KR20220051401A - 배양 중 개선된 지속성을 갖는 유전적으로 조작된 t 세포 - Google Patents

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KR20220051401A
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Abstract

조작되지 않은 T 세포 대응물에 비해 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 유전적으로 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포 은행: (a) 배양 중 향상된 증대능, (b) 향상된 증식능, (c) 감소된 아폽토시스, 및 (d) 향상된 활성화 빈도. 이러한 유전적으로 조작된 T 세포는 (i) 세포 자가-재생에 관여되는 돌연변이된 유전자; (ii) 아폽토시스에 관여되는 파괴된 유전자; (iii) T 세포 고갈의 조절에 관여되는 파괴된 유전자; 또는 (iv) (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 조합을 포함할 수 있다.

Description

배양 중 개선된 지속성을 갖는 유전적으로 조작된 T 세포
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 9월 6일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/897,016호, 2019년 10월 30일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/927,764호, 및 2020년 6월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/034,646호에 대한 우선권 이익을 청구한다. 선행 출원들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 치료법은 암세포를 보다 특이적이고 효율적으로 표적화하고 사멸시키도록 유전적으로 변형된 T 세포를 사용한다. 혈액으로부터 T 세포가 수집된 후, 세포는 이의 표면 상에 CAR을 포함하도록 조작된다. CAR은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용해 T 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 동종이계 CAR T 세포가 환자 내로 주사되는 경우, 수용체는 T 세포가 암세포를 사멸시킬 수 있게 한다.
배양 중 개선된 지속성을 갖는 T 세포가 CAR-T 치료법에서 요망된다. 이러한 T 세포는 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 더 길게 생존하며, 이에 따라 CAR-T 세포 제조 및 임상 적용에서 이익을 부여한다. 그러나, 배양 중 T 세포의 지속성을 개선하는 것은 여전히 난제이다.
본 개시는 적어도 부분적으로, 세포 배양 중 T 세포 지속성을 개선하기 위해 소정 유전자(예를 들어, TET2와 같은 세포 자가-재생, FAS와 같은 아폽토시스, CD70과 같은 T 세포 고갈 또는 복제 노화에 관여되는 유전자, 또는 이의 조합)가 유전자 편집된 T 세포를 포함하는 T 세포 은행의 개발에 기반한다. 본원에서 개시된 유전적으로 편집된 T 세포는 배양 중 향상된 세포 증대 및 증식능, 감소된 아폽토시스(예를 들어, FAS 리간드에 의해 유도됨), 향상된 활성화 빈도(예를 들어, 향상된 세포독성), 및 동물 모델에서 향상된 CAR-T 유효성(예를 들어, 더 긴 지속성을 통해)을 나타내었다. 예를 들어, 파괴된 TET2 유전자를 갖는 CAR-T 세포는 성장 이점 및 시험관내 CAR-T 농축 효과 둘 모두를 나타내었고 액체 및 고형 종양 둘 모두를 갖는 동물 모델에서 CAR-T 세포가 더 오래 지속될 수 있도록 한다. 또한, 파괴된 TET2 유전자를 갖는 유전적으로 편집된 T 세포는 사이토카인 의존적 성장을 나타내어, 안전성을 시사하였다. 이러한 T 세포 은행(예를 들어, 파괴된 TET2 유전자를 가짐)은 치료용 T 세포, 예를 들어, CAR-T 세포를 제조하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시의 하나의 양태는 하기를 포함하는 유전적으로 조작된 T 세포 집단(T 세포 은행)을 제공한다: (i) 세포 자가-재생에 관여되는 돌연변이된 유전자; (ii) 아폽토시스에 관여되는 파괴된 유전자; (iii) T 세포 고갈 또는 복제 노화의 조절에 관여되는 파괴된 유전자; 또는 (iv) (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 조합. 조작되지 않은 T 대응물에 비해, 유전적으로 조작된 T 세포 집단은 하기 더 우수한 특징 중 하나 이상을 갖는다: (a) 배양 중 향상된 증대능, (b) 향상된 증식능, (c) 감소된 아폽토시스 수준, 및 (d) 향상된 활성화 빈도. 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 은행은 하나 이상의 공여자, 예를 들어, 하나 이상의 인간 공여자의 일차 T 세포로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 자가-재생에 관여되는 유전자는 TET2 유전자를 포함할 수 있다. 돌연변이된 TET2 유전자는 파괴된 TET2 유전자일 수 있고, 이는 기능적 TET2 단백질을 발현하지 않는다. 대안적으로, 돌연변이된 TET2 유전자는 절단된 버전의 TET2(예를 들어, 약 170 kDa의 분자량을 갖는 절단된 버전)를 발현하는 조절된 TET2 유전자일 수 있다. 임의의 돌연변이된 TET2 유전자는, 예를 들어, TET2 유전자에서 요망되는 부위(코딩 영역 또는 비-코딩 영역)을 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)를 사용하여, CRISPR/Cas 매개 유전자 편집에 의해 유전적으로 편집될 수 있다. 일부 예에서, 돌연변이된 TET2 유전자는 엑손 1, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5 및 엑손 6 중 하나 이상에서 하나 이상의 유전자 편집 사건을 가질 수 있다. 특정한 예에서, 돌연변이된 TET2 유전자는 SEQ ID NO: 14, 18, 22, 26, 112, 116, 또는 120을 포함하는 gRNA를 사용하여 유전적으로 편집된다.
일부 구현예에서, 아폽토시스에 관여되는 유전자는 FAS를 포함할 수 있고/있거나 T 세포 고갈에 관여되는 유전자는 CD70을 포함할 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들어, CRISPR/Cas-매개 유전자 편집을 통해 파괴될 수 있다. FAS를 표적화하는 예시적 gRNA는 SEQ ID NO: 69, 73, 77, 81, 또는 85를 포함할 수 있다. CD70을 표적화하는 예시적 gRNA는 SEQ ID NO: 34, 38, 42, 46, 50, 54, 또는 58을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재되는 유전적으로 조작된 T 세포 집단은 세포 자가-재생에 관여되는 적어도 하나의 돌연변이된 유전자(예를 들어, TET2), 아폽토시스에 관여되는 적어도 하나의 유전자(예를 들어, FAS), 및/또는 T 세포 고갈에 관여되는 적어도 하나의 유전자(예를 들어, CD70)의 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 개시된 바와 같은 임의의 유전적으로 조작된 T 세포 집단은 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(ß2M) 유전자, 파괴된 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는, 예를 들어, CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 추가로 조작될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 T 세포의 게놈에 삽입된다. 특정 예에서, 유전적으로 조작된 T 세포는 파괴된 TRAC 유전자를 가질 수 있고, 여기에 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드산이 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 종양 항원을 표적화할 수 있다. 예에는 CD19, B 세포 성숙 항원(BCMA), 또는 CD70이 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 은행을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) 복수의 세포(T 세포 또는 이의 전구체 세포임)를 제공하는 단계; (b) 세포 자가-재생에 관여되는 적어도 하나의 유전자(예를 들어, TET2), 아폽토시스에 관여되는 적어도 하나의 유전자(예를 들어, FAS), 및/또는 T 세포 고갈의 조절에 관여되는 적어도 하나의 유전자(예를 들어, CD70)를 유전적으로 편집하는 단계; 및 (c) 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 (a)의 T 세포는 하나 이상의 적합한 공여자, 예를 들어, 하나 이상의 인간 공여자로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 사이토카인 의존적 성장을 나타낸다.
일부 구현예에서, 단계 (b)는 세포에 (a) 하나 이상의 RNA-가이드 뉴클레아제, 및 본원에서 개시되는 하나 이상의 표적 유전자에 특이적인 하나 이상의 gRNA를 전달함으로써 수행될 수 있다. 일부 예에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제, 예를 들어, 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 뉴클레아제일 수 있다. 일부 예에서, RNA-가이드 뉴클레아제 및 하나 이상의 gRNA는 리보뉴클레오단백질 입자(RNP)에서 복합체화될 수 있다. 단계 (b)는 단회 전기천공 사건에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 단계 (b)는 2개의 순차적 전기천공 사건에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 유전자는 TET2를 포함한다. TET2를 표적화하는 예시적 gRNA는 TET2 유전자의 엑손 1, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 및/또는 엑손 6에 특이적일 수 있다. 이러한 gRNA는 SEQ ID NO: 14, 18, 22, 또는 26의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 표적 유전자는 FAS 및/또는 CD70을 포함할 수 있다. FAS를 표적화하는 예시적 gRNA는 SEQ ID NO: 69, 73, 77, 81, 또는 85의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. CD70을 표적화하는 예시적 gRNA는 SEQ ID NO: 34, 38, 42, 46, 50, 54, 또는 58의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에서 개시되는 임의의 T 세포 은행으로부터 유전적으로 조작된 T 세포를 사용하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 유전적으로 조작된 T 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: (a) 세포 자가-재생에 관여되는 적어도 하나의 유전자(예를 들어, TET2), 아폽토시스에 관여되는 적어도 하나의 유전자(예를 들어, FAS), 및/또는 T 세포 고갈의 조절에 관여되는 적어도 하나의 유전자(예를 들어, CD70)를 갖는 유전적으로 조작된 T 세포를 포함할 수 있는 T 세포 은행으로부터의 복수의 T 세포를 제공하는 단계; (b) 복수의 T 세포에 CAR을 인코딩하는 핵산을 전달하는 단계; 및 (c) CAR을 발현하는 유전적으로 조작된 T 세포를 생성하는 단계.
일부 구현예에서, T 세포 은행으로부터의 복수의 T 세포는 파괴된 ß2M 유전자를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 ß2M 유전자를 유전적으로 편집하는 단계, 예를 들어, ß2M 유전자를 표적화하는 gRNA를 복수의 T 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 은행으로부터의 복수의 T 세포는 파괴된 TRAC 유전자를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 TRAC 유전자를 유전적으로 편집하는 단계, 예를 들어, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA를 복수의 T 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 개시된 임의의 방법에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 T 세포 은행으로부터의 복수의 T 세포에 전달될 수 있다. 일부 예에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제, 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제일 수 있다. 일부 예에서, RNA-가이드 뉴클레아제 및 gRNA(들)는 리보뉴클레오단백질 입자(RNP)에서 복합체화될 수 있다.
본원에서 개시된 임의의 제조 방법에 의해 제조된 유전적으로 편집된 T 세포가 또한 본 개시의 범위 내에 있다.
본원에서 개시된 임의의 CAR-T 세포는, 동일한 CAR 폴리펩타이드를 발현하고 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 지속성을 향상시키기 위한 유전자 편집이 없는(예를 들어, TET2, FAS, 및/또는 CD70에 대한 유전자 편집이 없는) CAR-T 세포의 용량을 나타내는 표준 용량의 CAR-T 치료법보다 낮은 용량으로 치료 목적을 위해(예를 들어, CAR-T 세포 상에서 CAR 폴리펩타이드에 의해 표적화된 질환 세포를 제거) 사용될 수 있다.
또한 TET2 유전자를 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)가 본 개시의 범위 내에 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 TET2 유전자의 엑손 엑손 5에 특이적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 예에서, gRNA에 의해 편집된 TET2 유전자는 절단된 버전의 TET2를 발현할 수 있다. 이러한 gRNA는 TET2 유전자의 엑손 5에서 GGGATGTCCTATTGCTAAGT(SEQ ID NO: 125)의 부위를 표적화할 수 있다. 하나의 예에서, gRNA는 SEQ ID NO: 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, gRNA는 TET2 유전자의 엑손 5에서 AGGGATGTCCTATTGCTAAG(SEQ ID NO: 126)의 부위를 표적화할 수 있다. 하나의 예에서, gRNA는 SEQ ID NO: 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, gRNA는 TET2 유전자의 엑손 3을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, gRNA는 TET2 유전자의 엑손 3에서 GATTCCGCTTGGTGAAAACG(SEQ ID NO: 129)를 표적화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, gRNA는 TET2 유전자의 엑손 3에서 CAGGACTCACACGACTATTC(SEQ ID NO: 131)를 표적화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, gRNA는 TET2 유전자의 엑손 3에서 TTCCGCTTGGTGAAAACGAG(SEQ ID NO: 133)를 표적화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 예시적 gRNA는 SEQ ID NO: 112, 116, 또는 120의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA는 TET2 유전자의 엑손 4를 표적화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, gRNA는 TET2 유전자의 엑손 4에서 CATTAGGACCTGCTCCTAGA(SEQ ID NO: 124)를 표적화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 하나의 예에서, gRNA는 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA는 TET2 유전자의 엑손 6을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, gRNA는 TET2 유전자의 엑손 6에서 ACGGCACGCTCACCAATCGC(SEQ ID NO: 127)를 표적화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 하나의 예에서, gRNA는 SEQ ID NO: 26의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 개시된 임의의 gRNA는 스캐폴드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, gRNA는 gRNA의 5' 및/또는 3' 말단에서 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 하나 이상의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 잔기를 포함할 수 있다: TET2를 표적화하는 예시적 gRNA가 표 3(비변형 서열 및 변형 서열이 포함됨)에 제공되며, 그 모두가 본 개시의 범위 내에 있고 숙주 세포, 예컨대 T 세포에서 TET2 유전자의 유전자 편집을 위해 본원에서 개시되는 임의의 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항을 아래의 설명에 나타낸다. 본 발명의 다른 특징 또는 장점은 하기 도면 및 여러 구현예의 상세한 설명, 그리고 또한 첨부 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1a 내지 도 1d에는 TET2 유전자 녹아웃(KO) 또는 단백질 절단을 야기하는 돌연변이가 일차 인간 T 세포에서 증식 및 증대를 증가시켰음을 나타내는 다이어그램이 포함된다. 도 1a: 웨스턴 블롯 검정에 의해 결정되는 TET2 유전자의 gRNA 표적 엑손 5에 의해 편집된 일차 인간 T 세포에서 TET2 단백질의 존재를 나타내는 사진. TET2 엑손 5_T1, 및 TET2 엑손 5_T2가 포함되는 gRNA 중 하나로 전달감염된 세포에서는 단백질이 검출되지 않았다. TET2 엑손 5_T1 gRNA는 TET2 단백질의 절단된 형태를 생성하였다. 도 1b: 웨스턴 블롯 검정에 의해 결정되는 TET2 유전자의 gRNA 표적 엑손 4 또는 엑손 6에 의해 편집된 일차 인간 T 세포에서 TET2 단백질의 존재를 나타내는 사진. TET2 엑손 4_BG4, 및 TET2 엑손 6_BG5로 전달감염된 세포에서는 전장 단백질이 검출되지 않았다. TET2 엑손 6_BG5 처리는 또한 절단된 TET2 단백질 종을 생성하였다. 도 1c: TET2의 조절이 배양 중 향상된 T 세포 증식 및 증대를 유의미하게 향상시켰음을 나타내는 그래프. TET2 엑손 5_T1 및 TET2 엑손 5_T2에 의한 TET2의 결실은 모의군에 비해 T 세포 증식을 증가시켰다. 절단된 TET2(TET2 엑손 5_T1)를 갖는 T 세포는 모든 다른 군에 비해 더 큰 증식을 가졌다. 도 1d: TET2의 조절이 배양 중 T 세포 증식을 유의미하게 향상시켰음을 나타내는 그래프. TET2 엑손4_BG4(BG4) 또는 TET2 엑손 6_BG5(BG5)에 의한 TET2의 결실은 Cas9:sgRNA RNP를 제공받지 않은 세포에 비해 T 세포 증식 및 증대를 증가시켰다.
도 2a 내지 도 2c에는 FAS 녹아웃(KO)이 시험관내 항-BCMA CAR T 세포에서 사이토카인 유도 증식을 증가시키고 아폽토시스를 구제하였음을 나타내는 다이어그램이 포함된다. 도 2a: 일차 인간 T 세포에서의 매우 효율적인 FAS 유전자 편집을 나타내는 그래프. FMO-FAS 군은 FAS 신호에 대한 음성 대조군인 형광 - 1 군을 나타낸다. 도 2b: FAS의 녹아웃이 시험관내 항-BCMA CAR T 세포의 IL-2/IL-7 유도 증식을 개선하였음을 나타내는 그래프. 도 2c: FAS의 녹아웃이 항-FAS 항체에 의해 유도된 아폽토시스로부터 항-BCMA CAR+ T 세포를 구제하였음을 나타내는 그래프.
도 3a 및 3b에는 삼중 녹아웃(FAS/TET2/CD70 녹아웃) T 세포에서 증가된 세포 사멸 및 세포 증식을 나타내는 다이어그램이 포함된다. 도 3a: FAS/TET2/CD70 삼중 녹아웃이 항-CD19 CAR T 세포의 세포 사멸 기능(48시간)을 증가시켰음을 나타내는 그래프. 도 3b: 세포 증식이 배양에서 4주 후 삼중 녹아웃 T 세포에서 계속되었음을 나타내는 그래프.
도 4에는 급성 림프모구 백혈병을 갖는 마우스에서 CAR-T 세포의 증대를 나타내는 그래프가 포함된다. 마우스는 임의로 표시된 바와 같은 파괴된 TET2, CD70, 및/또는 FAS와 조합된, 파괴된 TRAC 및 B2M 유전자를 갖는 항-CD19 CAR-T 세포로 처리되었다.
도 5a 및 도 5b에는 급성 림프모구 백혈병을 갖는 마우스에서 CAR-T 세포에 의한 생존 증가 및 종양 억제를 나타내는 그래프가 포함된다. 도 5a: CAR T 세포에서 TET2 KO 추가의 생존 증가를 나타내는 그래프. 도 5b: TET2 KO의 추가가 CAR T세포로 처리된 마우스에서 종양 부담을 추가로 감소시킴을 나타내는 그래프.
도 6a 내지 도 6e에는 종양 재-시험감염에 노출되는 경우 TET2 KO를 함유하는 CAR T 세포의 보호 효과를 나타내는 그래프가 포함된다. 도 6a: 종양 재-시험감염으로 항-CD19 CAR T 세포에서의 TET2 KO의 보호 효과를 나타내는 그래프. 도 6b: 항-BCMA CAR T 세포에서의 TET2 KO의 보호 효과를 나타내는 그래프. 도 6c: 종양 재-시험감염으로 항-BCMA CAR T 세포에서의 TET2 KO의 보호 효과를 나타내는 그래프. 도 6d: 항-CD70 CAR T 세포에서의 TET2 KO의 보호 효과를 나타내는 그래프. 도 6e: 종양 재-시험감염으로 항-CD70 CAR T 세포에서의 TET2 KO의 보호 효과를 나타내는 그래프.
도 7에는 TRAC-/B2M-/TET2- CAR T 세포의 사이토카인 독립적 성장을 나타내는 그래프가 포함된다.
도 8a 내지 도 8d에는 TET WT 항-BCMA CAR-T 세포에 비해 항-BCMA CAR-T 세포에서 TET KO에 의해 부여된 유리한 특징을 나타내는 그래프가 포함된다. 도 8a: 3회 MM.1S 표적 세포 자극 후 항-BCMA CAR-T 세포 +/- TET2 KO의 증대 성장 곡선을 나타내는 다이어그램. 도. 8b: 3회 MM.1S 표적 세포 자극 후 항-BCMA CAR-T 세포 +/- TET2 KO의 생활성 곡선을 나타내는 다이어그램. 도 8c: 3회 MM.1S 표적 세포 자극 후 항-BCMA CAR-T 세포 +/- TET2 KO의 FACS 표면 발현 곡선을 나타내는 다이어그램. 도 8d: 항-BCMA CAR-T 세포 +/- TET2 KO의 MM1S 자극 후 사이토카인 분비(IFNγ) 반응을 나타내는 차트.
도 9a 내지 도 9e에는 파괴된 TET2, FAS, 및 CD70 유전자를 갖는 동종이계 인간 항-CD19 CAR-T 세포의 지속성을 나타내는 다이어그램이 포함된다. 도 9a: 사이토카인 의존적인, 계속된 세포 증식을 나타내는 차트. 도 9b: 비장 단리 1개월 후 동종이계 인간 항-CD19 CAR-T 세포의 세포 사멸 활성을 나타내는 차트. 도 9c: 동종이계 인간 항-CD19 CAR-T 세포에 의한 인터페론 감마 분비를 나타내는 그래프. 도 9d: 동종이계 인간 항-CD19 CAR-T 세포에 의한 인터류킨 2(IL-2) 분비를 나타내는 그래프. 도 9e: Nalm6/NOG 마우스 모델에서 동종이계 인간 항-CD19 CAR-T 세포의 생존을 나타내는 차트.
본 개시는 CAR-T 치료법에서 오랫동안 느껴온 필요인 개선된 지속성을 갖는 T 세포를 포함하는 T 세포 은행의 확립을 목표로 한다. 이러한 T 세포 은행은 원료로서 진정한 T 세포, 예를 들어, 암화되지 않은 T 세포, 말단 분화된 T 세포, 안정한 게놈을 갖는 T 세포, 및/또는 증식 및 증대를 위해 사이토카인 및 성장 인자에 좌우되는 T 세포를 사용할 수 있다. 대안적으로, 이러한 T 세포 은행은 전구체 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포(예를 들어, iPSC), 예를 들어, 시험관내 배양으로부터 생성된 T 세포를 사용할 수 있다. 본원에서 개시된 T 세포 은행은 CAR-T 세포 제조 및 임상 적용 둘 모두에서 하나 이상의 이점을 부여할 수 있다.
통상적인 동종이계 CAR T 세포가 생성되며, 여기서 세포가 환자 면역계의 구성요소를 회피할 수 있고 이에 따라 GvHD를 유도하지 않도록 대부분의 경우 단일 공여자 류코팩(leukopak)이 편집된다. 이들 CAR T 세포를 증대하는 공정은 10s 내지 100s의 바이알에 넣은 완제 의약품을 산출할 수 있다. 환자는 단회 용량 또는 다회 용량을 제공받을 수 있다. 제조 공정 동안, 이들 CAR T 세포는 다양한 기전, 예를 들어, 아폽토시스, 고갈, 복제 노화, 및 세포가 덜 피팅하게 되는 다른 공정으로 인해 잠재력을 상실한다.
본원에서 개시된 편집된 T 세포 은행은 단일 류코팩이 10s to 100s의 세포 "바이알"의 세포 은행을 생성할 수 있는 공정을 제공할 수 있고, 그 각각이 동종이계 CAR T 세포의 다중-바이알화 완제 의약품을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 은행으로 만든 세포 및 이로부터 생성된 CAR T 세포 둘 모두는 표준(비-세포 은행) 공정에 의해(본원에서 개시된 유전자 편집 사건 중 하나 이상 없이) 생성된 CAR T 세포보다 큰 잠재력을 보유할 것으로 예상된다.
본원에서 제공된 T 세포 은행의 다른 제한되지 않은 유리한 특징에는 하기가 포함된다:
(a) 완제 의약품, 예컨대 CAR-T 제품의 개선된 품질 및 일관성.
(b) 인간 환자에서의 T 세포 은행 세포로부터 생성된 CAR-T 세포의 더 큰 효능 및 더 길게 생존하는 효능.
(c) 감소된 투여량 요건. 본원에서 개시된 T 세포는 향상된 증식 및 증대능을 가지므로, 이들은 생체내에서 더 길게 생존할 수 있다. 이와 같이, 표준 CAR-T 치료법보다 낮은 용량이 본원에서 개시된 유전자 편집(예를 들어, TET2의 파괴)을 갖지 않는 통상적 CAR-T 세포와 실질적으로 유사한 치료 효과를 달성할 수 있다.
(d) 안전성 증가. 본원에서 개시된 유전적으로 조작된 T 세포의 성장은 사이토카인에 좌우되는 것으로 확인되었고, 이는 암화의 부재를 시사하였다. 또한, 더 낮은 용량이 충분할 수 있으므로, 본원에서 개시된 CAR-T 세포의 사용은 CART-T 치료법과 일반적으로 연관된 부작용, 예를 들어, 사이토카인 방출 증후군(CRS), 대식구 활성화 증후군(MAS), 종양 용해 증후군(TLS), 및/또는 신경독성 효과를 감소시킬 것으로 예상될 것이다.
(e) 본원에서 개시된 CAR-T 세포의 향상된 증식 및 증대, 향상된 세포독성, 및 생체내 연장된 지속성으로 초래되는 증가된 유효성. 또한, T 세포 은행은 상기 주지된 바와 같이 안전성 및 유효성을 최적화하기 위해 환자에서 적정 가능한 투약의 이점을 제공할 것이다.
(f) 시험관내 및 생체내 둘 모두에서, T 세포 은행에서의 T 세포의 감소된 고갈 및/또는 복제 노화 및 연장된 지속성으로 인해 연장된 치료 효과.
(g) 적합한 천연 원천, 예컨대 단일 류코팩으로부터 생성될 수 있는, 바이알에 넣은 완제 의약품, 예컨대 동종이계 CAR T 세포 제품의 수 증가.
따라서, 배양 중 개선된 지속성을 갖는 T 세포를 포함하는 T 세포 은행, 이러한 T 세포 은행을 생성하는 방법, 및 치료용 T 세포, 예컨대 CAR-T 세포를 생성하기 위해 이러한 T 세포 은행을 사용하는 방법이 본원에서 제공된다. 본원에서 개시된 T 세포 은행을 제조하기 위한 구성요소 및 공정(예를 들어, 유전자 편집을 위한 CRISPR/Cas-매개 접근법 및 여기서 사용되는 구성요소)이 또한 본 개시의 범위 내이다.
I. 향상된 지속성을 갖는 T 세포 은행
본원에서 개시된 T 세포 은행은 배양 중 향상된 지속성을 갖는 유전적으로 조작된 T 세포를 포함한다. 이러한 유전적으로 조작된 T 세포는 세포 자가-재생에 관여되는 하나 이상의 유전자, 아폽토시스에 관여되는 하나 이상의 유전자, 및/또는 T 세포 고갈에 관여되는 하나 이상의 유전자의 유전자 편집을 가질 수 있다. 본원에서 개시된 연구에 의해 나타낸 바와 같이, 이러한 유전적으로 조작된 T 세포는 편집되지 않은 T 대응물에 비해 하기 더 우수한 특징 중 하나 이상을 나타낸다: 배양 중 향상된 증대능(예를 들어, 편집되지 않은 대응물에 비해, 적어도 4주, 예를 들어, 적어도 6주 동안 배양 중 증대 가능하고; 및/또는 적어도 10배, 증대 가능하고, 예를 들어, 적어도 15배 증대 가능함), 향상된 증식능, 더 큰 T 세포 활성화, 및 감소된 아폽토시스 수준.
(i) T 세포 은행에서 유전적으로 조작된 T 세포
본원에서 개시된 T 세포 은행에서 유전적으로 조작된 T 세포는 배양 중 T 세포 지속성과 연관된 하나 이상의 유전자에 유전자 편집을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "T 세포 지속성"은 배양 중 T 세포가 계속 성장하고, 증식하고, 자가-재생하고, 증대되고, 건강한 활성을 유지하는 경향을 나타낸다. 일부 경우에, T 세포 지속성은 T 세포가 시험관내 성장하고 증대될 수 있는 수명에 의해 나타낼 수 있고, 이는 본원에서 기재된 통상적 방법 및/또는 검정에 의해 측정될 수 있다. 다른 경우에서, T 세포 지속성은 고갈 또는 복제 노화를 특징으로 하는 세포사(예를 들어, 아폽토시스)의 감소 또는 세포 상태의 감소에 의해 나타낼 수 있다. 또 다른 경우에서, T 세포 지속성은 배양 중 T 세포 활성화능의 유지에 의해 나타낼 수 있다.
유전적으로 조작된 T 세포의 T 세포 지속성은 다양한 경로, 예를 들어, 세포 자가-재생, 아폽토시스, 및/또는 세포 고갈의 조절을 통해 세포 지속성 조절에서 기능하는 하나 이상의 유전자의 유전자 편집에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 T 세포는 세포 지속성을 조절하는 여러 경로에 관여되는 여러 유전자의 유전자 편집을 포함할 수 있다. 이러한 유전적으로 조작된 T 세포는 배양 중 증가된 성장 수명을 가질 수 있다. 또한, 이러한 유전적으로 조작된 T 세포로부터 유래되는 CAR-T 세포는 또한 향상된 생체내 치료 유효성을 가질 수 있다.
유전적으로 조작된 T 세포는 적합한 원천, 예를 들어, 하나 이상의 포유류 공여자로부터 수득된 모 T 세포(예를 들어, 편집되지 않은 야생형 T 세포)로부터 유래될 수 있다. 일부 예에서, 모 T 세포는 하나 이상의 인간 공여자로부터 수득된 일차 T 세포(예를 들어, 암화되지 않고 말단 분화된 T 세포)이다. 대안적으로, 모 T 세포는 하나 이상의 적합한 공여자 또는 줄기 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포 또는 유도 가능한 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 수득된 전구체 T 세포로부터 분화될 수 있고, 이는 시험관내 배양될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 T 세포는 세포 자가-재생에 관여되는 하나 이상의 돌연변이된 유전자, 아폽토시스에 관여되는 하나 이상의 파괴된 유전자, 및/또는 세포 고갈에 관여되는 하나 이상의 파괴된 유전자를 포함한다. 이러한 T 세포는 뉴클레오타이드(들)/핵산(들)이 DNA 서열, 예컨대 표적화된 세포의 게놈에서 삽입, 결실, 및/또는 치환되는 일종의 유전자 조작인 유전자 편집(게놈 편집이 포함됨)을 통해 생성될 수 있다. 표적화된 유전자 편집은 표적화된 세포의 게놈에서(예를 들어, 표적화된 유전자 또는 표적화된 DNA 서열에서)의 사전-선택된 부위에서 삽입, 결실, 및/또는 치환을 가능하게 한다. 내인성 유전자의 서열이 예를 들어 뉴클레오타이드(들)/핵산(들)의 결실, 삽입, 또는 치환에 의해 편집될 때, 영향을 받는 서열을 포함하는 내인성 유전자는 서열 변경으로 인해 녹아웃되거나 녹다운될 수 있다. 따라서, 표적화된 편집은 내인성 유전자 발현을 파괴하는 데 사용될 수 있다. "표적화된 통합"은 삽입 부위에서의 내인성 서열의 결실을 포함하거나 포함하지 않고, 하나 이상의 외인성 서열의 삽입이 관여되는 공정을 나타낸다. 표적화된 통합은 외인성 서열을 함유하는 공여자 주형이 존재할 때 표적화된 유전자 편집으로부터 초래될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "돌연변이된 유전자"는 표적 유전자 내로 도입된 임의의 유형의 유전적 돌연변이를 포괄한다. 일부 경우에, "돌연변이된 유전자"에는 돌연변이된 유전자 산물(예를 들어, 절단된 유전자 산물)의 발현을 야기하는 유전적 돌연변이가 포함될 수 있다. 다른 경우에서, "돌연변이된 유전자"는 파괴된 유전자일 수 있고, 이는 유전자 산물의 발현을 실질적으로 또는 완전히 폐지하는 유전적 돌연변이를 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "파괴된 유전자"는 내인성 유전자로부터의 기능적 단백질의 발현이 감소되거나 억제되도록 내인성 유전자에 비해 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 유전자를 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, "유전자의 파괴"는 내인성 유전자로부터의 기능적 단백질의 발현이 감소되거나 억제되도록 내인성 유전자에서의 적어도 하나의 뉴클레오타이드/핵산을 삽입, 결실 또는 치환하는 방법을 나타낸다. 유전자를 파괴하는 방법은 당업자에 알려져 있고, 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 파괴된 유전자를 포함하는 세포는 유전자에 의해 인코딩된 (예를 들어, 인코딩된 단백질에 대한 항체 결합을 사용하는 면역 검정에서 또는 유세포 측정으로) 검출 가능한 수준의 단백질을 (예를 들어, 세포 표면에서) 발현하지 않는다. 검출 가능한 수준의 단백질을 발현하지 않는 세포는 녹아웃 세포로 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 T 세포 은행의 유전적으로 조작된 T 세포는 돌연변이된 TET2 유전자, 파괴된 FAS 유전자, 파괴된 CD70 유전자, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 추가적인 유전자(예를 들어, ß2M 및/또는 TRAC)의 유전자 편집이 또한 포함될 수 있다.
Tet 메틸시토신 디옥시게나제 2 유전자(TET2) 편집
자가-재생은 세포(예를 들어, T 세포)가 분열하고 동일한 세포 상태/정체성을 유지하는 공정이다. 세포 자가-재생에 관여되는 유전자는 세포 자가-재생을 긍정적으로 조절하거나 부정적으로 조절하는 것들을 나타낸다. 본원에서 개시된 유전적으로 조작된 T 세포는 인코딩된 단백질 산물의 그 발현 및/또는 생체활성을 향상시키기 위해 세포 자가-재생을 긍정적으로 조절하는 유전자의 유전자 편집을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 유전적으로 조작된 T 세포는 그 발현을 파괴하기 위해 세포 자가-재생을 부정적으로 조절하는 유전자의 유전자 편집을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 T 세포는 세포 자가-재생에 관여되는 돌연변이된 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 유전자는 TET2(10(Ten) 11(eleven) 전위-2) 메틸시토신 디옥시게나제일 수 있다. Tet2는 변형된 게놈 염기 메틸시토신의 5-하이드록시메틸시토신으로의 및 추가 중간체로의 전환을 촉매하여 시토신 탈메틸화를 야기하는 디옥시게나제이다. 이러한 효소는 골수형성에 관여되며, TET2에서의 결함은 몇몇 골수증식성 장애와 연관된 것으로 보고되었다. TET2 유전자의 구조는 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 인간 TET2 유전자는 염색체 4q24 상에 위치한다. 추가 정보는 유전자 ID: 54790 또는 NCBI 참조 서열: NM_001127208.2 하에 GenBank에서 확인될 수 있다.
일부 예에서, 유전적으로 조작된 T 세포는 T 세포에서 TET2의 발현이 실질적으로 감소되거나 완전히 제거되도록 파괴된 TET2 유전자를 포함할 수 있다. 파괴된 TET2 유전자는 TET2 유전자의 발현을 파괴하는 하나 이상의 적합한 표적 부위에서(예를 들어, 코딩 영역 또는 비-코딩 조절 영역, 예컨대 프로모터 영역에서) 하나 이상의 유전자 편집을 포함할 수 있다. 이러한 표적 부위는 유전적으로 조작된 T 세포의 제조에서 사용하기 위한 유전자 편집 접근법에 기반하여 식별될 수 있다. 유전자 편집을 위한 예시적 표적 부위에는 엑손 1, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 또는 이의 조합이 포함될 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 유전자 편집이 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 또는 엑손 6에서 일어날 수 있다. 이러한 유전자 편집은 적합한 가이드 RNA, 예를 들어, 표 3에 나열된 것들을 사용하여 CRISPR/Cas 기술에 의해 유도될 수 있다. 표 3에 나열된 gRNA를 사용하는 편집된 생성 TET2 유전자는 아래의 표 15 내지 21에 제공된 하나 이상의 편집된 서열을 포함할 수 있다.
다른 예에서, 유전적으로 조작된 T 세포는 절단된 버전의 TET2 단백질을 발현하는 돌연변이된 TET2 유전자를 포함할 수 있고, 이는 TET2의 기능-획득 변이체일 수 있다. 이러한 돌연변이된 TET2 유전자는 엑손 5에 유전자 편집을 가질 수 있고 약 170 kDa의 분자량을 갖는 절단된 TET2 변이체를 생성하며, 이는 통상적 방법, 예컨대 SDS-PAGE에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 부분적으로 그 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지, 즉, 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 당분야의 관례에 따라, 허용 가능한 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 ± 20%, 바람직하게는 최대 ± 10%, 보다 바람직하게는 최대 ± 5%, 더욱 바람직하게는 최대 ± 1% 범위를 의미할 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 값이 본 출원 및 청구범위에 기재되는 경우, 용어 "약"은 암시적이며 이러한 맥락에서 특정 값의 허용 가능한 오차 범위 내를 의미한다.
일부 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 은행은 유전적으로 조작된 T 세포를 포함할 수 있으며, 적어도 50%는 파괴된 TET2 유전자(예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상)를 포함한다. 일부 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 은행은 유전적으로 조작된 T 세포를 포함할 수 있으며, 적어도 50%는 돌연변이된 TET2 유전자(예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상)를 포함하고, 이는 상기 개시된 바와 같은 절단된 버전의 TET2를 발현할 수 있다.
FAS 유전자 편집
아폽토시스는 다세포성 유기체에서 일어나는 프로그래밍된 세포사 공정이다. 아폽토시스에 관여되는 유전자는 이러한 생물학적 공정을 긍정적으로 조절하거나 부정적으로 조절하는 것들을 나타낸다. 본원에서 개시된 유전적으로 조작된 T 세포는 그 발현을 파괴하기 위해 세포 아폽토시스를 긍정적으로 조절하는 유전자의 유전자 편집을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 유전적으로 조작된 T 세포는 유전자 산물의 그 발현 및/또는 생물학적 활성을 향상시키기 위해 세포 아폽토시스를 부정적으로 조절하는 유전자의 유전자 편집을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 T 세포는 세포 아폽토시스, 예를 들어, 아폽토시스를 긍정적으로 조절하는 유전자의 파괴에 관여되는 편집된 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 유전자는 FAS 수용체, CD95, 또는 아폽토시스 항원 1(APO-1)로도 알려진 FAS 유전자일 수 있다. FAS 유전자는 FAS 리간드에 의해 유발된 경우 아폽토시스를 야기하는 세포 표면 상의 사멸 수용체를 인코딩한다. FASL-FAS 유도 아폽토시스는 세포에서의 여러 아폽토시스 경로 중 하나이다(또 다른 주요 경로는 미토콘드리아 경로임). FAS 유전자의 구조는 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 인간 FAS 유전자는 염색체 10q24.1 상에 위치한다. 추가 정보는 유전자 ID: 355 하에 GenBank에서 확인될 수 있다.
일부 예에서, 유전적으로 조작된 T 세포는 T 세포에서 FAS의 발현이 실질적으로 감소되거나 완전히 제거되도록 파괴된 FAS 유전자를 포함할 수 있다. 파괴된 FAS 유전자는 FAS 유전자의 발현을 파괴하는 하나 이상의 적합한 표적 부위에서(예를 들어, 코딩 영역 또는 비-코딩 조절 영역, 예컨대 프로모터 영역에서) 하나 이상의 유전자 편집을 포함할 수 있다. 이러한 표적 부위는 유전적으로 조작된 T 세포의 제조에서 사용하기 위한 유전자 편집 접근법에 기반하여 식별될 수 있다. 유전자 편집을 위한 예시적 표적 부위에는 엑손 2, 엑손 3, 또는 이의 조합이 포함될 수 있다.
일부 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 은행은 유전적으로 조작된 T 세포를 포함할 수 있고, 적어도 50%는 파괴된 FAS 유전자를 포함한다(예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상).
CD70 유전자 편집
T 세포 고갈은 T 세포 기능의 단계적이고 진행성인 손실 공정이며, 이는 연장된 항원 자극 또는 다른 요인에 의해 유도될 수 있다. T 세포 고갈에 관여되는 유전자는 이러한 생물학적 공정을 긍정적으로 조절하거나 부정적으로 조절하는 것들을 나타낸다. 본원에서 개시된 유전적으로 조작된 T 세포는 그 발현을 파괴하기 위해 T 세포 고갈을 긍정적으로 조절하는 유전자의 유전자 편집을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 유전적으로 조작된 T 세포는 유전자 산물의 그 발현 및/또는 생물학적 활성을 향상시키기 위해 T 세포 고갈을 부정적으로 조절하는 유전자의 유전자 편집을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 T 세포는 T 세포 고갈, 예를 들어, T 세포 고갈을 긍정적으로 조절하는 유전자의 파괴에 관여되는 편집된 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 유전자는 분화 클러스터 70(CD70) 유전자일 수 있다. CD70은 종양 괴사 인자 수퍼패밀리의 구성원이며, 그 발현은 활성화된 T 및 B 림프구와 성숙 수지상 세포로 제한된다. CD70은 그 리간드인 CD27과의 상호작용을 통해 종양 세포 및 조절 T 세포 생존에 연루된다. CD70 및 그 수용체 CD27은 T 세포(활성화된 및 Treg 세포) 및 B 세포를 포함하는 다수의 세포 유형에서의 면역 기능에서 여러 역할을 갖는다.
항원 표적화 모이어티를 발현하도록 조작된 면역 세포에서의 CD70 유전자의 파괴가 큰 종양에 대한 항종양 유효성을 향상시키고, 지속적인 항암 기억 반응을 유도한다는 것이 또한 확인되었다. 구체적으로는, 항암 기억 반응은 재-시험감염 시 종양 성장을 방지하였다. 추가로, CD70 유전자의 파괴가 더 낮은 비율의 조작된 면역 세포 대 표적 세포에서 항원 표적화 모이어티를 발현하도록 조작된 면역 세포의 세포독성을 향상시킨다는 것이 실증되었고, 이는 낮은 용량의 조작된 면역 세포의 잠재적 유효성을 시사한다. 예를 들어, 그 관련 개시가 본원에서 언급된 목적 및 요지를 위해 참조로 포함되는 WO2019/215500을 참고한다.
CD70 유전자의 구조는 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 인간 CD70 유전자는 염색체 19p13.3 상에 위치한다. 이 유전자는 엑손을 인코딩하는 4개의 단백질을 함유한다. 추가 정보는 유전자 ID: 970 하에 GenBank에서 확인될 수 있다.
일부 예에서, 유전적으로 조작된 T 세포는 T 세포에서 CD70의 발현이 실질적으로 감소되거나 완전히 제거되도록 파괴된 CD70 유전자를 포함할 수 있다. 파괴된 CD70 유전자는 CD70 유전자의 발현을 파괴하는 하나 이상의 적합한 표적 부위에(예를 들어, 코딩 영역 또는 비-코딩 조절 영역, 예컨대 프로모터 영역에서) 하나 이상의 유전자 편집을 포함할 수 있다. 이러한 표적 부위는 유전적으로 조작된 T 세포의 제조에서 사용하기 위한 유전자 편집 접근법에 기반하여 식별될 수 있다. 유전자 편집을 위한 예시적 표적 부위에는 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 또는 이의 조합이 포함될 수 있다. 또한, 그 관련 개시가 본원에서 언급된 목적 및 요지를 위해 참조로 포함되는 WO2019/215500을 참고한다.
일부 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 은행은 유전적으로 조작된 T 세포를 포함할 수 있으며, 그 적어도 50%는 파괴된 CD70 유전자(예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상)를 포함한다.
ß2M 유전자 편집
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포는 파괴된 ß2M 유전자를 추가로 포함할 수 있다. ß2M은 MHC I 복합체의 공통(불변) 구성요소이다. 유전자 편집에 의한 그 발현의 파괴는 치료용 동종이계 T 세포 대 숙주 반응을 방지하여 동종이계 T 세포 지속성을 증가시킬 것이다. 일부 구현예에서, 내인성 ß2M 유전자의 발현은 이식편 대 숙주 반응을 방지하기 위해 제거된다.
일부 구현예에서, T 세포 은행에서 유전적으로 조작된 T 세포의 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상)은 검출 가능한 수준의 ß2M 표면 단백질을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 편집된 ß2M 유전자는 표 1에서의 하기 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 편집된 ß2M 유전자와 같은 편집된 유전자에서의 상이한 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표 1에서의 것들)이 단일 gRNA에 의해 생성될 수 있음이 당업자에게 알려져 있다. 또한, 그 관련 개시가 본원에서 언급된 요지 및 목적을 위해 참조로 포함되는 WO2019097305를 참고한다.
[표 1]
ß2M을 표적화하는 예시적 gRNA의 서열
Figure pct00001
본원에서 개시된 T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포는 T 세포 기능을 개선하기 위해 하나 이상의 추가적인 유전자 편집(예를 들어, 유전자 녹인 또는 녹아웃)을 추가로 포함할 수 있다. 예에는 표적 세포 용해를 개선하기 위한 녹인 또는 녹아웃 유전자, 치료용 T 세포, 예컨대 T 세포 은행의 세포로부터 제조된 CAR-T 세포의 성능을 향상시키기 위한 녹인 또는 녹아웃 유전자가 포함된다. 예에는 면역 체크포인트 유전자, 예컨대 PD-1의 녹아웃이 포함된다.
TRAC 유전자 편집
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포는 파괴된 TRAC 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 파괴는 TCR의 기능 손실을 야기하고, 조작된 T 세포를 비동종반응성으로 만들고 동종이계 이식에 적합하게 하여, 이식편 대 숙주 질환의 위험을 최소화한다. 일부 구현예에서, 내인성 TRAC 유전자의 발현은 이식편 대 숙주 반응을 방지하기 위해 제거된다. 또한, 그 관련 개시가 본원에서 언급된 목적 및 요지를 위해 본원에 참조로 포함되는 WO2019097305를 참고한다.
하나를 초과하는 적합한 표적 부위/gRNA가 본원에서 개시된 각각의 표적 유전자, 예를 들어, 당분야에 알려지거나 본원에서 개시된 것들에 대해 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 추가적인 예는, 예를 들어, 그 관련 개시가 본원에서 언급된 목적 및 요지를 위해 본원에 참조로 포함되는 WO2019097305에서 확인될 수 있다.
T 세포 은행에서의 예시적인 유전적으로 조작된 T 세포
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 T 세포 은행은 파괴된 TET2 유전자를 포함하는 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 포함한다. 이러한 유전적으로 조작된 T 세포는 파괴된 FAS 유전자, 파괴된 CD70 유전자, 또는 둘 모두를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시된 T 세포 은행은 돌연변이된 TET2 유전자, 파괴된 FAS 유전자, 및 파괴된 CD70 유전자로부터 선택되는 유전적으로 편집된 유전자 중 적어도 2개의 조합을 포함하는 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 유전적으로 조작된 T 세포는 임의로 파괴된 ß2M 유전자, 파괴된 TRAC 유전자, 또는 둘 모두를 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에서 개시된 T 세포 은행은 본원에서 개시된 바와 같은 파괴된 TET2 유전자를 포함하는 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 포함한다. 일부 경우에, T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)는 통상적 검정에 의해 측정된 바와 같은 검출 가능한 수준으로 표면 TET2를 발현하지 않는다.
일부 예에서, 본원에서 개시된 T 세포 은행은 파괴된 TET2 유전자 및 파괴된 FAS 유전자를 포함하는 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 포함한다. 일부 경우에, T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)는 파괴된 TET2 유전자 및 파괴된 FAS 유전자를 포함한다.
일부 예에서, 본원에서 개시된 T 세포 은행은 파괴된 TET2 유전자 및 파괴된 CD70 유전자를 포함하는 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 포함한다. 일부 경우에, T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)는 돌연변이되거나 파괴된 TET2 유전자 및 파괴된 CD70 유전자를 포함한다.
특정 예에서, 본원에서 개시된 T 세포 은행은 파괴된 TET2 유전자, 파괴된 FAS 유전자, 및 파괴된 CD70 유전자를 포함하는 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 포함한다. 일부 경우에, T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)는 돌연변이되거나 파괴된 TET2 유전자, 파괴된 FAS 유전자, 및 파괴된 CD70 유전자를 포함한다.
일부 예에서, 본원에서 개시된 T 세포 은행은 본원에서 개시된 바와 같은 임의의 절단된 TET2 폴리펩타이드를 발현하는 돌연변이된 TET2 유전자 및 파괴된 FAS 유전자를 포함하는 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 포함한다. 일부 경우에, T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)는 돌연변이된 TET2 유전자 및 파괴된 FAS 유전자를 포함한다.
일부 예에서, 본원에서 개시된 T 세포 은행은 본원에서 개시된 바와 같은 절단된 TET2 폴리펩타이드를 발현하는 돌연변이된 TET2 유전자 및 파괴된 CD70 유전자를 포함하는 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 포함한다. 일부 경우에, T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)는 돌연변이된 TET2 유전자 및 파괴된 CD70 유전자를 포함한다.
특정 예에서, 본원에서 개시된 T 세포 은행은 파괴된 TET2 유전자, 파괴된 FAS 유전자, 및 파괴된 CD70 유전자를 포함하는 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 포함한다. 일부 경우에, T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)는 파괴된 TET2 유전자, 파괴된 FAS 유전자, 및 파괴된 CD70 유전자를 포함한다.
특정 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 은행은 본원에서 개시된 바와 같은 임의의 절단된 TET2 폴리펩타이드를 발현하는 돌연변이된 TET2 유전자, 파괴된 FAS 유전자, 및 파괴된 CD70 유전자를 포함하는 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 포함한다. 일부 경우에, T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)는 돌연변이된 TET2 유전자, 파괴된 FAS 유전자, 및 파괴된 CD70 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이된 TET2 유전자(예를 들어, 본원에서 개시된 바와 같은 절단된 버전의 TET2를 발현하도록 파괴되거나 돌연변이됨), 파괴된 FAS 유전자, 및 파괴된 CD70 중 하나 이상을 포함할 수 있는, T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포는 4주 초과, 예를 들어, 5주 초과, 6주 초과, 8주 초과, 및 10주 초과 동안 배양에서 증대 가능할 수 있다. 일부 예에서, T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포는 본원에서 개시된 바와 같은 절단된 TET2 폴리펩타이드를 발현하는 돌연변이된 TET2 유전자(임의로 FAS 및/또는 CD70의 파괴)를 포함하며 배양에서 6주 후(예를 들어, 7주 후, 8주 후, 9주 후, 또는 10주 후) 증대 가능하다. 이러한 유전적으로 조작된 T 세포는 배양에서 6주 후(예를 들어, 7주 후, 8주 후, 9주 후, 또는 10주 후) 활성화될 능력을 유지할 수 있다. 또한, 이러한 유전적으로 조작된 T 세포는 증가된 증대능을 가지며, 이는 조작되지 않은 대응물보다 적어도 10배(예를 들어, 적어도 15배) 더 높을 수 있다. 조작되지 않은 대응물은 본원에서 개시된 바와 같은 세포 자가-재생(예를 들어, TET2), 아폽토시스(예를 들어, FAS), 및/또는 T 세포 고갈(예를 들어, CD70)에 관여되는 유전자, 즉 야생형 대비 파괴된/돌연변이된 유전자를 제외하고, 동일한 유전적 배경을 갖는 T 세포를 나타낸다.
일부 구현예에서, T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포는 파괴된 FAS 유전자(임의로 돌연변이된 TET2 유전자, 예를 들어, 본원에서 개시된 바와 같이 파괴되거나 절단된 TET2 폴리펩타이드 발현 및/또는 파괴된 CD70 유전자)를 포함할 수 있고 조작되지 않은 대응물에 비해 감소된 아폽토시스 경향을 가질 수 있다. 예를 들어, 배양 중 유전적으로 조작된 T 세포의 FAS/FAS 리간드-유도 아폽토시스 수준은 조작되지 않은 대응물에서 FAS/FAS 리간드 유도 아폽토시스의 50% 미만(예를 들어, 40% 미만, 30% 미만, 20% 이하 미만)일 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포를 사용하여 생성된 CAR-T 세포는 파괴된 CD70 유전자(임의로 돌연변이된 TET2 유전자, 예를 들어, 본원에서 개시된 바와 같이 파괴되거나 절단된 TET2 폴리펩타이드 발현 및/또는 파괴된 FAS 유전자)를 포함하고 조작되지 않은 대응물에 비해 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 개선된 효능(예를 들어, 적어도 50% 더 높은, 적어도 1배 더 높은, 적어도 2배 더 높은, 적어도 5배 더 높은, 또는 적어도 10배 더 높은)을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 은행에서의 T 세포는 아래에서 상세히 기재된 바와 같은, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하기 위해 추가로 조작될 수 있다.
(ii) T 세포 은행을 제조하는 방법
본원에서 개시된 T 세포 은행의 유전적으로 조작된 T 세포는 통상적 유전자 편집 방법 또는 본원에서 기재된 것들을 통해 모 T 세포 또는 이의 전구체 세포의 유전자 편집에 의해 제조될 수 있다.
(a) T 세포
일부 구현예에서, T 세포 은행을 제조하는 데 사용하기 위한 T 세포는 하나 이상의 적합한 포유류, 예를 들어, 하나 이상의 인간 공여자로부터 유래될 수 있다. T 세포는 말초혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 가슴샘 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출물, 비장 조직, 및 종양이 포함되지만, 이에 제한되지 않는 다양한 원천으로부터 수득될 수 있다. 특정 구현예에서, T 세포는 침강, 예를 들어 FICOLL™ 분리와 같이 당업자에게 알려진 여러 기법을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득할 수 있다.
일부 예에서, T 세포는 단리된 T 세포 집단을 생성하기 위해 면역 세포의 혼합물(예를 들어, 본원에서 기재된 것들)로부터 단리될 수 있고, 이는 본원에서 개시된 T 세포 은행을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 말초혈 단핵 세포(PBMC)의 단리 후, 세포독성 T 림프구 및 헬퍼 T 림프구 둘 모두는 활성화, 증대, 및/또는 유전자 변형 전에 또는 후에 나이브 T 세포, 기억 T 세포, 및 효과기 T 세포의 하위집단으로 분류될 수 있다.
하기 세포 표면 마커 중 하나 이상을 발현하는 T 세포의 특정 하위집단: TCRab, CD3, CD4, CD8, CD27 CD28, CD38 CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD122, CD95, CD197, CCR7, KLRG1, MCH-I 단백질 및/또는 MCH-II 단백질은 양성 또는 음성 선별 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, TCRab, CD4, 및/또는 CD8로 구성되는 군으로부터 선택되는 마커 중 하나 이상을 발현하는 T 세포의 특정 하위집단이 양성 또는 음성 선별 기법에 의해 추가로 단리된다. 일부 구현예에서, T 세포의 하위집단은 유전자 조작 전에 및/또는 유전자 조작 후에 양성 또는 음성 선별에 의해 단리될 수 있다.
T 세포 은행을 제조하는 데 사용하기 위한 단리된 T 세포 집단은 CD3+, CD4+, CD8+, 또는 이의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는 T 세포 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 공여자, 또는 대상체로부터 단리되고, 유전자 편집을 겪기 전에 시험관내 증식하도록 처음 활성화되고 자극된다.
일부 경우에, T 세포 은행을 제조하는 데 사용하기 위한 T 세포 집단은 하나 이상의 인간 공여자로부터 단리된 일차 T 세포를 포함한다. 이러한 T 세포는 말단 분화되고, 암화되지 않으며, 성장을 위해 사이토카인 및/또는 성장 인자에 좌우되고, 및/또는 안정한 게놈을 갖는다.
대안적으로, T 세포 은행을 제조하는 데 사용하기 위한 T 세포는 시험관내 분화를 통해 줄기 세포(예를 들어, HSC 또는 iPSC)로부터 유래될 수 있다.
T 세포 은행을 제조하기 위한 충분한 양의 T 세포를 획득하기 위해, 적합한 원천으로부터의 T 세포는 1회 이상의 자극, 활성화, 및/또는 증대를 거칠 수 있다. 일반적으로, T 세포는 예를 들어 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 및 제6,867,041호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 증대될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 게놈 편집 조성물을 T 세포 내로 도입하기 전에 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 3일, 약 2일 내지 약 4일, 약 3일 내지 약 4일, 또는 약 1일, 약 2일, 약 3일, 또는 약 4일 동안 활성화되고 증대될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포는 유전자 편집 조성물을 T 세포 내로 도입하기 전에 약 4시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간, 또는 약 72시간 동안 활성화되고 증대된다. 일부 구현예에서, T 세포는 게놈 편집 조성물이 T 세포 내로 도입되는 것과 동시에 활성화된다. 일부 경우에, T 세포 집단은 본원에서 개시된 바와 같은 유전자 편집 후 증대되고/되거나 활성화될 수 있다. 본원에서 기재된 임의의 유전자 편집 방법에 의해 생성된 T 세포 집단 또는 단리된 T 세포는 또한 본 개시의 범위 내에 있다.
(b) 유전자 편집 방법
임의의 유전적으로 조작된 T 세포는 본원에서 개시된 표적 유전자 중 하나 이상을 편집하기 위해(표적화된 편집) 통상적인 유전자 편집 방법 또는 본원에서 기재된 것들을 사용하여 제조될 수 있다. 표적화된 편집은 뉴클레아제 독립적 접근법을 통해 또는 뉴클레아제 의존적 접근법을 통해 달성될 수 있다. 뉴클레아제 독립적인 표적화된 편집 접근법에서, 상동성 재조합은 숙주 세포의 효소 기구를 통해 내인성 서열 내로 도입될 외인성 폴리뉴클레오타이드의 측면에 있는 상동성 서열에 의해 가이드된다. 외인성 폴리뉴클레오타이드는 내인성 서열에 뉴클레오타이드의 결실, 삽입, 또는 대체를 도입할 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제 의존적 접근법은 특정 희귀-절단 뉴클레아제(예를 들어, 엔도뉴클레아제)에 의한 이중가닥 절단(DSB)의 특이적 도입을 통해 더 높은 빈도로 표적화된 편집을 달성할 수 있다. 이러한 뉴클레아제 의존적인 표적화된 편집은 또한 DNA 복구 기전, 예를 들어, DSB에 반응하여 일어나는 비상동성 말단 연결(NHEJ)을 이용한다. NHEJ에 의한 DNA 복구는 대개 소수의 내인성 뉴클레오타이드의 무작위 삽입 또는 결실(삽입결실)을 야기한다. NHEJ 매개 복구와 달리, 복구는 상동성 유도 복구(HDR)에 의해 일어날 수도 있다. 한 쌍의 상동성 아암이 측면에 있는 외인성 유전 물질을 함유하는 공여자 주형이 존재하는 경우, 외인성 유전 물질은 HDR에 의해 게놈 내로 도입될 수 있으며, 이로 인해 외인성 유전 물질의 표적화된 통합이 초래된다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 2개의 가이드 RNA를 사용하여 게놈 서열의 결실에 의해 발생할 수 있다. 세포에서 게놈 결실을 생성하기 위해 CRISPR-Cas 유전자 편집 기술을 사용하는(예를 들어, 세포에서 유전자를 녹아웃하는) 방법은 알려져 있다(Bauer DE et al. Vis. Exp. 2015; 95;e52118).
특이적이고 표적화된 DSB를 도입할 수 있는 이용 가능한 엔도뉴클레아제에는 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 RNA-가이드 뉴클레아제, 예컨대 CRISPR-Cas(예를 들어, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 관련 단백질 9 또는 CRISPR/Cas9)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, phiC31 및 Bxb1 인테그라제를 이용하는 DICE(이중 인테그라제 카세트 교환) 시스템이 표적화된 통합에 사용될 수도 있다. 일부 예시적 접근법이 아래에 상세히 개시된다.
CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템
CRISPR-Cas9 시스템은 유전자 편집에 사용되는 RNA-가이드 DNA-표적화 플랫폼으로 용도가 변경된, 원핵생물의 자연 발생 방어 기전이다. 이것은 DNA의 절단을 표적화하기 위해 DNA 뉴클레아제 Cas9, 및 crisprRNA(crRNA) 및 전사-활성화 RNA(tracrRNA)의 2개의 비코딩 RNA에 의존한다. CRISPR은, 예를 들어, 원핵생물을 감염시키거나 공격한 바이러스에 의해 세포에 이전에 노출된 외래 DNA와 유사성을 갖는 DNA의 단편(스페이서 DNA)을 함유하는 박테리아 및 고세균의 게놈에서 발견된 DNA 서열의 패밀리인 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부의 약어이다. 이 DNA 단편은 후속하는 공격 동안, 예를 들어 유사한 바이러스로부터의 재도입시 유사한 외래 DNA를 검출하고 파괴하도록 원핵생물에 의해 사용된다. CRISPR 유전좌위의 전사는 외래 외인성 DNA를 인식하고 절단할 수 있는 Cas(CRISPR 연관) 단백질과 회합하고 이를 표적화하는, 스페이서 서열을 포함하는 RNA 분자를 형성시킨다. CRISPR/Cas 시스템의 많은 유형 및 클래스가 기재되어 있다(예를 들어, Koonin et al., (2017) Curr Opin Microbiol 37:67-78 참고).
crRNA는 표적 DNA에서 전형적으로 20개 뉴클레오타이드(nt)의 서열과의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성을 통해 CRISPR-Cas9 복합체의 서열 인식 및 특이성을 유도한다. crRNA에서 5' 20 nt의 서열을 변경하면 CRISPR-Cas9 복합체를 특정 유전좌위로 표적화할 수 있다. 표적 서열 뒤에 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)로 언급되는 특정 짧은 DNA 모티프(서열 NGG 포함)가 있는 경우, CRISPR-Cas9 복합체는 crRNA의 처음 20 nt와 매치하는 서열을 함유하는 DNA 서열에만 결합한다.
TracrRNA는 crRNA의 3' 말단과 혼성화하여, Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 결합된 RNA-듀플렉스 구조를 형성하여 촉매 활성 CRISPR-Cas9 복합체를 형성한 다음, 표적 DNA를 절단할 수 있다.
CRISPR-Cas9 복합체가 표적 부위에서 DNA에 결합되면, Cas9 효소 내의 2개의 독립적인 뉴클레아제 도메인은 각각 PAM 부위의 상류에서 DNA 가닥 중 하나를 절단하여, DNA의 두 가닥 모두가 염기쌍으로 종결되는(무딘 말단) 이중가닥 절단(DSB)을 남긴다.
CRISPR-Cas9 복합체가 특정 표적 부위에서 DNA에 결합하고 부위 특이적 DSB를 형성한 후, 다음의 핵심 단계는 DSB의 복구이다. 세포는 비상동성 말단 연결(NHEJ) 및 상동성 유도 복구(HDR)의 두 가지 주요 DNA 복구 경로를 사용하여 DSB를 복구한다.
NHEJ는 비분열 세포를 비롯한 대부분의 세포 유형에서 매우 활성이 높은 것으로 나타나는 강력한 복구 기전이다. NHEJ는 오류가 발생하기 쉽고 DSB의 부위에서 1개 내지 수백 개 뉴클레오타이드를 제거하거나 부가할 수 있지만, 이러한 변형은 전형적으로 20 nt 미만이다. 생성된 삽입 및 결실(삽입결실)은 유전자의 코딩 영역 또는 비코딩 영역을 파괴할 수 있다. 대안적으로, HDR은 높은 정확도로 DSB를 복구하기 위해, 내인성으로 또는 외인성으로 제공되는 긴 길이의 상동성 공여자 DNA를 사용한다. HDR은 분열 세포에서만 활성이며, 대부분의 세포 유형에서 비교적 낮은 빈도로 발생한다. 본 발명의 많은 구현예에서, NHEJ는 복구 작동자로서 이용된다.
CRISPR에서 사용하기 위한 엔도뉴클레아제
일부 구현예에서, Cas9(CRISPR 연관 단백질 9) 엔도뉴클레아제는 본원에서 개시된 바와 같은 유전적으로 조작된 T 세포를 제조하기 위해 CRISPR 방법에서 사용된다. Cas9 효소는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된 것일 수 있지만, 다른 Cas9 동족체가 사용될 수도 있다. 본원에서 제공된 바와 같이, 야생형 Cas9가 사용되거나 Cas9의 변형된 버전(예를 들어, Cas9의 진화된 버전, 또는 Cas9 오솔로그 또는 변이체)이 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, Cas9는 다른 RNA-가이드 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cpf1(클래스 II CRISPR/Cas 시스템의 것)로 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 I형, II형 또는 III형 시스템으로부터 유래된 성분을 포함한다. CRISPR/Cas 유전좌위에 대한 업데이트된 분류 체계는 I형 내지 V형 또는 VI형을 갖는 클래스 1 및 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템을 정의한다(Makarova et al., (2015) Nat Rev Microbiol, 13(11):722-36; Shmakov et al., (2015) Mol Cell, 60:385-397). 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템은 단일 단백질 효과기를 갖는다. II형, V형 및 VI형의 Cas 단백질은 본원에서 "클래스 2 Cas 뉴클레아제"라 불리는 단일-단백질, RNA-가이드 엔도뉴클레아제이다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제에는 예를 들어 Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2 및 C2c3 단백질이 포함된다. Cpf1 뉴클레아제(Zetsche et al., (2015) Cell 163:1-13)는 Cas9에 상동성이고, RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 II형 CRISPR/Cas 시스템 유래이다(예를 들어, CRISPR/Cas9 시스템으로부터의 Cas9 단백질). 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템 유래이다(단일-단백질 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질). Cas9 및 Cpf1 패밀리 단백질은 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소이고, 이들은 본원에서 추가로 기재된 것처럼 적절한 가이드 RNA를 설계함으로써 요망되는 핵산 표적을 절단하도록 유도될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 하나 초과의 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, Cas9 뉴클레아제는 적어도 하나의 RuvC 유사 뉴클레아제 도메인(예를 들어, Cpf1) 및 적어도 하나의 HNH 유사 뉴클레아제 도메인(예를 들어, Cas9)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 표적 서열에 DSB를 도입한다. 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인만을 함유하도록 변형된다. 예를 들어, Cas9 뉴클레아제는 뉴클레아제 도메인 중 하나가 그 핵산 절단 활성을 감소시키도록 돌연변이되거나 전체적으로 또는 부분적으로 결실되도록 변형된다. 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 기능적 RuvC 유사 뉴클레아제 도메인을 함유하지 않도록 변형된다. 다른 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 기능적 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하지 않도록 변형된다. 뉴클레아제 도메인 중 하나만 기능적인 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 표적 서열 내로 단일-가닥 절단("닉")을 도입할 수 있는 니카아제이다. 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제 뉴클레아제 도메인 내의 보존된 아미노산은 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 변경하도록 치환된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제 니카아제는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에 아미노산 치환을 포함한다. RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에서의 예시적 아미노산 치환에는 (에스. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제에 기반한) D10A가 포함된다. 일부 구현예에서, 니카아제는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에 아미노산 치환을 포함한다. HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서의 예시적 아미노산 치환에는(에스. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제에 기반한) E762A, H840A, N863A, H983A 및 D986A가 포함된다.
일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 I형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 I형 CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 구성요소이다. 예를 들어, Cas 뉴클레아제는 Cas3 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 III형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 IV형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 V형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 VI형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다.
가이드 RNA(gRNA)
CRISPR 기술은 특정 표적 서열에서 유전자 편집을 위해 표적 유전자 내의 특정 표적 서열로 엔도뉴클레아제를 유도할 수 있는 게놈-표적화 핵산의 사용이 관여된다. 게놈-표적화 핵산은 RNA일 수 있다. 게놈-표적화 RNA는 본원에서 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"로 나타낸다. 가이드, RNA는 적어도 편집을 위해 표적 유전자 내의 표적 핵산 서열에 혼성화하는 스페이서 서열 및 CRISPR 반복 서열을 포함한다.
II형 시스템에서, gRNA는 tracrRNA 서열이라고 하는 제2 RNA를 또한 포함한다. II형 gRNA에서, CRISPR 반복 서열 및 tracrRNA 서열은 서로 혼성화하여 듀플렉스를 형성한다. V형 gRNA에서, crRNA는 듀플렉스를 형성한다. 두 시스템 모두에서, 듀플렉스는 부위 지정 폴리펩타이드에 결합하여, 가이드 RNA 및 부위 지정 폴리펩타이드가 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, 게놈-표적화 핵산은 부위 지정 폴리펩타이드와의 그 회합에 의해 복합체에 표적 특이성을 제공한다. 따라서 게놈-표적화 핵산은 부위 지정 폴리펩타이드의 활성을 유도한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 각각의 가이드 RNA는 그 게놈 표적 서열과 상보적인 스페이서 서열을 포함하도록 설계된다. 문헌[Jinek et al., Science, 337, 816-821 (2012) 및 Deltcheva et al., Nature, 471, 602-607 (2011)]을 참고한다.
일부 구현예에서, 게놈-표적화 핵산(예를 들어, gRNA)은 이중-분자 가이드 RNA이다. 일부 구현예에서, 게놈-표적화 핵산(예를 들어, gRNA)은 단일-분자 가이드 RNA이다.
이중-분자 가이드 RNA는 두 가닥의 RNA 분자를 포함한다. 첫 번째 가닥은 5'에서 3' 방향으로, 임의의 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열, 및 최소 CRISPR 반복 서열을 포함한다. 두 번째 가닥은 최소 tracrRNA 서열(최소 CRISPR 반복 서열에 상보적임), 3' tracrRNA 서열, 및 임의의 tracrRNA 연장 서열을 포함한다.
II형 시스템에서의 단일-분자 가이드 RNA("sgRNA"로 언급됨)는 5'에서 3' 방향으로 임의의 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열, 최소 CRISPR 반복 서열, 단일-분자 가이드 링커, 최소 tracrRNA 서열, 3' tracrRNA 서열 및 임의의 tracrRNA 연장 서열을 포함한다. 임의의 tracrRNA 연장은 가이드 RNA에 대한 추가 기능(예를 들어, 안정성)에 기여하는 요소를 포함할 수 있다. 단일-분자 가이드 링커는 최소 CRISPR 반복 및 최소 tracrRNA 서열을 연결하여 헤어핀 구조를 형성한다. 임의의 tracrRNA 연장은 하나 이상의 헤어핀을 포함한다. V형 시스템에서의 단일-분자 가이드 RNA는 5'에서 3' 방향으로 최소 CRISPR 반복 서열 및 스페이서 서열을 포함한다.
gRNA에서의 스페이서 서열은 관심 표적 유전자의 표적 서열(예를 들어, DNA 표적 서열, 예컨대 게놈 표적 서열)을 정의하는 서열(예를 들어, 20개 뉴클레오타이드 서열)이다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 15개 내지 30개의 뉴클레오타이드 범위이다. 예를 들어, 스페이서 서열은 15, 16, 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 함유한다.
"표적 서열"은 PAM 서열에 인접한 표적 유전자 내에 있으며, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)에 의해 변형될 서열이다. "표적 서열"은 PAM-가닥 및 상보적 비-PAM 가닥을 함유하는 이중-가닥 분자인 "표적 핵산"에서 소위 PAM-가닥 상에 있다. 당업자는 gRNA 스페이서 서열이 관심 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 위치한 상보적 서열에 혼성화한다는 것을 인식한다. 따라서, gRNA 스페이서 서열은 표적 서열의 RNA 등가물이다. 예를 들어, 표적 서열이 5'-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3'(SEQ ID NO: 7)이면, gRNA 스페이서 서열은 5'-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3'(SEQ ID NO: 8)이다. gRNA의 스페이서는 혼성화(즉, 염기쌍 형성)를 통해 서열 특이적 방식으로 관심 표적 핵산과 상호작용한다. 따라서, 스페이서의 뉴클레오타이드 서열은 관심 표적 핵산의 표적 서열에 좌우된다.
본원의 CRISPR/Cas 시스템에서, 스페이서 서열은 시스템에 사용된 Cas9 효소에 대해 인식 가능한 PAM의 5'에 위치한 표적 핵산 영역에 혼성화하도록 설계된다. 스페이서는 표적 서열과 완벽하게 매치되거나 미스매치를 가질 수 있다. 각각의 Cas9 효소는 이것이 표적 DNA에서 인식하는 특정 PAM 서열을 갖는다. 예를 들어, 에스. 피오게네스는 표적 핵산에서, 서열 5'-NRG-3'을 포함하는 PAM을 인식하며, 여기서 R은 A 또는 G를 포함하고, N은 임의의 뉴클레오타이드이고, N은 스페이서 서열에 의해 표적화된 표적 핵산 서열의 바로 3'에 있다.
일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 20개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 20개 미만의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 20개 초과의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 적어도 5개, 10개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 최대 5개, 10개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 PAM의 첫 번째 뉴클레오타이드의 바로 5'에 20개의 염기를 갖는다. 예를 들어, 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'을 포함하는 서열에서, 표적 핵산은 N에 대응하는 서열일 수 있으며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드일 수 있고, 밑줄 표시된 NRG 서열은 에스. 피오게네스 PAM이다.
본원에서 개시된 가이드 RNA는 crRNA에서 스페이서 서열을 통해 임의의 관심 서열을 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 스페이서 서열과 표적 유전자 내의 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 스페이서 서열 및 표적 유전자 내의 표적 서열은 100% 상보적이다. 다른 구현예에서, 가이드 RNA의 스페이서 서열 및 표적 유전자 내의 표적 서열은 최대 10개의 미스매치, 예를 들어, 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 미스매치를 함유할 수 있다.
본원에서 제공된 바와 같이 사용될 수 있는 gRNA의 비제한적인 예는 그 관련 개시가 본원에서 언급된 목적 및 요지를 위해 본원에 참조로 포함되는 WO2019097305에 제공된다. 본원에서 제공된 임의의 gRNA 서열의 경우, 변형을 명시적으로 표시하지 않은 것들은 비변형 서열 및 임의의 적합한 변형을 갖는 서열 둘 모두를 포괄하는 것을 의미한다.
본원에서 개시된 임의의 gRNA에서의 스페이서 서열의 길이는 CRISPR/Cas9 시스템 및 또한 본원에서 개시된 임의의 표적 유전자를 편집하기 위해 사용된 구성요소에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 상이한 박테리아 종으로부터의 상이한 Cas9 단백질은 다양한 최적 스페이서 서열 길이를 갖는다. 따라서, 스페이서 서열은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개 또는 50개 초과의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 18개 내지 24개의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 20개의 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA는 sgRNA일 수 있고, 이는 sgRNA 서열의 5' 말단에서 20개의 뉴클레오타이드 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에서 20개 미만의 뉴클레오타이드 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에서 20개 초과의 뉴클레오타이드 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에서 17개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖는 가변 길이의 스페이서 서열을 포함한다. 예는 아래에서 표 2에 제공된다. 이들 예시적 서열에서, "n"의 단편은 5' 말단에서의 스페이서 서열을 나타낸다.
[표 2]
예시적 sgRNA 식
Figure pct00002
일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에 우라실을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에 하나 이상의 우라실을 포함할 수 있다. 예를 들어, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에 1개 내지 8개의 우라실 잔기, 예를 들어, sgRNA 서열의 3' 말단에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 우라실 잔기를 포함할 수 있다.
임의의 sgRNA가 포함되는, 본원에서 개시된 임의의 gRNA는 변형되지 않을 수 있다. 대안적으로, 이는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드 및/또는 변형된 골격을 함유할 수 있다. 예를 들어, 변형된 gRNA, 예컨대 sgRNA는 하나 이상의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 이는 5' 말단, 3' 말단, 또는 둘 모두에 위치할 수 있다.
소정 구현예에서, 하나 초과의 가이드 RNA가 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템과 함께 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템이 하나를 초과하는 표적 핵산을 절단하도록 각각의 가이드 RNA는 상이한 표적화 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 동일한 또는 상이한 특성, 예컨대 Cas9 RNP 복합체 내의 활성 또는 안정성을 가질 수 있다. 하나를 초과하는 가이드 RNA가 사용되는 경우, 각각의 가이드 RNA는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에 인코딩될 수 있다. 하나를 초과하는 가이드 RNA의 발현을 유도하기 위해 사용된 프로모터는 동일하거나 상이하다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 gRNA는 TET2 유전자를 표적화하며, 예를 들어, TET2 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 또는 엑손 6 내의 부위를 표적화한다. 이러한 gRNA는 TET2 유전자, 또는 이의 단편의 엑손 3 또는 엑손 5에 표적 서열과 상보적인(전체적으로 또는 부분적으로) 스페이서 서열을 포함할 수 있다. TET2의 예시적 표적 서열 및 예시적 gRNA 서열은 아래에서 표 3에 제공된다:
[표 3]
예시적 TET2 gRNA 서열/표적 서열
Figure pct00003
Figure pct00004
*: 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 잔기
일부 구현예에서, TET2의 엑손 3에서의 부위를 표적화하는 gRNA(예를 들어, 상기 표 3에 나열된 것들)가 TET2 유전자의 편집을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, GATTCCGCTTGGTGAAAACG(SEQ ID NO: 129)의 부위를 표적화하는 gRNA, 예를 들어, SEQ ID NO: 112(비변형) 또는 SEQ ID NO: 113(변형)의 스페이서를 포함하는 gRNA가 사용될 수 있다. 이러한 gRNA는 SEQ ID NO: 114(비변형) 또는 SEQ ID NO: 115(변형)의 뉴클레오타이드 서열을 포함할(예를 들어, 이로 구성될) 수 있다. SEQ ID NO: 129의 부위를 표적화하는 gRNA에 의해 편집된 T 세포는 아래에서 표 15에 나열된 변형 중 적어도 하나를 갖는 변형된 TET2 유전자를 포함할 수 있다.
또 다른 특정 예에서, CAGGACTCACACGACTATTC(SEQ ID NO: 131)의 부위를 표적화하는 gRNA, 예를 들어 SEQ ID NO: 116(비변형) 또는 SEQ ID NO: 117(변형)의 스페이서를 포함하는 gRNA가 사용될 수 있다. 이러한 gRNA는 SEQ ID NO: 118(비변형) 또는 SEQ ID NO: 119(변형)의 뉴클레오타이드 서열을 포함할(예를 들어, 이로 구성될) 수 있다. SEQ ID NO: 131의 부위를 표적화하는 gRNA에 의해 편집된 T 세포는 아래에서 표 16에 나열된 변형 중 적어도 하나를 갖는 변형된 TET2 유전자를 포함할 수 있다.
또 다른 특정 예에서, TTCCGCTTGGTGAAAACGAG(SEQ ID NO: 133)의 부위를 표적화하는 gRNA, 예를 들어 SEQ ID NO: 120(비변형) 또는 SEQ ID NO: 121(변형)의 스페이서를 포함하는 gRNA가 사용될 수 있다. 이러한 gRNA는 SEQ ID NO: 122(비변형) 또는 SEQ ID NO: 123(변형)의 뉴클레오타이드 서열을 포함할(예를 들어, 이로 구성될) 수 있다. SEQ ID NO: 133의 부위를 표적화하는 gRNA에 의해 편집된 T 세포는 아래에서 표 17에 나열된 변형 중 적어도 하나를 갖는 변형된 TET2 유전자를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, TET2 유전자에 특이적인 gRNA는 엑손 5 내의 부위를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 엑손 5에서 GGGATGTCCTATTGCTAAGT(SEQ ID NO: 125)의 부위를 표적화하는 gRNA, 예를 들어, SEQ ID NO: 18(비변형) 또는 SEQ ID NO: 19(변형)의 스페이서를 포함하는 gRNA가 사용될 수 있다. 이러한 gRNA는 SEQ ID NO: 16(비변형) 또는 SEQ ID NO: 17(변형)의 뉴클레오타이드 서열을 포함할(예를 들어, 이로 구성될) 수 있다. SEQ ID NO: 125의 부위를 표적화하는 gRNA에 의해 편집된 T 세포는 아래에서 표 19에 나열된 변형 중 적어도 하나를 갖는 변형된 TET2 유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 gRNA를 사용하는 TET2 유전자의 유전자 편집은 TET2 단백질의 절단된 버전의 발현을 야기할 수 있고, 이는 약 170 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
다른 예에서, 엑손 5에서 AGGGATGTCCTATTGCTAAG(SEQ ID NO: 126)의 부위를 표적화하는 gRNA, 예를 들어, SEQ ID NO: 22(비변형) 또는 SEQ ID NO: 23(변형)의 스페이서를 포함하는 gRNA가 사용될 수 있다. 이러한 gRNA는 SEQ ID NO: 20(비변형) 또는 SEQ ID NO: 21(변형)의 뉴클레오타이드 서열을 포함할(예를 들어, 이로 구성될) 수 있다. SEQ ID NO: 126의 부위를 표적화하는 gRNA에 의해 편집된 T 세포는 아래에서 표 20에 나열된 변형 중 적어도 하나를 갖는 변형된 TET2 유전자를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, TET2 유전자에 특이적인 gRNA는 엑손 4 내의 부위를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 엑손 4에서 CATTAGGACCTGCTCCTAGA(SEQ ID NO: 124)의 부위를 표적화하는 gRNA, 예를 들어, SEQ ID NO: 14(비변형) 또는 SEQ ID NO: 15(변형)의 스페이서를 포함하는 gRNA가 사용될 수 있다. 이러한 gRNA는 SEQ ID NO: 12(비변형) 또는 SEQ ID NO: 13(변형)의 뉴클레오타이드 서열을 포함할(예를 들어, 이로 구성될) 수 있다. SEQ ID NO: 124의 부위를 표적화하는 gRNA에 의해 편집된 T 세포는 아래에서 표 21에 나열된 변형 중 적어도 하나를 갖는 변형된 TET2 유전자를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, TET2 유전자에 특이적인 gRNA는 엑손 6 내의 부위를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 엑손 6에서 ACGGCACGCTCACCAATCGC(SEQ ID NO: 127)의 부위를 표적화하는 gRNA, 예를 들어, SEQ ID NO: 26(비변형) 또는 SEQ ID NO: 27(변형)의 스페이서를 포함하는 gRNA가 사용될 수 있다. 이러한 gRNA는 SEQ ID NO: 24(비변형) 또는 SEQ ID NO: 25(변형)의 뉴클레오타이드 서열을 포함할(예를 들어, 이로 구성될) 수 있다. SEQ ID NO: 127의 부위를 표적화하는 gRNA에 의해 편집된 T 세포는 아래에서 표 18에 나열된 변형 중 적어도 하나를 갖는 변형된 TET2 유전자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 gRNA는 CD70 유전자를 표적화하며, 예를 들어, CD70의 엑손 1 또는 엑손 3 내의 부위를 표적화한다. 이러한 gRNA는 CD70 유전자, 또는 이의 단편의 엑손 1 또는 엑손 3의 표적 서열과 상보적인(전체적으로 또는 부분적으로) 스페이서 서열을 포함할 수 있다. CD70 유전자에서 예시적 표적 서열 및 CD70 유전자에 특이적인 예시적 gRNA가 아래의 표 4에 제공된다.
[표 4]
예시적 CD70 gRNA 서열/표적 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
*: 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 잔기
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 gRNA는 FAS 유전자를 표적화하며, 예를 들어, FAS의 엑손 1, 엑손 2, 또는 엑손 3 내의 부위를 표적화한다. 이러한 gRNA는 FAS 유전자, 또는 이의 단편의 엑손 1, 엑손 2, 또는 엑손 3의 표적 서열과 상보적인(전체적으로 또는 부분적으로) 스페이서 서열을 포함할 수 있다. FAS 유전자에서 예시적 표적 서열 및 FAS 유전자에 특이적인 예시적 gRNA가 아래의 표 5에 제공된다.
[표 5]
예시적 FAS gRNA 서열/표적 서열
Figure pct00008
Figure pct00009
*: 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 잔기
다른 구현예에서, FAS 유전자에 특이적인 gRNA는 엑손 2 내의 부위를 표적화할 수 있다. 예를 들어, FAS 유전자의 엑손 2에서 SEQ ID NO: 142의 부위를 표적화하는 gRNA, 예를 들어, SEQ ID NO: 73(비변형) 또는 SEQ ID NO: 74(변형)의 스페이서를 포함하는 gRNA가 사용될 수 있다. 이러한 gRNA는 SEQ ID NO: 71(비변형) 또는 SEQ ID NO: 72(변형)의 뉴클레오타이드 서열을 포함할(예를 들어, 이로 구성될) 수 있다(예를 들어, FAS-엑손2-T2 gRNA). SEQ ID NO: 142의 부위를 표적화하는 gRNA에 의해 편집된 T 세포는 아래에서 표 26에 나열된 변형 중 적어도 하나를 갖는 변형된 FAS 유전자를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, FAS 유전자에 특이적인 gRNA는 엑손 3 내의 부위를 표적화할 수 있다. 예를 들어, FAS 유전자의 엑손 3에서 SEQ ID NO: 144의 부위를 표적화하는 gRNA, 예를 들어, SEQ ID NO: 81(비변형) 또는 SEQ ID NO: 82(변형)의 스페이서를 포함하는 gRNA가 사용될 수 있다. 이러한 gRNA는 SEQ ID NO: 79(비변형) 또는 SEQ ID NO: 80(변형)의 뉴클레오타이드 서열을 포함할(예를 들어, 이로 구성될) 수 있다(예를 들어, FAS-엑손3-T1 gRNA). SEQ ID NO: 144의 부위를 표적화하는 gRNA에 의해 편집된 T 세포는 아래에서 표 27에 나열된 변형 중 적어도 하나를 갖는 변형된 FAS 유전자를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, FAS 유전자에 특이적인 gRNA는 엑손 3 내의 부위를 표적화할 수 있다. 예를 들어, FAS 유전자의 엑손 3에서 SEQ ID NO: 145의 부위를 표적화하는 gRNA, 예를 들어, SEQ ID NO: 85(비변형) 또는 SEQ ID NO: 86(변형)의 스페이서를 포함하는 gRNA가 사용될 수 있다. 이러한 gRNA는 SEQ ID NO: 83(비변형) 또는 SEQ ID NO: 84(변형)의 뉴클레오타이드 서열을 포함할(예를 들어, 이로 구성될) 수 있다(예를 들어, FAS-엑손3-T2 gRNA). SEQ ID NO: 145의 부위를 표적화하는 gRNA에 의해 편집된 T 세포는 아래에서 표 28에 나열된 변형 중 적어도 하나를 갖는 변형된 FAS 유전자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 gRNA는 ß2M 유전자를 표적화하며, 예를 들어, ß2M 유전자 내의 적합한 부위를 표적화한다. 또한 그 관련 개시가 본원에서 언급된 목적 및 요지를 위해 본원에 참조로 포함되는, 2018년 5월 11일 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2018/032334를 참고한다. 다른 gRNA 서열은 염색체 15에 위치한 ß2M 유전자 서열을 사용하여 설계될 수 있다(GRCh38 좌표: 염색체 15: 44,711,477-44,718,877; Ensembl: ENSG00000166710). 일부 구현예에서, ß2M 게놈 영역을 표적화하는 gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 ß2M 게놈 영역에서 절단을 생성하여 mRNA 또는 단백질의 발현을 파괴하는 ß2M 유전자에서의 삽입결실을 생성한다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 gRNA는 TRAC 유전자를 표적화한다. 또한 그 관련 개시가 본원에서 언급된 요지 및 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 2018년 5월 11일 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2018/032334를 참고한다. 다른 gRNA 서열은 염색체 14에 위치한 TRAC 유전자 서열을 사용하여 설계될 수 있다(GRCh38: 염색체 14: 22,547,506 내지 22,552,154; Ensembl; ENSG00000277734). 일부 구현예에서, TRAC 게놈 영역을 표적화하는 gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 TRAC 게놈 영역에서 절단을 생성하여 mRNA 또는 단백질의 발현을 파괴하는 TRAC 유전자에서의 삽입결실을 생성한다.
예시적 스페이서 서열 및 ß2M 유전자 또는 TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA는 아래에서 표 6에 제공된다.
[표 6]
gRNA 서열/표적 서열
Figure pct00010
*: 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 잔기
예를 들어, CRISPR/Cas/Cpf1 시스템에 사용되는 가이드 RNA, 또는 기타 더 작은 RNA는 아래 예시된 바와 같이 그리고 당분야에 알려진 바와 같이 화학적 수단에 의해 쉽게 합성될 수 있다. 화학적 합성 절차가 지속적으로 확장되고는 있지만, 폴리뉴클레오타이드 길이가 100개 정도의 뉴클레오타이드를 훨씬 넘어서 증가함에 따라 고성능 액체 크로마토그래피(PAGE와 같은 겔을 사용하지 않는 HPLC)와 같은 절차에 의한 이러한 RNA 정제는 더 어려워지는 경향이 있다. 길이가 더 긴 RNA를 생성하는 데 사용되는 한 가지 접근법은 서로 결찰된 2개 이상의 분자를 생성하는 것이다. Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 것들과 같은 훨씬 더 긴 RNA는 효소에 의해 보다 용이하게 생성된다. RNA의 화학적 합성 및/또는 효소적 생성 동안 또는 후에 다양한 유형의 RNA 변형, 예를 들어 당분야에 기재된 바와 같이 안정성을 향상시키고, 선천성 면역 반응의 가능성이나 정도를 감소시키고, 및/또는 기타 속성을 향상시키는 변형이 도입될 수 있다.
일부 예에서, 본 개시의 gRNA는 시험관내 전사(IVT), 합성 및/또는 화학적 합성 방법, 또는 이의 조합에 의해 생성될 수 있다. 효소(IVT), 고상, 액상, 조합된 합성 방법, 작은 영역 합성 및 결찰 방법이 이용된다. 하나의 구현예에서, gRNA는 IVT 효소 합성 방법을 사용하여 제조된다. IVT에 의해 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있고, WO2013/151666에 기재되어 있다. 따라서, 본 개시에는 또한 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 DNA가 포함되고, 작제물 및 벡터가 본원에서 기재된 gRNA를 시험관내 전사하기 위해 사용된다.
RNA의 화학적 합성 및/또는 효소적 생성 동안 또는 후에 다양한 유형의 RNA 변형, 예를 들어 당분야에 기재된 바와 같이 안정성을 향상시키고, 선천성 면역 반응의 가능성이나 정도를 감소시키고, 및/또는 기타 속성을 향상시키는 변형이 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 비천연 변형 뉴클레오염기는 합성 동안 또는 합성 후 본원에서 개시된 임의의 gRNA 내로 도입될 수 있다. 소정 구현예에서, 뉴클레오사이드간 연결, 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 당이 변형된다. 일부 구현예에서, 변형은 화학적 합성 또는 폴리머라제 효소에 의해 gRNA의 말단에서 도입된다. 변형된 핵산 및 이의 합성의 예는 WO2013/052523에 개시되어 있다. 변형된 폴리뉴클레오타이드의 합성은 또한 문헌[Verma and Eckstein, Annual Review of Biochemistry, vol. 76, 99-134 (1998)]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 효소적 또는 화학적 결찰 방법은 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 영역을 상이한 기능적 모이어티, 예컨대 표적화 또는 전달 제제, 형광 표지, 액체, 나노입자 등과 접합시키기 위해 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 및 변형 폴리뉴클레오타이드의 접합체는 문헌[Goodchild, Bioconjugate Chemistry, vol. 1(3), 165-187 (1990)]에서 검토된다.
본 개시의 일부 구현예에서, 본원에서 개시된 임의의 표적 유전자를 유전적으로 편집하는 데 사용하기 위한 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템에는 적어도 하나의 가이드 RNA가 포함될 수 있다. 일부 예에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 여러 gRNA, 예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개의 gRNA를 함유할 수 있다. 이러한 여러 gRNA는 동일한 표적 유전자에서 상이한 부위를 표적화할 수 있다. 대안적으로, 여러 gRNA는 상이한 유전자를 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA(들) 및 Cas 단백질은 리보뉴클레오단백질(RNP), 예를 들어 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다. 가이드 RNA(들)는 Cas 단백질을 본원에서 개시된 것들과 같은 하나 이상의 표적 유전자 상의 표적 서열(들)로 가이드할 수 있고, 여기서 Cas 단백질은 표적 부위에서 표적 유전자를 절단한다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 복합체는 Cpf1/가이드 RNA 복합체이다. 일부 구현예에서, CRISPR 복합체는 II형 CRISPR/Cas9 복합체이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 복합체는 Cas9/가이드 RNA 복합체이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 특정 gRNA를 포함하는, 특정 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 삽입결실 빈도(편집 빈도)는 TIDE 분석을 사용하여 결정될 수 있고, 이는 표적 유전자를 편집하기 위해 고도로 효율적인 gRNA 분자를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 고도로 효율적인 gRNA는 80% 초과의 유전자 편집 빈도를 산출한다. 예를 들어, gRNA는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 유전자 편집 빈도를 산출하면 고도로 효율적인 것으로 고려된다.
가이드 RNA 및 뉴클레아제의 T 세포로의 전달
하나 이상의 gRNA 및 적어도 하나의 RNA-가이드 뉴클레아제, 임의로 아래에서 개시된 바와 같은 공여자 주형을 포함하는, 본원에서 개시된 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 통상적 방법을 통해, 표적 유전자의 유전자 편집을 위해 표적 세포(예를 들어, T 세포)로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 구성요소는 동시에 또는 순차적으로, 표적 세포에 별도 전달될 수 있다. 다른 구현예에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 구성요소는 함께, 예를 들어, 복합체로서, 표적 내로 전달될 수 있다. 일부 경우에, gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 리보뉴클레오단백질(RNP)을 형성하기 위해 함께 예비복합체화될 수 있고, 이는 표적 세포 내로 전달될 수 있다.
RNP는 적어도 핵산-농후 세포 환경에서 잡다한 상호작용의 위험을 최소화하고 분해로부터 RNA를 보호하므로, 유전자 편집에 유용하다. RNP를 형성하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 뉴클레아제) 및 하나 이상의 관심 유전자를 표적화하는 하나 이상의 gRNA를 함유하는 RNP가 세포(예를 들어, T 세포)에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, RNP는 전기천공에 의해 T 세포에 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 세포에서 RNA-가이드 뉴클레아제를 발현하는 DNA 벡터에서 세포에 전달될 수 있다. 다른 예에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 RNA-가이드 뉴클레아제를 인코딩하고 세포에서 뉴클레아제를 발현하는 RNA에서 세포에 전달될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 유전자를 표적화는 gRNA는 RNA, 또는 세포에서 gRNA를 발현하는 DNA 벡터로서 세포에 전달될 수 있다.
RNA-가이드 뉴클레아제, gRNA, 및/또는 RNP의 전달은 직접 주입 또는 알려진 방법, 예를 들어, 전기천공 또는 화학적 전달감염을 사용하는 세포 전달감염을 통해서일 수 있다. 다른 세포 전달감염 방법이 사용될 수 있다.
다른 유전자 편집 방법
본원에서 개시된 CRISPR 방법에 더하여, 당분야에 알려진 바와 같은 추가적인 유전자 편집 방법이 또한 본원에서 개시된 유전적으로 조작된 T 세포를 제조하는 데 사용될 수 있다. 일부 예에는 엔도뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 제한 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제 호밍 엔도뉴클레아제 등이 관여되는 유전자 편집 접근법에 포함된다.
ZFN은 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 폴리펩타이드 도메인인 징크 핑거 DNA 결합 도메인(ZFBD)에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. 징크 핑거는 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 징크 핑거 결합 도메인 내의 약 30개 아미노산의 도메인이다. 징크 핑거의 예에는 C2H2 징크 핑거, C3H 징크 핑거, 및 C4 징크 핑거가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 설계된 징크 핑거 도메인은, 설계/조성이 대체로 합리적 기준, 예를 들어 기존 ZFP 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 전산화 알고리즘 및 치환 규칙의 적용으로부터 생성되는 자연에서 확인되지 않는 도메인이다. 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호, 제6,453,242호, 및 제6,534,261호를 참고한다; 또한 WO 98/53058, WO 98/53059, WO 98/53060, WO 02/016536, 및 WO 03/016496을 참고한다. 선택된 징크 핑거 도메인은 파지 디스플레이, 상호작용 트랩, 또는 하이브리드 선별과 같은 실험적 공정에서 주로 생성되는, 자연에서 확인되지 않는 도메인이다. ZFN은 미국 특허 제7,888,121호 및 미국 특허 제7,972,854호에 보다 자세히 설명되어 있다. ZFN의 가장 잘 알려진 예는 FokI 뉴클레아제와 징크 핑거 DNA 결합 도메인의 융합체이다.
TALEN은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "전사 활성화제-유사 효과기 DNA 결합 도메인", "TAL 효과기 DNA 결합 도메인", 또는 "TALE DNA 결합 도메인"은 TAL 효과기 단백질의 DNA에 대한 결합에 관여하는 TAL 효과기 단백질의 폴리펩타이드 도메인이다. TAL 효과기 단백질은 감염 동안 잔토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원체에 의해 분비된다. 이 단백질은 식물 세포의 핵에 들어가, DNA 결합 도메인을 통해 효과기 특이적 DNA 서열에 결합하고, 이들 서열에서 전사활성화 도메인을 통해 유전자 전사를 활성화한다. TAL 효과기 DNA 결합 도메인의 특이성은 반복 가변 이잔기(RVD)라고 하는 선택 반복 위치에서 다형성을 포함하는, 효과기 가변 수의 불완전한 34개 아미노산 반복에 좌우된다. TALEN은 미국 특허 출원 제2011/0145940호에 보다 자세히 기재되어 있다. 당분야에서 가장 잘 알려진 TALEN의 예는 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 대한 FokI 뉴클레아제의 융합 폴리펩타이드이다.
본원에서 제공된 바와 같이 사용하기에 적합한 표적화된 뉴클레아제의 추가예는, 개별적으로 사용되든 조합으로 사용되든 Bxb1, phiC31, R4, PhiBT1, 및 Wß/SPBc/TP901-1이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 개시된 임의의 뉴클레아제는 플라스미드 벡터, DNA 미니서클, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노 연관 바이러스 벡터, 및 이의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는 벡터 시스템을 사용하여 전달될 수 있다.
세포(예를 들어, T 세포)에서 공여자 주형 및 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 도입하기 위해 통상적인 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법이 사용될 수 있다. 비바이러스 벡터 전달 시스템에는 DNA 플라스미드, DNA 미니서클, 네이키드 핵산, 및 리포솜 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산이 포함된다. 바이러스 벡터 전달 시스템에는, 세포에 전달된 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스가 포함된다.
핵산의 비바이러스 전달 방법에는 전기천공, 리포펙션, 마이크로주사, 유전자총, 바이로솜, 리포솜, 면역리포솜, 폴리양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 네이키드 RNA, 캡핑된 RNA, 인공 비리온, 및 제제-강화 DNA 흡수가 포함된다. 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용하는 초음파천공이 또한 핵산 전달에 사용될 수 있다. 일부 구체적인 예가 아래에서 제공된다.
II. 치료용 T 세포를 생성하기 위한 T 세포 은행의 사용
본원에서 개시된 T 세포 은행으로부터의 유전적으로 조작된 T 세포는 치료용 T 세포, 예컨대 CAR-T 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료제를 인코딩하는 핵산, 예컨대 CAR은 치료용 T 세포를 생성하기 위해 T 세포 은행으로부터의 세포 내로 도입될 수 있다. 다른 구현예에서, T 세포 은행에서의 T 세포는 치료제, 예컨대 CAR을 발현하도록 조작되었다. 이러한 T 세포는 치료를 필요로 하는 대상체에서 사용하기 위한 치료용 T 세포를 생성하기 위해, T 세포 은행으로부터 수득되고, 임의로 시험관내 증대될 수 있다. T 세포 은행으로부터 생성된 치료용 T 세포는 생체내에서 더 길게 생존하고 더 강력할 것으로 예상된다. 이와 같이, 이러한 치료용 T 세포의 더 적은 용량이 치료법에서 요구될 것이며, 이는 더 적은 부작용을 초래할 것이다. 또한, 더 다수의 CAR-T 세포가 T 세포(예를 들어, 야생형 TET2 유전자, 야생형 FAS 유전자, 및/또는 야생형 CD70 유전자를 포함함)를 사용하는 통상적 접근법에 비해, 적합한 자연적 원천, 예컨대 단일 류코팩으로부터 단리된 T 세포로부터 생성될 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR)
키메라 항원 수용체(CAR)는 요망되지 않는 세포, 예를 들어, 질환 세포, 예컨대 암세포에 의해 발현된 항원을 인식하고 이에 결합하도록 조작된 인공 면역 세포 수용체를 나타낸다. CAR 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포는 CAR T 세포로 나타낸다. CAR은 T-세포 특이성 및 반응성을 MHC-비제한적 방식으로 선별된 표적 쪽으로 재유도할 수 있는 능력을 갖는다. MHC-비제한적 항원 인식은 CAR T 세포에 항원 가공과 무관하게 항원을 인식하는 능력을 부여하여 종양 회피의 주요 기전을 우회한다. 또한, T 세포 상에서 발현될 때, CAR은 유리하게는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬과 이량체화하지 않는다.
CAR에는 다양한 세대가 있으며, 각 세대는 상이한 구성요소를 함유한다. 1세대 CAR은 힌지 및 막관통 도메인을 통해 항체 유래 scFv를 T 세포 수용체의 CD3제타(ζ 또는 z) 세포내 신호전달 도메인에 연결한다. 2세대 CAR은 추가 공동-자극 도메인, 예를 들어 CD28, 4-1BB(41BB), 또는 ICOS를 포함하여 공동자극 신호를 제공한다. 3세대 CAR은 TCR CD3ζ 사슬과 융합된 2개의 공동자극 도메인(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB, ICOS, 또는 OX40의 조합)을 함유한다. [Maude et al., Blood. 2015; 125(26):4017-4023; Kakarla and Gottschalk, Cancer J. 2014; 20(2):151-155)]. 임의의 다양한 세대의 CAR 작제물은 본 개시의 범위 내에 있다.
일반적으로, CAR은 표적 항원을 인식하는 세포외 도메인(예를 들어, 항체의 단일쇄 단편(scFv) 또는 다른 항체 단편) 및 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인(예를 들어, CD3ζ) 및 대부분의 경우, 공동-자극 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다(Enblad et al., Human Gene Therapy. 2015; 26(8):498-505). CAR 작제물은 세포외 도메인 및 세포내 도메인 간 힌지 및 막관통 도메인뿐만 아니라 표면 발현을 위해 N-말단에 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩타이드의 예에는 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO: 102) 및 MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO: 103)가 포함된다. 다른 신호 펩타이드가 사용될 수 있다.
(i) 항원 결합 세포외 도메인
항원 결합 세포외 도메인은 CAR이 세포 표면 상에 발현되는 경우 세포외액에 노출되는 CAR 폴리펩타이드의 영역이다. 일부 경우에, 신호 펩타이드는 세포 표면 발현을 촉진하기 위해 N-말단에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 단일쇄 가변 단편(scFv, 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)이 (어느 방향으로든) 포함될 수 있음)일 수 있다. 일부 경우에, VH 및 VL 단편은 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커에는 유연성을 위한 글리신과 세린의 신장부, 및 부가된 용해성을 위한 글루타메이트와 리신의 신장부를 갖는 친수성 잔기가 포함된다. scFv 단편은 scFv 단편이 유래되는 모 항체의 항원 결합 특이성을 보유한다. 일부 구현예에서, scFv는 인간화 VH 및/또는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, scFv의 VH 및/또는 VL 도메인은 완전히 인간이다.
항원 결합 세포외 도메인은 관심 표적 항원, 예를 들어, 병리학적 항원, 예컨대 종양 항원에 특이적일 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 일반적으로 비종양 세포에서보다 종양 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 면역원성 분자, 예컨대 단백질을 언급하는 "종양 연관 항원"이고, 비종양 세포에서 이것은 전혀 발현되지 않거나, 낮은 수준으로만 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 보유 숙주의 면역계에 의해 인식되는 종양 연관 구조를 종양 연관 항원으로 나타낸다. 일부 구현예에서, 종양 연관 항원은 대부분의 유형의 종양에 의해 광범위하게 발현되는 경우, 공통 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 종양 연관 항원은 분화 항원, 돌연변이 항원, 과발현된 세포 항원, 또는 바이러스 항원이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 종양 세포에 고유한 단백질과 같은 면역원성 분자로 언급되는 "종양 특이적 항원" 또는 "TSA"이다. 종양 특이적 항원은 종양 세포에서만, 예를 들어, 특정 유형의 종양 세포에서만 발현된다.
예시적 종양 항원에는 CD19, CD33, BCMA, 및 CD70이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 종양 항원에 특이적인 임의의 알려진 항체, 예를 들어, 시판이 승인된 것들 및 임상 시험 중인 것들이 본원에서 개시된 CAR 작제물을 제조하는 데 사용될 수 있다.
(ii) 막관통 도메인
본원에서 개시된 CAR 폴리펩타이드는 막관통 도메인을 함유할 수 있고, 이는 막을 가로지르는 소수성 알파 나선일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "막관통 도메인"은 세포막, 바람직하게는 진핵생물 세포막에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조를 나타낸다. 막관통 도메인은 이를 함유하는 CAR의 안정성을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 바와 같은 CAR의 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인일 수 있다. 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8 및 CD28 막관통 도메인의 키메라이다. 다른 막관통 도메인이 본원에서 제공된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFACDIYIWA PLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR(SEQ ID NO: 104) 또는 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY(SEQ ID NO: 105)의 서열을 함유하는 CD8a 막관통 도메인이다. 다른 막관통 도메인이 사용될 수 있다.
(iii) 힌지 도메인
일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CAR의 세포외 도메인(항원 결합 도메인 포함)과 막관통 도메인 사이에, 또는 CAR의 세포질 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치할 수 있다. 힌지 도메인은 폴리펩타이드 사슬에서 막관통 도메인을 세포외 도메인 및/또는 세포질 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 힌지 도메인은 CAR, 또는 이의 도메인에 유연성을 제공하거나, CAR 또는 이의 도메인의 입체 장애를 방지하는 기능을 할 수 있다.
일부 구현예에서, 힌지 도메인은 최대 300개의 아미노산(예를 들어, 10개 내지 100개의 아미노산, 또는 5개 내지 20개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 힌지 도메인(들)이 CAR의 다른 영역에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인일 수 있다. 다른 힌지 도메인이 사용될 수 있다.
(iv) 세포내 신호전달 도메인
임의의 CAR 작제물은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, CD3ζ, 및 임의로 하나 이상의 공동-자극 도메인)을 함유하며, 이는 수용체의 기능적 말단이다. 항원 인식 후, 수용체가 클러스터링하고 신호가 세포로 전송된다.
CD3ζ은 T 세포 수용체 복합체의 세포질 신호전달 도메인이다. CD3ζ은 세(3) 개의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)을 함유하며, 이는 T 세포가 인지체 항원에 연루된 후 활성화 신호를 T 세포로 전송한다. 많은 경우, CD3ζ는 완전한 적격 활성화 신호가 아닌 일차 T 세포 활성화 신호를 제공하며, 이는 공동-자극 신호전달을 필요로 한다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 CAR 폴리펩타이드는 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, CD28 및/또는 4-1BB의 공동-자극 도메인은 CD3ζ에 의해 매개되는 일차 신호전달과 함께, 전체 증식/생존 신호를 전송하기 위해 사용될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 개시된 CAR은 CD28 공동-자극 분자를 포함한다. 다른 예에서, 본원에서 개시된 CAR은 4-1BB 공동-자극 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR에는 CD3ζ 신호전달 도메인 및 CD28 공동-자극 도메인이 포함된다. 다른 구현예에서, CAR에는 CD3ζ 신호전달 도메인 및 4-1BB 공동-자극 도메인이 포함된다. 또 다른 구현예에서, CAR에는 CD3ζ 신호전달 도메인, CD28 공동-자극 도메인, 및 4-1BB 공동-자극 도메인이 포함된다.
표 7은 본원에서 사용될 수 있는 4-1BB, CD28 및 CD3-제타로부터 유래된 신호전달 도메인의 예를 제공한다.
[표 7]
예시적인 세포내 신호전달 도메인 서열
Figure pct00011
CAR 작제물의 비제한적 예는 그 관련 개시가 본원에서 언급된 목적 및 요지를 위해 본원에 참조로 포함되는 WO2019097305 및 WO2019215500, 그리고 WO2020/095107에 제공된다. 일부 예가 아래에 제공된다:
항-CD19 CAR(SEQ ID NO: 148) :
Figure pct00012
항-BCMA CAR(SEQ ID NO: 149) :
Figure pct00013
항-CD70 CAR(SEQ ID NO: 150) :
Figure pct00014
Figure pct00015
예시적 항-CD33 CAR 작제물은 그 관련 개시가 본원에서 언급된 요지 및 목적을 위해 참조로 포함되는 WO2020095107에서 확인될 수 있다.
CAR 작제물의 T 세포로의 전달
일부 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 당업자에게 알려진 방법에 의해 본원에서 개시된 T 세포 은행으로부터 임의의 유전적으로 조작된 T 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, CAR의 코딩 서열은 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 이는 CAR의 발현을 위해 유전적으로 조작된 T 세포 내로 도입될 수 있다. 당분야에 알려진 다양한 여러 방법을 사용하여, 본원에서 개시된 임의의 핵산 또는 발현 벡터를 면역 효과기 세포 내로 도입할 수 있다. 세포 내로 핵산을 도입하는 방법의 비제한적인 예에는 하기가 포함된다: 리포펙션, 전달감염(예를 들어, 인산칼슘 전달감염, 고도로 분지된 유기 화합물을 사용하는 전달감염, 양이온성 중합체를 사용하는 전달감염, 덴드리머 기반 전달감염, 광학적 전달감염, 입자 기반 전달감염(예를 들어, 나노입자 전달감염), 또는 리포솜(예를 들어, 양이온성 리포솜)을 사용하는 전달감염), 마이크로주사, 전기천공, 세포 압착, 초음파천공, 원형질체 융합, 임페일펙션, 유체역학적 전달, 유전자 총, 마그네토펙션, 바이러스 전달감염, 및 뉴클레오펙션.
특정 예에서, CAR 작제물을 인코딩하는 핵산이 아데노 연관 바이러스(AAV)를 사용하여 세포에 전달될 수 있다. AAV는 숙주 게놈 내로 부위 특이적으로 통합되어 CAR과 같은 이식유전자를 전달할 수 있는 작은 바이러스이다. 역위 말단 반복부(ITR)는 AAV 게놈 및/또는 관심 이식유전자의 측면에 존재하고, 복제 원점으로서 작용한다. 또한 AAV 게놈에는, 전사될 때 표적 세포 내로의 전달을 위해 AAV 게놈을 캡슐화하는 캡시드를 형성하는 rep 및 cap 단백질이 존재한다. 이러한 캡시드의 표면 수용체는 AAV 혈청형을 부여하며, 이는 캡시드가 어느 표적 기관에 주로 결합할지를 결정하여 AAV에 의해 가장 효율적으로 감염될 세포를 결정한다. 현재 12개의 인간 AAV 혈청형이 알려져 있다. 일부 구현예에서, CAR-코딩 핵산을 전달하는 데 사용하기 위한 AAV는 AAV 혈청형 6(AAV6)이다.
아데노 연관 바이러스는 몇몇 이유로 유전자 치료법에 가장 흔히 사용되는 바이러스 중 하나이다. 첫째, AAV는 인간을 비롯한 포유류에 투여시 면역 반응을 유발하지 않는다. 둘째, AAV는 적절한 AAV 혈청형 선별을 고려할 때 특히, 표적 세포에 효과적으로 전달된다. 마지막으로, AAV는 게놈이 통합 없이 숙주 세포에서 지속할 수 있으므로 분열 세포와 비분열 세포 둘 모두를 감염시키는 능력을 갖는다. 이러한 특성으로 인해 AAV는 유전자 치료법에 이상적인 후보물질이다.
CAR을 인코딩하는 핵산은 숙주 T 세포에서 관심 게놈 부위 내로 삽입하기 위해 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 게놈 부위는 안전 보유 유전좌위에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터에 의해 운반될 수 있는, 공여자 주형을 통해) 유전적으로 조작된 T 세포에서 TRAC 유전자를 파괴하고 CAR 폴리펩타이드를 발현하기 위해 TRAC 유전자 내의 위치 내로 삽입할 수 있도록 설계될 수 있다. TRAC의 파괴는 내인성 TCR의 기능 손실을 야기한다. 예를 들어, TRAC 유전자의 파괴는 엔도뉴클레아제, 예컨대 본원에서 기재된 것들 및 하나 이상의 TRAC 게놈 영역을 표적화하는 하나 이상의 gRNA로 생성될 수 있다. TRAC 유전자에 특이적인 임의의 gRNA 및 본원에서 개시된 표적 영역이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
일부 예에서, TRAC 유전자에서의 게놈 결실 및 CAR 코딩 절편에 의한 대체는 상동성 유도 복구 또는 HDR(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터의 일부일 수 있는, 공여자 주형을 사용)에 의해 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자의 파괴는 엔도뉴클레아제, 예컨대 본원에서 개시된 것들 및 하나 이상의 TRAC 게놈 영역을 표적화하고 TRAC 유전자 내로 CAR 코딩 절편을 삽입하는 하나 이상의 gRNA로 생성될 수 있다.
본원에서 개시된 바와 같은 공여자 주형은 CAR에 대한 코딩 서열을 함유할 수 있다. 일부 예에서, CAR-코딩 서열은 관심 게놈 위치에서, 예를 들어, 당분야에 알려진 유전자 편집 방법을 사용하여 TRAC 유전자에서 효율적 HDR을 허용하는 2개의 상동성 영역이 측면에 있을 수 있다. 일부 예에서, CRISPR-기반 방법이 사용될 수 있다. 이 경우, 표적 유전좌위에서의 DNA의 두 가닥 모두는 표적 유전좌위에 특이적인 gRNA에 의해 가이드되는 CRISPR Cas9 효소에 의해 절단될 수 있다. 이후, HDR이 발생하여 이중-가닥 절단(DSB)을 복구하고 CAR을 코딩하는 공여자 DNA를 삽입한다. 이러한 발생이 정확하게 일어나기 위해, 공여자 서열은 표적 유전자, 예컨대 TRAC 유전자에서 DSB 부위의 주변 서열에 상보적인 측면 잔기(이하, "상동성 아암")를 갖도록 설계된다. 이러한 상동성 아암은 DSB 복구를 위한 주형으로서 작용하여, 본질적으로 오류가 없는 기전의 HDR을 허용한다. 상동성 유도 복구(HDR)율은 돌연변이와 절단 부위 사이의 거리의 함수이므로, 겹치거나 가까운 표적 부위를 선택하는 것이 중요하다. 주형에는 상동성 영역이 측면에 있는 추가 서열이 포함될 수 있거나, 게놈 서열과 상이한 서열을 함유할 수 있으므로, 서열 편집이 가능하다.
대안적으로, 공여자 주형은 DNA의 표적화된 위치에 대해 상동성 영역을 갖지 않을 수 있으며, 표적 부위에서의 절단 후 NHEJ 의존성 말단 연결에 의해 통합될 수 있다.
공여자 주형은 단일 가닥 및/또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 선형 또는 원형 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여자 서열의 말단은 당업자에게 알려진 방법에 의해(예를 들어, 핵외 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 선형 분자의 3' 말단에 하나 이상의 디데옥시뉴클레오타이드 잔기가 부가되고/되거나, 한쪽 또는 양쪽 말단에 자가-상보적 올리고뉴클레오타이드가 결찰된다. 예를 들어, 문헌[Chang et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al., (1996) Science 272:886-889]을 참고한다. 외인성 폴리뉴클레오타이드를 분해로부터 보호하는 추가 방법에는 말단 아미노기(들)의 부가 및 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오타이드간 연결의 사용이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
공여자 주형은, 예를 들어 복제 원점, 프로모터, 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 또한, 공여자 주형은 세포 내로 네이키드 핵산으로서, 또는 리포솜 또는 폴록사머와 같은 제제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 인테그라제 결함 렌티바이러스(IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 공여자 주형은 그 발현이 내인성 프로모터에 의해 유도될 수 있도록 내인성 프롬프터(예를 들어, 하류 또는 상류) 근처 부위에 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, 공여자 주형은 외인성 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 CAR 유전자의 발현을 제어하기 위해 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 프로모터는 EF1α 프로모터이다. 다른 프로모터가 사용될 수 있다.
또한, 외인성 서열에는 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩타이드를 인코딩하는 서열, 및/또는 폴리아데닐화 신호가 또한 포함될 수 있다.
필요한 경우, 추가적인 유전자 편집(예를 들어, 유전자 녹인 또는 녹아웃)이 T 세포 기능 및 치료 유효성을 개선하기 위해 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 은행으로부터 생성된 치료용 T 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, ß2M 녹아웃이 이식편-대-숙주 반응의 위험을 감소시키거나 방지하기 위해 사용될 수 있는 경우. 다른 예에는 표적 세포 용해를 개선하기 위한 녹인 또는 녹아웃 유전자, 치료용 T 세포, 예컨대 T 세포 은행의 세포로부터 제조된 CAR-T 세포의 성능을 향상시키기 위한 녹인 또는 녹아웃 유전자가 포함된다. 예에는 면역 체크포인트 유전자, 예컨대 PD-1의 녹아웃이 포함된다.
III. 치료 적용
T 세포 은행의 유전적으로 조작된 T 세포를 사용하여 생성된 치료용 T 세포는 TET2 유전자에서의 돌연변이, FAS 유전자의 파괴, CD70 유전자의 파괴, 또는 이의 조합에 의해 가능해진 T 세포 건강을 유지할 것으로 예상될 것이다. 예를 들어, T 세포 건강의 유지는 제조 동안 증대를 연장함으로써, 수율 및 일관성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 예에서, T 세포 건강의 유지는 고갈된/건강하지 않은 T 세포를 구제함으로써, 환자에서 잠재적으로 더 낮은 용량 및 더 강력한 반응을 가능하게 할 수 있다.
본원에서 개시된 T 세포 은행을 사용하여 생성된 치료용 T 세포는 치료 목적, 예를 들어, 치료용 T 세포에 의해 발현된 CAR 작제물에 의해 표적화되는 고형 종양의 치료를 위해 대상체에 투여될 수 있다.
투여 단계에는 요망되는 효과(들)가 생성될 수 있도록, 요망되는 부위, 예컨대 종양 부위에서 치료용 T 세포의 적어도 부분적인 편재를 초래하는 방법 또는 경로에 의해 대상체 내로의 치료용 T 세포의 배치(예를 들어, 이식)가 포함될 수 있다. 치료용 T 세포는 이식된 세포 또는 세포의 구성요소의 적어도 일부가 생활성으로 유지되는 대상체에서의 요망되는 부위로 전달시키는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상체에 대한 투여 후 세포의 생활성 기간은 짧게는 수 시간, 예를 들어 24시간, 수일, 길게는 수년, 또는 심지어 대상체의 수명까지, 즉, 장기간 생착일 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기재된 일부 양태에서, 치료용 T 세포의 유효량은 전신 투여 경로, 예컨대 복강내 또는 정맥내 경로를 통해 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료용 T 세포는 전신 투여되며, 이는 세포 집단이 표적 부위, 조직, 또는 장기 내로 직접 투여되는 것이 아니라, 대신 대상체의 순환계에 들어가 신진대사 등의 공정을 거치도록 하는 투여를 나타낸다. 적합한 투여 방식에는 주사, 주입, 점적, 또는 섭취가 포함된다. 주사에는 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 심실내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 뇌척수내, 및 흉골내 주사와 주입이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 경로는 정맥내이다.
대상체는 진단, 치료, 또는 치료법이 요망되는 임의의 대상체일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
일부 경우에, 치료용 T 세포는 대상체에 자가("자기")일 수 있다, 즉, 세포는 동일한 대상체로부터 유래된다. 대안적으로, 치료용 T 세포는 대상체에 비-자가("비-자기", 예를 들어, 동종이계, 동계, 또는 이종발생성)일 수 있다. "동종이계"는 치료용 T 세포가 치료를 제공받는 대상체로부터가 아니라 대상체와 동일한 종의 다른 개체(공여자)로부터 유래됨을 의미한다. 공여자는 치료받는 대상체가 아닌 개체이다. 공여자는 환자가 아닌 개체이다. 일부 구현예에서, 공여자는 치료받고 있는 암이 없거나 있는 것으로 의심되지 않는 개체이다. 일부 구현예에서, 다수의 공여자, 예를 들어 2명 이상의 공여자가 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 방법에 따라 투여되는 조작된 T 세포 집단은 하나 이상의 공여자로부터 수득된 동종이계 T 세포를 포함한다. 동종이계는 동일한 종의 하나 이상의 다른 공여자로부터 수득된 세포를 포함하는 세포, 세포 집단 또는 생물학적 샘플을 나타내고, 여기서 하나 이상의 유전좌위에서의 유전자는 수신체(예를 들어, 대상체)와 동일하지 않다. 예를 들어, 대상체에게 투여되는 조작된 T 세포 집단은 하나 이상의 관련되지 않은 공여자, 또는 하나 이상의 동일하지 않은 형제자매로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 동계 세포 집단, 예컨대 유전적으로 동일한 공여자(예를 들어, 동일한 쌍둥이)로부터 수득된 것들이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 자가 세포이다; 즉 조작된 T 세포는 대상체로부터 수득되거나 단리되고 동일한 대상체에 투여되며, 즉 공여자 및 수신체는 동일하다.
유효량은 의학적 병태(예를 들어, 암)의 적어도 하나 이상의 징후 또는 증상을 방지하거나 완화시키는 데 필요한 조작된 T 세포 집단의 양을 나타내고, 요망되는 효과를 제공하기 위한, 예를 들어 의학적 병태를 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물의 충분한 양과 관련된다. 유효량에는 또한 질환의 증상의 발생을 방지하거나 지연하거나, 질환의 증상의 경과를 변경하거나(예를 들어, 비제한적으로 질환의 증상의 진행을 늦춤), 질환의 증상의 역전시키기에 충분한 양을 포함한다. 임의의 주어진 사례에 대해, 적절한 유효량이 일상적 실험을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다고 이해된다.
본원에서 개시된 T 세포 은행으로부터 생성된 치료용 T 세포의 향상된 지속성 및 유효성으로 인해, 본원에서 제공되는 치료용 T 세포의 용량은 통상적 접근법에 의해(예를 들어, 돌연변이된 TET2 유전자, 파괴된 FAS 유전자, 및/또는 파괴된 CD70 유전자가 포함되는, 본원에서 개시된 유전자 편집 사건 중 하나 이상을 갖지 않는 T 세포를 사용하여) 제조된 CAR-T 세포의 표준 용량보다 낮을 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 개시된 치료용 T 세포의 유효량은 CAR-T 치료법의 표준 용량보다 적어도 2배 낮거나, 적어도 5배 낮거나, 적어도 10배 낮거나, 적어도 20배 낮거나, 적어도 50배 낮거나, 적어도 100배 낮을 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 개시된 치료용 T 세포의 유효량은 106개 세포 미만, 예를 들어, 105개 세포, 5 x104개 세포, 104개 세포, 5x 103개 세포, 또는 103개 세포일 수 있다. 본원에서 기재된 일부 예에서, 세포는 이를 필요로 하는 대상체에 대한 투여 전에 배양물 중 증대된다.
본원에서 개시된 치료용 T 세포를 사용하는 치료의 유효성은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일례로서의 기능적 표적 수준의 징후 또는 증상 중 어느 하나 또는 전부가 유리한 방식으로 변경(예를 들어, 적어도 10% 증가)되거나, 질환(예를 들어, 암)의 다른 임상적으로 허용되는 증상 또는 마커가 개선되거나 호전되는 경우, 치료는 "효과적인" 것으로 간주된다. 유효성은 또한 입원 또는 의학적 중재(예를 들어, 질환의 진행이 중지되거나 적어도 느려짐)의 필요성에 의해 평가되는, 악화하는 대상체의 실패에 의해 측정될 수 있다. 이들 지표를 측정하는 방법은 당업자에게 알려져 있고/있거나 본원에서 기재되어 있다. 치료에는 대상체에서의 임의의 질환 치료가 포함되고, 하기가 포함된다: (1) 질환을 억제하여, 예를 들어 증상의 진행을 정지시키거나 늦춤; 또는 (2) 질환을 경감시켜, 예를 들어 증상의 회귀를 유발함; 및 (3) 증상의 발생 가능성을 방지하거나 감소시킴.
조합 치료법이 또한 본 개시에 의해 포괄된다. 예를 들어, 본원에서 개시되는 치료용 T 세포는 동일한 적응증을 치료하기 위해, 또는 치료용 T 세포의 유효성을 향상시키기 위해 및/또는 치료용 T 세포의 부작용을 감소시키기 위해, 다른 치료제와 공동-사용될 수 있다.
키트
본 개시는 또한 T 세포 은행, 치료용 T 세포를 생성하는 데 사용하기 위한, 및 치료적 용도를 위한 키트를 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 키트는 TET2 유전자, FAS 유전자, 및 CD70 유전자 중 하나 이상의 유전자 편집을 수행하기 위한 구성요소, 및 임의로 유전자 편집이 수행될 면역 세포 집단(예를 들어, 류코팩)을 포함할 수 있다. 류코팩 샘플은 말초혈로부터 수집된 농축된 백혈구성분채집술 산물일 수 있다. 이는 전형적으로 단핵구, 림프구, 혈소판, 혈장, 및 적혈구가 포함되는 다양한 혈액 세포를 함유한다. 표적 유전자 중 하나 이상을 유전적으로 편집하기 위한 구성요소는 적합한 엔도뉴클레아제, 예컨대 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 및 하나 이상의 핵산 가이드를 포함할 수 있고, 이는 엔도뉴클레아제에 의한 하나 이상의 적합한 게놈 부위의 절단을 유도한다. 예를 들어, 키트는 Cas 효소, 예컨대 Cas 9 및 TET2 유전자, FAS 유전자, 및/또는 CD70 유전자를 표적화하는 하나 이상의 gRNA를 포함할 수 있다. 이들 표적 유전자에 특이적인 임의의 gRNA가 키트에 포함될 수 있다. 이러한 키트는 추가 유전자 편집을 위한 구성요소, 예를 들어, gRNA 및 임의로 다른 표적 유전자, 예컨대 ß2M 및/또는 TRAC를 편집하기 위한 추가적인 엔도뉴클레아제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 키트는 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 은행의 유전적으로 조작된 T 세포 집단, 및 또한 본원에서 개시된 바와 같은 치료용 T 세포를 생성하기 위한 하나 이상의 구성요소를 포함할 수 있다. 이러한 구성요소는 유전자 편집에 적합한 엔도뉴클레아제 및 관심 CAR 작제물을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. CAR-코딩 핵산은 본원에서 개시된 바와 같은 공여자 주형의 일부일 수 있고, 이는 CAR-코딩 서열의 측면에 상동성 아암을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 공여자 주형은 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터에 의해 운반될 수 있다. 키트는 CAR-코딩 서열을 TRAC 유전자 내로 삽입하기 위해 TRAC 유전자에 특이적인 gRNA를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에서 개시된 키트는 의도되는 치료 목적을 위해 개시된 바와 같은 치료용 T 세포 집단을 포함할 수 있다.
본원에서 개시된 임의의 키트는 T 세포 은행, 치료용 T 세포, 또는 치료용 T 세포의 치료 적용을 제조하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포함된 지침은 적합한 원천(예를 들어, 본원에서 기재된 것들)의 모 T 세포로부터 T 세포 은행을 제조하기 위해 표적 유전자(예를 들어, TET2, FAS, CD70, 또는 이의 조합) 중 하나 이상을 유전적으로 조작하기 위한 유전자 편집 구성요소의 사용 설명을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 포함된 지침은 치료용 T 세포를 제조하기 위한 T 세포 은행의 T 세포 내로 CAR 작제물을 인코딩하는 핵산을 어떻게 도입하는지의 설명을 포함할 수 있다.
대안적으로, 키트는 의도되는 활성, 예를 들어, 치료용 T 세포 상에서 발현된 CAR에 의해 표적화된 질환 세포의 제거를 달성하기 위한 본원에서 개시된 바와 같은 치료용 T 세포의 투여 지침을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 대상체가 치료를 필요로 하는지 여부를 식별하는 것에 기반하여 치료에 적합한 대상체를 선별하는 설명을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 기재된 치료용 T 세포의 사용에 관한 지침에는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투약 일정, 및 투여 경로에 대한 정보가 포함된다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다회 용량 패키지), 또는 하위단위 용량일 수 있다. 본 개시의 키트에 제공된 지침은 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물에 기재된 지침이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 치료용 T 세포가 대상체에서 질환 또는 장애의 치료, 발병 지연, 및/또는 완화를 위해 사용됨을 표시한다.
본원에서 제공된 키트는 적합한 패키징 내에 존재한다. 적합한 패키징에는 바이알, 병, 자(jar), 플렉시블 패키징 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 또한 특정 장치, 예컨대 치료용 T 세포의 투여를 위한 주입 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 고려된다. 키트에는 멸균 액세스 포트가 있을 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알 또는 정맥내 용액 백일 수 있음). 용기에도 멸균 액세스 포트가 있을 수 있다.
키트는 임의로 완충액 및 해석 정보와 같은 추가 구성요소를 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기 및 용기 상의 또는 용기와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일반 기법
본 개시의 실시는 달리 표시되지 않는 한, 당분야의 기술 범위 내에 있는 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 하기와 같은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985≫; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984≫; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986≫; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986≫; 및 B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)]에 자세히 설명되어 있다.
추가 설명 없이, 당업자는 상기 설명에 기반하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 하기 특정 구현예들은 단지 예시적 것으로, 어떤 식으로든 본 개시의 나머지 부분을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 인용된 모든 간행물은 본원에서 언급된 목적 또는 요지를 위해 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 일차 인간 T 세포에 대한 TET2 녹아웃(KO) 또는 돌연변이의 효과
(i) T 세포에서 Cas9:sgRNA RNP에 의한 TET2의 효율적 녹아웃 또는 돌연변이
본 실시예는 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하는 생체외 일차 인간 PBMC 세포로부터 유래된 T 세포에서 TET2 유전자의 효율적 편집을 기재한다. 엑손을 코딩하는 제4, 제5 및 제6 단백질을 함유하는 TET2 유전자의 게놈 절편을 gRNA 설계 소프트웨어에서 입력으로서 사용하였다. 요망되는 gRNA는 코딩 서열에서 결실을 야기하여, TET2의 아미노산 서열을 파괴하고 프레임외/기능 손실 대립유전자("TET2 녹아웃" 대립유전자 또는 TET2 단백질의 절단으로 나타냄)를 야기하는 것들이었다. TET2 유전자를 표적화하는 네(4) 개의 인실리코 식별된 gRNA 스페이서 서열을 합성하였고, gRNA를 표 1에 표시된 바와 같이 특이적으로 변형시켰다. 표 1에서의 gRNA는 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형에 의해 변형시켰지만, 비변형 gRNA 또는 다른 변형을 갖는 gRNA를 사용할 수 있다. 또한 그 관련 개시가 본원에서 언급된 목적 및 요지를 위해 참조로 포함되는 WO2019097305를 참고한다.
일차 인간 PBMC 세포로부터 유래된 활성화된 T 세포는 Cas9 뉴클레아제 및 TET2 유전자를 표적화하는 합성 변형된 sgRNA(상기 표 3에서의 서열)를 함유하는 리보뉴클레오단백질 입자(RNP) 또는 대조군(Cas9 없음, gRNA 없음)으로 전달감염(전기천공)시켰다. 전달감염 육(6) 일 후, 세포를 면역블로팅하여 삽입결실 효율을 평가하였다.
도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, gRNA TET2 엑손 4_BG4, TET2 엑손 5_T1, TET2 엑손 5_T2, 또는 TET2 엑손 6_BG5로 처리된 세포에서 단순 웨스턴(Simple Western)(단순 단백질, San Jose, CA)으로 명명된 모세관-기반 크기-분리 면역검정에 의해 TET2 단백질은 검출되지 않았고, 절단된 형태(들)의 TET2 단백질(야생형 TET2 대비 더 작은 겉보기 분자량을 가짐)이 TET2 엑손 5_T1 gRNA 또는 엑손 6_BG5 gRNA로 처리된 세포에서 검출되었다.
(ii) TET2 KO 또는 돌연변이가 T 세포 증식 및 증대를 증가시킴
사이토카인 함유 배지(IL-2 + IL-7)에서 증대될 T 세포의 능력에 대한 TET2 조절(파괴 또는 절단된 돌연변이 포함)의 효과를 평가하기 위해, 파괴되거나 돌연변이된 TET2 유전자를 갖는 세포를 상술된 바와 같이 생성하였다. 동일한 수의 세포를 사이토카인 함유 배지(IL-2+IL-7) 중 1.5X106개 세포/ml로 플레이트접종하고, 세포수를 2 내지 3일마다 기록하고, 세포 밀도를 신선 사이토카인 함유 배지(IL-2+IL-7) 중 1.5X106개 세포/ml로 조정하였다. TET2 엑손5_T1 또는 TET2 엑손5_T2에 의해 유도된 TET2 유전자에 파괴를 함유하는 T 세포는 TET2 유전자 파괴가 없는 대조군 세포에 비해 더 큰 수준으로 증대되었다(도 1b). 전달감염 후 6주 이후에, TET2 엑손5_T1 또는 TET2 엑손5_T2 gRNA를 갖는 TET2 편집된 세포는 증식을 유지하였고 TET2 엑손5_T1 gRNA에 의한 TET2의 조절(절단된 형태의 TET2를 생성함)은 다른 군에 비해 배양 중 더 큰 세포 수율을 초래하며 전달감염되지 않은 세포(WT)에 비해 세포 수율의 250배 초과 증가를 유발하였다. 도 1b.
다른 TET2 코딩 엑손의 파괴가 더 큰 T 세포 증대를 야기하는지를 평가하기 위해
TET2 엑손 4_BG4 및 TET2 엑손 6_BG5 gRNA를 이용한 처리 후 TET2 유전자에 파괴를 갖는 T 세포를 생성하였다. T 세포가 편집된 후 이들을 표준 T-세포 배양 조건 하에 4주 동안 성장시켰다(5% 인간 AB 혈청(HP1022, Valley Biomedical), 50 ng/ml의 IL-2(rhIL-2; 130-097-745, Miltenyi Biotech) 및 10 ng/ml의 IL-7(rhIL-7; Cellgenix 001410-050)이 보충된 (X-vivo 배지(04-744, Lonza). 4주 후, 3x106개 세포를 G-Rex(기체 투과 신속 증대(Gas Permeable Rapid Expansion), Wilson Wolf P/N80660M) 6웰 플레이트 내로 플레이트접종하였다. 10주 기간 동안 1주 1회 생활성 세포를 계수하여 세포 증대를 평가하였다. 증대를 3x106개 세포의 최초 플레이트접종에서 가장 최근 세포수로의 변화 배율(즉, 최근 세포수/3x106개 세포)로 기록하였다. 세포를 완전 배지 중 1x106개 세포/mL로 유지하였다. 도 1d에 나타낸 바와 같이, TET2 유전자의 엑손 4 또는 엑손 6을 파괴하여 생성된 TET2 KO는 10주 산정 기간(배양 중 총 14주) 동안 RNP 처리되지 않은 대조군 T-세포에 비해 15 내지 19배 증대를 야기하였다.
종합하면, TET2 변형 T 세포는 비변형 T 세포보다 훨씬 더 길게, 4주 초과 동안 배양 중에서 증대 가능한 것으로 확인되었다.
(iii) TET2 KO 또는 절단된 돌연변이가, 증대된 세포 배양에서 아폽토시스 세포수를 감소시킴
증대된 세포 배양에서 아폽토시스를 거치고 있는 TET2 결핍 세포수를 전기천공 후 36일차에 평가하였다. 간략하게, 세포의 분취액을 세척하고 실온에서 15분 동안 아넥신 V 결합 완충액(BioLegend) 중 7-AAD와 함께 FITC-접합 아넥신 V로 염색하였다. 이후, 세포를 세척하고, 유세포 측정에 의한 분석을 위해 아넥신 V 결합 완충액에 재현탁하였다. 아래에서 표 8에 나타낸 바와 같이, TET2 엑손5_T1 또는 TET2 엑손5_T2 gRNA로 편집된 T 세포는 비편집 세포에 비해 7 내지 8배만큼의 아폽토시스 세포의 감소 및 건강한 세포의 백분율 증가를 나타내었다.
[표 8]
전기천공 후 36일차의 건강한 세포의 백분율
Figure pct00016
(iv) TET2 KO 및 절단된 돌연변이가, 증대된 세포 배양에서 활성화 가능한 T 세포수를 증가시킴
증대된 세포 배양에서 활성화될 TET2-변형 T 세포의 능력을 평가하기 위해, 파괴된 TET2 유전자를 갖는 세포를 상술된 바와 같이 생성하였다. 전달감염 후 사십오(45) 일차에, 0.5X106개 T 세포를 한(1) 시간 동안 BD Golgiplug로 처리한 후 Golgiplug의 존재 하에 네(4) 시간 동안 PMA/이오노마이신으로 활성화하였다. 세포를 수집하고 활성화 마커에 대해 표면-염색하고 IFN-γ 생성에 대해 세포내-염색하였다. 각각 TET2 엑손3_T3 및 TET2 엑손5_T1에 의해 유도된 TET2 유전자에 파괴 및 절단된 돌연변이를 함유하는 T 세포는 TET2 유전자 파괴가 없는 대조군 세포 또는 다른 gRNA로 전달감염된 T 세포에 비해 더 큰 빈도의 활성화된 및 IFN-γ-양성 세포(CD25+, IFN-γ+ 세포)를 나타내었다. 아래에서 표 9의 결과를 참고한다.
[표 9]
유전적으로 편집된 T 세포에서 IFN-γ + /CD25 + T 세포의 백분율
Figure pct00017
실시예 2: FAS 녹아웃(KO)이 증식을 증가시키고 아폽토시스를 감소시킴
(i) T 세포에서 Cas9:sgRNA RNP에 의한 FAS의 녹아웃
본 실시예는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 접근법을 사용하는 생체외 일차 인간 T 세포에서 FAS 유전자의 효율적인 편집을 기재한다. 요망되는 gRNA는 코딩 서열에서 삽입 또는 결실을 야기하여, FAS의 아미노산 서열을 파괴하고, 프레임외/기능 손실 대립유전자(들)("FAS 녹아웃" 대립유전자로 나타냄)를 야기하는 것들이었다. FAS 유전자를 표적화하는 모든 다섯(5) 개의 인실리코 식별된 gRNA 스페이서 서열을 합성하였다.
2명의 건강한 공여자로부터의 일차 인간 T 세포를 Cas9 뉴클레아제 및 FAS 유전자를 표적화하는 합성 변형된 sgRNA(2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형 포함)(상기 표 5에서의 서열)를 함유하는 리보뉴클레오단백질 입자(RNP) 또는 대조군(Cas9 없음, gRNA 없음)으로 전달감염(전기천공)시켰다. 전달감염 육(6) 일 후, 세포를 유세포 측정(일차 항체: PE Dazzle 594 항-인간 FAS 항체, 클론 DX2, Biolegend)에 의해 처리하여 세포 표면에서의 FAS 발현 수준을 평가하였다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, 상기 표 5에 나열된 gRNA는 모두 소정 수준의 FAS 녹아웃을 야기하였고 gRNA FAS Ex3_T2가 가장 높은 편집 효율을 가졌다.
(ii) FAS KO가 항-BCMA CAR T 세포의 사이토카인 유도 증식을 증가시킴
세포 증식에 대한 FAS 및/또는 CD70 녹아웃의 효과를 평가하기 위해, 항-BCMA CAR T 세포를 이용하였다. 하기 편집된 T BCMA-CAR T 세포군을 생성하였다:
TRAC-/B2M-/항-BCMA CAR+(대조군; 2KO, BCMA CAR+)
TRAC-/B2M-/FAS-/항-BCMA CAR+(3KO(FAS), BCMA CAR+)
TRAC-/B2M-/CD70-/항-BCMA CAR+(3KO(CD70), BCMA CAR+)
TRAC-/B2M-/FAS-/CD70-/항-BCMA CAR+(4KO, BCMA CAR+)
편집된 세포는 CD3+B2M+ 세포의 자기 고갈에 의해 TRAC-/B2M- 세포에 대해 농축되었다. 간략하게, 세포를 15분 동안 4℃에서 100 μL 부피로 1x106개의 세포 당 각각 0.5 μg의, 항-CD3 바이오틴(Biolegend Cat# 300404), 항-β2M 바이오틴(Biolegend Cat# 316308) 항체로 표지하고, 세척하고, 4℃에서 15분 동안 스트렙타비딘 표지된 자기 마이크로비드(Miltenyi Biotech, 130-048-101)와 인큐베이션하였다. 세포를 완충액 중에 재현탁하고 제조업체의 프로토콜에 따라 LS 컬럼(Miltenyi Biotech, 130-042-401)을 통해 통과시켰다.
IL-2/IL-7 유도 T 세포 증식에 대한 FAS 또는 CD70의 효과를 결정하기 위해, 편집된 T 세포(1 x 106개 세포/ml)를 최대 4주 동안 5% 인간 AB 혈청(HP1022, Valley Biomedical), 50 ng/ml의 IL-2(rhIL-2; 130-097-745, Miltenyi Biotech) 및 10 ng/ml의 IL-7(rhIL-7; Cellgenix 001410-050)이 보충된 성장 배지(X-vivo 배지(04-744, Lonza)에서 배양하였다. 표시된 날짜에, 세포를 계수하고 적절한 배양 디쉬에서 1.5 x 106개 세포/ml로 신선 배지 중에 재접종하였다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, FAS 또는 CD70의 녹아웃은 대조군(즉, 내인성 FAS 및 CD70을 포함하는 항-BCMA CAR T 세포)에 비해 시험관내 항-BCMA CAR T 세포의 IL-2/IL-7 유도 증식을 개선하였다. FAS 및 CD70 둘 모두의 녹아웃은 FAS 단독 또는 CD70 단독 녹아웃에 비해 항-BCMA CAR T 세포의 증식 적격성에 대해 상승적 효과를 나타내었다. 도 2b.
(iii) FAS KO가 항-FAS 항체 유도 아폽토시스로부터 항-BCMA CAR T 세포를 구제함
항-FAS 항체에 대한 노출 후에 항-BCMA CAR+ T 세포의 아폽토시스 세포사에 대한 FAS KO의 효과를 평가하였다. 간략하게, FAS-FASL 신호전달 경로를 활성화하기 위해, 항-BCMA CAR+ T 세포를 48 hr 동안 항-FAS 항체(1 μg/ml, BioLegend, Cat No. 305704)에 노출시켰다. 처리 종료 시, 세포의 분취액을 세척하고, 실온에서 15분 동안 아넥신 V 결합 완충액(BioLegend) 중 7-AAD와 함께 형광색소 접합된 아넥신 V로 염색하였다. 이후, 세포를 세척하고, 유세포 측정에 의한 분석을 위해 아넥신 V 결합 완충액에 재현탁하였다.
도 2c에 나타낸 바와 같이, FAS의 결실(FAS KO)은 3KO(TRAC-/B2M-/FAS-) 및 4KO(TRAC-/B2M-/FAS-/CD70-) 세포 둘 모두에서 아폽토시스 세포의 백분율 감소로 실증된 바와 같이, 항-FAS 항체에 의해 유도된 아폽토시스로부터 항-BCMA CAR+ T 세포를 구제하였다.
실시예 3: CD70, TET2, 및 FAS의 삼중 녹아웃이 항-CD19 CAR T 세포의 세포용해 활성을 향상시킴
편집된 항-CD19 CAR T 세포의 제조 후에, CAR T 세포의 기능적 활성을 유세포 측정-기반 세포독성 검정을 이용하여 확인하였다. 항-CD19 CAR의 개시에 대해, 그 관련 개시가 본원에서 언급된 목적 및 요지를 위해 참조로 포함되는 WO2019/097305를 참고한다. 항-CD19 CAR T 세포(TRAC-/ß2M-/CD19 CAR+ 및 TRAC-/ß2M-/CD70-/TET2-/FAS-/CD19 CAR+)를 CD19 발현 암세포주(표적 세포)와 공동-배양하였다. Raji(ATCC ccl-86). 표적 세포를 5 μM efluor670(eBiosciences)으로 표지하고, 세척하고, 다양한 비율(0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1:1의 T 세포:표적 세포)의 TRAC-/ß2M-/항-CD19 CAR+, 또는 TRAC-/ß2M-/CD70-/TET2-/FAS-/ 항-CD19 CAR+와의 공동-배양에서 인큐베이션하였다. 표적 세포를 96웰, U-바닥 플레이트에서 웰당 100,000개의 세포로 접종하였다. 공동-배양을 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 웰을 세척하고, 배지를 5 mg/mL의 DAPI(Molecular Probes)의 1:500 희석액을 함유하는 200 μL의 배지로 대체하였다. 이후, 이십오(25) μL의 CountBright 비드(Life Technologies)를 각각의 웰에 첨가하고, 세포 배양을 유세포 측정에 의해 세포 생활성에 대해 분석하였다(즉, 생활성 세포는 DAPI 염색에 음성임).
이어서 표적 세포(예를 들어, Nalm6 또는 Raji 세포)의 세포 용해%를 하기 식을 사용하여 결정하였다:
세포 용해% = (1-((시험 샘플에서 표적 세포의 총 수) ÷ (대조군 샘플에서 표적 세포의 총 수))x100;
이러한 식에서, 시험 샘플은 (1) TRAC-/ß2M-/CD19 CAR+ T 세포, 또는 (2) TRAC-/ß2M-/CD70-/TET2-/FAS-/항-CD19 CAR+ 세포와 공동-배양된 표적 세포(예를 들어, Raji 세포)를 나타내며; 대조군 샘플은 CAR-T 세포와 공동-배양되지 않은 표적 세포 단독을 나타낸다.
CD70, TET2 및 FAS 유전자의 파괴는 낮은 CAR-T 대 표적 비율로 Raji 세포주에 대한 항-CD19 CAR-T 세포의 향상된 세포용해 활성을 야기했다. 도 3a. 항-CD19 CAR-T 세포(예를 들어, TC1 세포)의 설명에 대해서는 WO2019097305를 참고한다. 이러한 PCT 공보의 관련 개시는 본원에서 언급된 목적 및 요지를 위해 본원에 참조로 포함된다. Raji 세포주에 대한 CD70, TET2 및 FAS 손실에 의해 부여된 활성의 증가는 까다로운 종양 환경에서, 특히 CAR-T 대 종양 비율이 낮을 때, CD70, TET2, 및 FAS 손실이 종양 세포를 박멸하는 데 있어서 CAR-T 세포에 실질적인 이익을 가질 수 있음을 시사한다.
T 세포 은행의 생성 및 세포 은행 증대 후의 연속 편집
또한, CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술의 사용을 인간 T 세포 은행의 생성을 위해 탐색하며, 여기서 초기에 TET2 유전자를 녹아웃시킨 후, 배양에서 4주 동안 추가로 편집한다. 구체적으로는, FAS 세포 표면 사멸 수용체(FAS) 유전자, 및 분화 클러스터 70(CD70) 유전자를 추가적인 1개 또는 2개 이상의 유전자가 결핍된 T 세포를 생성하기 위해 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 4주째에 편집하였다. 최초 편집을 활성화된 일차 인간 T 세포에서 수행하였고, 최초 편집에는 대조군 T 세포(RNP 없음), 및 TET2 Cas9/gRNA RNP 복합체를 가진 T 세포의 전기천공이 포함되었다. 뉴클레오펙션 혼합물은 Nucleofector™ 용액, 5x106개의 세포, 1 μM의 Cas9, 및 5 μM의 gRNA를 함유하였다(문헌[Hendel et al., Nat Biotechnol. 2015; 33(9):985-989, PMID: 26121415]에 기재된 바와 같음).
4주 후 수행된 편집에는 TET2 녹아웃 T 세포, 및 RNP가 없는 대조군 T 세포의 재-전기천공이 포함되었다. 이중 녹아웃 T 세포의 생성을 위해, TET2 녹아웃 세포를 Cas9 단백질 및 하기 sgRNA: FAS 또는 CD70 중 하나를 함유하는 RNP 복합체로 전기천공하였다. 삼중 녹아웃 T 세포의 생성을 위해, TET2 녹아웃 세포를 2개의 상이한 RNP 복합체로 전기천공하였고, 각각의 RNA 복합체는 Cas 단백질 및 하기 sgRNA: FAS 및 CD70 중 하나를 함유하였다. TET2, FAS, 및 CD70 유전자의 유전자 편집에서 사용하기 위한 예시적 gRNA는 아래에서 표 10에 제공된다:
[표 10]
TET2 FAS CD70 gRNA 서열
Figure pct00018
*: 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 잔기
세포 은행의 추가 편집이 세포 증대에 영향을 미치는지를 평가하기 위해, 편집 후 7주 기간에 걸쳐 단일, 이중, 삼중 유전자 편집된 T 세포 중에서의 세포수를 열거하였다(편집되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용함). T 세포의 각각의 유전형에 대해 1x106개 세포를 생성하고 플레이트접종하였다. 전기천공 후, 7주 기간 동안 1주 1회 생활성 세포를 계수하여 세포 증대를 평가하였다. 세포를 완전 배지 중 1x106개 세포/mL로 유지하였다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, 세포 증식(증대)은 편집된 세포 은행 조건에서 두 번째 전기천공 후 계속되었다. 생활성 세포수에 의해 표시된 바와 같이, 단일 TET2(세포 은행), 이중(TET2-/CD70-) 또는 (TET2-/FAS-), 또는 삼중(TET2-/CD70-/FAS) 녹아웃 T 세포 중에서 세포 증식이 관찰되었다. 이들 데이터는 회복 기간 후 T 세포 증식에 의해 측정된 바와 같이 TET2- T 세포 은행에 대한 연속 유전자 편집이 T 세포 건강에 영향을 미치지 않음을 제시한다.
실시예 4: 정맥내 파종성 Nalm-6 인간 급성 림프모구 백혈병 종양 이종이식편 모델에서 동종이계 CAR T 세포에 대한 TET2, FAS 및 CD70 KO의 생체내 효과
파종성 마우스 모델을 이용하여 B2M 및 TRAC뿐만 아니라 TET2, FAS 및/또는 CD70이 없는 동종이계 CAR T 세포의 생체내 유효성을 추가로 평가하였다.
NOG 마우스에서 CD19+ B-ALL 유래 Nalm-6 인간 급성 림프모구 백혈병 종양 세포주를 사용하는 정맥내 파종성 모델(파종성 모델)을 본원에서 개시된 추가적인 유전자 편집(예를 들어, TET2, FAS 및/또는 CD70)이 있거나 없는 항-CD19/TRAC-/B2M- CAR T 세포(항-CD19 CAR T 세포)의 유효성을 실증하기 위해 사용하였다. 항-CD19 CAR T 세포를 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 또한 WO2019/097305를 참고한다.
항-CD19 CAR T 세포의 유효성을 Translations Drug Development, LLC(Scottsdale, AZ)에 의해 이용되고 본원에서 기재된 방법을 사용하여 파종성 모델에서 평가하였다. 간략하게, 40마리의, 5주령 내지 8주령 암컷 CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac) 마우스를 연구 시작 5일 내지 7일 전에 무병원균 조건 하에 유지되는 환기되는 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용하였다. 연구 시작 시, 마우스를 표 11에 나타낸 바와 같이 8개의 처리군으로 나누었다. 마우스에 Nalm6-Fluc-GFP(Nalm6-Fluc-Neo/eGFP--Puro) 세포를 정맥내 접종하여 파종성 질환을 모델링하였다. 1일차에, 모든 마우스가 0.5x106개의 Nalm6 세포/마우스의 정맥내 주사를 제공받았다. 4일차에, 군 2 내지 8은 표 11에 표시된 바와 같이 CAR T 세포(4x106개 CAR+ 세포/마우스)의 정맥내 주사를 제공받았다.
[표 11]
처리군
Figure pct00019
연구 과정 동안 마우스를 매일 모니터링하고 체중을 주 2회 측정하였다. 2, 7, 14, 21, 42 및 50일차에 턱밑샘 방혈(submandibular bleed)에 의해 모든 마우스로부터 혈액 샘플(0.1 ml/마우스)을 수집하여 연구 과정에 걸쳐 CAR T 세포 증대를 평가하였다. 연구 4일차에 시작하여 주 2회 생체발광(BLI; 총 ROI, 광자/s)을 측정하였다. 유의미한 종결점은 사망-근처까지의 시간이었고 T-세포 생착의 효과도 평가하였다. 동물 사망률의 백분율 및 사망까지의 시간을 연구에서 모든 군에 대해 기록하였다. 빈사 상태에 도달하기 전에 마우스를 안락사시켰다. 하기 기준 중 하나 이상이 충족되면 마우스를 빈사 상태로 정의하고 희생시킬 수 있다:
- 1주 초과 기간 동안 지속되는 20% 이상의 체중 감소;
- 섭식, 음용, 운동성, 및 배뇨 및 또는 배변 능력과 같은 정상적인 생리 기능을 억제하는 종양;
- 과도한 체중 감소(20% 이상)를 야기하는 장기간의 과도한 설사; 또는
- 지속적인 천명 및 호흡 곤란.
탈진, 구부린 자세, 마비/부전마비, 복부 팽창, 궤양, 농양, 발작, 및/또는 출혈과 같은 임상적 관찰에 의해 정의되는 장기간 또는 과도한 통증 또는 고통이 있는 경우의 동물도 빈사 상태로 간주하였다.
(i) 생체내 생존율
단독으로 또는 CD70 및/또는 FAS와 조합된, 추가적인 TET2 녹아웃을 갖는 TRAC-/B2M-CAR T 세포를 제공받는 군(군 4, 6 및 8)의 마우스는 미처리(군 1) 및 야생형 TET2 대립유전자를 갖는 TRAC-/B2M- 동종이계 항-CD19 CAR T 세포로 처리된 마우스(군 2) 둘 모두에 비해 생존 증가를 나타내었고, 심지어 치료 후 153일이 지나도록 Nalm6 백혈병에 굴복하지 않았다. CD70 손실(군 3; 항-CD19 CAR/TRAC-/B2M-/CD70-)은 군 2 마우스에 비해 생존을 증가시키지 않았지만, TET2 녹아웃의 추가는 군 2 마우스에 비해 군 6(항-CD19 CAR/TRAC-/B2M-/TET2-/CD70-) 및 군 8(항-CD19 CAR/TRAC-/B2M-/FAS-/TET2-/CD70-)에서 마우스의 생존을 연장하였다. 아래에서 표 12를 참고한다.
[표 12]
CAR-T 세포에 의해 처리된 마우스의 생존 일수
Figure pct00020
동종이계 항-CD19 CAR+/TRAC-/B2M- T 세포에서 관찰된 TET2 KO의 효과가 sgRNA TET2 엑손4 BG4에 특이적이었는지를 평가하기 위해, 별도의 세포 로트를 상이한 건강한 공여자로부터 제조하고 상기와 같이 Nalm6/생체내 모델에서 시험하였다. 하기 sgRNA(TET2 엑손6_BG5, TET2 엑손4_BG4 또는 TET2 엑손3_T1)로 TET2 유전좌위가 파괴된 4x106개 CAR+ 세포로 처리된 마우스는 모두 TRAC-/B2M-/CAR+ T 세포를 제공받은 마우스보다 마우스의 생존을 더 길게 연장하였고(도 5a; 모든 TET2- 군은 TRAC-/B2M-/CAR+ T 세포 대비 통계적으로 유의미한 생존을 나타냄(p=.0021); Log-순위 시험) 경시적으로 감소된 Nalm6-루시퍼라제 활성을 나타내었다(도 5b). 따라서, Tet2는 Nalm6 파종성 마우스 모델에서 CAR T 유효성을 개선하였다.
종합하면, TET2 녹아웃은 현저한 세포 증대를 야기하여, CD19+ 악성종양의 생체내 모델에서 CAR T 세포의 기능 향상을 야기한다. 또한, TET2 KO는 CAR-T 세포가 세포에 추가 이점(예를 들어, 항-아폽토시스/항-노화)을 가질 수 있지만 이들 자체가 이러한 백혈병 모델에서 생존을 연장하지 않는 다른 유전자에서의 편집을 운반할 수 있도록 허용한다.
(ii) 생체내 CAR T 세포 증대
상술된 바와 같이 연구를 통해 수집된 혈액 샘플로부터 단리된 DNA의 ddPCR에 의해 CAR 카피수를 측정하여 CAR T 세포 증대를 평가하였다.
Qiagen Dneasy 혈액 및 조직 키트(Qiagen, Venlo, Netherlands)를 사용하여 마우스 조직으로부터 DNA를 단리하였다. RBC-용해 샘플로부터의 핵산의 총 질량을 Nanodrop(Thermo Fisher Scientific) 또는 DropSense96(trinean, Gentbrugge, Belgium) 기계를 사용하여 정량하였다. 프라이머 및 6-카복시플루오레신(FAM)-표지 탐침 세트(아래에서 표 12에 제공됨)를 액적 디지털 PCR(ddPCR)에 의해 인간 TRAC 유전좌위 내로 통합된 CAR 작제물의 수준을 정량하도록 설계하였다. ddPCR을 Bio-Rad 자동화 액적 생성장치, Bio-Rad T100 열 사이클러, 및 Bio-Rad QX200 액적 판독기(들)(Bio-rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 수행하였다. QuantaSoft 버전 1.7.4.0917(Bio-rad Laboratories) 소프트웨어를 사용하여 샘플 당 통합된 절대 CAR 카피수를 계산하였다. 마지막으로, 검출된 CAR 대립유전자의 수를 입력 총 DNA 양으로 나누어 입력 샘플의 질량 당 절대 CAR 카피수를 컴퓨터로 계산하였다. ddPCR 검정은 내인성 TRAC 서열에 걸친 866 bp 앰플리콘 및 CAR 발현 카세트 프로모터(EF-1α)를 증폭하여 게놈 DNA(gDNA)의 질량 당 통합된 CAR 이식유전자의 카피수를 검출한다. 간략하게, 검정의 정량은 시험된 범위 내(2 내지 300,000개 카피/ug의 gDNA) 선형 데이터(R2>0.95)를 산출했을 뿐만 아니라 ≥ LLOQ 조건에 대해 정상 범위(RE% ≤ 100% 및 CV% ≤ 20%) 내의 상대 오차%(RE%) 및 변동 계수(CV%)를 생성하였다. LLOD 및 LLOQ를 이용 가능한 데이터에 기반하여 계산하고 LLOD를 5개 카피/0.2 μg의 gDNA로 설정하고 LLOQ를 40개 카피/0.2 μg으로 설정하였다.
[표 13]
ddPCR을 위해 사용된 프라이머 및 탐침
Figure pct00021
이들 분석은 TET2 KO의 동종이계 CAR T 세포(TRAC-/B2M-)로의 부가가 TET2 KO 없이 동종이계 CAR T 세포로 처리된 군(예를 들어, 군 2, 3, 5, 및 7)에 비해 처리된 마우스(예를 들어, 군 4, 6, 및 8)의 혈액에서 더 큰 수준으로 T 세포가 증대되는 것을 허용하였음을 실증하였다(도 4). 이러한 증대는 연구의 21일차에 명백하였고 100일을 넘어 지속되었다. FAS KO는 또한 50일차에 명백한 CAR T 세포에 보다 중등도 증대를 제공하는 것으로 드러났다(예를 들어, 군 5 또는 7 대 군 2)(도 4).
종합하면, TET2의 손실을 갖는 모든 군은 말초혈에서 증대된 CAR-T 세포를 가졌고 FAS의 손실을 갖는 군은 상대적으로 이후 시점에 증가된 수준을 나타내었다.
실시예 5: TET2의 녹아웃이 액체 및 고형 종양 모델에서 기능적 CAR-T 세포의 지속성을 증가시킴
TET2 KO가 CAR-T 효능을 증가시키는 기전을 평가하기 위해, CAR T 세포 지속성에 대한 TET2 파괴의 효과를 몇몇 재시험감염 모델에서 조사하였다. CD19+ 악성종양의 재-시험감염 모델에서 NOG 마우스에 첫 번째로 Nalm6-루시퍼라제 세포를 제공하였고 상술된 바와 같이 CAR-T 세포를 투약하였다. 마우스에 3개의 gRNA: TET2 엑손4_BG4, TET2 엑손3_T1, TET2 엑손6_BG5 중 하나를 사용하여 유도된 TET2의 추가적인 파괴를 가진 군과 함께 모두 TRAC-/B2M-인 8x106개 CAR+ CD19 CAR-T 세포를 투약하였다. 미처리 마우스는 백혈병에 빠르게 굴복했으나, 모든 CAR-T 세포군은 30일 기간 내에 최초의 Nalm6-루시퍼라제 백혈병을 제거하였다(도 6a). 연구 35일차에 모든 마우스는 보다 공격적인 암세포주를 사용하여, 두 번째 용량의 암세포를 제공받았다. CD19+ 버키트 림프종 유래 Raji-루시퍼라제 세포주를 정맥내(i.v.)로 마우스 당 0.5x106개 세포로 마우스 내로 주사하였다. 나이브 마우스(Nalm-luc 세포를 제공받지 않은 마우스)는 Raji 림프종에 빠르게 굴복한다. 그러나, TRAC-/B2M-/TET2- 세포를 제공받은 후 Nalm6 종양을 이전에 제거한 마우스는 TRAC-/B2M- CAR T 세포만을 제공받은 마우스보다 두 번째 종양을 더 잘 제어하였다(도 6a). 이들 데이터는 TET2 파괴가 기능적 CAR-T 세포의 계속된 지속성을 허용한다는 증거를 제공한다. 몇몇 구별되는 sgRNA로 편집된 세포가 유사한 결과를 제공하였으므로 이러한 효과는 파괴된 TET2 게놈 절편과 무관하다.
TET2 KO가, 상이한 CAR 작제물(항-BCMA CAR)의 맥락에서 상이한 액체 종양 모델(다발 골수종)에서의 CAR-T 세포의 지속성을 증가시키는 능력을 평가하기 위해, CAR- T 세포를 표적화하는 BCMA를 건강한 공여자로부터 제조하였다. 항-BCMA CAR T 세포를 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다. TRAC-/B2M- 및 TRAC-/B2M-/TET2-인 CAR-T 세포군을 제조하였다(TET2 엑손4_BG4, TET2 엑손6_BG5 또는 TET2 엑손5_T1 sgRNA를 사용함). 초기에, NOG 마우스의 오른쪽 넙다리에 1x107개 다발 골수종 유래 RPMI-8226 세포를 피하 접종하였다. 9일 후, 종양이 촉진 가능해진 경우, 1x106개 CAR+ 세포를 i.v. 주사하였다. 미처리 마우스는 종양 종결점(2000 mm3)에 빠르게 굴복한 반면, TRAC-/B2M- 및 TRAC-/B2M-/TET2- 군 둘 모두는 일차 RPMI-8226 종양을 효율적으로 제거하였다(도 6b). 연구 32일차에 CAR+ T 세포로 이전에 처리된 마우스는, 마우스의 왼쪽 넙다리 내로 1x107개 신선 RPMI-8226 세포를 주사함으로써, 종양 재-시험감염을 거쳤다. 새로운 군의 나이브 마우스는 왼쪽 넙다리 내로 1x107개 신선 RPMI-8226 세포를 주사하였다(미처리군). TRAC-/B2M- BCMA-CAR-T 세포는 어느 정도까지 재-시험감염을 제어할 수 있었으나, TRAC-/B2M-/TET2- BCMA-CAR-T 세포는 이들 새로운 종양 세포를 빠르게 제거하였다(도 6c). 종합하면 TET2 파괴는 CAR-T 세포가 여러 액체 종양 모델에서의 공격적 재-시험감염 모델에서 더 오래 지속될 수 있도록 허용한다. 이는 상이한 암 항원을 표적화하는 여러 CAR T 세포에 효과를 미친다.
TET2 손실이 고형 종양에서 CAR-T 세포의 지속성을 증가시키는 능력을 평가하기 위해, CD70 표적화 CAR T 세포(항-CD70 CAR T 세포)를 건강한 공여자로부터 제조하였다. TRAC-/B2M-/CD70- 및 TRAC-/B2M-/CD70-/TET2-(예를 들어: TET2 엑손4) BG4 sgRNA)인 CAR-T 세포군을 제조하였다. 초기에, NOG 마우스의 오른쪽 넙다리에 5x106개 신장 세포 암종(RCC) 유래 A498 세포를 피하 접종하였다. 종양이 500 mm3에 도달한 경우, 1x107개 CAR-T 세포를 i.v. 주사하였다. 미처리 마우스는 종양 종결점(2000 mm3)에 빠르게 굴복한 반면, TRAC-/B2M-/CD70- 및 TRAC-/B2M-/CD70-/TET2- 둘 모두는 일차 A498 종양을 효율적으로 제거하였다(도 6d). 연구 54일차에 마우스의 왼쪽 넙다리 내로 5x106개 RCC-유래 Caki-1 세포를 주사하여, 마우스가 종양 재-시험감염을 거치게 하였다. 새로운 군의 나이브 마우스는 왼쪽 넙다리 내로 1x107개 신선 RPMI-8226 세포를 주사하였다(미처리군). TRAC-/B2M-/CD70-/CD70-/CAR-T 세포는 Caki-1 종양의 중등도 제어를 나타낸 반면, TRAC-/B2M-/CD70-/TET2-/CD70-/CAR-T 세포는 이들 종양 세포를 빠르게 제거하였다(도 6e). 종합하면 TET2 파괴는 CAR-T 세포가 액체 및 고형 종양 둘 모두의 공격적 재-시험감염 모델에서 더 오래 지속될 수 있도록 허용한다.
실시예 6. TET2 결핍 CAR-T 세포가 성장을 위해 사이토카인에 좌우됨.
TET2가 없는 CAR-T 세포의 종양형성 잠재력을 평가하기 위해, TRAC-/B2M-이고 TET2에 대해 야생형이거나 TET2가 파괴된 항-CD19 CAR T 세포를 생성하였다(TET2 파괴는 TET2 엑손4_BG4, TET2 엑손6_BG5, TET2-엑손5_T1을 사용하여 생성함). 이후 세포를 사용하여 게놈 편집된 세포가 배양 중 성장 인자 및/또는 사이토카인 독립적 성장을 나타내는 능력에 대해 평가하였다. 2 x 106개 세포를 완전 T 세포 배지(5% 인간 혈청 + IL2 및 IL7 함유) 또는 혈청을 함유하지만 IL-2 및 IL-7이 없는 배지 중에 배치하였다. 이어서 세포를 트립판 블루 및 무색 자동화 세포 계수기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 매주 계수하였다. 모든 군의 세포가 혈청 및 사이토카인을 함유하는 배지 중에 성장할 수 있었으나, 어느 군으로부터도 6주 기간을 초과하는 생장은 검출되지 않았다. 도 7. 이들 데이터는 인간 말초혈 유래 T 세포가 이의 성장을 위해 사이토카인에 계속 좌우되므로, TET2 파괴가 이들 세포의 직접적 종양형성 암화를 야기하지 않음을 실증한다.
실시예 7. TET-2 가이드 RNA의 표적-상 및 표적-이외 편집
다양한 TET2-표적화 gRNA의 표적-상 및 표적-이외 편집 효율을 상기 실시예 1에 개시된 방법에 따라 조사하였다. 간략하게, 일차 인간 PBMC 세포로부터 유래된 활성화된 T 세포를 Cas9 뉴클레아제 및 TET2 유전자를 표적화하는 합성 변형된 sgRNA(상기 표 3에서의 서열)를 함유하는 리보뉴클레오단백질 입자(RNP) 또는 대조군(Cas9 없음, gRNA 없음)으로 전달감염(전기천공)시켰다. 전달감염 육(6) 일 후, 세포를 면역블로팅하여 단백질 발현에 대한 표적-상 TET2 편집의 효과를 평가하였다.
게놈 표적-상 및 표적-이외 평가를 위해, 동일한 전기천공 방법을 사용하여 2명의 상이한 공여자 T 세포(1 및 2로 명명됨)로부터의 2개의 편집된 세포의 세포 집단을 생성하였다. 세포를 표 3 및 14에 나열된 7개 가이드 각각으로 유전자 편집한 후, 전달감염 육(6) 일 후에 수집하였다. 이들 샘플을 차세대 시퀀싱과 조합된, 표적-상 및 표적-이외 부위를 농축하기 위한 상동성-의존적 방법인 하이브리드 포획으로 분석하였다. 간략하게, 각각의 gRNA 표적 부위에 대해 상동성을 갖는 표적-상 및 표적-이외 부위를 컴퓨터를 사용하여 식별하고, 단일-가닥 RNA 탐침을 사용하여 벌크 게놈 DNA로부터 이들 부위를 농축하고, 이들 농축된 부위를 차세대 시퀀싱으로 서열분석하고, 데이터를 CRISPR/Cas9-매개 유전자 편집 후 복구를 시사하는 삽입 및 결실에 대해 분석하였다.
결과는 아래에서 표 14에 제공된다.
[표 14]
하이브리드 포획에 의한 표적 상 및 표적 이외 결과
Figure pct00022
a 공여자 1 및 2에 걸친 평균.
T 세포에서의 표적-상 삽입결실 프로필의 분석
표적-이외 편집을 정량하기 위해 사용된 데이터를 또한 표 14에 나열된 모든 TET2 가이드에 대해 가장 빈번한 표적-상 삽입결실을 정량하고 요약하기 위해 사용하였다. 이러한 데이터를 2명의 공여자(공여자 1 및 공여자 2로 명명됨)에서 차세대 시퀀싱과 조합된 TET2 유전좌위의 하이브리드 포획으로부터 생성하였다.
유전자 편집 후, TET2- T 세포를 생성하기 위한 CRISPR/Cas9 유전자 편집 후 T 세포 집단에서의 TET2 유전좌위의 하이브리드 포획 분석은 TET2 유전좌위에서의 특정한 삽입결실 빈도 및 편집된 유전자 서열을 생성한다(표 15 내지 21; 결실은 대시선으로 및 삽입은 볼드체로).
하이브리드 포획 데이터로부터의 개체 서열 정량이라는 목적을 위해, 절단 부위의 20 bp 상류 및 하류, TET2 표적-상 부위에 걸쳐 정렬되는 서열 판독을 선택하고, 삽입결실 서열 정량을 위해 고려하였다. 선택된 판독으로부터, 각각의 추정 절단 부위(PAM의 약 3 bp 상류(Jinek, et al., Science 2012)의 10 bp 상류 및 하류 내 서열을 표적-상 비-상동성 말단 연결(NHEJ) 편집의 대표 영역으로서 정량하였다. 이들 표적-상 유전자 편집된 서열 상의 데이터를 각각의 절단 부위의 20 bp 상류 및 하류 내 표적-상 부위에 걸친 모든 서열의 %를 나타내는 이들 서열의 빈도와 함께 아래에서 표에 제시한다. 각각의 가이드에 대한 삽입결실을 표 15 내지 21에서 표적-상 참조 서열에 대비하여 나타낸다. 참조 서열은 PAM의 4 bp 3'에서 끝나는, 양 방향 중 어느 방향으로든 10 bp를 갖고, 절단 부위가 중심에 있다.
[표 15]
TET2-엑손3-T1 gRNA에 대한 적어도 1명의 유전자 편집된 T 세포 공여자에서 1% 초과 빈도의 표적-상 유전자 편집된 서열.
Figure pct00023
a 양 방향 중 어느 방향으로든 10 bp를 갖고, 절단 부위가 중심에 있는 표적-상 서열. 비교를 위해, 참조 표적-상 서열과 정렬되는 gRNA 표적 서열 부분에는 밑줄이 그어지고, PAM은 괄호로 표시된다.
b 결실은 대시선(-)으로 표시됨; 삽입은 볼드체로 표시됨
c 참조 서열에서 대시선(-)으로 표시된 유전자 편집된 서열에서 삽입된 염기의 위치
[표 16]
TET2-엑손3-T2 gRNA에 대한 적어도 1명의 유전자 편집된 T 세포 공여자에서 1% 초과 빈도의 표적-상 유전자 편집된 서열.
Figure pct00024
a 양 방향 중 어느 방향으로든 10 bp를 갖고, 절단 부위가 중심에 있는 표적-상 서열. 비교를 위해, 참조 표적-상 서열과 정렬되는 gRNA 표적 서열 부분에는 밑줄이 그어지고, PAM은 괄호로 표시된다.
b 결실은 대시선(-)으로 표시됨; 삽입은 볼드체로 표시됨
c 참조 서열에서 대시선(-)으로 표시된 유전자 편집된 서열에서 삽입된 염기의 위치
[표 17]
TET2-엑손3-T3 gRNA에 대한 적어도 1명의 유전자 편집된 T 세포 공여자에서 1% 초과 빈도의 표적-상 유전자 편집된 서열.
Figure pct00025
a 양 방향 중 어느 방향으로든 10 bp를 갖고, 절단 부위가 중심에 있는 표적-상 서열. 비교를 위해, 참조 표적-상 서열과 정렬되는 gRNA 표적 서열 부분에는 밑줄이 그어지고, PAM은 괄호로 표시된다.
b 결실은 대시선(-)으로 표시됨; 삽입은 볼드체로 표시됨
c 참조 서열에서 대시선(-)으로 표시된 유전자 편집된 서열에서 삽입된 염기의 위치
[표 18]
TET2-엑손6-BG5 gRNA에 대한 적어도 1명의 유전자 편집된 T 세포 공여자에서 1% 초과 빈도의 표적-상 유전자 편집된 서열.
Figure pct00026
a 양 방향 중 어느 방향으로든 10 bp를 갖고, 절단 부위가 중심에 있는 표적-상 서열. 비교를 위해, 참조 표적-상 서열과 정렬되는 gRNA 표적 서열 부분에는 밑줄이 그어지고, PAM은 괄호로 표시된다.
b 결실은 대시선(-)으로 표시됨; 삽입은 볼드체로 표시됨
c 참조 서열에서 대시선(-)으로 표시된 유전자 편집된 서열에서 삽입된 염기의 위치
[표 19]
TET2-엑손5-T1 gRNA에 대한 적어도 1명의 유전자 편집된 T 세포 공여자에서 1% 초과 빈도의 표적-상 유전자 편집된 서열.
Figure pct00027
a 양 방향 중 어느 방향으로든 10 bp를 갖고, 절단 부위가 중심에 있는 표적-상 서열. 비교를 위해, 참조 표적-상 서열과 정렬되는 gRNA 표적 서열 부분에는 밑줄이 그어지고, PAM은 괄호로 표시된다.
b 결실은 대시선(-)으로 표시됨; 삽입은 볼드체로 표시됨
c 참조 서열에서 대시선(-)으로 표시된 유전자 편집된 서열에서 삽입된 염기의 위치
[표 20]
TET2-엑손5-T2 gRNA에 대한 적어도 1명의 유전자 편집된 T 세포 공여자에서 1% 초과 빈도의 표적-상 유전자 편집된 서열.
Figure pct00028
a 양 방향 중 어느 방향으로든 10 bp를 갖고, 절단 부위가 중심에 있는 표적-상 서열. 비교를 위해, 참조 표적-상 서열과 정렬되는 gRNA 표적 서열 부분에는 밑줄이 그어지고, PAM은 괄호로 표시된다.
b 결실은 대시선(-)으로 표시됨; 삽입은 볼드체로 표시됨
c 참조 서열에서 대시선(-)으로 표시된 유전자 편집된 서열에서 삽입된 염기의 위치
[표 21]
TET2-엑손4-BG4 gRNA에 대한 적어도 1명의 유전자 편집된 T 세포 공여자에서 1% 초과 빈도의 표적-상 유전자 편집된 서열.
Figure pct00029
a 양 방향 중 어느 방향으로든 10 bp를 갖고, 절단 부위가 중심에 있는 표적-상 서열. 비교를 위해, 참조 표적-상 서열과 정렬되는 gRNA 표적 서열 부분에는 밑줄이 그어지고, PAM은 괄호로 표시된다.
b 결실은 대시선(-)으로 표시됨; 삽입은 볼드체로 표시됨
c 참조 서열에서 대시선(-)으로 표시된 유전자 편집된 서열에서 삽입된 염기의 위치
실시예 8. 항-BCMA CAR-T 세포에서의 TET2 녹아웃이 성장 이점 및 CAR-T 농축을 부여함
키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 치료법은 암세포를 보다 특이적이고 효율적으로 표적화하고 사멸시키기 위해 유전적으로 변형된 T 세포를 사용한다. 혈액으로부터 T 세포가 수집된 후, 세포는 이의 표면 상에 CAR을 포함하도록 조작된다. CAR은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용해 T 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 동종이계 CAR T 세포가 환자 내로 주사되는 경우, 수용체는 T 세포가 암세포를 사멸시킬 수 있게 한다.
본 실시예는 CAR-T 세포에서 유전자 편집을 통한 TET2 녹아웃으로 인해 일어나는, 예를 들어, 다회 표적 항원 자극으로 일어나는 유리한 특징을 추가로 탐색한다.
(I) TET2 KO(TET2-) 또는 TET2 WT(TET2+) 항-BCMA CAR-T 세포 생성
활성화된 일차 인간 T 세포를 Cas9:TET2 sgRNA 1 RNP 복합체로 전기천공하여(EP1) 폴리클로날 TET2 KO 집단을 생성하였다. 72시간 후 이들 세포 또는 야생형(WT)의 활성화된 일차 T 세포를 Cas9: gRNA RNP 복합체(RNP) 및 아데노-연관 아데노바이러스 벡터(AAV)로 다시 전기천공하여(EP2) TET2-/TRAC-/β2M-/항-BCMA CAR+(TET2-/항-BCMA CAR) 또는 TRAC-/β2M-/항-BCMA CAR+ T 세포(TET2+/항-BCMA CAR)를 생성하였다. AAV 또는 RNP가 EP2에서 제외된 2개의 대조군(각각 TET2-/AAV- 및 TET2-/RNP-)을 생성하였다. 항-BCMA CAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO: 149) 중 하나를 포함하는 재조합 AAV 혈청형 6(AAV6)을 활성화된 동종이계 인간 T 세포에 Cas9:sgRNA RNP(1 μM Cas9, 5 μM gRNA)와 함께 전달하였다. 하기 sgRNA를 사용하였다: TET2(SEQ ID NO: 13), TRAC(SEQ ID NO: 93) 및 β2M(SEQ ID NO: 97).
전기천공(EP1) 약 일(1) 주 후, 세포를 1:500 희석도로 항-TET2 폴리클로날 항체(Diagenode #C15410255-100)를 사용하여 자동화 웨스턴 블롯(WesTM, Proteinsimple)에 의해 TET2 단백질 녹다운에 대해 평가하였다. 이러한 검정으로부터 수득된 결과는 TET2 KO(TET2-) 항-BCMA CAR-T 세포에서 TET2의 검출 부재를 확인시켜주는 반면, 대조군 세포 및 TET2 WT(TET2+) 항-BCMA CAR-T 세포에서는 TET2 발현이 검출되었다.
EP2 후 9일차에 세포를 또한 유세포 측정을 위해 처리하여 편집된 세포 집단의 세포 표면에서의 TRAC 및 β2M 녹아웃 수준, 및 항-BCMA CAR 발현 수준을 평가하였다. 세포를 아래에서 표 22에 나타낸 항체 패널로 염색하였다.
[표 22]
CAR-T 세포 표면 단백질을 검출하기 위한 항체 패널
Figure pct00030
결과를 아래에서 표 23에 나타낸다. 모든 항-BCMA CAR-T 세포 및 TRAC-/β2M- 대조군 세포(TET2-/AAV-)에 있어서, 생활성 세포의 85% 초과에서 TCR의 발현이 없었고 74% 초과에서 β2M의 발현이 없었고, 72% 초과의 항-BCMA CAR-T 세포 집단은 TRAC-/B2M- 둘 모두였다. 살아있는 CAR-T 세포를 전방 산란(FSC) 및 측방 산란(SSC) 프로필에 의해, 및 7-AAD 염료로 관문화하였다.
[표 23]
EP2 후 9일째에 표면 항-BCMA CAR 발현 및 TRAC/B2M 녹다운의 양성 집단%
Figure pct00031
(II). TET2 KO(TET2-) 또는 TET2 WT(TET2+) 항-BCMA CAR-T 세포의 항원 자극
상이한 세포 집단을 CAR 발현 결정 후 1주 동안 증대시켰다. 이어서 각각의 CAR-T 집단(TET2-/항-BCMA CAR-T, TET2+/항-BCMA CAR-T, TET2-/AAV- 및 TET2-/RNP-)의 백만 개 세포를 완전 T 세포 배지 중 12-웰 조직 배양 플레이트에서, 3개씩, 1:1 E:T 비율로 표적 세포주 MM.1S와 공동-배양하고, 모든 표적 세포가 공동배양된 CAR-T 세포에 의해 사멸되었음을 확실히 하기 위해 이전에 확립된 충분한 시기인 48시간(자극 1회) 또는 72시간(자극 2회 및 3회) 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 자극 후, CAR-T 세포를 수집하고, 세척하고, 트립판 블루로 계수하고(생활성 평가를 위해), 3개씩 1:1의 E:T로 신선 표적 세포와 함께 백만 개 세포/웰로 재플레이트접종하는 총 3회 자극을 수행하였다. 추가적으로, 일부 세포를 아래에서 표 24에 나타낸 항체 패널을 사용하여 FACS에 의해 CAR-T 발현에 대해 평가하였다. 3회 자극 후, CAR-T 세포를 수집하고 증대시켜 성장 및 생활성%를 모니터링했을 뿐만 아니라 표 24에 나타낸 항체 패널을 사용하여 표면 CAR 발현의 주기적 FACS 평가를 수행하였다.
[표 24]
CAR-T 세포 표면 단백질을 검출하기 위한 항체 패널
Figure pct00032
이들 항-BCMA CAR-T 집단의 증대된 배양 결과는 T 세포에서 TET2의 녹아웃이 전반적 생활성에서 유의차 없이(도 8b), 표적 세포주로 자극된 CAR-T 세포에 증식 이점을 부여함(도 8a)을 시사한다. 또한, TET2+/항-BCMA CAR-T 세포 또는 비자극 세포에 비해 TET2 KO 세포에서 BCMA CAR-T 양성 세포의 우선적 농축이 관찰되었다(도 8c).
(III). TET2 KO 항-BCMA CAR-T 세포(TET2-/항-BCMA CAR T) 및 TET2 WT 항-BCMA CAR-T 세포(TET2+/항-BCMA CAR T) 간 기능적 특징의 비교
각 회의 표적 세포 자극 후 인터페론 감마(IFNγ)에 대한 사이토카인 방출 검정을 사용하여 항-BCMA CAR T 세포의 기능적 활성(효과기 사이토카인 분비에 의해 입증됨)을 평가하였다. 상기-언급된 공동배양 기간 후, 공동-배양된 세포로부터의 상청액 배지를 수집하고 제조업체의 지침에 따라 ELISA(RD Systems)를 사용하여 IFNγ 수준을 측정하였다. 자기 마이크로스피어인 HCYIFNG-MAG(Millipore, catalog # HCYIFNG-MAG)를 사용하는 MILLIPLEX 키트(Millipore, catalog # HCYTOMAG-60K)를 사용하여 공동배양된 자극 검정으로부터 샘플 중 IFN-γ 분비를 정량하였다. 검정은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.
간략하게, MILLIPLEX® 표준 및 품질 제어(QC) 샘플을 재구성하고, 10,000 pg/mL에서 3.2 pg/mL까지 작업 표준의 연속 희석액을 제조하였다. MILLIPLEX® 표준, QC, 및 세포 상청액을 각각의 플레이트에 첨가하고, 검정 배지를 사용하여 상청액을 희석하였다. 모든 샘플을 2시간 동안 HCYIFNG-MAG 비드와 인큐베이션하였다. 배양 후, 자동화 자기 플레이트 세척기를 사용해 플레이트를 세척하였다. 인간 사이토카인/케모카인 검출 항체 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션한 후 스트렙타비딘-피코에리트린과 함께 30분 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고, 샘플을 150 μL의 시스 유체(Sheath Fluid)로 재현탁하고, 플레이트 진탕기에서 5분 동안 진탕하였다. xPONENT® 소프트웨어가 설치된 Luminex® 100/200™ 기기를 사용하여 샘플을 판독하고, MILLIPLEX® 애널리스트 소프트웨어를 사용하여 데이터 획득 및 분석을 완료하였다. 미지 샘플에서 측정된 사이토카인 농도를 계산하는 5-매개변수 로지스틱 곡선 피팅 방법을 사용하여 중앙값 형광 세기(MFI) 데이터를 자동 분석한다.
결과는 이들 조건 하에 다회 표적 세포주 자극 후 TET2 KO를 갖거나 갖지 않는 항-BCMA CAR-T 세포에서 IFNγ 분비에 유의차가 없음을 나타내었다(도 8d). 대조군 세포 TCR-/ß2M-(AAV 음성) 및 비-CAR 편집(RNP 음성)은 MM1S 세포의 존재 하에 유의미하거나 특이적인 IFNγ 분비 반응을 나타내지 않았다.
요약하면, 상술된 연구는 하기를 나타낸다: (a) TET2 KO 항-BCMA CAR-T 세포(TET2-/항-BCMA CAR T)는 MM1S 항원 자극 후 TET2 WT 항-BCMA CAR T 세포(TET2+/항-BCMA CAR T) 대비 성장 이점을 나타내었고; (b) TET2 KO 항-BCMA CAR-T 세포는 항원 자극 후 TET2 WT 항-BCMA CAR T 세포에 비해 항-BCMA CAR 양성 세포에 대한 농축을 나타내었고; (c) TET2 KO는 다회 항원 자극으로 TET2 WT 항-BCMA CAR T 세포에 비해 항-BCMA CAR-T 기능적 활성(IFNγ 분비)을 변경하지 않았다. 이들 결과는 CAR-T 세포에서의 TET2 녹아웃 조작이(본원에서 일례로 항-BCMA CAR-T 세포를 사용함) 성장 이점 및 CAR-T 농축 효과 둘 모두를 부여함을 실증하였다. 이는 유전자 편집에 의한 시험관내 CAR-T 세포 증식의 부양이 실현 가능하며, 기능을 손상시키지 않고 더 높은 CAR-T 수율이 가능한 세포 은행을 생성하기 위해 사용될 수 있다는 개념 증명의 증거를 제공한다.
실시예 9. FAS 가이드 RNA의 표적-상 및 표적-이외 편집
다양한 FAS-표적화 gRNA의 표적-상 및 표적-이외 편집 효율을 가장 높은 유전자 편집 효율을 나타내는 3개의 가이드 FAS-ex2-T2, FAS-ex3_T1, FAS-ex3_T2에 대해 조사하였다(도 2a 참고). 간략하게, 일차 인간 PBMC 세포로부터 유래된 활성화된 T 세포를 Cas9 뉴클레아제 및 FAS 유전자를 표적화하는 합성 변형된 sgRNA(상기 표 5에서의 서열)를 함유하는 리보뉴클레오단백질 입자(RNP)로 전달감염(전기천공)시키거나 미처리 대조군(전기천공 없음, Cas9 없음, gRNA 없음)으로서 제조하였다.
게놈 표적-상 및 표적-이외 평가를 위해, 동일한 전기천공 방법을 사용하여 2명의 상이한 공여자 T 세포(1 및 2로 명명됨)로부터의 2개의 편집된 세포의 세포 집단을 생성하였다. 세포를 표 5에 나열된 상위 3개의 가이드로 유전자 편집한 후, 전달감염 십(10) 일 후에 수집하였다. 이들 샘플을 차세대 시퀀싱과 조합된, 표적-상 및 표적-이외 부위를 농축하기 위한 상동성-의존적 방법인 하이브리드 포획으로 분석하였다. 간략하게, 각각의 gRNA 표적 부위에 대해 상동성을 갖는 표적-상 및 표적-이외 부위를 컴퓨터를 사용하여 식별하고, 단일-가닥 RNA 탐침을 사용하여 벌크 게놈 DNA로부터 이들 부위를 농축하고, 이들 농축된 부위를 차세대 시퀀싱으로 서열분석하고, 데이터를 CRISPR 편집 후 복구를 시사하는 삽입 및 결실에 대해 분석하였다.
결과는 아래에서 표 25에 제공된다.
[표 25]
하이브리드 포획에 의한 표적 상 및 표적 이외 결과
Figure pct00033
a 공여자 1 및 2에 걸친 평균.
T 세포에서의 표적-상 삽입결실 프로필의 분석
표적-이외 편집을 정량하기 위해 사용된 데이터를 또한 표 25에 나열된 모든 FAS 가이드에 대해 가장 빈번한 표적-상 삽입결실을 정량하고 요약하기 위해 사용하였다. 이러한 데이터를 2명의 공여자(공여자 1 및 공여자 2로 명명됨)에서 차세대 시퀀싱과 조합된 FAS 유전좌위의 하이브리드 포획으로부터 생성하였다.
유전자 편집 후, FAS- T 세포를 생성하기 위한 CRISPR/Cas9 유전자 편집 후 T 세포 집단에서의 FAS 유전좌위의 하이브리드 포획 분석은 FAS 유전좌위에서의 특정한 삽입결실 빈도 및 편집된 유전자 서열을 생성한다(표 26 내지 28; 결실은 대시선으로 및 삽입은 볼드체로).
하이브리드 포획 데이터로부터의 개체 서열 정량이라는 목적을 위해, 절단 부위의 20 bp 상류 및 하류, FAS 표적-상 부위에 걸쳐 정렬되는 서열 판독을 선택하고, 삽입결실 서열 정량을 위해 고려하였다. 선택된 판독으로부터, 각각의 추정 절단 부위(PAM의 약 3 bp 상류(Jinek, et al., Science 2012)의 10 bp 상류 및 하류 내 서열을 표적-상 비-상동성 말단 연결(NHEJ) 편집의 대표 영역으로서 정량하였다. 이들 표적-상 유전자 편집된 서열 상의 데이터를 각각의 절단 부위의 20 bp 상류 및 하류 내 표적-상 부위에 걸친 모든 서열의 %를 나타내는 이들 서열의 빈도와 함께 아래에서 표에 제시한다. 각각의 가이드에 대한 삽입결실을 표 22 내지 24에서 표적-상 참조 서열에 대비하여 나타낸다. 참조 서열은 PAM의 4 bp 3'에서 끝나는, 양 방향 중 어느 방향으로든 10 bp를 갖고, 절단 부위가 중심에 있다.
[표 26]
FAS-엑손2-T2 gRNA에 대한 적어도 1명의 유전자 편집된 T 세포 공여자에서 1% 초과 빈도의 표적-상 유전자 편집된 서열.
Figure pct00034
a 양 방향 중 어느 방향으로든 10 bp를 갖고, 절단 부위가 중심에 있는 표적-상 서열. 비교를 위해, 참조 표적-상 서열과 정렬되는 gRNA 표적 서열 부분에는 밑줄이 그어지고, PAM은 괄호로 표시된다.
b 결실은 대시선(-)으로 표시됨; 삽입은 볼드체로 표시됨
c 참조 서열에서 대시선(-)으로 표시된 유전자 편집된 서열에서 삽입된 염기의 위치
[표 27]
FAS-엑손3-T1 gRNA에 대한 적어도 1명의 유전자 편집된 T 세포 공여자에서 1% 초과 빈도의 표적-상 유전자 편집된 서열.
Figure pct00035
a 양 방향 중 어느 방향으로든 10 bp를 갖고, 절단 부위가 중심에 있는 표적-상 서열. 비교를 위해, 참조 표적-상 서열과 정렬되는 gRNA 표적 서열 부분에는 밑줄이 그어지고, PAM은 괄호로 표시된다.
b 결실은 대시선(-)으로 표시됨; 삽입은 볼드체로 표시됨
c 참조 서열에서 대시선(-)으로 표시된 유전자 편집된 서열에서 삽입된 염기의 위치
[표 28]
FAS-엑손3-T2 gRNA에 대한 적어도 1명의 유전자 편집된 T 세포 공여자에서 1% 초과 빈도의 표적-상 유전자 편집된 서열.
Figure pct00036
a 양 방향 중 어느 방향으로든 10 bp를 갖고, 절단 부위가 중심에 있는 표적-상 서열. 비교를 위해, 참조 표적-상 서열과 정렬되는 gRNA 표적 서열 부분에는 밑줄이 그어지고, PAM은 괄호로 표시된다.
b 결실은 대시선(-)으로 표시됨; 삽입은 볼드체로 표시됨
c 참조 서열에서 대시선(-)으로 표시된 유전자 편집된 서열에서 삽입된 염기의 위치
실시예 10. 동종이계 인간 CD19 CAR-T 세포주의 유도
비장세포를 TRAC-/B2M-/FAS-/TET2-/CD70- 항 CD19 CAR-발현 T 세포(건강한 인간 공여자의 말초혈 T 세포로부터 생성됨)가 투약된 3마리 마우스로부터 단리하였다. 이들 마우스는 주입 후 3개월 초과 동안 Nalm6 백혈병을 제어하였다. 단리된 비장세포를 IL2/IL7 및 인간 혈청을 함유하는 인간 T 세포 배지 중에 배양하고 세포의 생장을 모니터링하였다. 마우스 비장 단리물 중 하나로부터의 세포가 경시적인 생장을 나타내었다(이들 세포는 단리된 세포로 나타냄). 이들 단리된 세포는 >99% TRAC-/B2M-/CAR+였고 배양 2개월 후 FAS, CD70, TET2에서 높은 빈도의 삽입결실과 더불어 CD4 표현형을 가졌다. 보다 구체적으로, FACS 분석은 시험된 세포 집단에서 97.8%가 살아있는 세포이고, 99.1%가 TCR 및 B2M 음성이고, 99.1%가 CAR 양성이고, 99.8%가 CD4 양성임을 나타내었다.
단리된 세포는 인간 사이토카인 IL2 및 IL7에 대한 이의 의존성을 유지하였다(도 9a). 이들 세포는 또한 CD19+ 세포를 사멸시키는 이의 능력을 보유하며(도 9b) 시험관내 세포독성 및 사이토카인 방출 기능을 추가로 유지하였다(각각 도 9c 및 9d). 다시 단리된 세포를 Nalm6-백혈병 모델 내로 재주사하였고 TRAC-/B2M-/항-CD19 CAR T 세포의 신선 로트에 필적하는 유효성을 나타내었다. (도 9e).
단리된 세포를 이용한 이러한 제2회 생체내 시험 후, 세포를 다시 1마리 마우스로부터 단리하고 사이토카인 함유 배지 중 몇 주 동안 추가로 배양하였다/증대시켰다. 이들 재단리된 세포는 최초의 생체내 단리로부터의 세포와 동일한 표현형을 유지하였다. 재단리된 세포를 두 번째 실험에서 사용하여 Nalm6 백혈병을 제어하는 이의 능력을 평가하였다.
본 실시예는 지속적 T 세포주가 시험관내 및 생체내 기능성을 유지하고 세포 은행 및/또는 치료제로서 작용할 잠재력을 갖는 건강한 정상 공여자(예를 들어, 인간 공여자) 유래 말초혈 T 세포로부터 생성될 수 있음을 제시한다.
기타 구현예
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대안적 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 동등하거나 유사한 특징의 일반 시리즈의 일례일 뿐이다.
이상의 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 용이하게 확인할 수 있고, 그 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 맞추기 위해 다양한 변경 및 변형을 가할 수 있다. 따라서, 기타 구현예도 청구범위 내이다.
균등물
몇 가지 본 발명의 구현예를 본원에서 설명하고 예시하였지만, 당업자는 본원에서 기재된 기능을 수행하고/하거나 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 수득하기 위한 다양한 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 것이며, 이러한 변경 및/또는 변형 각각은 본원에서 기재된 본 발명의 구현예의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 당업자는 본원에서 기재된 모든 매개변수, 치수, 재료, 및 구성이 예시를 나타낸다는 것과 실제 매개변수, 치수, 재료, 및/또는 구성이 본 발명의 교시가 사용되는 특정 적용 또는 적용들에 좌우될 것임을 쉽게 이해할 것이다. 당업자는 본원에서 기재된 특정의 본 발명의 구현예에 대한 많은 균등물을 통상적인 실험을 사용하는 것만으로도 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 구현예는 단지 예로서 제시된 것이고, 첨부된 청구범위 및 그에 대한 균등물의 범위 내에서 본 발명의 구현예가 구체적으로 설명되고 청구된 것과 다르게 실시될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명의 구현예는 본원에서 기재된 각각의 개별 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 2개 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법의 임의의 조합은, 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는 한, 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에서 정의되고 사용되는 모든 정의는 사전적 정의, 참조로 포함되는 문헌에서의 정의, 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미보다 우선하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 개시된 모든 참고문헌, 특허, 및 특허 출원은 각각이 인용된 요지와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에는 문헌의 전체를 포괄할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본원에서 사용된 단수형은, 명확히 반대로 표시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
명세서 및 청구범위에서 본원에서 사용된 어구 "및/또는"은 결합된 요소의 "둘 중 하나 또는 둘 모두", 즉 어떤 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 나열된 여러 요소는 동일한 방식으로, 즉 요소 중 "하나 이상"이 그렇게 결합된 것으로 해석되어야 한다. 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있든 없든 "및/또는"의 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 이외의 다른 요소가 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 확장 가능한(open-ended) 언어와 함께 사용될 때의 "A 및/또는 B"에 대한 언급은, 일 구현예에서 A만(임의로 B 이외의 요소를 포함)을 나타낼 수 있고; 또 다른 구현예에서는 B만(임의로 A 이외의 요소를 포함)을 나타낼 수 있고; 또 다른 구현예에서는 A와 B 둘 모두(임의로 다른 요소를 포함)를 나타낼 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본원에서 사용된 바와 같은 "또는"은 상기 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉 다수의 요소 또는 요소 목록 중 적어도 하나의 포함뿐만 아니라 둘 이상, 및 임의로 목록에 없는 추가 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "~중 하나만" 또는 "~중 정확히 하나"와 같은, 명확히 반대로 표시된 "만"이란 용어 또는 청구범위에서 사용될 때 "~로 구성되는"은 다수의 요소 또는 요소 목록 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 나타낼 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은 "둘 중 하나", "~중 하나", "~중 하나만", 또는 "~중 정확히 하나"와 같은 배타적 용어가 선행되는 경우, 배타적 대안(즉, "둘 모두는 아닌 하나 또는 다른 하나")을 표시하는 것으로만 해석되어야 한다. 청구범위에서 사용될 때 "본질적으로 ~로 구성되는"은 특허법 분야에서 사용되는 일반적인 의미를 갖는다.
명세서 및 청구범위에서 본원에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 "적어도 하나"라는 어구는 요소 목록의 요소 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 요소를 의미하되, 요소 목록 내에 구체적으로 나열된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함해야 하는 것은 아니며 요소 목록 내 요소의 임의의 조합을 제외하지도 않는 것으로 이해되어야 한다. 이 정의는 또한 "적어도 하나"라는 어구가 언급하는 요소 목록 내에서 구체적으로 식별된 요소 이외의 요소가 구체적으로 식별된 해당 요소와 관련이 있든 없든 임의로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A와 B 중 적어도 하나"(또는 이와 동등하게 "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 이와 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 하나의 구현예에서 B가 존재하지 않는(임의로 B 이외의 요소를 포함하는) 적어도 하나의 A, 임의로 둘 이상의 A를 포함하는 것을 나타낼 수 있고; 또 다른 구현예에서는 A가 존재하지 않는(임의로 A 이외의 요소를 포함하는) 적어도 하나의 B, 임의로 둘 이상의 B를 포함하는 것을 나타낼 수 있고; 또 다른 구현예에서는 적어도 하나의 A, 임의로 둘 이상의 A를 포함하는 것 및 적어도 하나의 B, 임의로 둘 이상의 B를 포함하는 것을 나타낼 수 있다.
또한, 명확히 반대로 표시되지 않는 한, 둘 이상의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에서 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서가 반드시 방법의 단계 또는 행위가 인용된 순서로 제한되지는 않음이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> CRISPR THERAPEUTICS AG <120> GENETICALLY ENGINEERED T CELLS HAVING IMPROVED PERSISTENCE IN CULTURE <130> 095136-0014 (001WO1) <140> PCT/IB2020/058280 <141> 2020-09-04 <150> US 63/034,646 <151> 2020-06-04 <150> US 62/927,764 <151> 2019-10-30 <150> US 62/897,016 <151> 2019-09-06 <160> 241 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctgcc tggaggctat ccagcgtgag 60 tctctcctac cctcccgct 79 <210> 2 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttcgcct ggaggctatc cagcgtgagt 60 ctctcctacc ctcccgct 78 <210> 3 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctgga ggctatccag cgtgagtctc 60 tcctaccctc ccgct 75 <210> 4 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctgga tagcctggag 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 169 cacacgacta ctggcttc 18 <210> 170 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 170 cacacgactc tggcttc 17 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 171 tggtgaaaac gaggggcctt 20 <210> 172 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 172 tggtgaaaac cgaggggcct t 21 <210> 173 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 173 tggtgagggg cctt 14 <210> 174 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 174 tggtgaaacg aggggcctt 19 <210> 175 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 175 tggtgaacga ggggcctt 18 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 176 gctcaccaat cgccggtgtg 20 <210> 177 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 177 gctcaccaac gccggtgtg 19 <210> 178 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 178 gctcaccaat tcgccggtgt g 21 <210> 179 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 179 gctcaccacg ccggtgtg 18 <210> 180 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 180 gctcaccggt gtg 13 <210> 181 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 181 gctcacccgc cggtgtg 17 <210> 182 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 182 gctcaccgcc ggtgtg 16 <210> 183 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 183 gctcaccaat acgccggtgt g 21 <210> 184 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 184 gctcacgccg gtgtg 15 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 185 gctcaccaat gcgccggtgt g 21 <210> 186 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 186 gctcaccaat ccgccggtgt g 21 <210> 187 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 187 gctcaccaat tcaaggcacg ccggtgtg 28 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 188 cctattgcta agtgggtaag 20 <210> 189 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 189 cctattgcta gtgggtaag 19 <210> 190 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 190 cctattgcta aagtgggtaa g 21 <210> 191 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 191 cctattgggt aag 13 <210> 192 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 192 cctattgcag tgggtaag 18 <210> 193 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 193 cagtgggtaa g 11 <210> 194 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 194 cctattgcta ag 12 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 195 cctattgcta tagtgggtaa g 21 <210> 196 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 196 cctattgagt gggtaag 17 <210> 197 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 197 ccagtgggta ag 12 <210> 198 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 198 cctattgtgg gtaag 15 <210> 199 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 199 cctagtgggt aag 13 <210> 200 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 200 cctatagtgg gtaag 15 <210> 201 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 201 cctattgcta tgggtaag 18 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 202 cctattgcta cagtgggtaa g 21 <210> 203 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 203 cctattgcta taag 14 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 204 tcctattgct aagtgggtaa 20 <210> 205 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 205 tcctattgct taagtgggta a 21 <210> 206 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 206 tcctattaag tgggtaa 17 <210> 207 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 207 tcctattgca agtgggtaa 19 <210> 208 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 208 tcctattgta agtgggtaa 19 <210> 209 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 209 tcctattggg taa 13 <210> 210 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 210 acctgctcct agatgggtat 20 <210> 211 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 211 acctgctcct tagatgggta t 21 <210> 212 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 212 acctgctcca gatgggtat 19 <210> 213 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 213 acctgctaga tgggtat 17 <210> 214 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 214 acctgctcta gatgggtat 19 <210> 215 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 215 acctgtagat gggtat 16 <210> 216 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 216 acctgctcct atgggtat 18 <210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 217 gcattaacac ttttggacga 20 <210> 218 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 218 gcattaacac tttttggacg a 21 <210> 219 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 219 gcattaacac ttttttggac ga 22 <210> 220 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 220 gcattaacat tttggacga 19 <210> 221 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 221 gcattaacac tttggacga 19 <210> 222 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 222 gcattatttt ggacga 16 <210> 223 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 223 gcattaacac tttttttgga cga 23 <210> 224 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 224 gcattaactt ttggacga 18 <210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 225 ctgcacagtc aatggggatg 20 <210> 226 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 226 ctgcacagtc aaatggggat g 21 <210> 227 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 227 ctgcacagtc caatggggat g 21 <210> 228 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 228 ctgcacaatg gggatg 16 <210> 229 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 229 ctgcacagtc atggggatg 19 <210> 230 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 230 ctgcacagta atggggatg 19 <210> 231 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 231 ctgcacaaat ggggatg 17 <210> 232 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 232 ctgcaatggg gatg 14 <210> 233 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 233 ctgcacagaa tggggatg 18 <210> 234 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 234 ctgcacagtc tggggatg 18 <210> 235 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 235 ctgcacagtc 10 <210> 236 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 236 aatggggatg 10 <210> 237 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 237 gccctgccaa gaagggaagg 20 <210> 238 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 238 gccctgccaa agaagggaag g 21 <210> 239 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 239 gccctgccag aagggaagg 19 <210> 240 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 240 gccctgccaa aagaagggaa gg 22 <210> 241 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 241 gccctagaag ggaagg 16

Claims (64)

  1. 유전적으로 조작된 T 세포 집단으로서,
    (i) 세포 자가-재생에 관여되는 파괴된 유전자;
    (ii) 아폽토시스에 관여되는 파괴된 유전자;
    (iii) T 세포 고갈의 조절에 관여되는 파괴된 유전자; 또는
    (iv) (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 조합을 포함하며;
    유전적으로 조작된 T 세포 집단은 조작되지 않은 T 대응물에 비해, 하기 특징 중 하나 이상을 갖는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단:(a) 배양 중 향상된 증대능, (b) 향상된 증식능, (c) 감소된 아폽토시스 수준, 및 (d) 향상된 활성화 빈도.
  2. 제1항에 있어서, T 세포는 (i) 내지 (iii)의 조합을 포함하는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  3. 제1항 또한 제2항에 있어서, (i)는 TET2를 포함하며, 임의로 유전적으로 조작된 T 세포는 (ii), (iii) 또는 둘 모두를 포함하지 않는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴된 TET2는 엑손 1, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 및 엑손 6, 또는 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 엑손에서 유전적으로 편집되며, 임의로 돌연변이된 TET2는 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 또는 엑손 6에서 유전적으로 편집되는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴된 TET2 유전자는 CRISPR/Cas-매개 유전자 편집에 의해 유전적으로 편집되는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  6. 제5항에 있어서, 파괴된 TET2 유전자는 SEQ ID NO: 14, 18, 22, 26, 112, 116, 또는 120의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 이용한 CRISPR/Cas-매개 유전자 편집에 의해 유전적으로 편집되는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)는 FAS를 포함하는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, (iii)는 CD70을 포함하는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 파괴된 FAS 및/또는 CD70 유전자는 CRISPR/Cas-매개 유전자 편집에 의해 유전적으로 편집되는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  10. 제9항에 있어서, 파괴된 FAS유전자는 SEQ ID NO: 69, 73, 77, 81, 또는 85의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)로 CRISPR/Cas-매개 유전자 편집에 의해 유전적으로 편집되고/되거나, 파괴된 CD70 유전자는 SEQ ID NO: 34, 38, 42, 46, 50, 54, 또는 58의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 gRNA로 CRISPR/Cas-매개 유전자 편집에 의해 유전적으로 편집되는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(ß2M) 유전자를 추가로 포함하는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 파괴된 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자를 추가로 포함하는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 추가로 조작되는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  14. 제13항에 있어서, CAR은 종양 항원을 표적화하는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  15. 제14항에 있어서, 종양 항원은 CD19, B 세포 성숙 항원(BCMA), 또는 CD70인, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 핵산은 T 세포의 게놈에 삽입되는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  17. 제16항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드산의 삽입을 갖는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 하나 이상의 인간 공여자의 일차 T 세포로부터 유래되는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 사이토카인 의존적 성장을 나타내는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 제조하는 방법으로서,
    (a) 복수의 세포(T 세포 또는 이의 전구체 세포임)를 제공하는 단계;
    (b) (i) 내지 (iii) 유전자 중 하나 이상을 유전적으로 편집하는 단계; 및
    (c) 유전적으로 조작된 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 단계 (b)는 복수의 세포에 RNA-가이드 뉴클레아제, 및 (i) 내지 (iii) 유전자 중 하나 이상을 표적화하는 하나 이상의 gRNA를 전달하여 수행되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, (i)는 TET2를 포함하며 임의로 TET2를 표적화하는 gRNA는 엑손 1, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 및 엑손 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 TET2 유전자의 엑손에 특이적인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, TET2를 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)는 SEQ ID NO: 14, 18, 22, 26, 112, 116, 또는 120의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)는 FAS를 포함하는, 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, (iii)은 CD70을 포함하는, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, FAS를 표적화하는 gRNA는 SEQ ID NO: 69, 73, 77, 81, 또는 85의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나 CD70을 표적화하는 gRNA는 SEQ ID NO: 34, 38, 42, 46, 50, 54, 또는 58의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 세포는 하나 이상의 인간 공여자의 일차 T 세포인, 방법.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, (i) 내지 (iii)의 조합을 표적화하는 gRNA는 세포로 전달되는, 방법.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, Cas9 뉴클레아제는 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 뉴클레아제인, 방법.
  31. 제20항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 뉴클레아제 및 하나 이상의 gRNA는 리보뉴클레오단백질 입자(RNP)에서 복합체화되는, 방법.
  32. 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 1회의 전기천공 사건에 의해 수행되는, 방법.
  33. 제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 2회의 순차적 전기천공 사건에 의해 수행되는, 방법.
  34. 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 유전적으로 조작된 T 세포를 제조하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 나타낸 유전적으로 조작된 T세포를 포함하는 세포 은행으로부터의 복수의 T 세포를 제공하는 단계;
    (b) 복수의 T 세포에 CAR을 인코딩하는 핵산을 전달하는 단계; 및
    (c) CAR을 발현하는 유전적으로 조작된 T 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포는 파괴된 ß2M 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제34항에 있어서, ß2M 유전자를 유전적으로 편집하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 유전적으로 편집하는 단계는 ß2M 유전자를 표적화하는 gRNA를 복수의 T 세포에 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포는 파괴된 TRAC 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, TRAC 유전자를 유전적으로 편집하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 은행에서의 유전적으로 조작된 T 세포는 하나 이상의 인간 공여자의 일차 T 세포로부터 유래되는, 방법.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 뉴클레아제는 T 세포로 전달되는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, Cas9 뉴클레아제는 에스. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제인, 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 뉴클레아제 및 gRNA(들)는 리보뉴클레오단백질 입자(RNP)에서 복합체화되는, 방법.
  45. 제20항 내지 제44항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는, 유전적으로 조작된 T 세포 집단.
  46. 대상체에서 요망되지 않는 세포를 제거하는 방법으로서, 요망되지 않는 세포를 표적화하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, T 세포는 제1항 내지 제19항 및 제45항 중 어느 한 항에 나타나는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 요망되지 않는 세포는 암세포인, 방법.
  48. TET2 유전자의 엑손 3 또는 엑손 5에 특이적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, TET2유전자를 표적화하는 가이드 RNA(gRNA).
  49. 제48항에 있어서, 엑손 5에 특이적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, gRNA.
  50. 제49항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 TET2 유전자의 엑손 5에서 GGGATGTCCTATTGCTAAGT(SEQ ID NO: 125) 또는 AGGGATGTCCTATTGCTAAG(SEQ ID NO: 126)의 부위를 표적화하는, gRNA.
  51. 제50항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 18 또는 22를 포함하는, gRNA.
  52. 제48항에 있어서, TET2 유전자의 엑손 3을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, gRNA.
  53. 제52항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 TET2 유전자의 엑손 3에서 GATTCCGCTTGGTGAAAACG(SEQ ID NO: 129), CAGGACTCACACGACTATTC(SEQ ID NO: 131), 또는 TTCCGCTTGGTGAAAACGAG(SEQ ID NO: 133)를 표적화하는, gRNA.
  54. 제53항에 있어서, SEQ ID NO: 112, 116, 또는 120의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, gRNA.
  55. 제48항에 있어서, TET2 유전자의 엑손 4을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, gRNA.
  56. 제55항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 TET2 유전자의 엑손 4에서 CATTAGGACCTGCTCCTAGA(SEQ ID NO: 124)를 표적화하는, gRNA.
  57. 제56항에 있어서, SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, gRNA.
  58. 제48항에 있어서, TET2 유전자의 엑손 6을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, gRNA.
  59. 제58항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 TET2 유전자의 엑손 6에서 ACGGCACGCTCACCAATCGC(SEQ ID NO: 127)를 표적화하는, gRNA.
  60. 제59항에 있어서, SEQ ID NO: 26의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, gRNA.
  61. 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 스캐폴드 서열을 추가로 포함하는, gRNA.
  62. 제48항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, gRNA.
  63. 제62항에 있어서, gRNA의 5' 및/또는 3' 말단에 하나 이상의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 잔기를 포함하는, gRNA.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 114, 115, 118, 119, 122, 또는 123의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, gRNA.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021252804A1 (en) 2020-06-12 2021-12-16 Nkarta, Inc. Genetically modified natural killer cells for cd70-directed cancer immunotherapy
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
TW202241935A (zh) 2020-12-18 2022-11-01 美商世紀治療股份有限公司 具有可調適受體專一性之嵌合抗原受體系統
TW202309077A (zh) * 2021-05-12 2023-03-01 瑞士商Ｃｒｉｓｐｒ治療公司 用於治療實性瘤的靶向ｃｄ７０的基因工程化免疫細胞
CN117844811A (zh) * 2024-03-08 2024-04-09 上海恒润达生生物科技股份有限公司 靶向敲除CD70基因的sgRNA组合物及其应用

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
AU4328801A (en) 2000-02-24 2001-09-03 Xcyte Therapies Inc Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US20040224385A1 (en) 2001-08-20 2004-11-11 Barbas Carlos F Zinc finger binding domains for cnn
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
WO2011072246A2 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Tal effector-mediated dna modification
RU2707251C2 (ru) 2011-10-03 2019-11-25 Модерна Терапьютикс, Инк. Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение
WO2013151666A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
WO2016069282A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Altering gene expression in modified t cells and uses thereof
US20180258149A1 (en) * 2015-09-17 2018-09-13 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3452499A2 (en) * 2016-05-06 2019-03-13 Juno Therapeutics, Inc. Genetically engineered cells and methods of making the same
WO2018030874A1 (ko) * 2016-08-12 2018-02-15 주식회사 툴젠 조작된 면역조절요소 및 이에 의해 변형된 면역 활성
RU2022103870A (ru) * 2016-08-12 2022-03-04 Тулджен Инкорпорейтед Модифицированный иммунорегуляторный элемент и изменение иммунитета посредством этого элемента
WO2019097305A2 (en) 2017-05-12 2019-05-23 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
MX2020008184A (es) * 2018-02-01 2020-09-22 Pfizer Receptores de antigeno quimericos dirigidos a cd70.
CA3099364A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating cancer comprising engineered t cells comprising modified chimeric antigen receptors
WO2020095107A1 (en) 2018-11-07 2020-05-14 Crispr Therapeutics Ag Anti-cd33 immune cell cancer therapy
JP2022530653A (ja) * 2019-05-01 2022-06-30 パクト ファーマ インコーポレイテッド Ｔｅｔ２改変ｔ細胞療法を使用するがんの治療のための組成物及び方法

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