CN117120062A - 用于发现cd8 t细胞中治疗靶标的体内crispr筛选系统 - Google Patents

Abstract

本公开提供了包含被破坏的Fli1的修饰的免疫细胞或其前体。还提供了组合物和治疗方法。本公开还提供了筛选T细胞的方法，所述方法包括评估T细胞衰竭。

Description

用于发现CD8 T细胞中治疗靶标的体内CRISPR筛选系统

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)享有2021年2月24日提交的美国临时专利申请号63/153,191的优先权，该申请特此通过引用以其整体并入本文。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的AI105343、AI117950、AI082630、AI112521、AI115712、AI108545、CA210944、CA234842、CA009140、MH109905和HG010480的政府支持下完成的。政府对该发明拥有某些权利。

背景技术

了解调节效应CD8 T细胞(T_EFF)分化的机制对于改善癌症和其它疾病的治疗方法至关重要。在急性消退感染期间或接种疫苗后，幼稚CD8 T细胞(T_N)的激活导致分化为T_EFF细胞，并伴有转录和表观遗传学重塑。抗原清除后，T_EFF细胞的终末分化亚群在随后的几天到几周内死亡，而一小部分记忆前体(T_MP)分化为长期记忆CD8 T细胞(T_MEM)。然而，在慢性感染和癌症期间，CD8 T细胞分化会沿着衰竭(耗尽，exhaustion)的路径倾斜(转向，diverted)。在这些条件下，T_EFF细胞变得过度刺激且持续性差，而活化的前体群分化为衰竭的CD8 T细胞(T_EX)。T_EX细胞具有多种抑制性受体(包括PD-1)的高表达、效应子功能降低、稳态调节改变(与T_MEM细胞相比)以及独特的转录和表观遗传学程序。阻断PD-1等抑制性受体能够使T_EX恢复活力(reinvigorate)，暂时恢复增殖和某些效应子样特性，其中在多种癌症类型中证明了临床益处。然而，尽管检查点阻断取得了成功，但大多数患者并没有获得持久的临床益处，并且在检查点阻断后或在癌症或其它疾病的细胞疗法期间，非常需要增强T细胞分化和效应子样活性。

人们对定义对检查点阻断有反应的T细胞群和探究细胞疗法的最佳分化状态非常感兴趣。T_EX细胞在人类肿瘤中很突出，可能是肿瘤反应性T细胞的主要来源。PD-1通路阻断介导临床益处，至少部分是由于T_EX细胞的再活化使这些细胞重新进入部分T_EFF细胞程序。然而，有限的治疗功效与T_EX细胞的次优再活化有关。CAR T细胞的治疗失败也与衰竭有关，而拮抗衰竭的方法正在积极研究中。然而，对检查点阻断的反应和控制癌症的细胞疗法这两者来说关键的是有效参与稳健的效应子程序的能力，包括效应子活性的数值扩增和激发。需要了解控制这种效应子活性的潜在分子机制，从而有效地设计出慢性感染和癌症的治疗干预措施。

转录因子(TF)在调节T_EFF相对T_MEM或T_EX的分化中的作用受到了相当大的关注。例如，TF Batf和Irf4在T细胞活化中发挥早期作用，并且还引发效应基因的第二波转录诱导。Runx3通过T-bet和Eomes诱导T_EFF基因表达，并且对组织驻留记忆CD8 T细胞(T_RM)很重要。Runx3还通过抑制TCF-1表达来拮抗滤泡样CD8 T细胞的命运。Runx1相反却在T_EFF分化过程中被Runx3拮抗。大多数T_EFF相关基因及其关联(cognate)顺式调控区在T_N状态下是不可及的(inaccessible)，这将效应子驱动TF的作用与T_N向T_EFF转变期间发生的染色质可及性(chromatin accessibility)改变联系起来。事实上，有证据表明，这些早期操作的TF(如Batf)中的一些可能通过染色质重塑来促成T_EFF基因可及性，但其它控制机制仍有待确定。

除了促进T_EFF形成的TF外，相反的机制还缓和效应子分化的完全定型(commitment)，从而为未来或正在进行的反应保留更持久的T细胞群。T_MEM和T_EX这两种交替的细胞命运无法从完全定型的T_EFF形成，这表明必须拮抗部分T_EFF程序才能实现T_MEM和T_EX分化。高速泳动族(high mobility group,HMG)TF(例如，TCF-1)对T_MEM和T_EX的发育和维持至关重要。TCF-1阻遏驱动T_EFF的TF(如T-bet和Blimp-1)并且可促进表观遗传学变化。此外，第二种HMG TF(Tox)对T_EX细胞命运的发展至关重要，阻遏T_EFF谱系分化。尽管开展了这项工作，但对防止T_EFF分化定型的机制仍知之甚少。这样的信息可能会使癌症和慢性感染的免疫疗法成为可能。然而，尽管失活途径如TCF-1或Tox会去阻遏(de-repress)整个T_EFF分化程序是令人感兴趣的，但这种方法会导致终末T_EFF，并且可能治疗益处有限，因为这样的细胞无法维持持久的反应。

因此，本领域需要发现选择性地去阻遏T_EFF分化的关键方面的机制，特别是那些涉及控制数值扩增和/或保护性免疫的机制。本发明解决了这一需求。

发明内容

在一个方面中，本文提供了修饰的免疫细胞或其前体，包含编码Fli1的内源性基因座中的修饰。

在另一个方面中，本文提供了修饰的免疫细胞或其前体，其中内源性Fli1基因或蛋白质被破坏(disrupted)。

在某些实施方式中，通过选自以下的方法进行所述修饰或破坏：CRISPR系统、抗体、siRNA、miRNA、拮抗剂、药物、小分子抑制剂、PROTAC靶标、TALEN和锌指核酸酶。

在某些实施方式中，所述CRISPR系统包含至少一个sgRNA，所述至少一个sgRNA包含SEQ ID NO:152-156或SEQ ID NO:676-713中的任一个。

在某些实施方式中，所述细胞是人细胞。在某些实施方式中，所述细胞是T细胞。在某些实施方式中，T细胞对T细胞衰竭具有抗性。

在另一个方面中，本文提供了药物组合物，其包含Fli1的抑制剂。在某些实施方式中，所述抑制剂选自CRISPR系统、抗体、siRNA、miRNA、拮抗剂、药物、小分子抑制剂、PROTAC靶标、TALEN和锌指核酸酶。在某些实施方式中，所述CRISPR系统包含至少一个sgRNA，所述至少一个sgRNA包含SEQ ID NO:152-156或SEQ ID NO:676-713中的任一个。

在另一个方面中，本发明包括治疗对其有需要的对象的疾病或障碍(disorder)的方法。所述方法包括向对象施用本文考虑到的任意细胞或任意组合物。

在某些实施方式中，所述疾病或障碍是感染。在某些实施方式中，所述疾病是癌症。

在另一个方面中，本文提供了筛选T细胞的方法。所述方法包括i)将Cas酶(或编码Cas的核酸)和sgRNA文库引入活化的T细胞中，ii)向感染的小鼠施用所述T细胞，iii)从所述感染的小鼠中分离所述T细胞，和iv)分析所述T细胞。

在某些实施方式中，所述sgRNA文库包含靶向多个转录因子的多个sgRNA。在某些实施方式中，所述多个转录因子包括表1中列出的任意转录因子。在某些实施方式中，每个sgRNA靶向每个转录因子的DNA结合结构域。在某些实施方式中，所述sgRNA文库包含选自SEQ ID NO:1-675的至少一个序列。在某些实施方式中，所述sgRNA文库由SEQ ID NO:1-675中列出的核苷酸序列组成。

在某些实施方式中，所述筛选评估T细胞衰竭。在某些实施方式中，所述方法鉴定管控(governing)T_EFF和T_EX细胞分化的新型转录因子。

在某些实施方式中，分析所述细胞包括选自测序、PCR、MACS和FACS的方法。在某些实施方式中，测序揭示感兴趣的靶标。在某些实施方式中，针对所述感兴趣的靶标设计药物。在某些实施方式中，当向所述T细胞施用所述药物时，至少一种T细胞反应增加。

在某些实施方式中，向所述感染的小鼠施用1x10⁵个T细胞。

附图说明

通过以下结合附图对说明性实施方式的详细描述，将更充分地理解本公开的前述和其它特征及优点。

图1A-图1F：使用OpTICS系统剖析CD8 T细胞的转录程序。图1A：优化的T细胞体内CRISPR筛选(Optimized T cell In vivo CRISPR Screening,OpTICS)的实验设计。在第0天(D0)，从CD45.2⁺C9P14小鼠中分离CD8 T细胞并在体外活化；使CD45.1⁺WT受体小鼠感染LCMV。在D1 p.i.，用RV-sgRNA文库转导活化的C9P14细胞6小时。在D2 p.i.，纯化Cas9⁺sgRNA⁺P14细胞，5-10％的分选细胞被冷冻用于D2基线(T0时间点)，并将其余细胞过继转移到LCMV感染的受体小鼠中。在指示的天数，通过MACS和FACS从受体小鼠分离Cas9⁺sgRNA⁺P14细胞(T1时间点)。用测序衔接子对sgRNA盒执行靶向PCR并对PCR产物测序。CRISPR评分(CS)的计算如图所示。图1B：CS比较了Arm p.i.D8或D15、Cl13 p.i.D9或D14来自脾的Cas9⁺sgRNA⁺细胞的靶基因的T1时间点与T0时间点(D2基线)。X轴显示所靶向基因；y轴显示每个所靶向基因(使用4-5个sgRNA)的CS。图1C：所靶向基因的CS的热图。热图对每个基因的CS的几何平均值进行等级排列(排序，ranks)。图1D：Ctrl、Pdcd1和Fli1 sgRNA的分布。轴代表log2倍数变化(FC)。直方图显示所有sgRNA的分布。黑色条代表所靶向sgRNA，灰色条代表所有其它sgRNA。图1E：来自脾的经分选的Cas9⁺sgFli1⁺P14细胞和配对的Cas9⁺sgFli1^-P14细胞的Fli1蛋白的蛋白质印迹。使用两个Fli1-sgRNA(sgFli1_290和sgFli1_360)。使用合并的(混合的，Pooled)小鼠(3-5只小鼠用于Arm，10-15只小鼠用于Cl13)。条形图代表Fli1的归一化带强度。首先将Fli1归一化为GAPDH，然后计算Cas9⁺sgFli1⁺与Cas9⁺sgFli1^-之间的比并显示出来。图1F：Arm p.i.D8、Arm p.i.D15、Cl13 p.i.D9和Cl13 p.i.D14时Ctrl-sgRNA(sgCtrl)组和2Fli1-sgRNA(sgFli1_290和sgFli1_360)组来自脾的归一化后的Cas9⁺sgRNA(VEX)⁺细胞数。基于D2体外转导效率归一化为sgCtrl组的细胞数目(参见图10B和图10D)。与对照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.001(单因素Anova分析)。对于图1F，数据代表4项独立实验(平均值±s.e.m.)，至少4只小鼠/组。

图2A-图2E：Fli1在急性感染期间抑制T_EFF细胞增殖和分化。图2A：KLRG1^HiCD127^Lo终末效应子(TE)和KLRG1^LoCD127^Hi记忆前体(MP)的流式细胞术图和统计分析。Arm p.i.D8和D15时sgCtrl组和2sgFli1组来自脾的频率(左)和数目(右)。对Cas9(GFP)⁺sgRNA(VEX)⁺P14细胞门控(Gated)。图2B：Arm p.i.D8和D15时sgCtrl组和2sgFli1组来自脾的CX3CR1⁺CXCR3^-T_EFF细胞和CX3CR1^-CXCR3⁺早期T_MEM细胞频率(左)和数目(右)的流式细胞术图和统计分析。对Cas9⁺sgRNA⁺P14细胞门控。图2C-图2E：实验设计。在D0，使CD45.1⁺P14细胞活化并使受体小鼠感染Arm；在D1 p.i.，用空-RV或Fli1过表达(OE)-RV转导活化的P14细胞。在D2p.i.，纯化每组的VEX⁺P14细胞，并将5×10⁴个细胞过继转移到受感染的受体小鼠中。图2C：空-RV和Fli1-OE-RV条件下CD45.2⁺VEX⁺细胞频率的流式细胞术图和CD45.2⁺VEX⁺细胞数目的统计分析。图2D：Arm p.i.D8和D15时空-RV和Fli1-OE-RV组来自脾的KLRG1^HiCD127^LoTE和KLRG1^LoCD127^Hi MP频率的流式细胞术图和统计分析。对VEX⁺P14细胞门控。图2E：Arm p.i.D8和D15时空-RV组和Fli1-OE-RV组来自脾的CX3CR1⁺CXCR3^-T_EFF细胞和CX3CR1^-CXCR3⁺早期T_MEM细胞频率的流式细胞术图和统计分析。对VEX⁺P14细胞门控。与对照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.001(双尾学生t检验和单因素Anova分析)。数据代表2-4项独立实验(平均值±s.e.m.)，至少3只小鼠/组。

图3A-图3G：Fli1在慢性感染期间拮抗T_EFF样细胞分化。图3A：Cl13 p.i.D8和D15时sgCtrl组和2sgFli1组来自脾的Ly108^-CD39⁺或TCF-1^-Gzmb⁺T_EFF样细胞和Ly108⁺CD39^-或TCF-1⁺Gzmb^-T_EX前体频率的流式细胞术图和统计分析。对Cas9(GFP)⁺sgRNA(VEX)⁺P14细胞门控。图3B：Cl13 p.i.D8和D15时sgCtrl组和2sgFli1组来自脾的CX3CR1⁺和Tim-3⁺频率以及KLRG1和PD-1MFI的统计分析。对Cas9⁺sgRNA⁺P14细胞门控。图3C：sgCtrl组与2sgFli1组之间差异表达的基因的热图。图3D：sgFli1组基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析。图3E：sgCtrl组GO富集分析。图3F：sgCtrl组与sgFli1组之间T_EX前体特征的基因集富集分析(Gene SetEnrichment Analysis,GSEA)。图3G：sgCtrl组与sgFli1组之间T_EFF样特征的GSEA。与对照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.001(双尾学生t检验和单因素Anova分析)。数据代表4项独立实验(平均值±s.e.m.)，A和B至少4只小鼠/组。

图4A-图4K：Fli1重塑CD8 T细胞的表观遗传学图谱(epigenetic profile)并抑制T_EFF相关基因表达。图4A：Cl13 p.i.D9时sgCtrl、sgFli1_290和sgFli1_360组ATAC-seq数据的PCA图。图4B：与sgCtrl组相比，sgFli1组总体染色质开放区域(open chromatin region,OCR)峰变化。图4C：sgCtrl组与sgFli1组之间发生变化的顺式元件OCR峰的类别。左图代表所有变化；右图代表可及性增加或减少的变化。图4D：热图显示sgCtrl组与2sgFli1组之间差异可及峰(调整后的p值<0.05，Log₁₀倍数变化>0.6)。指示了分配给这些峰的所选基因。图4E：图3C中具有差异可及(differentially accessible,DA)峰的基因与差异表达基因的重叠Venn图。图4F：最近基因的峰可及性与基因的差异表达的皮尔逊(Pearson)相关性。图4G：与Fli1丧失相关的转录因子(TF)基序的获得或丧失。X轴代表基序富集的logP值。Y轴代表基序富集的倍数变化。将sgCtrl组与sgFli1组间发生变化的OCR中所靶向基序与全基因组背景进行比较以计算p值和倍数变化。图4H：Cl13 p.i.D8时P14细胞上CUT&RUN的IgG或Fli1结合信号以及sgCtrl-sgRNA、sgFli1_290和sgFli1_360组在CD28、Cx3cr1和Havcr2基因座处通过ATAC-seq检测到的OCR信号。图4I：Cl13 p.i.D8时sgCtrl、sgFli1_290和sgFli1_360组CD28染色直方图和统计分析。灰色显示CD44^–幼稚T细胞的CD28染色。图4J：热图显示sgCtrl组与2sgFli1组间差异可及(DA)峰与Fli1 CUT&RUN结合峰重叠。指示了分配给这些峰的所选基因。图4K：显示Fli1 CUT&RUN峰中的前4富集的TF基序。与对照相比，*P＜0.05、**P＜0.01(单因素Anova分析)。数据代表2项独立实验(平均值±s.e.m.)，图4I至少5只小鼠/组。

图5A-图5G：CD8 T细胞中Fli1缺陷的环境下Runx1或Runx3的过表达。图5A：实验设计。在D0，从CD45.2⁺C9P14供体小鼠中分离并将其活化；使CD45.1⁺WT受体小鼠感染Cl13。在p.i.D1，用sgRNA-RV或OE-RV转导活化的C9P14细胞并将1×10⁵个转导的细胞过继转移到受感染的受体小鼠中。图5B-图5D：Cl13 p.i.D8时sgCtrl-VEX+空-mCherry、sgCtrl-VEX+Runx1-mCherry、sgFli1_290-VEX+空-mCherry和sgFli1_290-VEX+Runx1-mCherry来自脾的VEX⁺mCherry⁺C9P14细胞和Ly108CD39⁺/Ly108⁺CD39^-C9P14的流式细胞术图(图5B)和统计分析(图5C-图5D)。对Cas9(GFP)⁺CD45.2⁺P14细胞门控。图5E-图5G：Cl13 p.i.D8时sgCtrl-mCherry+空-VEX、sgCtrl-mCherry+Runx3-VEX、sgFli1_290-mCherry+空-VEX和sgFli1_290-mCherry+Runx3-VEX来自脾的VEX⁺mCherry⁺C9P14细胞和Ly108^-CD39⁺/Ly108⁺CD39^-C9P14细胞的流式细胞术图(图5E)和统计分析(图5F-图5G)。对Cas9⁺CD45.2⁺P14细胞门控。与对照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.001(单因素Anova分析)。数据代表2项独立实验(平均值±s.e.m.)，至少5只小鼠/组。

图6A-图6F：CD8 T细胞中Fli1缺陷增强对感染的保护性免疫力。图6A：实验设计。在D0，从CD45.2⁺C9P14供体小鼠中分离CD8 T细胞并将其活化；使CD45.1⁺WT受体小鼠感染LCMV Cl13、流感病毒PR8-GP33或单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)-GP33(LM-GP33)。在D1 p.i.，用sgCtrl或sgFli1 RV转导活化的C9P14细胞。在D2 p.i.，通过流式细胞术纯化sgCtrl组或sgFli1组的Cas9⁺sgRNA(VEX)⁺P14细胞，并将其过继转移到受感染的受体小鼠中。对于Cl13，每只小鼠转移1.5×10⁵个VEX⁺C9P14细胞；对于PR8-GP33和LM-GP33，每只小鼠转移1.0×10⁵个VEX⁺C9P14细胞。图6B：LCMV病毒载量是通过在Cl13 p.i.D15于指示的小鼠的肝、肾和血清中进行噬斑测定测量的。数据合并自两项独立的实验。图6C：来自NT组、sgCtrl⁺细胞转移组或sgFli1⁺细胞转移组的PR8-GP33感染小鼠的体重曲线。虚线代表C9P14过继转移的时间。图6D：NT、sgCtrl⁺或sgFli1⁺C9P14受体小鼠的肺中PR8-GP33病毒RNA载量。虚线指示检测极限。使用来自幼稚小鼠的肺样品和来自PR8-GP33感染小鼠的脾样品作为阴性对照。图6E：LM-GP33感染小鼠对NT、sgCtrl⁺或sgFli1⁺C9P14受体小鼠的调整后存活曲线。虚线代表C9P14过继转移的时间。图6F：D7 p.i.时存活的NT、sgCtrl⁺或sgFli1⁺C9P14受体小鼠的脾和肝中LM-GP33细菌载量。与对照相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****P<0.001(6B-6D、6F是单因素Anova分析，6E是Mantel-Cox测试)。数据代表2项独立实验(平均值±s.e.m.)，至少3只小鼠/组。

图7A-图7G：CD8 T细胞中Fli1的丧失提高抗肿瘤免疫力。图7A：实验设计。在D0，使CD45.2⁺Rag2-/-小鼠接种1.0×10⁵个B16-Dbgp33细胞。在肿瘤接种后(p.t.)D3，从CD45.1⁺C9P14小鼠中分离CD8 T细胞并将其活化。在D4 p.t.，用sgCtrl或sgFli1 RV转导活化的C9P14细胞。在D5 p.t.，从sgCtrl组或sgFli1组中分选sgRNA(VEX)⁺Cas9(GFP)⁺P14细胞，并将1×10⁶个纯化的VEX⁺C9P14细胞过继转移到荷瘤小鼠中。图7B：接受NT、sgCtrl⁺或sgFli1⁺C9P14细胞的小鼠的肿瘤体积曲线。图7C：接受NT、sgCtrl⁺或sgFli1⁺C9P14细胞的小鼠在D23p.t.时的肿瘤重量。图7D-图7E：D23 p.t.时sgCtrl组或sgFli1组来自肿瘤的CD45.1⁺sgRNA(VEX)⁺Cas9⁺P14细胞和Ly108^-CD39⁺/Ly108⁺CD39^-C9P14细胞的流式细胞术图(图7D)和统计分析(图7E)。图7F-图7G：D23 p.t时sgCtrl组或sgFli1组来自脾的CD45.1⁺sgRNA⁺Cas9⁺P14细胞和Ly108^-CD39⁺/Ly108⁺CD39^-C9P14细胞的细胞的流式细胞术图(图7F)和统计分析(图7G)。与对照相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.001(双尾学生t检验和单因素Anova分析)。数据代表2项独立实验(平均值±s.e.m.)，至少5只小鼠/组。

图8A-图8K：在Cas9⁺抗原特异性CD8 T细胞中使用逆转录病毒转导的sgRNA进行高效体内基因编辑和筛选。图8A：相比于原始sgRNA来优化sgRNA骨架。图8B：体内基因编辑测试的实验设计。在第0天(D0)，从CD45.1⁺LSL-Cas9⁺CD4^CRE+P14(C9P14)供体小鼠中分离CD8 T细胞，并用抗CD3、抗CD28和IL-2活化；使CD45.2⁺受体小鼠感染Cl13。在D1 p.i.，用Ctrl-sgRNA(sgCtrl)或Pdcd1-sgRNA(sgPdcd1)转导活化的C9P14细胞。转导后6小时，将5×10⁴个活化的供体细胞过继转移到受感染的受体小鼠中。然后在指示的时间从受体小鼠的不同器官分离C9P14细胞进行分析。图8C：用sgRNA载体(mCherry)活化的C9P14细胞的D2体外转导效率。门控是基于非转导对照设置的。图8D：D9 p.i.时sgCtrl组和sgPdcd1组脾中的Cas9(GFP)⁺sgRNA(mCherry)⁺群的流式细胞术图。图8E：血液(D7 p.i.)、脾(D9 p.i.)或肝(D9p.i.)中来自Cas9⁺sgRNA⁺P14细胞的PD-1表达直方图和PD-1⁺群的统计分析。图8F：来自sgCtrl组(合并的5只小鼠)或sgPdcd1组(合并的2只小鼠)经FACS纯化的Cas9⁺sgRNA⁺P14细胞的Pdcd1基因座的Sanger测序结果。图8G：靶向的sgRNA与sgCtrl组之间来自脾(Armp.i.D8)的Cas9⁺sgRNA⁺P14细胞的KLRG1或CXCR3表达直方图和KLRG1⁺或CXCR3⁺群的统计分析。图8H：在Arm感染期间，3种条件下的来自脾或肝的不同sgRNA的D8 p.i.(T1)到D2基线(T0)的Log₂倍数变化(L2FC)。x轴代表不同的sgRNA，y轴代表D8 p.i.(T1)到D2基线(T0)的L2FC。条件1：无优化的分选，平均输入覆盖率约100个细胞/sgRNA，Cas9^+/+P14供体。条件2：优化后的分选(在材料和方法中)，平均输入覆盖率约400个细胞/sgRNA，Cas9^+/+P14供体。条件3：优化后的分选，平均输入覆盖率约400个细胞/sgRNA，Cas9^+/-P14供体。示例靶基因用指示的颜色突出显示。图8I：Cas9^+/+或Cas9^+/-供体P14组的2次独立筛选之间所靶向基因的等级相关性(秩相关性，Rank correlation)。计算每个所靶向基因的sgRNA L2FC的平均值并根据独立筛选进行等级排列。计算等级排列(rankings)的皮尔逊相关性。图8J：脾中Cl13p.i.D14时sgPdcd1的倍数变化富集。数据来自图1A-图1C中进行的筛选。图8K：来自图1A-图1C中进行的筛选的不同样品的皮尔逊相关性。呈现了样品收集时间(p.i.天数)、LCMV感染和分选的Cas9⁺sgRNA⁺细胞的器官。与对照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.001(双尾学生t检验)。数据代表2项独立实验(平均值±s.e.m.)，至少3只小鼠/组。

图9A-图9E：Fli1的基因缺失导致更大的T细胞扩增。图9A：TIDE测定结果显示Fli1基因座对Cas9⁺Fli1-sgRNA(sgFli1)⁺细胞的基因组破坏效率。通过Sanger测序检测基因组破坏。图9B：体外转导后D2；Arm p.i.D8和D15时，来自sgCtrl组或2Fli1-sgRNA(sgFli1_290和sgFli1_360)组的脾细胞的Cas9(GFP)⁺sgRNA(VEX)⁺群的流式细胞术图(对供体P14细胞门控)。在D1 p.i.，将5×10⁴个活化的供体细胞过继转移到同类系受感染的受体小鼠中。图9C：Arm p.i.D8和D15时来自sgCtrl和两个sgFli1组的血液、肝和肺的归一化的Cas9⁺sgRNA⁺细胞数。基于D2体外转导效率归一化为sgCtrl组的细胞数。图9D：体外转导后D2、Cl13(脾)p.i.D9和D15时sgCtrl组和两个sgFli1组Cas9⁺sgRNA⁺P14细胞的流式细胞术图(对供体P14细胞门控)。在D1 p.i.，将5×10⁴个活化的供体P14细胞过继转移到受感染的受体小鼠中。图9E：Cl13 p.i.D9和D15时来自sgCtrl组和两个sgFli1组的血液、肝和肺的归一化的Cas9⁺sgRNA⁺细胞数。基于D2体外转导效率归一化为sgCtrl组的细胞数。与对照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.001(单因素Anova分析)。数据代表2-4项独立实验(平均值±s.e.m.)，至少3只小鼠/组。

图10A-图10J：Fli1抑制终末T_EFF分化而不影响T_MEM细胞形成。图10A：KLRG1^LoCD127^Lo细胞的流式细胞术图和统计分析。Arm p.i.D8和D15时sgCtrl组和2sgFli1组来自脾的频率(左)和数目(右)。对Cas9(GFP)⁺sgRNA(VEX)⁺P14细胞门控。图10B：GzmB⁺和TCF-1⁺C9P14细胞的流式细胞术图和统计分析。Arm p.i.D8时sgCtrl组和sgFli1(2sgRNA组合)组来自脾的频率。对Cas9(GFP)⁺sgRNA(VEX)⁺P14细胞门控。图10C：Arm p.i.D8时sgCtrl组和sgFli1(2sgRNA组合)组来自脾的C9P14细胞中T-bet和Eomes表达的直方图和统计分析。对Cas9(GFP)⁺sgRNA(VEX)⁺P14细胞门控。幼稚T细胞(CD44^-)染色以灰色显示。图10D：刺激5小时后产生细胞因子的C9P14细胞的流式细胞术图和统计分析。Arm p.i.D8时无刺激P14细胞、sgCtrl和sgFli1(2sgRNA组合)组来自脾的IFNγ⁺、IFNγ⁺TNF⁺和MIP1α⁺CD107a⁺频率(左)和数目(右)。对Cas9(GFP)⁺sgRNA(VEX)⁺P14细胞门控。图10E：Arm p.i.D8、D20和D29时sgCtrl组和sgFli1(2sgRNA组合)组的血液中总终末效应子(TE)或记忆前体(MP)C9P14细胞数的统计分析。数据归一化为sgCtrl⁺D2 p.i.转导效率。在转移日(D1 p.i.)，归一化的sgRNA⁺C9P14细胞数为约75个细胞/1x10⁶个PBMC。图10F：Arm p.i.D29时sgCtrl组和sgFli1(2sgRNA组合)组的脾中TE或MP C9P14频率和总TE或MP C9P14细胞数目的统计分析。数据归一化为sgCtrl⁺D2 p.i.转导效率。图10G：Arm p.i.D15时sgCtrl组和sgFli1(2sgRNA组合)组来自脾的总C9P14细胞的Bcl-2、Bcl-XL和Bim表达的直方图。对Cas9(GFP)⁺sgRNA(VEX)⁺P14细胞门控。幼稚T细胞(CD44^-)染色以灰色显示。图10H-图10J：Arm p.i.D15时sgCtrl组和sgFli1(2sgRNA组合)组来自脾的总和(图10H)、TE(图10I)和MP(图10J)C9P14细胞的Bcl-2、Bcl-XL、Bim表达以及Bcl-2/Bim和Bcl-XL/Bim之比的统计分析。对Cas9(GFP)⁺sgRNA(VEX)⁺P14细胞门控。与对照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.001(单因素Anova分析)。数据代表2项独立实验(平均值±s.e.m.)，至少4只小鼠/组。

图11A-图11H：Fli1在慢性感染期间抑制T_EFF样分化。图11A-图11B：Cl13 p.i.D8(图11A)和D15(图11B)时sgCtrl组和两个sgFli1组来自脾的Ly108^-CD39⁺或TCF-1^-GzmB⁺T_EFF样细胞和Ly108⁺CD39^-或TCF-1⁺GzmB T_EX前体细胞数的统计分析。对Cas9(GFP)⁺sgRNA(VEX)⁺P14细胞门控。图11C：Cl13 p.i.D8和D15时sgCtrl组和sgFli1组来自脾的C9P14细胞中Eomes、T-bet和Tox表达的直方图和统计分析。对Cas9(GFP)⁺sgRNA(VEX)⁺P14细胞门控。幼稚T细胞(CD44^-)染色以灰色显示。图11D：刺激5小时后产生细胞因子的C9P14细胞的流式细胞术图和统计分析。Cl13 p.i.D8时无刺激P14细胞、sgCtrl和sgFli1(2sgRNA组合)组来自脾的IFNγ⁺、IFNγ⁺TNF⁺和MIP1α⁺CD107a⁺频率(左)和数目(右)。对Cas9(GFP)⁺sgRNA(VEX)⁺P14细胞门控。图11E：Cl13 p.i.D8和D16时空-RV组和Fli1-OE-RV组CD45.2⁺VEX⁺P14的细胞数的流式细胞术图和统计分析。在D0，使CD45.2⁺P14细胞活化并使CD45.1⁺受体小鼠感染Cl13。在D1p.i.，用空-RV或Fli1-OE-RV转导活化的P14达6小时。在D2 p.i.，从每个RV转导组中分选VEX⁺P14细胞并将1x10⁵个细胞过继转移到受感染的受体中。图11F-图11G：Cl13 p.i.D8和D16时空-RV组和Fli1-OE-RV组Ly108^-CD39⁺或TCF-1^-Gzmb⁺T_EFF样细胞和Ly108⁺CD39^-或TCF-1⁺Gzmb^-T_EX前体频率的流式细胞术图和统计分析。对VEX⁺P14细胞门控。图11H：Cl13 p.i.D8和D16时空-RV组和Fli1-OE-RV组CX3CR1⁺和Tim-3⁺频率的统计分析。对VEX⁺P14细胞门控。与对照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(单因素Anova分析)。对于图11A-图11D，数据代表3项独立实验(平均值±s.e.m.)，至少4只小鼠/组。

图12A-图12I：转录和表观遗传学分析(profiling)解决了Fli1通过与Runx1协调和拮抗Runx3功能来抑制T_EFF样分化的问题。图12A：Cl13 p.i.D8时sgCtrl、sgFli1_290和sgFli1_360组RNA-seq数据的PCA图。图12B：sgCtrl组和sgFli1组中所有CUT&RUN Fli1结合峰与ATAC-seq检测到的峰重叠。图12C：所有CUT&RUN峰与ATAC-seq峰共定位的直方图。与ATAC-seq峰共定位的峰是灰色的；未共定位的峰是黑色的。图12D：D9 p.i.时P14细胞的CUT&RUN IgG或Fli1结合信号以及Tcf7和Id3基因座中sgCtrl、sgFli1_290和sgFli1_360组通过ATAC-seq检测到的染色质开放区域信号。图12E：体外D2以及D7 p.i.时空-RV或Runx1-OE-RV的CD45.1⁺mCherry⁺和Ly108^-CD39⁺/Ly108⁺CD39^-P14细胞数的流式细胞术图和统计分析。在D0，使CD45.1⁺P14细胞活化并使CD45.2⁺受体小鼠感染Cl13；在D1 p.i.，用空-RV或Runx1-OE-RV转导活化的P14细胞6小时，并将1x10⁵个转导的P14细胞过继转移到受感染的受体小鼠中。对CD45.1⁺P14细胞门控的流式细胞术图。图12F：sgCtrl-VEX+Empty-mCherry、sgCtrl-VEX+Runx1-mCherry、sgFli1_290-VEX+Empty-mCherry和sgFli1_290-VEX+Runx1-mCherry C9P14细胞的D2体外转导效率。图12G：Cl13 p.i.D7时sgCtrl-VEX+空-mCherry、sgCtrl-VEX+Runx1-mCherry、sgFli1_290-VEX+空-mCherry和sgFli1_290-VEX+Runx1-mCherry组来自脾的VEX⁺mCherry⁺C9P14细胞和Ly108^-CD39⁺/Ly108⁺CD39^-细胞数的统计分析。对Cas9(GFP)⁺CD45.2⁺P14细胞门控。图12H：sgCtrl-mCherry+空-VEX、sgCtrl-mCherry+Runx3-VEX、sgFli1_290-mCherry+空-VEX和sgFli1_290-mCherry+Runx3-VEX C9P14细胞的D2体外转导效率。图12I：Cl13 p.i.D8时sgCtrl-mCherry+空-VEX、sgCtrl-mCherry+Runx3-VEX、sgFli1_290-mCherry+空-VEX和sgFli1_290-mCherry+Runx3-VEX来自脾的VEX⁺mCherry⁺C9P14细胞和Ly108^-CD39⁺/Ly108⁺CD39^-细胞数的统计分析。对Cas9⁺CD45.2⁺P14细胞门控。与对照相比，*P<0.05，**P<0.01(双尾学生t检验)。数据代表2项独立实验(平均值±s.e.m.)，至少5只小鼠/组。

图13A-图13E：Fli1缺陷在流感病毒或单核细胞增多性李斯特菌感染期间导致CD8T细胞扩增。图13A：LCMV Cl13感染小鼠对sgCtrl⁺、sgFli1_290⁺和sgFli1_360⁺C9P14受体小鼠的调整后存活曲线(1.5×10⁵个细胞/小鼠，N＝5/组)。注意，这里使用JAX受体小鼠而不是NCI受体导致发病机理产生差异。虚线代表C9P14过继转移的时间。图13B：显示D8 p.i.时流感病毒(PR8-GP33)感染小鼠的肺中sgRNA(VEX)⁺C9P14细胞的流式细胞术图，与非转移(NT)、sgCtrl和sgFli1组进行比较。“恢复”被定义为D8 p.i.时体重完全恢复。图13C：PR8-GP3感染期间sgRNA⁺C9P14细胞数与体重比(D8 p.i./D2 p.i.)的相关性。在“体重未恢复”组(体重比在0.7与1.0之间)中，进一步比较sgRNA⁺C9P14细胞数。图13D：D8 p.i.时非转移(NT)、sgCtrl和sgFli1组PR8-GP33感染受体小鼠的脾中sgRNA⁺C9P14细胞的流式细胞术图和统计分析。图13E：D7 p.i.时非转移(NT)、sgCtrl和sgFli1组单核细胞增多性李斯特菌感染受体的脾中sgRNA⁺C9P14细胞的流式细胞术图和统计分析。与对照相比，*P<0.05，**P<0.01(双尾学生t检验和单因素Anova分析)。数据代表2项独立实验(平均值±s.e.m.)，至少6只小鼠/组。

图14A-图14G：在具有免疫能力的小鼠中，使CD8 T细胞中的Fli1缺失产生更好的肿瘤保护。图14A：实验设计。在D0，使CD45.2⁺Cas9⁺P14小鼠接种2×10⁵个B16-Dbgp33细胞。在肿瘤接种后(p.t.)D3，从CD45.2⁺C9P14供体小鼠中分离CD8 T细胞并将其活化。次日，用sgCtrl或sgFli1 RV转导活化的C9P14细胞6小时。在D5 p.t.，从sgCtrl组或sgFli1组中分选sgRNA(VEX)⁺P14细胞，并将3×10⁶个纯化的VEX⁺C9P14细胞过继转移到荷瘤小鼠中。图14B：来自NT、sgCtrl⁺和sgFli1⁺C9P14细胞转移组的荷瘤小鼠的肿瘤体积曲线。图14C：D24p.t.时NT、sgCtrl⁺和sgFli1⁺C9P14转移小鼠的肿瘤重量。图14D-图14E：D24 p.t.时sgCtrl组和sgFli1组来自肿瘤的sgRNA(VEX)⁺C9P14细胞和Ly108-CD39⁺/Ly108⁺CD39群的流式细胞术图(图14D)和统计分析(图14E)。图14F-14G：D24 p.t.时sgCtrl组和sgFli1组来自引流淋巴结(dLN，图14F)和脾(图14G)的sgRNA⁺C9P14细胞和Ly108^-CD39⁺或Ly108⁺CD39^-群的统计分析。与对照相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****P<0.001(双尾学生t检验和单因素Anova分析)。数据代表3项独立实验(平均值±s.e.m.)，至少6只小鼠/组。

具体实施方式

提高抗原特异性T细胞的效应子活性是癌症免疫疗法的主要目标。尽管鉴定出几种效应T细胞(T_EFF)驱动转录因子(TF)，但对T_EFF生物学的转录协调作用仍知之甚少。在本文中，开发了一种体内T细胞CRISPR筛选平台。鉴定了一种通过ETS家族TF即Fli1抑制T_EFF生物学的新机制。Fli1的基因缺失增强T_EFF反应，而不会损害记忆或衰竭前体。Fli1通过与效应子相关基因的顺式调控元件结合来抑制T_EFF谱系分化。Fli1的丧失增加ETS:RUNX基序处染色质可及性，从而实现更有效的Runx3驱动的T_EFF生物学。缺少Fli1的CD8 T细胞对多种感染和肿瘤提供远远更好的保护。这些数据表明，Fli1保护发展中的CD8 T细胞转录景观免受过度的ETS:RUNX驱动的T_EFF细胞分化。此外，Fli1的基因缺失改善感染和癌症的T_EFF分化和保护性免疫。

应当理解，本公开中描述的方法不限于本文公开的特定方法和实验条件，因为这样的方法和条件可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制。

此外，除非另有说明，否则本文所述的实验使用本领域技术范围内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。这些技术是本领域技术人员熟知的，并在文献中进行了充分解释。参见，例如，Ausubel,et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)(包括所有增刊)、MR Green和J.Sambrook的Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第四版)以及Harlow et al.,Antibodies:ALaboratory Manual,Chapter 14,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013年第2版)。

A.定义

除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员的通常理解相同的含义。在有任何潜在模棱两可的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外在的定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。术语“包括(including)”以及诸如“包括(includes)”和“包括的(included)”之类的其它形式的使用不是限制性的。

总体上，关于本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学以及杂交所使用的命名法在本领域中是公知且常用的。除非另有说明，否则本文提供的方法和技术总体上是根据本领域公知并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所述的常规方法进行的。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明书进行的，如本领域通常完成的或如本文所述的那样。关于本文描述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学所使用的命名法，以及本文描述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学的实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。

为了更容易理解本公开，选择的术语定义如下。

冠词“一个”和“一种”在本文中用于指代一个或多于一个(即，指代至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”意为一个元素或多于一个元素。

如本文使用的“约”，当指的是可测量的值如量、时间持续期等时，意指包含从指定值±20％或±10％的变化，更优选±5％，甚至更优选±1％，以及还更优选±0.1％的变化，只要这种变化适于执行所公开的方法即可。

如本文所用，“活化(激活，Activation)”指的是已经被充分地刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可以与诱导的细胞因子产生以及可检测的效应子功能相关联。术语“活化的T细胞”指的是正经历细胞分裂的T细胞等。

如本文所用，“减轻”疾病是指降低疾病的一种或多种症状的严重性。

如本文所用的术语“抗原”被定义为激发免疫反应的分子。该免疫反应可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有的蛋白质或肽，都可充当抗原。

此外，抗原可源自重组DNA或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA——其包含编码引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必单独地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本公开包括但不限于多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以各种组合进行布置以引起期望的免疫反应。此外，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”进行编码。容易显而易见的是抗原可经合成生成，也可源自生物学样品。这种生物学样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物学流体。

如本文所用，术语“自体的”意指源自相同个体的任意物质，其随后被再次引入该个体。

“共刺激分子”是指与共刺激配体特异性结合从而介导通过T细胞的共刺激反应——诸如但不限于增殖——的T细胞上的关联结合伙伴(partner)。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。

如本文所用的“共刺激信号”是指与初级信号结合，诸如TCR/CD3连接，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。

“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能保持稳态，以及其中如果不改善该疾病，则动物的健康继续恶化。与之相比，动物中的“障碍是一种健康状态，其中动物能够保持稳态，但其中动物的健康状态与它没有处于该障碍相比不太有利。不加以治疗，障碍不必定引起动物健康状态的进一步降低。

如本文所用的术语“下调”是指一个或多个基因的基因表达的减少或消除。

“有效量”或“治疗有效量”在本文可交换地使用，并且是指对实现特定的生物学结果或提供治疗或预防益处有效的如本文描述的化合物、制剂、材料或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于当施用于哺乳动物时，与在不存在本公开组合物的情况下检测到的免疫反应相比，引起可检测水平的免疫抑制或耐受的量。免疫反应可以容易地通过大量本领域公认的方法进行评估。本领域技术人员会理解本文所施用的组合物的量是变化的，并且可以基于许多因素容易地确定，诸如所治疗的疾病或状况、所治疗的哺乳动物的年龄和健康状况以及身体状况、疾病的严重程度、所施用的特定化合物等。

“编码”是指多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列充当模板合成在生物学过程中的其它多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。

如本文所用的“内源性”是指来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。

如本文所用的术语“表位”被定义为抗原上的可引发免疫反应(包括B细胞反应或T细胞反应)的小化学分子。抗原可具有一个或多个表位。大多数抗原具有多个表位；即，它们是多价的。总体上，一个表位的大小约10个氨基酸和/或糖。优选地，表位约4-18个氨基酸，更优选约5-16个氨基酸，甚至更最优选6-14个氨基酸，更优选约7-12个氨基酸，以及最优选约8-10个氨基酸。本领域技术人员理解，通常而言分子的整体三维结构而非分子的特异性线性序列是抗原特异性的主要标准，因此来区分一个表位与另一个表位。基于本公开，本公开中使用的肽可以是表位。

如本文所用，术语“外源性”是指从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的任何物质。

如本文所用，术语“扩增”是指数量增加，如T细胞数量增加。在一个实施方式中，离体扩增的T细胞的数量相对于原来存在于培养物中的数量增加。在另一实施方式中，离体扩增的T细胞的数量相对于培养物中的其它细胞类型增加。如本文所用，术语“离体”是指已经从活生物体(例如，人)移出并在该生物体外(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。

如本文使用的术语“表达”被定义为由特定核苷酸序列的启动子驱动的该序列的转录和/或翻译。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含充足的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，如包含该重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

如本文使用的“同一性”是指两个多聚体分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，诸如，两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同的位置处具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子中的每个中的位置均被精氨酸占据，则它们在该位置处是同一的。在比对时，两个氨基酸序列在相同位置处具有相同残基的同一性或程度经常表达为百分数。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或同一位置数目的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，十个氨基酸长度的多聚体中的五个位置)是同一的，则这两个序列是50％同一的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同一的，则这两个氨基酸序列是90％同一的。

如本文使用的术语“免疫反应”被定义为当淋巴细胞将抗原分子识别为异物和诱发形成抗体和/或活化淋巴细胞以去除抗原时发生的针对抗原的细胞反应。

术语“免疫抑制”在本文中用于指减少整体免疫反应。

“插入/缺失(insertion/deletion)”，通常缩写为“indel”，是一种基因多态性，其中具体核苷酸序列在基因组中存在(插入)或不存在(缺失)。

“分离的”是指自天然状态改变或移出的。例如，活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分开的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，也可以存在于非天然环境，如，例如宿主细胞中。

如本文使用的术语“敲低(knockdown)”是指一个或多个基因的基因表达减少。

如本文使用的术语“敲入(knockin)”是指已插入到靶序列(例如，内源性基因座)中的外源性核酸序列。在一些实施方式中，当靶序列是基因时，敲入的产生导致外源性核酸序列与控制靶基因表达的任意上游和/或下游调控元件处于可操作的连接。在一些实施方式中，敲入的产生导致外源性核酸序列与控制靶基因表达的任意上游和/或下游调控元件不处于可操作的连接。

如本文使用的术语“敲除(knockout)”是指一个或多个基因的基因表达的切除。

如本文使用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中的独特之处在于能够感染非分裂细胞；其可以将大量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此其是基因传递载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。衍生自慢病毒的载体提供了实现体内显著水平基因转移的手段。

如本文使用的术语“修饰的”意指本公开的分子或细胞的改变的状态或结构。分子可以以多种方式被修饰，包括化学地、结构地和功能地。细胞可以通过引入核酸而被修饰。

如本文使用的术语“调节”意指与不存在治疗或化合物的对象中的反应水平相比，和/或与在其它方面相同但未治疗的对象中的反应水平相比，介导对象中的反应水平的可检测的增加或减少。该术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或反应，从而介导对象(优选地，人)中的有益的治疗性反应。

在本公开的背景下，使用常见核酸碱基的下列缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，以及“U”是指尿苷。

术语“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸。应当理解，当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、C、G)表示时，这也包括RNA序列(即A、U、C、G)——其中“U”取代了“T”。

除非另外指定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此是简并形式并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，就编码该蛋白质的核苷酸序列可以在一些译本中包含内含子(一个或多个)而言。

免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。

如本文使用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。另外，核酸是核苷酸的多聚体。因而，如本文使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有核酸是可以被水解为单体“核苷酸”的多核苷酸的一般知识。单体核苷酸可以被水解为核苷。如本文使用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可获得的任何手段——非限制性地包括重组手段，即，使用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，和通过合成手段——获得的所有核酸序列。

如本文使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质的或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，该肽或蛋白质包含通过肽键相互连接的两个或更多个氨基酸。如本文所用，该术语是指短链(在本领域中也通常被称为例如肽、寡肽和寡聚物)；和较长链(在本领域中通常被称为蛋白质，其具有多种类型)两者。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

如本文关于抗体使用的术语“特异性结合”意指识别特异性抗原，但是基本上不识别或不结合样品中的其它分子的抗体。例如，特异性结合至来自一个物种的抗原的抗体也结合至来自一个或多个物种的该抗原。但是，这样的跨物种反应性本身不将抗体的类别改变为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合该抗原的不同等位基因形式。然而，这样的交叉反应性本身不将抗体的类别改变为特异性的。在某些情况下，术语“特异性的结合”或“特异性结合”可以关于抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用使用，意指相互作用依赖该化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合特异性蛋白质结构，而不是一般地识别和结合蛋白质。如果抗体特异于表位“A”，则在包含标示的“A”和该抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标示的A)的分子将降低结合该抗体的标示的A的量。

术语“刺激”意指通过结合刺激分子(例如，TCR/CD3复合体)与其关联配体，从而介导信号转导事件——诸如，但不限于经由TCR/CD3复合体的信号转导——诱导的初次反应。刺激可以介导某些分子的改变的表达，如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织等。

“刺激分子”，作为本文使用的术语，意指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。

如本文使用的“刺激配体”意指如下配体：其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)时，可以与T细胞上的关联结合伙伴(在本文称为“刺激分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初次反应，其包括但不限于活化、起始免疫反应、增殖等。刺激配体在本领域是公知的，并且涵盖，特别是使用肽、抗CD3抗体、超兴奋剂(superagonist)抗CD28抗体和超兴奋剂抗CD2抗体负载的MHC I类分子。

术语“对象”意图包括其中可以引发免疫反应的活的生物体(例如，哺乳动物)。如其中使用的“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括，例如，家畜和宠物，如羊、牛、猪、狗、猫和鼠哺乳动物。优选地，对象是人。

“靶位点”或“靶序列”是指限定结合分子可以在足以使结合发生的条件下特异性结合的核酸部分的核酸序列。在一些实施方式中，靶序列是指限定结合分子可以在足以使结合发生的条件下特异性结合的核酸部分的基因组核酸序列。

如本文使用的术语“治疗性”意为治疗和/或预防。治疗效果通过疾病状态的抑制、缓解或根除而获得。

“移植体”是指待移植的生物相容性格栅(lattice)或供体组织、器官或细胞。移植体的实例可包括但不限于皮肤细胞或组织、骨髓以及诸如心脏、胰腺、肾、肺和肝的实体器官。移植体也可以指任何待向宿主施用的材料。例如，移植体可以指核酸或蛋白质。

如本文使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指如下过程：通过该过程，外源性核酸被转移或引入到宿主细胞中。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代对象细胞及其子代。

作为本文使用的术语，“治疗”疾病，意指降低对象经历的疾病或障碍的至少一种迹象或症状的频率或严重性。

“载体”是包含分离的核酸并且可被用于将该分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。多种载体在本领域已知，包括但不限于线性多核苷酸、与离子型或两亲性化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸到细胞中转移的非质粒和非病毒化合物，如，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。

范围：贯穿本公开内容，本公开的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解，以范围格式的描述仅仅出于方便和简洁，而不应当解释为对本发明的范围的死板限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体地公开了子范围诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这均适用。

B.修饰的免疫细胞

本文提供了修饰的免疫细胞或其前体(例如，T细胞)，其中内源性Fli1已被破坏。内源性Fli1可以通过本领域普通技术人员已知的任意手段在基因或蛋白质水平上被破坏。这种破坏Fli1的方法包括但不限于CRISPR系统、抗体、siRNA、miRNA、药物、拮抗剂、小分子抑制剂和PROTAC靶标。

在一个方面中，本公开提供了修饰的免疫细胞或其前体(例如，T细胞)，包含编码Fli1的内源性基因座中的修饰。在某些实施方式中，所述细胞包含能够下调内源性Fli1的基因表达的核酸。

在一个方面中，本公开提供了修饰的免疫细胞或其前体(例如，T细胞)，包含编码Fli1的内源性基因座中的CRISPR介导的修饰，所述修饰能够下调内源性Fli1的基因表达。

在某些实施方式中，修饰细胞是人细胞。

本公开提供了经基因编辑的修饰细胞。在一些实施方式中，对本公开的修饰进行基因编辑以破坏编码Fli1的内源性基因座的表达。在一些实施方式中，经基因编辑的免疫细胞(例如，T细胞)具有对内源性Fli1的表达的下调、减少、缺失、消除、敲除或破坏。

免疫疗法在治疗癌症患者方面已显示出各种疗效。限制其效果的主要问题之一是T细胞在肿瘤细胞的持续刺激后衰竭。衰竭的T细胞具有降低的效应子功能，如细胞因子的产生和对肿瘤细胞的细胞毒性，并且它们表达更高水平的检查点抑制分子，如PD-1和CTLA-4。PD-1和CTLA-4抗体已在临床上用于治疗多种类型的癌症。

在一些实施方式中，对本公开的修饰细胞进行基因编辑以破坏另外的内源性基因的表达。例如，可以进一步编辑所述细胞以破坏内源性PDCD1基因产物(例如程序性死亡1受体；PD-1)。破坏内源性PD-1的表达可能会产生“检查点”抗性修饰细胞，从而增强肿瘤控制。检查点抗性修饰细胞也可以通过破坏例如但不限于腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、B和T淋巴细胞衰减因子蛋白(B and T Lymphocyte Attenuator protein,BTLA/CD272)、CD96、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4/CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM-3)或T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)的表达来产生。

本领域技术人员已知各种基因编辑技术。基因编辑技术包括但不限于回归内切核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物(TALE)核酸酶(TALEN)和成簇的规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)相关蛋白9(Cas9)。回归内切核酸酶通常以二聚体形式切割其DNA底物，并且不具有不同的结合和切割结构域。ZFN识别由两个锌指结合位点组成的靶位点，这两个锌指结合位点位于FokI切割结构域所识别的5碱基对(bp)到7碱基对间隔序列的侧翼。TALEN识别由两个TALE DNA结合位点组成的靶位点，这两个TALE DNA结合位点位于FokI切割结构域所识别的12-bp至20-bp间隔序列的侧翼。Cas9核酸酶靶向的DNA序列与单指导RNA(gRNA)内的靶向序列互补，紧接在相容性原间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)上游。因此，本领域技术人员将能够为本公开选择合适的基因编辑技术。

在一些方面中，通过使用RNA指导的核酸酶如CRISPR-Cas系统(如CRISPR-Cas9系统)进行基因编辑来实施破坏，该系统对被破坏的基因(例如，Fli1)具有特异性。在一些实施方式中，将剂——其含有Cas9和含有靶向基因座区域的靶向结构域的指导RNA(gRNA)——引入细胞中。在一些实施方式中，所述剂是或包含Cas9多肽与gRNA的核糖核蛋白(RNP)复合体(Cas9/gRNA RNP)。在一些实施方式中，所述引入包括使所述剂或其部分在体外与细胞接触，这可以包括培养或孵育细胞和剂上至24、36或48小时或3、4、5、6、7或8天。在一些实施方式中，所述引入还可以包括将所述剂有效递送到细胞中。在各种实施方式中，根据本公开的方法、组合物和细胞利用Cas9与gRNA的核糖核蛋白(RNP)复合体向细胞的直接递送，例如通过电穿孔。在一些实施方式中，RNP复合体包括gRNA，该gRNA已被修饰为包括3’聚腺苷酸尾和5’抗反向帽类似物(5’Anti-Reverse Cap Analog,ARCA)帽。

CRISPR/Cas9系统是一种易于获得且有效的诱导靶向基因改变的系统。Cas9蛋白的靶标识别需要指导RNA(gRNA)内的“种子”序列和gRNA结合区上游含有保守的二核苷酸的原间隔序列邻近基序(PAM)序列。CRISPR/Cas9系统进而可以通过重新设计gRNA而被改造为在细胞系(如293T细胞)、原代细胞和TCR T细胞中切割几乎任意的DNA序列。CRISPR/Cas9系统可以通过将单个Cas9蛋白与两个或更多个gRNA共表达来同时靶向多个基因组基因座，从而使该系统适合于多重基因编辑或靶基因的协同活化。

Cas9蛋白和指导RNA形成识别和切割靶序列的复合体。Cas9由六个结构域组成：REC I、REC II、桥螺旋(Bridge Helix)、PAM相互作用、HNH和RuvC。REC I结构域与指导RNA结合，而桥螺旋与靶DNA结合。HNH和RuvC结构域是核酸酶结构域。指导RNA被改造为具有与靶DNA序列互补的5’端。当指导RNA与Cas9蛋白结合时，发生构象变化，从而活化该蛋白。一旦活化，Cas9就会通过结合与其原间隔序列邻近基序(PAM)序列匹配的序列来搜寻靶DNA。PAM是在与指导RNA互补的区域下游一个核苷酸内的两个或三个核苷酸碱基序列。在一个非限制性实例中，PAM序列为5’-NGG-3’。当Cas9蛋白通过适当的PAM找到其靶序列时，它会熔解PAM上游的碱基并将它们与指导RNA上的互补区域配对。然后RuvC和HNH核酸酶结构域在PAM上游第三核苷酸碱基之后切割靶DNA。

在美国专利申请公开号US20140068797中描述了用于抑制基因表达的CRISPR/Cas系统的一个非限制性实例即CRISPRi。CRISPRi诱导永久性基因破坏，利用RNA指导的Cas9内切核酸酶引入DNA双链断裂，从而触发倾向差错修复途径，导致移码突变。催化失活的(catalytically dead)Cas9缺乏内切核酸酶活性。当与指导RNA共表达时，会产生特异性干扰转录延伸、RNA聚合酶结合或转录因子结合的DNA识别复合体。该CRISPRi系统有效阻遏所靶向基因的表达。

当靶基因特异性指导核酸序列和Cas内切核酸酶被引入细胞并形成复合体——该复合体使Cas内切核酸酶能够在靶基因处引入双链断裂——时发生CRISPR/Cas基因破坏。在某些实施方式中，CRISPR/Cas系统包括表达载体，诸如但不限于pAd5F35-CRISPR载体。在其它实施方式中，Cas表达载体诱导Cas9内切核酸酶的表达。也可以使用其它内切核酸酶，包括但不限于Cas12a(Cpf1)、T7、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、本领域已知的其它核酸酶及其任意组合。

在某些实施方式中，诱导Cas表达载体包括将细胞暴露于活化Cas表达载体中的诱导型启动子的剂。在这样的实施方式中，Cas表达载体包括诱导型启动子，如可通过暴露于抗生素(例如，通过四环素或四环素衍生物，例如多西环素)而诱导的启动子。也可以使用本领域技术人员已知的其它诱导型启动子。诱导剂可以是导致诱导型启动子的诱导的选择性条件(例如，暴露于剂，例如抗生素)。这导致Cas表达载体的表达。

如本文所用，术语“指导RNA”或“gRNA”是指促进RNA指导的核酸酶如Cas9与细胞中的靶序列(例如基因组或附加型序列)的特异性结合(或“靶向”)的任意核酸。

如本文所用，“模块化”或“双RNA”指导包括多于一个，通常是两个独立的RNA分子，如CRISPR RNA(crRNA)和反式活化crRNA(tracrRNA)，它们通常例如通过双链(duplexing)相互关联。gRNA及其组成部分在整个文献中都有描述(参见，例如Briner et al.Mol.Cell,56(2),333-339(2014)，其通过引用并入)。

如本文所用，“单分子gRNA”、“嵌合gRNA”或“单指导RNA(sgRNA)”包括单个RNA分子。sgRNA可以是连接在一起的crRNA与tracrRNA。例如，crRNA的3’端可以连接到tracrRNA的5’端。crRNA和tracrRNA可以联结成单个单分子或嵌合gRNA，例如，通过桥接crRNA(其3’端处)与tracrRNA(其5’端处)的互补区域的四核苷酸(例如，GAAA)“四核苷酸环”或“连接体”序列。

如本文所用，“重复”序列或区域是crRNA的3’端处或附近的核苷酸序列，其与tracrRNA的反向重复序列互补。

如本文所用，“反向重复”序列或区域是tracrRNA的5’端处或附近的核苷酸序列，其与crRNA的重复序列互补。

关于指导RNA结构和功能的其它细节，包括用于基因组编辑的gRNA/Cas9复合体，至少可以在以下中找到：Mali et al.Science,339(6121),823-826(2013)；Jiang etal.Nat.Biotechnol.31(3).233-239(2013)；和Jinek et al.Science,337(6096),816-821(2012)；其通过引用并入本文。

如本文所用，“指导序列”或“靶向序列”是指gRNA的核苷酸序列，无论是单分子的还是模块化的，其与需要编辑的细胞基因组中的DNA序列内的靶结构域或靶多核苷酸完全或部分互补。指导序列通常长度为10-30个核苷酸，优选地长度为16-24个核苷酸(例如，长度为16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)，并且位于Cas9 gRNA的5’末端处或附近。

如本文所用，“靶结构域”或“靶多核苷酸序列”或“靶序列”是细胞基因组中与gRNA的指导序列互补的DNA序列。

在CRISPR复合体的形成的环境下，“靶序列”指代指导序列被设计为与其具有一定互补性的序列，其中靶序列和指导序列之间的杂交促进CRISPR复合体的形成。只要有足够的互补性来引起杂交并促进CRISPR复合体的形成，就不必需要完全的互补性。靶序列可以包括任意多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。在某些实施方式中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在其它实施方式中，靶序列可以在真核细胞的细胞器内，例如线粒体或细胞核。通常，在CRISPR系统的环境下，CRISPR复合体(包括与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致靶序列中或附近(例如，在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内)的一条或两条链的切割。与靶序列一样，据信只要这足以发挥作用，就不需要完全的互补性。

在某些实施方式中，将驱动CRISPR系统的一个或多个元件的表达的一种或多种载体引入宿主细胞，使得CRISPR系统的这些元件的表达引导CRISPR复合体在一个或多个靶位点处的形成。例如，Cas核酸酶、crRNA和tracrRNA可以各自在单独载体上与单独的调节元件可操作地连接。可选地，由相同或不同调节元件表达的元件中的两种或更多种可以组合在单个载体中，其中一种或多种另外的载体提供CRISPR系统的未包括在第一载体中的任意组分。组合在单个载体中的CRISPR系统元件可以按任意合适的取向布置，如一个元件相对于第二元件位于5’(“在上游”)或相对于第二元件位于3’(“在下游”)。一个元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的相同或相对的链上，并且沿相同或相对方向定向。在某些实施方式中，单个启动子驱动编码CRISPR酶的转录物和指导序列、tracr伴侣序列(任选地可操作地连接到指导序列)和嵌入一个或更多个内含子序列中的tracr序列(例如，每一个都在不同的内含子中，两个或更多个在至少一个内含子中，或全部都在单个内含子中)中一个或多个的表达。

在某些实施方式中，CRISPR酶是包含一个或多个异源蛋白质结构域的融合蛋白(例如，除了CRISPR酶之外，还有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个结构域)的一部分。CRISPR酶融合蛋白可包含任意另外的蛋白质序列，以及任选地任意两个结构域之间的连接体序列。可与CRISPR酶融合的蛋白质结构域的实例包括但不限于表位标签、报道基因序列和具有以下一种或多种活性的蛋白质结构域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录活化活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。在美国专利申请公开号US20110059502(其通过引用并入本文)中描述了可构成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的其它结构域。在某些实施方式中，带标签的CRISPR酶用于鉴定靶序列的位置。

常规的基于病毒和基于非病毒的基因转移方法可用于在哺乳动物和非哺乳动物细胞或靶组织中引入核酸。这样的方法可用于将编码CRISPR系统的组分的核酸施用于培养中的或宿主生物体中的细胞。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如，本文所述载体的转录物)、裸核酸和与递送媒剂如脂质体复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA病毒和RNA病毒，其在递送到细胞后具有附加型或整合后的基因组(Anderson,1992,Science 256:808-813；和Yu,et al.,1994,Gene Therapy 1:13-26)。

在一些实施方式中，CRISPR/Cas衍生自II型CRISPR/Cas系统。在其它实施方式中，CRISPR/Cas系统衍生自Cas9核酸酶。可在本公开中使用的示例性Cas9核酸酶包括但不限于化脓性链球菌Cas9(S.pyogenes Cas9,SpCas9)、金黄色葡萄球菌Cas9(S.aureus Cas9,SaCas9)、嗜热链球菌Cas9(S.thermophilus Cas9,StCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(N.meningitidis Cas9,NmCas9)、空肠弯曲菌Cas9(C.jejuni Cas9,CjCas9)和土芽孢杆菌Cas9(Geobacillus Cas9,GeoCas9)。

通常，Cas蛋白包含至少一个RNA识别和/或RNA结合结构域。RNA识别和/或RNA结合结构域与指导RNA相互作用。Cas蛋白还可以包含核酸酶结构域(即DNase或RNase结构域)、DNA结合结构域、解旋酶结构域、RNAse结构域、蛋白质-蛋白质相互作用结构域、二聚化结构域以及其它结构域。Cas蛋白可以被修饰以增加核酸结合亲和力和/或特异性、改变酶促活性和/或改变该蛋白的其它性质。在某些实施方式中，融合蛋白的Cas样蛋白可衍生自野生型Cas9蛋白或其片段。在其它实施方式中，Cas可以衍生自修饰的Cas9蛋白。例如，Cas9蛋白的氨基酸序列可以被修饰以改变该蛋白的一种或多种性质(例如，核酸酶活性、亲和力、稳定性等)。可选地，可以从Cas9蛋白中消除该蛋白的不参与RNA指导的切割的结构域，使得修饰的Cas9蛋白小于野生型Cas9蛋白。通常，Cas9蛋白包含至少两个核酸酶(即DNase)结构域。例如，Cas9蛋白可以包含RuvC样核酸酶结构域和HNH样核酸酶结构域。RuvC和HNH结构域一起工作来切割单链，从而在DNA中形成双链断裂。(Jinek,et al.,2012,Science,337:816-821)。在某些实施方式中，Cas9衍生蛋白可以被修饰为仅包含一个功能性核酸酶结构域(RuvC样或HNH样核酸酶结构域)。例如，可以对Cas9衍生蛋白进行修饰使得其中一个核酸酶结构域被缺失或突变，使得其不再具有功能(即，核酸酶活性不存在)。在其中一个核酸酶结构域无活性的一些实施方式中，Cas9衍生蛋白能够将切口引入双链核酸(这种蛋白质被称为“切口酶”)，但并不切割双链DNA。在任意上述实施方式中，任意或所有的核酸酶结构域都可以使用公知的方法(如位点定向诱变、PCR介导的诱变和总基因合成)以及本领域已知的其它方法，通过一种或多种缺失突变、插入突变和/或取代突变来失活。

在一个非限制性实施方式中，载体驱动CRISPR系统的表达。本领域充满在本公开中有用的合适的载体。待使用的载体适于在真核细胞中复制和任选地整合。典型的载体包含可用于调控所需核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。本公开的载体也可用于核酸标准基因递送方案。基因递送的方法是本领域已知的(美国专利号5,399,346、5,580,859和5,589,466，其通过引用以其整体并入本文)。

此外，载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的，并且在例如Sambrook et al.(第4版,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York,2012)和其它病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、辛德比斯病毒、γ-逆转录病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种生物体中具有复制功能的来源、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择性标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。

在一些实施方式中，指导RNA(一种或多种)和Cas9可以作为核糖核蛋白(RNP)复合体(例如，Cas9/RNA蛋白复合体)递送到细胞。RNP由与gRNA复合的纯化的Cas9蛋白组成，并且被有效递送到多种类型的细胞——包括但不限于干细胞和免疫细胞——在本领域中是公知的(Addgene,Cambridge,MA,Mirus Bio LLC,Madison,WI)。在一些实施方式中，通过电穿孔将Cas9/RNA蛋白复合体递送到细胞中。

在一些实施方式中，使用CRISPR/Cas9编辑本公开的修饰细胞以破坏编码Fli1的内源性基因座。用于破坏Fli1的合适的gRNA在本文中列出(参见表1和表2)并且包括但不限于SEQ ID NO:152-156和SEQ ID NO:676-713。本领域技术人员将理解，指导RNA序列可用胸苷(T)或尿苷(U)核苷酸叙述。

表2：人类Fli1 sgRNA

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CRISPR介导的修饰的非限制性类型包括取代、插入、缺失和插入/缺失(INDEL)。修饰可以位于编码Fli1的内源性基因座的任意部分，包括但不限于外显子、剪接供体或剪接受体。

在某些实施方式中，指导RNA包含与编码Fli1的内源性基因座中的靶序列充分互补的指导序列。在某些实施方式中，指导RNA包含与编码Fli1的内源性基因座中的靶序列充分互补的指导序列，如，例如包含SEQ ID NO:152-156或SEQ ID NO:676-713中所列序列中的任一个的指导序列。

在某些实施方式中，修饰细胞对细胞功能障碍具有抗性。在某些实施方式中，修饰细胞对细胞衰竭具有抗性。在某些实施方式中，修饰细胞是自体细胞。在某些实施方式中，修饰细胞是从人类对象分离的细胞。在某些实施方式中，修饰细胞是修饰的免疫细胞。在某些实施方式中，修饰细胞是修饰的T细胞。在某些实施方式中，修饰细胞是对T细胞衰竭具有抗性的修饰的T细胞。在某些实施方式中，修饰细胞是对T细胞功能障碍具有抗性的修饰的T细胞。

在一些方面中，所提供的组合物和方法包括免疫细胞组合物中至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的免疫细胞含有所需基因修饰的那些组合物和方法。例如，在引入用于敲除或基因破坏内源性基因(例如，Fli1)的剂(例如gRNA/Cas9)的细胞组合物中约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的免疫细胞包含基因破坏；不表达所靶向内源性多肽，或不包含所靶向基因的邻接和/或功能拷贝。在一些实施方式中，根据本公开的方法、组合物和细胞包括在引入用于敲除或基因破坏所靶向基因的剂(例如gRNA/Cas9)的细胞组合物中至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞不表达诸如免疫细胞的表面上的所靶向多肽的那些方法、组合物和细胞。在一些实施方式中，在引入用于敲除或基因破坏所靶向基因的剂(例如gRNA/Cas9)的细胞组合物中至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞在两个等位基因中被敲除，即在这样的百分比的细胞中包含双等位基因缺失。

在一些实施方式中，提供了这样的组合物和方法，其中所靶向基因中或附近(例如在切割位点上游或下游100个碱基对内或约100个碱基对内，50个碱基对内或约50个碱基对内，或25个碱基对内或约25个碱基对内，或10个碱基对内或约10个碱基对内)的Cas9介导的切割效率(％indel)在已引入用于敲除或基因破坏所靶向基因的剂(例如gRNA/Cas9)的细胞组合物的细胞中是至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

在一些实施方式中，所提供的细胞、组合物和方法导致在引入用于敲除或基因破坏所靶向基因的剂(例如gRNA/Cas9)的细胞组合物中至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞中通过内源性递送的信号的减少或破坏。

在一些实施方式中，根据所提供的公开内容的包含经重组受体改造的细胞且包含内源性基因表达的减少、缺失、消除、敲除或破坏(例如Fli1的基因破坏)的组合物当在相同条件下评估时，与包含该受体但不包含基因的基因破坏或表达多肽的相应或参考组合物的改造细胞中所表达的受体相比，保持受体的功能性或活性。在一些实施方式中，所提供的组合物的改造细胞当在相同条件下评估时，与包含这样的经重组受体改造但不包含基因破坏或表达所靶向多肽的改造细胞的相应或参考组合物相比，保持功能性或活性。在一些实施方式中，与这样的相应或参考组合物相比，细胞保持细胞毒性、增殖、存活或细胞因子分泌。

在一些实施方式中，组合物中的免疫细胞当在相同条件下评估时，与相应或参考组合物中的细胞的表型相比，保持免疫细胞的表型。在一些实施方式中，组合物中的细胞包括幼稚细胞、效应记忆细胞、中枢记忆细胞、干中枢记忆细胞、效应记忆细胞和长寿效应记忆细胞(long-lived effector memory cells)。在一些实施方式中，包含所靶向基因(例如，Fli1)的基因破坏的该百分比T细胞表现出与不包含基因破坏的细胞的相应或参考群或组合物相同或基本相同的非活化的长寿记忆或中枢记忆表型。在一些实施方式中，可以在体外测定中测量这样的性质、活性或表型。在一些实施方式中，任意经评估的活性、性质或表型都可以在电穿孔或剂的其它引入后于各种天数进行评估，诸如3、4、5、6、7天后或上至3、4，5、6，7天。在一些实施方式中，当在相同条件下评估时，与含有不包含所靶向基因的基因破坏的细胞的相应组合物的活性相比，组合物中至少80％、85％、90％、95％或100％的细胞保持这样的活性、性质或表型。

如本文所用，对“相应组合物”或“相应免疫细胞群”(也称为“参考组合物”或“参考细胞群”)的提及是指在相同或基本相同的条件下获得、分离、生成、产生和/或孵育的免疫细胞(例如，T细胞)，不同之处在于免疫细胞或免疫细胞群未将剂引入。在一些方面中，除了不包含剂的引入，这样的免疫细胞受到与已将剂引入的免疫细胞相同或基本相同的处理，使得能够影响细胞活性或性质的任一种或多种条件(包括抑制分子的上调或表达)在细胞间没有变化或基本没有变化——除了剂的引入之外。

用于评估T细胞标记的表达和/或水平的方法和技术是本领域已知的。用于检测这种标记的抗体和试剂是本领域公知的，并且容易获得。检测此类标记的测定和方法包括但不限于流式细胞术，包括细胞内流式细胞术、ELISA、ELISPOT、流式微珠阵列术(cytometricbead array)或其它多重方法、蛋白质印迹和其它基于免疫亲和性的方法。在一些实施方式中，可以通过流式细胞术或其它基于免疫亲和性的方法检测细胞的针对这种细胞所特有的标记的表达，然后可以对这种细胞共染色来检测另一种或多种细胞表面标记。

在一些实施方式中，细胞、组合物和方法提供待过继转移的免疫细胞(例如T细胞)中靶基因表达的缺失、敲除、破坏或减少。在一些实施方式中，方法是在诸如来自对象的原代免疫细胞(例如T细胞)的原代细胞上离体进行的。在一些方面中，生产或生成这种基因改造T细胞的方法包括将一种或多种能够破坏待靶向的基因(例如Fli1)的剂引入含有免疫细胞(例如T细胞)的细胞群中。如本文所用，术语“引入”涵盖在体外或体内将DNA引入细胞的各种方法，这些方法包括转化、转导、转染(例如电穿孔)和感染。载体可用于将DNA编码分子引入细胞。可能的载体包括质粒载体和病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体或其它载体如腺病毒载体或腺相关载体。

含有T细胞的细胞群可以是从对象获得的细胞，如从外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级的T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采血液成分术产物或白细胞提取法产物获得的细胞。在一些实施方式中，可以使用阳性或阴性选择和富集方法分离或选择T细胞以富集群中的T细胞。在一些实施方式中，群包含CD4+、CD8+或CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方式中，引入编码基因改造抗原受体的核酸的步骤和引入剂(例如Cas9/gRNA RNP)的步骤可以同时或按任意顺序相继发生。在一些实施方式中，在引入外源性受体和一种或多种基因编辑剂(例如Cas9/gRNA RNP)之后，在刺激细胞扩增和/或增殖的条件下培养或孵育细胞。

因此，提供了增强免疫细胞如T细胞在过继性细胞疗法中的功能的细胞、组合物和方法，包括诸如通过增加所施用的基因改造细胞的活性和效力，同时随时间推移维持对所转移细胞的持久性或暴露的那些提供改进的功效的细胞、组合物和方法。在一些实施方式中，与某些可用的方法相比，基因改造细胞当在体内向对象施用时表现出增加的扩增和/或持久性。在一些实施方式中，所提供的免疫细胞当在体内向对象施用时表现出增加的持久性。在一些实施方式中，基因改造免疫细胞在施用后于对象中的持久性与通过替代方法——诸如那些涉及通过不向T细胞引入减少编码内源性受体的基因的表达或破坏该基因的剂的方法施用基因改造的细胞的方法——所将实现的持久性相比更大。在一些实施方式中，持久性增大至少或约至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。

在一些实施方式中，所施用细胞的持久度或持久程度可以在向对象施用后检测或定量。例如，在一些方面中，定量PCR(qPCR)用于评估对象的血液或血清或器官或组织(例如，疾病部位)中细胞的数量。在一些方面中，持久性被量化为每微克DNA编码外源性受体的DNA或质粒的拷贝数，或每微升样品(例如血液或血清)表达受体的细胞数，或每微升样品外周血单核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞的各总数。在一些实施方式中，也可以进行流式细胞术测定，其通常使用对细胞具有特异性的抗体来检测细胞。基于细胞的测定也可用于检测功能性细胞——诸如能够结合和/或中和和/或诱导对抗疾病或状况的细胞或表达受体所识别的抗原的细胞的反应(例如，细胞毒性反应)——的数目或百分比。在任意这样的实施方式中，与细胞相关的另一种标记的表达程度或水平可用于区分对象中的所施用细胞与内源性细胞。

C.免疫细胞的来源

在一些实施方式中，从对象获得免疫细胞的来源以供离体操纵。供离体操纵的靶细胞的来源还可包括，例如，自体或异源供体血液、脐带血或骨髓。例如，免疫细胞的来源可来自待用本公开的修饰的免疫细胞处理的对象，例如，对象的血液、对象的脐带血或对象的骨髓。对象的非限制性实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。优选地，对象是人。

免疫细胞可从多种来源获得，包括血液、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织、脐带、淋巴或淋巴器官。免疫细胞是免疫系统的细胞，如先天性免疫或适应性免疫的细胞，例如，髓样细胞或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，一般是T细胞和/或NK细胞。其它示例性细胞包括干细胞，如多能干细胞和多潜能干细胞，包括诱导多潜能干细胞(iPSC)。在某些方面中，这些细胞是人细胞。对于待处理的对象，这些细胞可以是同种异体和/或自体的。这些细胞一般是原代细胞，诸如那些从对象直接分离和/或从对象分离并冷冻的细胞。

在某些实施方式中，免疫细胞是T细胞，例如，CD8+T细胞(例如，CD8+幼稚T细胞、中枢记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4+T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、调节T细胞(Treg)、干细胞记忆T细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)或树枝状细胞。在一些实施方式中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如，髓样细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树枝状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。在一个实施方式中，靶细胞是诱导多潜能干(iPS)细胞或源自iPS细胞的细胞，例如，从对象生成的iPS细胞，经操纵以改变(例如，诱导一个或多个靶基因的突变)或操纵一个或多个靶基因的表达，并分化成例如T细胞，例如CD8+T细胞(例如，CD8+幼稚T细胞、中枢记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4+T细胞、干细胞记忆T细胞、淋巴祖细胞或造血干细胞。

在一些实施方式中，细胞包括一个或多个T细胞亚群或其它细胞类型，如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞，及其亚群，如由功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或隔室中的存在、标记或细胞因子分泌概况(profile)和/或分化程度所定义的那些。在T细胞和/或CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的亚型和亚群中的是幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，如干细胞记忆T细胞(TSCM)、中枢记忆T细胞(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在的和适应性调节T(Treg)细胞、辅助性T细胞，如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助性T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。在某些实施方式中，可以使用本领域中可获得的任意数量的T细胞系。

在一些实施方式中，方法包括从对象分离免疫细胞，对其制备、处理、培养和/或改造。在一些实施方式中，改造细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。所述用于改造的细胞可从样品(如生物样品，例如，获自或源自对象的生物样品)中分离。在一些实施方式中，从中分离细胞的对象是患有疾病或状况或需要细胞疗法或将要对其施用细胞疗法的对象。在一些实施方式中，对象是需要特定治疗干预(诸如细胞进行分离、处理和/或改造的过继性细胞疗法)的人。因此，一些实施方式中的细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。样品包括组织、流体和直接取自对象的其它样品，以及得自一个或多个处理步骤，如分离、离心、基因改造(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品，也可以是经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液，如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液、组织和器官样品，包括源自其中的经处理的样品。

在一些方面中，细胞源自或从中分离的样品是血液样品或源自血液的样品，或是或源自单采血液成分术产物或白细胞提取法产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其它淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其它器官和/或源自其的细胞。在细胞疗法(例如，过继性细胞疗法)的环境下，样品包括来自自体来源和同种异体来源的样品。

在一些实施方式中，细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方式中细胞获自异种来源，例如获自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备步骤和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些实例中，细胞在一种或多种试剂的存在下被洗涤、离心和/或孵育，从而例如去除不需要的组分、富集所期望的组分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、大小、敏感性和/或对特定组分的抗性)来分离细胞。

在一些实例中，例如通过单采血液成分术或白细胞提取法从对象的循环血液中获得细胞。在一些方面中，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和/或血小板，而在一些方面中包含除红细胞和血小板之外的细胞。在一些实施方式中，洗涤从对象收集的血细胞，从而例如去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于后续处理步骤。在一些实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些方面中，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)来完成洗涤步骤。在一些实施方式中，细胞在洗涤后被重悬于多种生物相容性缓冲液中。在某些实施方式中，去除血细胞样品的组分并且将细胞直接重悬于培养基中。在一些实施方式中，方法包括基于密度的细胞分离方法，诸如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血制备白细胞。

在一个实施方式中，通过单采血液成分术或白细胞提取法获得来自个体的循环血液的免疫。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。可洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，或洗涤溶液缺乏钙并且可能缺乏镁或可能缺乏许多(甚至所有的)二价阳离子以用于后续处理步骤。洗涤后，细胞可重悬于多种生物相容性缓冲液中，如，例如无钙无镁的PBS。可选地，可以去除单采血液成分术样品的不期望的组分并将细胞直接重悬于培养基中。

在一些实施方式中，分离方法包括基于一种或多种特异性分子，如表面标记(例如，表面蛋白)、胞内标记或核酸在细胞中的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方式中，可以使用基于此类标记的任意已知的分离方法。在一些实施方式中，分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面中，分离包括基于细胞的表达或一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的表达水平对细胞和细胞群进行的分离，例如，通过与特异性地结合此类标记的抗体或结合伙伴孵育，之后大体上是洗涤步骤和将结合了抗体或结合伙伴的细胞与未结合该抗体或结合伙伴的细胞分离。

这种分离步骤可以基于阳性选择，其中保留已结合试剂的细胞以供进一步使用，和/或基于阴性选择，其中保留未结合抗体或结合伙伴的细胞。在一些实例中，这两部分都被保留以供进一步使用。在一些方面中，阴性选择在没有可用于在异质群体中特异性地鉴定细胞类型的抗体的情况下会特别有用，使得基于由除了所期望的群体之外的细胞所表达的标记进行分离是最佳的。分离无需导致特定细胞群或表达特定标记的细胞的100％富集或去除。例如，对特定类型的细胞(诸如表达标记的细胞)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不必导致不表达该标记的细胞的完全缺失。同样地，特定类型细胞(诸如表达标记的细胞)的阴性选择、去除或耗竭是指减少此类细胞的数量或百分比，但不必导致完全去除所有此类细胞。

在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中从一个步骤经阳性选择或阴性选择的部分经历另一分离步骤，诸如后续的阳性选择或阴性选择。在一些实例中，单个分离步骤可同时耗竭表达多个标记的细胞，诸如通过将细胞与多个抗体或结合伙伴孵育，每个抗体或结合伙伴都对阴性选择所靶向的标记具有特异性。同样地，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多个抗体或结合伙伴孵育，可以同时阳性选择出多种细胞类型。

在一些实施方式中，针对对一个或多个特定标记(如表面标记)呈阳性(标记⁺)或表达高水平(标记^高)的一个或多个特定标记的细胞来富集T细胞群中的一个或多个或使其从上述细胞中耗竭，或针对对一个或多个标记呈阴性(标记^-)或表达相对低水平(标记^低)的一个或多个标记的细胞来富集T细胞群中的一个或多个或使其从上述细胞中耗竭。例如，在一些方面中，通过阳性选择技术或阴性选择技术分离T细胞的特异性亚群，诸如呈阳性的或表达高水平的一个或多个表面标记的细胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。在某些情况下，此类标记是在某些T细胞群(如非记忆细胞)上缺失或以相对较低水平表达，但在某些其它T细胞群(如记忆细胞)上存在或以相对较高水平表达的标记。在一个实施方式中，针对呈阳性的或表达高表面水平CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L的细胞来富集(即，阳性选择)细胞(如CD8+细胞或T细胞，例如，CD3+细胞)和/或使其从呈阳性的或表达高表面水平CD45RA的细胞中耗竭(例如，阴性选择)。在一些实施方式中，针对呈阳性的或表达高表面水平CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra(CD127)的细胞来富集细胞或使其从上述细胞中耗竭。在一些实例中，针对对CD45RO呈阳性(或对CD45RA呈阴性)且对CD62L呈阳性的细胞来富集CD8+T细胞。例如，可以使用CD3/CD28共轭磁珠(例如，M-450CD3/CD28T Cell Expander)阳性选择CD3+、CD28+T细胞。

在一些实施方式中，通过在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其它白细胞)上表达的标记(如CD 14)的阴性选择，从PBMC样品中分离T细胞。在一些方面中，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一个或多个幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或表达到相对较高程度的标记进行阳性选择或阴性选择，可将此类CD4+和CD8+群体进一步分选为亚群。在一些实施方式中，诸如通过基于与相应亚群相关联的表面抗原的阳性选择或阴性选择，针对幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞来进一步富集CD8+细胞或使其从上述细胞中耗竭。在一些实施方式中，对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以提高功效，从而在施用后诸如提高长期存活、扩增和/或移植，这在某些方面在此类亚群中是尤其稳健的。在一些实施方式中，将富集TCM的CD8+T细胞和CD4+T细胞组合，进一步增强功效。

在一些实施方式中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚群中。可诸如使用抗CD8抗体和抗CD62L抗体，针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+部分来富集PBMC或将其从上述部分中耗竭。在一些实施方式中，CD4+T细胞群和CD8+T细胞亚群，例如，是针对中枢记忆T(TCM)细胞富集的亚群。在一些实施方式中，对中枢记忆T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面中，其基于对表达或高表达CD45RA和/或粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面中，通过耗竭表达CD4、CD14、CD45RA的细胞和对表达CD62L的细胞阳性选择或富集来进行针对TCM细胞富集的CD8+群体的分离。一方面，对中枢记忆T(TCM)细胞进行的富集以基于CD4表达所选择的细胞的阴性部分开始，该阴性部分经历基于CD14和CD45RA的表达的阴性选择，并且经历基于CD62L的阳性选择。在一些方面中，这种选择是同时进行的，而在其它方面中，是以任一顺序相继进行的。在一些方面中，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性部分和阴性部分都得以保留，并且任选地在一个或多个其它阳性选择或阴性向选择步骤之后用于方法的后续步骤中。

通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分选为幼稚细胞、中枢记忆细胞和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方式中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方式中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方式中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO。在一个实例中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CDl lb、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方式中，抗体或结合伙伴与固体载体或基质如磁珠或顺磁性珠结合，以允许分离细胞用于阳性和/或阴性选择。

在一些实施方式中，细胞在基因改造之前或与基因改造结合时被孵育和/或培养。孵育步骤可以包括培养(culture)、培育(cultivation)、刺激、活化和/或繁殖。在一些实施方式中，在刺激条件或刺激剂存在下孵育组合物或细胞。这种条件包括那些被设计用于诱导细胞在群体中增殖、扩增、活化和/或存活以模拟抗原暴露，或和/启动细胞以进行基因改造(诸如用于将重组抗原受体引入)的条件。这些条件可包括以下中的一个或多个：特定的培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、剂，例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伙伴、融合蛋白、重组可溶性受体)以及被设计以使细胞活化的任意其它剂。在一些实施方式中，刺激条件或剂包括一种或多种剂，例如，配体，其能够活化TCR复合体的胞内信号传导结构域。在一些方面中，该剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3胞内信号传导级联。此类剂可包括抗体，诸如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的抗体，例如，例如结合固体载体(诸如珠)的抗CD3、抗CD28，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法可进一步包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)的步骤。在一些实施方式中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，至少约10单位/mL的IL-2浓度。

在另一个实施方式中，通过裂解红细胞并耗竭单核细胞，例如通过PERCOLL^TM梯度离心将T细胞从外周血中分离出来。可选地，T细胞可以从脐带中分离出来。在任何情况下，特定T细胞亚群都可以通过阳性选择技术或阴性选择技术进一步分离。

可以从表达某些抗原，包括但不限于CD34、CD8、CD14、CD19和CD56的细胞中耗竭如此分离的脐带血单核细胞。可使用分离的抗体、包含抗体的生物样品(如腹水)、结合到物理载体的抗体和细胞结合抗体来完成对这些细胞的耗竭。

通过阴性选择富集T细胞群可以使用针对以阴性方式选择的细胞所特有的表面标记的抗体的组合来实现。优选方法是通过使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体混合物的阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集CD4⁺细胞，单克隆抗体混合物通常包括抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8抗体。

为了通过阳性选择或阴性选择来分离所期望的细胞群，可以改变细胞的浓度和表面(例如，颗粒，如珠子)。在某些实施方式中，会期望显著减少珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在其它实施方式中，使用大于1亿个细胞/ml。在其它实施方式中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施方式中，使用7500、8000、8500、9000、9500万个或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在其它实施方式中，可使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量增加、细胞活化和细胞扩增。

T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻，不需要去除单核细胞的步骤。虽然不希望受到理论的束缚，但冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和在某种程度上去除单核细胞提供了更为均一的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，细胞可以悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在此环境下将是有用的，但在非限制性实例中，一种方法涉及使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或其它合适的细胞冷冻介质。然后以每分钟1℃的速率将细胞冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的汽相中。可使用其它的受控冷冻方法，也可在-20℃下或在液氮中立即进行非受控冷冻。

在一个实施方式中，T细胞群包含在诸如外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系的细胞内。在另一实施方式中，外周血单核细胞包含T细胞群。在又一实施方式中，纯化的T细胞包含T细胞群。

在某些实施方式中，可从样品中分离T调节细胞(Treg)。样品可包括但不限于脐带血或外周血。在某些实施方式中，通过流式细胞术分选来分离Treg。在分离之前，可通过本领域已知的任意手段富集样品中的Treg。分离的Treg可冷冻保存，和/或在使用前扩增。分离Treg的方法在美国专利号：7,754,482、8,722,400和9,555,105以及美国专利申请号13/639,927(其内容以其整体并入本文中)中有所描述。

D.产生修饰的免疫细胞的方法

本公开提供了产生或生成修饰的免疫细胞或其前体(例如，T细胞)的方法。

在某些实施方式中，本公开提供了生成修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括将CRISPR系统引入免疫细胞或前体细胞，所述CRISPR系统包含一种或多种能够下调内源性Fli1的基因表达的多肽和/或核酸。

在一些实施方式中，通过表达载体将核酸引入细胞中。合适的表达载体包括慢病毒载体、γ逆转录病毒载体、泡沫病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、改造的杂合病毒、裸DNA，包括但不限于转座子介导的载体，如睡美人(Sleeping Beauty)、Piggybak、和整合酶类如Phi31。一些其它合适的表达载体包括单纯疱疹病毒(HSV)表达载体和逆转录病毒表达载体。

在某些实施方式中，通过病毒转导将核酸引入细胞中。在某些实施方式中，病毒转导包括使免疫细胞或前体细胞与包含核酸的病毒载体接触。在某些实施方式中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在某些实施方式中，AAV载体包括5’ITR和3’ITR。在某些实施方式中，AAV载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(Woodchuck Hepatitis Virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)。在某些实施方式中，AAV载体包含聚腺苷酸化(polyA)序列。在某些实施方式中，polyA序列是牛生长激素(BGH)polyA序列。

腺病毒表达载体基于腺病毒，腺病毒整合到基因组DNA的能力低，但转染宿主细胞的效率高。腺病毒表达载体包含的腺病毒序列足以：(a)支持表达载体的包装和(b)在宿主细胞中最终表达靶序列。在一些实施方式中，腺病毒基因组是36kb的线性双链DNA，其中可插入外来DNA序列以取代腺病毒DNA的大片段，从而制成本公开的表达载体(参见，例如，Danthinne和Imperiale,Gene Therapy(2000)7(20):1707-1714)。

另一表达载体基于腺相关病毒(AAV)，腺相关病毒利用腺病毒偶联的系统。此AAV表达载体整合到宿主基因组的频率高。其可感染非分裂细胞，从而使其用于例如在组织培养物中或体内将基因递送到哺乳动物细胞中。AAV载体对宽泛的宿主范围具有感染性。有关AAV载体的生成和使用的细节在美国专利号5,139,941和4,797,368中有所描述。

逆转录病毒表达载体能够整合到宿主基因组中，从而递送大量的外来基因物质、感染广谱的物种和细胞类型和被包装到特殊的细胞系中。逆转录病毒载体通过将核酸插入病毒基因组中的某些位置从而产生复制缺陷的病毒来构建。尽管逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型，但是基因/蛋白的整合与稳定表达要求宿主细胞的分裂。

慢病毒载体源自慢病毒，慢病毒是复合物逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，慢病毒载体还包含具有调控和结构功能的其它基因(参见，例如，美国专利号6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体是通过多次消减HIV毒力基因产生的，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，从而使得该载体在生物学上是安全的。慢病毒载体能够感染非分裂细胞并且既可用于体内基因转移和表达，又可用于离体基因转移和表达(参见，例如，美国专利号5,994,136)。

包括本公开的核酸的表达载体可通过本领域技术人员已知的任何手段引入到宿主细胞中。如果需要，表达载体可包括用于转染的病毒序列。可选地，表达载体可通过融合、电穿孔、生物射弹、转染、脂质转染等引入。在引入表达载体之前，宿主细胞可在培养物中生长和扩增，之后对载体的引入和整合进行适当处理。宿主细胞然后被扩增并且可借助载体中存在的标记来筛选。本领域已知可以使用的各种标记，并且可以包括hprt、新霉素抗性、胸腺嘧啶激酶、潮霉素抗性等。如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”可以互换使用。在一些实施方式中，宿主细胞是免疫细胞或其前体，例如T细胞、NK细胞或NKT细胞。

本公开还提供了基因改造细胞，其中内源性Fli1被破坏。在一些实施方式中，基因改造细胞是能够引起治疗相关成果的基因改造的T-淋巴细胞(T细胞)、幼稚T细胞(TN)、记忆T细胞(例如，中枢记忆T细胞(TCM)、效应记忆细胞(TEM))、自然杀伤细胞(NK细胞)和巨噬细胞。在某些实施方式中，基因改造细胞是自体细胞。在某些实施方式中，修饰细胞对T细胞衰竭有抗性。在某些实施方式中，修饰细胞对T细胞功能障碍有抗性。

修饰细胞可通过用包括本公开的核酸的表达载体稳定转染宿主细胞产生。生成本公开的修饰细胞的其它方法非限制地包括化学转变方法(例如，使用磷酸钙、树枝状大分子、脂质体和/或阳离子聚合物)、非化学转变方法(例如，电穿孔、光学转变、基因电转移和/或流体动力学递送)和/或基于粒子的方法(例如，穿刺转染(impalefection)、使用基因枪和/或磁性转染(magnetofection))。本公开的转染后的细胞可离体扩增。

用于将表达载体引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域是公知的。参见，例如，Sambrook et al.(2001),Molecular Cloning:ALaboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York。用于将表达载体引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。

适合使用的脂质可从商业来源获得。例如，可以从Sigma,St.Louis,MO获得二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)；双十六烷基磷酸(dicetyl phosphate)(“DCP”)可从K&KLaboratories(PlannView,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储备溶液可储存在-20℃左右。氯仿可作为唯一溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是上位术语，其涵盖由封闭的脂质双层或聚集物的生成所形成的多种单一和多层的脂质媒剂。脂质体的特征可在于具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层膜脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh et al.,1991Glycobiology 5:505-10)。还涵盖在溶液中结构不同于正常囊泡结构的组合物。例如，脂质可以呈胶束结构，也可仅仅作为脂质分子的非均匀聚集物而存在。也考虑了lipofectamine-核酸复合物。

不管是用于将外源核酸引入宿主细胞，还是以其它方式将细胞暴露于本公开的抑制剂的方法，为了确认宿主细胞中存在核酸，可以执行各种测定。此类测定包括，例如，本领域技术人员公知的分子生物学测定，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；生物化学测定，诸如，例如通过免疫手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过落入本公开范围的本文所述的用于鉴别剂的测定来检测特定肽的存在或不存在。

在一个实施方式中，引入到宿主细胞的核酸是RNA。在另一个实施方式中，RNA是mRNA，其包含体外转录的RNA或合成RNA。RNA可利用聚合酶链式反应(PCR)生成的模板，通过体外转录产生。来自任意来源的感兴趣的DNA都可通过PCR直接转换成模板，以供使用适当的引物和RNA聚合酶体外合成mRNA。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任意其它适当的DNA来源。

PCR可用于生成mRNA体外转录的模板，然后将其引入细胞中。执行PCR的方法在本领域是公知的。用于PCR的引物被设计成具有与用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补的”是指引物序列中的大多数或所有碱基互补的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期DNA模板退火或杂交。引物可被设计成与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以设计引物来扩增基因的通常在细胞中转录的部分(开放阅读框)，包括5’UTR和3’UTR。引物还可被设计用于扩增基因的编码特定的感兴趣结构域的部分。在一个实施方式中，引物被设计成扩增人cDNA的编码区，包括5’UTR和3’UTR的全部或部分。用于PCR的引物通过本领域公知的合成方法生成。“正向引物”是含有核苷酸区域的引物，该核苷酸与待扩增DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互补。“上游”在本文中用于指代相对于编码链扩增的DNA序列的5’位。“反向引物”是含有核苷酸区域的引物，该核苷酸与待扩增DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补。“下游”在本文中用于指代相对于编码链扩增的DNA序列的3’位。

也可以使用能够促进RNA的稳定性和/或翻译效率的化学结构。RNA优选具有5’UTR和3’UTR。在一个实施方式中，5’UTR的长度在0和3000个核苷酸之间。添加到编码区的5’UTR序列和3’UTR序列的长度可以通过不同的方法改变，包括但不限于设计对UTR的不同区域退火的PCR引物。使用此方法，本领域普通技术人员可以修改在经转录的RNA转染之后实现最佳翻译效率所需的5’UTR和3’UTR长度。

5’UTR和3’UTR可以是感兴趣的基因的天然存在的内源性5’UTR和3’UTR。可选地，可以通过将对感兴趣的基因而言是非内源性的UTR序列并入正向引物和反向引物中或通过模板的任意其它修改来添加这些UTR序列。对感兴趣的基因而言是非内源性的UTR序列的使用可用于改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3’UTR序列中富含AU的元件会降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域公知的UTR的特性来选择或设计3’UTR以提高经转录的RNA的稳定性。

在一个实施方式中，5’UTR可包含内源性基因的Kozak序列。可选地，当如上所述通过PCR添加对感兴趣的基因而言是非内源性的5’UTR时，可以通过添加该5’UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但并不是所有RNA都需要Kozak序列才能实现高效翻译。许多mRNA对Kozak序列的要求是本领域已知的。在其它实施方式中，5’UTR可源自这样的RNA病毒：其RNA基因组在细胞中是稳定的。在其它实施方式中，可在3’UTR或5’UTR中使用各种核苷酸类似物以阻止mRNA的核酸外切酶降解。

为了能够从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，转录启动子应附着在待转录序列上游的DNA模板上。在充当RNA聚合酶启动子的序列被添加到正向引物的5’端时，RNA聚合酶启动子被并入到待转录开放阅读框上游的PCR产物中。在一个实施方式中，如本文其它部分所述，启动子是T7聚合酶启动子。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。本领域已知T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列。

在一个实施方式中，mRNA在5’端有一个帽和一个3’多聚(A)尾，其决定核糖体结合、翻译的起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板(例如，质粒DNA)上，RNA聚合酶产生不适合在真核细胞中表达的长的多联体产物。在3’UTR端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，其即使在转录后经过聚腺苷酸化，在真核转染中也是没有作用的。

在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录物的3’端延伸到模板的最后一个碱基之外(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。

转录DNA模板的多聚A/T片段可在PCR期间通过使用包含多聚T尾(如100T尾(大小可为50-5000T))的反向引物产生，或在PCR之后通过任意其它方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)产生。多聚(A)尾也提供RNA的稳定性并减少其降解。一般来说，多聚(A)尾的长度与经转录RNA的稳定性呈正相关。在一个实施方式中，多聚(A)尾在100和5000个腺苷之间。

利用多聚(A)聚合酶，如大肠杆菌多聚A聚合酶(E-PAP)，在体外转录后，RNA的多聚(A)尾可以进一步延伸。在一个实施方式中，将多聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300和400个核苷酸之间导致RNA的翻译效率提高约两倍。另外，不同化学基团在3’端的附着可以提高mRNA的稳定性。这种附着可以包含修饰的/人工的核苷酸、适体和其它化合物。例如，可以使用多聚(A)聚合酶将ATP类似物并入多聚(A)尾中。ATP类似物可以进一步提高RNA的稳定性。

5’帽也为RNA分子提供稳定性。在优选实施方式中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5’帽。利用本领域已知并在本文中描述的技术提供5’帽(Cougot,et al.,Trendsin Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski,et al.,RNA,7:1468-95(2001)；Elango,et al.,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。

在一些实施方式中，诸如以体外转录的RNA的形式将RNA电穿孔到细胞中。可包括适合细胞电穿孔的任何溶质——其可含有促进细胞通透性和活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。

所公开的方法可应用于在癌症、干细胞、急慢性感染和自身免疫疾病领域中对基础研究和治疗中的T细胞活性进行调节，包括评估基因修饰T细胞杀死靶癌细胞的能力。

这些方法还提供了通过改变例如启动子或输入RNA的量，在宽范围内控制表达水平的能力，从而使单独调控表达水平成为可能。此外，基于PCR的mRNA产生技术大大促进了具有不同结构及其结构域组合的mRNA的设计。

本公开的RNA转染方法的一个优点是RNA转染基本上是瞬时的并且是无载体的。RNA转基因可被递送到淋巴细胞中并在短暂的(brief)体外细胞活化后在其中表达——作为最小表达盒而不需要任何其它的病毒序列。在这些条件下，转基因整合到宿主细胞基因组是不可能的。由于RNA的转染效率以及其能够均一地修饰整个淋巴细胞群，因此不需要对细胞克隆。

用体外转录的RNA(IVT-RNA)对T细胞进行基因修饰，采用两种不同的策略，这两种策略先后都已在各种动物模型上进行了测试。通过脂质体转染或电穿孔，用体外转录的RNA转染细胞。为了实现所转移的IVT-RNA的长时间表达，期望使用各种修饰来稳定IVT-RNA。

一些IVT载体在文献中是已知的，它们以标准化的方式被用作体外转录的模板，并且以产生稳定RNA转录物的方式被基因修饰。本领域中目前使用的方案基于具有以下结构的质粒载体：实现RNA转录的5’RNA聚合酶启动子，之后是在3’和/或5’侧有非翻译区(UTR)的感兴趣的基因，以及含有50-70个A核苷酸的3’聚腺苷盒。在体外转录之前，环状质粒在聚腺苷盒下游被II型限制酶线性化(识别序列对应于切割位点)。因此，聚腺苷盒对应于转录物中后来的多聚(A)序列。此程序导致一些核苷酸在线性化后仍然作为酶切位点的一部分，并延伸或掩盖3’端的多聚(A)序列。尚不清楚这种非生理性的突出端是否会影响在胞内由这种构建物产生的蛋白质的量。

另一方面，通过电穿孔将RNA构建物递送到细胞中。例如，参见US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中教导的将核酸构建物电穿孔到哺乳动物细胞中的制剂和方法。任何已知细胞类型的电穿孔所需的各种参数(包括电场强度)在相关研究文献以及该领域的众多专利和申请中是普遍知晓的。参见例如美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗性应用的设备可商业获得，例如MedPulser^TMDNA Electroporation TherapySystem(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，并在诸如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223、美国专利号5,993,434、美国专利号6,181,964、美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482的专利中有所描述；电穿孔也可用于体外对细胞转染，例如US20070128708A1中所述。电穿孔也可用于在体外将核酸传递到细胞中。因此，利用本领域技术人员已知的多种可获得的装置和电穿孔系统中的任意装置和电穿孔系统进行的电穿孔介导的将核酸(包括表达构建物)施用到细胞中，展示了用于将感兴趣的RNA递送到靶细胞的令人兴奋的新手段。

在一些实施方式中，可以在引入编码基因编辑剂(例如Cas9/gRNA RNP)的核酸分子之前、期间和/或之后孵育或培养免疫细胞(例如T细胞)。在一些实施方式中，方法包括在引入基因编辑剂例如Cas9/gRNA RNP之前用刺激剂或活化剂(例如抗CD3/抗CD28抗体)活化或刺激细胞。在一些实施方式中，在引入剂之前，例如通过去除任何的刺激剂或活化剂来允许细胞静息(rest)。在一些实施方式中，在引入剂之前，不去除刺激剂或活化剂和/或细胞因子。

E.用修饰细胞处理的方法

本文所述的修饰细胞(例如T细胞)可包含在用于免疫疗法的组合物中。所述组合物可以包括药物组合物并且还包括药学上可接受的载剂。可以施用治疗有效量的包含修饰的T细胞的药物组合物。

在一个方面中，本文提供了用于过继性细胞转移疗法的方法，其包括向对其有需要的对象施用本公开的修饰细胞。在另一个方面中，本文提供了治疗对象的疾病或状况的方法，其包括向对其有需要的对象施用修饰细胞群。还包括了治疗对其有需要的对象的疾病或状况的方法，其包括向对象施用基因编辑的修饰细胞(例如，包括下调内源性Fli1的表达)。

施用免疫细胞以用于过继性细胞疗法的方法是已知的，并且可结合所提供的方法和组合物使用。例如，过继性T细胞疗法方法在授权Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；授权Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10):577-85)中进行了描述。参见，例如，Themeli et al.(2013)NatBiotechnol.31(10):928-933；Tsukahara et al.(2013)Biochem Biophys Res Commun438(1):84-9；Davila et al.(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。在一些实施方式中，细胞疗法(例如，过继性T细胞疗法)通过自体转移进行，其中细胞从待接受细胞疗法的对象中分离和/或以其它方式从待接受细胞疗法的对象制备，或来自源自这样的对象的样品。因此，在某些方面中，细胞源自对象(例如，需要治疗的患者)，并且细胞在分离和处理之后被施用至同一个对象。

在一些实施方式中，细胞疗法(例如，过继性T细胞疗法)通过同种异体转移来实施，其中细胞从除了待接受或最终接受细胞疗法的对象以外的对象(例如，第一对象)分离和/或以其它方式制备。在这样的实施方式中，然后将细胞施用至同一物种的不同对象，例如，第二对象。在一些实施方式中，第一对象和第二对象在遗传上是相同的。在一些实施方式中，第一对象和第二对象在遗传上是相似的。在一些实施方式中，第二对象表达与第一对象相同的HLA类别或超型。

在一些实施方式中，在施用细胞或含有细胞的组合物之前，对象已用靶向疾病或状况(例如，肿瘤)的治疗剂治疗过。在一些方面中，对象是其它治疗剂难治的或对其无反应。在一些实施方式中，对象例如在用其它治疗干预(包括化疗、放射和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如，同种异体HSCT)治疗之后患有持久性或复发性疾病。在一些实施方式中，尽管对象已对其它疗法有抗性，但施用仍有效地治疗对象。

在一些实施方式中，对象对其它治疗剂有反应，并且用该治疗剂治疗减轻了疾病负担。在一些方面中，对象最初对治疗剂有反应，但随着时间的推移表现出疾病或状况的复发。在一些实施方式中，对象没有复发。在一些这样的实施方式中，对象被确定处于复发风险，诸如处于高复发风险，因此预防性地施用细胞，从而例如降低复发的可能性或防止复发。在一些方面中，对象之前没有接受其它治疗剂的治疗。

在一些实施方式中，对象例如在用其它治疗干预(包括化疗、放射和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如，同种异体HSCT)治疗之后患有持久性或复发性疾病。在一些实施方式中，尽管对象已对其它疗法有抗性，但施用仍有效地治疗对象。

本公开的修饰的免疫细胞可施用于动物，优选哺乳动物，甚至更优选是人，以治疗癌症。此外，本公开的细胞可用于治疗与癌症相关的任何状况，特别是针对肿瘤细胞(一种或多种)的细胞介导的免疫反应，其中期望治疗或减轻疾病。待用本公开的修饰细胞或药物组合物治疗的癌症类型包括癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤和恶性瘤例如肉瘤、癌和黑素瘤。其它示例性癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲状腺癌等。癌症可以是非实体肿瘤(如血液肿瘤)或实体肿瘤。成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也包括在内。在一个实施方式中，癌症是实体肿瘤或血液肿瘤。在一个实施方式中，癌症是癌。在一个实施方式中，癌症是肉瘤。在一个实施方式中，癌症是白血病。在一个实施方式中，癌症是实体肿瘤。

实体肿瘤是通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体肿瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞类型命名(如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体肿瘤(如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也被称为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。

可顺应(amenable to)本文公开方法所进行的疗法的癌包括但不限于食管癌、肝细胞癌、基底细胞癌(一种皮肤癌形式)、鳞状细胞癌(各种组织)、膀胱癌(包括移行细胞癌(膀胱恶性肿瘤))、支气管癌、结肠癌、结直肠癌、胃癌、肺癌(包括肺部小细胞癌和非小细胞癌)、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肾细胞癌、导管原位癌或胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、成骨癌、上皮癌和鼻咽癌。

可顺应本文公开方法所进行的疗法的肉瘤包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和其它软组织肉瘤。

在某些示例性实施方式中，本公开的修饰的免疫细胞用于治疗骨髓瘤，或与骨髓瘤相关的状况。骨髓瘤或与其相关的状况的实例包括但不限于轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、意义未明单克隆免疫球蛋白血症(monoclonal gamopathy of underterminedsignificance)(MGUS)、浆细胞瘤(例如，单发性、多发性单发性、髓外浆细胞瘤)、淀粉样变性和多发性骨髓瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗多发性骨髓瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗难治性骨髓瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗复发性骨髓瘤。

在某些示例性实施方式中，本公开的修饰的免疫细胞用于治疗黑素瘤，或与黑素瘤相关的状况。黑素瘤或与其相关的状况的实例包括但不限于浅表扩展性黑素瘤、结节性黑素瘤、恶性小痣、肢端着色斑性黑素瘤、无色素性恶性黑素瘤或皮肤黑素瘤(例如，皮肤、眼、外阴、阴道、直肠黑素瘤)。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗皮肤黑素瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗难治性黑素瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗复发性黑素瘤。

在又其它示例性实施方式中，本公开的修饰的免疫细胞用于治疗肉瘤，或与肉瘤相关的状况。肉瘤或与其相关的状况的实例包括但不限于血管肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、纤维肉瘤、胃肠间质瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性外周神经鞘瘤、骨肉瘤、多形性肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗滑膜肉瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗脂肪肉瘤，如粘液/圆细胞脂肪肉瘤、分化/去分化脂肪肉瘤和多形性脂肪肉瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗粘液/圆细胞脂肪肉瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗难治性肉瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗复发性肉瘤。

就经历疗法的对象而言，待施用的本公开的细胞可以是自体的。

在某些示例性实施方式中，本公开的修饰的免疫细胞用于治疗感染。在某些实施方式中，感染是急性感染。在某些实施方式中，感染是慢性感染。在某些实施方式中，感染是病毒感染。在某些实施方式中，本公开的方法用于治疗选自LCMV、HIV、乙型肝炎、丙型肝炎、疟疾或结核病的疾病、障碍或感染。

本公开的细胞的施用可以本领域技术人员已知的任何便利方式实施。本公开的细胞可通过雾化吸入、注射、摄取、输注、植入或移植施用于对象。本文所述的组合物可经动脉、皮下、皮内、瘤内(intratumorally)、节内(intranodally)、髓内(intramedullary)、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用于患者。在其它情况下，将本公开的细胞直接注射到对象的炎症部位、对象的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤等。

在一些实施方式中，以所期望剂量(dosage)施用细胞，所期望剂量在一些方面中包括所期望剂量(dose)或细胞数或细胞类型(一种或多种)和/或所期望的细胞类型比。因此，在一些实施方式中，细胞的剂量基于细胞的总数(或每kg体重的数量)和单独的群体或亚型的所期望的比，诸如CD4+与CD8+的比。在一些实施方式中，细胞的剂量基于单独的群体或单独的细胞类型中所期望的细胞总数(或每kg体重的数量)。在一些实施方式中，剂量基于这样的特征的组合，如单独的群体中所期望的总的细胞数、所期望的比和所期望的细胞总数。

在一些实施方式中，在总细胞的所期望剂量(如T细胞的所期望剂量)的容许差异下或在该容许差异内施用细胞群或细胞亚型(如CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞)。在一些方面中，所期望剂量是所期望的细胞数或施用细胞的对象的每单位体重所期望的细胞数，例如，细胞数/kg。在一些方面中，所期望剂量等于最小细胞数或每单位体重最小细胞数，或在最小细胞数或每单位体重最小细胞数以上。在一些方面中，在以所期望剂量施用的总细胞中，单独的群体或亚型以所期望的输出比(如CD4⁺与CD8⁺的比)或接近所期望的输出比(例如，在这种比的某个容许差异或误差内)存在。

在一些实施方式中，在一种或多种单独的细胞群或细胞亚型的所期望剂量(如CD4+细胞的所期望剂量和/或CD8+细胞的所期望剂量)的容许差异下或在该容许差异内施用细胞。在一些方面中，所期望剂量是该亚型或群体细胞的所期望数量，或是施用细胞的对象的每单位体重此类细胞的所期望的数量，例如，细胞数/kg。在一些方面中，所期望剂量等于该群体或亚型细胞的最小数或在该群体或亚型细胞的最小数以上，或等于每单位体重该群体或亚型细胞的最小数或在每单位体重该群体或亚型细胞的最小数以上。因此，在一些实施方式中，剂量基于总细胞的所期望的固定剂量和所期望的比，和/或基于单独的亚型或亚群中一种或多种(例如，每一种)的所期望的固定剂量。因此，在一些实施方式中，剂量基于T细胞的所期望的固定剂量或最小剂量和CD4⁺与CD8⁺细胞的所期望的比，和/或基于CD4⁺和/或CD8⁺细胞的所期望的固定剂量或最小剂量。

在某些实施方式中，这些细胞，或细胞亚型的单独的群体以如下范围向对象施用：约100万至约1000亿个细胞，诸如，例如，100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞，或上述值中任意两个所限定的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞，或上述值中任意两个所限定的范围)，以及在某些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围内的任意值。

在一些实施方式中，总细胞的剂量和/或细胞的单独亚群的剂量在以下范围内：在等于或约1x10⁵个细胞/kg至约1x10¹¹个细胞/kg之间，10⁴，和等于或约10¹¹个细胞/千克(kg)体重，如在10⁵与10⁶个细胞/kg体重之间，例如，等于或约1x 10⁵个细胞/kg体重、1.5x 10⁵个细胞/kg体重、2x 10⁵个细胞/kg体重或1x 10⁶个细胞/kg体重。例如，在一些实施方式中，在以下某个误差范围下或在该误差范围内施用细胞：在等于或约10⁴与等于或约10⁹个T细胞/千克(kg)体重之间，如在10⁵与10⁶个T细胞/kg体重之间，例如，等于或约1x 10⁵个T细胞/kg体重、1.5x 10⁵个T细胞/kg体重、2x 10⁵个T细胞/kg体重或1x 10⁶个T细胞/kg体重。在其它示例性实施方式中，用于本公开方法的修饰细胞的合适的剂量范围非限制地包括约1x10⁵个细胞/kg至约1x10⁶个细胞/kg、约1x10⁶个细胞/kg至约1x10⁷个细胞/kg、约1x10⁷个细胞/kg约1x10⁸个细胞/kg、约1x10⁸个细胞/kg约1x10⁹个细胞/kg、约1x10⁹个细胞/kg约1x10¹⁰个细胞/kg、约1x10¹⁰个细胞/kg约1x10¹¹个细胞/kg。在示例性实施方式中，用于本公开方法的合适的剂量是约1x10⁸个细胞/kg。在示例性实施方式中，用于本公开方法的合适的剂量是约1x10⁷个细胞/kg。在其它实施方式中，合适的剂量是约1x10⁷个总细胞至约5x10⁷个总细胞。在一些实施方式中，合适的剂量是约1x10⁸个总细胞至约5x10⁸个总细胞。在一些实施方式中，合适的剂量是约1.4x10⁷个总细胞至约1.1x10⁹个总细胞。在示例性实施方式中，用于本公开方法的合适的剂量是约7x10⁹个总细胞。

在一些实施方式中，在以下某个误差范围下或在该误差范围内施用细胞：在等于或约10⁴与等于或约10⁹个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/千克(kg)体重之间，如在10⁵与10⁶个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg体重之间，例如，等于或约1x 10⁵个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg、1.5x 10⁵个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg体重、2x 10⁵个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg体重或1x 10⁶个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg体重。在一些实施方式中，在以下某个误差范围下或在该误差范围内施用细胞：大于，和/或至少约1x 10⁶、约2.5x 10⁶、约5x 10⁶、约7.5x 10⁶或约9x 10⁶个CD4⁺细胞，和/或至少约1x 10⁶、约2.5x 10⁶、约5x 10⁶、约7.5x 10⁶或约9x 10⁶个CD8+细胞，和/或至少约1x 10⁶、约2.5x 10⁶、约5x 10⁶、约7.5x 10⁶或约9x 10⁶个T细胞。在一些实施方式中，在以下某个误差范围下或在该误差范围内施用细胞：在约10⁸与10¹²个T细胞之间或在约10¹⁰与10¹¹个T细胞之间、在约10⁸与10¹²个CD4⁺细胞之间或在约10¹⁰与10¹¹个CD4⁺细胞之间和/或在约10⁸与10¹²个CD8⁺细胞之间或在约10¹⁰与10¹¹个CD8⁺细胞之间。

在一些实施方式中，在多个细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所期望的输出比的容许范围下或在该容许范围内施用细胞。在一些方面中，所期望的比可以是具体的比，也可以是比的范围，例如，在一些实施方式中，所期望的比(例如，CD4⁺细胞与CD8⁺细胞的比)在等于或约5:1与等于或约5:1(或大于约1:5与小于约5:1)之间，或在等于或约1:3与等于或约3:1(或大于约1:3与小于约3:1)之间，如在等于或约2:1与等于或约1:5之间(或大于约1:5与小于约2:1之间，如等于或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5)。在一些方面中，容许差异在所期望的比的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包含这些范围之间的任意值。

在一些实施方式中，以单剂量或多剂量向对其需要的对象施用修饰细胞的剂量。在一些实施方式中，以多剂量施用修饰细胞的剂量，例如，一周一次或每7天一次、每2周一次或每14天一次、每3周一次或每21天一次、每4周一次或每28天一次。在示例性实施方式中，向对其需要的对象施用单剂量的修饰细胞。在示例性实施方式中，通过快速静脉内输注向对其需要的对象施用单剂量的修饰细胞。

对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于待治疗疾病的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和过程、是否出于预防或治疗目的施用细胞、先前疗法、对象的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的判断。在一些实施方式中，组合物和细胞一次或通过一系列治疗适当地施用于对象。

在一些实施方式中，作为组合治疗的一部分来施用细胞，诸如与其它治疗性干预(如抗体或改造的细胞或受体或剂，如细胞毒性剂或治疗剂)同时施用或以任意顺序相继施用。在一些实施方式中细胞同时或以任意顺序相继与一种或多种其它治疗剂共同施用，或结合另一治疗性干预施用。在某些环境下，细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同施用，使得细胞群增强一种或多种其它治疗剂的效果，反之亦然。在一些实施方式中，在一种或多种其它治疗剂之前施用细胞。在一些实施方式中，在一种或多种其它治疗剂之后施用细胞。在一些实施方式中，一种或多种其它试剂包括细胞因子，如IL-2，从而例如增强持久性。在一些实施方式中，方法包括化疗剂的施用。

在某些实施方式中，本公开的修饰细胞(例如，包含修饰的内源性Fli1的修饰细胞)可以与免疫检查点抗体(例如，抗PD1、抗CTLA-4或抗PDL1抗体)组合施用于对象。例如，修饰细胞可以与靶向例如PD-1(程序性死亡1蛋白)的抗体或抗体片段组合施用。抗PD-1抗体的实例包括但不限派姆单抗(pembrolizumab)(以前是lambrolizumab，也称为MK-3475)和纳武单抗(nivolumab)(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、/>)或其抗原结合片段。在某些实施方式中，修饰细胞可以与抗PD-L1抗体或其抗原结合片段组合施用。抗PD-L1抗体的实例包括但不限于BMS-936559、MPDL3280A(/>阿特珠单抗(Atezolizumab))和MEDI4736(德瓦鲁单抗(Durvalumab),Imfinzi)。在某些实施方式中，修饰细胞可以与抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段组合施用。抗CTLA-4抗体的实例包括但不限于伊匹单抗(Ipilimumab)(商品名Yervoy)。也可以使用其它类型的免疫检查点调节剂，包括但不限于小分子、siRNA、miRNA、和CRISPR系统。免疫检查点调节剂可以在修饰细胞之前、之后或与其同时施用。在某些实施方式中，包含免疫检查点调节剂的组合治疗可以提高包含本公开修饰细胞的疗法的治疗功效。

在细胞施用后，在一些实施方式中，例如通过多种已知方法中的任意种来测量改造细胞群的生物活性。评估参数包括改造的或天然的T细胞或其它免疫细胞在体内(例如，通过成像)或在体外(例如，通过ELISA或流式细胞术)与抗原的特异性结合。在某些实施方式中，可使用本领域已知的任何合适的方法测量改造的细胞毁坏靶细胞的能力，如，例如Kochenderfer et al.,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009),和Herman etal.J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定。在某些实施方式中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD 107a、IFNy、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在一些方面中，生物活性是通过评估临床结果，如肿瘤负担或负荷的减少来衡量的。

在某些实施方式中，对象被提供二级治疗(secondary treatment)。二级治疗包括但不限于化疗、放疗、手术和药物。

在一些实施方式中，可以在施用修饰细胞之前施用给对象调理疗法(conditioning therapy)。在一些实施方式中，调理疗法包括向对象施用有效量的环磷酰胺。在一些实施方式中，调理疗法包括向对象施用有效量的氟达拉滨。在优选实施方式中，调理疗法包括向对象施用有效量的环磷酰胺与氟达拉滨的组合。在修饰细胞之前施用调理疗法可提高修饰细胞的功效。美国专利号9,855,298(其通过引用以其整体并入本文)中描述了针对T细胞疗法对患者进行调理的方法。

在一些实施方式中，本公开的具体剂量方案包括在施用修饰的T细胞之前的淋巴细胞耗竭步骤(lymphodepletion step)。在示例性实施方式中，淋巴细胞耗竭步骤包括环磷酰胺和/或氟达拉滨的施用。

本公开的细胞可按剂量和途径施用，并且有时在适当的临床前与临床实验和试验中确定。细胞组合物可按在这些范围内的剂量多次施用。本公开的细胞的施用可与可用于治疗由本领域技术人员所确定的期望的疾病或状况的其它方法组合。

在某些实施方式中，在施用修饰细胞之后，可以向对象施用细胞因子释放综合征(CRS)的治疗，免疫活化导致炎性细胞因子升高。因此，本公开提供了在CRS诊断之后适当的CRS管理策略，以减轻不受控制的炎症的生理症状，而不减弱修饰细胞的抗肿瘤功效。CRS管理策略是本领域已知的。例如，可施用全身性皮质类固醇以快速逆转sCRS(例如，3级CRS)的症状，而不损害初始抗肿瘤反应。在一些实施方式中，可施用抗IL-6R抗体。抗IL-6R抗体的实例是美国食品和药品监督管理局批准的单克隆抗体托珠单抗(tocilizumab)，也称为atlizumab(市场上称为Actemra，或RoActemra)。托珠单抗是一种针对白介素-6受体(IL-6R)的人源化单克隆抗体。托珠单抗的施用已证明CRS几乎立即被逆转。

本公开的修饰的免疫细胞可用于本文所述的治疗方法。在一些实施方式中，修饰的免疫细胞包含Fli1基因座中能够下调Fli1的基因表达的插入和/或缺失。在一些实施方式中，当Fli1被下调时，免疫细胞的功能被增强。例如，非限制地，当被下调时，Fli1增强肿瘤浸润、肿瘤杀伤和/或免疫细胞对免疫抑制的抗性。在一些实施方式中，当Fli1被下调时，T细胞衰竭被减少或消除。在一些实施方式中，当Fli1被下调时，T细胞功能障碍被减少或消除。

在一个方面中，本公开包括治疗对其有需要的对象的癌症的方法，包括向对象施用本文公开的任一种修饰的免疫细胞或前体细胞。本公开的另一个方面包括治疗对其有需要的对象的癌症的方法，包括向对象施用通过本文公开的方法中的任一种生成的修饰的免疫细胞或前体细胞。

本公开的又一方面包括治疗对其有需要的对象的疾病或障碍的方法，包括向对象施用修饰细胞，所述修饰细胞包括：编码Fli1的内源性基因座中的CRISPR介导的修饰，其中所述修饰能够下调内源性Fli1的基因表达。

F.筛选细胞的方法

本公开提供了筛选细胞(例如T细胞)的方法，如优化的T细胞体内CRISPR筛选(OpTICS)方法，如图1A、图8A和图8B所示例。

在一个方面中，本公开提供了筛选细胞的方法，包括：i)将Cas酶(或编码Cas的核酸)和sgRNA文库引入活化的细胞中，ii)将细胞施用于受感染或荷瘤小鼠中，iii)从受感染小鼠中分离细胞，和iv)分析细胞。

在一个方面中，本公开提供了筛选T细胞的方法，包括：i)将Cas酶和sgRNA文库引入活化的T细胞中，ii)将T细胞施用于受感染或荷瘤小鼠中，iii)从受感染小鼠中分离T细胞，和iv)分析T细胞。

sgRNA文库应被解释为包含靶向任意数目的感兴趣基因的任意数目的sgRNA，包括但不限于具有注释功能结构域的任意和所有基因。

在某些实施方式中，sgRNA文库包含靶向多个转录因子的多个sgRNA。在某些实施方式中，所述多个转录因子包括表1中列出的任意转录因子。在某些实施方式中，每个sgRNA靶向每个转录因子的DNA结合结构域。在某些实施方式中，sgRNA文库包含选自SEQ ID NO:1-675的至少一个序列。在某些实施方式中，sgRNA文库由SEQ ID NO:1-675中列出的核苷酸序列组成。所述文库应被解释为包含选自SEQ ID NO:1-675的任意和所有数目的sgRNA。例如，sgRNA文库中sgRNA的数目可以是1、10、20、50、100、200、300、400、500、600、675，或者1-675之间的任意和所有数目。

在某些实施方式中，该方法筛选T细胞以评估T细胞衰竭。在某些实施方式中，该方法鉴定管控T_EFF和T_EX细胞分化的新型转录因子。

在某些实施方式中，该方法用于在肿瘤系统中筛选，即用于鉴定肿瘤/癌症中感兴趣的基因。在某些实施方式中，该方法筛选B细胞以评估记忆B细胞和浆细胞形成。在某些实施方式中，该方法筛选造血干细胞或组织干细胞以评估干细胞和相关谱系。

在某些实施方式中，分析细胞包括选自测序、PCR、MACS和FACS的方法。在某些实施方式中，测序揭示了感兴趣的靶标。在某些实施方式中，针对感兴趣的靶标设计药物。在某些实施方式中，当向T细胞施用药物时，至少一种T细胞反应被增加或引发。在某些实施方式中，在分析过程中，例如，如图1A所示计算CRISPR评分(CS)。

在某些实施方式中，将约1x10⁵个T细胞施用于受感染小鼠。

G.药物组合物和制剂

还提供了本公开的免疫细胞群，和含有这样的细胞和/或富集这样的细胞的组合物。在组合物当中，是用于施用以诸如用于过继性细胞疗法的药物组合物和制剂。还提供了用于向对象(例如，患者)施用细胞和组合物的治疗方法。

还提供了包括用于施用的细胞的组合物，该组合物包括药物组合物和制剂，如单位剂型组合物，单位剂型组合物包括以给定剂量或其部分来施用的细胞的数量。药物组合物和制剂通常包括一种或多种任选的药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方式中，组合物包括至少一种其它的治疗剂。

术语“药物制剂”是指这样的制剂：这种形式的该制剂允许其中所含活性成分的生物活性有效，且不含有对将施用该制剂的对象具有不可接受的毒性的其它成分。“药学上可接受的载剂”是指药物制剂中除活性成分外，对于对象无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。在一些方面中，载剂的选择部分地由特定细胞和/或施用方法确定。因此，存在多种合适的制剂。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。例如，Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980)对载剂进行了描述。所采用的剂量和浓度下的药学上可接受的载剂通常对接受者是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯类，如羟苯甲酯或羟苯丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。

在一些方面中，缓冲剂包括在组合物中。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其它酸和盐。在一些方面中，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法在例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中有更详细的描述。

制剂可包括水溶液。制剂或组合物还可包含多于一种的活性成分，活性成分可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或状况，优选活性与该细胞互补的活性，其中各自的活性彼此不产生不利影响。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。因此，在一些实施方式中，药物组合物进一步包括其它药学活性剂或药物，如化疗剂，例如天门冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗(rituximab)、长春花碱和/或长春新碱。在一些实施方式中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或状况的量(如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方式中，通过对所治疗的对象周期性评估来监测治疗或预防功效。所期望的剂量可通过细胞的单次弹丸施用、细胞的多次弹丸施用，或通过细胞的连续输注施用来递送。

制剂包括口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺部、经皮、肌肉内、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用的制剂。在一些实施方式中，肠胃外施用细胞群。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方式中，利用外周全身性递送，通过静脉内注射、腹膜内注射或皮下注射将细胞施用于对象。在一些实施方式中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在某些方面可缓冲至选定的pH值。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物更便于施用，尤其是通过注射施用。另一方面，粘性组合物可在适当的粘度范围内配制以提供与特定组织的长时期接触。液体组合物或粘性组合物可包含载剂，其可以是溶剂或分散介质，溶剂或分散介质含有，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。

无菌可注射溶液可通过将细胞并入溶剂中来制备，诸如与合适的载剂、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物可包含辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、凝胶或粘性增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或色素，这取决于施用途径和所期望的制剂。在某些方面可以参考标准文本来制备合适的制剂。

可以添加各种增强组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚和山梨酸可以确保对微生物作用的预防。通过使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以延长可注射的药物形式的吸收。

待用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌性可以很容易地实现，例如通过无菌过滤膜来过滤。

本文提到或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它文件和可以电子方式获得的信息的内容特此通过引用以其整体并入，其程度与所指示通过引用将每一个独立的出版物具体且独立地并入一样。申请人保留将来自任何此类文章、专利、专利申请或其它实体和电子文件中的任何以及所有材料和信息并入本申请的权利。

尽管已经参考其具体实施方式描述了本公开，但是本领域技术人员应该理解，在不背离本发明的真实精神和范围的情况下，可以做出各种改变和等同物替换。对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不脱离本文所公开的实施方式的范围的情况下，可以使用合适的等同物对本文描述的方法进行其它合适的修改和改动。另外，可以做出多种修改以使特定情况、材料、物质组成、过程、一个或多个方法步骤适应本公开的目的、精神和范围。所有这些修改都旨在落入所附权利要求的范围内。现在已经详细描述了某些实施方式，通过参考以下实例将会对其更清楚地了解，这些实例仅出于说明的目的被包括在内而不旨在限制。

实验实施例

现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，并且本发明不限于这些实施例，而是涵盖由于本文提供的教导而显而易见的所有变型。

材料和方法

小鼠：CD4CRE、LSL-Cas9-GFP和组成型-Cas9-GFP小鼠购自Jackson实验室(Jackson Laboratory)。使LSL-Cas9-GFP小鼠与CD4CRE小鼠和TCR转基因P14 C57BL/6小鼠(对LCMV DbGP33–41具有特异性的TCR)交配繁殖，并且使用前回交超过6代。使组成型-Cas9-GFP小鼠与TCR转基因P14 C57BL/6小鼠交配繁殖。在笼舍中繁育组成型-Cas9-GFP小鼠供受体使用。6-8周龄的C57BL/6Ly5.2CR(CD45.1)或C57BL/6(CD45.2)小鼠购自NCI。6周龄C57BL/6(CD45.2)小鼠购自Jackson实验室。5-7周龄的Rag2-/-C7BL/6小鼠购自Jackson实验室。LCMV激惹(challenge)用受体小鼠来自NCI，除非图例中另有说明。既使用雄性小鼠又使用雌性小鼠。所有小鼠均按照宾夕法尼亚大学实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)指导方针使用。

实验模型

LCMV感染：小使鼠腹膜内(i.p.)感染2×10⁵个噬斑形成单位(PFU)Arm或静脉内(i.v.)感染4×10⁶个PFU Cl13。如先前所述(Pauken et al.,2016)进行LCMV Cl13噬斑测定以检测病毒载量(viral load)。基本上，将组织匀浆，并将含1:10、1:10²、1:10³的血清稀释液或1:10、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵和1:10⁶的匀浆组织稀释液的培养基在贴壁Vero细胞上孵育1hr。用培养基与1％琼脂糖的1:1混合物覆盖细胞并培养4天。在用培养基:1％琼脂糖:中性红的9.5:9.5:1混合物覆盖16小时后，对噬斑(PFU)进行计数。

单核细胞增多性李斯特菌(LM)感染：在脑心浸液(BHI)培养基中培养过夜后，通过光密度(OD)测量表达DbGP33的LM(LM-gp33)的浓度(1OD指8×10⁸LM-gp33)。使每只受体小鼠静脉内(i.v.)感染1×10⁵CFU LM-gp33。调整后的存活率基于在强制性实验动物管理和使用委员会(IACUC)安乐死体重减轻30％截止值以上的剩余小鼠。用含完全BHI培养基的2％琼脂糖板来计算用于细菌载量计算的每单位LM-gp33菌落形成。在1ml BHI培养基中粉碎受感染器官，并取出20ul(2％)的器官。制备1:10、1:102、1:103、1:104、1:105和1:106的受感染器官BHI培养基稀释液，并将其铺板在BHI琼脂糖板上。在37℃培养箱中将板孵育16小时后，对菌落进行计数。

流感PR8感染：用表达DbGP33的PR8株(PR8-gp33)以3.0LD50的剂量鼻内(i.n.)感染小鼠。小鼠在i.n.感染前被麻醉。如先前所述(Laidlaw et al.,(2013)PLOS Pathogens9,e1003207)对PR8病毒qPCR病毒RNA量检测进行计算。从PR8-GP33感染小鼠的肺以及成对脾中纯化总RNA(包括宿主和病毒RNA)，然后用随机引物进行逆转录。对靶向流感PA蛋白的cDNA进行实时定量PCR，三次技术重复。采用流感PA蛋白cDNA标准对流感病毒RNA量进行标准化。

肿瘤转移：使表达DbGP33的B16F10黑素瘤细胞(B16F10-gp33,(Prévost-Blondeletal.,(1998)The Journal of Immunology 161,2187–2194)在补充有10％ FBS、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺的DMEM培养基中维持在37℃下。将肿瘤细胞以1×10⁵个细胞/受体皮下注射到Rag2-/-小鼠的胁腹，和以2×10⁵个细胞/受体皮下注射到Cas9+B6小鼠的胁腹。分选活化的sgRNA+C9P14细胞并以1×10⁶个细胞/受体(对于Rag2-/-而言)或3×10⁶个细胞/受体(对于Cas9+而言)转移到受体小鼠中。接种后每2-3天使用数字卡尺测量肿瘤大小。

载体构建和sgRNA克隆：在本研究中，使用pSL21-VEX或pSL21-mCherry(U6-sgRNA-EFS-VEX或U6-sgRNA-EFS-mCherry)表达SpCas9 sgRNA。为了产生pSL21-VEX或pSL21-mCherry，将U6-sgRNA表达盒从LRG2.1 PCR克隆到逆转录病毒载体MSCV-Neo中，然后用VEX或mCherry荧光报道基因交换Neo选择标记。通过使两个DNA寡聚体(oligos)退火和T4 DNA连接到Bbs1消化的pSL21-VEX或pSL21-mCherry载体中来克隆sgRNA。为了提高U6启动子转录效率，另将5’G核苷酸添加到所有尚未以5’G起始的sgRNA寡聚体设计中。Runx1和Runx3构建体被构建在MIGR或MSCV mCherry构建体上，空MIGR或MSCV-mChery用作这些载体的对照。

细胞培养和体外刺激：根据制造商的说明书，使用EasySep小鼠CD8+T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies)，通过阴性选择从脾中纯化CD8 T细胞。在含10％胎牛血清(FBS)、10mM HEPES、100μM非必需氨基酸(NEAA)、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素和50μMβ-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中，用100U/mL重组人IL-2、1μg/mL抗小鼠CD3ε和5μg/mL抗小鼠CD28刺激细胞。

逆转录病毒载体(RV)实验：使用Lipofectamine 3000，通过MSCV和pCL-Eco质粒在293T细胞中产生RV。如所描述的那样进行RV转导(Kurachi et al.,(2017)NatureProtocols,12:9 12,1980–1998)。简言之，使用EasySepTM小鼠CD8+T细胞分离剂盒，从P14小鼠的脾中纯化CD8+T细胞。体外刺激18-24小时后，在自旋感染(spin infection)期间(32℃下2,000g达60分钟)溴化己二甲季胺(polybrene)(0.5μg/ml)存在的情况下，用RV(0.5μg/ml)转导P14细胞，此前在37℃下进行孵育——单RV和sgRNA文库为6小时，或双RV为12小时。将RV转导的P14细胞过继转移到受体小鼠中，该受体小鼠在转移前24-48小时被感染。

流式细胞术和分选：对于小鼠实验，如所描述的那样处理组织，获得单细胞悬浮液，并将细胞染色(Wherry et al.,(2003)Nature Immunology 2006 7:12 4,225–234)。用LIVE/DEAD细胞染色剂(Invitrogen)和靶向表面蛋白或细胞内蛋白的抗体对小鼠细胞进行染色。在GolgiPlug、GolgiStop和抗CD107a存在的情况下用GP33-41肽离体刺激5小时后，进行细胞内细胞因子染色。刺激后，根据制造商的说明书用表面抗体对细胞进行染色，之后用固定/渗透缓冲液固定，然后使用渗透洗涤缓冲液，用TNF、IFN-γ和MIP1α的细胞内抗体进行染色。用LSRII进行流式细胞术。使用BD-Aria分选仪——其具有70微米喷嘴和4℃循环冷却系统——进行细胞分选实验以供测序、western和TIDE测定。

为了转移实验中的分选，RV+细胞的优化分选，将BD Aria分选仪设置为37℃和100微米喷嘴，流速低于3.0。在分选过程中，将3X 10⁶个细胞浓缩在含100U/mL重组人IL-2的300ul 10％完全RPMI中。使用37℃预热的含10％完全RPMI(100U/ml IL-2)的收集管。分选的细胞在转移到受体中之前，通过37℃温热的纯RPMI洗涤。

TIDE测定：冷冻至少1×10⁴Cas9+sgRNA+T细胞沉淀。使用QIAmp DNA Mini剂盒，从这些样品中分离基因组DNA。使用2x Phusion快速高保真PCR主混合液(2x Phusion FlashHigh-Fidelity PCR Master Mix)和围绕sgRNA靶部分的基因组区域设计的引物对每个样品进行TIDE PCR，以从基因组DNA中提取指导区域；然后对所得产物进行凝胶验证，PCR纯化，并送去进行Sanger测序。

蛋白质印迹：使用FACS机对2×10⁵个T细胞进行分选，并冷冻沉淀。从这些样品中提取蛋白质，并通过在95℃下、2X工作上样缓冲液(1M Tris-HCl、10％ SDS、甘油、10％溴酚蓝)中煮沸使其变性。在10％ SDS-PAGE凝胶上运行裂解物，然后转移到硝化纤维素膜上。一次Fli1(1:200)和GAPDH(1:1000)抗体过夜染色，之后次日进行1:5000二次抗体染色。

OpTICS筛选

sgRNA候选物选择：选择了271个符合以下标准的TF：1)处于在(Doering et al.,(2012)Immunity 37,1130–1144)和(Philip et al.,(2017)Nature 2017 545:7652 545,452–456)中差异表达的前50，2)处于先前描述的(Sen et al.,(2016)Science 354,1165–1169)中幼稚、D8 Arm和D8 Cl13中TF基序差异开放的前10，3)涉及前列的(top)免疫调节家族，如IRF和STAT蛋白。手动选择120个TF以包含在TF文库中，原则如下：1)在CD8 T细胞中功能已知；2)与免疫功能相关的那些TF家族成员，例如IRF、STAT和Smad；3)已发表的CD8 T细胞数据集中RNA表达差异最显著的TF；4)在来自先前CD8 T细胞数据集的ATAC-seq数据中具有最高基序富集的TF。

文库构建：基于从NCBI保守结构域数据库(NCBI Conserved Domains Database)检索到的结构域序列信息，针对每个TF的单个DNA结合结构域或其它功能结构域设计4-5个sgRNA。所有的sgRNA寡聚体，包括阳性和阴性对照sgRNA，都是由Integrated DNATechnologies(IDT)合成的，并以等摩尔浓度合并。然后通过PCR扩增合并的sgRNA寡聚体，并使用Gibson Assembly试剂盒将其克隆到BsmBI消化的SL21载体中。为了验证合并的质粒中sgRNA的身份(identity)和相对代表性，在MiSeq仪上进行深度测序分析。我们证实，100％的经设计的sgRNA被克隆在SL21载体中，并且>95％的单个sgRNA构建体的丰度在平均值的5倍以内。

小鼠实验工作流程：在第0天，从CD45.2⁺C9P14小鼠的脾和淋巴结中分离C9P14细胞，并使用抗CD3/CD28和IL-2按照标准T细胞活化方案进行处理；同一天，使幼稚CD45.1⁺受体小鼠感染LCMV。在D1 p.i.，通过RV-sgRNA文库转导活化的C9P14细胞，并在洗掉RV上清液之前孵育6小时。18-24小时后，对转导的sgRNA⁺Cas9⁺细胞进行分选。然后，在任何选择之前，将10％的sgRNA+Cas9+T细胞冷冻，作为D2基线(T0时间点)对照，同时将90％的细胞转移到受感染的受体(最多1x10⁵个细胞/受体)中。在T1时间点(图中D8)，从受体的多个器官中分选出sgRNA⁺Cas9⁺CD45.2⁺T细胞。

分离文库构建和MiSeq处理：为了量化参考和结束时间点的sgRNA丰度，使用高保真聚合酶从基因组DNA中PCR扩增sgRNA盒。通过T4 DNA聚合酶、DNA聚合酶I、大(Klenow)片段和T4多核苷酸激酶对PCR产物进行末端修复。接下来，用Klenow片段(3’-5’exo-)将3’A-突出端添加到平头DNA片段的末端。用Quick连接剂盒将DNA片段连接到多样性增加的定制条形码(custom barcodes)上。通过采用高保真聚合酶的PCR反应，将Illumina配对末端测序衔接子附接到条形码标记的(barcoded)经连接的产物上。通过Bioanalyzer AgilentDNA 1000对最终产物进行定量并以等摩尔比合并在一起，并通过使用MiSeq(Illumina)和MiSeq Reagent Kit V3 150循环(Illumia)进行配对末端(双端，pair-end)测序。

数据处理：将测序数据拆分为单个样本(de-multiplexed)和修剪(trimmed)，使其仅包含sgRNA序列盒。在无错配的情况下计算每个单个sgRNA的读出计数，并将其与先前描述的(Shi et al.,(2015)Nature Biotechnology 2015 33:6 33,661–667)参考sgRNA的序列进行比较。将每个样品的数据归一化为相同的读出帐户。瀑布图(图1B)：对于每个基因，计算多个sgRNA的log2倍数变化的平均值。热图(图1C)：对于每个基因，计算多个sgRNA的log10倍数变化的平均值。在按条件基因矩阵中，跨条件进行分位数归一化使得每个条件都具有相同的值分布。基因按每行的平均值排序。直方图(图1D)：对于每个条件，绘制所有基因的sgRNA的背景(灰色条和直方图)。通过使用背景值的第5百分位数和第95百分位数来提取5％和95％区间。红色条显示一个基因的sgRNA的log倍数变化(或对照)。

RNA测序

实验工作流程：在Cl13 D8 p.i.，从受感染受体的脾中分离CD8 T细胞。使用FACS分选VEX⁺GFP⁺细胞，纯度>95％。使用QIAGEN RNeasy Micro试剂盒分离RNA，每个样品2x10⁴个细胞。使用SMARTSeq V4 Ultra Low试剂盒生成cDNA文库。使用KAPA Library Quant试剂盒(KAPABiosystems)通过qPCR对文库进行定量。将归一化文库合并，稀释至1.8pg/ml，加载到TG NextSeq 500/550Mid Output Kit v2(150个循环，130M读出，Illumina)上，并在NextSeq 550(Illumina)上进行配对末端测序。每个样品的估计读出深度为15M读出。

数据处理：使用Kallisto将RNAseq配对末端测序的原始FASTQ文件与GRCm38/mm10参考基因组进行比对(https://pachterlab.github.io/kallisto/)。读出19357个基因和8个样品的测序读数。在超过三个的条件下读数为零的基因被过滤掉。在此步骤后留有13628个基因。然后，使用DESeq 2包进行差异表达分析。

发现1440个基因的表达在两个条件之间存在显著差异，BH校正的P值<0.05。使用ClusterProfiler进行GO富集分析。图中显示了前20个最富集的途径。使用BroadInstitute软件进行(https://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)进行GSEA。通过比较sgCtrl组和sgFli1组来计算富集评分。T_EX前体基因特征来自(Chen et al.,(2019)Immunity,51 6,970-972)。T_EFF基因特征来自(Bengsch et al.,(2018)Immunity 48,1029–1045.e5)。

ATAC-测序

实验工作流程：通过微小的调整如所述(Buenrostro et al.,2013)进行ATACseq样品制备。使用FACS分选VEX⁺GFP⁺细胞，纯度>95％。将分选的细胞(2.5×10⁴)在冷PBS中洗涤两次，并重悬于50μl冷裂解缓冲液(10nM Tris-HCl,pH 7.4,10mM NaCl,3mM MgCl2,0.1％吐温)中。将裂解物离心(750xg,10min,4℃)并将核团(nuclei)重悬于50μl转座反应混合液(TD缓冲液[25μl]、Tn5转座酶[2.5μl]和无核酸酶水[22.5μl]；(Illumina))中，并在37℃下孵育30分钟。使用Qiagen Reaction MiniElute剂盒纯化转座的DNA片段，用NEXTERA双指数(Illumina)进行条形码标记，并使用NEBNext高保真度2x PCR主混合液(NewEngland Biolabs)通过PCR扩增11个循环。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，并使用高灵敏度D1000 ScreenTapes(Agilent Technologies)在2200TapeStation(AgilentTechnologies)上验证扩增的片段大小。

使用KAPA Library Quant试剂盒(KAPABiosystems)通过qPCR对文库进行定量。将归一化的文库合并，稀释至1.8pg/ml，加载到TG NextSeq 500/550Mid Output Kit v2(150个循环，130M读出，Illumina)上，并在NextSeq 550(Illumina)上进行配对末端测序。每个样品的估计读出深度为10M读出。

数据处理：使用在以下储库(repository)可获得的脚本处理配对末端测序的原始ATACseq FASTQ文件(https://github.com/wherrylab/jogiles_ATAC)。使用Bowtie2将样品与GRCm38/mm10参考基因组进行比对。Samtools用于移除未映射、未配对的线粒体读出。ENCODE黑名单区域也被移除(https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists)。使用Picard移除PCR重复。使用MACS v2(FDR q值0.01)进行峰识别(Peak calling)。对于每个实验，将所有样品的峰组合以创建联合峰列表，并使用BedToolsmerge合并重叠峰。使用BedTools覆盖度(BedTools coverage)确定每个峰中的读出个数。除非另有指示，否则在DESeq2归一化后，使用FDR截止值<0.05来鉴定差异可及区域。使用HOMER(默认参数)计算sgCtrl组和sgFli1组之间差异可及的峰上的Motif富集情况。使用已知的基序发现策略进行转录结合位点预测分析。

CUT&RUN

实验工作流程：如先前所述(Skene et al.,(2018)Nature Protocols 2017 12:913,1006–1019)进行CUT&RUN实验，并进行了调整。简言之，在1.5ml管中用1ml冷洗涤缓冲液(20mM HEPES-NaOH pH 7.5、150mM NaCl、0.5mM亚精胺和来自Sigma的蛋白酶抑制剂混合物)洗涤2x10⁵个分选的细胞两次。然后将细胞重悬于1ml冷洗涤缓冲液中，并通过在4℃下旋转25min与10μl BioMagPlus伴刀豆球蛋白A(Bangs laboratories)一起孵育以使细胞结合。将管放置在磁性支架上，并在溶液变澄清后移除液体。将250μl冷抗体缓冲液(20mMHEPES-NaOH pH 7.5、150mM NaCl、0.5mM亚精胺、2mM EDTA、0.1％毛地黄皂苷和来自Sigma的蛋白酶抑制剂混合物)中的一次抗体加入管中，并在4℃下旋转过夜。次日，在用1ml冷洗涤缓冲液洗涤细胞一次后，将250μl冷毛地黄皂苷缓冲液(20mM HEPES-NaOH pH 7.5、150mMNaCl、0.5mM亚精胺、0.1％毛地黄皂苷和来自Sigma的蛋白酶抑制剂混合物)中的蛋白质A-MNase(pA-MN)加入管中，并在4℃下旋转1h。为了洗除未结合的pA-MN，用1ml冷毛地黄皂苷缓冲液将细胞洗涤两次，然后重悬于150μl冷毛地黄皂苷缓冲液中。这些管被放置在预先冷却的金属块上。为了启动pA-MN消化，通过轻弹管10次，使3μl的0.1M CaCl2与150μl冷毛地黄皂苷缓冲液中的细胞混合。管立即被放回金属块中。孵育30分钟后，通过添加150μl 2x停止缓冲液(340mM NaCl、20mM EDTA、4mM EGTA、0.02％毛地黄皂苷、50μg/ml RNase A、50μg/ml糖原和4pg/ml酵母异源掺入(spike-in)DNA)来停止消化。通过在37℃下将管在加热块上孵育10min来释放目标染色质。在4℃下以16,000g将上清液离心5min，然后转移到新管中。在70℃下将染色质与3μl的10％ SDS和2.5μl的20mg/ml蛋白酶K孵育10min，然后进行苯酚:氯仿:异戊醇提取。将含有DNA的上面的相与20μg糖原混合，并在-20℃下与750μl的冷100％乙醇孵育过夜。通过在4℃下以20,000g离心30min来沉淀DNA。DNA沉淀用冷100％乙醇洗涤一次，风干，并储存在-20℃下以用于文库制备。蛋白质A-MNase(第6批，以1:200使用)和酵母异源掺入DNA由Steve Henikoff博士慷慨提供。使用的抗体为：Fli1，ab15289，以1:50使用(abcam)，以及豚鼠抗兔IgG，以1:100使用，ABIN101961(抗体在线(antibodies-online))。

通过微小的调整如先前所述(Liu et al.,2018)制备CUT&RUN DNA文库。简言之，使用NEBNext Ultra IIDNA Library Prep试剂盒(NEB)将所有从pA-MN消化沉淀的DNA用于文库制备。将衔接子稀释至1:25以供衔接子连接。对DNA进行条形码标记并扩增14个PCR循环，并通过AMPure XP珠清理DNA文库(Liu et al.,2018)。使用Qubit和生物分析仪检查文库质量，并根据制造商的说明书使用NEBNext library Quant Kit for Illumina(NEB)通过qPCR确定文库量。将18个条形码标记文库以等摩尔浓度合并，并在NextSeq550平台中使用NextSeq 500/550高输出试剂盒(75个循环)v2.5试剂盒进行测序。进行配对末端测序(42:6:0:42)。

数据处理：使用Bowtie2 v2.3.4.1以Henikoff建议的选项将配对末端读出与mm10参考基因组进行比对(Skene et al.,(2018)Nature Protocols 2017 12:9 13,1006–1019)。Picard工具v1.96用于使用MarkDuplicates命令移除假定的PCR重复。包含独特映射读出的Bam文件是使用Samtools v1.1创建的。对于下游分析，在此步骤中合并生物重复(每个条件3次重复)。Bedtools v2.28.0用于生成大小为40bp-500bp的片段BED文件。将黑名单区域、随机染色体和线粒体移除。过滤后的BED文件用于下游分析。

使用bedGraphToBigWig(UCSC)创建每百万读出(Read per million,RPM)归一化bigwig文件，并用于将结合信号可视化。使用MACS v2.1识别峰，用的是broadPeak设置，p值截止值1e-8，-f BEDPE和IgG作为对照。使用来自HOMER v4的annotatePeaks.pl针对mm10基因组对接近峰的基因进行注释。使用来自HOMER v4的findMotifsGenome.pl鉴定Fli1结合基序。使用Bioconductor软件包ChIPpeakAnno绘制与ATAC-Seq峰的比较Venn图。热图是使用Bioconductor包ComplexHeatmap生成的。

统计分析：通过Prism 7(GraphPad Software)，用非配对双尾学生t检验或单因素ANOVA与Tukey多重比较检验来计算统计学显著性。P值在图例中报告。

现在描述实验结果：

实施例1：用于体内小鼠原代T细胞基因编辑的优化的CRISPR-Cas9

为了能够在抗原特异性原代CD8 T细胞中进行基因编辑，将LSL-Cas9⁺小鼠(Plattet al.,(2014)Cell 159,440–455)与携带LCMV D^bGP_33-41表位特异性CD8 T淋巴细胞的CD4^CRE+P14⁺小鼠杂交(称为Cas9⁺P14，或C9P14)。使骨架优化的Cas9单指导RNA(sgRNA)(Grevet et al.,(2018)Science 361,285–290)表达，逆转录病毒(RV)载体中有荧光标记(图8A)。为了评估体内基因编辑效率，使用优化的RV转导方案(Kurachi et al.,(2017)Nature Protocols,12:9 12,1980–1998)，用阴性对照sgRNA(sgCtrl1:AGTGGAAGCCATTGCTCTCG(SEQ ID NO:714)；sgCtrl_2:AATGGCAACTGGTCCCCTTC(SEQ ID NO:715)；sgCtrl_3GAAGATGGGCGGGAGTC TTC(SEQ ID NO:716))或靶向Pdcd1的sgRNA(编码PD-1，sgPdcd1:CAGCTTGTCCAACTGGTCGG(SEQ ID NO:717))转导C9P14细胞(图8B)。将sgRNA(mCherry⁺)和Cas9(GFP⁺)CD8 T细胞的双阳性群(图8C)过继转移到感染慢性LCMV株(克隆13；Cl13)的同类系受体小鼠中(图8B)。在感染后(p.i.)第9天，分离并评估sgRNA⁺C9P14细胞。正如预期的那样，sgPdcd1诱导的抗原特异性CD8 T细胞扩增是对照sgRNA的5倍(图8D)，与Pdcd1的基因敲除一致。sgPdcd1还导致PD-1蛋白表达的稳健降低(图8E)和Pdcd1基因座的indel突变(图8F)。此外，通过设计靶向Klrg1(sgKlrg1:CCAAAGCCACCATT GCAAAG(SEQ IDNO:718))和Cxcr3(sgCxcr3:GAACATCGGCTACAGCCAGG(SEQ ID NO:719))的sgRNA，证实了该系统的高基因编辑效率(图8G)。总之，这种在C9P14中体外sgRNARV转导、之后体内过继转移的系统，为研究体内小鼠CD8 T细胞的基因调控网络提供了一个强大的平台。

实施例2：OpTICS能够在体内于CD8T细胞中进行合并的基因筛选

为了能够在LCMV感染系统中进行体内合并的基因筛选，对C9P14和RV sgRNA平台(图1A)进行进一步优化。首先，确定用于筛选的过继转移的CD8 T细胞的生理学数目；因为转移的T细胞的数目能够影响肿瘤模型中癌症的进展或体内感染的结局。因此，过继转移的RV转导的CD8 T细胞的数目被限制为每只小鼠1x10⁵个(接受后约1x10⁴个)，这是以前在慢性感染中优化的数目。接下来，通过使用LCMV模型，在体内靶向CD8 T细胞中受关注的一组29个TF来评估该系统的表现。此前，发现靶向功能上重要的蛋白质编码结构域的sgRNA可以显著提高基因筛选效率，因为框内突变和移码突变都会促成产生功能缺失等位基因。设计并克隆了靶向29个TF和其它对照基因(例如未选择的对照sgRNA和Pdcd1)的DNA结合结构域的sgRNA文库，每个靶标4-5个sgRNA。在CD8 T细胞移植后，每个sgRNA的平均输入覆盖率为约400个细胞，这提高了信噪比，并且成功鉴定了命中(hits)——与每个sgRNA100个细胞相比(图8H)。第三，使用表达LSL-Cas9转基因的杂合与纯合等位基因的P14细胞评估体内筛选的表现。在信噪比和独立筛选间的一致性方面，Cas9杂合P14细胞优于Cas9纯合P14细胞(图8H-图8I)，这可能是由于杂合环境中脱靶DNA损伤减少。从这些初步优化筛选中，我们鉴定出Batf、Irf4和Myc对早期T细胞活化至关重要，因为这些基因的基因靶向在体内强力地抑制T细胞活化(图8H)，这与Batf、Irf4和Myc在T_EFF生物学中的已知作用一致。此系统是高效的，对CD8 T细胞反应所必需的基因富集上至约100倍(图8H)，以及对阻遏T细胞活化和分化的基因富集近20倍(图8J)。

实施例3：OpTICS鉴定出参与T_EFF和T_EX细胞分化的新型TF

为了鉴定管控T_EFF和T_EX细胞分化的新TF，针对120个TF构建了另一个结构域聚焦的sgRNA文库(表1)。此文库共有675个sgRNA，包括每个DNA结合结构域4-5个sgRNA、阳性选择对照(sgPdcd1)和非选择对照(例如sgAno9、sgRosa26等)(图1A)。使用这个靶向120个TF的sgRNA文库，在急性消退性(acutely resolving)LCMV Arm(Arm)或慢性Cl13 p.i.1或2周时探究体内选择和sgRNA富集情况(图1A)。检查来自不同器官(PBMC、脾、肝和肺)的C9P14细胞，以鉴定对CD8 T细胞针对感染的反应广泛重要的TF。一般来说，组是根据时间点和感染而不是解剖位置进行聚类的(图8K)。在p.i.2周时，Arm和Cl13的数据出现分歧(图8K)，这与急性消退的感染相对慢性感染期间T细胞分化的不同轨迹一致。关注于脾，Batf、Irf4和Myc在两种感染的两个时间点都是作为最强的阴性选择命中的一些出现的(图1B-图1C)。确认了几种其它已知的效应子驱动TF，包括Tbx21(编码T-bet)、Id2、Stat5a、Stat5b以及NF-kB复合体组分(图1B-图1C)。此外，还揭示了几种在T细胞活化和分化中具有潜在新作用的TF，包括Smad4、Smad7和Mybl2(图1B-图1C)。

OpTICS系统也被用作“UP”筛选(Kaelin,(2017)Nature Reviews Cancer 201213:1 17,441–450)，以鉴定阻遏最佳T细胞活化和T_EFF细胞分化的基因。这样的基因，如Pdcd1，代表改善癌症或感染中T细胞反应的潜在免疫疗法靶标。PD-1充当典型的阳性对照，正如预期的那样，Pdcd1-sgRNA在感染、时间点和所有组织中都强烈地被阳性选择(图1B-图1D)。此筛选还鉴定了拮抗稳健的CD8 T细胞反应的TF(图1B-图1C)。其中，Smad2已显示在急性感染和慢性感染期间限制T_EFF细胞反应。还鉴定了Nfatc2和Nr4a2(图1C)，这两种都与促进T细胞衰竭有关，从而限制T_EFF反应。此外，这里鉴定的Gata3与驱动T细胞功能障碍和抑制T_EFF细胞反应有关。因此，此筛选鉴定出已知抑制T_EFF分化，以及在某些情况下促进衰竭的关键TF。

此OpTICS筛选还鉴定出抑制最佳T_EFF分化的新型TF。这组基因包括Atf6、Irf2、Erg和Fli1，其中Fli1是阻遏T_EFF分化的最强命中之一。对Fli1作为T_EFF分化的抑制剂的鉴定在Arm和Cl13感染中也类似地发生(图1B-图1D)，表明此TF在抑制T_EFF生物学的普遍作用。选择了两种Fli1-sgRNA(sgFli1_290：CGCTGTCGGACAGTAGT TCC(SEQ ID NO:720)和sgFli1_360：GCCATGGAAGTCAAACTTGT(SEQ ID NO:721))，并且证实这些sgRNA有效地编辑Fli1基因(70％-80％编辑；图9A)，导致蛋白质表达减少(图1E)。在体内C9P14细胞中使用这些单独的Fli1-sgRNA靶向Fli1，导致在Arm或Cl13 p.i.1周到2周时5-20倍大的扩增(图1F和图9B-图9E)。这些数据表明Fli1在急性消退性或发展中的慢性感染中对稳健的CD8 T细胞扩增的阻遏。

实施例4：Fli1的基因缺失在急性消退感染期间促进稳健的T_EFF分化

接着在急性消退感染期间探究Fli1-sgRNA(sgFli1)或Ctrl-sgRNA(sgCtrl)转导的C9P14细胞的分化状态。在p.i.第8天，Fli1缺失降低CD127^Hi记忆前体(T_MP)的比例，然而频率KLRG1^Hi终末效应子(T_EFF)群仍不变，而CD127^LoKLRG1^Lo群略有增加(图2A和图10A)。当CD127^Hi T_MP群的频率降低而KLRG1^Hi T_EFF细胞群增加时，这些效果在p.i.第15天更为显著(图2A)。然而，在两个时间点，由于Fli1-缺陷型CD8 T细胞的增殖性扩增，T_MP和T_EFF的绝对数目都增大了约2-10倍(图2A)。使用CX3CR1和CXCR3也观察到T细胞向T_EFF样群分化的这种偏斜，与CX3CR1^-CXCR3⁺早期T_MEM亚群相比，CX3CR1⁺CXCR3^-T_EFF群sgFli1有明显富集(图2B)。虽然sgFli1⁺组中细胞毒性潜能增加的C9P14细胞(GzmB⁺TCF-1^-)也增加(图10B)，但是组间表达T-bet或Eomes的细胞比例相似(图10C)。与sgCtrl⁺组相比，sgFli1⁺组的C9P14细胞在离体肽刺激后产生IFN-γ的频率略低，但产生IFN-γ的细胞或同时共同产生多种效应分子的细胞的绝对数目增加(图10D)。

促进T_EFF增加的一个问题是防止T_MEM的形成。因此，在p.i.1个月检查Fli1-缺陷型T_MEM的形成。事实上，在p.i.第29天，与sgCtrl⁺组相比，sgFli1⁺C9P14组中KLRG1^Hi效应记忆C9P14细胞的数目仍很高。此时CD127^Hi T_MEM的数目在组间是相似的(图10E-10F)，表明在缺少Fli1的情况下产生的KRLG1^HI T_EFF群的稳健增加并不损害T_MEM的形成。为了进一步探究Fli1缺陷对T_MEM的影响，检查促凋亡分子和抗凋亡分子Bcl-2、Bcl-XL和Bim的表达。在p.i.第15天，与sgCtrl⁺组相比，sgFli1⁺C9P14细胞的Bcl-2和Bim表达均较低，但Bcl-XL表达没有变化(图10G-图10H)，导致sgFli1⁺C9P14组中BclXL/Bim之比呈更高趋势(图10H)。T_EFF或T_MP亚群中Bcl-2、Bcl-XL或Bim的表达没有差异(图10I-图10J)，这表明总C9P14群的差异部分地反映终末T_EFF和T_MP的不同比例。这些观察结果可与Bcl-XL/Bim之比在终末T_EFF存活中可比Bcl-2/Bim之比更重要的观察结果一致。

使用基于RV的过表达(OE)系统在WT LCMV特异性P14细胞中强制Fli1表达(Kurachi et al.,(2017)Nature Protocols,12:9 12,1980–1998)。与空载体对照相比，在p.i.第8天和第16天，观察到有反应的Fli1-OE-RV转导的P14细胞减少约5倍(图2C)。此外，强制的Fli1表达使有反应的P14细胞转向T_MP分化(图2D-图2E)。总之，这些数据揭示了Fli1在急性感染期间抑制T_EFF分化和促进T_MP发育中的作用。

实施例5：Fli1在慢性感染期间拮抗T_EFF样分化

在慢性病毒感染期间，CD8 T细胞反应存在早期命运分歧，其中抗病毒CD8 T细胞发育成终末T_EFF样细胞或形成T_EX前体，最终形成成熟的T_EX群。因此，研究了慢性感染早期Fli1在这种细胞命运决定中的作用。与急性消退性感染一样，Fli1的基因扰动使病毒特异性CD8 T细胞反应偏向T_EFF途径，被定义为TCF-1^-GrzmB⁺或Ly108^-CD39⁺细胞(图3A)。由于总Fli1-缺陷型细胞增加5-10倍，因此T_EFF样和T_EX前体群的细胞数目都得以增加(图11A-图11B)。还研究了已知参与早期T_EX形成的TF回路。TCF-1在这个早期时间点驱动Eomes的表达，Eomes是T_EX形成的另一个至关重要的TF，而事实上，Eomes在缺少Fli1的情况下是减少的(图11C)。T-bet，即另一种T-box TF，在sgCtrl⁺组和sgFli1⁺组间的表达是相似的(图11C)。Fli1的丧失也与在Cl13 p.i.第15天T_EX主调节因子Tox的低表达有关，这表明Fli1缺陷拮抗T_EX的发育，取而代之促进T_EFF样分化(图11C)。这种向T_EFF命运的倾斜与细胞毒性分子表达增加(图3A)和转变为数目增加的产细胞因子细胞的更多的细胞数目(图11D)有关。此外，Fli1的基因扰动导致慢性感染中CX3CR1⁺和Tim3⁺T_EFF样细胞比例增加(图3B)。相反，强制的Fli1表达具有相反的效果，不仅导致更低的细胞数目(图11E)，而且促进Ly108⁺CD39^-或TCF-1⁺GrzmB^-T_EX前体的形成和更少的CX3CR1⁺细胞(图11F-图11H)。值得注意的是，PD-1的表达没有变化，与急性消退的感染不同，KLRG1的表达不受影响(图3B)。

为了剖析潜在的机制，在Cl13感染的第9天对分选的sgCtrl⁺或sgFli1⁺C9P14细胞进行RNA-seq。靶向Fli1的两个sgRNA都产生相似的转录效应(图3C、图12A)。sgFli1⁺C9P14细胞在转录上与sgCtrl⁺C9P14细胞不同，在这两种条件间有1400多个基因差异表达(图3C、图12A)。效应子相关基因如Prf1、Gzmb、Cd28、Ccl3和Prdm1在sgFli1⁺C9P14细胞中稳健增加，然而sgCtrl⁺C9P14s在T_EX前体基因如Tcf7、Cxcr5、Slamf6和Id3中富集(图3C)。基因本体富集分析还鉴定了sgFli1⁺C9P14细胞中细胞分裂相关和T细胞活化相关途径(图3D)，然而sgCtrl⁺C9P14s富集于代谢途径，特别是核苷酸、核苷和嘌呤生物合成(图3E)。当发生分化成T_EFF样或T_EX前体细胞命运的分歧时，基因集富集分析(GSEA)用于检查慢性感染的早期。事实上，与sgFli1⁺C9P14群相比，T_EX前体特征在sgCtrl⁺C9P14细胞中强烈富集，而T_EFF基因特征在sgFli1⁺C9P14群中强烈富集(图3F-图3G)。因此，Fli1在急性消退和慢性感染中都抑制最佳T_EFF分化，而Fli1的丧失拮抗T_EX细胞的发育。然而，尽管Fli1的基因扰动在慢性感染的第9天驱动效应子相关基因的表达增加，但Tox、Tox2和Cd28也增加了。这种效应可表明，尽管Fli1的丧失可能会增强T_EFF样生物学，但这种效应可能并不以所需维持癌症的慢性感染中的反应的基因为代价。

实施例6：Fli1重塑CD8 T细胞的表观遗传学景观和拮抗T_EFF相关基因表达

在急性髓性白血病中，FLI1与染色质重塑因子(remodeler)BRD4共定位，以及驱动尤因氏肉瘤的EWS-FLI1融合癌蛋白可通过染色质重塑触发从头增强子形成并且可通过置换ETS家族成员使现有增强子失活。然而，尚不清楚Fli1如何影响发育中的T_EFF、T_MEM或T_EX细胞的表观遗传学景观变化。

为了检查Fli1在支持CD8 T细胞的表观遗传学景观中的作用，在Cl13 p.i.第9天对sgFli1⁺和sgCtrl⁺C9P14细胞进行ATAC-seq。与sgCtrl⁺C9P14细胞相比，sgFli1⁺组的染色质可及性发生显著变化(图4A)。对照组和Fli1扰动组间有5000多个染色质开放区域(OCR)不同，获得或丧失的峰数大致相等(图4B-图4D)。这些变化大多位于与顺式调控元件或增强子元件一致的内含子或基因间区域(图4C)。

每个OCR都被分配到最近的基因，以估测可以被这些顺式调控元件调节的基因。T_EFF相关基因如Ccl3、Ccl5、Cd28、Cx3cr1和Prdm1在sgFli1⁺组中获得了染色质可及性(图4D)，这与RNA-seq数据一致。相比之下，在sgFli1⁺组中，参与T细胞祖细胞生物学的基因如Tcf7、Slamf6、Id3和Cxcr5附近的染色质可及性减少(图4D)。此外，sgFli1⁺C9P14细胞在Tox(和Tox2)基因座中的可及性发生改变，但这些变化包括不同峰可及性既有增加又有减少(图4D)。这些染色质可及性的变化与基因表达的变化相对应，其中在转录上发生改变的基因中约1/3与差异可及的染色质区域相关(1467个中有402个)(图4E)。总体上，虽然可及性的增加与转录的增加有关，但是存在一个明确的区域亚群——其中可及性减少对应于转录的增加(图4F)。

接下来，对OCR中存在的依赖Fli1实现改变的可及性的TF基序进行定义。在缺少Fli1的情况下可及性降低的OCR当中，富集程度最高的TF基序是IRF1和IRF2的(图4G)，其潜在地将Fli1与IFN信号传导下游的IRF1和IRF2连接，或与这些TF对细胞周期的调控连接。在缺少Fli1的情况下可及性增加的OCR组中，ETS和RUNX基序高度富集(图4G)。到目前为止，复合ETS:RUNX基序的变化最大，富集18倍(图4G)。这些观察结果表明，Fli1可能限制其它ETS家族成员(例如ETS1、ETV1或ELK1)的活性或改变ETS:RUNX结合位点处的可及性(图4G)。Runx3是T_EFF分化的核心驱动者，并且其功能是直接调控效应基因表达，通过T-bet和Eomes协调和启用效应基因调控，以及拮抗TCF-1表达。因此，Fli1在Runx3生物学中的潜在作用将提供Fli1丧失与T_EFF分化改善之间的机制联系。

Fli1 CUT&RUN(Skene et al.(2017)Cdn.Elifesciences.org)用于测试Fli1基因组结合如何与染色质可及性和T_EFF生物学的变化相关。在Cl13 p.i.的第9天，>90％的经鉴定的Fli1结合位点包含在ATAC-seq所检测到的OCR中(图12B-图12D)。具体地，Fli1与T_EFF样基因如Cx3cr1、Cd28和Havcr2的OCR结合。Fli1缺失后，这些位置的染色质可及性增加(图4H)，导致转录(图3C)和蛋白质表达(图3B和图4I)增加。相比之下，对于在缺少Fli1的情况下表达减少的参与祖细胞生物学的基因如Tcf7和Id3，未观察到Fli1的直接结合(图12D)，这可能表明Fli1的主要作用是防止过于稳健的T_EFF程序，而不是直接启用记忆/祖细胞生物学。此外，在缺少Fli1的情况下，78％的Fli1被CUT&RUN定义为结合的位点的染色质可及性增加；相比之下，22％的可及性降低(图4J)，这表明Fli1主要起到阻遏染色质可及性的作用。分析Fli1 CUT&RUN数据中的DNA结合基序揭示了预期的Fli1基序。然而，SP2、NFY1和RUNX1基序在Fli1结合的情况下也显著富集(图4K)。再加上上述Fli1-缺陷型ATAC-seq观察结果中ETS:RUNX基序的增加，这些数据支持Fli1与RUNX家族成员协调来控制T_EFF分化的模型。

实施例7：强制的Runx3表达与Fli1缺失协同增强T_EFF反应

与T_EFF生物学不同，Runx1和Runx3在T_EX发育中的作用尚不清楚。由于T_EFF和T_EX在慢性感染中的命运相反，并且在缺少Fli1的情况下ETS:RUNX基序变得更加可及，因此假设RUNX-Fli1轴可能影响T_EFF相对T_EX分化。因此，测试Fli1-缺陷型CD8 T细胞中Runx1或Runx3的表达是否会影响早期慢性感染中的T_EFF分化。

在Cl13感染的p.i.第7天，Runx1在WT P14细胞中的强制表达降低细胞数目(图12E)。此外，Runx1-OE促进Ly108⁺CD39^-T_EX前体的形成，代价是更多的T_EFF样Ly108^-CD39⁺群(图12E)。为了探究在缺少Fli1的情况下强制的Runx1表达的影响，使用双RV转导方法并将对照或Fli1 sgRNA RV转导与空的或表达Runx1的RV组合。使用VEX(针对sgRNA)和mCherry来区分单转导细胞和双转导细胞。将C9P14细胞有效地单转导或双转导(图12F)并过继转移到Cl13感染的小鼠中，并在p.i.第8天分析双转导(即GFP⁺VEX⁺mCherry⁺)C9P14细胞(图5A)。在sgFli1⁺Runx1^-OE组中，GFP⁺VEX⁺mCherry⁺C9P14细胞的数目减少，而Ly108^-CD39⁺细胞更少。相比之下，sgFli1⁺空-RV组的GFP⁺VEX⁺mCherry⁺C9P14细胞群增加，并且这些细胞向Ly108^-CD39⁺T_EFF样命运倾斜(图5B-图5D、图12G)，如上所述。然而，在CD8 T细胞扩增增强的Fli1-缺陷型环境中，Runx1过表达降低反应的幅度，并部分地逆转Fli1丧失导致的向Ly108^-CD39⁺T_EFF样命运的倾斜(图5B-图5D)。

与Runx1的效果相反，仅强制表达Runx3(在sgCtrl⁺组中)会适度地增加CD8 T细胞反应的幅度，但会使G GFP⁺VEX⁺mCherry⁺C9P14群向CD39⁺Ly108^-T_EFF样群稳健地倾斜(图5A、图5E-图5G)。在sgFli1+Runx3-OE强制表达组中，在缺少Fli1的情况下这些效果更显著，数值扩增更大，甚至进一步向CD39+Ly108-T_EFF样细胞倾斜(图5E-图5G)。尽管sgFli1⁺Runx3-OE组的T_EX前体群频率较低，但与对照相比，此群的绝对数目仍不变(图5E、图5G、图12I)。总之，这些数据支持这样的模型——其中Fli1的丧失揭示Runx1和/或Runx3可以使用的ETS:RUNX基序。然而，尽管Runx3驱动更多的T_EFF样群——一种在缺少Fli1的情况下被放大的效应，但是Runx1似乎拮抗T_EFF的产生，这与Runx1和Runx3的相反功能一致。因此，Fli1通过限制基因组访问(接近，access)和保护ETS:RUNX结合位点来抑制Runx3功能的T_EFF促进活性。这些数据揭示Fli1、Runx3以及还可能有Runx1是最初活化后早期，T_EFF与T_EX之间命运选择的关键调节因子。

实施例8：缺少Fli1的情况下增强的T_EFF细胞反应提高对病原体的保护性免疫力

上述数据引发了Fli1的丧失是否会因T_EFF分化增强而改善感染控制的问题。为了测试这一想法，LCMV Cl13被用于研究慢性感染以及两种急性感染模型即流感病毒(PR8)或单核细胞增多性李斯特菌(LM)(各自表达P14细胞所识别的LCMV_GP33-41表位(PR8_GP33和LM_GP33))期间的保护性免疫力(图6A)。

在Cl13感染期间，与无转移条件相比，sgCtrl⁺C9P14细胞的过继性转移提供中等程度的病毒控制(NT，图6B)。然而，在p.i.约2周时，与sgCtrl⁺C9P14细胞相比，sgFli1⁺C9P14提供远远改善的病毒复制控制(图6B)，这显示出甚至在慢性病毒感染——其中衰竭的诱导是有效保护性免疫力的主要障碍——时因Fli1的丧失所获的益处。值得注意的是，在一些实验中，sgFli1⁺C9P14，而不是sgCtrl⁺C9P14受体小鼠经历严重的疾病而不得不在p.i.D7-D13之间实施安乐死(图13A)，这表明Fli1可以防止过度的T_EFF样分化和限制T细胞介导的免疫病理学。

接下来，评估Fli1的丧失在急性消退感染过程中的影响。在流感-PR8_GP33感染期间，接受sgFli1⁺C9P14细胞的小鼠比对照非转移小鼠或接受sgCtrl⁺C9P14细胞的小鼠体重减轻更少(图6C)。体重减轻降低与接受sgFli1⁺C9P14细胞的小鼠肺病毒复制的更好控制有关(图6D)。在这种环境下，PR8GP33感染后肺中sgFli1⁺C9P14扩增的幅度存在变化(图13B-图13D)。T细胞反应的这种异质性与病毒控制的差异有关，一些小鼠到这个时间点几乎消除了病毒RNA(图6D)并从体重减轻中恢复。事实上，在已经恢复的小鼠中，C9P14反应的总体幅度较低，这与在尚未控制感染的小鼠中病毒复制延长和驱动T细胞扩增增加的抗原载量升高一致(图13B-图13C)。值得注意的是，相比于接受sgCtrl⁺C9P14的11只小鼠中仅有1只，在接受sgFli1⁺C9P14细胞的12只小鼠中有6只到这个时间点控制了疾病(图6D、图13C)。在肺中仍携带病毒RNA的小鼠组中，与sgCtrl⁺C9P14细胞相比，sgFli1⁺C9P14细胞已扩增到远远更高的数目(图13C)。在脾中也观察到T_EFF细胞扩增的类似差异(图13D)。

LMGP33感染后Fli1的丧失也赋予了类似的优势。尽管sgCtrl⁺和sgFli1⁺C9P14细胞在高剂量LMGP33激惹后都提高了存活率(图6E)，但与p.i.第7天时的sgCtrl⁺C9P14细胞相比，sgFli1⁺C9P14细胞对细菌复制的控制远远更好(图6F)。与流感病毒模型一致，与sgCtrl⁺组相比，这种保护性免疫力的提高与sgFli1⁺C9P14细胞更大的数值扩增有关(图13E)。因此，在慢性Cl13感染、呼吸道流感病毒感染和细胞内细菌全身感染期间，Fli1的缺陷对T_EFF细胞扩增和保护性免疫力赋予实质性益处。

实施例9：CD8 T细胞中Fli1的丧失增强肿瘤免疫力

接下来探究Fli1缺陷是否增强对肿瘤的控制。采用皮下B16_GP33肿瘤模型。在肿瘤接种后(p.t.)第5天，荷瘤小鼠接受相同数目的sgCtrl⁺或sgFli1⁺C9P14细胞(图7A)。Rag2-/-受体小鼠用于分开sgCtrl⁺相对sgFli1⁺C9P14细胞的影响(图7A)。在这种环境下，与未转移的小鼠或sgCtrl⁺C9P14组相比，sgFli1⁺C9P14细胞稳健地控制肿瘤进展(图7B)。此外，在终点时，与任一对照组相比，sgFli1⁺C9P14组的肿瘤重量显著降低(图7C)。尽管C9P14细胞数/克肿瘤没有明显差异，但这种肿瘤控制与sgFli1⁺组中Ly108^-CD39⁺供体C9P14的显著增加有关，这与更多的T_EFF样群一致(图7D-图7E)。然而，在脾中，与sgCtrl⁺组相比，sgFli1⁺C9P14细胞数目以及Ly108^-CD39⁺细胞比例显著增加(图7F-图7G)。这些发现被扩展到具有免疫能力的小鼠身上。Cas9+C57BL/6受体小鼠用于防止C9P14供体细胞的排斥，并允许在延长的时间段内分析反应(图14A)。在这种环境下，与sgCtrl⁺C9P14细胞相比，sgFli1⁺C9P14细胞再次对肿瘤控制赋予实质性益处(图14B-图14C)。此外，这种肿瘤控制的改善与肿瘤、引流淋巴结(draining lymph node,dLN)和脾中Ly108^-CD39⁺T_EFF样群的增加以及dLN和脾中C9P14细胞数目的增加有关(图14D-图14G)。因此，Fli1的基因缺失对肿瘤控制赋予实质性益处，表明Fli1在肿瘤进展过程中在协调和抑制保护性T_EFF反应中发挥着核心作用。总之，这些数据表明，在全身和局部、急性消退和慢性感染以及肿瘤进展的环境下，Fli1的丧失导致保护性免疫力提高。

实施例10：讨论

本文致力于通过更好地了解T_EX和T_EFF分化的生物学来改善癌症和慢性感染的免疫疗法。使用体内CRISPR筛选方法来具体探究管控T_EX相对T_EFF分化的机制。Fli1被鉴定为保护转录和表观遗传学定型为完全T_EFF分化的关键TF。从机制上讲，Fli1限制ETS:RUNX位点的表观遗传学可及性，从而阻止Runx3完全启用效应子程序。因此，使Fli1缺失，显著地提高了急性感染、慢性感染和癌症的多种模型中的保护性免疫力，从而将Fli1鉴定为T_EFF相对T_EX分化程序的新型调节因子，也是未来免疫疗法策略的靶标。

基于CRISPR的筛选方法的最新进展实现了剖析体外T细胞活化和体内对感染和肿瘤的反应。为了更好地了解T_EFF和T_EX的命运定型，本文开发了OpTICS。OpTICS是一种体内CRISPR系统，其允许使用保留疾病发病机理和正常CD8细胞分化生物学的生理T细胞数目，在成熟的CD8 T细胞中进行筛选，等等。除了鉴定众多已知的CD8 T细胞反应调节因子外，此方法还鉴定了若干新型的T_EFF分化负调节因子，包括Smad2、Erg和Fli1。事实上，Fli1的基因丧失提高急性或慢性感染和癌症的多种环境下的保护性免疫力。此外，与驱动T_EX的TF Tox的丧失的影响——其中在慢性感染或癌症期间，由于T_EX祖细胞的丧失导致CD8 T细胞反应无法持续——不同，Fli1的缺陷并不减少T_EX祖群。

Fli1在造血干细胞分化中发挥作用，并且与其它TF如Gata1/2和Runx1共定位。在本文中，发现了Fli1的基因扰动显著增加抗原特异性CD8 T细胞对病毒感染响应时ETS:RUNX基序处的染色质可及性。此外，在缺少Fli1的情况下，强制的Runx3表达的效果得到增强。这些观察结果表明，Fli1阻止对RUNX结合位点的可及性，从而限制效应子促进性(effector-promoting)TF Runx3的活性。此外，Runx3还可以协调编码其它效应子促进性TF的基因座的表观遗传学变化。虽然Runx1可能拮抗Runx3(反之亦然)，但是Runx3似乎在T细胞活化的环境下占主导。本文的数据还表明，Fli1可以与Runx1协作来抑制T_EFF分化，可能靠的是Fli1与Runx1在ETS-RUNX基序处共结合。总之，这些数据表明了这样的模型——其中Fli1，与Runx1组合，阻止Runx3的有效基因组可及性或活性，从而抑制涉及Runx3的正向前馈效应子促进活性的完全效应基因程序。因此，Fli1的基因缺失至少部分地通过创造更有效的Runx3活性的机会来去阻遏T_EFF分化。

最近的工作已经开始定义指引终末T_EFF、T_MEM和T_EX之间命运决定的转录回路。这些促进一种细胞命运的转录机制中有很多直接阻遏相反的命运。例如，Tox在阻遏T_EFF的同时促进T_EX，TCF-1以T_EFF为代价促进T_MEM或T_EX，以及Blimp-1、T-bet、Id2等驱动T_EFF并阻遏T_MEM。Fli1被鉴定为是一种防止向效应子分化过度定型的基因组“保护”，这揭示了若干新颖的构思。首先，在慢性感染期间，TCF-1或Tox的丧失产生在感染后期由于向终末分化的T_EFF的定型而维持反应的能力。这些观察结果引发了这样一个问题，即促进T_EFF细胞命运的增加是否必然以失去T_MEM或T_EX谱系为代价。Fli1代表在其它方面稳健的前馈效应子转录回路上的一种独特类型的阻尼器(damper)。通过抑制效应子布线(effector wiring)中的Runx3节点，Fli1缓和中心步骤，该步骤不仅直接控制关键效应基因的表达，而且积极加强其它协同效应TF。然而，与TCF-1和Tox不同，Fli1不是祖细胞生物学所必需的，并且在缺少Fli1的情况下T_EFF细胞和TMP(在急性消退感染中)或T_EX祖细胞(在慢性感染中)的数目均是增加的。因此，通过阻断回路中的这个“阻尼器”，而不是使TMP或T_EX分化的主开关缺失，在不损害长期免疫力的情况下增加短期保护性免疫力的有益方面是可能的。其次，本文的数据揭示了Fli1与在ETS:RUNX基序处结合的其它因子之间对实现表观遗传的竞争机制。这些效应可表现出来，因为Fli1占据可被ETS:RUNX家族TF结合的基因组位置，从而催化染色质可及性变化。可选地，这些效应可能是由Fli1自身协调的染色质变化引起的。例如，EWS-FLI1融合体(fusion)招募BAF复合体来起始癌细胞中的染色质变化。因此，Fli1在CD8 T细胞中的作用可能涉及一种基于染色质可及性的机制来抑制ETS:RUNX驱动的效应子生物学，尽管也可能存在通过IRF1/IRF2的其它效应。

目前的研究表明，在感染和癌症的多种环境下，Fli1的丧失对保护性免疫力有重要的有益效果。Fli1的缺少会一贯地提高各模型的保护性免疫力。与免疫疗法尤其相关的是，使Fli1缺失改善对肿瘤生长和慢性LCMV感染——其中衰竭的诱导通常会限制免疫力——这两者的控制。最后，考虑到在细胞治疗环境中应用CRISPR介导的基因操纵的能力，可以通过靶向Fli1或相关途径来实现临床益处。

因此，OpTICS平台提供了高度稳健的体内平台来筛选参与调节CD8 T细胞分化的基因，因为它与肿瘤免疫疗法有关。这种高度聚焦和优化的平台实现了sgRNA检测的20-100倍富集(强化，enrichment)和相当大的功能获得筛选分辨率。除了这里揭示的Fli1的新作用外，通过此筛选，还有许多其它潜在的探索靶标。此外，使用OpTICS将这种聚焦TF的生物学扩展到细胞生物学的其它领域，应该会为未来的发现提供一个强大的平台。

列举的实施方式

提供了以下列举的实施方式，其编号不应被解释为指定重要性级别。

实施方式1提供修饰的免疫细胞或其前体，包含编码Fli1的内源性基因座中的修饰。

实施方式2提供实施方式1的修饰的免疫细胞或其前体，其中内源性Fli1基因或蛋白质被破坏。

实施方式3提供实施方式1或2的修饰的免疫细胞或其前体，其中所述修饰或破坏通过选自以下的方法进行：CRISPR系统、抗体、siRNA、miRNA、拮抗剂、药物、小分子抑制剂、PROTAC靶标、TALEN和锌指核酸酶。

实施方式4提供实施方式3的修饰的免疫细胞或其前体，其中所述CRISPR系统包含至少一个sgRNA，所述至少一个sgRNA包含SEQ ID NO:152-156或SEQ ID NO:676-713中的任一个。

实施方式5提供前述实施方式中任一项的免疫细胞或其前体，其中所述细胞是人细胞。

实施方式6提供前述实施方式中任一项的免疫细胞或其前体，其中所述细胞是T细胞。

实施方式7提供实施方式6的免疫细胞或其前体，其中所述T细胞对T细胞衰竭具有抗性。

实施方式8提供药物组合物，其包含Fli1的抑制剂。

实施方式9提供实施方式8的药物组合物，其中所述抑制剂选自CRISPR系统、抗体、siRNA、miRNA、拮抗剂、药物、小分子抑制剂、PROTAC靶标、TALEN和锌指核酸酶。

实施方式10提供实施方式9的药物组合物，其中所述CRISPR系统包含至少一个sgRNA，所述至少一个sgRNA包含SEQ ID NO:152-156或SEQ ID NO:676-713中的任一个。

实施方式11提供治疗对其有需要的对象的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述对象施用实施方式1-7中任一项的细胞或实施方式8-10中任一项的组合物。

实施方式12提供实施方式11的方法，其中所述疾病或障碍是感染。

实施方式13提供实施方式11的方法，其中所述疾病是癌症。

实施方式14提供筛选T细胞的方法，所述方法包括：i)将Cas酶和sgRNA文库引入活化的T细胞中，ii)将所述T细胞施用于受感染小鼠，iii)从所述受感染小鼠中分离所述T细胞，和iv)分析所述T细胞。

实施方式15提供实施方式14的方法，其中所述sgRNA文库包含靶向多个转录因子的多个sgRNA。

实施方式16提供实施方式15的方法，其中所述多个转录因子包括表1中列出的任意转录因子。

实施方式17提供实施方式15的方法，其中每个sgRNA靶向每个转录因子的DNA结合结构域。

实施方式18提供实施方式14的方法，其中所述sgRNA文库包含至少一个序列，所述至少一个序列选自SEQ ID NO:1-675。

实施方式19提供实施方式14的方法，其中所述sgRNA文库由SEQ ID NO:1-675中列出的核苷酸序列组成。

实施方式20提供实施方式14的方法，其中所述筛选评估T细胞衰竭。

实施方式21提供实施方式14的方法，其中分析所述细胞包括选自测序、PCR、MACS和FACS的方法。

实施方式22提供实施方式14的方法，其中所述测序揭示感兴趣的靶标。

实施方式23提供实施方式22的方法，其中针对所述感兴趣的靶标设计药物。

实施方式24提供实施方式22的方法，其中当向所述T细胞施用所述药物时，至少一种T细胞反应增加。

实施方式25提供实施方式14的方法，其中1x10⁵个T细胞被施用于所述受感染小鼠。

实施方式26提供实施方式14的方法，其中所述方法鉴定管控T_EFF和T_EX细胞分化的新型转录因子。

本文引用的每件专利、专利申请和出版物的公开内容特此通过引用以其整体并入本文。虽然已经参考具体实施方式公开了本发明，但显然本领域其他技术人员可以在不背离本发明真实精神和范围的情况下设计出本发明的其它实施方式和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。

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序列表

<110> 宾夕法尼亚大学董事会

E•J•惠里

Z•陈

J•石

O•科汗

J•R•贾尔斯

S•曼尼

<120> 用于发现CD8 T细胞中治疗靶标的体内CRISPR筛选系统

<130> 046483-7324WO1(02826)

<150> 63/153,191

<151> 2021-02-24

<160> 721

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 90

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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cttcttggtg agcagaccga 20

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<220>

<223> sgRNA

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ctgcagatac cttggctgtg 20

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<220>

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<220>

<223> sgRNA

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<220>

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<220>

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cagatgtcgt tattcacagc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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tgtgaataac gacatctgcc 20

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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ccttctgctg ggcagggata 20

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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tcacaacctt ctgctgggca 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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gttcctcttg cacttgctgc 20

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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ccatcttatt ccgttccctt 20

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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ttccttctct ttcagcagat 20

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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gatctgtcag ctccctccga 20

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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cttctcctct tccagctcct 20

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<210> 173

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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gaggccaccc tactcttata 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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ccaagtgtag atgtccttca 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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ccaatggcaa ggtctccttc 20

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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cttctcggct gagctctcga 20

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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cgacagggtg agcctcttct 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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ccctgtcgca gatctacgag 20

<210> 181

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gaagagcgtg ccctacttca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gcacgggcaa gagctcttgg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 187

ctgtggcggc gagatggtac 20

<210> 188

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 188

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gcttgggctt gataaggggc 20

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<212> DNA

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<220>

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 191

acatcttccg gtttcgggtc 20

<210> 192

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 192

caagatgtga gctcacattg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 193

aagatgtgag ctcacattgt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 194

agatgtgagc tcacattgtg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 195

ttgataaagc ttctgttatg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 196

tctcacacgt aaataactga 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 197

tcagagaggt aactcgttcc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 198

ccaattatat actttcagag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 199

cctctctgaa agtatataat 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 200

ataattggtt tgctaatcga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 201

ttggtttgct aatcgacgga 20

<210> 202

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 202

ctgcacgaag aaggcgtacg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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cttcgtgcag acctgccgcg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gaagaagcat cccgactcgt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gcgaagttca ccgacgagtc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 206

ggcgaagttc accgacgagt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gagcggcccc acggaggacc 20

<210> 208

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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tctccacctg gtcctccgtg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 209

atctccacct ggtcctccgt 20

<210> 210

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 210

cgatgaggca cagcgtggtg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gcagagtggc ggcggtcaga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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ctactccaag ctcaaggaac 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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tgtaatcgat gacgtgctgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gcacgtcatc gattacatct 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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cttggacctg cagatcgccc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 217

accactgcta ctcgcgcctg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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ctggtgccgg gagtcccgcg 20

<210> 220

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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tggctaagct gagtgcctcg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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atctgtggga tcgtttgcat 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gggtaaaaga agctccgcac 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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tctcagaagg ttgcccttct 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gtctcagaag gttgcccttc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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cccccgagtg cagcttgatg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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cgccggcgtg acgcactcac 20

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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ccagatcccc tggatgcatg 20

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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gtgccgagcc gcatgcatcc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 252

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 254

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 255

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 256

gttagctgct gacaatagca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 258

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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acaagccaga tcctcctact 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 262

ccccaccacc ccgccgtgtg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gtactggcag ctgttcacct 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 264

gtgaacagct gccagtaccc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 265

tgaacagctg ccagtaccca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 266

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 267

tgtgtagcca gatgagacca 20

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

<400> 268

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 269

ccaggggatc tggaagcgtt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 270

tggcatgttt ccaggggatc 20

<210> 271

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 271

cttgatgtac gatggcacca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 272

tcagcagcgg ccagtacgag 20

<210> 273

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 273

gccactgcag cccctcgtac 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 274

gccagtacga ggggctgcag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 275

gcacagtctt ccgcgtaccc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 276

ctgtgctgtg gagtgcacag 20

<210> 277

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 277

cagaaatgtc cagctgggac 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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atggctcaga aatgtccagc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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tggctcagaa atgtccagct 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 280

tcagtcactt cttcaaaatc 20

<210> 281

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 281

agtgactgac cggtcccagc 20

<210> 282

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 282

ctgcatgctt ccagggaatc 20

<210> 283

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 283

cggattccct ggaagcatgc 20

<210> 284

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 284

ttgcttgcct gcatgcttcc 20

<210> 285

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 285

gcggagctgg atcgtggagc 20

<210> 286

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 286

gagctggatc gtggagcagg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 287

aggagcggat caaggcagag 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 288

ggcacttgga ggcggcaatg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 289

cagcttcctt ttccggcact 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 290

ggaagctgga gcggatcgct 20

<210> 291

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gaaagcgcaa aactccgagc 20

<210> 292

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 292

ggcactaccg caaacacaca 20

<210> 293

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<212> DNA

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<212> DNA

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ttcaagaagt gtctctccgt 20

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ttaagaagtg tctgtctgtg 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

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tcagttcatg gtggctctgg 20

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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tcgataggtg cagccagact 20

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<212> DNA

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<220>

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catcactcaa ctccagtctg 20

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<220>

<223> sgRNA

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cggagcggga gaaggagcgc 20

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<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 598

ggagcgggag aaggagcgcc 20

<210> 599

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 599

gcgggagaag gagcgccggg 20

<210> 600

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 600

gcgggtccgc gacatcaatg 20

<210> 601

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 601

gcacctgctg ctccaggctg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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ttgaggggtt tcttgatgac 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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taaagcatga acgcattgag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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gtaaagcatg aacgcattga 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 605

tcaaccagat cctgggtcgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 606

atacccgggc tggtccgcgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 607

atacaacatg aaggcattca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 608

tacaacatga aggcattcag 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 609

tatacaacat gaaggcattc 20

<210> 610

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 610

taatggctgc actttccttc 20

<210> 611

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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atagttgtcc cgggctgacc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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acaggcttct ggggctcatt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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tttgttcttt cgtgataccc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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caaaagtagc atttggattc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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cgaagattgt ggcatcaatg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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actggcttct gtggctcatt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 618

taggccgaca ctggcttctg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> sgRNA

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ggagtacctg aaagccttgg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> sgRNA

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tctgtacggc ggtctctccc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<220>

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<212> DNA

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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tcctggtatt cacaccatca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 642

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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ccacacttgt cacattgata 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 647

acagacatgt ggtccttgta 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 652

tccactgtgt atcctctgat 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 653

ctccactgtg tatcctctga 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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acccatcaga ggatacacag 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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ggattctttg atgtcttatg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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aggatctgtc ccaggctcct 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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agcttccctt taaggccttc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 661

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<210> 663

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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attccatggg ctcagccacc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 666

gacagcaaac cggaagctga 20

<210> 667

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 667

aggacttcgg acttcttcta 20

<210> 668

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 668

gaagaagtcc gaagtcctat 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 669

ctagctgacc gataggactt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 670

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<210> 671

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 671

ctcaaagact gatccttctg 20

<210> 672

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 672

ggacagaaaa atccagcctt 20

<210> 673

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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ctactcaggt gaaaaagcaa 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 677

ccaggaggaa ttgccacagc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 678

ccagctgtgg caattcctcc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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tgtcggagag cagctccagg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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cgctgtcgga gagcagctcc 20

<210> 681

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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acagctggcg ttggcgctgt 20

<210> 682

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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ccaggtgata cagctggcgt 20

<210> 683

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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ccaacgccag ctgtatcacc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 684

cccctcccag gtgatacagc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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cgccagctgt atcacctggg 20

<210> 687

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 687

gccagctgta tcacctggga 20

<210> 688

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 688

ccagctgtat cacctgggag 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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cacctgggag gggaccaacg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

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caaaatgacg gaccccgatg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 696

aatgacggac cccgatgagg 20

<210> 697

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 697

agcgcctggc cacctcatcg 20

<210> 698

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 698

cggaccccga tgaggtggcc 20

<210> 699

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 699

cagcgcctgg ccacctcatc 20

<210> 700

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 700

ccagcgcctg gccacctcat 20

<210> 701

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 701

ccgatgaggt ggccaggcgc 20

<210> 702

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 702

cgatgaggtg gccaggcgct 20

<210> 703

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 703

gatgaggtgg ccaggcgctg 20

<210> 704

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 704

tttccgctcg ccccagcgcc 20

<210> 705

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 705

tggccaggcg ctggggcgag 20

<210> 706

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 706

agcttgtcgt aattcatgtt 20

<210> 707

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 707

catagtaata acggagggcc 20

<210> 708

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 708

tttatcatag taataacgga 20

<210> 709

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 709

ttttatcata gtaataacgg 20

<210> 710

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 710

tgtttttatc atagtaataa 20

<210> 711

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 711

aacattatga ccaaagtgca 20

<210> 712

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 712

atatcttttg ccgtgcactt 20

<210> 713

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 713

gcttacaaat ttgacttcca 20

<210> 714

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 714

agtggaagcc attgctctcg 20

<210> 715

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 715

aatggcaact ggtccccttc 20

<210> 716

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 716

gaagatgggc gggagtcttc 20

<210> 717

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 717

cagcttgtcc aactggtcgg 20

<210> 718

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 718

ccaaagccac cattgcaaag 20

<210> 719

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 719

gaacatcggc tacagccagg 20

<210> 720

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 720

cgctgtcgga cagtagttcc 20

<210> 721

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 721

gccatggaag tcaaacttgt 20

Claims (26)

1.修饰的免疫细胞或其前体，包含编码Fli1的内源性基因座中的修饰。

2.修饰的免疫细胞或其前体，其中所述内源性Fli1基因或蛋白质被破坏。

3.根据权利要求1或2所述的修饰的免疫细胞或其前体，其中所述修饰或破坏通过选自以下的方法进行：CRISPR系统、抗体、siRNA、miRNA、拮抗剂、药物、小分子抑制剂、PROTAC靶标、TALEN和锌指核酸酶。

4.根据权利要求3所述的修饰的免疫细胞或其前体，其中所述CRISPR系统包含至少一个sgRNA，所述至少一个sgRNA包含SEQ ID NO:152-156或SEQ ID NO:676-713中的任一个。

5.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的免疫细胞或其前体，其中所述细胞是人细胞。

6.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的免疫细胞或其前体，其中所述细胞是T细胞。

7.根据权利要求6所述的修饰的免疫细胞或其前体，其中所述T细胞对T细胞衰竭具有抗性。

8.药物组合物，其包含Fli1的抑制剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述抑制剂选自CRISPR系统、抗体、siRNA、miRNA、拮抗剂、药物、小分子抑制剂、PROTAC靶标、TALEN和锌指核酸酶。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述CRISPR系统包含至少一个sgRNA，所述至少一个sgRNA包含SEQ ID NO:152-156或SEQ ID NO:676-713中的任一个。

11.治疗对其有需要的对象的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求1-7中任一项所述的细胞或权利要求8-10中任一项所述的组合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述疾病或障碍是感染。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述疾病是癌症。

14.筛选T细胞的方法，所述方法包括：

i)将Cas酶和sgRNA文库引入活化的T细胞中，

ii)将所述T细胞施用于受感染小鼠，

iii)从所述受感染小鼠中分离所述T细胞，和

iv)分析所述T细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述sgRNA文库包含靶向多个转录因子的多个sgRNA。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述多个转录因子包括表1中列出的任意转录因子。

17.根据权利要求15所述的方法，其中每个sgRNA靶向每个转录因子的DNA结合结构域。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述sgRNA文库包含选自SEQ ID NO:1-675的至少一个序列。

19.根据权利要求14所述的方法，其中所述sgRNA文库由SEQ ID NO:1-675中列出的核苷酸序列组成。

20.根据权利要求14所述的方法，其中所述筛选评估T细胞衰竭。

21.根据权利要求14所述的方法，其中分析所述细胞包括选自测序、PCR、MACS和FACS的方法。

22.根据权利要求14所述的方法，其中所述测序揭示感兴趣的靶标。

23.根据权利要求22所述的方法，其中针对所述感兴趣的靶标设计药物。

24.根据权利要求22所述的方法，其中当将所述药物施用于所述T细胞时，至少一种T细胞反应增加。

25.根据权利要求14所述的方法，其中1x10⁵个T细胞被施用于所述受感染小鼠。

26.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法鉴定管控T_EFF和T_EX细胞分化的新型转录因子。