CN117844811A - 靶向敲除CD70基因的sgRNA组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及靶向敲除CD70基因的sgRNA组合物及其应用，所述sgRNA组合物包含靶向CD70的靶向序列分别为SEQ ID NO:1‑3的三种sgRNA。本发明还提供了应用所述sgRNA组合物对细胞内CD70基因进行基因编辑的方法和构建得到的CD70基因敲除细胞。本发明提供的sgRNA组合物能够高效引导Cas核酸酶结合靶向CD70基因的靶序列，具有敲除效率高的优势，可以高效构建CD70基因不表达的细胞系，有助于开展CD70 CAR‑T细胞体外功能实验。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑领域，具体涉及靶向敲除CD70基因的sgRNA组合物及其应用。
背景技术
CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，是现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低的技术之一，是当今最主流的基因编辑系统。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。该技术就是通过人工设计的sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。
肾癌，又称肾细胞癌，是泌尿系统中恶性程度较高的肿瘤，也是最常见的肿瘤之一，在我国泌尿生殖系统肿瘤中占第二位，占成人恶性肿瘤的2%～3%、小儿恶性肿瘤的20%左右。肾癌的治疗方法主要是手术切除、靶向治疗药物和免疫疗法。目前CD70被认为是肾癌的新型特异性肿瘤标志物。因此，CD70是肿瘤靶向和免疫治疗的良好靶点。目前，已经有多种靶向CD70的药物在研，包括CAR-T细胞、单抗药物和ADC等。
CD70是一种Ⅱ型跨膜蛋白，主要表达于活化的T细胞、B细胞及成熟的树突状细胞。CD70受体为CD27，CD70与CD27作用可以促进T细胞和B细胞的活化、增殖及分化，并调节免疫应答。在正常情况下，高表达于活化的T细胞和B细胞表面，在免疫应答晚期随着抗原刺激的减少其表达下调，表达时间短。但在病理情况下，CD70高表达于多种肿瘤细胞，肿瘤细胞通过表达CD70结合T细胞受体CD27，慢性的共刺激导致T细胞表达PD-1，TIM-3等免疫检查点，从而导致免疫功能耗竭。CD70在肿瘤中的高表达可能暗示了肿瘤利用CD70来控制表达CD27的肿瘤浸润淋巴细胞，从而发生免疫逃逸。CD70的异常表达与肿瘤的发生发展及患者的不良预后显著相关。CD70在多种恶性肿瘤尤其是肾癌中表达量高且阳性检出率高，已成为治疗肾癌的兼具有效性和安全性的潜力靶点。针对CD70为靶点的CAR-T细胞治疗是肾癌治疗的一个热点。
根据查询ClinicalTrials，与CD70 CAR-T相关的有多家在研，比如浙江大学和Yake Biotechnology、Shenzhen Geno-Immune Medical Institute、CRISPRTherapeutics、Allogene Therapeutics。适应症主要为肾细胞癌，其他也包括急性髓系白血病非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤以及其他B细胞恶性肿瘤等血液肿瘤。目前尚无靶向CD70的相关产品上市，但部分研究已经进入临床阶段，主要的适应症为血液肿瘤和肾癌。据中国国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）和美国食品药品监督管理局（FDA）显示，目前全球有三款CD70 CAR-T细胞治疗产品获得IND批准进入注册临床以探索实体瘤的治疗。
靶向CD70的CAR-T细胞治疗产品在进行体内外功能验证时，需要评估不同来源的CD70 CAR-T细胞对肾癌细胞系和小鼠肿瘤模型的抗肿瘤活性。常用的肾癌细胞系有ACHN细胞，源自一名22岁患有肾细胞腺癌的白人男性的胸腔积液，是剪切过的人腺病毒5（Ad5）转染的人胚肾细胞形成的永生化细胞。在体内研究中，常使用ACHN细胞构建小鼠肾癌模型，用于探索肾癌治疗方法的研究。CD70在ACHN中高表达，可被CD70 CAR-T细胞靶向识别，是体外功能验证时理想的肾癌细胞系。在评估CD70 CAR-T细胞对ACHN细胞的特异性抗肿瘤活性时，我们需要从正反面来进行验证，既要证明CD70 CAR-T细胞对ACHN细胞的杀伤作用，同时要证明当CD70在ACHN细胞中不再表达时，CD70 CAR-T细胞对ACHN细胞的杀伤作用将不复存在。因此要建立CD70基因敲除的ACHN细胞系。现有技术公开了一些靶向敲除CD70的sgRNA，而目前未见如本申请能高效敲除ACHN细胞CD70基因的sgRNA组合物产品。
发明内容
本发明提供一种靶向敲除CD70基因的sgRNA组合物及其应用。
第一方面，本发明提供一种对细胞内CD70基因进行基因编辑的sgRNA组合物，所述sgRNA组合物包含靶向CD70的靶向序列分别为SEQ ID NO:1-3的三种sgRNA。
在一个或多个实施方案中，所述sgRNA组合物包含SEQ ID NO:4-6所示的三种sgRNA。
在一个或多个实施方案中，所述sgRNA组合物中SEQ ID NO:4-6所示的三种sgRNA的摩尔百分比为(0.000001%-99.999999%):(0.000001%-99.999999%):(0.000001%-99.999999%)；在一些实施方案中，摩尔百分比为(40%-60%):(40%-60%):(40%-60%)；在一些实施方案中，摩尔百分比为50%:50%:50%。
在一个或多个实施方案中，所述sgRNA是经修饰的。优选地，所述修饰为核苷酸修饰、核苷酸间修饰、5’端修饰和3’端修饰、糖修饰、糖-核苷酸间连接键修饰中的一种或几种。优选地，所述修饰为甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或几种。
第二方面，本发明提供一种对细胞内CD70基因进行基因编辑的组合物，包含：
(i)本文任一实施方案所述的sgRNA组合物中的三种sgRNA；或，含有编码本文任一实施方案所述的sgRNA组合物中的三种sgRNA的核酸；和
(ii)含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域（guide nucleotide sequence-programmable DNA binding protein domain）的蛋白；或，含有编码所述含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白的核酸。
在一个或多个实施方案中，所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域来源于Cas核酸酶。优选地，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或几种。更优选的，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。
第三方面，本发明提供一种对细胞内CD70基因进行基因编辑的方法，所述方法包括步骤：将含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白和本文任一实施方案所述的sgRNA组合物导入细胞、对CD70基因进行编辑，所述sgRNA组合物引导所述含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白对CD70基因进行切割并形成断裂位点。
在一个或多个实施方案中，所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域来源于Cas核酸酶。优选地，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或几种。更优选的，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。
在一个或多个实施方案中，将含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白和sgRNA组合物导入细胞的方式选自电穿孔、载体转化、转染、热休克、转导、基因枪或显微注射。优选地，采用电穿孔的方式。
第四方面，本发明提供本文任一实施方案所述的方法制备得到的基因编辑的细胞。
第五方面，本发明提供本文任一实施方案所述的sgRNA组合物、本文任一实施方案所述的组合物在制备对细胞内CD70进行基因编辑的产品中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供的sgRNA组合物能够高效引导Cas核酸酶结合靶向CD70基因的靶序列，具有敲除效率高的优势，可以高效构建CD70基因不表达的细胞系，有助于开展CD70 CAR-T细胞体外功能实验。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1：human CD70基因组信息示意图。人源的CD70基因仅含有三个外显子，第一个外显子含有5’UTR序列和161bp的编码序列。我们在第一个外显子的编码区设计了三条sgRNA。
图2：其中三条sgRNA的序列信息。
图3：流式检测ACHN细胞内CD70的敲除效率（三条sgRNA混合）。电转时将三条sgRNA混合后进行电转。流式检测CD70的表达情况，结果表明与野生型对照组相比，CD70敲除组几乎检测不到CD70的表达，敲除效率100%。
图4：流式检测ACHN细胞内CD70的敲除效率（单条sgRNA）。电转时将三条sgRNA分别进行电转。流式检测CD70的表达情况，结果表明与野生型对照组相比，电转sgRNA1组的CD70表达最低，敲除效率最高，敲除效率87%左右。
图5：流式检测ACHN（CD70 KO）单克隆中CD70的表达。流式检测ACHN（CD70 KO）单克隆中CD70的表达情况，结果表明1A3和1A5单克隆皆不表达CD70，说明CD70敲除的ACHN细胞单克隆构建成功。
实施方式
本申请发明人经过广泛而深入的研究，选择了数条sgRNA，一方面将sgRNA分别电转至ACHN细胞，另一方面将任两种或几种sgRNA混合后电转至ACHN细胞中。后续皆在蛋白水平分析比较了CD70在ACHN细胞中的敲除效率，旨在选择敲除CD70敲除效率最高的实验组，方便后期更快地制备CD70敲除的ACHN细胞单克隆。这对后期体外功能实验验证评估CD70CAR-T细胞对ACHN细胞的特异性抗肿瘤活性具有积极的意义。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。本文中述及的所有出版物和其他参考文献都通过引用纳入本文。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。
CRISPR/Cas基因编辑技术
本发明所称的“CRISPR/Cas技术”、“CRISPR/Cas基因组编辑”、“CRISPR/Cas基因组编辑技术”、“CRISPR/Cas基因组编辑方法”一般是指利用CRISPR/Cas系统对目的DNA序列进行修改的技术。“CRISPR/Cas技术”也可以包含利用类似原理进行基因表达调控的方法，如基于CRISPR/dCas9的基因表达调控技术。
sgRNA组合物
如本文所用，“sgRNA”、“向导RNA”或“本发明sgRNA”可互换使用，均指靶向CD70基因的sgRNA。所述sgRNA组合物包含靶向CD70的靶向序列分别为SEQ ID NO:1-3的三种sgRNA。在一些实施方案中，所述sgRNA组合物包含SEQ ID NO:4-6所示的三种sgRNA。
在一些实施方案中，所述sgRNA组合物中的任一种或几种sgRNA是经修饰的。允许的修饰为核苷酸修饰、核苷酸间修饰、5’端修饰和3’端修饰、糖修饰、糖-核苷酸间连接键修饰中的一种或几种。允许的碱基修饰的类型为甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或几种。在优选的实施方式中，所述sgRNA包括5’末端第1-n位碱基的任意一个、任意几个或任意连续几个碱基的化学修饰，和/或3’末端第1至n位碱基的任意一个、任意几个或任意连续几个碱基的化学修饰；所述n选自2、3、4、5、6、7、8、9或10。优选的，sgRNA包括5’末端一个、两个、三个、四个或五个碱基的化学修饰，和/或3’末端一个、两个、三个、四个或五个碱基的化学修饰。例如，在sgRNA的5’末端第1位碱基、第2位碱基、第3位碱基、第4位碱基、第5位碱基或第1-2位碱基、第1-3位碱基、第1-4位碱基、第1-5位碱基进行化学修饰；和/或，在sgRNA的3’末端第1位碱基、第2位碱基、第3位碱基、第4位碱基、第5位个碱基或第1-2位碱基、第1-3位碱基、第1-4位碱基、第1-5位碱基进行化学修饰。在本发明的一个具体实施方案中，sgRNA的5’和3’末端均带有三个硫代修饰。
组合物
本发明的对细胞内CD70基因进行基因编辑的组合物包含：(i)本文任一实施方案所述的sgRNA组合物中的三种sgRNA；或，含有编码本文任一实施方案所述的sgRNA组合物中的三种sgRNA的核酸；和(ii)含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白；或，含有编码所述含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白的核酸。
在一些实施方案中，所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域来源于Cas核酸酶。可选地，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或几种。可选地，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。此处，来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌应当理解为来自或衍生自肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。对于衍生的酶，意指与野生型酶具有高度序列同源性的含义，例如，在某些位点上已经被突变或修饰。
核酸酶是指包括一个或多个DNA结合结构域和一个或多个DNA切割结构域的核酸酶。本发明中的核酸酶可以是由天然存在的核酸酶或由人工改造的核酸酶设计和/或修饰而来。本发明的核酸酶包括归巢核酸内切酶、megaTALs、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)以及成簇的规律间隔的短回文重复序列CRISPR/Cas核酸酶系统。在优选的实施方式中，本发明的核酸酶包括CRISPR/Cas核酸酶系统。
本发明中，CRISPR/Cas核酸酶系统包括Cas核酸酶和将Cas核酸酶募集到靶位点的一个或多个RNA，例如反式活化cRNA(tracrRNA)和CRISPR RNA(crRNA)或单向导RNA(sgRNA)。crRNA和tracrRNA可以设计“单向导RNA”或“sgRNA”的一个多核苷酸序列。
方法
本发明的对细胞内CD70基因进行基因编辑的方法包括步骤：将含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白和sgRNA导入细胞、对CD70基因进行编辑，所述sgRNA引导所述含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白对CD70基因进行切割并形成断裂位点；所述sgRNA为本文任一实施方案所述的sgRNA组合物中的三种sgRNA。
在一些实施方案中，所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域来源于Cas核酸酶。可选地，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或几种。可选地，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。此处，来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌应当理解为来自或衍生自肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。对于衍生的酶，意指与野生型酶具有高度序列同源性的含义，例如，在某些位点上已经被突变或修饰。
在一些实施方案中，将含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白和sgRNA导入细胞的方式选自电穿孔、载体转化、转染、热休克、转导、基因枪或显微注射，本发明对此不做限制，例如可以将核酸酶和sgRNA形成复合物，再将复合物通过电穿孔的方式引入到细胞中。
然而，本发明的sgRNA介导的基因编辑系统相比于现有技术具备优异的基因组编辑能力。在具体的实施例中，利用本发明的基因编辑系统获得的基因失活率高于90％，较优选高于95%，更优选达到100％。
细胞
利用本文任一实施方案所述的对细胞内CD70基因进行基因编辑的方法可以构建得到CD70基因敲除的细胞。所述CD70基因敲除，意指所述细胞的CD70表达量相比于野生细胞出现下降；优选地，下降10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%以上；更优选地，下降95%、96%、97%、98%或99%以上。
在一些实施方案中，所述细胞为肿瘤细胞，例如肾细胞癌、急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌或胶质母细胞瘤细胞，具体如ACHN细胞系、786-O细胞系、A498细胞系、Caki-2细胞系、Caki-1细胞系、Caki-2细胞系、L99-15细胞系、CCRF-CEM细胞系、HL-60细胞系、THP-1细胞系、U937细胞系、Jeko-1细胞系、Raji细胞系、MM. 1S细胞系、H929细胞系、U266细胞系、RPMI8226细胞系、Jeko-1细胞系、Grante519细胞系、Mino细胞系、Z-138细胞系、RF-1细胞系、REC-1细胞株、Toledo细胞系、OCI-LY10细胞系、CFPAC-1细胞系、SW1990细胞系、Capan-1细胞系、PANC-1细胞系、MCF7细胞系、MDA-MB-231细胞系、MCF-7细胞系、MDA-MB-453细胞系、U251细胞系、A172细胞系、U373细胞系或U87细胞系。
用途
本发明的sgRNA组合物可制备成产品，如试剂盒，用于对细胞内CD70进行基因编辑。所述试剂盒可进一步包含核酸酶等。采用该sgRNA组合物进行基因编辑的方法包括步骤：将含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白和sgRNA导入细胞、对CD70基因进行编辑，所述sgRNA引导所述含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白对CD70基因进行切割并形成断裂位点。将含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白和sgRNA导入细胞的方式选自电穿孔、载体转化、转染、热休克、转导、基因枪或显微注射，本发明对此不做具体限制，例如可以将核酸酶和sgRNA形成复合物，再将复合物通过电穿孔的方式引入到细胞中。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
实施例
一、实验方法
1.sgRNA的设计与合成
为了将ACHN细胞（来源：中国科学院细胞库）中的CD70进行敲除，我们使用了CRISPR-Cas9基因编辑技术来实施。我们设计了数条sgRNA序列，并选择金斯瑞公司进行合成并进行修饰：2'-O-methyl and phosphorothioate modifications at the firstthree 5’ and 3’ terminal RNA residue（本文中译为：5’和3’末端均带有三个硫代修饰）（图1、图2）。
2.电转
我们选择Lonza电转仪以电转的方式将Cas9蛋白（厂商：GenScript; 货号：203702-500）和sgRNA以RNP复合物的形式递送至ACHN细胞内来进行基因编辑。电转前需要制备sgRNA工作溶液和电转缓冲液。sgRNA工作溶液的制备：将合成的冻干粉状的3nmol的EasyEdit sgRNA溶解在 RNase-/DNase-free且无热原的水中，终浓度为 100 µM（100pmol/µl）。电转缓冲液的制备：将SF电转液与补充溶液（试剂盒：SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S；厂商：Lonza；货号：V4XC-2032）按照4.5:1的比例混合制备电转缓冲液，混合后平衡至室温。将ACHN细胞进行消化计数，取所需量的细胞（2E5/20ul反应）离心收集。在无菌、DNase/RNase Free 的1.5ml Ep管中按顺序依次加入以下试剂：每个反应体系中加入5ul的混合后的电转缓冲液、1.2ul（120pmol）的sgRNA（若是电转三种sgRNA，则每条sgRNA的用量是0.4ul(40pmol)）、1.6ul（40pmol）的Cas9 蛋白，充分混匀后，在室温下孵育 10 分钟以形成 RNP 混合物。用15ul电转缓冲液重悬离心后的细胞沉淀，随后将细胞悬液加入到装有RNP的1.5ml Ep管中混匀，并转移至16孔的NucleocuvetteTM电转板条中。启动 4D-NucleofectorTM电转仪，选择合适的电转程序CM130，将电转板条放置于 4D-NucleofectorTM X Unit 的板条托槽内，开始电转过程。运行完成后，立即从机器板条托槽上小心取出NucleocuvetteTM电转板条，向每个孔中加入80ul预热的R10培养基，置于37°C培养箱中静置30min。取出电转板条，将细胞转移至预先铺有300ul R10培养基的48孔板中，置于37°C培养箱中培养。培养3-7天后通过流式检测的方式来判断CD70的敲除效率。
3.流式检测ACHN细胞内CD70的敲除效率
电转后的细胞培养3-7天，分别取野生型及CD70 敲除组的ACHN细胞，用PBS洗一次后，用流式抗体PE anti-human CD70（厂商：Biolegend；货号：355104）和Zombie red进行染色，4度冰箱染色30min。染色结束后PBS洗一次，用100ul PBS重悬细胞，将细胞放置于流式细胞仪SA3800进行流式检测。流式结束后用Flowjo软件分析各组中CD70的蛋白表达情况，以野生型ACHN细胞中CD70的表达为基准，来分析CD70敲除组中CD70的敲除效率。
4.挑取单克隆验证CD70敲除
流式检测确认ACHN细胞中CD70基因敲除后，为了后续实验的统一性，我们需要制备单克隆。我们利用有限稀释法对敲除了CD70的ACHN混合细胞悬液进行稀释，然后将细胞悬液铺到96孔板中，每孔100ul体系，以保证每孔0.5个细胞为标准进行的铺板。待单克隆细胞增殖扩增至一定细胞数量后流式检测单克隆中ACHN中CD70的表达情况。
二、实验结果
流式检测结果表明，将三条sgRNA混合后进行电转，与野生型对照组相比，CD70敲除组几乎检测不到CD70的表达，敲除效率100%（图3）；将三条sgRNA分别进行电转，与野生型对照组相比，电转sgRNA1组的CD70表达最低，敲除效率最高，为87%左右（图4）。挑取单克隆细胞验证CD70表达，结果单克隆皆不表达CD70，说明CD70敲除的ACHN细胞单克隆构建成功（图5）。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种对细胞内CD70基因进行基因编辑的sgRNA组合物，其特征在于，所述sgRNA组合物包含靶向CD70的靶向序列分别为SEQ ID NO:1-3的三种sgRNA；优选地，所述sgRNA组合物包含SEQ ID NO:4-6所示的三种sgRNA。
2.根据权利要求1所述的sgRNA组合物，其特征在于，所述sgRNA组合物中SEQ ID NO:4-6所示的三种sgRNA的摩尔百分比为(0.000001%-99.999999%):(0.000001%-99.999999%):(0.000001%-99.999999%)；优选地，摩尔百分比为(40%-60%):(40%-60%):(40%-60%)；更优选地，摩尔百分比为50%:50%:50%。
3.根据权利要求1所述的sgRNA组合物，其特征在于，所述sgRNA组合物中的任一种或几种sgRNA是经修饰的；优选地，所述修饰为核苷酸修饰、核苷酸间修饰、5’端修饰和3’端修饰、糖修饰、糖-核苷酸间连接键修饰中的一种或几种；优选地，所述修饰为甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或几种。
4.一种对细胞内CD70基因进行基因编辑的组合物，其特征在于，包含：
(i)权利要求1-3任一所述的sgRNA组合物中的三种sgRNA；或，含有编码所述权利要求1-3任一所述的sgRNA组合物中的三种sgRNA的核酸；和
(ii)含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白；或，含有编码所述含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白的核酸。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域来源于Cas核酸酶；优选地，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或几种；更优选的，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。
6.一种对细胞内CD70基因进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白和权利要求1-3任一所述的sgRNA组合物导入细胞、对CD70基因进行编辑，所述权利要求1-3任一所述的sgRNA组合物引导所述含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白对CD70基因进行切割并形成断裂位点。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域来源于Cas核酸酶；优选地，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或几种；更优选的，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白和sgRNA组合物导入细胞的方式选自电穿孔、载体转化、转染、热休克、转导、基因枪或显微注射；优选地，采用电穿孔的方式。
9.权利要求6-8任一所述的方法制备得到的基因编辑的细胞。
10.权利要求1-3任一所述的sgRNA组合物、权利要求4-5任一所述的组合物在制备对细胞内CD70进行基因编辑的产品中的应用。
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