靶向一种或多种感兴趣基因的一种或多种gRNA的RNP递送至细胞(例如，T细胞)中。在一些实施例中，可以通过电穿孔将RNP递送至T细胞。

在一些实施例中，RNA引导的核酸酶可以以在细胞中表达RNA引导的核酸酶的DNA载体形式递送至细胞。在其他实例中，RNA引导的核酸酶可以以编码RNA引导的核酸酶并且在细胞中表达该核酸酶的RNA形式递送至细胞。替代性地或另外，靶向基因的gRNA可以作为在细胞中表达该gRNA的RNA或DNA载体递送至细胞。

RNA引导的核酸酶、gRNA和/或RNP的递送可以通过使用已知方法直接注射或细胞转染(例如，电穿孔或化学转染)来进行。可以使用其他细胞转染方法。

其他基因编辑方法

除了本文披露的CRISPR方法之外，本领域已知的另外的基因编辑方法也可用于制备本文披露的基因工程化T细胞。一些实例包括涉及锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、限制性核酸内切酶、大范围核酸酶归巢核酸内切酶等的基因编辑。

ZFN是靶向核酸酶，包含与锌指DNA结合结构域(ZFBD)融合的核酸酶，ZFBD是通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA的多肽结构域。锌指是锌指结合结构域内约30个氨基酸的结构域，其结构通过锌离子的配位稳定。锌指的实例包括但不限于C2H2锌指、C3H锌指和C4锌指。设计的锌指结构域是自然界中不存在的结构域，其设计/组成主要来自于合理的标准，例如，取代规则和用于在存储现有ZFP设计信息和结合数据的数据库中处理信息的计算机算法的应用。参见，例如，美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。选择的锌指结构域是在自然界中找不到的结构域，其产生主要来自经验过程，例如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交选择。ZFN在美国专利号7,888,121和美国专利号7,972,854中更详细描述。ZFN的最广为人知的实例是FokI核酸酶与锌指DNA结合结构域的融合物。

TALEN是靶向核酸酶，其包含与TAL效应子DNA结合结构域融合的核酸酶。“转录激活子样效应子DNA结合结构域”、“TAL效应子DNA结合结构域”或“TALE DNA结合结构域”是TAL效应子蛋白的多肽结构域，其负责TAL效应子蛋白与DNA的结合。TAL效应子蛋白由黄杆菌属(Xanthomonas)的植物病原体在感染期间分泌。这些蛋白进入植物细胞的核，通过其DNA结合结构域结合效应子特异性DNA序列，并通过其反式激活结构域激活这些序列上的基因转录。TAL效应子DNA结合结构域特异性取决于不完全的34个氨基酸重复的效应子可变数目，其在选择的称为重复可变二残基(RVD)的重复位置处包含多态性。在美国专利申请号2011/0145940中更详细地描述了TALEN。在本领域中最公认的TALEN实例是FokI核酸酶与TAL效应DNA结合结构域的融合多肽。

适用于如本文提供的用途的靶向核酸酶的其他实例包括但不限于Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1和Wβ/SPBc/TP901-1，无论是单独使用还是组合使用。

本文披露的任何核酸酶都可以使用载体系统递送，包括但不限于质粒载体、DNA微环、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒载体及其组合。

常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将编码核酸酶和供体模板的核酸引入细胞(例如，T细胞)中。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、DNA小环、裸核酸以及与递送媒介物诸如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，这些病毒在递送至细胞后具有附加型基因组或整合型基因组。

核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂转染、显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、裸RNA、带帽的RNA、人工病毒体和增强对DNA的吸收的试剂。使用例如Sonitron 2000系统(瑞奇玛公司(Rich-Mar))的超声操作也可用于递送核酸。下面提供了一些具体实例。

II.T细胞库用于产生治疗性T细胞的用途

来自本文披露的T细胞库的基因工程化T细胞可以用于产生治疗性T细胞，诸如CAR-T细胞。在一些实施例中，可将编码治疗剂诸如CAR的核酸引入来自T细胞库的细胞中以产生治疗性T细胞。在其他实施例中，T细胞库中的T细胞已被工程化以表达治疗剂诸如CAR。此类T细胞可从T细胞库获得，并且任选地在体外扩增，以产生用于需要治疗的受试者的治疗性T细胞。预计从T细胞库产生的治疗性T细胞存活得更久并且在体内更有效。因此，治疗中将需要较低剂量的此类治疗性T细胞，这会产生较低的副作用。另外，与使用T细胞的常规方法(例如，使用野生型TET2基因、野生型FAS基因和/或野生型CD70基因)相比，可以从分离自合适的天然来源(诸如单个leukopak)的T细胞产生更多数量的CAR-T细胞。

嵌合抗原受体(CAR)

嵌合抗原受体(CAR)是指人工免疫细胞受体，其经工程化以识别并结合不希望的细胞表达的抗原，例如疾病细胞表达的抗原，例如癌细胞表达的抗原。表达CAR多肽的T细胞被称为CAR T细胞。CAR具有以非MHC限制的方式将T细胞特异性和反应性重定向至所选靶标的能力。非MHC限制性抗原识别使CAR T细胞能够独立于抗原加工识别抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞上表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)α和β链发生二聚化。

有不同代的CAR，每一代都含有不同的组分。第一代CAR通过铰链和跨膜结构域将抗体衍生的scFv接合到T细胞受体的CD3zeta(ζ或z)胞内信号传导结构域。第二代CAR包含另外的共刺激结构域(例如，CD28、4-1BB(41BB)或ICOS)以提供共刺激信号。第三代CAR含有与TCR CD3ζ链融合的两个共刺激结构域(例如，CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40的组合)。Maude等人,Blood.[血液]2015；125(26):4017-4023；Kakarla和Gottschalk,Cancer J.[癌症杂志]2014；20(2):151-155)。不同代CAR构建体中的任何一代都在本披露的范围内。

通常，CAR是一种融合多肽，其包含识别靶抗原的胞外结构域(例如，抗体或其他抗体片段的单链片段(scFv))和包含T细胞受体(TCR)复合物(例如，CD3ζ)的信号传导结构域的胞内结构域(并且在大多数情况下为共刺激结构域)。(Enblad等人,Human GeneTherapy.[人类基因治疗]2015；26(8):498-505)。CAR构建体可以进一步包含位于胞外结构域和胞内结构域之间的铰链和跨膜结构域，以及用于表面表达的N末端的信号肽。信号肽的实例包括MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO:102)和MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ IDNO:103)。可以使用其他信号肽。

(i)抗原结合胞外结构域

抗原结合胞外结构域是当CAR在细胞表面表达时暴露于胞外流体的CAR多肽的区域。在一些情况下，信号肽可以位于N末端，以促进细胞表面表达。在一些实施例中，抗原结合结构域可以是单链可变片段(scFv，其可以包括抗体重链可变区(V_H)和抗体轻链可变区(V_L)(以任一取向))。在一些情况下，V_H和V_L片段可通过肽接头连接。在一些实施例中，接头包括亲水性残基，即，多段甘氨酸和丝氨酸用于柔性，以及多段谷氨酸和赖氨酸用于增加溶解度。scFv片段保留了scFv片段衍生自的亲本抗体的抗原结合特异性。在一些实施例中，scFv可包含人源化V_H和/或V_L结构域。在其他实施例中，scFv的V_H和/或V_L结构域完全是人的。

细胞外抗原结合结构域可以对目标靶抗原，例如病理性抗原诸如肿瘤抗原有特异性。在一些实施例中，肿瘤抗原是“肿瘤相关抗原”，指免疫原性分子(例如蛋白)，其通常在肿瘤细胞中的表达水平高于非肿瘤细胞中的表达水平，其在非肿瘤细胞可以不表达或仅在较低水平上表达。在一些实施例中，被携带肿瘤的宿主的免疫系统识别的肿瘤相关结构被称为肿瘤相关抗原。在一些实施例中，如果肿瘤相关抗原由大多数类型的肿瘤广泛表达，则其为通用肿瘤抗原。在一些实施例中，肿瘤相关抗原是分化抗原、突变抗原、过表达的细胞抗原或病毒抗原。在一些实施例中，肿瘤抗原是“肿瘤特异性抗原”或“TSA”，是指肿瘤细胞特有的免疫原性分子，例如蛋白。肿瘤特异性抗原仅在肿瘤细胞中表达，例如在特定类型的肿瘤细胞中表达。

示例性肿瘤抗原包括但不限于CD19、CD33、BCMA和CD70。任何已知的对此类肿瘤抗原有特异性的抗体，例如已批准上市的那些和尚在临床试验中的那些，可以用于制备本文披露的CAR构建体。

(ii)跨膜结构域

本文披露的CAR多肽可以含有跨膜结构域，该跨膜结构域可以是跨膜的疏水性α螺旋。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜、优选真核细胞膜中热力学稳定的任何蛋白结构。跨膜结构域可以提供含有其的CAR的稳定性。

在一些实施例中，如本文提供的CAR的跨膜结构域可以是CD8跨膜结构域。在其他实施例中，跨膜结构域可以是CD28跨膜结构域。在又其他实施例中，跨膜结构域是CD8和CD28跨膜结构域的嵌合体。如本文提供的，可使用其他跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域是含有FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR(SEQ ID NO:104)或IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY(SEQ ID NO:105)的序列的CD8a跨膜结构域。可使用其他跨膜结构域。

(iii)铰链结构域

在一些实施例中，铰链结构域可以位于CAR的胞外结构域(包含抗原结合结构域)与跨膜结构域之间或者CAR的胞质结构域与跨膜结构域之间。铰链结构域可以是起到将跨膜结构域连接至多肽链中的胞外结构域和/或胞质结构域的功能的任何寡肽或多肽。铰链结构域可以起到向CAR或其结构域提供柔性或防止CAR或其结构域的空间位阻的功能。

在一些实施例中，铰链结构域可以包含多达300个氨基酸(例如，10至100个氨基酸或5至20个氨基酸)。在一些实施例中，一个或多个铰链结构域可以包括在CAR的其他区域中。在一些实施例中，铰链结构域可以是CD8铰链结构域。可以使用其他铰链结构域。

(iv)细胞内信号传导结构域

任何CAR构建体均含有一个或多个细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ，和任选地一个或多个共刺激结构域)，其是受体的功能性末端。抗原识别后，受体聚簇，并且信号被传递到细胞。

CD3ζ是T细胞受体复合物的细胞质信号传导结构域。CD3ζ包含三(3)个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，在T细胞与关联抗原接合后，它们将激活信号传输到T细胞。在许多情况下，CD3ζ提供主要的T细胞激活信号，但不提供完全感受态的激活信号，这需要共刺激信号传导。

在一些实施例中，本文披露的CAR多肽可进一步包含一个或多个共刺激信号传导结构域。例如，CD28和/或4-1BB的共刺激结构域可用于传递完整的增殖/存活信号，以及CD3ζ介导的主要信号传导。在一些实例中，本文披露的CAR包含CD28共刺激分子。在其他实例中，本文披露的CAR包含4-1BB共刺激分子。在一些实施例中，CAR包括CD3ζ信号传导结构域和CD28共刺激结构域。在其他实施例中，CAR包括CD3ζ信号传导结构域和4-1BB共刺激结构域。在其他实施例中，CAR包括CD3ζ信号传导结构域、CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域。

表7提供了可以在本文中使用的衍生自4-1BB、CD28和CD3-ζ的信号传导结构域的实例。

表7.示例性胞内信号传导结构域序列

CAR构建体的非限制性实例在WO 2019097305和WO 2019215500和WO 2020/095107中提供，其相关披露内容通过援引并入本文以用于本文提及的目的和主题。一些示例在下面提供：

抗CD19 CAR(SEQ ID NO:148)：

抗BCMA CAR(SEQ ID NO:149)：

抗CD70 CAR(SEQ ID NO:150)：

示例性抗CD33 CAR构建体可以在WO 2020095107中找到，其相关披露内容通过援引并入以用于本文提及的主题和目的。

将CAR构建体递送至T细胞

在一些实施例中，可以通过本领域技术人员已知的方法将编码CAR的核酸引入来自本文披露的T细胞库的任何基因工程化T细胞中。例如，可以将CAR的编码序列克隆到载体中，可以将该载体引入基因工程化T细胞中以表达CAR。可以使用本领域已知的多种不同方法将本文披露的任何核酸或表达载体引入免疫效应细胞中。将核酸引入细胞的方法的非限制性实例包括：脂转染、转染(例如，磷酸钙转染、使用高度支化有机化合物的转染、使用阳离子聚合物的转染、基于树状聚合物的转染、光学转染、基于颗粒的转染(例如，纳米颗粒转染)或使用脂质体的转染(例如，阳离子脂质体))、显微注射、电穿孔、细胞挤压、声波穿孔、原生质体融合、刺穿转染(impalefection)、流体动力学递送、基因枪、磁转染、病毒转染和核转染。

在具体实例中，可以使用腺相关病毒(AAV)将编码CAR构建体的核酸递送至细胞。AAV是小病毒，其位点特异性整合到宿主基因组中，并且因此可以递送转基因，例如CAR。存在反向末端重复序列(ITR)，位于AAV基因组和/或目的转基因的侧翼，并用作复制起点。AAV基因组中还存在rep和cap蛋白，它们在转录时形成衣壳，这些衣壳封装AAV基因组以递送到靶细胞中。这些衣壳上的表面受体会赋予AAV血清型，其决定衣壳主要结合哪个靶器官，并且因此决定AAV将最有效地感染哪些细胞。目前已知十二种人AAV血清型。在一些实施例中，用于递送CAR编码核酸的AAV是AAV血清型6(AAV6)。

出于多种原因，腺相关病毒是用于基因疗法的最常用病毒之一。首先，AAV在施用于包括人在内的哺乳动物后不会引起免疫反应。第二，将AAV有效地递送至靶细胞，尤其是在考虑选择合适的AAV血清型时。最后，因为基因组可以在宿主细胞中持续存在而不整合，AAV具有感染分裂和非分裂细胞的能力。这种特性使它们成为基因疗法的理想候选。

可以设计编码CAR的核酸，以插入宿主T细胞中的目标基因组位点中。在一些实施例中，靶基因组位点可以在安全港基因座中。

在一些实施例中，编码CAR的核酸(例如，经由供体模板，其可由病毒载体诸如腺相关病毒(AAV)载体携带)可被设计成使得其可插入TRAC基因内的位置以破坏基因工程化T细胞中的TRAC基因并表达CAR多肽。TRAC的破坏导致内源性TCR的功能丧失。例如，TRAC基因中的破坏可以用核酸内切酶(如本文所述的那些)和靶向一个或多个TRAC基因组区域的一个或多个gRNAs来产生。本文披露的对TRAC基因和靶区域有特异性的任何gRNA均可用于该目的。

在一些实例中，TRAC基因中的基因组缺失和由CAR编码片段的替换可以通过同源定向修复或HDR(例如，使用供体模板，其可以是病毒载体例如腺相关病毒(AAV)载体的一部分)来产生。在一些实施例中，TRAC基因中的破坏可以利用核酸内切酶(如本文所披露的那些)和靶向一个或多个TRAC基因组区域的一个或多个gRNA并将CAR编码片段插入TRAC基因中来产生。

如本文披露的供体模板可以包含CAR的编码序列。在一些实例中，CAR编码序列的侧翼可以是两个同源区域，以允许使用本领域已知的基因编辑方法在目标基因组位置，例如在TRAC基因处进行有效的HDR。在一些实例中，可以使用基于CRISPR的方法。在这种情况下，靶基因座处的DNA的两条链都可以被CRISPR Cas9酶切割，该酶由靶位点特异性的gRNA引导。然后发生HDR，以修复双链断裂(DSB)并插入编码CAR的供体DNA。为了使此正确发生，设计供体序列的侧翼残基与靶基因(例如TRAC基因)中DSB位点周围的序列(以下简称“同源臂”)互补。这些同源臂用作DSB修复的模板，并使HDR成为基本无错误的机制。同源定向修复(HDR)的速率是突变与切割位点之间的距离的函数，因此选择重叠或附近的靶位点很重要。模板可以包括同源区侧翼的额外序列或者可以含有与基因组序列不同的序列，从而可以进行序列编辑。

替代性地，供体模板可以与DNA中的靶位置不具有同源区域，并且可以通过在靶位点切割后通过NHEJ依赖性末端连接而整合。

供体模板可以是单链和/或双链的DNA或RNA，并且可以线性或环状形式引入细胞中。如果以线性形式引入，则可以通过本领域技术人员已知的方法保护供体序列的末端(例如，以防止核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3'末端和/或将自身互补的寡核苷酸连接至一个或两个末端。参见，例如，Chang等人,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]84:4959-4963；Nehls等人,(1996)Science[科学]272:886-889。保护外源多核苷酸免于降解的其他方法包括但不限于一个或多个末端氨基基团的添加和经修饰的核苷酸间键的使用，例如，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。

可以将供体模板作为载体分子的一部分引入细胞中，该载体分子具有另外的序列，诸如例如，复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，供体模板可以作为裸露的核酸引入细胞(作为与试剂(例如脂质体或泊洛沙姆)复合的核酸引入)，或可以通过病毒递送(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷型慢病毒(IDLV))。

在一些实施例中，供体模板可以插入内源性启动子附近的位点处(例如，下游或上游)，从而其表达可以由内源性启动子驱动。在其他实施例中，供体模板可包含外源启动子和/或增强子，例如组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子，以控制CAR基因的表达。在一些实施例中，外源启动子是EF1α启动子。可以使用其他启动子。

此外，外源序列还可包括转录或翻译调控序列，例如，启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽的序列和/或聚腺苷酸化信号。

当需要时，可以将另外的基因编辑(例如，基因敲入或敲除)引入由本文披露的T细胞库产生的治疗性T细胞中，以改善T细胞功能和治疗功效。例如，如果可以进行β2M敲除以降低宿主抗移植物反应的风险或预防宿主抗移植物反应。其他实例包括用于改善靶细胞裂解的敲入或敲除基因、用于增强治疗性T细胞(诸如由T细胞库的细胞制备的CAR-T细胞)的性能的敲入或敲除基因。实例包括免疫检查点基因诸如PD-1的敲除。

III.治疗应用

预计使用T细胞库的基因工程化T细胞产生的治疗性T细胞可维持通过TET2基因的突变、FAS基因的破坏、CD70基因的破坏或它们的组合而实现的T细胞健康。例如，维持T细胞健康可延长制造期间的扩增，从而增加产量和一致性。在另一个实例中，维持T细胞健康可以挽救耗竭的/不健康的T细胞，从而使患者中的潜在更低的剂量和更强的应答成为可能。

本文披露的T细胞库产生的治疗性T细胞可以出于治疗目的(例如，治疗由治疗性T细胞表达的CAR构建体靶向的实体瘤)而施用给受试者。

施用步骤可包括通过引起治疗性T细胞至少部分定位在所需位点(诸如，肿瘤)的方法或途径将治疗性T细胞置于(例如，移植到)受试者体内，从而产生所需的一种或多种效果。治疗性T细胞可以通过任何适当的途径施用，该途径导致递送至受试者中的所需位置，在该位置中至少一部分植入的细胞或细胞组分保持活力。在施用于受试者后，细胞的活力期可以短至数小时(例如，二十四小时)、几天，长达数年，或甚至受试者的寿命(即长期植入)。例如，在本文所述的一些方面，有效量的治疗性T细胞可以经由全身性施用途径(诸如腹膜内或静脉内途径)施用。

在一些实施例中，全身性施用治疗性T细胞，这是指将细胞群体以不同于直接施用至靶部位、组织或器官的方式施用，而是使其进入受试者的循环系统，从而经受代谢和其他类似过程。施用的合适模式包括注射、输注、滴注或摄取。注射包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施例中，该途径是静脉内。

受试者可以是期望对其进行诊断，治疗或疗法的任何受试者。在一些实施例中，该受试者是哺乳动物。在一些实施例中，该受试者是人。

在一些情况下，治疗性T细胞可以是受试者自体的(“自身的”)，即细胞来自同一受试者。替代性地，治疗性T细胞可以是受试者非自体的(“非自身的”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。“同种异体的”意指治疗性T细胞不是源自接受治疗的受试者，而是源自与受试者相同物种的不同个体(供体)。供体是非正在治疗的受试者的个体。供体是非患者个体。在一些实施例中，供体是不患有或不怀疑患有要治疗的癌症的个体。在一些实施例中，可以使用多个供体，例如两个或更多个供体。

在一些实施例中，根据本文所述方法施用的工程化T细胞群体包含获自一个或多个供体的同种异体T细胞。同种异体是指从相同物种的一个或多个不同供体获得的细胞、细胞群体或包含细胞的生物学样品，其中一个或多个基因座处的基因与接受体(例如受试者)不同。例如，施用于受试者的工程化T细胞群体可以衍生自一个或多个不相关的供体，或衍生自一个或多个不同的同胞。在一些实施例中，可以使用同系细胞群体，诸如从遗传上相同的供体(例如，相同的双胞胎)获得的那些。在一些实施例中，细胞是自体细胞；即，这些工程化T细胞是从受试者获得或分离并施用给相同受试者的，即，供体和接受体是相同的。

有效量是指预防或减轻医学病症(例如，癌症)的至少一种或多种体征或症状所需的工程化T细胞群体的量，并且涉及足以提供所希望的效果(例如，治疗患有医学病症的受试者)的组合物的量。有效量还包括足以预防或延迟疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于减慢疾病症状的进展)或逆转疾病症状的量。应当理解，对于任何给定的情况，本领域的普通技术人员可以使用常规实验来确定适当的有效量。

由于由本文披露的T细胞库产生的治疗性T细胞具有增强的持久性和功效，因此本文提供的治疗性T细胞的剂量可低于通过常规方法(例如，使用不具有本文披露的一个或多个基因编辑事件(包括被突变的TET2基因、破坏的FAS基因和/或破坏的CD70基因)的T细胞)制备的CAR-T细胞的标准剂量。在一些实例中，本文披露的治疗性T细胞的有效量可以比CAR-T疗法的标准剂量低至少2倍，低至少5倍，低至少10倍，低至少20倍，低至少50倍或低至少100倍。在一些实例中，本文披露的治疗性T细胞的有效量可以小于10⁶个细胞，例如10⁵个细胞、5×10⁴个细胞、10⁴个细胞、5×10³个细胞或10³个细胞。在本文所述的一些实例中，将细胞在施用给有需要的受试者之前在培养中扩增。

使用本文披露的治疗性T细胞的治疗功效可由熟练的临床医师确定。如果疾病(例如，癌症)的任何一种或所有体征或症状(举一个例子，功能性靶标的水平)以有益的方式改变(例如，增加至少10％)或其他临床上可接受的症状或标志物得到改善或减轻，则该治疗被认为是“有效的”。功效还可以通过如通过住院治疗或需要医疗干预所评估的受试者恶化的失败(例如，疾病进展停止或至少减慢)来测量。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或本文所述的。治疗包括对受试者疾病的任何治疗，包括：(1)抑制疾病，例如阻止或减缓症状的进展；或者(2)减轻疾病，例如引起症状消退；以及(3)预防或降低症状发展的可能性。

本披露还包括组合疗法。例如，本文披露的治疗性T细胞可以与其他治疗剂共同使用，用于治疗相同的适应症，或用于增强治疗性T细胞的功效和/或减少治疗性T细胞的副作用。

试剂盒

本披露还提供了用于产生T细胞库、治疗性T细胞和用于治疗用途的试剂盒。

在一些实施例中，本文提供的试剂盒可包括用于对TET2基因、FAS基因和CD70基因中的一种或多种进行基因编辑的组分，以及任选地将对其进行基因编辑的免疫细胞群体(例如，leukopak)。leukopak样品可以是从外周血收集的富集的白细胞去除产物。它通常含有多种血细胞，包括单核细胞、淋巴细胞、血小板、血浆和红细胞。用于对一种或多种靶基因进行基因编辑的组分可包括合适的核酸内切酶(诸如RNA引导的核酸内切酶)和一种或多种核酸引导物，这些核酸引导物指导核酸内切酶切割一个或多个合适的基因组位点。例如，试剂盒可包括Cas酶诸如Cas 9和一种或多种靶向TET2基因、FAS基因和/或CD70基因的gRNA。试剂盒中可以包括对这些靶基因具有特异性的任何gRNA。此类试剂盒可进一步包括用于进一步基因编辑的组分，例如gRNA和任选地另外的用于编辑其他靶基因诸如β2M和/或TRAC的核酸内切酶。

在一些实施例中，本文提供的试剂盒可包括如本文披露的T细胞库的基因工程化T细胞群体和一种或多种用于产生同样如本文披露的治疗性T细胞的组分。此类组分可包括适于基因编辑的核酸内切酶和编码感兴趣CAR构建体的核酸。编码CAR的核酸可以是如本文披露的供体模板的一部分，其可含有位于CAR编码序列侧翼的同源臂。在一些情况下，供体模板可由病毒载体诸如AAV载体携带。试剂盒可进一步包括对TRAC基因具有特异性的gRNA，用于将CAR编码序列插入TRAC基因中。

在其他实施例中，本文披露的试剂盒可包括如针对预期治疗目的披露的治疗性T细胞群体。

本文披露的任何试剂盒可进一步包括用于制备T细胞库、治疗性T细胞或治疗性T细胞的治疗应用的说明书。在一些实例中，所包括的说明书可包括使用基因编辑组分对一种或多种靶基因(例如，TET2、FAS、CD70或它们的组合)进行基因工程化以从合适来源(例如，本文所述的那些)的亲本T细胞制备T细胞库的描述。在其他实例中，所包括的说明书可包括如何将编码CAR构建体的核酸引入T细胞库的T细胞以制备治疗性T细胞的描述。

替代性地，该试剂盒可进一步包含施用本文所披露的治疗性T细胞以实现预期活性，例如消除由治疗性T细胞上表达的CAR靶向的疾病细胞的说明书。试剂盒可进一步包含基于鉴定受试者是否需要治疗来选择适于治疗的受试者的描述。与使用本文所述的治疗性T细胞有关的说明书通常包括关于剂量、给药时间表和用于预期治疗的施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在本披露的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页上的书面说明书。标签或包装插页指示治疗性T细胞用于治疗、延迟受试者中疾病或病症的发作和/或缓解受试者中的疾病或病症。

本文提供的试剂盒在适当的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、柔性包装等等。还考虑了与特定装置(诸如用于施用治疗性T细胞的输注装置)组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌的进口端(例如，容器可以是静脉内注射溶液袋或具有能够被皮下注射针刺破的塞子的小瓶)。容器还可以具有无菌的进入口。

试剂盒可以任选地提供另外组分，例如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包含容器和在容器上或与容器相关的标签或一个或多个包装插页。在一些实施例中，本披露提供了包含上述试剂盒的内容物的制品。

通用技术

除非另有指示，否则本披露的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。此类技术在诸如以下文献中有充分说明：Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版(Sambrook等人,1989)冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)；Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成](M.J.Gait编,1984)；Methods in MolecularBiology[分子生物学方法],Humana Press[胡玛纳出版社]；Cell Biology:A LaboratoryNotebook[细胞生物学：实验室笔记](J.E.Cellis编,1989)学术出版社(Academic Press)；Animal Cell Culture[动物细胞培养](R.I.Freshney编,1987)；Introuction to Celland Tissue Culture[细胞和组织培养导论](J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)普莱纽姆出版社(Plenum Press)；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures[细胞和组织培养：实验室程序](A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell,编,1993-8)威利父子出版社(J.Wiley and Sons)；Methods in Enzymology[酶学方法](学术出版社(Academic Press,Inc.))；Handbook of Experimental Immunology[实验免疫学手册](D.M.Weir和C.C.Blackwell编):Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells[哺乳动物细胞的基因转移载体](J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学现行方案](F.M.Ausubel等人编,1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction[PCR：聚合酶链式反应](Mullis等人编,1994)；Current Protocols inImmunology[免疫学现行方案](J.E.Coligan等人编,1991)；Short Protocols inMolecular Biology[分子生物学简短方案](威利父子出版社(Wiley and Sons),1999)；Immunobiology[免疫学](C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies[抗体](P.Finch,1997)；Antibodies:a practice approach[抗体：实用方法](D.Catty.编,IRL出版社(IRLPress),1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach[单克隆抗体：实用方法](P.Shepherd和C.Dean编,Oxford University Press[牛津大学出版社],2000)；Using antibodies:a laboratory manual[使用抗体：实验室手册](E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1999)；The Antibodies[抗体](M.Zanetti和J.D.Capra编,哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1995)；DNA Cloning:A practical Approach[DNA克隆：实用方法],第I和II卷(D.N.Glover编,1985)；Nucleic Acid Hybridization[核酸杂交](B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985》；Transcription and Translation[转录和翻译](B.D.Hames&S.J.Higgins编(1984》；Animal Cell Culture[动物细胞培养](R.I.Freshney编,(1986》；Immobilized Cells andEnzymes[固定化细胞和酶](lRL出版社(lRL Press),(1986》；以及B.Perbal,A practicalGuide To Molecular Cloning[分子克隆实用指南](1984)；F.M.Ausubel等人(编)。

无需进一步详细阐述，相信本领域的普通技术人员可以基于以上描述在其最大程度上利用本发明。因此以下特定实施例将被解释为仅是说明性的，并且无论如何并非以任何方式限制本披露的其余内容。本文引用的所有出版物均为本文引用的目的或主题通过援引并入。

实例

实例1：TET2敲除(KO)或突变对原代人类T细胞的影响

(i)Cas9高效敲除或突变TET2：T细胞中的sgRNA RNP

本实例描述了使用CRISPR/Cas9基因编辑离体对源自原代人类PBMC细胞的T细胞中的TET2基因进行高效编辑。将含有第四、第五和第六蛋白编码外显子的TET2基因的基因组片段用作gRNA设计软件的输入。所需的gRNA是将在编码序列中产生缺失、破坏TET2的氨基酸序列并导致功能等位基因脱框/丢失的那些(称为“TET2敲除”等位基因或TET2蛋白的截短)。合成四(4)个靶向TET2基因的计算机模拟鉴定的gRNA间隔子序列，并对gRNA进行特异性修饰，如表1所示。虽然表1中的gRNA已用2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰进行了修饰，但可使用未修饰的gRNA或具有其他修饰的gRNA。还参见WO 2019097305，其相关披露内容通过援引并入以用于本文提及的目的和主题。

用含有Cas9核酸酶和靶向TET2基因的合成的经修饰sgRNA(上表3中的序列)的核糖核蛋白颗粒(RNP)或对照(无Cas9，无gRNA)转染(电穿孔)源自原代人类PBMC细胞的激活T细胞。转染后六(6)天，对细胞进行免疫印迹以评估插缺效率。

如图1A-1B所示，在用gRNA TET2外显子4_BG4、TET2外显子5_T1、TET2外显子5_T2或TET2外显子6_BG5处理的细胞中，通过称为Simple Western的基于毛细管的大小分离免疫测定法(加利福尼亚州圣何塞的普诺森生物科技公司(protein simple,San Jose,CA))确定未检测到TET2蛋白，并且在用TET2外显子5_T1 gRNA或外显子6_BG5 gRNA处理的细胞中检测到TET2蛋白的截短形式(表观分子量低于野生型TET2)。

(ii)TET2 KO或突变增加T细胞增殖和扩增

为了评估TET2调节(包括破坏或截短突变)对T细胞在含细胞因子培养基(IL-2+IL-7)中扩增的能力的影响，如上所述产生具有破坏或突变的TET2基因的细胞。以1.5×10⁶个细胞/ml含细胞因子培养基(IL-2+IL-7)接种数量相等的细胞，每2-3天记录细胞计数，并在新鲜的含细胞因子培养基(IL-2+IL-7)中将细胞密度调节为1.5×10⁶个细胞/ml。与没有TET2基因破坏的对照细胞相比，含有由TET2外显子5_T1或TET2外显子5_T2诱导的TET2基因破坏的T细胞扩增至更高水平(图1B)。转染后超过6周，具有TET2外显子5_T1或TET2外显子5_T2 gRNA的经TET2编辑的细胞保持增殖，并且TET2外显子5_T1 gRNA对TET2的调节(产生TET2的截短形式)使得培养物中的细胞产量相较于其他组更高，并且使得细胞产量相较于非转染细胞(WT)增加超过250倍。图1B.

评估其他TET2编码外显子的破坏是否引起更大的T细胞扩增在用TET2外显子4_BG4和TET2外显子6_BG5 gRNA处理后，产生TET2基因破坏的T细胞。对T细胞进行编辑后，使它们在标准T细胞培养条件(X-vivo培养基(04-744，龙沙公司(Lonza))，补充有5％人AB血清(HP1022，威利生物医药公司(Valley Biomedical))、50ng/ml IL-2(rhIL-2；130-097-745，美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))和10ng/ml IL-7(rhIL-7；希尔季克思公司(Cellgenix)，001410-050))下生长4周。四周后，将3×10⁶个细胞接种到G-Rex(透气快速扩增(Gas Permeable Rapid Expansion)，威尔逊沃尔夫公司(Wilson Wolf)，P/N80660M)6孔板中。通过每周一次对活细胞进行计数持续十周来评估细胞扩增。将扩增记录为最初接种3×10⁶个细胞到最新细胞计数的倍数变化(即，当前细胞计数/3×10⁶个细胞)。将细胞以1×10⁶个细胞/mL维持在完全培养基中。如图1D所示，通过破坏TET2基因的外显子4或外显子6产生的TET2 KO使得在10周计数期(总共培养14周)期间相对于无RNP处理的对照T细胞扩增15-19倍。

总之，发现经TET2修饰的T细胞可在培养物中扩增超过4周，比未修饰的T细胞长得多。

(iii)TET2 KO或截短突变减少延长细胞培养物中的凋亡细胞数量

在电穿孔后第36天评价在延长细胞培养物中经历凋亡的TET2缺陷细胞的数量。简而言之，洗涤等分试样细胞，并在室温下用FITC偶联的膜联蛋白V连同7-AAD的膜联蛋白V结合缓冲液(百进生技公司(BioLegend))染色15分钟。然后洗涤细胞，并将其重悬于膜联蛋白V结合缓冲液中，以通过流式细胞术进行分析。如下表8所示，与未编辑的细胞相比，用TET2外显子5_T1或TET2外显子5_T2 gRNA编辑的T细胞显示出凋亡细胞减少并且健康细胞百分比增加7-8倍。

表8.电穿孔后第36天的健康细胞百分比

(iv)TET2 KO和截短突变增加延长细胞培养物中可激活T细胞的数量

为了评估经TET2修饰的T细胞在延长细胞培养物中被激活的能力，如上所述产生具有破坏的TET2基因的细胞。在转染后第四十五(45)天，将0.5×10⁶个T细胞用BDGolgiplug处理一(1)小时，然后在Golgiplug存在下用PMA/离子霉素激活四(4)小时。收集细胞并对激活标志物进行表面染色，并对IFN-γ产生进行细胞内染色。与没有TET2基因破坏的对照细胞或用其他gRNA转染的T细胞相比，在TET2基因中含有分别由TET2外显子3_T3和TET2外显子5_T1引起的破坏和截短突变的T细胞显示出更高频率的激活和IFN-γ阳性细胞(CD25⁺、IFN-γ⁺细胞)。参见下表9中的结果。

表9.经基因编辑的T细胞中的IFN-γ⁺/CD25⁺T细胞百分比

实例2：FAS敲除(KO)增加增殖并减少凋亡

(i)Cas9敲除FAS：T细胞中的sgRNA RNP

本实例描述了使用CRISPR/Cas9基因编辑方法离体对原代人类T细胞中的FAS基因进行高效编辑。所需的gRNA是将在编码序列中产生插入或缺失、破坏FAS的氨基酸序列、导致功能等位基因脱框/丢失的那些(称为“FAS敲除”等位基因)。合成全部五(5)个靶向FAS基因的计算机模拟鉴定的gRNA间隔子序列。

用含有Cas9核酸酶和靶向FAS基因的合成的经修饰sgRNA(具有2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰)(上表5中的序列)的核糖核蛋白颗粒(RNP)或对照(无Cas9，无gRNA)转染(电穿孔)来自两个健康供体的原代人类T细胞。转染后六(6)天，通过流式细胞术(一抗：PEDazzle 594抗人FAS抗体，克隆DX2，百进生技公司)处理细胞以评估细胞表面的FAS表达水平。

如图2A所示，上表5中列出的gRNA均导致一定程度的FAS敲除，其中gRNA FAS Ex3_T2具有最高的编辑效率。

(ii)FAS KO增加抗BCMA CAR T细胞的细胞因子驱动的增殖

为了评价FAS和/或CD70敲除对细胞增殖的影响，使用抗BCMA CAR T细胞。产生以下组的经编辑的T BCMA-CAR T细胞：

TRAC-/B2M-/抗BCMA CAR+(对照；2KO，BCMA CAR+)

TRAC-/B2M-/FAS-/抗BCMA CAR+(3KO(FAS)，BCMACAR+)

TRAC-/B2M-/CD70-/抗BCMA CAR+(3KO(CD70)，BCMACAR+)

TRAC-/B2M-/FAS-/CD70-/抗BCMA CAR+(4KO，BCMA CAR+)

通过磁性耗尽CD3+B2M+细胞使经编辑的细胞富集TRAC-/B2M-细胞。简而言之，将细胞用抗CD3生物素(百进生技公司，Cat#300404)、抗β2M生物素(百进生技公司，Cat#316308)抗体(各0.5μg/1×10⁶个细胞)在100μl体积中在4℃下标记15分钟，用链霉亲和素标记的磁性微珠(美天旎生物技术公司，130-048-101)在4℃下洗涤并孵育15分钟。根据制造商的方案，将细胞重悬于缓冲液中并使其通过LS柱(美天旎生物技术公司，130-042-401)。

为了确定FAS或CD70对IL-2/IL-7驱动的T细胞增殖的影响，将经编辑的T细胞(1×10⁶个细胞/ml)在补充有5％人AB血清(HP1022，威利生物医药公司)、50ng/ml IL-2(rhIL-2；130-097-745，美天旎生物技术公司)和10ng/ml IL-7(rhIL-7；希尔季克思公司，001410-050)的生长培养基(X-vivo培养基(04-744，龙沙公司))中培养长达四周。在指定的天数，对细胞进行计数，并将其以1.5×10⁶个细胞/ml重新接种在适当培养皿中的新鲜培养基中。

如图2B所示，与对照(即，包含内源性FAS和CD70的抗BCMA CAR T细胞)相比，FAS或CD70的敲除在体外改善了抗BCMA CAR T细胞的IL-2/IL-7驱动的增殖。相对于仅敲除FAS或CD70，敲除FAS和CD70两者显示出对抗BCMA CAR T细胞的增殖能力的协同作用。图2B.

(iii)FAS KO拯救抗BCMA CAR T细胞免于发生抗FAS抗体诱导的凋亡

评价FAS KO对抗BCMA CAR+T细胞暴露于抗FAS抗体后的凋亡细胞死亡的影响。简而言之，为了激活FAS-FASL信号传导通路，将抗BCMA CAR+T细胞暴露于抗FAS抗体(1μg/ml，百进生技公司，目录号305704)48小时。在处理结束时，洗涤等分试样细胞，并在室温下用荧光染料偶联的膜联蛋白V连同7-AAD的膜联蛋白V结合缓冲液(百进生技公司)染色15分钟。然后洗涤细胞，并将其重悬于膜联蛋白V结合缓冲液中，以通过流式细胞术进行分析。

如图2C所示，FAS(FAS KO)的缺失拯救了抗BCMACAR+T细胞免于由抗FAS抗体诱导的凋亡，如3KO(TRAC-/B2M-/FAS-)和4KO(TRAC-/B2M-/FAS-/CD70-)细胞中的凋亡细胞百分比降低所证明。

实例3：CD70、TET2和FAS的三重敲除增强抗CD19 CAR T细胞的细胞溶解活性

在制备经编辑的抗CD19 CAR T细胞后，使用基于流式细胞术的细胞毒性测定验证CAR T细胞的功能活性。抗CD19 CAR的披露内容参见WO 2019/097305，其相关披露内容通过援引并入以用于本文提及的目的和主题。将抗CD19 CAR T细胞(TRAC-/β2M-/CD19 CAR+和TRAC-/β2M-/CD70-/TET2-/FAS-/CD19 CAR+)与表达CD19的癌细胞系(靶细胞)Raji(ATCCccl-86)共培养。将靶细胞用5μM efluor670(伊生物技术公司(eBiosciences))标记，洗涤并与TRAC-/β2M-/抗CD19 CAR+或TRAC-/β2M-/CD70-/TET2-/FAS-/抗CD19 CAR+以不同比率(0.01、0.05、0.1、0.5、1:1T细胞:靶细胞)共培养。将靶细胞以100,000个细胞/孔接种在96孔U型底板中。将共培养物孵育48小时。孵育后，洗涤孔，并用200μL含有5mg/mL DAPI的1:500稀释液的培养基(分子探针公司(Molecular Probes))替换培养基。然后将二十五(25)μL CountBright珠(生命技术公司(Life Technologies))添加到每个孔中，并通过流式细胞术分析细胞培养物的细胞活力(即，对DAPI染色呈阴性的活细胞)。

然后使用以下公式确定靶细胞(例如，Nalm6或Raji细胞)的细胞裂解百分比：

细胞裂解百分比＝(1-((测试样品中靶细胞的总数量)÷(对照样品中靶细胞的总数量))×100；

在该公式中，测试样品是指与(1)TRAC-/β2M-/CD19 CAR+T细胞或(2)TRAC-/β2M-/CD70-/TET2-/FAS-/抗CD19 CAR+细胞共培养的靶细胞(例如，Raji细胞)；并且对照样品是指未与CAR-T细胞共培养的单独的靶细胞。

CD70、TET2和FAS基因的破坏使得在低CAR-T与靶标比率下抗CD19 CAR-T细胞对Raji细胞系的细胞溶解活性增强。图3A.对抗CD19 CAR-T细胞(例如，TC1细胞)的描述参见WO 2019097305。该PCT公开的相关披露内容通过援引据此并入以用于本文提及的目的和主题。由于CD70、TET2和FAS丢失赋予的对Raji细胞系的活性增加表明，在攻击性肿瘤环境中，尤其是当CAR-T与肿瘤比率较低时，CD70、TET2和FAS丢失可能对CAR-T细胞根除肿瘤细胞具有实质性益处。

T细胞库的产生和细胞库扩增后的系列编辑

此外，探索了使用CRISPR/Cas9基因编辑技术来产生人类T细胞库，其中最初将TET2基因敲除，然后在培养四周后对其进行进一步编辑。具体地，在四周时通过CRISPR/Cas9基因编辑对FAS细胞表面死亡受体(FAS)基因和分化簇70(CD70)基因进行编辑，以产生缺乏另外的一种或两种基因的T细胞。在激活的原代人类T细胞中进行初始编辑，包括对对照T细胞(无RNP)和具有TET2 Cas9/gRNA RNP复合物的T细胞进行电穿孔。核转染混合物含有Nucleofector^TM溶液、5×10⁶个细胞、1μM Cas9和5μM gRNA(如Hendel等人,NatBiotechnol.[自然生物]2015；33(9):985-989,PMID:26121415中所述)。

四周后进行的编辑包括对TET2敲除T细胞和不含RNP的对照T细胞进行再次电穿孔。为了产生双重敲除T细胞，用含有Cas9蛋白和以下sgRNA中的一种的RNP复合物对TET2敲除细胞进行电穿孔：FAS或CD70。为了产生三重敲除T细胞，用两种不同的RNP复合物(每种RNA复合物含有Cas蛋白和以下sgRNA中的一种)对TET2敲除细胞进行电穿孔：FAS和CD70。用于对TET2、FAS和CD70基因进行基因编辑的示例性gRNA在下表10中提供：

表10.TET2 FAS CD70 gRNA序列

*：2'-O-甲基硫代磷酸酯残基

为了评估对细胞库进行进一步编辑是否影响细胞扩增，在编辑后的七周时间内，列举了经单个、双重、三重基因编辑的T细胞(未编辑的T细胞用作对照)中的细胞数量。产生1×10⁶个细胞，并针对每种T细胞基因型进行铺板。电穿孔后，通过每周一次对活细胞进行计数持续七周来评估细胞扩增。将细胞以1×10⁶个细胞/mL维持在完全培养基中。

如图3B所示，在经编辑的细胞库条件下第二次电穿孔后，细胞增殖(扩增)继续。在单个TET2(细胞库)、双重(TET2-/CD70-)或(TET2-/FAS-)或者三重(TET2-/CD70-/FAS)敲除T细胞中观察到细胞增殖，如活细胞数量所指示。这些数据表明对TET2-T细胞库进行连续基因编辑不影响T细胞健康，如通过恢复期后的T细胞增殖所测量。

实例4：在静脉内播散性Nalm-6人急性淋巴细胞白血病肿瘤异种移植模型中TET2、FAS和CD70 KO对同种异体CAR T细胞的体内作用

利用播散性小鼠模型进一步评估缺乏B2M和TRAC以及TET2、FAS和/或CD70的同种异体CAR T细胞的体内功效。

使用NOG小鼠中的静脉内播散性模型(播散性模型)(其使用CD19+B-ALL来源的Nalm-6人急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞系)来证明具有或没有本文披露的另外基因编辑(例如，TET2、FAS和/或CD70)的抗CD19/TRAC^-/B2M^-CAR T细胞(抗CD19 CAR T细胞)的功效。如实例3所述制备抗CD19 CAR T细胞。还参见WO 2019/097305。

在播散性模型中使用转化药物开发有限责任公司(Translations DrugDevelopment,LLC)(亚利桑那州斯科茨代尔(Scottsdale,AZ))采用的和本文所述的方法评价抗CD19 CAR T细胞的功效。简而言之，研究开始前5-7天，将40只5-8周龄的雌性CIEA NOG(NOD.Cg-Prkdc^scidI12rg^tm1Sug/JicTac)小鼠饲养在通风的微型隔离笼中，保持在无病原体的条件下。在研究开始时，将小鼠分为8个治疗组，如表11所示。给小鼠静脉内接种Nalm6-Fluc-GFP(Nalm6-Fluc-Neo/eGFP--Puro)细胞以模拟播散性疾病。第1天，所有小鼠接受静脉内注射0.5×10⁶个Nalm6细胞/小鼠。第4天，组2-8接受静脉内注射CAR T细胞(4×10⁶个CAR+细胞/小鼠)，如表11所示。

表11.治疗组

在研究过程中，每天监测小鼠，并且每周两次测量体重。在第2、7、14、21、42和50天通过颌下采血从所有小鼠收集血液样品(0.1ml/小鼠)，以评估研究过程中的CAR T细胞扩增。从研究第4天开始每周两次测量生物发光(BLI；总ROI，光子数/秒)。一个重要的终点是围发病(peri-morbidity)时间，并且还评估了T细胞植入的效果。记录了研究中每个组的动物死亡数的百分比和死亡时间。在达到垂死状态之前对小鼠实施安乐死。如果满足以下一项或多项标准，则可将小鼠定义为垂死并处死：

-体重减轻20％或以上持续超过1周的时间；

-肿瘤抑制正常生理功能(诸如进食、饮水、活动以及排尿和/或排便能力)；

-长期过度腹泻导致体重过度减轻(>20％)；或者

-持续喘息和呼吸窘迫。

如果临床观察到所定义的长期或过度疼痛或痛苦，诸如：虚脱、驼背姿势、瘫痪/麻痹、腹部膨胀、溃疡、脓肿、癫痫发作和/或出血，动物也被认为垂死。

(i)体内存活率

单独或与CD70和/或FAS组合接受具有另外的TET2敲除的TRAC^-/B2M^-CAR T细胞的组(组4、6和8)中的小鼠相对于未治疗的小鼠(组1)中和用具有野生型TET2等位基因的TRAC^-/B2M^-同种异体抗CD19CAR T细胞治疗的小鼠(组2)表现出存活率增加，并且甚至在治疗后长达153天也没有死于Nalm6白血病。虽然CD70丢失(组3；抗CD19CAR/TRAC^-/B2M^-/CD70^-)相对于组2小鼠未增加存活率，但是与组2小鼠相比，添加TET2敲除延长了组6(抗CD19 CAR/TRAC^-/B2M^-/TET2^-/CD70^-)和组8(抗CD19 CAR/TRAC^-/B2M^-/FAS^-/TET2^-/CD70^-)中小鼠的存活期。参见下表12。

表12.通过CAR-T细胞治疗的小鼠的存活天数

为了评估在同种异体抗CD19 CAR+/TRAC-/B2M-T细胞中观察到的TET2 KO的作用是否对sgRNA TET2外显子4BG4具有特异性，从不同的健康供体制备单独批次的细胞并如上所述在Nalm6//体内模型中进行测试。用4×10⁶个TET2基因座被以下sgRNA(TET2外显子6_BG5、TET2外显子4_BG4或TET2外显子3_T1)中的任一种破坏的CAR+细胞治疗的小鼠比接受TRAC-/B2M-/CAR+T细胞的小鼠都延长了小鼠的存活期(图5A；所有TET2-组相对于TRAC-/B2M-/CAR+T细胞显示出统计学显著的存活(p＝.0021)；对数秩(Log-Rank)检验)，并且显示出Nalm6-荧光素酶活性随时间降低(图5B)。因此，Tet2在Nalm6播散性小鼠模型中改善了CAR T功效。

总之，TET2敲除引起显著的细胞扩增，从而使得CAR T细胞在CD19⁺恶性肿瘤的体内模型中的功能增强。此外，TET2 KO允许CAR-T细胞在其他基因中进行编辑，这些编辑可能对细胞有额外益处(例如，抗凋亡/抗衰老)，但不会自行在这种白血病模型中延长存活期。

(ii)体内CAR T细胞扩增

如上所述，通过对从整个研究中收集的血液样品中分离的DNA进行ddPCR测量CAR拷贝数来评估CAR T细胞扩增。

使用Qiagen Dneasy血液和组织试剂盒(荷兰文洛的凯杰公司(Qiagen,Venlo,Netherlands))从小鼠组织中分离DNA。使用Nanodrop(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific))或DropSense96(比利时根特布鲁格的特瑞恩公司(trinean,Gentbrugge,Belgium))机器对来自RBC裂解样品的核酸的总质量进行定量。设计引物和6-羧基荧光素(FAM)标记的探针组(在下表12中提供)以通过液滴数字PCR(ddPCR)对整合到人类TRAC基因座中的CAR构建体的水平进行定量。使用Bio-Rad自动化液滴发生器、Bio-Rad T100热循环仪和Bio-Rad QX200液滴读取机(加利福利亚赫拉克勒斯的伯乐实验室(Bio-radLaboratories,Hercules,CA))进行ddPCR。使用QuantaSoft 1.7.4.0917版(伯乐实验室)软件计算每份样品整合的CAR拷贝的绝对数量。最后，将检测到的CAR等位基因的数量除以输入的总DNA量以计算每单位质量输入样品的CAR拷贝的绝对数量。ddPCR测定通过扩增跨越内源性TRAC序列和CAR表达盒启动子(EF-1α)的866bp扩增子来检测每单位质量基因组DNA(gDNA)整合的CAR转基因拷贝的数量。简而言之，对于条件≥LLOQ，该测定的鉴定产生在测试范围(2至300,000个拷贝/ug gDNA)内的线性数据(R²>0.95)以及产生在正常范围(％RE≤100％和％CV≤20％)内的％相对误差(％RE)和％变异系数(％CV)。基于可用数据计算LLOD和LLOQ，并且将LLOD设为每0.2μg gDNA 5个拷贝，将LLOQ设为每0.2μg 40个拷贝。

表13.用于ddPCR的引物和探针

这些分析证明，与用没有TET2 KO的同种异体CAR T细胞治疗的组(例如，组2、3、5和7)相比，向同种异体CAR T细胞(TRAC^-/B2M^-)添加TET2 KO使T细胞在被治疗小鼠(例如，组4、6和8)的血液中扩增至更高水平(图4)。这种扩增在研究的第21天很明显，并经过了第100天。FAS KO似乎还在第50天明显对CAR T细胞产生更适度的扩增(例如，组5或7相对于组2)(图4)。

总之，所有TET2丢失组的外周血中的CAR-T细胞均扩增，而FAS丢失组在相对较晚的时间点显示水平升高。

实例5：TET2的敲除增加功能性CAR-T细胞在液体和实体肿瘤模型中的持久性

为了评估TET2 KO如何增加CAR-T效力的机制，在几个再攻击模型中检查了TET2破坏对CAR T细胞持久性的影响。在CD19+恶性肿瘤的再攻击模型中，NOG小鼠首先接受Nalm6-荧光素酶细胞，并如上所述给予CAR-T细胞。给予小鼠8×10⁶个均为TRAC-/B2M-的CAR+CD19CAR-T细胞以及具有使用以下三种gRNA中的一种诱导的TET2的额外破坏的组：TET2外显子4_BG4、TET2外显子3_T1或TET2外显子6_BG5。虽然未治疗的小鼠很快死于白血病，但是所有CAR-T细胞组均在30天内清除了最初的Nalm6-荧光素酶白血病(图6A)。在研究的第35天，所有小鼠接受第二剂量的癌细胞，使用的是更具侵袭性的癌细胞系。将CD19+伯基特淋巴瘤来源的Raji-荧光素酶细胞系以0.5×10⁶个细胞/小鼠静脉内注射到小鼠体内。未经治疗的小鼠(未接受Nalm-luc细胞的小鼠)很快死于Raji淋巴瘤。然而，先前在接受TRAC-/B2M-/TET2-细胞后清除Nalm6肿瘤的小鼠比仅接受TRAC-/B2M-CAR T细胞的小鼠更好地控制第二肿瘤(图6A)。这些数据提供了TET2破坏允许功能性CAR-T细胞持续存在的证据。这种效应与被破坏的TET2基因组片段无关，因为用几种不同的sgRNA编辑的细胞产生了类似的结果。

为了评估TET2 KO在不同CAR构建体(抗BCMACAR)背景下增加CAR-T细胞在不同液体肿瘤模型(多发性骨髓瘤)中的持久性的能力，从健康供体制备靶向BCMA的CAR-T细胞。如前所述制备抗BCMA CAR T细胞。将CAR-T细胞组制备成TRAC-/B2M-和TRAC-/B2M-/TET2-(使用TET2外显子4_BG4、TET2外显子6_BG5或TET2外显子5_T1 sgRNA)。最初在NOG小鼠的右侧腹皮下接种1×10⁷个多发性骨髓瘤来源的RPMI-8226细胞。9天后，当可触知肿瘤时，静脉内注射1×10⁶个CAR+细胞。虽然未治疗的小鼠很快死于肿瘤终点(2000mm3)，但是TRAC-/B2M-和TRAC-/B2M-/TET2-组均高效地清除了原发性RPMI-8226肿瘤(图6B)。在研究的第32天，通过将1×10⁷个新鲜RPMI-8226细胞注射到小鼠的左侧腹，使先前用CAR+T细胞处理的小鼠经受肿瘤再攻击。在一组新的未经治疗的小鼠的左侧腹注射1×10⁷个新鲜RPMI-8226细胞(未处理组)。虽然TRAC-/B2M-BCMA-CAR-T细胞可以在一定程度上控制再攻击，但是TRAC-/B2M-/TET2-BCMA-CAR-T细胞快速消除了这些新的肿瘤细胞(图6C)。总之，TET2破坏允许CAR-T细胞在多个液体肿瘤模型中的侵袭性再攻击模型中持续更长时间。这会影响靶向不同癌抗原的多种CAR T细胞。

为了评估TET2丢失增加CAR-T细胞在实体肿瘤中的持久性的能力，从健康供体制备靶向CD70的CAR T细胞(抗CD70 CAR T细胞)。将CAR-T细胞组制备成TRAC-/B2M-/CD70-和TRAC-/B2M-/CD70-/TET2-(例如，TET2外显子4)BG4 sgRNA)。最初在NOG小鼠的右侧腹皮下接种5×10⁶个肾细胞癌(RCC)来源的A498细胞。当肿瘤达到500mm³时，静脉内注射1×10⁷个CAR-T细胞。虽然未治疗的小鼠很快死于肿瘤终点(2000mm³)，但是TRAC-/B2M-/CD70-和TRAC-/B2M-/CD70-/TET2-均高效地清除了原发性A498肿瘤(图6D)。在研究的第54天，通过将5×10⁶个RCC来源的Caki-1细胞注射到小鼠的左侧腹，使小鼠经受肿瘤再攻击。在一组新的未经治疗的小鼠的左侧腹注射1×10⁷个新鲜RPMI-8226细胞(未处理组)。虽然TRAC-/B2M-/CD70-/CD70-/CAR-T细胞显示出对Caki-1肿瘤的适度控制，但是TRAC-/B2M-/CD70-/TET2-/CD70-/CAR-T细胞快速消除了这些新的肿瘤细胞(图6E)。总之，TET2破坏允许CAR-T细胞在液体和实体肿瘤的侵袭性再攻击模型中持续更长时间。

实例6.TET2缺陷型CAR-T细胞依赖于细胞因子进行生长。

为了评估缺乏TET2的CAR-T细胞的致瘤潜力，产生为TRAC-/B2M-和TET2野生型或TET2被破坏(TET2破坏使用TET2外显子4_BG4、TET2外显子6_BG5、TET2-外显子5_T1)的抗CD19 CAR T细胞。然后使用这些细胞评估经基因组编辑的细胞在培养物中显示生长因子和/或细胞因子非依赖性生长的能力。将2×10⁶个细胞置于全T细胞培养基(含有5％人血清+IL2和IL7)或含有血清但缺乏IL-2和IL-7的培养基中。然后使用台盼蓝和Countess自动细胞计数器(赛默飞世尔科技)每周对细胞进行计数。虽然所有组的细胞都可以在含有血清和细胞因子的培养基中生长，但是在6周的时间内没有从任何组中检测到生长。图7.这些数据证明TET2破坏不会导致人外周血来源的T细胞的直接致癌转化，因为这些细胞继续依赖于细胞因子进行生长。

实例7.TET-2引导RNA的中靶和脱靶编辑

按照以上实例1披露的方法检查各种靶向TET2的gRNA的中靶和脱靶编辑效率。简而言之，用含有Cas9核酸酶和靶向TET2基因的合成的经修饰sgRNA(上表3中的序列)的核糖核蛋白颗粒(RNP)或对照(无Cas9，无gRNA)转染(电穿孔)源自原代人类PBMC细胞的激活T细胞。转染后六(6)天，对细胞进行免疫印迹以评估中靶TET2编辑对蛋白表达的影响。

对于基因组中靶和脱靶评估，使用相同的电穿孔方法从两种不同的供体T细胞(称为1和2)产生经编辑的细胞的两种细胞群体。用表3和14中列出的七种引导物中的每一种对细胞进行基因编辑，然后在转染后六(6)天收集细胞。用杂交捕获(一种富集中靶和脱靶位点的同源依赖性方法)结合下一代测序来分析这些样品。简而言之，通过计算鉴定与每个gRNA靶位点具有同源性的中靶位点和脱靶位点，使用单链RNA探针从主体基因组DNA中富集这些位点，用下一代测序对这些富集的位点进行测序，并且分析数据中指示CRISPR/Cas9介导的基因编辑后修复的插入和缺失。

结果在下表14中提供。

表14.通过杂交捕获实现的中靶和脱靶结果

^a供体1和供体2的平均值。

T细胞中的中靶插缺概况分析

用于量化脱靶编辑的数据也用于量化和总结针对表14中列出的所有TET2引导物的最常见中靶插缺。该数据是由两个供体(称为供体1和供体2)中TET2基因座的杂交捕获与下一代测序组合产生的。

基因编辑后，在CRISPR/Cas9基因编辑产生TET2-T细胞后，对T细胞群体中的TET2基因座进行杂交捕获分析得到特定插缺频率和在TET2基因座处编辑的基因序列(表15-21；缺失以短划线表示，插入以粗体表示)。

为了根据杂交捕获数据中进行单个序列量化，选择并考虑跨TET2中靶位点(切割位点上游和下游20bp)对齐序列读数以进行插缺序列量化。从选定的读段中，每个推定切割位点上游和下游10bp以内的序列(PAM上游～3bp)(Jinek等人，Science[科学]2012)被量化为中靶非同源末端连接(NHEJ)编辑的代表性区域。这些中靶基因编辑序列的数据在下表中给出，这些序列的频率代表在每个切割位点上游和下游20bp之内跨越中靶位点的所有序列的百分比。每种引导物的插缺在表15-21中相对于中靶参考序列示出。参考序列以切割位点为中心，在任一方向上具有10bp，以PAM的3′的4bp为末端。

表15.在TET2-外显子3-T1 gRNA的至少一个经基因编辑的T细胞供体中频率>1％的中靶基因编辑序列。

^a以切割位点为中心的中靶序列，在任一方向上具有10bp。为便于比较，gRNA靶序列与参考中靶序列对齐的部分加下划线且PAM用括号表示。

^b缺失以短划线(-)表示；插入以粗体表示

^c在经基因编辑的序列中所插入的碱基的位置在参考序列中以短划线(-)表示

表16.在TET2-外显子3-T2 gRNA的至少一个经基因编辑的T细胞供体中频率>1％的中靶基因编辑序列。

^b缺失以短划线(-)表示；插入以粗体表示

表17.在TET2-外显子3-T3 gRNA的至少一个经基因编辑的T细胞供体中频率>1％的中靶基因编辑序列。

^b缺失以短划线(-)表示；插入以粗体表示

表18.在TET2-外显子6-BG5 gRNA的至少一个经基因编辑的T细胞供体中频率>1％的中靶基因编辑序列。

^b缺失以短划线(-)表示；插入以粗体表示

表19.在TET2-外显子5-T1 gRNA的至少一个经基因编辑的T细胞供体中频率>1％的中靶基因编辑序列。

^b缺失以短划线(-)表示；插入以粗体表示

表20.在TET2-外显子5-T2 gRNA的至少一个经基因编辑的T细胞供体中频率>1％的中靶基因编辑序列。

^b缺失以短划线(-)表示；插入以粗体表示

表21.在TET2-外显子4-BG4 gRNA的至少一个经基因编辑的T细胞供体中频率>1％的中靶基因编辑序列。

^b缺失以短划线(-)表示；插入以粗体表示

实例8.抗BCMA CAR-T细胞中的TET2敲除赋予生长优势和CAR-T富集

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法使用经基因修饰的T细胞来更特异性地且高效地靶向并杀伤癌细胞。从血液中收集T细胞后，对细胞进行工程化，使其表面上包含CAR。可使用CRISPR/Cas9基因编辑技术将CAR引入T细胞中。将这些同种异体CAR T细胞注射到患者体内时，受体使T细胞能够杀伤癌细胞。

本实例进一步探索了通过在CAR-T细胞中进行基因编辑(例如，利用多轮靶抗原刺激)敲除TET2产生的有利特征。

(I)产生TET2 KO(TET2-)或TET2 WT(TET2+)抗BCMA CAR-T细胞

用Cas9:TET2 sgRNA 1RNP复合物电穿孔(EP1)激活的原代人类T细胞，以产生多克隆TET2 KO群体。72小时后，用Cas9:gRNA RNP复合物(RNP)和腺相关腺病毒载体(AAV)再次电穿孔(EP2)这些细胞或野生型(WT)激活的原代T细胞，以产生TET2-/TRAC-/β2M-/抗BCMACAR+(TET2-/抗BCMA CAR)或TRAC-/β2M-/抗BCMA CAR+T细胞(TET2+/抗BCMA CAR)。产生两个对照组，其中在EP2中不包括AAV或RNP(分别为TET2-/AAV-和TET2-/RNP-)。将包含编码抗BCMA CAR(SEQ ID NO:149)的核苷酸序列中的一种的重组AAV血清型6(AAV6)与Cas9:sgRNARNP(1μM Cas9，5μM gRNA)一起递送至激活的同种异体人类T细胞。使用以下sgRNA：TET2(SEQ ID NO:13)、TRAC(SEQ ID NO:93)和β2M(SEQ ID NO:97)。

电穿孔(EP1)后约一(1)周，使用1:500稀释度的抗TET2多克隆抗体(帝亚吉诺德(Diagenode)，#C15410255-100)通过自动蛋白印迹(Wes^TM，普诺森生物科技公司)评估细胞的TET2蛋白敲低。从该测定获得的结果证实在TET2 KO(TET2-)抗BCMA CAR-T细胞中没有检测到TET2，而在对照细胞和TET2 WT(TET2+)抗BCMA CAR-T细胞中检测到TET2表达。

在EP2后第9天，还对细胞进行流式细胞术处理，以评估TRAC和β2M敲除水平以及经编辑的细胞群体的细胞表面的抗BCMA CAR表达水平。用表22所示的一组抗体对细胞进行染色。

表22.用于检测CAR-T细胞表面蛋白的抗体组

结果在下表23中示出。对于所有抗BCMA CAR-T细胞和TRAC-/β2M-对照细胞(TET2-/AAV-)，>85％的活细胞缺乏TCR的表达，并且>74％缺乏β2M的表达，其中>72％的抗BCMA CAR-T细胞群体都是TRAC-/B2M-。通过前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)谱并利用7-AAD染料对活CAR-T细胞进行门控。

表23.EP2后9天表面抗BCMA CAR表达和TRAC/B2M敲低的阳性群体百分比

(II).TET2 KO(TET2-)或TET2 WT(TET2+)抗BCMA CAR-T细胞的抗原刺激

测定CAR表达后，将不同的细胞群体扩增一周。然后将每种CAR-T群体(TET2-/抗BCMA CAR-T、TET2+/抗BCMA CAR-T、TET2-/AAV-和TET2-/RNP-)的100万个细胞与靶细胞系MM.1S以1:1的E:T比一式三份地在12孔组织培养板中的全T细胞培养基中共培养，并在37℃下孵育48小时(第1轮刺激)或72小时(第2和3轮刺激)，这是先前确立的足以确保共培养的CAR-T细胞杀伤所有靶细胞的时间段。总共进行3轮刺激，其中在每次刺激后，收集CAR-T细胞，洗涤，用台盼蓝进行计数(用于活力评估)，并以100万个细胞/孔用新鲜靶细胞以1:1的E:T比一式三份地重新铺板。另外，使用下表24中所示的抗体组通过FACS评价一部分细胞的CAR-T表达。3轮刺激后，收集并扩增CAR-T细胞，以监测生长和％活力，以及使用表24中所示的抗体组定期FACS评价表面CAR表达。

表24.用于检测CAR-T细胞表面蛋白的抗体组

延长培养这些抗BCMA CAR-T群体的结果表明，敲除T细胞中的TET2赋予已用靶细胞系刺激的CAR-T细胞增殖优势(图8A)，而在总体活力方面没有显著差异(图8B)。另外，与TET2+/抗BCMA CAR-T细胞或非刺激细胞相比，观察到TET2 KO细胞中BCMA CAR-T阳性细胞的优先富集(图8C)。

(III).TET2 KO抗BCMA CAR-T细胞(TET2-/抗BCMA CAR T)和TET2 WT抗BCMA CAR-T细胞(TET2+/抗BCMA CAR T)之间的功能特征比较

在每轮靶细胞刺激后，使用干扰素γ(IFNγ)的细胞因子释放测定评估抗BCMACAR T细胞的功能活性(通过效应细胞因子分泌证明)。在上述共培养期后，收集来自共培养细胞的上清液培养基，并使用ELISA(RD系统公司(RD Systems))根据制造商的说明书测量IFNγ的水平。使用MILLIPLEX试剂盒(密理博公司(Millipore)，目录号HCYTOMAG-60K)(使用磁性微球)、HCYIFNG-MAG(密理博公司，目录号HCYIFNG-MAG)来定量来自共培养刺激测定的样品中的IFN-γ分泌。根据制造商的方案进行该测定。

简言之，重构

标准品和质量控制(QC)样品，并且制备10,000pg/mL至3.2pg/mL的工作标准品的连续稀释液。将

标准品、QC和细胞上清液添加到每个板中，并使用测定培养基稀释上清液。将所有样品与HCYIFNG-MAG珠一起孵育2小时。孵育后，使用自动磁性板洗涤器洗涤板。向每孔中添加人细胞因子/趋化因子检测抗体溶液，并孵育1小时，随后与链霉亲和素-藻红蛋白一起孵育30分钟。随后洗涤板，用150μL鞘液重悬样品，并在板振荡器上搅拌5分钟。使用带

软件的

100/200^TM仪器读取样品，并使用

分析师软件完成数据采集和分析。使用5参数逻辑曲线拟合方法自动分析中位荧光强度值(MFI)数据，以计算在未知样品中测量的细胞因子浓度。

结果表明，在这些条件下，经过多轮靶细胞系刺激后，具有或没有TET2 KO的抗BCMA CAR-T细胞中的IFNγ分泌没有显著差异(图8D)。对照细胞TCR-/β2M-(AAV阴性)和非CAR编辑的(RNP阴性)在MM1S细胞存在下没有显示出显著或特异性的IFNγ分泌反应。

总之，上述研究表明：(a)在MM1S抗原刺激后，TET2 KO抗BCMA CAR-T细胞(TET2-/抗BCMA CAR T)显示出优于TET2 WT抗BCMA CAR T细胞(TET2+/抗BCMA CAR T)的生长优势；(b)抗原刺激后，TET2 KO抗BCMA CAR-T细胞显示出优于TET2 WT抗BCMA CAR T细胞的抗BCMA CAR阳性细胞富集；并且(c)与具有多重抗原刺激的TET2 WT抗BCMA CAR T细胞相比，TET2 KO未改变抗BCMA CAR-T功能活性(IFNγ分泌)。这些结果证明，在CAR-T细胞(此处使用抗BCMA CAR-T细胞作为实例)中工程化TET2敲除赋予生长优势和CAR-T富集效应。这提供了概念证据，证明通过基因编辑在体外促进CAR-T细胞增殖是可行的，并且可以用于产生能够在不影响功能的情况下提高CAR-T产量的细胞库。

实例9.FAS引导RNA的中靶和脱靶编辑

对表现出最高基因编辑效率的三个引导物FAS-ex2-T2、FAS-ex3_T1、FAS-ex3_T2检查各种FAS靶向gRNA的中靶和脱靶编辑效率(参见图2A)。简而言之，用含有Cas9核酸酶和靶向FAS基因的合成的经修饰sgRNA(上表5中的序列)或制备为未处理对照(未电穿孔，无Cas9，无gRNA)的核糖核蛋白颗粒(RNP)转染(电穿孔)源自原代人类PBMC细胞的激活T细胞。

对于基因组中靶和脱靶评估，使用相同的电穿孔方法从两种不同的供体T细胞(称为1和2)产生经编辑的细胞的两种细胞群体。用表5中列出的前面引导物中的三种对细胞进行基因编辑，然后在转染后十(10)天收集细胞。用杂交捕获(一种富集中靶和脱靶位点的同源依赖性方法)结合下一代测序来分析这些样品。简而言之，通过计算鉴定与每个gRNA靶位点具有同源性的中靶位点和脱靶位点，使用单链RNA探针从主体基因组DNA中富集这些位点，用下一代测序对这些富集的位点进行测序，并且分析数据中指示CRISPR编辑后修复的插入和缺失。

结果在下表25中提供。

表25.通过杂交捕获实现的中靶和脱靶结果

^a供体1和供体2的平均值。

T细胞中的中靶插缺概况分析

用于量化脱靶编辑的数据也用于量化和总结针对表25中列出的所有FAS引导物的最常见中靶插缺。该数据是由两个供体(称为供体1和供体2)中FAS基因座的杂交捕获与下一代测序组合产生的。

基因编辑后，在CRISPR/Cas9基因编辑产生FAS-T细胞后，对T细胞群体中的FAS基因座进行杂交捕获分析得到特定插缺频率和在FAS基因座处编辑的基因序列(表26-28；缺失以短划线表示，插入以粗体表示)。

为了根据杂交捕获数据中进行单个序列量化，选择并考虑跨FAS中靶位点(切割位点上游和下游20bp)对齐序列读数以进行插缺序列量化。从选定的读段中，每个推定切割位点上游和下游10bp以内的序列(PAM上游～3bp)(Jinek等人，Science[科学]2012)被量化为中靶非同源末端连接(NHEJ)编辑的代表性区域。这些中靶基因编辑序列的数据在下表中给出，这些序列的频率代表在每个切割位点上游和下游20bp之内跨越中靶位点的所有序列的百分比。每种引导物的插缺在表22-24中相对于中靶参考序列示出。参考序列以切割位点为中心，在任一方向上具有10bp，以PAM的3′的4bp为末端。

表26.在FAS-外显子2-T2 gRNA的至少一个经基因编辑的T细胞供体中频率>1％的中靶基因编辑序列。

^b缺失以短划线(-)表示；插入以粗体表示

表27.在FAS-外显子3-T1 gRNA的至少一个经基因编辑的T细胞供体中频率>1％的中靶基因编辑序列。

^b缺失以短划线(-)表示；插入以粗体表示

表28.在FAS-外显子3-T2 gRNA的至少一个经基因编辑的T细胞供体中频率>1％的中靶基因编辑序列。

^b缺失以短划线(-)表示；插入以粗体表示

实例10.同种异体人类CD19 CAR-T细胞系的衍生

从3只给予表达TRAC-/B2M-/FAS-/TET2-/CD70-抗CD19 CAR的T细胞(从健康人类供体的外周血T细胞产生)的小鼠中分离脾细胞。这些小鼠在输注后>3个月控制住了Nalm6白血病。在含有IL2/IL7和人血清的人类T细胞培养基中培养分离的脾细胞，并监测细胞的生长。来自其中一种小鼠脾脏分离物的细胞随时间显示出生长(这些细胞称为：分离的细胞)。这些分离的细胞是>99％的TRAC-/B2M-/CAR+，并且在培养2个月后具有CD4表型以及FAS、CD70、TET2的高频插缺。更具体地，FACS分析表明，在测试的细胞群体中，97.8％为活细胞，99.1％为TCR和B2M阴性，99.1％为CAR阳性，并且99.8％为CD4阳性。

分离的细胞保持其对人类细胞因子IL2和IL7的依赖性(图9A)。这些细胞还保留它们杀伤CD19+细胞的能力(图9B)，并且进一步保持体外细胞毒性和细胞因子释放功能(分别为图9C和9D)。将分离的细胞再次重新注射到Nalm6白血病模型中，显示出与新鲜批次的TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR T细胞相当的功效(图9E)。

用分离的细胞进行该第二轮体内测试后，再次从1只小鼠中分离细胞，并在含细胞因子的培养基中进一步培养/扩增数周。这些再分离的细胞保持与来自最初体内分离的细胞相同的表型。将再分离的细胞用于第二实验，以评估它们控制Nalm6白血病的能力。

本实例表明持久的T细胞系可以由正常健康供体(例如，人类供体)来源的外周血T细胞产生，这些T细胞系在体外和体内保持功能性并且具有作为细胞库和/或治疗物的潜力。

其他实施例

在本说明书中披露的所有特征能以任何组合来组合。在本说明书中披露的每个特征可以由用于相同，等同或类似目的替代特征替换。因此，除非另有说明，所披露的每个特征仅仅是等效或类似特征的通用系列的示例。

通过以上的说明，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特征并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明作不同变化和变更，以使它适应不同用途和条件。因此，其他实施例也在权利要求书范围内。

等同适用

尽管本文已经描述并展示了几个发明实施例，但本领域普通技术人员将容易想象用于执行功能和/或获得结果和/或本文描述的优点中的一个或多个的多种其他装置和/或结构，并且此类变型和/或修改中的每一个被视为是在本文描述的发明实施例的范围内。更一般地说，本领域的技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料以及配置意味着为示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于发明传授内容所用于的一种或多种具体应用。本领域的技术人员仅仅使用常规实验将认识到或能够确认本文描述的具体发明实施例的许多等同物。因此，应了解，前述实施例是仅借助于实例来呈现，并且在所附权利要求书和其相等形式的范围内，发明实施例可以按与具体地描述和要求不同的方式实践。本披露的发明实施例涉及本文描述的每个单独特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾，两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合包括在本披露的发明范围内。

如本文限定并使用的所有定义应当被理解成凌驾于所限定术语的字典定义、通过援引而并入的文件中的定义、和/或一般含义。

本文披露的所有参考文献、专利和专利申请都相对于每个被引用的主题通过援引而并入，这在一些情况下可以包括文件的全部内容。

除非清楚地作相反指示，否则在说明书中和在权利要求中，如本文使用的不定冠词“一个”和“一种”(a和an)应当理解为意思指“至少一个(种)”。

在说明书中和在权利要求中，如本文使用的短语“和/或”应当理解为意思指如此联在一起的要素中的“任何一个或两个”，即，要素在一些情形中联合地存在并且在其他情形中分离性地存在。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式来解释，即，这样结合的要素中的“一个或多个”。除了由“和/或”从句具体鉴定的元素，其他元素可以任选地存在，无论是与具体鉴定的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当结合开放式语言诸如“包括”使用时，对“A和/或B”的提及可以在一个实施例中仅指A(任选地包括除了B的元素)；在另一个实施例中，仅指B(任选地包括除了A的元素)；在又另一个实施例中，指A和B(任选地包括其他元素)；等。

在说明书中和在权利要求中，如本文使用的“或”应理解为具有与如以上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔一个清单中的项目时，“或”或“和/或”应当解释为包容性的，即，包括多个元素或元素清单中的至少一个，而且包括其中的多于一个，以及任选地，另外的未列出的项目。仅相反地清楚指示的术语，诸如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”，或者当用于权利要求中时，“由……组成”将指恰好包括一些或一列元素中的一个元素。总体而言，如本文使用的术语“或”当前面加有排他性的术语，诸如“任何一个”、“……中一个”、“……中仅一个”或“……中只有一个”时，应当仅解释为指示排他性的替代形式(即，“一个或另一个，但非两者”)。“主要由……组成”当用于权利要求中时，应具有如在专利法领域中所用的其普通含义。

如本文在说明书中和在权利要求中所用，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为意指选自该要素列表中的任一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括在该要素列表内具体地列出的每个和每一个要素中的至少一个，并且不排除该要素列表中的多个要素的任何组合。这一定义还允许，可以任选地存在除该短语“至少一个”所指元素清单内具体地鉴别出的元素外的元素，无论是与具体地鉴别出的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施例中可以是指至少一个、任选地包括多于一个A，而不存在B(并且任选地包括除了B的元素)；在另一个实施例中，可以是指至少一个、任选地包括多于一个B，而不存在A(并且任选地包括除了A的元素)；在又另一个实施例中，可以是指至少一个、任选地包括多于一个A，以及至少一个、任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他元素)；等。

还应当理解，除非明确指出相反，在包括多于一个步骤或动作的本文所要求保护的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于其中方法的步骤或动作被列举的顺序。

Claims

1.一种基因工程化T细胞群体，该群体包含：

(i)破坏的参与细胞自我更新的基因；

(ii)破坏的参与凋亡的基因；

(iii)破坏的参与T细胞耗竭调节的基因；或者

(iv)(i)-(iii)中任一项的组合；

其中与非工程化T细胞对应物相比，该基因工程化T细胞群体具有一个或多个以下特征：(a)在培养物中增强的扩增能力，(b)增强的增殖能力，(c)降低的凋亡水平，以及(d)增强的激活频率。

2.如权利要求1所述的基因工程化T细胞群体，其中这些T细胞包含(i)-(iii)的组合。

3.如权利要求1或权利要求2所述的基因工程化T细胞群体，其中(i)包括TET2，并且任选地其中这些基因工程化T细胞不包含(ii)、(iii)或两者。

4.如权利要求1-3中任一项所述的基因工程化T细胞群体，其中在选自由外显子1、外显子3、外显子4、外显子5和外显子6或它们的组合组成的组的外显子中对破坏的TET2进行基因编辑，任选地其中在外显子3、外显子4、外显子5或外显子6中对突变的TET2进行基因编辑。

5.如权利要求1-4中任一项所述的基因工程化T细胞群体，其中通过CRISPR/Cas介导的基因编辑对该破坏的TET2基因进行基因编辑。

6.如权利要求5所述的基因工程化T细胞群体，其中通过CRISPR/Cas介导的基因编辑用包含SEQ ID NO:14、18、22、26、112、116或120的核苷酸序列的引导RNA(gRNA)对该破坏的TET2基因进行基因编辑。

7.如权利要求1-6中任一项所述的基因工程化T细胞群体，其中(ii)包括FAS。

8.如权利要求1-7中任一项所述的基因工程化T细胞群体，其中(iii)包括CD70。

9.如权利要求7或权利要求8所述的基因工程化T细胞群体，其中通过CRISPR/Cas介导的基因编辑对破坏的FAS和/或CD70基因进行基因编辑。

10.如权利要求9所述的基因工程化T细胞群体，其中通过CRISPR/Cas介导的基因编辑用包含SEQ ID NO:69、73、77、81或85的核苷酸序列的引导RNA(gRNA)对该破坏的FAS基因进行基因编辑，和/或其中通过CRISPR/Cas介导的基因编辑用包含SEQ ID NO:34、38、42、46、50、54或58的核苷酸序列的gRNA对该破坏的CD70基因进行基因编辑。

11.如权利要求1-10中任一项所述的基因工程化T细胞群体，其中这些T细胞进一步包含破坏的β-2-微球蛋白(β2M)基因。

12.如权利要求1-11中任一项所述的基因工程化T细胞群体，其中这些T细胞进一步包含破坏的T细胞受体α链恒定区(TRAC)基因。

13.如权利要求1-12中任一项所述的基因工程化T细胞群体，其中这些T细胞被进一步工程化为表达嵌合抗原受体(CAR)。

14.如权利要求13所述的基因工程化T细胞群体，其中该CAR靶向肿瘤抗原。

15.如权利要求14所述的基因工程化T细胞群体，其中该肿瘤抗原是CD19、B细胞成熟抗原(BCMA)或CD70。

16.如权利要求13-15中任一项所述的基因工程化T细胞群体，其中这些T细胞包含编码该CAR的核酸，并且其中该核酸插入这些T细胞的基因组中。

17.如权利要求16所述的基因工程化T细胞群体，其中该破坏的TRAC基因具有编码该嵌合抗原受体的核苷酸的插入。

18.如权利要求1-17中任一项所述的基因工程化T细胞群体，其中这些T细胞源自一个或多个人类供体的原代T细胞。

19.如权利要求1-18中任一项所述的基因工程化T细胞群体，其中这些T细胞表现出细胞因子依赖性生长。

20.一种用于制备如权利要求1-10中任一项所述的基因工程化T细胞群体的方法，该方法包括：

(a)提供多个细胞，这些细胞是T细胞或其前体细胞；

(b)对(i)-(iii)基因中的一种或多种进行基因编辑；以及

(c)产生该基因工程化T细胞群体。

21.如权利要求20所述的方法，其中步骤(b)通过向该多个细胞递送RNA引导的核酸酶和靶向(i)-(iii)基因中的一种或多种的一种或多种gRNA来进行。

22.如权利要求21所述的方法，其中(i)包括TET2，并且任选地其中靶向TET2的gRNA对该TET2基因的外显子具有特异性，该外显子选自由外显子1、外显子3、外显子4、外显子5和外显子6组成的组。

23.如权利要求22所述的方法，其中该靶向TET2的引导RNA(gRNA)包含SEQ ID NO:14、18、22、26、112、116或120的核苷酸序列。

24.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其中(ii)包括FAS。

25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中(iii)包括CD70。

26.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其中靶向FAS的gRNA包含SEQ ID NO:69、73、77、81或85的核苷酸序列，和/或其中靶向CD70的gRNA包含SEQ ID NO:34、38、42、46、50、54或58的核苷酸序列。

27.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其中步骤(a)的这些细胞是一个或多个人类供体的原代T细胞。

28.如权利要求20-27中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，将靶向(i)-(iii)的组合的gRNA递送至这些细胞。

29.如权利要求20-28中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，该RNA引导的核酸酶是Cas9核酸酶。

30.如权利要求29所述的方法，其中该Cas9核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶。

31.如权利要求20-30中任一项所述的方法，其中该RNA引导的核酸酶和该一种或多种gRNA复合在核糖核蛋白颗粒(RNP)中。

32.如权利要求20-31中任一项所述的方法，其中步骤(b)通过单次电穿孔事件来进行。

33.如权利要求20-32中任一项所述的方法，其中步骤(b)通过两次连续电穿孔事件来进行。

34.一种用于制备表达嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的方法，该方法包括：

(a)提供来自包含如权利要求1-10中任一项所阐述的基因工程化T细胞的细胞库的多个T细胞；

(b)向该多个T细胞递送编码CAR的核酸；以及

(c)产生表达该CAR的基因工程化T细胞。

35.如权利要求34所述的方法，其中该细胞库中的这些基因工程化T细胞进一步包含破坏的β2M基因。

36.如权利要求34所述的方法，其中该方法进一步包括对β2M基因进行基因编辑。

37.如权利要求36所述的方法，其中该基因编辑步骤包括向该多个T细胞递送靶向β2M基因的gRNA。

38.如权利要求34-37中任一项所述的方法，其中该细胞库中的这些基因工程化T细胞进一步包含破坏的TRAC基因。

39.如权利要求34-38中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括对TRAC基因进行基因编辑。

40.如权利要求34-39中任一项所述的方法，其中该细胞库中的这些基因工程化T细胞源自一个或多个人类供体的原代T细胞。

41.如权利要求34-40中任一项所述的方法，其中向这些T细胞递送RNA引导的核酸酶。

42.如权利要求41所述的方法，其中该RNA引导的核酸酶是Cas9核酸酶。

43.如权利要求42所述的方法，其中该Cas9核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶。

44.如权利要求41-43中任一项所述的方法，其中该RNA引导的核酸酶和该gRNA复合在核糖核蛋白颗粒(RNP)中。

45.一种基因工程化T细胞群体，该群体通过如权利要求20-44中任一项所述的方法制备。

46.一种用于消除受试者体内不需要的细胞的方法，该方法包括向有需要的受试者施用表达靶向这些不需要的细胞的嵌合抗原受体的T细胞，其中这些T细胞如权利要求1-19和45中任一项所阐述。

47.如权利要求46所述的方法，其中这些不需要的细胞是癌细胞。

48.一种靶向TET2基因的引导RNA(gRNA)，该gRNA包含对该TET2基因的外显子3或外显子5具有特异性的核苷酸序列。

49.如权利要求48所述的gRNA，其中该gRNA包含对外显子5具有特异性的核苷酸序列。

50.如权利要求49所述的gRNA，其中该核苷酸序列靶向该TET2基因的外显子5中的GGGATGTCCTATTGCTAAGT(SEQ ID NO:125)或AGGGATGTCCTATTGCTAAG(SEQ ID NO:126)位点。

51.如权利要求50所述的gRNA，其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO:18或22。

52.如权利要求48所述的gRNA，其中该gRNA包含靶向该TET2基因的外显子3的核苷酸序列。

53.如权利要求52所述的gRNA，其中该核苷酸序列靶向该TET2基因的外显子3中的GATTCCGCTTGGTGAAAACG(SEQ ID NO:129)、CAGGACTCACACGACTATTC(SEQ ID NO:131)或TTCCGCTTGGTGAAAACGAG(SEQ ID NO:133)。

54.如权利要求53所述的gRNA，其中该gRNA包含SEQ ID NO:112、116或120的核苷酸序列。

55.如权利要求48所述的gRNA，其中该gRNA包含靶向该TET2基因的外显子4的核苷酸序列。

56.如权利要求55所述的gRNA，其中该核苷酸序列靶向该TET2基因的外显子4中的CATTAGGACCTGCTCCTAGA(SEQ ID NO:124)。

57.如权利要求56所述的gRNA，其中该gRNA包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。

58.如权利要求48所述的gRNA，其中该gRNA包含靶向该TET2基因的外显子6的核苷酸序列。

59.如权利要求58所述的gRNA，其中该核苷酸序列靶向该TET2基因的外显子6中的ACGGCACGCTCACCAATCGC(SEQ ID NO:127)。

60.如权利要求59所述的gRNA，其中该gRNA包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列。

61.如权利要求48-60中任一项所述的gRNA，其中该gRNA进一步包含支架序列。

62.如权利要求48-61中任一项所述的gRNA，其中该gRNA包含一个或多个经修饰的核苷酸。

63.如权利要求62所述的gRNA，其中该gRNA在该gRNA的5’和/或3’末端包含一个或多个2’-O-甲基硫代磷酸酯残基。

64.如权利要求61-63中任一项所述的gRNA，该gRNA包含SEQ ID NO:12、13、16、17、20、21、24、25、114、115、118、119、122或123的核苷酸序列。