JP2023518852A - Ｒｂｃｅｖを使用する免疫細胞への核酸の送達方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、免疫細胞（例えばＴ細胞）に核酸を送達するための核酸赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）の使用に関し、上記核酸カーゴは、上記ＲＢＣＥＶ中にインビトロまたはエクスビボで搭載される。本発明はまた、がんなどの疾患における上記免疫細胞の予防的及び治療的使用にも関する。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は２０２０年３月２６日出願のＵＳ６３／０００，４６８の優先権を主張し、上記出願の内容及び要素は、全ての目的に対して本明細書に援用される。

本発明は免疫細胞に関し、詳細には、免疫細胞への薬剤、例えば核酸の送達方法に関するが、これに限定はされない。本発明はまた、上記核酸を含む免疫細胞、ならびに医学的治療方法及び予防方法における上記免疫細胞の使用にも関する。

Ｔリンパ球は、感染症及びがんからヒトの体を守る適応免疫系の必須成分である。したがって、Ｔ細胞の活性化及び機能に関与する遺伝子の発現を変化させることによって、Ｔ細胞発生の分子機序を理解することが重要である。Ｔ細胞の操作及び組換えは、がん及びその他の疾患の新たな治療方法として浮上している、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、養子Ｔ細胞移植療法、Ｔ細胞受容体療法を含むＴ細胞療法にとっても重要である。

Ｔ細胞の改変は、これらの細胞中に核酸を送達するためのウイルス法及び非ウイルス法に依拠している。ウイルスベクターは、多くの場合、トランスフェクション効率が高いが、高品位のウイルスを作製するには長時間を要し、多額の費用を要し、労働集約的である。さらに、レンチウイルスによる形質導入により、宿主細胞における形質転換の危険性が高いＤＮＡインテグレーションが生じることも多い。エレクトロポレーション及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）を含む非ウイルス送達方法は、より速く、より経済的である。しかしながら、これらの処理は細胞にとって過酷であり、高い割合で死に至る。アデノ随伴ウイルスによる形質導入及びリポフェクションなどの他の送達方法は、Ｔ細胞には有効ではない。したがって、有効且つ実施可能なＴ細胞のトランスフェクション方法が強く求められている。

細胞外小胞（ＥＶ）は、リン脂質二分子膜に封入されたナノサイズの細胞由来の粒子である。ＥＶはすべての生細胞によって分泌され、エキソソーム及び微小胞を含む種々のサブタイプに分類される。エキソソームは、エンドソーム膜の内向きの出芽から生成し、多小胞体中に腔内小胞を形成し、多小胞体は最終的に原形質膜と融合し、エキソソームを細胞外空間に放出する。微小胞は、原形質膜から直接出芽することにより形成される。一般的には、エキソソームは径が３０～１００ｎｍである一方、微小胞は１００ｎｍよりも大きい。

ＥＶは、さまざまな脂質、タンパク質（表面及び腔内）、及び核酸から構成される。元来、ＥＶは、表面において受容体－リガンド結合を介して、または細胞内でエンドサイトーシスを介して、レシピエント細胞と相互作用することによって、細胞間情報伝達の手段として作用する。ＥＶは、細胞膜を通して大きな高分子を輸送するその元来の能力により、小分子、タンパク質、ならびに、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの短鎖ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの長鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）でさえも含む核酸の輸送のための薬物送達ビヒクルとして提案されている。したがって、ＥＶは、治療のための分子の送達のための潜在的なプラットフォームとして浮上している。

本発明者らは以前、核酸を含む治療用試薬を送達するために赤血球由来ＥＶ（ＲＢＣＥＶ）を利用している。このプラットフォームには多くの利点がある。第１に、ＲＢＣＥＶは脱核赤血球に由来し、そのためＤＮＡをほとんどまたはまったく含まない。第２に、ＲＢＣＥＶの生産は、採血の容易さ及び血液中の赤血球が豊富に存在するために、他のＥＶ源と比較して大規模に行うことができる。第３に、ＥＶは、自家性であるか、または輸血と同様に血液型が一致する同種異系間で送達することができる。ＲＢＣＥＶは、マウスモデルにおいてがんを治療するために、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む治療用ＲＮＡを安定して送達をすることが明らかになっている（例えば、ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０５９６を参照のこと）。

本発明は、上記考察に照らして考案されたものである。

本発明者らは、ＲＢＣＥＶを使用して、ナイーブＴ細胞に、細胞死または活性化を誘発することなく、効果的に核酸を送達することができることを発見した。ＲＢＣＥＶはＴ細胞により安定して取り込まれ、ＲＢＣＥＶを使用してＴ細胞中に核酸を搭載することができる。したがって、ＲＢＣＥＶを使用して、エクスビボまたはインビボ免疫療法用のＴ細胞の遺伝子改変のための治療用の核酸を送達することができる。

本明細書に開示の方法は、免疫細胞をＲＢＣＥＶに、上記免疫細胞が上記ＲＢＣＥＶを取り込むのに好適な時間及び条件下で接触させるステップを含む。

一態様において、本開示は、免疫細胞中への核酸の送達方法であって、上記免疫細胞を、核酸カーゴを搭載した赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）と共にインキュベートすることを含む上記方法を提供する。

別の態様において、本開示は、免疫細胞への核酸の形質導入方法であって、上記免疫細胞を、核酸カーゴを搭載したＲＢＣＥＶと共にインキュベートすることを含む上記方法を提供する。

上記免疫細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの単核球であってもよい。上記免疫細胞は、好ましくはＣＤ３＋細胞である。上記免疫細胞はＴ細胞であってもよい。

場合により、上記免疫細胞は樹状細胞である。場合により、上記免疫細胞はマクロファージである。

上記方法はインビトロ法またはエクスビボ法であることが好ましい。上記免疫細胞は、上記ＲＢＣＥＶとインビトロまたはエクスビボで接触されることが好ましい。場合により、上記免疫細胞は、上記ＲＢＣＥＶとインビボで接触される。

本明細書に開示の方法は、ＲＢＣＥＶに核酸カーゴを搭載するステップを含んでいてもよい。他の方法において、上記ＲＢＣＥＶに核酸カーゴを搭載するステップを必要としないように、上記ＲＢＣＥＶは、既に搭載された上記核酸カーゴと共に提供される。

上記核酸カーゴはＲＮＡまたはＤＮＡを含んでいてもよい。例えば、上記核酸カーゴは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはプラスミドを含んでいてもよい。

上記方法は、対象から免疫細胞を単離するステップを含んでいてもよい。他の方法において、上記方法は、事前に対象から得られた免疫細胞上で実施される。上記方法は、本明細書に開示の方法によって製造された免疫細胞を、対象に投与することを含んでいてもよい。例えば、本明細書に開示されるように、ＲＢＣＥＶを使用して核酸が搭載された、すなわち形質導入された免疫細胞を投与すること。

別の態様において、本開示は、免疫細胞に核酸を送達するための、核酸を搭載したＲＢＣＥＶの使用を提供する。

別の態様において、本開示は、免疫細胞または複数種の免疫細胞を含む組成物であって、上記免疫細胞（複数可）が外因性核酸を含み、上記核酸がＲＢＣＥＶを使用して送達されるか、もしくは送達されている、上記免疫細胞または組成物を提供する。場合により、上記免疫細胞は、ナイーブであるか、未分化であるか、または未活性化である。

別の態様において、本開示は、治療方法であって、上記治療方法を必要とする対象に、治療有効量の本明細書に開示の免疫細胞を投与することを含む治療方法、あるいは、かかる方法に使用するための、または疾患もしくは障害の治療に使用するための医薬の製造のための、本明細書に開示の免疫細胞を提供する。別の態様において、本開示は、対象の免疫細胞に、治療有効量の、カーゴを搭載したＲＢＣＥＶを投与することを含む治療方法、あるいは、かかる方法に使用するための、または疾患もしくは障害の治療に使用するための医薬の製造のためのＲＢＣＥＶを提供する。

本発明の原理を説明する実施形態及び実施例を、添付の図面を参照して議論することとなるが、それらの図面は以下の通りである。

マウスT細胞は容易にヒトＲＢＣＥＶを取り込む。ＣＦＳＥ色素でＲＢＣＥＶを標識することによる取り込みアッセイの概略図である。 マウスT細胞は容易にヒトＲＢＣＥＶを取り込む。マウスＣＤ３＋ Ｔ細胞によるＣＦＳＥ標識ＲＢＣＥＶの取り込みのフローサイトメトリー分析の図である。 マウスT細胞は容易にヒトＲＢＣＥＶを取り込む。マウスＣＤ３＋ Ｔ細胞をＲＢＣＥＶと共にまたはＲＢＣＥＶなしでインキュベートした（ｎ＝３での繰り返し）場合の、活性化マーカーＣＤ４４及びＣＤ６９を有する該細胞の割合（％）を示す図である。 マウスT細胞は容易にヒトＲＢＣＥＶを取り込む。ＲＢＣＥＶを介したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のマウスＣＤ３＋ Ｔ細胞への送達の概略図である。２４時間及び７２時間後にそれぞれ細胞を採取し、ｑＰＣＲ及びフローサイトメトリーに供した。 マウスT細胞は容易にヒトＲＢＣＥＶを取り込む。図１Ｄで処理したＣＤ３＋ Ｔ細胞（ｎ＝３での繰り返し）における内部対照（ｓｎｏＲＮＡ２３４）を基準として正規化したｍｉＲ－１２５ｂのレベルを示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定によって判定して、^＊＊＊はｐ＜０．００１であることを示す。 ヒトＰＢＭＣはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を搭載したＲＢＣＥＶを取り込む。ヒトＰＢＭＣの、ＣＦＳＥで標識されたＲＢＣＥＶとのインキュベーションを含む取り込みアッセイの概略図である。 ヒトＰＢＭＣはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を搭載したＲＢＣＥＶを取り込む。全ＰＢＭＣ及び各亜集団によるＣＦＳＥ標識ＲＢＣＥＶの取り込みのフローサイトメトリーによる分析を示す図である。 ヒトＰＢＭＣはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を搭載したＲＢＣＥＶを取り込む。ヒトＰＢＭＣの、Ｃｙ５標識対照ＡＳＯ（Ｃｙ５－ＮＣ－ＡＳＯ）を搭載したＲＢＣＥＶとのインキュベーションを含む取り込みアッセイの概略図である。 ヒトＰＢＭＣはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を搭載したＲＢＣＥＶを取り込む。Ｃｙ５－ＮＣ－ＡＳＯを搭載したＲＢＣＥＶと共にインキュベートしたＰＢＭＣにおける、Ｃｙ５蛍光シグナルのフローサイトメトリーによる分析を、未処理及び非搭載ＡＳＯによる処理と比較した図である。 ＲＢＣＥＶによるＡＳＯの送達とヒトリンパ球における他のトランスフェクション方法との比較。ヒトＣＤ８ Ｔ細胞中にＦＡＭ－ＮＣ－ＡＳＯを送達するために使用したトランスフェクションプロトコルの概略図である。 ＲＢＣＥＶによるＡＳＯの送達とヒトリンパ球における他のトランスフェクション方法との比較。２４時間及び１２０時間の時点における、種々の方法によってＦＡＭ－ＮＣ－ＡＳＯでトランスフェクトされたヒトＣＤ８ Ｔ細胞における、ＦＡＭシグナルのフローサイトメトリーによる分析を示す図である。 ＲＢＣＥＶによるＡＳＯの送達とヒトリンパ球における他のトランスフェクション方法との比較。１２０時間の時点における、種々の方法によってＦＡＭ－ＮＣ－ＡＳＯでトランスフェクトされたＣＤ８ Ｔ細胞（ｎ＝３での繰り返し）の生存率を示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定によって判定して、^＊＊はｐ＜０．０１、^＊＊＊はｐ＜０．００１であることを示す。 ヒトＣＤ８ Ｔ細胞中へのＡＳＯ及びｍｉＲＮＡ模倣体のトランスフェクションによって、マイクロＲＮＡの発現を抑制または上方制御することができる。ＲＢＣＥＶをＡＳＯまたは模倣体のいずれかでエレクトロポレーションし、次いでヒトＣＤ８ Ｔ細胞と共にインキュベートすることによるトランスフェクションアッセイの概略図である。７２時間後に細胞を採取し、ｑＲＴ－ＰＣＲに供した。 ヒトＣＤ８ Ｔ細胞中へのＡＳＯ及びｍｉＲＮＡ模倣体のトランスフェクションによって、マイクロＲＮＡの発現を抑制または上方制御することができる。ｍｉＲ－２９ａ ＡＳＯ（２９－ＡＳＯ）または陰性対照ＡＳＯ（ＮＣ－ＡＳＯ）でトランスフェクトされた成人ＣＤ８ Ｔ細胞（ｎ＝３での繰り返し）におけるｍｉＲ－２９ａ及びその標的のレベルを示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定によって判定して、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊＊はｐ＜０．００１であることを示す。 ヒトＣＤ８ Ｔ細胞中へのＡＳＯ及びｍｉＲＮＡ模倣体のトランスフェクションによって、マイクロＲＮＡの発現を抑制または上方制御することができる。ｍｉＲ－２９ａ ＡＳＯ（２９－ＡＳＯ）または陰性対照ＡＳＯ（ＮＣ－ＡＳＯ）でトランスフェクトされた成人ＣＤ８ Ｔ細胞（ｎ＝３での繰り返し）におけるｍｉＲ－２９ａ及びその標的のレベルを示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定によって判定して、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊＊はｐ＜０．００１であることを示す。 ヒトＣＤ８ Ｔ細胞中へのＡＳＯ及びｍｉＲＮＡ模倣体のトランスフェクションによって、マイクロＲＮＡの発現を抑制または上方制御することができる。ｍｉＲ－２９ａ模倣体（２９模倣体）またはＮＣ模倣体（ＮＣ模倣体）でトランスフェクトされた臍帯血ＣＤ８ Ｔ細胞（ｎ＝３での繰り返し）におけるｍｉＲ－２９ａ及びその標的のレベルを示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定によって判定して、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊＊はｐ＜０．００１であることを示す。 ヒトＣＤ８ Ｔ細胞中へのＡＳＯ及びｍｉＲＮＡ模倣体のトランスフェクションによって、マイクロＲＮＡの発現を抑制または上方制御することができる。ｍｉＲ－２９ａ模倣体（２９模倣体）またはＮＣ模倣体（ＮＣ模倣体）でトランスフェクトされた臍帯血ＣＤ８ Ｔ細胞（ｎ＝３での繰り返し）におけるｍｉＲ－２９ａ及びその標的のレベルを示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定によって判定して、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊＊はｐ＜０．００１であることを示す。 トランスフェクトされたＣＤ８ Ｔ細胞は有意な活性化及び分化を伴うことなくｍｉＲＮＡ標的の変化を示す。ＲＢＣＥＶをＡＳＯまたは模倣体のいずれかでエレクトロポレートし、次いでヒトＣＤ８ Ｔ細胞と共にインキュベートすることによるトランスフェクションアッセイの概略図である。１２０時間後に細胞を採取し、フローサイトメトリーに供した。 トランスフェクトされたＣＤ８ Ｔ細胞は有意な活性化及び分化を伴うことなくｍｉＲＮＡ標的の変化を示す。２９－ＡＳＯまたはＮＣ－ＡＳＯでトランスフェクトされたナイーブ成人ＣＤ８ Ｔ細胞におけるｍｉＲ－２９ａ標的（ＥＯＭＥＳ及びＴＢＥＴ）の相対幾何学平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定によって判定して、^＊＊＊はｐ＜０．００１であることを示す。 トランスフェクトされたＣＤ８ Ｔ細胞は有意な活性化及び分化を伴うことなくｍｉＲＮＡ標的の変化を示す。図５Ｂで処理したナイーブ成人ＣＤ８ Ｔ細胞（ｎ＝４での繰り返し）の活性化（ＣＤ４４ＮＥＧ）及び分化（ＣＤ６２ＬＰＯＳ）の相対的割合を示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。 トランスフェクトされたＣＤ８ Ｔ細胞は有意な活性化及び分化を伴うことなくｍｉＲＮＡ標的の変化を示す。２９模倣体またはＮＣ模倣体でトランスフェクトされたナイーブ臍帯血ＣＤ８ Ｔ細胞（ｎ＝４での繰り返し）におけるｍｉＲ－２９ａ標的の相対ｇＭＦＩを示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定によって判定して、^＊＊＊はｐ＜０．００１であることを示す。 トランスフェクトされたＣＤ８ Ｔ細胞は有意な活性化及び分化を伴うことなくｍｉＲＮＡ標的の変化を示す。図５Ｄで処理したナイーブ臍帯血ＣＤ８ Ｔ細胞（ｎ＝４での繰り返し）の相対的活性化及び分化を示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。 トランスフェクトされたＴリンパ球は生存率が変化することなくｍＣｈｅｒｒｙを発現する。ＲＢＣＥＶにトランスフェクション試薬（ＴＲ）及びｍＲＮＡを搭載することによるトランスフェクションアッセイの概略図である。２４時間後に細胞を採取し、フローサイトメトリーに供した。 トランスフェクトされたＴリンパ球は生存率が変化することなくｍＣｈｅｒｒｙを発現する。図６Ａで処理したヒトＴリンパ球、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルの代表的なヒストグラムである。 トランスフェクトされたＴリンパ球は生存率が変化することなくｍＣｈｅｒｒｙを発現する。図６Ａで処理したヒトリンパ球の種々の細胞集団（ｎ＝３での繰り返し）におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルの相対ｇＭＦＩを示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定によって判定して、^＊はｐ＜０．０５であることを示す。 トランスフェクトされたＴリンパ球は生存率が変化することなくｍＣｈｅｒｒｙを発現する。種々の処置群におけるトランスフェクション後の細胞の生存率を示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。 トランスフェクトされたＴリンパ球は生存率が変化することなくＧＦＰを発現する。ＲＢＣＥＶにトランスフェクション試薬（ＴＲ）及びプラスミド（ＭＣ－ＧＦＰ）を搭載することによるトランスフェクションアッセイの概略図である。７２時間後に細胞を採取し、フローサイトメトリーに供した。 トランスフェクトされたＴリンパ球は生存率が変化することなくＧＦＰを発現する。図７Ａで処理したヒトＣＤ３＋ Ｔリンパ球におけるＧＦＰシグナルの代表的なヒストグラムである。 トランスフェクトされたＴリンパ球は生存率が変化することなくＧＦＰを発現する。図７Ａで処理したヒトリンパ球の種々の処置（ｎ＝４での繰り返し）におけるＧＦＰシグナルの相対ｇＭＦＩを示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定によって判定して、^＊はｐ＜０．０５であることを示す。 トランスフェクトされたＴリンパ球は生存率が変化することなくＧＦＰを発現する。図７Ａで処理した種々の群におけるトランスフェクション後の細胞の生存率を示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。 トランスフェクトされたＴリンパ球はｃａｓ９タンパク質を発現する。ＲＢＣＥＶにトランスフェクション試薬（ＴＲ）及びＨＡタグ付きＣａｓ９ ｍＲＮＡを搭載することによるトランスフェクションアッセイの概略図である。２４時間後及び４８時間後に細胞を採集して免疫染色に供した。 トランスフェクトされたＴリンパ球はｃａｓ９タンパク質を発現する。図８Ａで処理したヒトＣＤ８＋ Ｔリンパ球におけるＣａｓ９タンパク質の代表的な免疫染色を示す図である。画像は２０倍の倍率で撮影した。 トランスフェクトされたＴリンパ球はｃａｓ９タンパク質を発現する。図８Ａで処理したＣＤ８ Ｔ細胞の、２４時間後及び４８時間後におけるＣａｓ９陽性率を示す図である。 トランスフェクトされたＴリンパ球はｃａｓ９タンパク質を発現する。図８Ａで処理したヒトＣＤ４＋ Ｔリンパ球における、代表的なＣａｓ９タンパク質の免疫染色画像である。画像は２０倍の倍率で撮影した。 トランスフェクトされたＴリンパ球はｃａｓ９タンパク質を発現する。図８Ａで処理したＣＤ４ Ｔ細胞の、２４時間後及び４８時間後におけるＣａｓ９陽性率を示す図である。 ＲＢＣＥＶはヒト樹状細胞によって取り込まれる。活性化マーカーＨＬＡ－ＤＲ及び共刺激マーカーＣＤ８０及びＣＤ８６の発現に基づく、単球からの樹状細胞の成熟のＦＡＣＳ分析を示す図である。 ＲＢＣＥＶはヒト樹状細胞によって取り込まれる。２４時間または４８時間のインキュベーション後の、単球由来樹状細胞による０．１ｍｇまたは０．２ｍｇのＣＦＳＥ標識ＲＢＣＥＶの取り込みを示す図である。 ＲＢＣＥＶを使用したマウス脾細胞へのｍＲＮＡの送達。マウス全脾細胞、従来の樹状細胞１型（ｃＤＣ１）及び２型（ｃＤＣ２）、ＮＫ細胞、ならびにＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを搭載したＲＢＣＥＶと共に４８時間インキュベートした後の、これらの細胞中のｍＣｈｅｒｒｙのＦＡＣＳ分析を示す図である。この実験では、ＲＢＣＥＶにｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを搭載し、免疫適格Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞と共にインキュベートした。細胞に、ＣＤ４５＋、次いで表示した細胞型特異的マーカーに基づいてゲーティングを行った。 ＲＢＣＥＶを使用したマウス脾細胞へのプラスミドＤＮＡの送達。マウス全脾細胞、従来の樹状細胞１型（ｃＤＣ１）及び２型（ｃＤＣ２）、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、及びＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＧＦＰ－ミニサークル（ＭＣ）を搭載したＲＢＣＥＶと共に４８時間インキュベートした後の、これらの細胞におけるＧＦＰの発現を示す図である。 ＲＮＡ搭載ＲＢＣＥＶを使用したゲノム編集。活性化ヒトＣＤ３ Ｔ細胞におけるｍｉＲ－１２５ｂノックアウトの概略図である。ｍｉＲ－１２５ｂまたはＲＡＢ１１ａ（対照）を標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ（１：１ ｗ／ｗ）を、ＴＲによって別個にＲＢＣＥＶに搭載した。最後の洗浄後に、これらのＥＶを一緒にプールし、異なる用量（ｓｇＲＮＡ量に基づいて１または２μｇ）で上記Ｔ細胞と共にインキュベートした。トランスフェクション後２４時間で細胞を採取し、ｑＲＴ－ＰＣＲに供した。 ＲＮＡ搭載ＲＢＣＥＶを使用したゲノム編集。図１２Ｃで処理したＴ細胞（ｎ＝３）中のｍｉＲ－１２５ｂレベルを示す図である。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定によって判定して、^＊はｐ＜０．０５であり、^＊＊はｐ＜０．０１であり、ｎ．ｓ．は有意ではないことを示す。 ＲＢＣＥＶを介したマウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）中へのｍＲＮＡの送達。ＲＢＣＥＶにｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを搭載し、ＢＭＤＣをＲＮＡ搭載ＲＢＣＥＶと共にインキュベートすることによるＢＭＤＣへのＲＮＡの送達の概略図である。２４時間後に細胞を採取し、フローサイトメトリーに供した。 ＲＢＣＥＶを介したマウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）中へのｍＲＮＡの送達。１５日間のＢＭ細胞の分化後の従来の樹状細胞１型（ｃＤＣ１ｓ）及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の成熟マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＲＢＣＥＶを介したマウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）中へのｍＲＮＡの送達。ｍＣｈｅｒｒｙ－ｍＲＮＡ搭載ＲＢＣＥＶで処理したマウスＢＭＤＣ及びそのサブタイプにおけるｍＣｈｅｒｒｙのフローサイトメトリー分析を示す図である。 肺中の免疫細胞へのＲＮＡ搭載ＲＢＣＥＶの送達。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける肺送達の概略図である。ＡＦ６４７標識非標的化ｓｉＲＮＡ（ＡＦ６４７－ＲＮＡ）を、トランスフェクション試薬（ＴＲ）を使用してＲＢＣＥＶに搭載した。搭載されたＥＶをエアゾール化装置を使用して肺に送達した。２４時間後にマウスを屠殺し、肺細胞を分離し、肺内の種々の免疫細胞のフローサイトメトリー分析に供した。 肺中の免疫細胞へのＲＮＡ搭載ＲＢＣＥＶの送達。未処理、貫流、及びＲＮＡ搭載ＲＢＣＥＶ（ＲＮＡ＋ＴＲ＋ＥＶ）を含む、図１４Ａで処理したマウスの全肺細胞におけるＡＦ６４７－ＲＮＡシグナルの代表的な点プロットを示す図である。 肺中の免疫細胞へのＲＮＡ搭載ＲＢＣＥＶの送達。図１４Ａで処理したマウスの肺中の種々の免疫細胞型（マクロファージ、樹状細胞、好中球、及び肺胞マクロファージ）におけるＡＦ６４７－ＲＮＡシグナルの代表的なヒストグラムを示す図である。

本発明は、ＲＢＣＥＶ及び、エキソビボもしくはインビボ免疫療法のための免疫細胞の遺伝子改変のために、または例えば遺伝子発現の研究のためのインビトロトランスフェクションのために、治療用核酸を送達するための上記ＲＢＣＥＶの使用に関する。ＲＢＣＥＶを使用した免疫細胞への治療用分子の送達は、効率的であり、簡易であり、且つ費用対効果が高い。

本発明者らは、ＲＢＣＥＶがＴ細胞によって安定的に取り込まれ、トランスフェクトされた細胞中で良好に機能する安定な核酸を送達することができることを見出した。ＲＢＣＥＶは、がん細胞もしくは幹細胞由来のＥＶ中に通常多数存在する発がん性核酸または増殖因子を含まず、このことは、ＲＢＣＥＶが、レシピエントの細胞に形質転換の危険性を生じさせないことを意味する。さらに、ＲＢＣＥＶによって送達されたＤＮＡは当該細胞のゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異誘発の危険性は無視してよい。

ＲＢＣＥＶによって、核酸をナイーブＴ細胞に、該ナイーブ細胞の細胞死、活性化、または分化を生じさせることなく送達することができ、有利である。

ＲＢＣはヒトの血液中に豊富に存在し、容易に入手することができ、且つ細胞を培養することなく多数のＥＶをＲＢＣから精製することができることから、ＲＢＣＥＶの生産コストは低い。ＲＢＣＥＶはまた、ウイルスやほとんどの合成トランスフェクション試薬とは異なり、血液型が一致していれば、非免疫原性である可能性も高い。

したがって、免疫細胞を形質導入するためのＲＢＣＥＶの使用は、ウイルスに基くまたは他の非ウイルスに基く方法よりも安全且つ効率的である。本発明は、ＲＢＣＥＶを使用した、免疫細胞への核酸の送達方法を提供する。

細胞外小胞
本明細書では、用語「細胞外小胞」（ＥＶ）とは、細胞から細胞外環境中に放出される小さな小胞様構造を指す。本明細書に開示される特に好ましい態様において、上記細胞外小胞は赤血球に由来する（ＲＢＣＥＶ）。

細胞外小胞（ＥＶ）は、径が５０～１０００ｎｍの細胞膜またはエンドソーム膜の実質的に球状のフラグメントである。細胞外小胞は、病理学的条件及び生理的条件の両方の下でさまざまな細胞型から放出される。細胞外小胞は膜を有する。この膜は、二重層膜（すなわち、脂質二重層）であってよい。上記膜は細胞膜を起源としていてもよい。したがって、上記細胞外小胞の膜は、該膜が由来する細胞と類似する組成を有していてもよい。本明細書に開示されるいくつかの態様において、上記細胞外小胞は、実質的に透明である。

用語細胞外小胞は、エキソソーム、微小胞、膜微粒子（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、エクトソーム、ブレブ、及びアポトーシス小体を包含する。細胞外小胞は、細胞膜の外方への出芽及び分裂を介して産生されたものであってよい。この産生は、天然プロセス、または化学的に誘導もしくは亢進されたプロセスであってよい。本明細書に開示されるいくつかの態様において、上記細胞外小胞は、化学的誘導を介して産生された微小胞である。

細胞外小胞は、それらの形成の起源に基づいて、エキソソーム、微小胞、またはアポトーシス小体として分類される場合がある。微小胞は、本明細書に開示される、本発明に係る細胞外小胞の特に好ましい群である。本発明の細胞外小胞は、細胞膜からシェディングされたものであり、エンドソームシステムを起源としないことが好ましい。本明細書に記載の特定の態様において、上記細胞外小胞はエキソソームではない。場合により、上記細胞外小胞は非エキソソームＥＶである。

本開示のいくつかの態様及び実施形態において、上記細胞外小胞はエキソソームではない。本開示のいくつかの態様及び実施形態において、上記細胞外小胞はエクトソームではない。本開示のいくつかの態様及び実施形態において、上記細胞外小胞はブレブではない。本開示のいくつかの態様及び実施形態において、上記細胞外小胞はアポトーシス小体ではない。

本開示のいくつかの態様及び実施形態において、上記細胞外小胞は微小胞または膜微粒子である。

本明細書に開示の細胞外小胞は、さまざまな細胞、例えば、赤血球、白血球、がん細胞、幹細胞、樹状細胞、マクロファージなどに由来していてもよい。好ましい実施形態において、上記細胞外小胞は赤血球に由来する、但し、細胞株由来などの任意の供給源由来の細胞外小胞を使用することができる。本明細書に記載の好ましい態様において、上記細胞外小胞は赤血球に由来する。

微小胞または微粒子は、細胞膜の直接的な外方への出芽及び分裂を介して生じる。微小胞は、通常はエキソソームよりも大きく、１００～５００ｎｍの範囲の径を有する。場合により、微小胞の組成物は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、１０１～３００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、または１００～２００ｎｍの範囲の径を有する微小胞を含む。径は１００～３００ｎｍであることが好ましい。

微小胞の集団、例えば、組成物、医薬組成物、医薬、または調剤中に存在するものとしての上記集団は、種々の広範な径を有する微小胞を含むこととなり、微小胞試料内の微小胞のメジアン径は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、１０１～３００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍの範囲であってよい。上記メジアン径は、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍの範囲のうちの１つにはいっていることが好ましい。平均径は、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ（任意選択で±１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｍ）のうちの１つであってよい。

エキソソームの径は、約３０～約１００ｎｍの範囲である。場合により、エキソソームの集団は、組成物中に存在する場合として、１０～２００ｎｍ、１０～１５０ｎｍ、１０～１２０ｎｍ、１０～１００ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２５～１１０ｎｍ、２５～１００ｎｍ、または３０～１００ｎｍの範囲の径を有するエキソソームを含む。上記径は３０～１００ｎｍであることが好ましい。エキソソームの集団、例えば、組成物、医薬組成物、医薬、または調剤中に存在するものとしての上記集団は、種々の広範な径を有するエキソソームを含むこととなり、試料内のエキソソームのメジアン径は、１０～２００ｎｍ、１０～１５０ｎｍ、１０～１２０ｎｍ、１０～１００ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２５～１１０ｎｍ、２５～１００ｎｍ、または３０～１００ｎｍの範囲であってよい。上記メジアン径、３０～１００ｎｍであることが好ましい。平均径は、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、または１２０ｎｍ（任意選択で±１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｎｍ）のうちの１つであってよい。

細胞外小胞の集団は、（任意選択で担体１ｍｌ当たり）少なくとも１０、１００、１０００、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、または１０^１４個の細胞外小胞のうちの１つを含んでいてもよい。

エキソソームは、リンパ球、樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、肥満細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、及び腸上皮細胞を含む多様な培養細胞において観測される。エキソソームは、細胞質における大きな嚢である多胞体内に位置するエンドソームネットワークを起源とする。これらの嚢は、細胞膜と融合した後に細胞外環境中に放出される。

アポトーシス小体またはブレブは、最大の細胞外小胞であり、１～５μｍの範囲である。アポトーシスを受ける有核細胞は、核クロマチンの凝縮から始まり、膜ブレブ形成、及び最終的なアポトーシス小体を含むＥＶの放出のいくつかの段階を経る。

上記細胞外小胞は、ヒト細胞、またはヒト起源の細胞に由来することが好ましい。本発明の細胞外小胞は、小胞誘導剤と接触した細胞から誘導されたものであってもよい。上記小胞誘導剤は、カルシウムイオノフォア、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、またはホルボール－１２－ミリスタート－１３－アセタート（ＰＭＡ）であってよい。

本明細書に記載の多くの態様において、細胞は改変されない。特に、細胞外小胞の由来となる細胞は、外因性核酸またはタンパク質を含まない。場合により、上記細胞は採血に由来するようなエクスビボである。場合により、上記細胞は、形質導入され、トランスフェクトされ、感染し、または他の形態で改変されてはいるが、インビボの当該細胞と比較して実質的に変化していないように、改変されていない。上記細胞が赤血球である場合、該細胞は、ＤＮＡを含まないか、またはＤＮＡを実質的に含んでいなくてもよい。上記赤血球はＤＮＡを含んでいなくてもよい。したがって、好ましい実施形態において、上記細胞外小胞は、該細胞外小胞が形成され単離された後に、それらの核酸カーゴが搭載される。好ましくは、上記細胞外小胞は、それらが由来する細胞中に存在した核酸、特にＤＮＡを含まないことが好ましい。

赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）
本明細書に開示される特定の態様において、上記細胞外小胞は赤血球に由来する。赤血球は、多くの理由からＥＶの良好な供給源である。赤血球は脱核されているので、ＲＢＣＥＶは、他の供給源由来のＥＶよりも含む核酸が少ない。ＲＢＣＥＶは内因性ＤＮＡを含まない。ＲＢＣＥＶはｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡを含んでいてもよい。ＲＢＣＥＶは発がん性ＤＮＡまたはＤＮＡ変異体などの発がん性物質を含まない。

場合により、上記ＥＶは、赤血球、例えばヒト赤血球に由来する非エキソソームＥＶである。

場合により、上記ＲＢＣＥＶはＲＢＣから単離される。ＲＢＣＥＶの単離方法及びキャラクタリゼーション方法は、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９， ２３５９ （２０１８） ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０４７９１－８）（その全体が本明細書に援用される）に記載される。

ＲＢＣＥＶは、ヘモグロビン及び／またはストマチン及び／またはフロチリン－２を含んでいてもよい。それらは赤色であってよい。一般的には、ＲＢＣＥＶは、透過型電子顕微鏡下でドーム状（凹形）表面、または「カップ形状」を示す。上記ＲＢＣＥＶは、細胞表面ＣＤ２３５ａを有することを特徴とする場合がある。

本発明にかかるＲＢＣＥＶの径は約１００ｎｍ～約３００ｎｍであってよい。場合により、ＲＢＣＥＶの組成物は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、１０１～３００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍまたは１００～１５０ｎｍの範囲の径を有するＲＢＣＥＶを含む。上記径は、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍであることが好ましい。

ＲＢＣＥＶの集団、例えば、組成物中に存在していてもよいものとしての上記集団は、種々の広範な径を有するＲＢＣＥＶを含むこととなり、ＲＢＣＥＶ試料内のＲＢＣＥＶのメジアン径は、５０～１０００ｎｍ、５０～７５０ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１０１～１０００ｎｍ、１０１～７５０ｎｍ、１０１～５００ｎｍ、１０１～３００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍまたは１００～１５０ｎｍの範囲であってよい。上記メジアン径は、５０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍであることが好ましい。平均径は、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ（任意選択で±１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｍ）のうちの１つであってよい。

上記ＲＢＣＥＶは、ヒトもしくは動物の血液試料または初代細胞もしくは固定化赤血球株に由来する赤血球に由来することが好ましい。上記血液細胞は、治療を受け得る患者に適合する型であってよく、したがって、上記血液細胞は、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型、またはＯ型であってよい。上記血液はＯ型であることが好ましい。上記血液はアカゲザル陽性またはアカゲザル陰性であってよい。場合により、上記血液は、Ｏ型及び／またはアカゲザル陰性、例えば、Ｏ－型である。上記血液は、疾患または障害がないこと、例えば、ＨＩＶ、鎌状赤血球貧血、マラリアがないことが判定されていてもよい。但し、任意の血液型を使用することができる。場合により、上記ＲＢＣＥＶは自家性であり、治療を受ける患者から得た血液試料に由来する。場合により、上記ＲＢＣＥＶは同種異系であり、治療を受ける患者から得た血液試料に由来しない。

ＲＢＣＥＶは赤血球の試料から単離されてもよい。赤血球からＥＶを得るためのプロトコルは当該技術分野で公知である（例えば、Ｄａｎｅｓｈ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｂｌｏｏｄ． ２０１４ Ｊａｎ ３０；１２３（５）： ６８７－６９６）。ＥＶを得るために有用な方法は、赤血球を含む試料を提供するまたは得るステップ、赤血球を、細胞外小胞を産生するように誘導するステップ、及び細胞外小胞を単離するステップを含んでいてもよい。上記試料は全血試料であってよい。赤血球以外の細胞は、当該試料の細胞成分が赤血球となるように、該試料から除去されていることが好ましい。

上記試料中の赤血球を、濃縮し、または白血球及び血漿などの全血試料の他の成分から分画してもよい。赤血球を遠心分離によって濃縮してもよい。試料は、白血球低減に供してもよい。

上記赤血球を含む試料は実質的に赤血球のみを含んでいてもよい。細胞外小胞は、赤血球を小胞誘導剤と接触させることによって赤血球から誘導してもよい。上記小胞誘導剤は、カルシウムイオノフォア、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、またはホルボール－１２－ミリスタート－１３－アセタート（ＰＭＡ）であってよい。

ＲＢＣＥＶは、遠心分離（超遠心分離または非超遠心分離）プロセス、沈殿プロセス、ろ過プロセス、例えば、タンジェンシャルフローろ過、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって単離することができる（例えば、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａを参照のこと）。このようにして、ＲＢＣＥＶは、上記混合物のＲＢＣ及び他の成分から分離することができる。

細胞外小胞は、赤血球の試料を得ることと；赤血球を小胞誘導剤と接触させることと；誘導された細胞外小胞を単離することとを含む方法によって、上記赤血球から得ることができる。

上記赤血球は、低速度遠心分離及び白血球枯渇フィルターの使用によって、白血球及び血漿を含む全血試料から分離することができる。場合により、上記赤血球試料は、白血球などの他の細胞型を含まない。すなわち、上記赤血球試料は実質的に赤血球からなる。上記赤血球試料は、上記小胞誘導剤と接触させる前に、ＰＢＳなどの緩衝液で希釈してもよい。上記小胞誘導剤は、カルシウムイオノフォア、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、またはホルボール－１２－ミリスタート－１３－アセタート（ＰＭＡ）であってよい。上記小胞誘導剤は約１０ｎＭのカルシウムイオノフォアであってもよい。上記赤血球は、終夜、または少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、もしくは１２時間を超えて、上記小胞誘導剤と接触させてもよい。この混合物を低速度遠心分離に供して、ＲＢＣ、細胞デブリ、または他の非ＲＢＣＥＶ物質を除去してもよく、且つ／または上清を約０．４５μｍのシリンジフィルターに通してもよい。ＲＢＣＥＶを、約１００，０００×ｇでの遠心分離などの超遠心分離によって濃縮してもよい。ＲＢＣＥＶを、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、または少なくとも１時間の超遠心分離によって濃縮してもよい。濃縮したＲＢＣＥＶを冷ＰＢＳ中に懸濁させてもよい。これらを６０％スクロースクッション上に層化させてもよい。上記スクロースクッションは、凍結した６０％スクロースを含んでいてもよい。上記スクロースクッション上に層化させたＲＢＣＥＶを、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、またはそれを超える時間、１００，０００ｇでの超遠心分離に供してもよい。好ましくは、上記スクロースクッション上に層化させたＲＢＣＥＶを、約１６時間、１００，０００xｇでの超遠心分離に供してもよい。次いで、上記スクロースクッション上の赤色層を回収し、それによりＲＢＣＥＶを得る。得られたＲＢＣＥＶを、さらなる処理、例えば、洗浄、タグ付け、及び任意選択で搭載に供してもよい。

表面タグ付け
細胞外小胞は、好ましくは小胞膜に結合した、または小胞膜を通して挿入されたタグを含んでいてもよい。

上記細胞外小胞は、それらの表面にタグを有していてもよい。上記タグは、好ましくはタンパク質またはペプチド配列である。上記タグはペプチドまたはタンパク質であってよい。上記タグは改変されたペプチドまたはタンパク質、例えば、グリコシル化またはビオチン化タンパク質またはペプチドであってよい。上記タグは、上記細胞外小胞に共有結合している、例えば、上記細胞外小胞中の膜タンパク質に共有結合していてもよい。上記タグは、上記細胞外小胞が形成された後に、その細胞外小胞に結合させてもよい。上記タグは、タンパク質リガーゼ認識配列である、もしくは該配列に由来する配列を含む、またはその配列からなる配列によって上記細胞外小胞に結合していてもよい。例えば、上記タグは、タンパク質リガーゼ認識配列に対する１００％の配列同一性、またはタンパク質リガーゼ認識配列に対する約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、もしくは約４０％の配列同一性を含む配列によって上記細胞外小胞に結合していてもよい。上記アミノ酸配列はＬＰＸＴを含んでいてもよい。

上記タグは上記小胞の外表面上に提示されてもよく、したがって、小胞外環境に曝露される。

上記タグは外因性分子であってもよい。すなわち、上記タグは、天然では上記小胞の外表面上に存在しない分子である。場合により、上記タグは、上記細胞外小胞が由来する細胞または赤血球中はに存在しない外因性分子である。

上記タグは、上記細胞外小胞の循環における安定性、取り込み効率、及び利用可能性を向上させる場合がある。

場合により、上記タグは、身体における循環及び器官において、上記細胞外小胞及びカーゴを含む細胞外小胞を表示するように作用する。上記ペプチド及びタンパク質は、標的細胞の機能の遮断／活性化またはワクチン接種のための抗原の提示などの、治療用分子として作用することができる。上記ペプチド及びタンパク質はまた、毒素の診断などのバイオマーカー検出のためのプローブとして作用することもできる。

上記タグは機能性ドメイン及びタンパク質リガーゼ認識配列を含んでいてもよい。上記機能性ドメインは、標的部分に結合することが可能であり、検出が可能であり、または治療効果を誘導することが可能であってもよい。上記機能性ドメインは標的分子に結合することが可能であってもよい。かかる機能性ドメインを含むタグは、本明細書で結合分子と呼ぶ場合がある。結合分子は標的分子と特異的に相互作用することが可能な分子である。結合部分を含む細胞外小胞は、標的分子を有する細胞にカーゴまたは治療薬を送達するのに特に有用である場合がある。好適な結合分子としては、抗体及び抗原結合性フラグメント（抗体フラグメントとして知られる場合もある）、リガンド分子、ならびに受容体分子が挙げられる。上記結合分子は対象とする標的に結合することとなる。上記標的は、対象とする細胞に関連する、例えば、該細胞の表面上で発現する分子であってよい。上記リガンドは、受容体分子などの、標的細胞上の生体分子と複合体を形成してもよい。上記標的は、細胞表面マーカーなどの、免疫細胞に関連する分子であってもよい。

好適な結合分子としては、抗体及び抗原結合性フラグメントが挙げられる。Ｆａｂ及びＦａｂ２フラグメントなどのフラグメントは、遺伝子操作された抗体及び抗体フラグメントとして使用することができる。抗体の可変重（ＶＨ）ドメイン及び可変軽（ＶＬ）ドメインは抗原認識に関与し、初期のプロテアーゼ消化実験によって初めて認識された事実である。げっ歯動物抗体の「ヒト化」によってさらに確認がなされた。げっ歯動物起源の可変ドメインを、得られる抗体がげっ歯動物親抗体の抗原特異性を保持するように、ヒト起源の定常ドメインに融合することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｄ． ＵＳＡ ８１， ６８５１－６８５５）。本明細書に開示の細胞外小胞において有用な抗体または抗原結合性フラグメントは、標的分子を認識し、且つ／またはそれに結合する。

抗原特異性が可変ドメインによって付与され、定常ドメインとは無関係であることは、抗体フラグメント（すべてが１つ以上の可変ドメインを含む）の細菌の抗体フラグメントの発現を含む実験から公知である。これらの分子としては、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０， １０４１）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０， １０３８）；ＶＨ及びＶＬパートナードメインがフレキシブルオリゴペプチドを介して連結されている一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２， ４２３；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｄ． ＵＳＡ ８５， ５８７９）；及び単離されたＶドメインを含むシングルドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１， ５４４）が挙げられる。それらの特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技法の全般的な総説は、Ｗｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９， ２９３－２９９に記載されている。本明細書において有用な抗体及びフラグメントは、ヒトもしくはヒト化、マウス、ラクダ、キメラであり、または任意の他の好適な供給源由来のものであってよい。

「ＳｃＦｖ分子」は、ＶＨ及びＶＬパートナードメインが、例えば、直接的に、ペプチドによってまたは柔軟なオリゴペプチドによって共有結合した分子を意味する。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、及びｓｄＡｂ抗体フラグメントはすべて、Ｅ． ｃｏｌｉ中で発現される及びＥ． ｃｏｌｉから分泌されることが可能であることから、容易な大量の上記フラグメントの産生が可能になる。

完全抗体、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは「二価」である。「二価」とは、上記抗体及びＦ（ａｂ’）２フラグメントが２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、及びｓｄＡｂフラグメントは一価であり、１つのみの抗原結合部位を有する。一価抗体フラグメントは、それらのサイズが小さいことから、タグとして特に有用である。

好ましい結合分子はｓｄＡｂであってよい。「ｓｄＡｂ」とは、１つ、２つ、またはそれを超える単一の単量体可変抗体ドメインからなる単一ドメイン抗体を意味する。ｓｄＡｂ分子はｄＡｂと呼ばれる場合もある。

場合により、上記結合分子は、一本鎖抗体、またはｓｃＡｂである。ｓｃＡｂは、共有結合したＶＨ及びＶＬパートナードメイン（例えば、直接ペプチドによって、または柔軟なオリゴペプチドによって）及び任意選択で軽鎖定常ドメインからなる。

他の好適な結合分子としては、標的分子に対する親和性を有するリガンド及び受容体が挙げられる。上記タグは細胞表面受容体のリガンドであってもよい。例としては、ストレプトアビジン及びビオチン、アビジン及びビオチン、または他の受容体のリガンド、例えば、フィブロネクチン及びインテグリンが挙げられる。ビオチンの小さなサイズは、結合した分子の生物学的活性に対してほとんどまたは全く影響を及ぼさない。ビオチン及びストレプトアビジン、ビオチン及びアビジン、ならびにフィブロネクチン及びインテグリンは、高い親和性及び特異性でそれらの対と結合することから、それらは結合分子として非常に有用である。上記アビジン－ビオチン複合体は、タンパク質とリガンドとの間の最も強い既知の非共有結合性相互作用（Ｋｄ＝１０～１５Ｍ）である。結合形成は迅速であり、一度形成されると、極端なｐＨ、温度、有機溶媒、及び他の変性剤によっても影響を受けない。ストレプトアビジンに対するビオチンの結合も強く、形成が迅速であり、バイオテクノロジー用途において有用である。

上記機能性ドメインは治療剤を含んでいてもよく、または治療薬からなっていてもよい。上記治療薬は酵素であってよい。上記治療薬はアポトーシス誘導剤または阻害剤であってもよい。

上記機能性ドメインは抗原または抗体認識配列を含んでいてもよい。上記タグは１種以上の抗原性ペプチドに由来する１種以上の短いペプチドを含んでいてもよい。上記ペプチドは抗原性ペプチドのフラグメントであってもよい。好適な抗原性ペプチドは当業者に公知である。

上記機能性ドメインは検出可能部分を含んでいてもよく、または該部分からなっていてもよい。検出可能な部位としては、蛍光標識、比色分析標識、フォトクロミック化合物、磁性粒子、または他の化学的標識が挙げられる。上記検出可能部分はビオチンまたはＨｉｓタグであってもよい。

上記タグはスペーサーまたはリンカー部分を含んでいてもよい。上記スペーサーまたはリンカーは、上記タグとタンパク質リガーゼ認識配列との間に配置されていてもよい。上記スペーサーまたはリンカーは、上記タグのＮまたはＣ末端に連結していてもよい。上記スペーサーまたはリンカーは、上記タグによる標的結合活性などの該タグの機能と干渉するまたはこれを阻害しないように配置されていてもよい。上記スペーサーまたはリンカーはペプチド配列であってもよい。場合により、上記スペーサーまたはリンカーは、一連の少なくとも１個のアミノ酸、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１１個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１３個のアミノ酸、少なくとも１４個のアミノ酸、または少なくとも１５アミノ酸である。上記スペーサーまたはリンカーは柔軟であってもよい。上記スペーサーは複数のグリシン及び／またはセリンアミノ酸を含んでいてもよい。

スペーサー及びリンカー配列は当業者に公知であり、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ （２０１３） ６５（１０）： １３５７－１３６９（本記述をもってその全体が援用される）に記載される。いくつかの実施形態において、リンカー配列は柔軟なリンカー配列であってよい。柔軟なリンカー配列により、該リンカー配列によって結合したアミノ酸配列の相対的な移動が可能になる。柔軟なリンカーは当業者に公知であり、いくつかがＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ （２０１３） ６５（１０）： １３５７－１３６９において特定されている。柔軟なリンカー配列は、多くの場合、高い割合のグリシン及び／またはセリン残基を含む。

場合により、上記スペーサーまたはリンカー配列は、少なくとも１つのグリシン残基及び／または少なくとも１つのセリン残基を含む。いくつかの実施形態において、上記リンカー配列はグリシン及びセリン残基からなる。場合により、上記スペーサーまたはリンカー配列の長さは、１～２、１～３、１～４、１～５、または１～１０アミノ酸長である。

上記スペーサーまたはリンカー配列を含むことにより、上記細胞外小胞と上記タグ部分との間のタンパク質リガーゼ反応の効率が向上する場合がある。本明細書で使用される用語「タグ」は、タグ、スペーサー、及びタンパク質リガーゼ認識配列を含むペプチドを包含する場合がある。

好適なタンパク質リガーゼ認識配列は当該技術分野で公知である。上記タンパク質リガーゼ認識配列は、上記細胞外小胞のタグ付け方法において使用されるタンパク質リガーゼによって認識される。例えば、上記方法において使用されるタンパク質リガーゼがソルターゼである場合、上記タンパク質リガーゼ認識配列はソルターゼ結合部位である。これらの場合、上記配列は、ＬＰＸＴＧ（但し、Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸である）、好ましくはＬＰＥＴＧであってよい。あるいは、上記酵素がアスパラギニルエンドペプチダーゼ１（ＡＥＰ１）である場合、上記タンパク質リガーゼ認識配列はＮＧＬであってもよい。上記タンパク質リガーゼ結合部位は上記ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に配置されていてもよい。

上記タグは、該タグ自体の産生中に、タグ付け法の間に、または後の精製のために、該タグの精製もしくは処理において助けとなる１つ以上のさらなる配列を追加的に含んでいてもよい。当該技術分野で公知の任意の好適な配列を使用することができる。例えば、上記配列は、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ（例えば、ポリＨｉｓタグ、または６ｘＨｉｓタグ）であってもよい。

上記タグは、集団または組成物中の上記細胞外小胞の実質的にすべてに結合していてもよい。本明細書に開示される組成物は、細胞外小胞であって、それらの少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、または少なくとも９７％が上記タグを含む上記細胞外小胞を含んでいてもよい。上記細胞外小胞の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、または少なくとも９７％がタグを含むことが好ましい。場合により、上記組成物内の異なる細胞外小胞が異なるタグを含む。場合により、上記細胞外小胞は、同一または実質的に同一のタグを含む。

タグの組み込み方法は、ＰＣＴ／ＳＧ２０１９／０５０４８１、ＷＯ２０１４／１８３０７１Ａ２、ＷＯ２０１４／１８３０６６Ａ２、及びＵＳ２０１４／００３０６９７Ａ１（それぞれ、その全体が本明細書に援用される）に記載されている。

カーゴ
本明細書に記載される細胞外小胞にはカーゴが搭載されていてもよい、すなわち、該細胞外小胞はカーゴを含んでいてもよい。本開示は特に核酸カーゴに関する。いくつかの好ましい実施形態において、上記カーゴは、ＲＮＡまたは化学的に改変されたＲＮＡを含むか、または上記ＲＮＡからなる。用語「カーゴ」は、本明細書において「積荷」（ｌｏａｄ）と同義で使用される。

核酸カーゴとは、細胞外小胞中もしくは細胞外小胞上に搭載された核酸（例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）を指す。核酸カーゴは通常、オリゴヌクレオチド鎖（任意の形態、例えば、一本鎖、二本鎖、スーパーコイル状または非スーパーコイル状、染色体状または非染色体状であってよい）を指す。上記核酸は、他の分子、例えば、担体、安定剤、ヒストン、親油性剤にコンジュゲートされるか、またはそれらと複合体化されていてもよい。

本明細書に開示される方法は、任意の核酸カーゴに対して使用することができる。核酸は二本鎖または一本鎖であってよい。上記核酸は一本鎖であることが好ましい。核酸は環状であってもよい。

上記カーゴは好ましくは外因性である。すなわち、上記核酸は、それらが新たに生成する際に、上記細胞外小胞中には存在しておらず、及び／または該細胞外小胞が由来する細胞中に存在していない。上記カーゴは、インビトロもしくはインシリコで設計及び／または構築される、合成品であってよい。

上記カーゴは治療用オリゴヌクレオチドまたは診断用オリゴヌクレオチドであってよい。上記カーゴは、標的細胞に送達された後に、該標的細胞中で治療効果を発揮してもよい。上記核酸は目的の遺伝子をコードしていてもよい。例えば、上記カーゴは、存在しない遺伝子を置き換えるための、欠陥遺伝子を修復するための、または標的組織において治療効果を誘導するための機能性遺伝子をコードしていてもよい。場合により、上記カーゴは、レポーター遺伝子であり、または容易に検出可能な分子をコードする。

場合により、上記カーゴは核酸であってよい。上記核酸は一本鎖または二本鎖であってよい。上記カーゴはＲＮＡであってもよい。上記ＲＮＡは治療用ＲＮＡであってもよい。上記ＲＮＡは、化学合成もしくはインビトロ転写によって産生された、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（tＲＮＡ）、または長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）であってもよい。場合により、上記カーゴは、例えば、転写因子、ｍｉＲＮＡ、または他の内因性ｍＲＮＡなどの内因性核酸に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

上記カーゴは対象とする分子であってもよく、または該分子をコードしていてもよい。例えば、上記カーゴはＣａｓ９または別のヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡであってもよい。上記カーゴは対象とする１種以上のペプチド／ポリペプチドをコードしていてもよい。

場合により、上記カーゴは、ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であるか、またはそれらをコードする核酸である。かかるカーゴは、遺伝子サイレンシング方法または遺伝子発現の下方制御方法において有用である場合がある。上記ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯは、標的細胞中で発現する配列、例えばｍＲＮＡ配列に対応していてもよい。上記配列は、対象とする特定の遺伝子もしくはタンパク質の発現を阻害または亢進するように作用してもよい。上記核酸は、標的細胞中で発現するｍｉＲＮＡに対応するｓｉＲＮＡまたはＡＳＯをコードしていてもよい。

上記カーゴはｍＲＮＡを含むか、またはｍＲＮＡをコードしていてもよい。上記ｍＲＮＡは導入遺伝子をコードしていてもよい。

上記細胞において、アンチセンス核酸を対応するｍＲＮＡにハイブリダイズし、二本鎖分子を形成してもよい。上記細胞は二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないことから、上記アンチセンス核酸は上記ｍＲＮＡの翻訳を妨害する可能性がある。遺伝子のインビトロ翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は、当技術分野で周知である（例えば、Ｍａｒｃｕｓ－Ｓａｋｕｒａ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８８， １７２：２８９を参照のこと）。さらに、上記ＤＮＡに直接結合するアンチセンス分子を使用してもよい。アンチセンス核酸は、一本鎖または二本鎖の核酸であってよい。アンチセンス核酸の非限定的な例としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；それらの誘導体または前駆体、例えばヌクレオチド類似体などを含む）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓａＲＮＡ（低分子活性化ＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）もしくはそれらの特定の誘導体もしくは前駆体、長鎖非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）、またはキメラＡＳＯもしくはギャップマーなどの一本鎖分子が挙げられる。アンチセンス核酸分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＲＮａｓｅ分解などの他の細胞分解機序を刺激する場合がある。

いくつかの好ましい実施形態において、上記カーゴは、マイクロＲＮＡを標的とする、例えばマイクロＲＮＡにハイブリダイズするＡＳＯを含むか、またはコードする。場合により、上記ＡＳＯは、上記マイクロＲＮＡの機能を阻害し、上記ｍｉＲＮＡが転写後に遺伝子発現を調節するのを防ぐ。場合により、上記ＡＳＯは、通常ｍｉＲＮＡによって下方制御される１種以上の遺伝子の発現を上方制御するように機能する。したがって、アンチセンス核酸カーゴは、標的遺伝子の転写を妨害し、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害し、且つ／または標的ｍＲＮＡの分解を促進する可能性がある。場合により、アンチセンス核酸は、標的遺伝子の発現の低下を誘導する能力がある。

本明細書で提供される「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「低分子ＲＮＡ」、または「ＲＮＡｉ」とは、二本鎖ＲＮＡであって、遺伝子または標的遺伝子と同一の細胞中で発現した場合に、上記遺伝子または標的遺伝子の発現を低減または阻害する能力を有する上記二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指す。ハイブリダイズして上記二本鎖分子を形成する上記核酸の上記相補的部分は、通常、実質的または完全な同一性を有する。一実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉは、標的遺伝子と実質的なまたは完全な同一性を有し、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する核酸である。実施形態において、上記ｓｉＲＮＡは、相補的な細胞ｍＲＮＡと相互作用することによって遺伝子発現を阻害し、それによって上記相補的なｍＲＮＡの発現を妨害する。通常、上記核酸の長さは少なくとも約１５～５０ヌクレオチドである（例えば、上記二本鎖ｓｉＲＮＡのそれぞれの相補的配列の長さは１５～５０ヌクレオチドであり、上記二本鎖ｓｉＲＮＡの長さは約１５～５０塩基対である）。いくつかの実施形態において、上記長さは、２０～３０塩基ヌクレオチド、好ましくは約２０～２５または約２４～２９ヌクレオチド、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドである。

ＲＮＡｉ及びｓｉＲＮＡは、例えば、Ｄａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ． ２０１７；１３（２）： ４８－５７（その全体が本明細書に援用される）に記載がある。アンチセンス核酸分子は、標的核酸配列に相補的な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または部分的二本鎖ＲＮＡを含んでいてもよい。二本鎖ＲＮＡ分子は、分子内の第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分との間の相補的対合によって形成される。ＲＮＡ配列（すなわち、一方の部分）の長さは、一般に３０ヌクレオチド未満（例えば、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０ヌクレオチド、またはそれ未満）である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列の長さは、１８～２４ヌクレオチドである。一部のｓｉＲＮＡ分子では、当該ＲＮＡ分子の相補的な第１の部分と第２の部分がヘアピン構造の「幹」を形成する。上記２つの部分は連結配列によって結合されていてもよく、それによってヘアピン構造における「ループ」を形成していてもよい。上記連結配列の長さは変化する場合があり、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３ヌクレオチドの長さであってよい。好適な連結配列は当技術分野で公知である。

本発明の方法で使用するのに好適なｓｉＲＮＡ分子は、当技術分野で公知のスキームによって設計することができる（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２００１ ４１１：４９４－８；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２００４ ３１６（４）：１０５０－８；ａｎｄ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２００４， ２２（３）：３２６－３０を参照のこと）。ｓｉＲＮＡ分子の作製に関する詳細は、Ａｍｂｉｏｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、及びＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅなどの、数社の工業的供給元のウェブサイトに記載がある。一般に、可能性のあるｓｉＲＮＡ候補の配列は、ＢＬＡＳＴアラインメントプログラムを使用して、他の核酸配列または核酸配列の多型とのいずれの一致の可能性も確認することができる（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅのインターネットウェブサイトを参照のこと）。一般的には、多数のｓｉＲＮＡが生みだされ、スクリーニングされて、有効な薬物候補が得られる（米国特許第７，０７８，１９６号を参照のこと）。ｓｉＲＮＡは、ベクターから発現させること、及び／または化学的もしくは合成的に生成させることができる。合成ＲＮＡｉは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）などの工業的供給元から入手することができる。ＲＮＡｉベクターも、工業的供給元、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手することができる。

上記核酸分子は、ｍｉＲＮＡであってよく、ｍｉＲＮＡを含んでいてもよく、またはｍｉＲＮＡをコードしていてもよい。用語「ｍｉＲＮＡ」は、その平易な通常の意味に従って使用され、転写後に遺伝子発現を調節する能力がある低分子非コードＲＮＡ分子を指す。一実施形態において、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子に対する実質的なまたは完全な同一性を有する核酸である。いくつかの実施形態において、上記ｍｉＲＮＡは、相補的な細胞ｍＲＮＡと相互作用することによって遺伝子発現を阻害し、それによって上記相補的なｍＲＮＡの発現を妨害する。一般的には、上記ｍｉＲＮＡの長さは少なくとも約１５～５０ヌクレオチドである（例えば、上記ｍｉＲＮＡのそれぞれの相補的配列の長さは１５～５０ヌクレオチドであり、上記ｍｉＲＮＡは長さは約１５～５０塩基対である）。場合により、上記核酸は合成品または組換え品である。上記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ－２９ａであってもよい。上記ｍｉＲＮＡは、配列５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧ－３’を含んでいてもよいか、または該配列から構成されていてもよい。場合により、上記核酸はｍｉＲＮＡステムループである。

本発明の方法に有用な核酸としては、発がん性ｍｉＲＮＡ（ｏｎｃｏｍｉＲとしても知られる）もしくは転写因子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡが挙げられる。上記カーゴはリボザイムまたはアプタマーであってもよい。場合により、上記核酸はプラスミドである。

本明細書に記載の特定の態様において、上記カーゴはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡに相補的であってよい。上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ配列に対して配列が相補的である、少なくとも部分を含む。上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列に結合し、それによって標的配列を阻害してもよい。例えば、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列の翻訳プロセスを阻害してもよい。上記ｍｉＲＮＡは、がんに関連するｍｉＲＮＡ（Ｏｎｃｏｍｉｒ）であってもよい。上記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ－１２５ｂであってもよい。

いくつかの態様において、上記カーゴは、遺伝子編集システム、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システム、の１つ以上の構成要素である。例えば、上記カーゴは、特定の標的配列を認識する核酸を含んでいてもよい。上記カーゴはｇＲＮＡであってもよい。かかるｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集に有用である可能性がある。上記カーゴは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはＣａｓ９をコードするプラスミドであってよい。上記Ｃａｓ９酵素は、Ｃａｓ１２またはＣａｓ１３酵素で置き換えられてもよい。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの他の遺伝子編集分子をカーゴとして使用してもよい。上記カーゴは、標的細胞中の特定の核酸配列を標的とするように操作された配列を含んでいてもよい。上記遺伝子編集分子はｍｉＲＮＡを特異的に標的としてもよい。例えば、上記遺伝子編集分子は、ｍｉＲ－１２５ｂを標的とするｇＲＮＡであってもよい。上記ｇＲＮＡは、配列５’－ＣＣＵＣＡＣＡＡＧＵＵＡＧＧＧＵＣＵＣＡ－３’を含んでいてもよいか、または該配列から構成されていてもよい。

いくつかの実施形態において、上記方法は、部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）を使用する標的遺伝子編集を使用する。ＳＳＮを使用した遺伝子編集については、例えばＥｉｄ ａｎｄ Ｍａｈｆｏｕｚ， Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ２０１６ Ｏｃｔ；４８（１０）： ｅ２６５（本記述をもってその全体が援用される）などに総説が記載される。部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせる能力をもつ酵素を操作して、ＤＳＢを目的の標的核酸配列（複数可）に導入することができる。ＤＳＢは、エラーを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復されてもよく、ＮＨＥＪでは、多くの場合ヌクレオチドの挿入または削除によって切断の２つの端部が再結合される。あるいは、ＤＳＢは、高度な相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復されてもよく、ＨＤＲでは、切断部位と相同な末端をもつＤＮＡテンプレートが供給され、ＤＳＢの部位に導入される。

標的核酸配列特異的ＤＳＢが生じるように操作することが可能なＳＳＮとしては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－９ （ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムが挙げられる。

ＺＦＮシステムは、例えば、Ｕｍｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ． （２０１０） １１（９）：６３６－４６（本記述をもってその全体が援用される）に総説が記載される。ＺＦＮは、プログラム可能なジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメイン）を含む。上記ＤＮＡ結合ドメインは、標的核酸配列に結合する能力をもつジンクフィンガーアレイをスクリーニングすることによって識別することができる。

ＴＡＬＥＮシステムは、例えば、Ｍａｈｆｏｕｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ． （２０１４） １２（８）：１００６－１４（本記述をもってその全体が援用される）に総説が記載される。ＴＡＬＥＮは、プログラム可能なＤＮＡ結合ＴＡＬＥドメイン及びＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメイン）を含む。ＴＡＬＥは、リピート可変二残基（ＲＶＤ）である各リピートの１２位及び１３位の２つの残基を除いて同一である、３３～３９個のアミノ酸のリピートからなるリピートドメインを含む。各ＲＶＤは、以下の関係、すなわち、「ＨＤ」はＣに結合、「ＮＩ」はＡに結合、「ＮＧ」はＴに結合、及び「ＮＮ」または「ＮＫ」はＧに結合（Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００９） ３２６（５９５９）：１５０１．）に従って、標的ＤＮＡ配列中のヌクレオチドへの上記リピートの結合を決定する。

ＣＲＩＳＰＲはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓの略記である。この用語は、これらの配列の起源及び機能が知られていない時期に最初に使用され、これらの配列の起源が原核生物であると想定されていた。ＣＲＩＳＰＲは、パリンドロームリピート中の短い、反復する塩基配列を含むＤＮＡのセグメントである（ヌクレオチドの配列は両方向で同一である）。各反復の後には、ウイルスまたはプラスミド由来の外来ＤＮＡの以前の組み込みに由来するスペーサーＤＮＡの短いセグメントが続く。ＣＡＳ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子の小さなクラスターがＣＲＩＳＰＲ配列の隣に位置する。上記スペーサー配列を有するＲＮＡは、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質が外来の病原性ＤＮＡを認識して切断するのを助長する。他のＲＮＡ誘導型Ｃａｓタンパク質は外来ＲＮＡを切断する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単純なバージョンであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ゲノムを編集するように改変されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を細胞中に送達することにより、当該細胞のゲノムを所望の位置で切断し、既存の遺伝子を削除する及び／または新たな遺伝子を追加することが可能である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは２つの群に分類される。クラス１システムは、複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用して外来核酸を分解する。クラス２システムは、同一の目的で単一の大きなＣａｓタンパク質を使用する。クラス１は、Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型に分けられ、クラス２は、ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型に分けられる。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集は、タＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを使用する。

いくつかの態様において、上記ＥＶにはＣＲＩＳＰＲ関連のカーゴが搭載される。換言すれば、上記ＥＶは、治療用遺伝子編集などの遺伝子編集を伴う方法に有用である。場合により、上記ＥＶはインビトロ遺伝子編集に有用である。場合により、上記ＥＶはインビボ遺伝子編集に有用である。

上記カーゴはガイドＲＮＡであってもよい。上記ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＰＳＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含んでいてもよい。上記ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合して活性複合体を形成するする領域と共に、宿主ＤＮＡの正しいセクションを示すガイドＲＮＡを含む。上記ｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡに結合し、活性複合体を形成する。上記ｇＲＮＡは、上記ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの両方を結合し、それによって活性複合体をコードする。上記ｇＲＮＡは、複数のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含んでいてもよい。上記ｇＲＮＡは、目的の配列または遺伝子に結合するように設計されていてもよい。上記ｇＲＮＡは切断のための遺伝子を標的としてもよい。任意選択で、ＤＮＡ修復テンプレートの任意選択のセクションが含まれる。上記修復テンプレートは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）のいずれかで利用することができる。

上記カーゴはＣａｓ９ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼであってもよい。上記ヌクレアーゼは、たんぱく質であって、その活性型がＤＮＡを改変することができる上記タンパク質である。ヌクレアーゼ変異体は、一本鎖ニッキング、二本鎖切断、ＤＮＡ結合、またはその他のさまざまな機能の能力をもつ。上記ヌクレアーゼはＤＮＡ部位を認識し、これにより部位特異的なＤＮＡ編集が可能になる。

上記ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼは、プラスミド上にコードされていてもよい。換言すれば、上記ＥＶカーゴは、ｇＲＮＡと上記ヌクレアーゼの両方をコードするプラスミドを含んでいてもよい。場合により、ＥＶが上記ｇＲＮＡを含み、且つ別のＥＶが上記ヌクレアーゼを含むか、またはコードしていてもよい。場合により、ＥＶは上記ｇＲＮＡをコードするプラスミドと、上記ヌクレアーゼをコードするプラスミドを含む。したがって、いくつかの態様において、ＥＶを含む組成物であって、当該ＥＶの一部が、Ｃａｓ９などの上記ヌクレアーゼを含むかまたはコードし、上記ＥＶの一部が上記ｇＲＮＡを含むかまたはコードする、上記組成物が提供される。場合により、上記ｇＲＮＡを含むまたはコードするＥＶを含む組成物と、上記ヌクレアーゼをコードするまたは含むＥＶを含む組成物とが同時投与される。場合により、上記組成物は、ＥＶがｇＲＮＡ及びヌクレアーゼの両方をコードするオリゴヌクレオチドを含むＥＶを含む。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び関連システム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ１、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ２、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ３は、例えば、Ｎａｋａｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ （２０１７） ８（３）：２６５－２７３（本記述をもってその全体が援用される）に総説が記載される。これらのシステムは、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆｌなど）と上記一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子を含む。上記ｓｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ活性を目的の核酸配列に標的化するように操作してもよい。

場合により、上記核酸カーゴは、１種以上の改変されたヌクレオチドまたは他の改変を含む。化学的改変としては、例えば、改変ヌクレオチドの組み込み、キャッピング部分（例えば、３’キャッピング）の組み込み、高分子量非免疫原性化合物（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））へのコンジュゲーション、脂溶性化合物へのコンジュゲーション、リン酸骨格における置換を含む、上記核酸の糖位、リン酸位、及び／または塩基位での化学的置換を挙げることができる。例えば、上記核酸は、１つ以上の２’位の糖改変、例えば、２’－アミノ（２’－ＮＨ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、及び２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）を含んでいてもよい。塩基改変としては、５位のピリミジン改変、８位のプリン改変、環外アミンにおける改変、４－チオウリジンの置換、５－ブロモ－または５－ヨード－ウラシルの置換、骨格改変、メチル化、イソ塩基であるイソシチジン及びイソグアニジンなどの通常ではない塩基対形成の組み合わせを挙げることができる。改変としては、キャッピングなどの３’及び５’改変も挙げることができる。他の改変としては、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体による置換、ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマートなど）による改変及び荷電結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）による改変、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）による改変、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、ならびに改変された結合（例えば、アルファアノマー核酸など）による改変などを挙げることができる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、ホスホナート基またはリン酸基によって置換されていてもよく；標準的な保護基によってされていてもよく；またはさらなるヌクレオチドもしくは固体担体にさらに結合させるために活性化されていてもよい。５’及び３’末端ＯＨ基は、リン酸化されていてもよく、あるいは、アミン、約１～約２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーもしくは他の親水性もしくは疎水性の生物学的または合成ポリマーで置換されていてもよい。核酸は、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはギャップマーなどの変異体型の核酸であってもよい。

核酸カーゴはＤＮＡ分子を含んでいてもよい。

上記カーゴは、発現ベクターまたは発現カセット配列を含んでいてもよい。好適な発現ベクター及び発現カセットは公知技術である。本明細書に記載の方法に有用な発現ベクターは、標的細胞における１種以上の核酸配列の発現を促進する要素を含む。本開示において有用な発現ベクターは、導入遺伝子または他の核酸配列を含んでいてもよい。

発現ベクターとは、当該細胞中で／当該細胞によって発現させるために、外来遺伝物質を細胞に移入するためのビヒクルとして使用されるオリゴヌクレオチド分子を指す。かかるベクターは、発現されることとなる遺伝子配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含んでいてもよい。ベクターはまた、終結コドン及び発現エンハンサーも含んでいてよい。当技術分野で公知の、任意且つ適宜のプロモーター、エンハンサー、及び終結コドンを使用することができる。

本明細書において、用語「作動可能に連結された」は、選択されたヌクレオチド配列及び調節ヌクレオチド配列（例えば、プロモーター及び／またはエンハンサー）が、ヌクレオチド配列の発現を調節配列の影響下または制御下に置く（それによって発現カセットを形成する）ような形態で共有結合している状況を包含していてもよい。したがって、調節配列が選択されたヌクレオチド配列の転写を生じさせる能力をもつ場合、上記調節配列は上記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。必要に応じて、得られた転写物は次に、所望のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドに翻訳されてもよい。

環状カーゴ分子の例としては、ミニサークル及びプラスミドが挙げられる。

上記核酸カーゴはミニサークルであってもよい。ミニサークルは低分子（約４ｋｂｐ）の環状レプリコンである。ミニサークルは一般に、通常は二本鎖であるＤＮＡからなる。ミニサークルは一部の真核生物の細胞小器官のゲノム中に天然に存在するが、本明細書で好ましいミニサークルは合成的に誘導される。場合により、上記ミニサークルは複製起点を含まず、そのため細胞内で複製されない。ミニサークルは当業者に公知であり、例えば、Ｇａｓｐａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ： ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１５ Ｍａｒ；１５（３）：３５３－７９． ｄｏｉ： １０．１５１７／１４７１２５９８．２０１５．９９６５４４． Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｄｅｃ ２４を参照されたい。場合により、上記ミニサークルはレポーター遺伝子を含む。

場合により、上記核酸カーゴはプラスミドである。プラスミドは通常、細胞中で独立に複製することが可能である。上記プラスミドは複製起点配列を含んでいてもよい。

場合により、上記核酸は、上記小胞の表面上のタンパク質に結合する配列を含むように改変されていない。例えば、上記カーゴ核酸はトランス活性化応答（ＴＡＲ）要素を含まない。場合により、上記細胞外小胞は、外因性ＡＲＲＤＣ１タンパク質またはＡＲＲＤＣ１タンパク質由来の配列などの改変表面タンパク質を含むように改変されていない。

本開示に係る細胞外小胞は、小胞当たり少なくとも０．１個の核酸分子を含んでいてもよい（例えば、搭載していてもよい）。上記細胞外小胞（複数可）は、小胞当たり０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０個、またはそれを超える上記核酸のコピーのうちの１つを含んでいてもよい（例えば、搭載していてもよい）。上記細胞外小胞（複数可）は、小胞当たり少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも３．５、少なくとも４、少なくとも５個、またはそれを超える上記核酸のコピーを含んでいてもよい（例えば、搭載していてもよい）。上記細胞外小胞（複数可）は、小胞当たり約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれを超える核酸のコピーを含んでいてもよい（例えば、搭載していてもよい）。上記細胞外小胞（複数可）は、小胞当たり０．１～１．０、０．１～２．０、０．１～３．０、０．１～４．０、０．１～５．０、０．１～６．０、０．１～７．０、０．１～８．０、０．１～９．０、０．１～１０、０．１～１５．０、０．１～２０．０、０．１～２５．０、０．１～３０．０、０．１～３５．０、０．１～４０．０、０．１～４５．０、０．１～５０、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、１～５０、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、２～１５、２～２０、２～２５、２～３０、２～３５、２～４０、２～４５、２～５０、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～１５、３～２０、３～２５、３～３０、３～３５、３～４０、３～４５、３～５０、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、４～１５、４～２０、４～２５、４～３０、４～３５、４～４０、４～４５、４～５０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～４５、５～５０、６～７、６～８、６～９、６～１０、６～１５、６～２０、６～２５、６～３０、６～３５、６～４０、６～４５、６～５０、７～８、７～９、７～１０、７～１５、７～２０、７～２５、７～３０、７～３５、７～４０、７～４５、７～５０、８～９、８～１０、８～１５、８～２０、８～２５、８～３０、８～３５、８～４０、８～４５、８～５０、９～１０、９～１５、９～２０、９～２５、９～３０、９～３５、９～４０、９～４５、９～５０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１０～３５、１０～４０、１０～４５、１０～５０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、１５～３５、１５～４０、１５～４５、１５～５０、２０～２５、２０～３０、２０～３５、２０～４０、２０～４５、２０～５０、２５～３０、２５～３５、２５～４０、２５～４５、２５～５０、３０～３５、３０～４０、３０～４５、３０～５０、３５～４０、３５～４５、３５～５０、４０～４５、４０～５０、または４５～５０個の核酸のコピーのうちの１つを含んでいてもよい（例えば、搭載していてもよい）。

小胞当たりの上記核酸（複数可）の数は、例えば、組成物中に存在するＥＶの集団全体にわたる代表数、好ましくは平均値であってよい。小胞当たりの核酸のコピーの数は、搭載された核酸カーゴのコピーの総数をＥＶの総数で除すことによって決定することができる。すなわち、［ＥＶ当たりのコピー＝搭載された核酸のコピーの数／ＥＶ粒子の総数］である。核酸のコピーの数は、ｑＰＣＲによって決定することができる。ＥＶの数は、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＡＲＭＭｓ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１８ ９－９６０に記載される）によって決定することができる。ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）は、液体中の粒子の可視化及び解析方法である。この技法は、限外顕微鏡及びレーザー照射装置と共に使用され、これらによって、液体懸濁液中の微細粒子がブラウン運動下で移動しているのを可視化することが可能になる。上記粒子によって散乱した光は、ＣＣＤまたはＥＭＣＣＤカメラを使用して複数のフレームにわたって捕捉される。次いでコンピュータソフトウエアを使用して、各粒子のフレームからフレームへの運動を追跡する。

本明細書では、別段の指示がない限り、用語「平均値」とは、算術平均値を指す。これは、試料中で測定された核酸の総量を、当該試料中の小胞の総数で除した値を指してもよい。

上記カーゴが、組成物中の上記細胞外小胞の実質的にすべてに搭載されることが望ましくてもよいが、本明細書に開示の組成物は、細胞外小胞であって、それらの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％が上記カーゴを含む上記細胞外小胞を含んでいてもよい。好ましくは、上記細胞外小胞の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の少なくとも１つが上記カーゴを含んでいてもよい。場合により、上記組成物内の異なる細胞外小胞が異なるカーゴを含んでいてもよい。場合により、上記細胞外小胞は、同一の、または実質的に同じカーゴ分子を含んでいてもよい。

核酸カーゴのサイズは、塩基（一本鎖核酸の場合）または塩基対（二本鎖核酸の場合）で表されるその長さで定義されてもよい。本明細書において、当該核酸カーゴの一本鎖であるかまたは二本鎖であるかの性格が示されていない場合、塩基（例えば、ｋｂ（キロ塩基）で表される長さは、塩基対（例えば、ｋｂｐ）で表される同一の長さの開示でもある。このように、１ｋｂ（１０００塩基）の長さは１ｋｂｐ（１０００塩基対）の開示でもある。用語「塩基」は用語「ヌクレオチド」と同義で使用される。上記核酸カーゴは一本鎖または二本鎖であってよい。上記核酸カーゴは直鎖状または環状であってよい。

上記核酸カーゴ、例えばＲＮＡの長さは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基のうちの１つであってよい。上記核酸カーゴの長さは、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００塩基のうちの１つであってよい。上記核酸カーゴの長さは、少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０塩基のうちの１つであってよい。

上記核酸カーゴが一本鎖である場合、その長さは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０塩基；少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００塩基；または少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、もしくは２５０塩基のうちの１つであってよい。

上記核酸カーゴが一本鎖である場合、その長さは、少なくとも２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、または１１０００塩基のうちの１つであってよい。上記核酸カーゴが一本鎖である場合、任意選択で、その最大長さは、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５００、９７５０、１００００、１０２５０、１０５００、１０７５０、または１１０００塩基のうちの１つであってよい。好ましい実施形態において、一本鎖核酸カーゴの最大長さは、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００塩基、または５０００塩基を超える長さのうちの１つであってよい。

上記核酸カーゴが一本鎖である場合、その長さは、２５０～７５０、５００～１０００，１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、１０００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、９０００～１００００、１００００～１１０００、２５０～１０００、１０００～３０００、１０００～４０００、１０００～５０００、１０００～６０００、１０００～７０００、１０００～８０００、１０００～９０００、１０００～１００００、１０００～１１０００、２０００～４０００、２０００～５０００、２０００～６０００、２０００～７０００、２０００～８０００、２０００～９０００、２０００～１００００、２０００～１１０００、３０００～５０００、３０００～６０００、３０００～７０００、３０００～８０００、３０００～９０００、３０００～１００００、３０００～１１０００、４０００～６０００、４０００～７０００、４０００～８０００、４０００～９０００、４０００～１００００、４０００～１１０００、５０００～７０００、５０００～８０００、５０００～９０００、５０００～１００００、５０００～１１０００、６０００～８０００、６０００～９０００、６０００～１００００、６０００～１１０００、７０００～９０００、７０００～１００００、または７０００～１１０００塩基のうちの１つであってよい。

いくつかの実施形態において、上記核酸カーゴが一本鎖である場合、その長さは、最大で、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、または４００００塩基のうちの１つであってよい。上記一本鎖核酸カーゴの長さは、５０００～１００００、５０００～１５０００、５０００～２００００、５０００～２５０００、５０００～３００００、５０００～３５０００、５０００～４００００、１００００～１５０００、１００００～２００００、１００００～２５０００、１００００～３００００、１００００～３５０００、１００００～４００００、１５０００～２００００、１５０００～２５０００、１５０００～３００００、１５０００～３５０００、１５０００～４００００、２００００～２５０００、２００００～３００００、２００００～３５０００、２００００～４００００、２５０００～３００００、２５０００～３５０００、２５０００～４００００、３００００～３５０００、３００００～４００００、または３５０００～４００００塩基のうちの１つであってよい。

上記核酸カーゴが二本鎖、例えばｓｉＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡである場合、その長さは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基対のうちの１つであってよい。上記核酸カーゴの長さは、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００塩基対のうちの１つであってよい。上記核酸カーゴの長さは、少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０塩基対のうちの１つであってよい。

好適な小分子としては、細胞毒性試薬及びキナーゼ阻害剤が挙げられる。上記小分子は、蛍光プローブ及び／または金属を含んでいてもよい。例えば、上記カーゴは、酸化鉄粒子などの超常磁性粒子を含んでいてもよい。上記カーゴは、酸化鉄ナノ粒子などの超微粒超常磁性酸化鉄粒子であってもよい。

場合により、上記カーゴは蛍光デキストランなどの検出可能な部分である。上記カーゴは放射性標識されていてもよい。

場合により、上記核酸カーゴは均質である（すなわち、ＥＶの組成物中の各核酸は類似しているかまたは実質的に同一である）。場合により、上記核酸カーゴは不均一である（すなわち、ＥＶの組成物中核酸は、互いに類似しておらず、または実質的に同一ではない）。

細胞外小胞の搭載方法
本明細書において、細胞外小胞へのカーゴの搭載とは、当該細胞外小胞が、当該カーゴの担体として役立ち、例えば、上記カーゴの細胞への送達が可能となるような、安定なまたは準安定な形態で細胞外小胞とカーゴを会合させることを指す。カーゴ分子は、少なくとも２つの方法で搭載することができる。１つは、上記カーゴを上記細胞外小胞の内腔中に存在させるための方法（内腔搭載）である。もう１つは、上記カーゴを、上記細胞外小胞の外表面、例えば膜に結合させ、接着させ、上記外表面を通して挿入し、または上記外表面と複合体化させるための方法（外表面搭載）である。上記細胞外小胞の外表面上に搭載するカーゴ分子は通常、該小胞をヌクレアーゼ、例えばＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅと接触させることによって除去することができる。

場合により、細胞外小胞（複数可）、核酸、及びトランスフェクション試薬を、適宜の条件下、搭載が起こるのに十分な時間、一緒にする。

カーゴを細胞外小胞中に搭載するのに好適な方法は、ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０５９６に記載されており、該方法としては、例えば、エレクトロポレーション、音波処理、超音波、リポフェクション、または低張透析が挙げられる。

搭載方法は、搭載する核酸をトランスフェクション試薬、例えばＥｘｏｆｅｃｔ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と接触させることを含んでいてもよい。

細胞外小胞への搭載は、内腔搭載と外表面搭載との組み合わせによって行ってもよく、かかる細胞外小胞は、カーゴ核酸を標的細胞に効果的に送達することができる。

任意選択で、いくつかの実施形態において、搭載に関する言及は内腔搭載のみについて行われてもよい。任意選択で、いくつかの他の実施形態において、搭載に関する言及は外表面搭載のみについて行われてもよい。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞外小胞中へのカーゴの搭載は、ウイルスによる送達方法を含まず、例えば、搭載方法は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを含まない。

免疫細胞
本発明は、ＲＢＣＥＶを使用した核酸の免疫細胞への送達に関する。また、ＲＢＣＥＶ及び／または送達された核酸を含む免疫細胞、ならびにＲＢＣＥＶを使用して送達された核酸を発現する免疫細胞も記載される。

本発明は、核酸カーゴを搭載した、または核酸カーゴを含むＲＢＣＥＶを含む免疫細胞を包含する。

本明細書において、細胞が単数形（すなわち、「ａ／ｔｈｅ ｃｅｌｌ」）で言及される場合、かかる細胞の複数形／集団も企図されることが理解されるよう。

本開示に係る免疫細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞であってよい。上記哺乳動物は、ヒト、または非ヒト哺乳動物（例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のげっ歯動物（任意のげっ歯目の動物を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌ウシ、例えば乳牛、または任意のＢｏｓ目の動物を含む）、ウマ（任意のＥｑｕｉｄａｅ目の動物を含む）、ロバ、及びヒト以外の霊長動物であってよい。

いくつかの実施形態において、上記細胞は、ヒト対象に由来するか、またはヒト対象から得られたものであってよい。上記細胞が対象に投与される場合、または該細胞が対象に投与される細胞の集団の調製に使用される場合、上記細胞は、投与される対象とは異なる対象に由来していてもよい（すなわち、上記細胞は同種異系であってよい）。場合により、上記免疫細胞は自家細胞である（すなわち、上記免疫細胞は、単離され、改変され、次いで該細胞が単離された対象と同一の対象に投与される）。場合により、上記免疫細胞は同種異系細胞である（すなわち、上記免疫細胞は、単離され、改変され、次いで該細胞が単離された対象とは異なる対象に投与される）。同種異系細胞はレシピエント対象と一致するＨＬＡである。場合により、上記免疫細胞は異種細胞／異種細胞集団中の細胞である（すなわち、細胞が単離され、改変され、次いで該細胞が単離された対象とは異なる対象に投与される）。異種細胞は、異なるドナー対象から得られた細胞の混合集団中に存在する場合がある。

上記免疫細胞は、造血起源の細胞、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、樹状細胞、リンパ球、または単球であってもよい。上記免疫細胞は、単核細胞、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であってもよい。リンパ球は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、または自然リンパ球（ＩＬＣ）、またはそれらの前駆体であってもよい。上記免疫細胞は、例えば、ＣＤ３ポリペプチド（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、またはＣＤ３δ）、ＴＣＲポリペプチド（ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、またはＴＣＲδ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４、またはＣＤ８を発現してもよい。

いくつかの実施形態において、上記免疫細胞はＴ細胞、例えばＣＤ３＋ Ｔ細胞である。場合により、上記Ｔ細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞はＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）である。いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ））である。

いくつかの実施形態において、上記免疫細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞は対象から得られる／得られた。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞は、対象から得られた免疫細胞／免疫細胞集団に由来する／由来している。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞は不死化細胞株の細胞ではない。

いくつかの実施形態において、上記免疫細胞はナイーブ且つ／または未分化Ｔ細胞である。上記Ｔ細胞はＣＤ４＋ Ｔ細胞であってよく、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、及び／またはＣＤ２７を発現してもよい。上記Ｔ細胞はＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋ Ｔ細胞であってよい。いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ２５、またはＨＬＡ－ＤＲを発現しない。場合により、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋Ｔ細胞であり得る。場合により、上記Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－ Ｔ細胞ではない。

いくつかの実施形態において、上記免疫細胞は単球、例えばＣＤ１４＋単球である。場合により、上記単球は、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＣＲ２、及び／またはＣＤ１６を発現する。

いくつかの実施形態において、上記免疫細胞は樹状細胞である。場合により、上記樹状細胞は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６を発現する。上記樹状細胞は、従来の樹状１型（ｃＤＣ１）細胞であってよい。上記樹状細胞は、従来の樹状２型（ｃＤＣ２）細胞であってよい。上記樹状細胞は形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）であってもよい。

いくつかの実施形態において、上記免疫細胞はＢ細胞、例えばＣＤ１９＋ Ｂ細胞である。場合により、上記Ｂ細胞は未成熟Ｂ細胞である。場合により、上記Ｂ細胞は、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、及び／またはＣＤ４５Ｒを発現する。場合により、上記Ｂ細胞はＣＤ２５またはＣＤ３０を発現しない。

いくつかの実施形態において、上記免疫細胞はマクロファージである。場合により、上記マクロファージは肺胞マクロファージである。場合により、上記マクロファージは組織常在性マクロファージである。場合により、上記マクロファージはクッパー細胞である。場合により、上記マクロファージは脾臓マクロファージである。

いくつかの実施形態において、上記免疫細胞は、対象とする抗原に特異的な抗原受容体を含む／発現する。いくつかの実施形態において、上記抗原受容体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、上記抗原受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。

免疫細胞中への核酸の送達方法
本明細書に開示の方法は、免疫細胞をＲＢＣＥＶに、該免疫細胞が該ＲＢＣＥＶを取り込むのに適した条件下で十分な時間、接触させるステップを含む。上記ＲＢＣＥＶに本明細書に記載の核酸カーゴを搭載することができる。

いくつかの態様において、本発明は、免疫細胞中への核酸の送達方法を提供し、上記方法は、上記免疫細胞を、核酸カーゴが搭載されたＲＢＣＥＶと共にインキュベートすることを含む。本明細書においてＲＢＣＥＶが単数形（すなわち、「ａ／ｔｈｅ ＲＢＣＥＶ」）で言及される場合、かかるＲＢＣＥＶの複数形／集団も企図されることを理解されたい。

また、免疫細胞への核酸の形質導入方法であって、上記免疫細胞を核酸カーゴを搭載したＲＢＣＥＶと共にインキュベートすることを含む上記方法も提供される。

本明細書では、用語「培養すること（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）」／「培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）」／「培養する（ｉｎｃｕｂａｔｅ）」とは、上記免疫細胞（複数可）とカーゴを搭載したＲＢＣＥＶ（複数可）とを、該免疫細胞（複数可）によって該ＲＢＣＥＶ（複数可）が取り込まれる、すなわち、吸収される、組み入れられる、または取り入れられるような適切な温度で適切な時間、一緒にすることを指すために使用される。これらの用語はまた、本明細書において、上記免疫細胞（複数可）と搭載されたＲＢＣＥＶ（複数可）とを、上記免疫細胞（複数可）が上記ＲＢＣＥＶ（複数可）及び／または上記カーゴ、例えば外因性核酸を、例えばインキュベーション中にまたはインキュベーション後に、取り込む、すなわち、吸収する、組み入れる、または取り入れるのに十分に接触させることを指すためにも使用される。インキュベーションによって、少なくとも１種のＲＢＣＥＶ及び／もしくはカーゴを含むまたは含有する本明細書に記載の免疫細胞（複数可）を産生することができる。上記免疫細胞（複数可）は、インキュベーション中及び／またはインキュベーション後に産生することができる。インキュベーションは、上記カーゴを搭載したＲＢＣＥＶを含む細胞培養培地中でのインビトロ／エクスビボで、上記免疫細胞またはその集団を培養することを含んでいてもよい。インキュベーションは、本明細書の実施例に記載されているように行うことができる。

インキュベーションは、哺乳動物の体温に近い温度、例えば、少なくとも３５．０℃、少なくとも３５．５℃、少なくとも３６．０℃、少なくとも３６．１℃、少なくとも３６．２℃、少なくとも３６．３℃、少なくとも３６．４℃、少なくとも３６．５℃、少なくとも３６．６℃、少なくとも３６．７℃、少なくとも３６．８℃、少なくとも３６．９℃、少なくとも３７．０℃、少なくとも３７．１℃、少なくとも３７．２℃、少なくとも３７．３℃、少なくとも３７．４℃、及び／または少なくとも３７．５℃のうちの１つ以上で実施してもよい。場合により、上記インキュベーションは、例えば上記のような、２つ以上の温度で実施される。場合により、上記インキュベーションは、単一の温度で実施される。場合により、上記インキュベーションは人間の体温で実施される。場合により、上記インキュベーションは少なくとも３７．０℃で実施される。場合により、上記インキュベーションは３７．０℃で実施される。インキュベーションは、同一の細胞に対して繰り返し実施されてもよい。

インキュベーションは、細胞培養のＣＯ_２レベルを制御することを含んでいてもよい。ＣＯ_２の制御を含むインキュベーションにより、インキュベートされる混合物のｐＨを制御することができる。場合により、上記インキュベートされる混合物のＣＯ_２レベルは、血液、例えば哺乳動物の血液のＣＯ_２レベルまたはそれに近いレベルに維持される。場合により、インキュベーションは、少なくとも４．０％、少なくとも４．１％、少なくとも４．２％、少なくとも４．３％、少なくとも４．４％、少なくとも４．５％、少なくとも４．６％、少なくとも４．７％、少なくとも４．８％、少なくとも４．９％、少なくとも５．０％、少なくとも５．１％、少なくとも５．２％、少なくとも５．３％、少なくとも５．４％、少なくとも５．５％、少なくとも５．６％、少なくとも５．７％、少なくとも５．８％、少なくとも５．９％、及び／または少なくとも６．０％のＣＯ_２のうちの１つ以上で実施される。場合により、インキュベーションは、少なくとも３０ｍｍＨｇ、少なくとも３１ｍｍＨｇ、少なくとも３２ｍｍＨｇ、少なくとも３３ｍｍＨｇ、少なくとも３４ｍｍＨｇ、少なくとも３５ｍｍＨｇ、少なくとも３６ｍｍＨｇ、少なくとも３７ｍｍＨｇ、少なくとも３８ｍｍＨｇ、少なくとも３９ｍｍＨｇ、少なくとも４０ｍｍＨｇ、少なくとも４１ｍｍＨｇ、少なくとも４２ｍｍＨｇ、少なくとも４３ｍｍＨｇ、少なくとも４４ｍｍＨｇ、及び／または少なくとも４５ｍｍＨｇのＣＯ_２のうちの１つ以上で実施される。

場合により、インキュベーションは少なくとも５％のＣＯ_２で実施される。場合により、インキュベーションは約５％のＣＯ_２で実施される。場合により、インキュベーションは５％のＣＯ_２で実施される。場合により、インキュベーションは少なくとも３８ｍｍＨｇのＣＯ_２で実施される。場合により、インキュベーションは約３８ｍｍＨｇのＣＯ_２で実施される。場合により、インキュベーションは３８ｍｍＨｇのＣＯ_２で実施される。場合により、インキュベーションは、加湿環境、例えば加湿インキュベーター中で実施される。

インキュベーションは、上記ＲＢＣＥＶが上記免疫細胞によって取り込まれるような長さの時間実施されてもよい。インキュベーションは、例えば上記のような温度及びＣＯ_２レベルの組み合わせで、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、または７２時間のうちの１つで実施されてもよい。場合により、インキュベーションは、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、少なくとも２８時間、少なくとも２９時間、少なくとも３０時間、少なくとも３１時間、少なくとも３２時間、少なくとも３３時間、少なくとも３４時間、少なくとも３５時間、少なくとも３６時間、少なくとも３７時間、少なくとも３８時間、少なくとも３９時間、少なくとも４０時間、少なくとも４１時間、少なくとも４２時間、少なくとも４３時間、少なくとも４４時間、少なくとも４５時間、少なくとも４６時間、少なくとも４７時間、少なくとも４８時間、少なくとも４９時間、少なくとも５０時間、少なくとも５１時間、少なくとも５２時間、少なくとも５３時間、少なくとも５４時間、少なくとも５５時間、少なくとも５６時間、少なくとも５７時間、少なくとも５８時間、少なくとも５９時間、少なくとも６０時間、少なくとも６１時間、少なくとも６２時間、少なくとも６３時間、少なくとも６４時間、少なくとも６５時間、少なくとも６６時間、少なくとも６７時間、少なくとも６８時間、少なくとも６９時間、少なくとも７０時間、少なくとも７１時間、または少なくとも７２時間実施される。

場合により、インキュベーションは、少なくとも３６時間または少なくとも４８時間実施される。場合により、インキュベーションは４８時間実施される。本明細書に記載の方法は、例えば吸収されていないいずれのＲＢＣＥＶも除去するために、インキュベーション後に免疫細胞を洗浄する１つ以上のステップを含んでいてもよい。洗浄は、ＰＢＳ及び遠心分離（例えば、４℃における）を使用して実施されてもよい。

本明細書に記載の方法は、例えば上記の、温度、ＣＯ_２レベル、及び／または時間の任意の組み合わせを含むインキュベーションステップを含んでいてもよい。場合により、インキュベーションは、３７℃、５％のＣＯ_２で、４８時間実施される。

インキュベーションは、任意且つ適宜の培地、例えば細胞培養培地中で実施されてもよい。免疫細胞に適した培地は当技術分野で周知であり、例えばＡｒｏｒａ Ｍ， ＭＡＴＥＲ ＭＥＴＨＯＤＳ ２０１３；３：１７５に記載されている。

場合により、インキュベーションは、インキュベーション時間の一部または全ての間、混合物を振とうすることを含む。

上記方法は、例えば本明細書に記載の、ＲＢＣＥＶに核酸カーゴを搭載するステップを含んでいてもよい。このステップは、当該ＲＢＣＥＶを当該免疫細胞と共にインキュベートする前に実施されてもよい。このステップは、当該ＲＢＣＥＶを当該免疫細胞と共にインキュベートすることとは別個に実施されてもよい。

場合により、上記方法は、当該ＲＢＣＥＶに核酸カーゴを搭載するステップを含まず、例えば、当該免疫細胞は、核酸カーゴが事前に搭載されたＲＢＣＥＶと共にインキュベートされる。

場合により、本明細書に記載の、外因性核酸の免疫細胞への送達方法／免疫細胞への外因性核酸の形質導入方法は、上記免疫細胞（複数可）をトランスフェクション試薬に接触させることを含まない（但し、上記ＲＢＣＥＶ自体には、例えばトランスフェクション試薬を使用して、核酸カーゴが搭載されてもよい／されていてもよい）。

場合により、免疫細胞中への上記核酸の送達方法はインビトロまたはエクスビボで実施される。場合により、上記ＲＢＣＥＶへの上記核酸カーゴの搭載はインビトロまたはエクスビボで実施される。

場合により、上記免疫細胞は対象、例えばヒト対象から単離されている。上記方法は対象から免疫細胞を単離する最初の工程を含んでいてもよい。

場合により、上記方法は、核酸を含む免疫細胞を、対象、例えば本明細書に記載の、例えばヒト対象に導入または投与することを含む。場合により、本明細書に記載の方法は、トランスフェクトされた免疫細胞（複数可）、すなわち上記核酸を含む免疫細胞（複数可）を、対象への投与のために再製剤化することを含む。再製剤化は、上記免疫細胞（複数可）または免疫細胞の集団を、哺乳動物、例えばヒトへの投与に適したアジュバント、希釈剤、または担体と混合することを含んでいてもよい。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、ＲＢＣＥＶ（複数可）及び／または核酸を含む免疫細胞（複数可）が活性化及び／または分化しているかどうかを試験することを含む。場合により、上記方法は、本明細書に記載の免疫細胞（複数可）及び搭載されたＲＢＣＥＶ（複数可）をインキュベートし、次いで該免疫細胞が活性化及び／または分化しているかどうかを試験することを含む。場合により、活性化及び／または分化していない免疫細胞（複数可）を、活性化及び／または分化した免疫細胞（複数可）から単離する。場合により、活性化及び／または分化していない免疫細胞（複数可）は、その後の用途、例えば対象への投与及び／または治療方法での使用に使用される。場合により、活性化及び／または分化した免疫細胞（複数可）は、その後の用途に使用されない。免疫細胞が活性化及び／または分化しているかどうかの判定方法の例は、本明細書に後述される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、核酸を搭載したＲＢＣＥＶ（複数可）と共にインキュベートされた上記免疫細胞（複数可）が、ＲＢＣＥＶによって送達された核酸を発現する／発現しているかどうかを試験することを含む。細胞が核酸を発現するかどうかを判定するための好適な方法は当技術分野で周知であり、該方法としては、例えば、核酸発現を判定するためのｑＰＣＲ、及びＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫ブロットなどの翻訳されたタンパク質を検出するためのイムノアッセイに基づく方法が挙げられる。

いくつかの実施形態において、ＲＢＣＥＶによって送達された核酸を含む、及び／または核酸を搭載したＲＢＣＥＶを含む免疫細胞の産生のための方法のステップは、以下、すなわち、対象から血液試料を取得すること；上記血液試料から免疫細胞、例えばＰＢＭＣまたはＴ細胞を単離すること；免疫細胞、例えばＴ細胞の集団を生成／増殖すること；インビトロまたはエクスビボ細胞培養において免疫細胞を培養すること；上記免疫細胞を、カーゴ、例えば核酸が搭載されたＲＢＣＥＶに接触させること；上記免疫細胞を、カーゴ、例えば核酸が搭載されたＲＢＣＥＶと共にインキュベートすること；上記核酸を含む免疫細胞を収取すること；上記免疫細胞が上記核酸を発現するかどうかを判定すること；上記核酸を含む／発現する上記免疫細胞を単離すること；上記免疫細胞が活性化／分化しているかどうかを判定すること；活性化／分化していない免疫細胞を単離すること；上記核酸を発現する免疫細胞及び／または活性化／分化していない免疫細胞を、インビトロまたはエクスビボ細胞培養において培養すること；上記核酸を発現する免疫細胞及び／または活性化／分化していない免疫細胞を、アジュバント、希釈剤、または担体と混合すること；改質免疫細胞を対象に投与することのうちの１つ以上を含んでいてもよい。

核酸カーゴが搭載されたＲＢＣＥＶの、上記核酸を免疫細胞中に送達するための使用も提供される。

本明細書に記載の方法によって得られる、または得ることができる免疫細胞及び免疫細胞の集団も提供される。かかる細胞の特性／特徴の例、及びかかる細胞を如何にして同定及び／または規定することができるかについて、以下に説明する。

本開示に係る免疫細胞を、例えばインビトロ／エクスビボで培養することを含む方法であって、例えばかかる細胞の集団を生成／増殖するための上記も提供される。インビトロ／エクスビボでの免疫細胞の集団の生成／増殖方法は当業者に周知である。一般的な培養条件（すなわち、細胞培養培地、添加剤、温度、気体雰囲気）、細胞数、培養期間などは、例えばＮｇｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． （２０１４） ３７（４）：１９３－２０３（本記載をもってその全体が援用される）を参照することによって決定することができる。

本開示に係る免疫細胞の培養物は、好都合に、５％のＣＯ_２を含む加湿雰囲気中、３７℃に維持されてもよい。本開示に係る細胞培養物の細胞は、当業者によって容易に測定することができる、任意且つ適宜の密度で確立及び／または維持することができる。例えば、培養物は、約０．５×１０^６～約５×１０^６細胞／ｍｌ－培養物（例えば約１×１０^６細胞／ｍｌ）の初期密度で確立されてもよい。

培養は、培養物の容積に適した任意の容器、例えば細胞培養プレートのウェル中、細胞培養フラスコ中、バイオリアクター中などで実施することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、バイオリアクター、例えば、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｄｕｄｌｅｙ， Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２０１２） １（８）：１４３５－１４３７（本記載をもってその全体が援用される）中で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＧＲｅｘ細胞培養容器、例えばＧＲｅｘフラスコまたはＧＲｅｘ １００バイオリアクター中で培養される。

ＲＢＣＥＶによって送達された核酸を含む免疫細胞の特性
本開示に係る、ＲＢＣＥＶを含む、及び／またはＲＢＣＥＶによって送達された、すなわち外因性の核酸でトランスフェクトされた／該核酸を含む／該核酸を発現する免疫細胞は、１つ以上の機能上の特性を参照することによってキャラクタライズまたは規定することができる。

本発明に係る方法によって産生された免疫細胞は、改変、例えば、遺伝子改変されていてもよい。場合により、上記免疫細胞は、ＲＢＣＥＶによって送達された核酸、例えばｍＲＮＡを含む及び／または発現する。ｍＲＮＡは、上記免疫細胞によってタンパク質に翻訳されてもよい。

上記送達された核酸カーゴは、当該免疫細胞に新たな及び／または改善された特性を提供する場合がある。例えば、上記核酸が抗原特異的受容体をコードする実施形態では、上記核酸を含む／発現する免疫細胞は、抗原特異的受容体に対する抗原を発現する細胞に対するエフェクター免疫活性を示す場合がある。場合により、上記核酸は受容体をコードする。いくつかの実施形態において、上記核酸は受容体に対するリガンドをコードする。受容体及びリガンドは、可溶性／分泌型または細胞膜結合型であってよい。

場合により、上記送達された核酸は抗原特異的受容体をコードする。抗原特異的受容体としては、例えば、抗体／免疫グロブリン（Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を含む）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が挙げられる。抗原特異的受容体は、可溶性／分泌型または細胞膜結合型であってよい。

いくつかの実施形態において、上記送達された核酸は、抗原特異的受容体に対する抗原をコードする。いくつかの実施形態において、上記核酸は疾患または障害（例えば、がん、感染症、または自己免疫疾患）に関連する抗原をコードする。

上記送達された核酸は、共刺激受容体（例えば、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＣＤ３０、もしくはＧＩＴＲ）、または免疫チェックポイントタンパク質（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、もしくはＢＴＬＡ）をコードしていてもよい。上記核酸は、共刺激受容体のリガンド（例えば、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ３０Ｌ、もしくＧＩＴＲＬ）、または免疫チェックポイントタンパク質のリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｇａｌ－９、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、もしくはＶＳＩＧ３）をコードしていてもよい。

場合により、上記送達された核酸は、当該核酸を含む／発現する免疫細胞の１種以上の活性を増加及び／または減少させる能力をもつ核酸であるか、または該核酸をコードする。場合により、上記免疫細胞は、上記送達された核酸によって、その発現が改変される／改変されている遺伝子及び／またはタンパク質を含む。上記遺伝子及び／もしくはタンパク質は、上記免疫細胞にとって内因性の種、すなわち上記細胞のゲノム中の種であってよく、または上記免疫細胞にとって外因性の種、すなわち上記細胞中に導入されたものであってもよい。遺伝子／タンパク質発現の改変は、転写レベルでの発現の上方制御もしくは下方制御、及び／または翻訳レベルでのｍＲＮＡの発現の上方制御もしくは下方制御を含む。例えば、ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡは、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節において機能する。転写後調節によって、送達された核酸によって標的とされる内因性ＲＮＡが下方制御される可能性がある。また、転写後調節によって、送達された核酸によってその発現が下方制御される内因性標的ＲＮＡにより通常は阻害される遺伝子（複数可）／タンパク質（複数可）が、上方制御される場合もある。

本明細書に記載の方法は、例えば上記のような遺伝子編集システムの１種以上の成分を免疫細胞に送達してもよい。したがって、上記免疫細胞は、遺伝物質であって、該遺伝物質が、例えば、ヌクレオチドの一本鎖切断（複数可）、二本鎖切断（複数可）、及び／または挿入（複数可）もしくは欠失（複数可）を含むように編集された上記遺伝物質を含んでいてもよい。上記免疫細胞は、上記送達された核酸によって導入された外因性ＤＮＡテンプレートを含む遺伝物質を含んでいてもよい。上記免疫細胞は、例えば上記免疫細胞が改変された／編集されたタンパク質を発現するように、上記送達された核酸によって編集される／編集された遺伝物質から翻訳されたタンパク質（複数可）を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態において、本開示に係るＲＢＣＥＶによって送達された核酸を含む免疫細胞は、以下の特性、すなわち、
ａ）上記ＲＢＣＥＶによって送達された核酸の発現、
ｂ）外因性核酸、すなわち、ＲＢＣＥＶによって送達される／送達された核酸の発現、
ｃ）上記ＲＢＣＥＶによって送達された核酸の恒常的または一過性の発現、
ｄ）ＲＢＣＥＶによらない送達、例えばエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して同一の核酸でトランスフェクトされた免疫細胞と比較した、上記ＲＢＣＥＶによって送達された核酸の発現の増加、
ｅ）上記ＲＢＣＥＶによって送達された核酸の存在、
ｆ）ＲＢＣＥＶによらない送達、例えばエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して同一の核酸でトランスフェクトされた免疫細胞と比較した、上記ＲＢＣＥＶによって送達された核酸の存在の増加、
ｇ）ナイーブ、未分化、または非活性化の状態、
ｈ）ナイーブ、未分化、または非活性化の状態を示す細胞マーカーの発現、
ｉ）例えば、ＲＢＣＥＶによらない送達、例えばエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して核酸でトランスフェクトされた免疫細胞上の細胞マーカーの発現と比較した、ナイーブ、未分化、または非活性化の状態を示す細胞マーカーの発現の増加、
ｊ）例えば、ＲＢＣＥＶによらない送達、例えばエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して核酸でトランスフェクトされた免疫細胞上の細胞マーカーの発現と比較した、ナイーブ、未分化、または非活性化の状態を示す細胞マーカーの維持の増加、
ｋ）例えば、ＲＢＣＥＶによらない送達、例えばエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して核酸でトランスフェクトされた免疫細胞上の細胞マーカーの発現と比較した、活性化及び／または分化の状態を示す細胞マーカーの発現の減少、
ｌ）細胞マーカーＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、及び／またはＣＤ２７の発現、
ｍ）例えば、ＲＢＣＥＶによらない送達、例えばエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して核酸でトランスフェクトされた免疫細胞上のこれらの細胞マーカーの発現と比較した、ＲＢＣＥＶ搭載核酸によるトランスフェクション後の細胞マーカーＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、及び／またはＣＤ２７の発現の維持の増加、
ｎ）細胞マーカーＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＣＲ７の発現、
ｏ）例えば、ＲＢＣＥＶによらない送達、例えばエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して核酸でトランスフェクトされた免疫細胞上のこれらの細胞マーカーの発現と比較した、ＲＢＣＥＶ搭載核酸によるトランスフェクション後の細胞マーカーＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＣＲ７の発現の維持の増加、
ｐ）細胞マーカーＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＣＲ２、及び／またはＣＤ１６の発現、
ｑ）例えば、ＲＢＣＥＶによらない送達、例えばエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して核酸でトランスフェクトされた免疫細胞上のこれらの細胞マーカーの発現と比較した、ＲＢＣＥＶ搭載核酸によるトランスフェクション後の細胞マーカーＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＣＲ２、及び／またはＣＤ１６の発現の維持の増加、
ｒ）細胞マーカーＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、及び／またはＣＤ４５Ｒの発現、
ｓ）例えば、ＲＢＣＥＶによらない送達、例えばエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して核酸でトランスフェクトされた免疫細胞上のこれらの細胞マーカーの発現と比較した、ＲＢＣＥＶ搭載核酸によるトランスフェクション後の細胞マーカーＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、及び／またはＣＤ４５Ｒの発現の維持の増加、
ｔ）例えば、ＲＢＣＥＶによらない送達、例えばエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して核酸でトランスフェクトされた免疫細胞上のこれらの細胞マーカーの発現と比較した、細胞マーカーＣＤ４４、ＣＤ６９、及び／またはＣＤ６２Ｌの発現の減少、
ｕ）上記核酸カーゴではない核酸及び／またはタンパク質の発現の増加、
ｖ）上記核酸カーゴではない核酸及び／またはタンパク質の発現の減少；
ｗ）例えば、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して核酸でトランスフェクトされた免疫細胞と比較した、細胞生存率の維持、
ｘ）例えば、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して核酸でトランスフェクトされた免疫細胞と比較した、細胞生存率の増加、
ｙ）例えば、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを使用して核酸でトランスフェクトされた免疫細胞と比較した、細胞死の危険性の減少、
ｚ）上記免疫細胞中における核酸搭載ＲＢＣＥＶの存在。
ａａ）例えば抗ＰＤ１ ｓｉＲＮＡを搭載したＲＢＣＥＶを使用した、免疫細胞の枯渇の減少、
ｂｂ）例えば抗ｍｉＲ－２９ ＡＳＯを搭載したＲＢＣＥＶを使用した、免疫細胞の活性化の増加、
ｃｃ）治療用遺伝子、例えばＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９ノックインを使用した、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の長期発現、
ｄｄ）ワクチン接種に対する抗原（例えばがん抗原）の発現
のうちの１つ以上を示す。

免疫細胞集団は、系統特異的マーカーとして使用することができる細胞特異的タンパク質、例えば分化抗原群（ＣＤ）タンパク質の存在及び数を検出することによって、同定及びキャラクタライズすることができる。かかるマーカーは、当業者に周知の技法、例えばフローサイトメトリー、マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、免疫組織化学、または免疫細胞化学を使用して検出することができる。Ｔ細胞活性化のプロセスは当業者に周知であり、例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５ｔｈ Ｅｄｎ． Ｊａｎｅｗａｙ ＣＡ Ｊｒ， Ｔｒａｖｅｒｓ Ｐ， Ｗａｌｐｏｒｔ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００１）， Ｃｈａｐｔｅｒ ８（その全体が援用される）に詳細な記載がある。

核酸の発現及び活性は、ＲＮＡレベルの定量的ＰＣＲ分析などの分野で一般的な技法を使用して、及び／またはＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、イムノブロットなどの関連タンパク質を検出するためのイムノアッセイに基づく方法によって、検出及び定量化することができる。

細胞生存率は当技術分野で周知のアッセイ、例えばＣｏｂｂＬ， ＭＡＴＥＲ ＭＥＴＨＯＤＳ ２０１３；３：２７９９及びＰｏｓｉｍｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ． ２０１４；（８３）： ５０６４５に記載されるアッセイを使用して評価することができる。

細胞死は、例えばＣｕｍｍｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００４ Ｓｅｐ １；０ １２：１０に記載されるものなどの技法を使用して測定することができる。細胞毒性は、例えば、Ｚａｒｉｔｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ （２０１１）， ９（６）：６０１－６１６（本記述をもってその全体が援用される）の総説に記載される方法のいずれか、例えば^５１Ｃｒ放出アッセイを使用して調べることができる。細胞毒性は、例えば本明細書の実施例２に記載されるｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイによっても調べることができる。

ＲＢＣＥＶ、例えば核酸が搭載されたＲＢＣＥＶの存在は、例えば標識ＲＢＣＥＶを任意且つ適宜の検出剤、例えば本明細書に記載の蛍光色素と共に使用して測定することができる。ＲＢＣＥＶの存在は、上記の送達された核酸の存在または活性を検出することによっても測定することができる。

組成物
本開示は、例えば本明細書に記載の、免疫細胞の集団すなわち複数種の免疫細胞を含む組成物を提供する。場合により、上記組成物は、外因性核酸を含む及び／もしくは発現する１種以上または複数種の免疫細胞を含む。場合により、上記組成物は、ＲＢＣＥＶによって送達された外因性核酸を含む１種以上または複数種の免疫細胞を含む。場合により、上記組成物は、核酸カーゴが搭載されたＲＢＣＥＶ（複数可）を含み、且つ／または外因性核酸を含む、１種以上または複数種の免疫細胞を含む。場合により、上記組成物は、本明細書に記載の方法によって産生された、且つ／または本明細書に記載の特徴を有する、例えばＲＢＣＥＶによって送達された核酸を発現する、１種以上の免疫細胞を含む。

場合により、免疫細胞の集団すなわち複数種の免疫細胞を含む組成物は複数種の細胞外小胞も含む。場合により、免疫細胞の集団すなわち複数種の免疫細胞自体が複数種の細胞外小胞を含む。

本明細書に記載の組成物は、本明細書で提供される単離された免疫細胞の集団を含むか、または該集団から構成されていてもよい。

場合により、本明細書に記載の方法によって産生される細胞の集団は、本発明の送達／形質導入方法に供される前の当該細胞集団と比較して、外因性の、すなわち、ＲＢＣＥＶによって送達された核酸を含む免疫細胞に富む（すなわち、外因性核酸を含む免疫細胞が、送達／形質導入方法の後に、該集団中に増加した頻度で存在する）。上記組成物は医薬組成物もしくは医薬であってもよく、または医薬組成物もしくは医薬を含んでいてもよい。上記組成物は、１種以上の免疫細胞及び／もしくは細胞外小胞、ならびに任意選択で薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含んでいてもよい。薬学的組成物は特定の投与経路による投与用に製剤化されてもよい。例えば、上記医薬組成物は、静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮内、皮下、鼻腔内、または他の投与経路用に製剤化されてもよい。

場合により、本明細書に記載の組成物はＲＢＣＥＶを含む。上記ＲＢＣＥＶにはカーゴが積載されていてもよい。上記組成物は、上記カーゴを免疫細胞に送達に使用するための組成物であってよい。

組成物は緩衝液を含んでいてもよい。組成物は防腐剤化合物を含んでいてもよい。組成物は薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。

本発明の核酸含有組成物は、無菌の生理学的に許容される担体であって、細胞中への上記核酸の導入を補助する任意の物質と共に上記核酸が分散している上記担体中で、保存及び投与されてもよい。

上記組成物の投与には、水、ＰＢＳ、エタノール、脂質などを含むさまざまな無菌溶液を使用することができる。場合により、上記核酸の濃度は、輸送効率に依存する治療用投薬量を与えるのに十分な濃度になり、該治療用投薬量は当該細胞中への輸送効率に応じたものとなる。

組成物は、凍結形態または凍結乾燥形態で提供されてもよい。

ＲＢＣＥＶによって送達された核酸を含む免疫細胞の用途
本明細書に記載のＲＢＣＥＶ及び組成物は、対象とする核酸を免疫細胞、例えばＴ細胞中に導入するために使用することができる。上記対象とする核酸を含む免疫細胞は、治療方法及び／または予防方法における用途がある。

対象における疾患／疾病の治療方法／予防方法であって、本発明の送達方法によって得られたまたは調製された、対象とする核酸を含む免疫細胞を対象に投与することを含む上記方法が提供される。また、医学上の治療方法／予防方法で使用するための、本発明の送達方法によって得られたまたは調製された、対象とする核酸を含む免疫細胞も提供される。また、疾患／疾病の治療方法／予防方法で使用するための、本発明の送達方法によって得られたまたは調製された、対象とする核酸を含む免疫細胞も提供される。また、疾患／疾病の治療方法／予防方法で使用するための医薬の製造における、本発明の送達方法によって得られたまたは調製された、対象とする核酸を含む免疫細胞の使用も提供される。上記免疫細胞を含む組成物も、上記疾患または疾病の治療方法／予防方法のために提供される。

いくつかの実施形態において、対象における疾患／疾病の治療方法／予防方法であって、核酸カーゴが搭載されたＲＢＣＥＶを含む免疫細胞を対象に投与することを含む上記方法が提供される。また、医学上の治療方法／予防方法で使用するための、核酸カーゴが搭載されたＲＢＣＥＶを含む免疫細胞も提供される。また、疾患／疾病の治療方法／予防方法で使用するための、核酸カーゴが搭載されたＲＢＣＥＶを含む免疫細胞も提供される。また、疾患／疾病の治療方法／予防方法で使用するための医薬の製造における、核酸カーゴが搭載されたＲＢＣＥＶを含む免疫細胞の使用も提供される。上記免疫細胞を含む組成物も、上記疾患または疾病の治療方法／予防方法のために提供される。

いくつかの実施形態において、対象における疾患／疾病の治療方法／予防方法であって、ＲＢＣＥＶによって送達された核酸を含む免疫細胞を対象に投与することを含む上記方法が提供される。また、医学上の治療方法／予防方法で使用するための、ＲＢＣＥＶによって送達された核酸を含む免疫細胞も提供される。また、疾患／疾病の治療方法／予防方法で使用するための、ＲＢＣＥＶによって送達された核酸を含む免疫細胞も提供される。疾患／疾病の治療方法／予防方法で使用するための医薬の製造における、ＲＢＣＥＶによって送達された核酸を含む免疫細胞の使用も提供される。上記免疫細胞を含む組成物、上記疾患または疾病の治療方法／予防方法のために提供される。

本明細書に開示の方法によって得られる免疫細胞は、免疫療法において使用されてもよい。

場合により、本開示は、養子細胞移植（ＡＣＴ）による疾患／疾病の治療方法／予防方法における、対象とする送達された核酸を含む免疫細胞の使用を企図する。

養子細胞移植は、概括的には、対象から細胞（例えば免疫細胞）を、通常は血液試料を採取し、該血液試料から上記細胞を単離することによって得るプロセスを指す。次いで、上記細胞を一般的には改変し且つ／または増殖させ、次に同一の対象（自家／自原細胞の養子移植の場合）または異なる対象（同種異系細胞の養子移植の場合）のいずれかに投与する。上記治療は、一般的には、特定の所望の特徴を有する細胞の集団を対象に与えること、または当該対象においてかかる特徴を有するかかる細胞の頻度を増加させることを目的とする。本開示において、養子移植は、細胞もしくは細胞の集団を対象に導入すること、及び／または対象における細胞もしくは細胞の集団の頻度を増加させることを目的として実施されてもよい。

いくつかの実施形態において、上記免疫細胞を単離する対象は、改変された免疫細胞が投与される対象である（すなわち、養子移植は自家細胞の養子移植である）。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞を単離する対象は、改変された免疫細胞が投与される対象とは異なる対象である（すなわち、養子移植は同種異系細胞の養子移植である）。

免疫細胞の養子移植は、例えば、Ｋａｌｏｓ ａｎｄ Ｊｕｎｅ ２０１３， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９（１）： ４９－６０、及びＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． ２０１５， Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． ２１（６）： ４８６－４９１（本記述をもって、これらの両方の全体が援用される）に記載されており。当業者は、例えば、Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ Ｊ Ｎａｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０８（７）： ｄｊｖ４３９（その全体が援用される）を参照することにより、本開示に係る細胞の養子移植のための適当な試薬及び手順を決定することができる。

いくつかの実施形態において、上記方法は、
（ａ）本開示の方法に従って対象とする核酸を免疫細胞中に導入することと、
（ｂ）上記対象とする核酸を含む免疫細胞を対象に投与することと
を含む。

いくつかの実施形態において、上記方法は、
（ａ）免疫細胞を単離することと、
（ｂ）本開示の方法に従って対象とする核酸を上記免疫細胞中に導入することと、
（ｃ）上記対象とする核酸を含む上記免疫細胞を対象に投与することと
を含む。

いくつかの実施形態において、上記方法は、
（ａ）対象から免疫細胞を単離することと、
（ｂ）免疫細胞の集団を生成／増殖させることと、
（ｃ）本開示の方法に従って、対象とする核酸を免疫細胞中に導入することと、
（ｄ）上記対象とする核酸を含む上記免疫細胞を対象に投与することと
を含む。

いくつかの実施形態において、上記免疫細胞を単離する対象は、細胞が投与される対象と同一の対象である（すなわち、養子移植は自家／自原遺伝子細胞の養子移植であってよい）。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞が単離される対象は、細胞が投与される対象とは異なる対象である（すなわち、養子移植は同種異系細胞の養子移植であってよい）。

上記方法はインビトロ法であることが好ましい。上記免疫細胞はＲＢＣＥＶとインビトロで接触させることが好ましい。

いくつかの実施形態において、上記方法は、以下、すなわち、
対象から血液試料を採取すること、
上記血液試料から免疫細胞（ＰＢＭＣ）を単離すること、
免疫細胞の集団（例えば、Ｔ細胞、樹状細胞）を生成／増殖させること、
インビトロまたはエクスビボ細胞培養で上記免疫細胞を培養こと、
上記免疫細胞を、対象とする核酸（カーゴ）を含むＲＢＣＥＶと接触させること、
上記免疫細胞を、対象とする核酸（カーゴ）を含むＲＢＣＥＶと共にインキュベートすること、
上記核酸カーゴを含む免疫細胞を収取／単離すること、
上記免疫細胞が上記核酸を発現するかどうかを判定すること、
上記核酸を含む／発現する上記免疫細胞を収取／単離すること、
上記免疫細胞が活性化／分化しているかどうかを判定すること、
活性化／分化していない上記免疫細胞を収取／単離すること、
上記ＲＢＣＥＶ及び／または対象とする核酸を含む上記免疫細胞を、インビトロまたはエクスビボ細胞培養において培養すること、
上記核酸を発現する及び／または活性化／分化していない上記免疫細胞を、インビトロまたはエクスビボ細胞培養において培養すること、
上記対象とする核酸を含む／発現する及び／または活性化／分化していない免疫細胞を、アジュバント、希釈剤、または担体と混合すること、
上記対象とする核酸を含む／発現する免疫細胞を対象に投与すること
のうちの１つ以上を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態において、上記方法は、上記免疫細胞を処理して、上記送達された核酸の発現を誘導する／亢進させること、及び／または上記送達された核酸を含む免疫細胞の増殖または生存を誘導する／亢進させることをさらに含んでいてもよい。例えば、上記核酸は、特定の物質による処理に応答して、当該核酸の発現の誘導可能な上方制御のための制御要素を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態において、処置は、エクスビボまたはインビトロでの培養中の細胞への、上記ＲＢＣＥＶの投与によるエクスビボまたはインビトロである。いくつかの実施形態において、処置は、上記ＲＢＣＥＶをインビボで免疫細胞に投与することによるインビボである。

本明細書においてＲＢＣＥＶが単数形で言及される場合（すなわち、「ａ／ｔｈｅ ＲＢＣＥＶ」）、かかるＲＢＣＥＶの複数形／集団も企図されることを理解されたい。

場合により、上記免疫細胞は、ＣＡＲＴ細胞療法及びＴ細胞受容体療法に関連するものなどの、Ｔ細胞療法に関連する治療方法に有用である。

上記方法は、疾患／疾病の発症／進行を軽減する、疾患／疾病の症状を緩和する、または疾患／疾病の病理を軽減するのに有効である可能性がある。上記方法は、上記疾患／疾病の進行を防止する、例えば、上記疾患／疾病の悪化を防止する、またはその発症速度を遅延させるのに有効である可能性がある。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記疾患／疾病の改善、例えば、上記疾患／疾病の症状の軽減、または上記疾患／疾病の重症度／活動性の何らかの他の関連事象の軽減につながる可能性がある。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記疾患／疾病の後期（例えば、慢性段階または転移）の発症を予防する可能性がある。

上記免疫細胞及び／または上記細胞外小胞は治療用カーゴを含んでいてもよい。上記治療用カーゴは、標的細胞中の標的遺伝子と相互作用するための非内因性物質であってよい。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法及び免疫細胞は、標的遺伝子に関連する障害に罹患している対象を治療するのに有用であり、この方法は、ＲＢＣＥＶによって送達された核酸を含む有効量の免疫細胞を上記対象に投与するステップを含む。上記標的遺伝子は、免疫細胞、例えばＴ細胞によって発現される遺伝子であってよい。上記核酸は、上記標的遺伝子の発現を阻害するもしくは亢進させてもよく、または特定の遺伝子をサイレンシングする遺伝子編集を促進してもよい。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療方法は、核酸カーゴ由来のタンパク質またはペプチドの発現による対象における疾患の治療を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療方法は、核酸カーゴの活性を介してタンパク質またはペプチドの発現を阻害することによる、対象における疾患の治療を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法及び免疫細胞は、機能不全の免疫細胞、例えば機能不全のＴ細胞に関連する障害に罹患している対象を治療するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法及び免疫細胞は、対象における免疫応答を亢進させる、改善する、及び／または向上させるのに有用である。

場合により、本明細書に開示の方法及び免疫細胞は、遺伝性疾患、炎症性疾患、がん、自己免疫疾患、心血管疾患、または胃腸疾患の治療に特に有用である。場合により、上記障害は、サラセミア、鎌状赤血球貧血、または遺伝的代謝障害から選択される遺伝性障害である。場合により、上記細胞外小胞または免疫細胞は、肝臓、骨髄、肺、脾臓、脳、膵臓、胃、または腸の障害を治療するのに有用である。

特定の態様において、上記免疫細胞はがんの治療に有用である。本明細書に開示の免疫細胞は、がん細胞の成長または増殖を阻害するのに有用である可能性がある。上記がんは、白血病、リンパ腫、または骨髄腫などの液体癌または血液癌であってもよい。他の場合において、上記がんは、乳癌、肺癌、肝臓癌、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、腎臓癌、または神経膠腫などの固形癌である。場合により、上記がんは、肝臓、骨髄、肺、脾臓、脳、膵臓、胃、または腸に位置する。

上記核酸は、標的遺伝子の発現を阻害するもしくは亢進させてもよく、または遺伝子編集を行って特定の遺伝子をサイレンシングしてもよい。

本明細書に記載の免疫細胞及び組成物は、全身投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、非経口投与、静脈内投与、動脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、及び経鼻投与を含む、但しこれらに限定されない多くの経路によって投与されてもよく、上記経路による投与用に製剤化されてもよい。上記免疫細胞は、腫瘍内投与、腹腔内投与、または静脈内投与から選択される経路によって投与されることが好ましい。上記ＲＢＣＥＶは、経口投与、経鼻投与、吸入、全身投与、静脈内投与、腹腔内投与、非経口投与、動脈内投与、皮内投与、皮下投与、または筋肉内投与から選択される経路によって投与されることが好ましい。医薬及び組成物は、流体または固体の形態で製剤化されてもよい。流体製剤は、ヒトまたは動物の身体の選択された領域への注射による投与用に製剤化されてもよい。あるいは、流体製剤は、吸入用にエアゾール化されてもよい。

投与は、好ましくは「治療有効量」で行われ、この治療有効量は、個体に有益であるために十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与の速度及び時間経過は、治療を受ける疾患の性質及び重症度に依存する。投薬量などの決定などの治療薬の処方は、一般の開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、通常、治療を受ける障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び医師に公知の因子を考慮する。上述の技法及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２０００， ｐｕｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓに記載されている。

本明細書に記載の免疫細胞は、治療を受ける疾病に応じて、同時にまたは逐次的にのいずれかで、単独でまたは他の治療薬との併用で投与されてもよい。

本明細書に記載のカーゴが搭載された細胞外小胞を使用して、上記カーゴを標的細胞に送達してもよい。場合により、上記方法はインビトロ法である。上記標的細胞は、組織常在性免疫細胞などの免疫細胞である。例えば、上記組織常在性免疫細胞は、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、Ｔ細胞、またはＢ細胞などの、組織常在性白血球であってよい。

対象
本開示の態様に係る対象は、任意の動物またはヒトであってよい。上記対象は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。上記対象は非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒトである。上記対象は男性であっても女性であってもよい。上記対象は患者であってもよい。治療的な使用は、ヒトまたは動物（獣医用途）において行われてもよい。

対象は、治療を要する疾患または疾病と診断されていてもよく、かかる疾患／疾病を有する疑いがあってもよく、またはかかる疾患／疾病を発症する／これらに罹患する危険性があってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、かかる疾患／疾病の特定のマーカーのキャラクタリゼーションに基づいて、本発明の方法に係る治療に対して選択されてもよい。

本発明は、記載された態様及び好ましい特徴の組み合わせを含むが、但し、かかる組み合わせが明らかに許容できないか、または明示的に回避されている場合はこの限りではない。

本発明を上記の例示的な実施形態に関連して説明してきたが、この開示が与えられれば、当業者であれば多くの等価の改変及び変形が明らかとなろう。したがって、上記の本発明の例示的な実施形態は例示的であり、限定的ではないと考えらよう。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、記載された実施形態に対するさまざまな変更を行うことができる。

如何なる疑義を避けるために、本明細書に記載されている理論的な説明は、読者の理解を深めることを目的として提供される。発明者らは、これらの理論的説明のいずれによっても拘束されることを望むものではない。

本明細書で使用するいずれの節の見出しも、構成上の目的のみのためのものであり、記載される内容を限定するものとして解釈されるべきものではない。

後に続く特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上別段の必要性がない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、及び「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」などの変化形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群、但し、いずれの他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群も除外するものではないことを含むことを意味すると理解されよう。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈により明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書では範囲は、「約」１つの特定の値から、及び／または「約」別の特定の値までとして表現されてもよい。かかる範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から及び／または他の特定の値までを含む。同様に、前置詞「約」を使用して値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。数値に関する用語「約」は任意であり、且つ例えば±１０％を意味する。

本明細書に核酸配列が開示されている場合、その逆相補体も明示的に企図される。

本明細書に記載の方法は、好ましくはインビトロで実施されてもよい。用語「インビトロ」とは、培養中の細胞を用いて行われる手順を包含することを意図し、用語「インビボ」とは、インタクトな多細胞生物を用いた／該生物上での手順を包含することを意図する。

ここで、添付の図面を参照して、本発明の態様及び実施形態を例として説明する。当業者であればさらなる態様及び実施形態は明らかであろう。この本文で言及されているすべての書面は、本明細書に援用される。

実施例１
材料及び方法
マウスＴ細胞の単離
脾臓をＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）から採取し、均質化し、コラゲナーゼＩＶで処理して解離細胞を得た。ＡＣＫ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して赤血球を除去した。残った細胞を４℃、３５０×ｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ ＢＳＡ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））に再懸濁させた。Ｐａｎ ＴＣｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ,Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＴ細胞を濃縮した。バルクの単離細胞を、３７℃及び５％ ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ中で培養した。

ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
全血試料を、インフォームドコンセントと共に健康なドナーから得た（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ ｏｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ）。遠心分離を使用して血漿及び赤血球を分離した。白血球フィルターチャンバーからの白血球濃縮血をバックフラッシュし、ＥＤＴＡを含むＰＢＳで希釈した。血液試料をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に重層した。４℃、４００×ｇで３０分間遠心分離した後、血漿とフィコールとの間の界面層からＰＢＭＣを収取した。単離した細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ中、３７℃、５％ ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で培養するか、またはさらなる使用に備えて、１０％ ＤＭＳＯ及び９０％ ＦＢＳを含む培地中で凍結させた。

ヒトＴ細胞の単離
ヒトＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を、それぞれ抗ヒトＣＤ４及びＣＤ８磁気ビーズを使用した正の選択によってＰＢＭＣから単離した。低分子ＲＮＡトランスフェクションのために、単離したＣＤ８ Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７、及び１％ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ中、３７℃、５％ ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で培養した。ＲＮＡトランスフェクションのために、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を、１０％ ＦＢＳ、２００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５、１％ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、及び１×プラスモシンを含むＲＰＭＩ中で培養した。

単球由来樹状細胞の生成
ＰＢＭＣを、１０％ ＦＢＳ及び０．１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０に再懸濁させた。６時間後に、接着細胞（単球）をＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄し、１０００Ｕ／ｍｌヒトＧＭ－ＣＳＦ及び５００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ－４を補充した完全ＲＰＭＩ １６４０培地と共にインキュベートした。５日後に、培地を、５０ｎｇ／ｍｌヒトＴＮＦα及び１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１βを含有する完全ＲＰＭＩ １６４０と交換した。７日目に、緩く接着したＤＣを回収し、ＦＡＣＳを使用してＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の発現を分析した。

ＲＢＣＥＶの精製
ＲＢＣＥＶを、本発明者らの以前の研究（Ｗａｑａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）に従い、わずかな変更を加えて精製した。簡単に説明すれば、白血球と血漿を完全に除去した。ＲＢＣをＲＢＣ緩衝液で希釈した（１：１）。１μＬの１０ｍＭカルシウムイオノフォアを１ｍＬのＲＢＣ溶液に添加し、細胞を３７℃で終夜インキュベートした。細胞をペレット化し、高速で遠心分離することにより（６００×ｇで２０分間、１，６００×ｇで１５分間、及び３，２６０×ｇで１５分間）上清を収取した。上清を０．４５μｍの膜を通してろ過し、その後ＳＷ３２ローターを使用し、４℃、１００，０００×ｇで７０分間遠心分離した。ペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、続いて６０％スクロースクッション上に積載し、ＳＷ３２ローター中、４℃、１００，０００×ｇで１６時間超遠心分離した。ＲＢＣＥＶを界面で収取し、ＰＢＳで希釈し、１００，０００×ｇで７０分間最終的な洗浄を行った。ＲＢＣＥＶをＰＢＳで希釈した。ＲＢＣＥＶの各バッチから試料を採取し、粒子濃度（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）、タンパク質濃度（ＢＣＡアッセイ）、及びヘモグロビン濃度を測定した。

ＲＢＣＥＶの標識化及び取り込みアッセイ
１ｍｇのＲＢＣＥＶを２０μＭ ＣＦＳＥ蛍光色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に３７°Ｃで１時間インキュベートした。２１，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離することにより、過剰な色素を除去した。ＲＢＣＥＶペレットをＰＢＳに再懸濁させ、ｑＥＶオリジナルのＩｚｏｎカラム（Ｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に載置した。ＲＢＣＥＶ画分を収取し、２１，０００×ｇで遠心分離した。ＲＢＣＥＶペレットをＰＢＳに再懸濁させ、ヘモグロビンアッセイキット（Ａｂｃａｍ）を使用して定量化した。

１００μｇのＣＦＳＥ標識ＲＢＣＥＶを、３００，０００細胞のマウス脾臓Ｔ細胞またはヒトＰＢＭＣ、または５００，０００細胞の樹状細胞と共に、５００μＬの培地中、３７℃、５％ ＣＯ_２の加湿インキュベーター内でインキュベートした。２４時間後または４８時間後に細胞を収取し、４℃、３５０×ｇで５分間遠心分離することによりＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。次に、処理した細胞をフローサイトメトリー分析に供し、ＣＦＳＥシグナルを検出した。

ＲＢＣＥＶ中へのＲＮＡまたはＤＮＡの搭載
トランスフェクション試薬またはエレクトロポレーションを使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはｍｉＲＮＡ模倣物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をＲＢＣＥＶ中に搭載した。エレクトロポレーションに関しては、７５μｇ ＲＢＣＥＶを、氷上で１０分間、１００μＬ ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）中で４００ｐｍｏｌのＡＳＯまたはｍｉＲＮＡ模倣物と混合した。この溶液をエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）中に充填し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、２５０Ｖ、１００μＦ、及び指数電流でエレクトロポレーションを行った。次に、搭載したＥＶを３００，０００細胞のＣＤ８ Ｔ細胞と共に２４時間インキュベートし、その後新たな培地を添加した。トランスフェクションに関しては、１μｇ ＡＳＯ（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＧｅｎｅｓＰｈａｒｍａ）、ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、またはＧＦＰ－ＭＣプラスミド（Ｃａｒｍｉｎｅ）を２．５μｌ トランスフェクション試薬と混合し、室温で２０分間インキュベートし、次いで５０μｇ ＲＢＣＥＶと共に室温で３０分間、振とうしながらインキュベートした。その後、遊離ＲＮＡ及びトランスフェクション試薬を、サイズ排除クロマトグラフィーまたは遠心分離を使用して洗い流した。１００μｇのＲＮＡ／ＤＮＡを搭載したＥＶを３００，０００細胞と共にインキュベートした。４８時間後に細胞を洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。

対照として、３００，０００細胞のＣＤ８ Ｔ細胞を、４００ｐｍｏｌ ＦＡＭ標識ＮＣ－ＡＳＯで、それぞれＡｍａｘａ Ｔ細胞ヌクレオフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）またはＮｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）を製造元のプロトコルに従って使用して、ヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションを行った。簡単に説明すれば、ヌクレオフェクションに関しては、９００，０００細胞を１００μｌ ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション試薬溶液及び１，２００ｐｍｏｌ ＦＡＭ－ＮＣ－ＡＳＯと混合した。次にこの細胞溶液をキュベットに充填し、高生存率用のプログラムＵ－０１４を使用してヌクレオフェクションを行った。ヌクレオフェクション後に、細胞を３７℃の事前に調整した培地に再懸濁させた。エレクトロポレーションに関しては、９００，０００細胞を、１，２００ｐｍｏｌ ＦＡＭ－ＮＣ－ＡＳＯを含む１００μｌの緩衝液Ｔに再懸濁した。細胞を１００μｌのＮｅｏｎチップに充填し、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後に、細胞を抗生物質を含まない事前に調整した完全培地に再懸濁させた。２４時間及び１２０時間時点で細胞を採取して、フローサイトメトリー分析に供した。７２時間後に、１００，０００細胞のＣＤ８ Ｔ細胞をＡＳＯ／ｍｉＲＮＡを搭載したＲＢＣＥＶと共にインキュベートし、処理した細胞も採取して、ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲに供した。１２０時間後に、ＲＢＣＥＶで処理した細胞を抗ＥＯＭＥＳ抗体及び抗ＴＢＥＴ抗体で染色し、フローサイトメトリー分析に供した。

ＲＢＣＥＶを使用したマウス脾細胞へのｍＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの送達
コラゲナーゼＩＶを使用し、３７℃で３０分間、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から脾細胞を分離した。ＲＢＣＥＶにｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡまたはＧＦＰ－ＭＣプラスミドを搭載し、上記のように洗浄した。０．５ｍｇの搭載されたＲＢＣＥＶを脾細胞と４８時間インキュベートした。脾細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１０３、ＮＫ１．１、ＣＤ８、及びＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄｓ）を認識する蛍光抗体と共にインキュベートし、ＦＡＣＳ分析に供した。

結果
マウスＴ細胞は活性化することなくヒト由来ＲＢＣＥＶを容易に取り込む
ＲＢＣＥＶの核酸をＴ細胞に送達する潜在能力を調べるために、マウスの脾臓からＣＤ３＋ Ｔ細胞を分離し、ＣＦＳＥ標識ＲＢＣＥＶと共にインキュベートした。ＦＡＣＳを使用して細胞中のＣＦＳＥを分析した（図１Ａ）。４８時間後に、すべての細胞がＣＦＳＥ陽性になった（図１Ｂ）。ＲＢＣＥＶで処理したマウスＴ細胞中のＴ細胞活性化マーカー、ＣＤ４４及びＣＤ６９を調べた。未処理の試料と比較して、ＲＢＣＥＶ処理後もＣＤ４４＋及びＣＤ６９＋細胞の割合は変化しなかった（図１Ｃ）。ＲＢＣＥＶが機能性カーゴを送達する能力を検証するために、ｍｉＲ－１２５ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＲＢＣＥＶ中に搭載し、次いで搭載したＲＢＣＥＶをマウスＣＤ３＋ Ｔ細胞と共にインキュベートした（図１Ｄ）。２４時間後に、ｍｉＲ－１２５ｂ ＡＳＯを搭載したＲＢＣＥＶで処理したＣＤ３＋ Ｔ細胞において、ｍｉＲ－１２５ｂのレベルが有意に低下した（図１Ｅ）。したがって、ＲＢＣＥＶは、マウスＴ細胞によって、活性化することなく容易に取り込まれ、ＲＢＣＥＶ中の上記カーゴは取り込み後も機能性を維持する。

ＲＢＣＥＶはＴ細胞を含むヒトＰＢＭＣにＲＮＡ ＡＳＯを送達する
ヒトＰＢＭＣをＣＦＳＥ標識ＲＢＣＥＶと共にインキュベートして、ＲＢＣＥＶの取り込みを試験した（図２Ａ）。４８時間後に、ＦＡＣＳで分析して、全ＰＢＭＣの約８０％がＣＦＳＥ陽性となった（図２Ｂ）。未処理の対照と比較して約９９％の細胞がＣＦＳＥ陽性になり、ＣＤ１４＋単球は、ＰＢＭＣの亜集団の中で、ＲＢＣＥＶの最も強力なレシピエントであった（図２Ｂ）。ＣＤ１９＋ Ｂ細胞及びＣＤ３＋ Ｔ細胞も、それぞれ８６％及び７１％の割合でＲＢＣＥＶを取り込んだ（図２Ｂ）。

さらに、ＲＢＣＥＶにＣｙ５標識非標的化ＡＳＯ（Ｃｙ５－ＮＣ－ＡＳＯ）を搭載し、次いでヒトＰＢＭＣと共にインキュベートした（図２Ｃ）。４８時間後に、ＰＢＭＣの約７０％がＣｙ５陽性になった（図２Ｄ）。上記細胞を、Ｃｙ５－ＮＣ－ＡＳＯ及び搭載試薬のみと共に、またはＲＢＣＥＶと未搭載のＣｙ５－ＮＣ－ＡＳＯと共にインキュベーションを行っても、未処理の試料と比較して、ヒトＰＢＭＣ中のＣｙ５シグナルは増加しなかった（図２Ｄ）。これらの結果は、ＲＢＣＥＶが、Ｔ細胞集団を含むヒトＰＢＭＣに、ＡＳＯを効果的に送達することができることを示している。

ＲＢＣＥＶは他のトランスフェクション方法よりも効果的にヒトＣＤ８ Ｔ細胞にＲＮＡを送達する
ＲＢＣＥＶによるＲＮＡの送達の効率をリンパ球の一般的なトランスフェクション法と比較するために、ＲＢＣＥＶ、細胞エレクトロポレーション、またはヌクレオフェクションを使用して、ＦＡＭ標識ＡＳＯをヒトＣＤ８ Ｔ細胞に送達した（図３Ａ）。トランスフェクションの２４時間後に、市販のＮｅｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ）及びＡｍａｘａキット（Ｌｏｎｚａ）をそれぞれ使用したＴ細胞のエレクトロポレーション及びヌクレオフェクションと比較して、ＦＡＭ－ＮＣ－ＡＳＯを搭載したＲＢＣＥＶで処理した細胞の９９．４％がＦＡＭシグナルに対して強く陽性であった（図３Ｂ）。さらに、他のトランスフェクション方法では、トランスフェクション後２４時間で細胞中のＦＡＭシグナルが低下した（１７～３２％のＦＡＭ＋）だけでなく、これらのシグナルは５日後には徐々に減少した。ヌクレオフェクションを行った細胞のほとんど及びエレクトロポレーションを行った細胞の一部は、これらの処理の結果として死に至った。一方、ＲＢＣＥＶで処理したＣＤ８ Ｔ細胞は良好に生存し、ＦＡＭシグナルを最大で５日間維持した（８９．４％）（図３Ｃ）。したがって、ＲＢＣＥＶは、ヒトリンパ球中へのＲＮＡの送達において、ヌクレオフェクション法及びエレクトロポレーション法よりも長期間にわたって有効である。

ＲＢＣＥＶによるＣＤ８ Ｔ細胞中への機能性ＡＳＯ及びｍｉＲＮＡ模倣体の送達
ｍｉＲ－２９ａは、エフェクターＴ細胞機能の重要な調節因子である。ｍｉＲ－２９ａは成人ＣＤ８ Ｔ細胞中には豊富に含まれているが、新生児のＣＤ８ Ｔ細胞中では低レベルである^７。成人ＣＤ８ Ｔ細胞中のｍｉＲ－２９ａを抑制する実験、または臍帯血由来ＣＤ８ Ｔ細胞中のこのｍｉＲＮＡを過剰発現させる実験を、それぞれ、ＲＢＣＥＶ中のｍｉＲ－２９ａ ＡＳＯまたはｍｉＲ－２９ａ模倣体を使用して実施した（図４Ａ）。７２時間に後、ｍｉＲ－２９ ＡＳＯを含むＲＢＣＥＶで処理した成人ＣＤ８ Ｔ細胞中では細胞のｍｉＲ－２９ａが有意に下方制御されたのに対し、ｍｉＲ－２９ａの標的であるＥＯＭＥＳ及びＴＢＥＴは上方制御された（図４Ｂ－Ｃ）。一方、臍帯血ＣＤ８ Ｔ細胞中のｍｉＲ－２９ａレベルは、ｍｉＲ－２９ａ模倣体を搭載したＲＢＣＥＶでの処理後に、ＮＣ模倣体で処理した対照と比較して約４０００倍増加した（図４Ｄ）。本発明者らはまた、ｍｉＲ－２９ａの過剰発現の結果として、ＥＯＭＥＳ及びＴＢＥＴの優位な下方制御も観測した（図４Ｅ）。

フローサイトメトリーによる分析により、一貫して、ｍｉＲ－２９ａ ＡＳＯを搭載したまたは模倣体を搭載したＲＢＣＥＶでの１２０時間の処理後に、ＥＯＭＥＳ及びＴＢＥＴの細胞レベルが、それぞれ成人ＣＤ８ Ｔ細胞中で増加し、臍帯血ＣＤ８ Ｔ細胞中で減少することが示された（図５Ｂ、Ｄ）。一般的なトランスフェクション方法では、多くの場合、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞は活性化及び分化する。しかし、本発明者らは、成人及び臍帯血のナイーブＣＤ８ Ｔ細胞の両方が、ＲＢＣＥＶ処理後も不活性且つ未分化のままであることを見出した（図５Ｃ、Ｅ）。したがって、ＲＢＣＥＶは、細胞を活性化または分化させることなく、機能性ＲＮＡをヒトナイーブリンパ球に効果的に移送することが可能である。

ＲＢＣＥＶによるリンパ球への機能性ｍＲＮＡの送達
ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをＲＢＣＥＶ中に搭載し、搭載されたＲＢＣＥＶを単離したヒトリンパ球中に添加した（図６Ａ）。２４時間後に、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方において、ＲＮＡ搭載ＲＢＣＥＶで処理した細胞からｍＣｈｅｒｒｙシグナルが検出された（図６Ｂ～Ｃ）。さらに、細胞は送達後も高い生存率を維持していた（図６Ｄ）。したがって、ＲＢＣＥＶはｍＲＮＡをリンパ球に送達する能力をもつ。

ＲＢＣＥＶによるヒトリンパ球中への機能性プラスミドの送達
ＧＦＰ配列を含むミニサークルプラスミド（ＭＣ－ＧＦＰ）をＲＢＣＥＶ中に搭載し、この混合物を活性化ヒトリンパ球に添加した（図７Ａ）。７２時間後に、プラスミドを搭載したＲＢＣＥＶで処理したＣＤ３陽性細胞からＧＦＰシグナルが検出された（図７Ｂ～Ｃ）。さらに、細胞は送達後も高い生存率を維持していた（図７Ｄ）。要約すると、ＲＢＣＥＶは、リンパ球中に種々の種類の核酸を非常に効率的に送達する。

ＲＢＣＥＶを使用したヒトリンパ球へのＣａｓ９ ｍＲＮＡの送達
Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の送達の実現可能性を試験するために、本発明者らは、ＲＢＣＥＶにＨＡタグ付きＣａｓ９ ｍＲＮＡを搭載し、それらをＣＤ４＋及びＣＤ８＋ヒトＴ細胞と共に２４～４８時間インキュベートした（図８Ａ）。本発明者らは、ＨＡタグの免疫染色を使用して、２４～４８時間後に約５０％のＣＤ４＋ Ｔ細胞の核中でＣａｓ９－ＨＡタンパク質が発現することを見出した（図８Ｂ～Ｃ）。同様のことがＣＤ８＋ Ｔ細胞においても観測されたが、Ｃａｓ９－ＨＡは当初、２４時間時点で約６０％の細胞中に見られ、４８時間時点では約３８％の細胞にのみ見られた（図８Ｄ-Ｅ）。このデータは、ＲＢＣＥＶが、核内でＣａｓ９タンパク質に翻訳されるＣａｓ９ ｍＲＮＡを送達したことを示唆している。したがって、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集に使用することがきる。

ＲＢＣＥＶはヒト樹状細胞によって取り込まれる
ＲＢＣＥＶが樹状細胞に取り込まれるかどうかを試験するために、本発明者らは、ヒトＰＢＭＣを細胞培養プレートに接着させ、これを、サイトカインカクテルを使用して１週間、成熟樹状細胞へと分化させた。ＦＡＣＳ分析により、細胞の１５～２８％において、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０、及びＣＤ８６を含む成熟樹状細胞マーカーが発現していることが明らかになった（図９Ａ）。ＣＦＳＥ標識ＲＢＣＥＶとのインキュベーションによって、ＣＦＳＥ陽性細胞の割合に基づいて、２４時間後には上記樹状細胞の８６％が取り込んでおり、４８時間後には１００％が取り込んでいた（図９Ｂ）。このデータは、樹状細胞がＲＢＣＥＶを容易に取り込み、したがってＲＢＣＥＶを使用して、免疫療法のために樹状細胞に治療用分子を送達することが可能であることを示唆している。

ＲＢＣＥＶを使用したマウス脾細胞へのｍＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの送達
ＲＢＣＥＶの、脾臓中の免疫細胞に核酸ペイロードを送達する潜在能力を調べるために、本発明者らは、免疫適格性Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙ－ｍＲＮＡまたはＧＦＰ－ＭＣを搭載したＲＢＣＥＶと共にインキュベートした。４８時間後に、これらの細胞をＰＢＳで洗浄し、いくつかの免疫細胞集団を認識する抗体と共にインキュベートした。ｍＣｈｅｒｒｙの発現が、全脾細胞の１３．８％、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１０３＋ＤＣの２．６５％、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ＤＣの２１．２％、ＮＫ細胞の５．６％、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の１０％、及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の８％に見られた（図１０）。ＧＦＰの発現は、全脾細胞の５％、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１０３＋ＤＣの５．４％、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ＤＣの３．５％、ＮＫ細胞の０．３％、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の１４％、及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の７．２％で見られた（図１１）。これらのデータは、ＲＢＣＥＶが導入遺伝子発現のために脾臓中の免疫細胞に核酸を送達することが可能であることを示唆している。

実施例２
Ｔリンパ球におけるＲＮＡ搭載ＲＢＣＥＶによるゲノム編集
本発明者らは、ＲＢＣＥＶに、Ｃａｓ９－ＨＡ ｍＲＮＡ及びｍｉｒ－１２５ｂ２遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、または陰性対照としての、ＲＡＢ１１ａ遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡを搭載した（図１２Ａ）。２４時間後に細胞を採取して、ＲＴ－ｑＰＣＲに供して成熟ｍｉＲ－１２５ｂレベルを定量化した。Ｃａｓ９－ＨＡ ｍＲＮＡ及び１２５ｂ ｓｇＲＮＡを種々の濃度で使用してｍｉｒ－１２５ｂ２遺伝子座を標的とすることによって、ｍｉＲ－１２５ｂの細胞レベルが有意に減少した一方、未処理の試料と比較して、ＲＡＢ１１ａを標的とするｓｇＲＮＡで処理した細胞では効果が観測されなかった（図１２Ｂ）。このデータは、ＲＮＡを搭載したＲＢＣＥＶを使用してゲノム編集を行うことができることを意味する。

ＲＢＣＥＶを介したマウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）中へのｍＲＮＡの送達
本発明者らは、６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの大腿骨から骨髄細胞を採取し、２％ ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３Ｌ、及び５ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦを補充したＩＭＤＭ中で１５日間培養した。フローサイトメトリー分析により、マウス骨髄細胞の樹状細胞への分化が確認された（図１３Ｂ）。上記細胞の約５％が従来の樹状細胞１型（ｃＤＣ１）である一方、上記細胞の約２４％が形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）に成熟した（図１３Ｂ）。分化したＢＭＤＣを、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを搭載したＲＢＣＥＶと共にインキュベートした（図１３Ａ）。２４時間後に、本発明者らはＢＭＤＣを収取し、フローサイトメトリーを使用してｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を分析した。全ＢＭＤＣの約２６％がｍＣｈｅｒｒｙ陽性であった（図１３Ｃ）。従来の樹状細胞１型（ｃＤＣ１）がｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の中の最も高い割合（７４．８％）を占めていた一方、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の５分の１もｍＣｈｅｒｒｙに対して陽性であった（図１３Ｃ）。これらの結果は、ＲＢＣＥＶがＤＣ中へのＲＮＡ送達のプラットフォームとしても機能する可能性があることを示している。

免疫細胞への低分子ＲＮＡのインビボ送達
ＡＦ６４７蛍光で標識した非標的化ｓｉＲＮＡをＲＢＣＥＶに搭載して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける上記ＥＶの肺送達によるインビボでの上記ＲＮＡの取り込みを追跡した（図１４Ａ）。肺へのＲＢＣＥＶの投与の２４時間後に、本発明者らは肺細胞を分離し、フローサイトメトリーを使用して種々の免疫細胞型を分析した。全体として、肺細胞の約７．３％がＡＦ６４７シグナルに関して陽性であった（図１４Ｂ）。免疫細胞の中で、マクロファージの約７．４％がＲＮＡを搭載したＥＶを取り込んでいた。樹状細胞及び好中球も、標識したＥＶを匹敵する割合（それぞれ１２％及び１５．２％）で取り込んでいた（図１４Ｃ）。肺胞マクロファージは、全細胞の半数以上（５６．４％）がＡＦ６４７シグナルに対して陽性であり、ＲＮＡが搭載されたＥＶの有力なレシピエントであった（図１４Ｃ）。まとめると、これらのデータは、本発明者らが、ＲＢＣＥＶを使用して、インビボで組織常在性免疫細胞にＲＮＡを送達することができることを示唆している。

参考文献
本発明及び本発明が関係する技術水準をより完全に説明及び開示するために、多数の刊行物が上記に引用されている。これらの参考文献の完全な引用を以下に示す。これらの参考文献のそれぞれの全体が本明細書に援用される。
１．Ｓａｄｅｌａｉｎ， Ｍ．， Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． ＆ Ｒｉｄｄｅｌｌ， Ｓ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ５４５， ４２３ （２０１７）．
２．Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｑｉｕ， Ｓ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ． ＆ Ｃｈｅｎ， Ｗ． Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＤＮＡ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８， ４－４ （２０１８）．
３．Ｒｏｔｈ， Ｔ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗｉｔｈ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ５５９， ４０５－４０９ （２０１８）．
４．ｖａｎ Ｎｉｅｌ， Ｇ．， Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ， Ｇ． ＆ Ｒａｐｏｓｏ， Ｇ． Ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｌｉｇｈｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９， ２１３ （２０１８）．
５．Ｍｅｌｄｏｌｅｓｉ， Ｊ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｅｃｔｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ２８， Ｒ４３５－Ｒ４４４ （２０１８）．
６．Ｕｓｍａｎ， Ｗ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ９， ２３５９ （２０１８）．
７．Ｗｉｓｓｉｎｋ， Ｅ． Ｍ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｎ． Ｌ．， Ｓｐｅｋｔｏｒ， Ｒ．， Ｒｕｄｄ， Ｂ． Ｄ． ＆ Ｇｒｉｍｓｏｎ， Ａ． ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｔａｒｇｅｔｓ Ａｒｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ Ａｄｕｌｔ ａｎｄ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ８＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１， １０１７－１０３０ （２０１５）．
標準的な分子生物学技法に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ．Ｗ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ３ ｅｄ． ２００１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。

Claims (19)

1. 免疫細胞中への核酸の送達方法であって、前記免疫細胞を、核酸カーゴを搭載した赤血球細胞外小胞（ＲＢＣＥＶ）と共にインキュベートすることを含む前記方法。
2. 免疫細胞への核酸の形質導入方法であって、前記免疫細胞を、核酸カーゴを搭載したＲＢＣＥＶと共にインキュベートすることを含む前記方法。
3. 前記免疫細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記免疫細胞がＣＤ３＋細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記免疫細胞が樹状細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
7. インビトロまたはエクスビボで行われる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記ＲＢＣＥＶに核酸カーゴを搭載するステップを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記搭載するステップがインビトロまたはエクスビボで行われる、請求項８に記載の方法。
10. 前記核酸カーゴがＲＮＡを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記核酸カーゴが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはプラスミドからなる群より選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 対象から免疫細胞を単離する初期ステップを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 核酸カーゴを搭載した前記ＲＢＣＥＶを含む前記免疫細胞を対象に投与することを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 核酸カーゴを搭載したＲＢＣＥＶの使用であって、免疫細胞中に前記核酸を送達するための前記使用。
15. 外因性核酸を含む免疫細胞であって、前記核酸がＲＢＣＥＶを使用して送達されるか、または送達されている、前記免疫細胞。
16. 外因性核酸を含む１種以上の免疫細胞を含む組成物であって、前記核酸がＲＢＣＥＶを使用して送達されるか、または送達されている前記組成物。
17. 治療有効量の、請求項１５に記載の免疫細胞または請求項１６に記載の組成物を、治療を必要とする対象に投与することを含む治療方法。
18. 治療方法に使用するための、請求項１５に記載の免疫細胞または請求項１５に記載の組成物。
19. 疾患または障害の治療のための医薬の製造における、請求項１５に記載の免疫細胞または請求項１６に記載の組成物の使用。

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