CN113748126A - 鉴定免疫调节基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于鉴定免疫调节基因的方法。在一些实施方案中，该方法包括筛选候选基因，该方法包括：a)在多于一个免疫细胞中表达外源细胞受体或其功能部分；b)将i和ii引入所述多于一个免疫细胞中：i.指导多核酸或编码所述指导多核酸的核酸，其中所述指导多核酸靶向所述候选基因；和ii.外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸；从而产生包含所述候选基因中的基因组破坏的多于一个工程化免疫细胞；c)使所述多于一个工程化免疫细胞与表达所述外源细胞受体或其功能部分的同源抗原的多于一个细胞接触，从而进行体外测定；并且d)确定所述体外测定的读取。

Description

鉴定免疫调节基因的方法
相关申请
本申请要求于2018年11月30日提交的美国临时专利申请第62/773,767号和于2019年9月23日提交的美国临时专利申请第62/904,283号的权益，这些申请的每个的公开内容在此通过引用以其整体并入。
序列表
本申请包括序列表，所述序列表已以ASCII格式电子地提交并且通过引用特此以其全文并入。于2019年11月13日生成的所述ASCII副本被命名为47533-743_601_SL.txt并且大小为1,234字节。
背景
针对癌细胞的免疫应答对于限制癌症的生长或扩散可以是重要的。然而，一些癌细胞可以负面调节免疫应答，这可以有助于癌细胞的存活和扩散。免疫应答可以通过涉及免疫调节基因的机制被下调。免疫调节基因的鉴定可以导致对于癌症、自身免疫性疾病等的新治疗的开发。然而，需要新的鉴定免疫调节基因的高通量方法。
概述
在一方面，本文描述了筛选多于一个单个候选基因的方法，所述方法包括：a)在免疫细胞的多于一个单独群体中表达外源细胞受体或其功能片段，其中每个群体包含多于一个免疫细胞；b)将CRISPR系统引入所述免疫细胞的单独群体中的每一个中，所述CRISPR系统包含：i)指导核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述免疫细胞的单独群体中的每一个是不同的；和ii)外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸；从而产生工程化免疫细胞的多于一个单独群体，所述工程化免疫细胞包含所述单个候选基因中的基因组破坏，其中所述基因组破坏抑制所述单个候选基因的表达；c)进行体外测定，包括在体外使所述多于一个工程化免疫细胞与表达所述外源细胞受体或所述功能片段的同源抗原的多于一个细胞接触；并且d)从所述体外测定中获得读取，从而确定抑制所述单个候选基因的表达的所述基因组破坏对所述工程化免疫细胞的多于一个单独群体的影响。
在一些实施方案中，所述读取包括确定所述工程化免疫细胞的多于一个单独群体中的每一个的细胞溶解活性水平。在一些实施方案中，所述细胞溶解活性水平通过铬释放测定、电阻抗测定、时差显微术或共培养测定来确定。
在一些实施方案中，所述读取包括确定所述工程化免疫细胞的多于一个单独群体中的每一个的增殖水平。在一些实施方案中，所述增殖水平通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)测定、显微术、电阻抗测定或流式细胞术来确定。
在一些实施方案中，所述读取包括确定由所述工程化免疫细胞的多于一个单独群体中的每一个表达的因子水平。在一些实施方案中，所述因子是蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白由所述工程化免疫细胞群体分泌。在一些实施方案中，所述蛋白是细胞因子或趋化因子。在一些实施方案中，所述蛋白是细胞表面蛋白。在一些实施方案中，所述表达通过流式细胞术、蛋白质印迹或ELISA来确定。
在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的免疫细胞包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少80％的免疫细胞包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少90％的免疫细胞包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的所述免疫细胞百分比通过分解追踪插入缺失(Tracking of Indels by Decomposition，TIDE)分析来确定。
在一些实施方案中，所述外源细胞受体被整合到所述免疫细胞的多于一个单独群体的基因组中。在一些实施方案中，所述外源细胞受体被整合到编码内源细胞受体的内源基因序列中。在一些实施方案中，所述外源细胞受体被整合到安全港位点(safe harborsite)中。在一些实施方案中，所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。在一些实施方案中，所述外源细胞受体被整合到编码起所述多于一个免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。
在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的免疫细胞表达所述外源细胞受体。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少70％的免疫细胞表达所述外源细胞受体。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少80％的免疫细胞表达所述外源细胞受体。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少90％的免疫细胞表达所述外源细胞受体。在一些实施方案中，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的所述免疫细胞百分比通过流式细胞术或测序来确定。
在一些实施方案中，所述基因组破坏是双链断裂。在一些实施方案中，所述核酸酶使用电穿孔引入。根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述核酸酶是内切核酸酶。在一些实施方案中，所述内切核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csx1S、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Cpfl、c2c1、c2c3和Cas9HiFi。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是Cas9。在一些实施方案中，所述指导核酸是指导核糖核酸(gRNA)。在一些实施方案中，所述指导核酸包括硫代磷酸酯(PS)连接、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-O-Me)连接、2-O-甲基3硫代磷酸酯连接、S-约束乙基(cEt)修饰或其任何组合。在一些实施方案中，所述指导核酸使用电穿孔引入。
在一些实施方案中，所述外源细胞受体使用电穿孔引入。在一些实施方案中，所述外源细胞受体使用病毒载体引入。在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，所述AAV载体选自由以下组成的组：重组AAV(rAAV)载体、杂合AAV载体、嵌合AAV载体、自身互补AAV(scAAV)载体、修饰的AAV载体及其任何组合。在一些实施方案中，所述AAV载体是嵌合AAV载体。在一些实施方案中，所述嵌合AAV载体包含至少一个AAV衣壳基因序列中的修饰。
在一些实施方案中，所述外源细胞受体是T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、NK细胞受体、树突细胞受体、单核细胞受体、巨噬细胞受体、中性粒细胞受体、嗜酸性粒细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述外源细胞受体是T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，所述单个基因是免疫调节基因。在一些实施方案中，所述单个基因是候选免疫检查点基因。
在一些实施方案中，所述方法还包括冷冻保存所述工程化免疫细胞的单独群体。在一些实施方案中，所述方法还包括处理所述读取以鉴定候选免疫调节基因。
在一些实施方案中，所述处理包括由以下至少一项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。
在一些实施方案中，所述处理包括由以下至少两项、三项、四项、五项、六项、七项或八项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。
在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少一种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少一种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少一种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述方法还包括选择所述排序的候选免疫调节基因的前10种、20种、30种、40种或50种，从而产生排序的输出。
在一些实施方案中，所述方法还包括从所述排序的输出中鉴定基因家族、基因功能或细胞内信号传导通路中的至少一种，从而产生分析的排序的输出。
在一些实施方案中，所述方法还包括关联所述分析的排序的输出的细胞溶解活性，从而产生细胞溶解相关联的排序的输出。
在一些实施方案中，所述方法还包括根据由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的所述细胞内定位，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述方法还包括根据所述开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物和所述针对所述候选免疫调节基因的现有药物，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、NK细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。
在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个T细胞。在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包括多于一个CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包括多于一个CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包括多于一个CD4+ T细胞和多于一个CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个人类细胞。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个原代细胞。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个离体细胞。
根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述免疫细胞的多于一个单独群体包括免疫细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞群体中的所述每一个包含编码改善所述工程化免疫细胞的免疫调节功能的蛋白的转基因。在一些实施方案中，所述转基因被整合在所述工程化免疫细胞的基因组中。
在一些实施方案中，所述转基因被整合到安全港位点。
在一些实施方案中，所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。在一些实施方案中，所述转基因被整合到编码起所述多于一个免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞群体中的所述每一个包含增强编码改善所述工程化免疫细胞的免疫调节功能的蛋白的基因表达的遗传修饰。
在一些实施方案中，表达所述同源抗原的所述多于一个细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是原代癌细胞或来自癌细胞系。在一些实施方案中，所述癌细胞包含至少一种基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述基因组破坏由CRISPR系统介导，所述CRISPR系统包含与所述基因的一部分结合的gRNA和介导基因组DNA裂解的核酸酶。
在一些实施方案中，所述基因组破坏是双链断裂。
在一些实施方案中，所述至少一种基因编码是免疫应答的负调节因子的蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白是检查点抑制剂的配体。在一些实施方案中，所述蛋白是选自由以下组成的组的检查点抑制剂的配体：程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)和蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。
在一些实施方案中，所述癌细胞表达至少一种外源蛋白。在一些实施方案中，所述外源蛋白是细胞表面受体。在一些实施方案中，所述外源蛋白是细胞内蛋白。在一些实施方案中，编码所述外源蛋白的转基因被整合到所述癌细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述外源蛋白调节免疫细胞识别和/或杀伤所述癌细胞的能力。
在一些实施方案中，所述免疫细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。
在一方面，本文提供了组合物，所述组合物包含免疫细胞的多于一个单独群体，其中免疫细胞的每个单独群体包含多于一个免疫细胞，所述多于一个免疫细胞i)表达外源细胞受体；和ii)包含CRISPR系统，所述CRISPR系统包含指导核酸和外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述免疫细胞的单独群体中的每一个是不同的。
在一些实施方案中，每个单独群体的所述多于一个免疫细胞的所述群体包含所述单个候选基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，每个单独群体的所述多于一个免疫细胞的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述免疫细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。在一些实施方案中，所述免疫细胞的多于一个单独群体包括免疫细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
在一方面，本文提供了组合物，所述组合物包含多于一个单独的细胞群体，每个单独的细胞群体包含i)表达外源细胞受体的多于一个免疫细胞和ii)表达所述外源细胞受体的同源抗原的细胞；其中所述多于一个免疫细胞中的每一个包含单个候选基因的改变的基因组序列，并且其中所述单个候选基因对于所述单独的细胞群体中的每一个是不同的。
在一些实施方案中，每个单独的细胞群体的所述多于一个免疫细胞的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因的所述改变的基因组序列。在一些实施方案中，所述单独的细胞群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。在一些实施方案中，所述细胞的多于一个单独群体包括细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
在一方面，本文提供了筛选多于一个单个候选基因的方法，所述方法包括：a)在T细胞的多于一个单独群体中表达外源T细胞受体(TCR)或其功能片段，其中每个群体包含多于一个T细胞；b)将CRISPR系统引入所述免疫细胞的单独群体中的每一个中，所述CRISPR系统包含：i)指导核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述免疫细胞的单独群体中的每一个是不同的；和ii)外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸；从而产生工程化T细胞的多于一个单独群体，所述工程化T细胞包含所述单个候选基因中的基因组破坏，其中所述基因组破坏抑制所述单个候选基因的表达；c)进行体外测定，包括在体外使所述多于一个工程化T细胞与表达所述外源细胞受体或其所述功能片段的同源抗原的多于一个细胞接触；d)确定所述体外测定的读取，从而确定抑制所述单个候选基因的表达的所述基因组破坏对所述工程化T细胞的多于一个单独群体的影响；并且e)处理所述读取以鉴定候选免疫调节基因。
在一些实施方案中，所述读取包括确定所述工程化T细胞的多于一个单独群体中的每一个的细胞溶解活性水平。在一些实施方案中，所述细胞溶解活性水平通过铬释放测定、电阻抗测定、时差显微术或共培养测定来确定。
在一些实施方案中，所述读取包括确定所述工程化T细胞的多于一个单独群体中的每一个的增殖水平。在一些实施方案中，所述增殖水平通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)测定、显微术、电阻抗测定或流式细胞术来确定。
在一些实施方案中，所述读取包括确定由所述工程化T细胞的多于一个单独群体中的每一个表达的因子水平。在一些实施方案中，所述因子是蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白由所述工程化T细胞群体分泌。在一些实施方案中，所述蛋白是细胞因子或趋化因子。在一些实施方案中，所述蛋白是IL-2、IFNγ、TNFα、LT-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-9、IL-10、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-26、TNF、CCL20、IL-21或TGF-β。在一些实施方案中，所述蛋白是细胞表面蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白是CD3、CD4、CD8、CD28、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CCR6或CD25。在一些实施方案中，所述蛋白是CISH、PD1、CTLA4、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)或蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。在一些实施方案中，所述表达通过流式细胞术、蛋白质印迹或ELISA来确定。
在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述T细胞的单独群体中的每一个的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的T细胞包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述T细胞的单独群体中的每一个的至少80％的T细胞包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述T细胞的单独群体中的每一个的至少90％的T细胞包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，所述T细胞的单独群体中的每一个的所述T细胞百分比通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析来确定。
在一些实施方案中，所述外源T细胞受体(TCR)被整合到所述免疫细胞的多于一个单独群体的基因组中。
在一些实施方案中，所述外源T细胞受体(TCR)被整合到编码内源T细胞受体的内源基因序列中。在一些实施方案中，所述基因是TRAC或TCRB。
在一些实施方案中，所述外源T细胞受体(TCR)被整合到安全港位点中。在一些实施方案中，所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。
在一些实施方案中，所述外源T细胞受体(TCR)被整合到编码起所述多于一个免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。在一些实施方案中，所述基因编码CISH、PD1、CTLA4、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)或蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。
在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述T细胞的单独群体中的每一个的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的T细胞表达所述外源T细胞受体。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述T细胞的单独群体中的每一个的至少70％的T细胞表达所述外源T细胞受体。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述T细胞的单独群体中的每一个的至少80％的T细胞表达所述外源T细胞受体。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述T细胞的单独群体中的每一个的至少90％的T细胞表达所述外源T细胞受体。在一些实施方案中，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的所述T细胞百分比通过流式细胞术或测序来确定。
在一些实施方案中，所述基因组破坏是双链断裂。在一些实施方案中，所述核酸酶使用电穿孔引入。在一些实施方案中，所述核酸酶是内切核酸酶。在一些实施方案中，所述内切核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csx1S、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Cpfl、c2c1、c2c3和Cas9HiFi。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是Cas9。
在一些实施方案中，所述指导核酸是指导核糖核酸(gRNA)。在一些实施方案中，所述指导核酸包括硫代磷酸酯(PS)连接、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-O-Me)连接、2-O-甲基3硫代磷酸酯连接、S-约束乙基(cEt)修饰或其任何组合。在一些实施方案中，所述指导核酸使用电穿孔引入。
在一些实施方案中，所述外源T细胞受体(TCR)使用电穿孔引入。在一些实施方案中，所述外源T细胞受体(TCR)使用病毒载体引入。在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，所述AAV载体选自由以下组成的组：重组AAV(rAAV)载体、杂合AAV载体、嵌合AAV载体、自身互补AAV(scAAV)载体、修饰的AAV载体及其任何组合。在一些实施方案中，所述AAV载体是嵌合AAV载体。在一些实施方案中，所述嵌合AAV载体包含至少一个AAV衣壳基因序列中的修饰。
在一些实施方案中，所述单个基因是免疫调节基因。在一些实施方案中，所述单个基因是候选免疫检查点基因。
在一些实施方案中，所述方法还包括冷冻保存所述工程化T细胞的单独群体。
在一些实施方案中，所述方法还包括处理所述读取以鉴定候选免疫调节基因。在一些实施方案中，所述处理包括由以下至少一项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。
在一些实施方案中，所述处理包括由以下至少两项、三项、四项、五项、六项、七项或八项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。
在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少一种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少一种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述方法还包括选择所述排序的候选免疫调节基因的前10种、20种、30种、40种或50种，从而产生排序的输出。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述排序的输出中鉴定基因家族、基因功能或细胞内信号传导通路中的至少一种，从而产生分析的排序的输出。在一些实施方案中，所述方法还包括关联所述分析的排序的输出的细胞溶解活性，从而产生细胞溶解相关联的排序的输出。在一些实施方案中，所述方法还包括根据由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的所述细胞内定位，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。在一些实施方案中，所述方法还包括根据所述开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物和所述针对所述候选免疫调节基因的现有药物，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述工程化T细胞的单独群体中的每一个包括多于一个CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述工程化T细胞的单独群体中的每一个包括多于一个CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述工程化T细胞的单独群体中的每一个包括多于一个CD4+ T细胞和多于一个CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述工程化T细胞的单独群体中的每一个包括肿瘤浸润性T细胞(TIL)。在一些实施方案中，所述工程化T细胞的单独群体中的每一个包括多于一个人类细胞。在一些实施方案中，所述工程化T细胞的单独群体中的每一个包括多于一个原代细胞。在一些实施方案中，所述工程化T细胞的单独群体中的每一个包括多于一个离体细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞的单独群体中的每一个包括T细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
在一些实施方案中，所述工程化T细胞的单独群体中的所述每一个包含编码改善所述工程化T细胞的免疫调节功能的蛋白的转基因。在一些实施方案中，所述蛋白是磷酸二酯酶1C(PDE1C)、rhotekin 2(RTKN2)、神经生长因子受体(NGFR)或参与选择的胸腺细胞表达分子(THEMIS)。
在一些实施方案中，所述转基因被整合到安全港位点。在一些实施方案中，所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。
在一些实施方案中，所述转基因被整合到编码起所述多于一个T细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。在一些实施方案中，所述整合减少或抑制起免疫应答的负调节因子作用的所述蛋白的功能形式的表达。在一些实施方案中，所述蛋白是CISH、PD1、CTLA4、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)或蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。
在一些实施方案中，所述工程化T细胞群体中的所述每一个包含增强编码改善所述工程化T细胞的免疫调节功能的蛋白的基因表达的遗传修饰。在一些实施方案中，所述蛋白是磷酸二酯酶1C(PDE1C)、rhotekin 2(RTKN2)、神经生长因子受体(NGFR)或参与选择的胸腺细胞表达分子(THEMIS)。
在一些实施方案中，所述方法还包括选择表达所述外源TCR或其功能片段的T细胞。
在一些实施方案中，表达所述同源抗原的所述多于一个细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞是原代癌细胞或来自癌细胞系。在一些实施方案中，所述癌细胞包含至少一种基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述基因组破坏由CRISPR系统介导，所述CRISPR系统包含与所述基因的一部分结合的gRNA和介导基因组DNA裂解的核酸酶。在一些实施方案中，所述基因组破坏是双链断裂。在一些实施方案中，所述至少一种基因编码是免疫应答的负调节因子的蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白是检查点抑制剂的配体。在一些实施方案中，所述蛋白是选自由以下组成的组的检查点抑制剂的配体：程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)和蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。
在一些实施方案中，所述癌细胞表达至少一种外源蛋白。在一些实施方案中，所述外源蛋白是细胞表面受体。在一些实施方案中，所述外源蛋白是细胞内蛋白。在一些实施方案中，编码所述外源蛋白的转基因被整合到所述癌细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述外源蛋白调节免疫细胞识别和/或杀伤所述癌细胞的能力。
在一些实施方案中，所述免疫细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。
在一方面，本文提供了组合物，所述组合物包含T细胞的多于一个单独群体，其中T细胞的每个单独群体包含多于一个T细胞，所述多于一个T细胞i)表达外源细胞受体；和ii)包含CRISPR系统，所述CRISPR系统包含指导核酸和外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述T细胞的单独群体中的每一个是不同的。
在一些实施方案中，每个单独群体的所述多于一个T细胞的所述群体包含所述单个候选基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，每个单独的群体的所述多于一个T细胞的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述T细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。在一些实施方案中，所述T细胞的多于一个单独群体包括T细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
在一方面，本文提供了组合物，所述组合物包含多于一个单独的细胞群体，每个单独的细胞群体包含i)表达外源细胞受体的多于一个T细胞和ii)表达所述外源细胞受体的同源抗原的细胞；其中所述多于一个T细胞中的每一个包含单个候选基因的改变的基因组序列，并且其中所述单个候选基因对于所述单独的细胞群体中的每一个是不同的。
在一些实施方案中，每个单独的细胞群体的所述多于一个T细胞的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因的所述改变的基因组序列。在一些实施方案中，所述单独的细胞群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。在一些实施方案中，所述多于一个单独的细胞群体包括至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独的细胞群体。
在一方面，本文提供了筛选多于一个单个候选基因的方法，所述方法包括：a)获得表达抗原的癌细胞的多于一个单独群体，其中每个群体包括多于一个癌细胞；b)将CRISPR系统引入所述癌细胞的单独群体中的每一个中，所述CRISPR系统包含：i)指导核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述癌细胞的单独群体中的每一个是不同的；和ii)外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸；从而产生工程化癌细胞的多于一个单独群体，所述工程化癌细胞包含所述单个候选基因中的基因组破坏，其中所述基因组破坏抑制所述单个候选基因的表达；c)进行体外测定，包括在体外使所述多于一个工程化癌细胞与表达与所述抗原结合的细胞受体或其功能片段的多于一个免疫细胞接触；并且d)从所述体外测定中获得读取，从而确定抑制所述单个候选基因的表达的所述基因组破坏对所述工程化癌细胞的多于一个单独群体或表达与所述抗原结合的细胞受体或其功能片段的所述免疫细胞的影响。
在一些实施方案中，所述读取包括确定所述工程化癌细胞的单独群体中的每一个的细胞死亡水平。在一些实施方案中，所述细胞死亡水平通过流式细胞术或显微术来确定。
在一些实施方案中，所述读取包括确定所述工程化癌细胞的单独群体中的每一个的一定百分比的细胞被杀伤的时间。在一些实施方案中，所述细胞死亡水平通过流式细胞术或显微术来确定。
在一些实施方案中，所述读取包括确定所述多于一个免疫细胞的细胞溶解活性水平。在一些实施方案中，所述细胞溶解活性水平通过铬释放测定、电阻抗测定、时差显微术或共培养测定来确定。
在一些实施方案中，所述读取包括确定所述多于一个免疫细胞的增殖水平。在一些实施方案中，所述增殖水平通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)测定、显微术、电阻抗测定或流式细胞术来确定。
在一些实施方案中，所述读取包括确定由所述多于一个免疫细胞表达的因子水平。在一些实施方案中，所述因子是蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白由所述工程化免疫细胞群体分泌。在一些实施方案中，所述蛋白是细胞因子或趋化因子。在一些实施方案中，所述蛋白是细胞表面蛋白。在一些实施方案中，所述表达通过流式细胞术、蛋白质印迹或ELISA来确定。
在一些实施方案中，所述抗原是内源抗原。在一些实施方案中，所述抗原是外源抗原。根据权利要求111所述的方法，其中步骤a.包括在所述癌细胞的单独群体中的每一个中表达所述外源抗原。
在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述癌细胞的单独群体中的每一个的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的癌细胞包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述癌细胞的单独群体中的每一个的至少80％的癌细胞包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述癌细胞的单独群体中的每一个的至少90％的癌细胞包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，所述癌细胞的单独群体中的每一个的所述癌细胞百分比通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析来确定。
在一些实施方案中，所述细胞受体是免疫调节细胞受体。在一些实施方案中，所述细胞受体是外源细胞受体。在一些实施方案中，所述外源细胞受体被整合到所述多于一个免疫细胞的基因组中。
在一些实施方案中，所述外源细胞受体被整合到编码外源细胞受体的内源基因序列中。在一些实施方案中，所述外源细胞受体被整合到安全港位点中。在一些实施方案中，所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。在一些实施方案中，所述外源细胞受体被整合到编码起所述多于一个免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。在一些实施方案中，所述整合减少或抑制起所述多于一个免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的所述蛋白的表达。在一些实施方案中，所述基因编码选自由以下组成的组的蛋白：CISH、PD1、CTLA4、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)或蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。
在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的所述多于一个免疫细胞表达所述细胞受体。在一些实施方案中，所述多于一个免疫细胞的所述免疫细胞百分比通过流式细胞术或测序来确定。
在一些实施方案中，所述基因组破坏是双链断裂。在一些实施方案中，所述核酸酶使用电穿孔引入。在一些实施方案中，所述核酸酶是内切核酸酶。在一些实施方案中，所述内切核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csx1S、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Cpfl、c2c1、c2c3和Cas9HiFi。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是Cas9。
在一些实施方案中，所述指导核酸是指导核糖核酸(gRNA)。
在一些实施方案中，所述指导核酸包括硫代磷酸酯(PS)连接、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-O-Me)连接、2-O-甲基3硫代磷酸酯连接、S-约束乙基(cEt)修饰或其任何组合。在一些实施方案中，所述指导核酸使用电穿孔引入。
在一些实施方案中，所述细胞受体是使用电穿孔引入的外源细胞受体。在一些实施方案中，所述细胞受体是使用病毒载体引入的外源细胞受体。
在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，所述AAV载体选自由以下组成的组：重组AAV(rAAV)载体、杂合AAV载体、嵌合AAV载体、自身互补AAV(scAAV)载体、修饰的AAV载体及其任何组合。在一些实施方案中，所述AAV载体是嵌合AAV载体。在一些实施方案中，所述嵌合AAV载体包含至少一个AAV衣壳基因序列中的修饰。
在一些实施方案中，所述细胞受体是T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、NK细胞受体、树突细胞受体、单核细胞受体、巨噬细胞受体、中性粒细胞受体、嗜酸性粒细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述细胞受体是T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，所述单个基因是免疫调节基因。在一些实施方案中，所述单个基因是候选免疫检查点受体配体基因。
在一些实施方案中，所述方法还包括冷冻保存所述工程化癌细胞的单独群体。
在一些实施方案中，所述方法还包括处理所述读取以鉴定候选免疫调节基因。
在一些实施方案中，所述处理包括由以下至少一项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。
在一些实施方案中，所述处理包括由以下至少两项、三项、四项、五项、六项、七项或八项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。
在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少一种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少一种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少一种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述方法还包括选择所述排序的候选免疫调节基因的前10种、20种、30种、40种或50种，从而产生排序的输出。
在一些实施方案中，所述方法还包括从所述排序的输出中鉴定基因家族、基因功能或细胞内信号传导通路中的至少一种，从而产生分析的排序的输出。
在一些实施方案中，所述方法还包括关联所述分析的排序的输出的细胞溶解活性，从而产生细胞溶解相关联的排序的输出。
在一些实施方案中，所述方法还包括根据由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的所述细胞内定位，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述方法还包括根据所述开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物和所述针对所述候选免疫调节基因的现有药物，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述多于一个免疫细胞包括多于一个T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、NK细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。
在一些实施方案中，所述多于一个免疫细胞包括多于一个T细胞。在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包括多于一个CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包括多于一个CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包括多于一个CD4+ T细胞和多于一个CD8+ T细胞。
根据权利要求95-163中任一项所述的方法，其中所述多于一个免疫细胞包括多于一个人类细胞。在一些实施方案中，所述多于一个免疫细胞包括多于一个原代细胞。在一些实施方案中，所述多于一个免疫细胞包括多于一个离体细胞。
在一些实施方案中，所述癌细胞的多于一个单独群体包括癌细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
在一些实施方案中，所述多于一个免疫细胞包含编码改善所述免疫细胞的免疫调节功能的蛋白的转基因。在一些实施方案中，所述转基因被整合在所述免疫细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述转基因被整合到安全港位点。在一些实施方案中，所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。在一些实施方案中，所述多于一个免疫细胞包含增强编码改善所述免疫细胞的免疫调节功能的蛋白的基因表达的遗传修饰。在一些实施方案中，所述转基因被整合到编码起所述免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。
在一些实施方案中，所述癌细胞的单独群体中的每一个包含至少一种基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述基因组破坏由CRISPR系统介导，所述CRISPR系统包含与所述基因的一部分结合的gRNA和介导基因组DNA裂解的核酸酶。在一些实施方案中，所述基因组破坏是双链断裂。在一些实施方案中，所述至少一种基因编码是免疫应答的负调节因子的蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白是检查点抑制剂的配体。在一些实施方案中，所述蛋白是选自由以下组成的组的检查点抑制剂的配体：程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)和蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。
在一些实施方案中，所述癌细胞表达至少一种外源蛋白。在一些实施方案中，所述外源蛋白是细胞表面受体。在一些实施方案中，所述外源蛋白是细胞内蛋白。在一些实施方案中，编码所述外源蛋白的转基因被整合到所述癌细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述外源蛋白调节免疫细胞识别和/或杀伤所述癌细胞的能力。
在一些实施方案中，所述免疫细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。
在一方面，本文提供了组合物，所述组合物包含癌细胞的多于一个单独群体，其中癌细胞的每个单独群体包含多于一个癌细胞，所述多于一个癌细胞i)表达抗原；和ii)包含CRISPR系统，所述CRISPR系统包含指导核酸和外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述癌细胞的单独群体中的每一个是不同的。
在一些实施方案中，每个单独群体的所述多于一个癌细胞的所述群体包含所述单个候选基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，每个单独群体的所述多于一个癌细胞的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述癌细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。在一些实施方案中，所述癌细胞的多于一个单独群体包括癌细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
在一方面，本文提供了组合物，所述组合物包含多于一个单独的细胞群体，每个单独的细胞群体包含：i)表达抗原的多于一个癌细胞；和ii)表达与所述抗原结合的细胞受体或其功能片段的细胞；其中所述多于一个癌细胞中的每一个包含单个候选基因的改变的基因组序列，并且其中所述单个候选基因对于所述单独的细胞群体中的每一个是不同的。
在一些实施方案中，每个单独的细胞群体的所述多于一个癌细胞的所述群体的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因的所述改变的基因组序列。
在一些实施方案中，所述单独的细胞群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。
在一些实施方案中，所述多于一个单独的细胞群体包括至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独的细胞群体。
在一方面，本文提供了筛选多于一个单个候选基因的方法，所述方法包括：a)获得表达抗原的癌细胞的多于一个单独群体，其中每个群体包括多于一个癌细胞；b)将CRISPR系统引入所述癌细胞的单独群体中的每一个中，所述CRISPR系统包含：i)指导核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述癌细胞的单独群体中的每一个是不同的；和ii)外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸；从而产生工程化癌细胞的多于一个单独群体，所述工程化癌细胞包含所述单个候选基因中的基因组破坏，其中所述基因组破坏抑制所述单个候选基因的表达；c)进行体外测定，包括在体外使所述多于一个工程化癌细胞与表达与所述抗原结合的细胞受体或其功能片段的多于一个T细胞接触；并且d)从所述体外测定中获得读取，从而确定抑制所述单个候选基因的表达的所述基因组破坏对所述工程化癌细胞的多于一个单独群体或表达与所述抗原结合的细胞受体或其功能片段的所述T细胞的影响。
在一些实施方案中，所述读取包括确定所述工程化癌细胞的单独群体中的每一个的细胞死亡水平。在一些实施方案中，所述细胞死亡水平通过流式细胞术或显微术来确定。
在一些实施方案中，所述读取包括确定所述工程化癌细胞的单独群体中的每一个的一定百分比的细胞被杀伤的时间。在一些实施方案中，所述细胞死亡水平通过流式细胞术或显微术来确定。
在一些实施方案中，所述读取包括确定所述多于一个T细胞的细胞溶解活性水平。在一些实施方案中，所述细胞溶解活性水平通过铬释放测定、电阻抗测定、时差显微术或共培养测定来确定。
在一些实施方案中，所述读取包括确定所述多于一个T细胞的增殖水平。在一些实施方案中，所述增殖水平通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)测定、显微术、电阻抗测定或流式细胞术来确定。
在一些实施方案中，所述读取包括确定由所述多于一个T细胞表达的因子水平。在一些实施方案中，所述因子是蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白由所述工程化T细胞群体分泌。在一些实施方案中，所述蛋白是细胞因子或趋化因子。在一些实施方案中，所述蛋白是细胞表面蛋白。在一些实施方案中，所述表达通过流式细胞术、蛋白质印迹或ELISA来确定。
在一些实施方案中，所述抗原是内源抗原。在一些实施方案中，所述抗原是外源抗原。根据权利要求111所述的方法，其中步骤a.包括在所述癌细胞的单独群体中的每一个中表达所述外源抗原。
在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述单独的癌细胞群体中的每一个的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的癌细胞包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述单独的癌细胞群体中的每一个的至少80％的癌细胞包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述单独的癌细胞群体中的每一个的至少90％的癌细胞包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，所述癌细胞的单独群体中的每一个的所述癌细胞百分比通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析来确定。
在一些实施方案中，所述细胞受体是免疫调节细胞受体。在一些实施方案中，所述细胞受体是外源细胞受体。在一些实施方案中，所述外源细胞受体被整合到所述多于一个T细胞的基因组中。
在一些实施方案中，所述外源细胞受体被整合到编码外源细胞受体的内源基因序列中。在一些实施方案中，所述外源细胞受体被整合到安全港位点中。在一些实施方案中，所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。在一些实施方案中，所述外源细胞受体被整合到编码起所述多于一个T细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。在一些实施方案中，所述整合减少或抑制起所述多于一个T细胞的免疫应答的负调节因子作用的所述蛋白的表达。在一些实施方案中，所述基因编码选自由以下组成的组的蛋白：CISH、PD1、CTLA4、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)或蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。
在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述多于一个T细胞的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％表达所述细胞受体。在一些实施方案中，所述多于一个T细胞的所述T细胞百分比通过流式细胞术或测序来确定。
在一些实施方案中，所述基因组破坏是双链断裂。在一些实施方案中，所述核酸酶使用电穿孔引入。在一些实施方案中，所述核酸酶是内切核酸酶。在一些实施方案中，所述内切核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csx1S、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Cpfl、c2c1、c2c3和Cas9HiFi。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是Cas9。
在一些实施方案中，所述指导核酸是指导核糖核酸(gRNA)。
在一些实施方案中，所述指导核酸包括硫代磷酸酯(PS)连接、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-O-Me)连接、2-O-甲基3硫代磷酸酯连接、S-约束乙基(cEt)修饰或其任何组合。在一些实施方案中，所述指导核酸使用电穿孔引入。
在一些实施方案中，所述细胞受体是使用电穿孔引入的外源细胞受体。在一些实施方案中，所述细胞受体是使用病毒载体引入的外源细胞受体。
在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，所述AAV载体选自由以下组成的组：重组AAV(rAAV)载体、杂合AAV载体、嵌合AAV载体、自身互补AAV(scAAV)载体、修饰的AAV载体及其任何组合。在一些实施方案中，所述AAV载体是嵌合AAV载体。在一些实施方案中，所述嵌合AAV载体包含至少一个AAV衣壳基因序列中的修饰。
在一些实施方案中，所述细胞受体是T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、NK细胞受体、树突细胞受体、单核细胞受体、巨噬细胞受体、中性粒细胞受体、嗜酸性粒细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述细胞受体是T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，所述单个基因是免疫调节基因。在一些实施方案中，所述单个基因是候选免疫检查点受体配体基因。
在一些实施方案中，所述方法还包括冷冻保存所述工程化癌细胞的单独群体。
在一些实施方案中，所述方法还包括处理所述读取以鉴定候选免疫调节基因。
在一些实施方案中，所述处理包括由以下至少一项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。
在一些实施方案中，所述处理包括由以下至少两项、三项、四项、五项、六项、七项或八项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。
在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少一种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少一种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少一种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述方法还包括选择所述排序的候选免疫调节基因的前10种、20种、30种、40种或50种，从而产生排序的输出。
在一些实施方案中，所述方法还包括从所述排序的输出中鉴定基因家族、基因功能或细胞内信号传导通路中的至少一种，从而产生分析的排序的输出。
在一些实施方案中，所述方法还包括关联所述分析的排序的输出的细胞溶解活性，从而产生细胞溶解相关联的排序的输出。
在一些实施方案中，所述方法还包括根据由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的所述细胞内定位，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述方法还包括根据所述开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物和所述针对所述候选免疫调节基因的现有药物，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。
在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包括多于一个CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包括多于一个CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包括多于一个CD4+ T细胞和多于一个CD8+ T细胞。
根据权利要求95-163中任一项所述的方法，其中所述多于一个T细胞包括多于一个人类细胞。在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包括多于一个原代细胞。在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包括多于一个离体细胞。
在一些实施方案中，所述癌细胞的多于一个单独群体包括癌细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包含编码改善所述T细胞的免疫调节功能的蛋白的转基因。在一些实施方案中，所述转基因被整合在所述T细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述转基因被整合到安全港位点。在一些实施方案中，所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。在一些实施方案中，所述多于一个T细胞包含增强编码改善所述T细胞的免疫调节功能的蛋白的基因表达的遗传修饰。在一些实施方案中，所述转基因被整合到编码起所述T细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。
在一些实施方案中，所述癌细胞的单独群体中的每一个包含至少一种基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述基因组破坏由CRISPR系统介导，所述CRISPR系统包含与所述基因的一部分结合的gRNA和介导基因组DNA裂解的核酸酶。在一些实施方案中，所述基因组破坏是双链断裂。在一些实施方案中，所述至少一种基因编码是免疫应答的负调节因子的蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白是检查点抑制剂的配体。在一些实施方案中，所述蛋白是选自由以下组成的组的检查点抑制剂的配体：程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)和蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。
在一些实施方案中，所述癌细胞表达至少一种外源蛋白。在一些实施方案中，所述外源蛋白是细胞表面受体。在一些实施方案中，所述外源蛋白是细胞内蛋白。在一些实施方案中，编码所述外源蛋白的转基因被整合到所述癌细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述外源蛋白调节T细胞识别和/或杀伤所述癌细胞的能力。
在一些实施方案中，所述T细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。
在一方面，本文提供了组合物，所述组合物包含癌细胞的多于一个单独群体，其中癌细胞的每个单独群体包含多于一个癌细胞，所述多于一个癌细胞i)表达抗原；和ii)包含CRISPR系统，所述CRISPR系统包含指导核酸和外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述癌细胞的单独群体中的每一个是不同的。
在一些实施方案中，每个单独群体的所述多于一个癌细胞的所述群体包含所述单个候选基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，每个单独群体的所述多于一个癌细胞的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述癌细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。在一些实施方案中，所述癌细胞的多于一个单独群体包括癌细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
在一方面，本文提供了组合物，所述组合物包含多于一个单独的细胞群体，每个单独的细胞群体包含：i)表达抗原的多于一个癌细胞和ii)表达与所述抗原结合的细胞受体或其功能片段的T细胞；其中所述多于一个癌细胞中的每一个包含单个候选基因的改变的基因组序列，并且其中所述单个候选基因对于所述单独的细胞群体中的每一个是不同的。
在一些实施方案中，每个单独的细胞群体的所述多于一个癌细胞的所述群体的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因的所述改变的基因组序列。
在一些实施方案中，所述单独的细胞群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。
在一些实施方案中，所述多于一个单独的细胞群体包括至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独的细胞群体。
本文提供了筛选候选基因的方法，所述方法包括将i)和ii)引入细胞中，i)指导多核酸或编码指导多核酸的核酸，其中指导多核酸靶向候选基因；和ii)外源核酸酶或编码外源核酸酶的核酸；从而产生包含候选基因中的基因组破坏的工程化细胞；b)使工程化细胞与剂接触，从而进行体外测定；并且c)确定体外测定的读取。在一些实施方案中，读取包括确定细胞增殖水平。在一些实施方案中，读取包括确定细胞存活力水平。在一些实施方案中，读取包括确定细胞死亡水平。在一些实施方案中，增殖水平可以通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)测定、显微术、电阻抗测定或细胞计量术中的至少一项来确定。在一些实施方案中，细胞存活力水平和/或细胞死亡水平可以通过显微术、电阻抗测定或细胞计量术来确定。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞、神经元细胞、肝细胞、肾细胞、胰腺细胞、胃细胞、皮肤细胞、心脏细胞、脑细胞、肌肉细胞、肺细胞、乳腺细胞、小肠细胞、结肠细胞、直肠细胞(anal cell)、卵巢细胞、宫颈细胞或前列腺细胞。在一些实施方案中，细胞是癌细胞。
本文提供了筛选候选基因的方法，所述方法包括：a)在免疫细胞中表达外源细胞受体或其功能部分；将i)和ii)引入免疫细胞中：i)指导多核酸或编码指导多核酸的核酸，其中指导多核酸靶向候选基因；和ii)外源核酸酶或编码外源核酸酶的核酸；从而产生包含候选基因中的基因组破坏的工程化免疫细胞；b)使工程化免疫细胞与表达T细胞受体或其功能部分的同源抗原的细胞接触，从而进行体外测定；并且c)确定体外测定的读取。在一些情况下，方法还可以包括选择包含外源细胞受体的免疫细胞。在一些情况下，读取包括确定工程化免疫细胞的细胞溶解活性水平。在一些情况下，细胞溶解活性水平可以通过共培养测定、铬释放测定或时差显微术中的至少一项来确定。在一些情况下，读取包括确定工程化免疫细胞的增殖水平。在一些情况下，增殖水平可以通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)测定、显微术、电阻抗测定或细胞计量术中的至少一项来确定。在一些情况下，读取包括确定由工程化免疫细胞表达的因子水平。在一些情况下，因子可以选自IL-2、IFNγ、TNFα、CD3、CD4、CD8、CD28、PD-1、CTLA4。
在一些情况下，表达可以通过流式细胞术、蛋白质印迹或ELISA来确定。在一些情况下，方法还可以包括定量基因组破坏的水平。在一些情况下，定量包括进行蛋白质印迹分析或通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析中的至少一项。在一些情况下，基因组破坏可以处于免疫检查点基因中。在一些情况下，方法还可以包括将第二基因组破坏引入工程化免疫细胞中。在一些情况下，第二基因组破坏可以处于免疫检查点基因中。在一些情况下，第二基因组破坏可以处于不是免疫检查点基因的基因中。在一些情况下，方法还可以包括冷冻保存工程化免疫细胞。在一些情况下，指导多核酸可以以非病毒方式引入。在一些情况下，指导多核酸可以以病毒方式引入。在一些情况下，基因组破坏可以通过内切核酸酶进行。在一方面，内切核酸酶可以选自由以下组成的组：成簇规律间隔短回文重复序列(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)内切核酸酶、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)内切核酸酶、Argonaute内切核酸酶和锌指内切核酸酶。在一些情况下，内切核酸酶可以是CRISPR内切核酸酶。在一些情况下，CRISPR内切核酸酶可以是Cas9。
在一些实施方案中，所述候选基因中的所述基因组破坏以至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的效率引入。在一些实施方案中，所述候选基因中的所述基因组破坏以至少80％的效率引入。在一些实施方案中，所述效率通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析来测量。在一些实施方案中，所述效率通过测序来测量。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述多于一个免疫细胞的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述多于一个免疫细胞的至少80％包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，所述多于一个免疫细胞的所述百分比通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析来测量。
在一些实施方案中，所述多于一个免疫细胞的所述百分比通过测序来测量。在一些实施方案中，所述外源细胞受体以至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的效率引入。在一些实施方案中，所述外源细胞受体以至少70％的效率引入。在一些实施方案中，所述效率通过流式细胞术来测量。在一些实施方案中，所述效率通过测序来测量。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述多于一个细胞中的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的细胞表达所述外源细胞受体。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述多于一个细胞中的至少70％的细胞表达所述外源细胞受体。在一些实施方案中，所述多于一个细胞中的所述细胞百分比通过流式细胞术来测量。在一些实施方案中，所述多于一个细胞中的所述细胞百分比通过测序来测量。
在一些情况下，a)包括使免疫细胞与包含编码外源细胞受体或其功能部分的核酸的病毒颗粒接触。在一些情况下，病毒颗粒是腺相关病毒(AAV)颗粒。在一些情况下，病毒颗粒可以是修饰的腺相关病毒(AAV)颗粒。在一些情况下，外源细胞受体可以是T细胞受体(TCR)或其一部分，或者嵌合抗原受体(CAR)或其一部分。在一些情况下，外源细胞受体可以是TCR。
在一些情况下，一种方法还可以包括处理读取以鉴定候选免疫调节基因或其部分。在一些情况下，处理包括由以下至少一项中确定标准：细胞溶解活性、候选免疫调节基因或其部分的基因表达、由候选免疫调节基因或其部分产生的蛋白的细胞内定位、候选免疫调节基因或其部分与人类疾病相关的功能丧失、靶向候选免疫调节基因或其部分的gRNA的gRNA评分、开发中的靶向候选免疫调节基因或其部分的现有药物、针对候选免疫调节基因或其部分的现有药物、候选免疫调节基因或其部分的功能丧失表型。在一些情况下，处理包括根据至少一种标准对候选免疫调节基因或其部分进行排序。在一些情况下，方法还可以包括选择排序前10的候选免疫调节基因或其部分，从而产生排序的输出。在一些情况下，方法还可以包括从排序的输出中鉴定基因家族、基因功能、细胞内信号传导通路中的至少一种，从而产生分析的排序的输出。在一些情况下，方法还可以包括关联分析的排序的输出的细胞溶解活性，从而产生细胞溶解相关联的排序的输出。在一些情况下，方法还可以包括根据由候选免疫调节基因或其部分产生的蛋白的细胞内定位，对来自细胞溶解相关联的排序的输出的候选免疫调节基因或其部分进行排序。在一些情况下，蛋白的细胞内定位评分可能是低的。
在一些情况下，方法还可以包括根据开发中的靶向候选免疫调节基因或其部分的现有药物和针对候选免疫调节基因或其部分的现有药物，对来自细胞溶解相关联的排序的输出的候选免疫调节基因或其部分进行排序。在一些情况下，蛋白的细胞内定位评分可能是低的。在一些情况下，方法还可以包括重复该方法，其中引入指导多核酸包括引入靶向通过处理鉴定的候选免疫调节基因或其部分的指导多核酸。在一些情况下，免疫细胞可以是T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或NK细胞。在一些情况下，T细胞可以是CD8细胞。在一些情况下，T细胞可以是CD4细胞。在一些情况下，同源抗原结合外源细胞受体。在一些情况下，指导多核酸可以是被修饰的。在一些情况下，免疫细胞可以是人类的。
本文提供了一种筛选候选基因的方法，所述方法包括：a)在免疫细胞中表达外源T细胞受体(TCR)或其功能部分；b)在免疫细胞中使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统在候选基因中引入基因组破坏，从而产生工程化免疫细胞；c)使工程化免疫细胞与表达TCR或其功能部分的同源抗原的细胞接触，从而进行体外测定；d)确定体外测定的读取；并且e)处理读取以鉴定候选免疫调节基因或其部分。在一些情况下，方法还可以包括选择包含外源TCR或其功能部分的免疫细胞。在一些情况下，方法还可以包括定量基因组破坏的水平。在一些情况下，定量包括进行蛋白质印迹分析或通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析中的至少一项。在一些情况下，基因组破坏处于免疫检查点基因中。在一些情况下，方法还可以包括将第二基因组破坏引入工程化免疫细胞中。在一些情况下，第二基因组破坏可以处于免疫检查点基因中。在一些情况下，第二基因组破坏可以处于不是免疫检查点基因的基因中。
在一些实施方案中，所述候选基因中的所述基因组破坏以至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的效率引入。在一些实施方案中，所述候选基因中的所述基因组破坏以至少80％的效率引入。在一些实施方案中，所述效率通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析来测量。在一些实施方案中，所述效率通过测序来测量。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述多于一个免疫细胞的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述多于一个免疫细胞的至少80％包含所述基因组破坏。在一些实施方案中，所述多于一个免疫细胞的所述百分比通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析来测量。在一些实施方案中，所述多于一个免疫细胞的所述百分比通过测序来测量。在一些实施方案中，所述外源TCR以至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的效率引入。在一些实施方案中，所述外源TCR以至少70％的效率引入。在一些实施方案中，所述效率通过流式细胞术来测量。在一些实施方案中，所述效率通过测序来测量。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述多于一个细胞中的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的细胞表达所述外源TCR。在一些实施方案中，在没有选择步骤的情况下，所述多于一个细胞中的至少70％的细胞表达所述外源TCR。在一些实施方案中，所述多于一个细胞中的所述细胞百分比通过流式细胞术来测量。在一些实施方案中，所述多于一个细胞中的所述细胞百分比通过测序来测量。
在一些情况下，方法还可以包括冷冻保存工程化免疫细胞。在一些情况下，CRISPR系统以非病毒方式引入。在一些情况下，CRISPR系统可以以病毒方式引入。在一些情况下，CRISPR系统包含Cas9内切核酸酶。在一些情况下，a)包括使免疫细胞与包含编码外源细胞受体或其功能部分的核酸的病毒颗粒接触。在一些情况下，病毒颗粒可以是腺相关病毒(AAV)颗粒。在一些情况下，病毒颗粒可以是修饰的腺相关病毒(AAV)颗粒。在一些情况下，d)包括确定工程化免疫细胞的细胞溶解活性。
在一些情况下，细胞溶解活性通过共培养测定、铬释放测定或时差显微术(time-lapse microscopy)中的至少一项来确定。在一些情况下，d)包括确定工程化免疫细胞的增殖。在一些情况下，增殖可以通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)测定、显微术或细胞计量术中的至少一项来确定。在一些情况下，d)包括确定工程化免疫细胞的因子表达。在一些情况下，因子可以选自IL-2、IFNγ、TNF、CD3、CD4、CD8、CD28、PD-1、CTLA4。在一些情况下，表达可以通过流式细胞术、蛋白质印迹或ELISA来确定。
在一些情况下，处理包括由以下至少一项中确定标准：细胞溶解活性、候选免疫调节基因或其部分的基因表达、由候选免疫调节基因或其部分产生的蛋白的细胞内定位、候选免疫调节基因或其部分与人类疾病相关的功能丧失、靶向候选免疫调节基因或其部分的gRNA的gRNA评分、开发中的靶向候选免疫调节基因或其部分的现有药物、针对候选免疫调节基因或其部分的现有药物、候选免疫调节基因或其部分的功能丧失表型。在一些情况下，处理包括根据至少一种标准对候选免疫调节基因或其部分进行排序。在一些情况下，方法还可以包括选择排序前10的候选免疫调节基因或其部分，从而产生排序的输出。在一些情况下，方法还可以包括从排序的输出中鉴定基因家族、基因功能或细胞内信号传导通路中的至少一种，从而产生分析的排序的输出。在一些情况下，方法还可以包括关联分析的排序的输出的细胞溶解活性，从而产生细胞溶解相关联的排序的输出。在一些情况下，方法还可以包括根据由候选免疫调节基因或其部分产生的蛋白的细胞内定位，对来自细胞溶解相关联的排序的输出的候选免疫调节基因或其部分进行排序。在一些情况下，蛋白的细胞内定位评分可能是低的。在一些情况下，方法还可以包括根据开发中的靶向候选免疫调节基因或其部分的现有药物和针对候选免疫调节基因或其部分的现有药物，对来自细胞溶解相关联的排序的输出的候选免疫调节基因或其部分进行排序。在一些情况下，蛋白的细胞内定位评分可能是低的。在一些情况下，方法还可以包括重复该方法，其中引入指导多核酸包括引入靶向通过处理鉴定的候选癌症治疗性基因或其部分的指导多核酸。
在一些情况下，免疫细胞可以是T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或NK细胞。在一些情况下，T细胞可以是CD8细胞。在一些情况下，T细胞可以是CD4细胞。在一些情况下，表达T细胞受体或其功能部分的同源抗原的细胞结合TCR。在一些情况下，CRISPR系统可以是被修饰的。在一些情况下，免疫细胞可以是人类的。在一些情况下，表达T细胞受体或其功能部分的同源抗原的细胞可以是癌细胞。
附图简述
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体地阐述。通过参考以下详细描述和附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解，该详细描述阐述了利用本发明的原理的说明性实施方案，在附图中：
图1提供了用于产生表达具有已知特异性的外源TCR的原代人类T细胞群体的示例性方案。
图2提供了用于评价候选免疫调节基因破坏在原代人类T细胞中的影响的示例性方案。
图3示出了辅助候选免疫调节基因的排序、选择或鉴定的算法的示例性使用。
图4示出了用于鉴定免疫调节基因的本公开内容的各种组分的循环或迭代实施。
图5提供了算法工作流程的说明性概述。图5A提供了基于筛选测定和其他加权参数对候选免疫调节基因进行排序的算法的说明性概述。图5B提供了用于迭代选择待筛选的候选免疫调节基因的算法的说明性概述。图5C提供了用于鉴定与是不良药物靶的候选基因相关的可药化(druggable)免疫调节基因的算法的说明性概述。
图6是显示使用本文描述的CRISPR系统的检查点基因敲除效率的柱状图，该CRISPR系统包含针对四种不同的检查点基因(靶)的gRNA。将冷冻保存的CD3+ T解冻，用CD3和CD28 Dynabeads刺激3天，并且在具有10％人类血清、IL2、IL7和IL15的离体生长培养基中培养。将Dynabeads取出，并且将细胞返回至新鲜的生长培养基中持续2小时，然后转染。转染使用Neon转染系统进行，并且将3×10^5个T细胞在10μl neon尖头中用1.5μg的Cas9mRNA和0.5μg的gRNA转染。将T细胞以1×10^6个细胞/ml的密度放置于新鲜的生长培养基中。转染后3天时取样品进行Tide分析，以检查编辑效率。
图7是来自FACS分析的图，显示了使用本文描述的AAV载体的TCR整合的效率。示出了三代载体，其中第三代具有78％的敲入效率。将冷冻保存的CD3+ T解冻，用CD3和CD28Dynabeads刺激3天，并且在具有10％人类血清、IL2、IL7和IL15的离体生长培养基中培养。将Dynabeads取出，并且将细胞返回至新鲜的生长培养基中持续2小时，然后转染。转染使用Neon转染系统进行，并且将3×10^5个T细胞在10μl neon尖头中用1.5μg的Cas9 mRNA和0.5μg的gRNA转染。将T细胞以1×10^6个细胞/ml的密度放置于新鲜的生长培养基中。转染后2小时，将包含外源TCR构建体的AAV供体病毒添加至培养基中(以1×10^6的MOI)。转染后3天时取样品进行Tide分析，以检查编辑效率。这种方案各代之间的差异导致TCR敲入百分比的提高，这与为CRISPR编辑T细胞的临床细胞疗法方案开发的另一项研究相关联。
图8A提供了剪接接纳体KRAS-G12D特异性TCR转基因构建体及其在内源TRAC基因座处由CRISPR/AAV介导的插入的图解。图8B提供了表达例如，KRAS G12D特异性TCR的工程化T细胞与用G12D肽脉冲的COS7 MHCI+细胞之间相互作用的图解。
图9提供了本文描述的产生修饰的细胞(例如，T细胞)的方法的实施方案的图解，其中CD8+ T细胞从受试者(例如，人类受试者)中分离，工程化以敲入对所选择的抗原特异性的TCR并以高效率敲除感兴趣的基因(例如，免疫检查点基因，例如，CISH、PD1、CTLA4)，任选地富集基因组编辑的细胞，任选地通过测定例如蛋白质印迹、TiDE确认DNA破坏和蛋白损失，以及在本文描述的筛选方法中使用细胞，或者任选地冷冻保存细胞以稍后在本文描述的测定中使用。
图10示出了鉴定本文描述的修饰的细胞中的免疫检查点蛋白的方法的实施方案的图解，其中将编辑的和任选地富集的细胞(例如，如图10中描述的T细胞)的纯群体阵列化(例如，到96孔板中)，使得每个孔包含表达转基因TCR和单个免疫检查点蛋白敲除的T细胞。随后，将靶细胞诸如呈递由转基因TCR识别的肽抗原的细胞添加至阵列中。读取靶细胞的T细胞介导的细胞溶解，以鉴定在特定基因被敲除时具有增强的细胞毒性的T细胞。这种方法也可以用来显示基因组合被敲除时的协同或加性效应。
图11示出了鉴定本文描述的修饰的细胞中的免疫检查点蛋白的方法的实施方案的图解。
图12是来自FACS分析的图，显示了在少于72小时的时间帧内，CRISPR编辑的TCR敲入T细胞的富集，从而增加测定中抗原特异性细胞溶解杀伤的有效性和范围。将24孔板包被抗TCR抗体(在PBS中的4μg/mL)。在24孔板的每个孔中添加250μL培养基，并且在4℃放置过夜。去除上清液，然后添加5×10^5个TCR敲入T细胞。将T细胞在TCR敲入编辑后7天添加。将2μg抗CD28单克隆抗体添加至T细胞中，并且将T细胞在5％CO2中在37℃培养7天，根据需要喂养和更换培养基。
图13示出了来自使用xCelligence平台进行的T细胞细胞溶解测定的图。图示出了T细胞和靶细胞组合后多达120小时的T细胞杀伤动力学。测定显示了在杀伤量级和在应答动力学两个方面稳健的活性窗口，其中可以鉴定增加癌症抗原特异性杀伤的基因靶。COS-7靶细胞的无阻碍增殖被用作死亡的基线水平，设置为零。真正的抗原特异性杀伤是响应于表达G12WT肽的COS-7细胞的G12D TCR工程化CD8+ T细胞之间的细胞死亡差异。鉴定增加癌症抗原特异性杀伤的基因的测定窗口是最大对照(所有细胞都被Triton X添加杀死)和与表达同源肽抗原(KRAS G12D)的COS-7细胞共培养的抗原特异性TCR工程化CD8+ T细胞的应答之间的细胞死亡差异。
图14示出了来自使用xCelligence平台进行的T细胞细胞溶解测定的图。图显示了最初24小时内的急性杀伤阶段和稍后的连续杀伤阶段二者。与WT CD8+ T细胞相比，CISH敲除CD8+ T细胞显示出升高水平的癌症抗原特异性杀伤。此外，CISH损失增加了在早期时间点(例如，急性杀伤期)观察到的癌细胞杀伤的速度，以及增加了抗原特异性细胞杀伤的总量级。
图15A是显示CISH敲除CD8+ T细胞和WT CD8+ T细胞的细胞溶解百分比的柱状图。与WT相比，CISH缺陷型T细胞在T细胞和靶细胞组合后16小时、72小时和96小时时显示出响应于突变特异性肿瘤抗原的增强的细胞毒性。细胞溶解使用xCelligence平台测量。图15B示出了使用基于CellTox染料的测定的T细胞和靶细胞组合后16小时的CISH敲除CD8+T细胞和WT CD8+ T细胞的细胞溶解。将使用如图16A示出的xCelligence平台产生的数据与使用基于CellTox染料的测定产生的数据相关联。
图16是显示筛选测定结果的柱状图，该测定测量CD8+ T细胞和靶细胞组合后16小时特异性细胞裂解的增加倍数。鉴定了两个阳性击中，给出杀伤相比于野生型T细胞的1.8倍和1.6倍增加。
图17是显示来自筛选11种不同的靶基因的使用xCelligence平台的T细胞细胞溶解测定的图。筛选显示了表达工程化TCR的CD8+ T细胞的稳健的抗原特异性杀伤应答。
图18A是显示来自筛选10种不同的靶基因的使用xCelligence平台的T细胞细胞溶解测定的图。筛选鉴定了一种靶基因，其中与WT T细胞相比，TCR转基因CD8+ T细胞中基因的敲除使T细胞杀伤快速增加。图18B是显示CD8+ T细胞和靶细胞组合后16小时时图18A中筛选测定结果的柱状图。
图19示出了本文描述的实施方案的图解，其中细胞毒性测定与软件组合以鉴定新的可药化靶基因。软件检索大量生物数据库和检索策略，以在随后的实验轮中选择用于CRISPR介导的敲除的基因。软件使用几种相互竞争的算法，并且更成功的算法更频繁地用于随后筛选。最终结果是富集击中的列表，鉴定了导致更高的选择的功能输出(例如，大量T细胞杀伤)的基因。检索可以包括例如生物过程、细胞组分、分子功能、最近邻(nearestneighbor)和Steiner树。
图20示出了算法输入-输出的图解。从CRISPR T细胞细胞溶解筛选产生的数据是输入，并且使用基于统计的网络来寻找另外的靶(例如，基于分子功能的Go Term本体检索)。用于下一轮筛选的靶是输出，并且软件可以对基因靶进行另外的分析，以基于成药性(例如，靶细胞类型(例如，T细胞)中的表达水平)、可追踪性、细胞定位、市场上靶向该基因的现有药物、靶向该基因的药物是否处于临床试验以及该基因是否与人类疾病相关)的参数来增加加权。基于这些参数，软件为下一轮筛选输出精炼的基因靶列表。
图21示出了并入了迭代机器学习以演进和改进软件并提供高价值药物靶和组合基因效应的更快鉴定的方法的图解。软件预测对T细胞细胞溶解活性重要的基因的能力的迭代改进使得能够更快速鉴定高度可药化的靶。每一轮CRISPR筛选都会生成数据，以改进软件并选择主导决策算法。软件还鉴定了预测当组合干扰时导致T细胞杀伤的显著改进的基因。
详细描述
以下描述和实例详细说明了本公开内容的实施方案。应当理解，本公开内容不限于本文描述的特定实施方案，并且本身可以变化。本领域技术人员将认识到，本发明存在许多变化和修改，这些变化和修改都被包括在本发明范围内。
本文中的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入，其程度如同每一个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入。在本文中的术语和并入的参考文献中的术语发生冲突的情况下，以本文中的术语为准。
引言
特定细胞群体中新的感兴趣的用于破坏的基因的鉴定可能导致与疾病或紊乱相关的新的治疗。例如，新的免疫调节基因的鉴定可能导致用于与这些基因相关的癌症或其他紊乱(例如，自身免疫性疾病)的新的治疗。本公开内容尤其提供了鉴定免疫调节基因的方法，包括例如允许大规模筛选原代人类T细胞的方法。先前对免疫调节基因的筛选依赖于与癌细胞识别和杀伤(例如T细胞增殖)具有有限相关性的读取，以及依赖于细胞系而不是原代细胞，或者涉及在一种实验条件下汇集候选免疫调节基因破坏。
本文提供的方法允许，例如，对原代人类T细胞以抗原依赖性方式进行细胞溶解杀伤癌细胞的阵列化筛选。不希望受理论所束缚，用于细胞溶解活性的测定可以提供优于用于T细胞增殖的测定的益处，因为细胞溶解活性可以是关于候选基因将癌细胞杀伤活性赋予免疫细胞诸如T细胞的能力的更相关的度量(例如，当候选基因被敲除时，特别地在表达肿瘤反应性TCR的免疫细胞中)，当在原代细胞中测定时特别如此，因为这些条件比细胞系更准确地反映生理过程。此外，这些更准确的方法与本文描述的机器学习系统协同地相互作用，因为它们为机器学习系统提供了更好的数据，从而为候选免疫调节基因做出推荐(即，更好的数据输入产生更好的预测输出)。此外，在没有大量细胞因子、趋化因子和其他体内因子的情况下，T细胞的离体增殖是人工的，并且与细胞溶解测试相比，可能是人类患者中靶和药物应答的较差预测因子。细胞溶解测定再现了在体内肿瘤微环境中观察到的同源TCR和抗原相互作用，并且能够形成免疫突触和动员效应物功能，从而导致直接杀伤癌细胞，这更接近于癌症免疫疗法中的重要条件。本公开内容的方法强大之处还在于，当阵列化的细胞溶解测定(例如，使用CRISPR进行候选基因破坏)与高效率T细胞工程化组合时，T细胞可以被特异性修饰以敲除基因靶，然后进行CRISPR文库筛选。这可能包括筛选T细胞中的免疫检查点敲除(例如，在PD-1、CTLA-4和/或CISH中)，以发现协同地或加性地导致更好的癌症杀伤的基因。在迭代轮筛选中，这也可能包括在筛选本身内鉴定的新的靶。本文描述的算法也可以被编程以预测当一起敲除时协同作用的可能靶，诸如通过考虑单独显示阳性细胞溶解应答的基因，并且添加关于它们考虑冗余并推断导致合理选择组合筛选的基因的关系的基因通路的知识。
在一些实施方案中，表达具有已知特异性的外源TCR的原代人类T细胞群体如图1中概述产生。在一些实施方案中，将原代人类T细胞分离、扩增，并且将具有已知特异性的外源T细胞受体(TCR)在T细胞中表达。在一些实施方案中，将基因破坏在该阶段引入T细胞中(例如，内源TCR、免疫检查点基因或其组合的破坏)。在一些实施方案中，然后将表达具有已知特异性的TCR的T细胞富集(例如，通过荧光活化细胞分选(FACS))并扩增。在一些实施方案中，测试所得T细胞的基因破坏和/或外源TCR的表达(例如，通过流式细胞术、蛋白质印迹、通过分解追踪插入缺失(TIDE)或测序)。在一些实施方案中，将T细胞冷冻保存用于稍后使用。
在一些实施方案中，候选免疫调节基因被破坏，并且基因破坏的影响如图2中概述评价。例如，在一些实施方案中，将候选免疫调节基因的破坏在表达具有已知特异性的外源TCR的原代人类T细胞中进行。在一些实施方案中，将候选免疫调节基因的破坏以阵列化的格式进行，并且涉及核酸酶(例如，Cas9)的转染和指导RNA(gRNA)的转导。这可以产生原代人类T细胞的阵列化群体，所有这些T细胞群体都表达具有已知特异性的TCR，但是具有在不同实验条件下破坏不同候选免疫调节基因的特征(例如，在96孔板的每个孔中破坏一种基因)。在一些实施方案中，然后阵列化的T细胞与表达或呈递具有已知特异性的TCR或其功能部分的同源抗原的靶细胞(例如，原代细胞、原代癌细胞或细胞系)共培养。在一些实施方案中，然后评价候选免疫调节基因破坏对靶细胞的T细胞应答的影响(例如，在一些实施方案中，通过细胞毒性测定评价靶细胞的T细胞杀伤；在一些实施方案中，细胞因子的产生、增殖、活化或记忆分化)。在一些实施方案中，T细胞包含一种或更多种候选免疫调节基因和/或一种或更多种已知免疫调节基因的破坏。两种或更多种基因的破坏可能是有益的，因为它有助于筛选协同或加性效应。在一些实施方案中，共培养在存在免疫抑制剂(例如，腺苷受体激动剂或TGF-β)的情况下进行，以筛选克服免疫抑制的破坏。
在一些实施方案中，算法用于辅助候选免疫调节基因的预测、排序、选择或鉴定，如通过图3示出的。例如，在一些实施方案中，将测试候选免疫调节基因破坏的影响的测定结果输入到算法中，该算法可以将该数据与其他数据(例如，先前的测定结果或数据库条目)组合，并且提供排序的基因的输出用于后续实验。在一些实施方案中，算法用于基于筛选测定和其他加权参数对候选免疫调节基因进行排序，如通过实施例24和图5A示出的。在一些实施方案中，算法用于候选免疫调节基因的迭代选择以进行筛选，如通过实施例25和图5B示出的。在一些实施方案中，算法用于鉴定与是不良药物靶的候选基因相关的可药化免疫调节基因，如通过实施例26和图5C示出的。
在一些实施方案中，以上概述的各种组分以循环或迭代的方式执行，如通过图4示出的。例如，在一些实施方案中，运行筛选测定，其中测试多种候选免疫调节基因。在一些实施方案中，将结果输入到算法中，该算法输出候选基因的排序列表以在随后测定中进行筛选。可以运行测定，将结果输入到算法中，并且可以重复循环。
在一些实施方案中，本文提供的方法鉴定了免疫调节基因，所述免疫调节基因可以在药物开发中被靶向，例如，开发小分子、生物制品或细胞疗法以治疗与免疫调节基因相关的癌症或其他疾病。在一些实施方案中，本文提供的方法可以鉴定免疫检查点基因。
免疫调节基因和免疫检查点基因
本文公开了用于鉴定免疫调节基因的方法。免疫调节基因可以影响一系列疾病包括癌症的进展。因此，鉴定的免疫调节基因(例如，使用本公开内容的方法鉴定的)可以是用于治疗涉及这些基因的癌症或其他疾病的靶。
针对癌细胞的免疫应答对于限制癌症的生长或扩散是重要的。例如，T细胞可以通过T细胞受体(TCR)识别突变的自身抗原(新抗原(neoantigen))，这可以导致针对突变的细胞的免疫应答，例如，通过细胞毒性CD8 T细胞或产生炎性细胞因子来杀伤突变的细胞。然而，一些癌细胞可以负面调节免疫应答，这可以有助于癌细胞的存活和扩散。免疫应答可以通过涉及免疫调节基因的机制被下调。
免疫调节基因有助于抑制、下调或限制免疫应答。免疫调节基因可以是调节免疫应答幅度的反馈回路的一部分。免疫调节基因可以例如抑制免疫细胞扩增、抑制免疫细胞功能亲合力、抑制细胞因子产生、抑制细胞因子多功能性、抑制靶细胞的细胞溶解或细胞毒性杀伤、抑制免疫细胞迁移、抑制免疫细胞脱粒、抑制免疫细胞对活化刺激的灵敏度、抑制免疫细胞持久性、抑制免疫细胞存活、促进免疫细胞凋亡、促进免疫细胞无反应性、促进免疫细胞衰竭或其任何组合。免疫调节基因可以包括共抑制受体及其配体，其可以例如导致抑制、下调或限制免疫应答的信号传导级联。特别地，本文描述的方法可以用于鉴定当其被破坏时具有杀伤癌细胞(细胞溶解)活性的免疫调节基因。通过直接测定细胞溶解活性，本文提供的方法可以提供优于不测定该活性的方法的优点。
免疫调节基因可以包括检查点基因。靶向免疫检查点基因的疗法可以包括检查点抑制剂。一些检查点抑制剂例如，抗PD-L1单克隆抗体在癌症治疗中已经显示出功效。因此，新的免疫调节基因或检查点基因的鉴定可以为用于癌症的新的疗法的开发提供靶。
靶向免疫调节基因的疗法可以导致免疫应答，例如，抗癌免疫应答的上调。靶向免疫调节基因的疗法可以靶向免疫调节基因、免疫调节基因的蛋白产物或者免疫调节基因或其蛋白产物的配体、相互作用伴侣或活化因子。
本公开内容的免疫细胞包括，例如，T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、调节性T细胞(Treg)、细胞毒性T淋巴细胞、TH1细胞、TH2细胞、TH17细胞、TH9细胞、自然杀伤T细胞(NKT)、自然杀伤细胞(NK)、先天淋巴细胞(ILC)、B细胞、浆细胞、抗原呈递细胞(APC)、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、浆细胞样树突细胞、中性粒细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、肥大细胞或其组合。在一些实施方案中，本公开内容的免疫细胞是患者来源的天然表达针对肿瘤抗原的内源TCR的T细胞或TIL。这些包括，例如，分离的和扩增的突变反应性TIL。在一些实施方案中，APC是表达同源抗原的细胞系或自体细胞患者来源的细胞。
免疫细胞的扩增
本公开内容提供了用于针对免疫调节基因筛选原代免疫细胞(例如，人类T细胞)的方法。在一些实施方案中，为了产生用于筛选测定的足够数目的原代免疫细胞(例如，人类T细胞)，将原代细胞扩增。
通常，在一些实施方案中，本公开内容的细胞通过与表面接触而扩增，所述表面附接有能够刺激CD3 TCR复合体相关信号的剂和能够刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，在一些实施方案中，T细胞群体在体外被刺激，诸如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或者抗CD2抗体接触，或者通过与蛋白激酶C活化因子(例如，苔藓抑素)(有时与钙离子载体联合)接触。在一些实施方案中，为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体在能够刺激T细胞增殖的条件下接触。在一些情况下，4-1BB可以用于刺激细胞。例如，细胞可以用4-1BB和IL-21或另一种细胞因子刺激。
为了刺激CD4 T细胞或CD8 T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。例如，提供信号的剂可以在溶液中或者被偶联至表面。颗粒与细胞的比例可以取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。在另外的实施方案中，细胞，诸如T细胞，可以与剂包被的珠组合(其中珠和细胞可以随后分离)，并且任选地培养。每个珠可以包被有抗CD3抗体或抗CD28抗体，或者在一些情况下，两者的组合。在替代实施方案中，在培养前，不分离剂包被的珠和细胞，而是一起培养。细胞表面蛋白可以通过使可以附接有抗CD3和抗CD28的顺磁性珠(3×28珠)与T细胞接触来连接。在一种实施方案中，将细胞和珠(例如，以1:1比例的
Figure BDA0003190278790000531
M-450CD3/CD28T顺磁性珠)在缓冲液，例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)(例如，没有二价阳离子，诸如钙离子和镁离子)中组合。
可以使用任何细胞浓度。例如，在一些实施方案中，扩增前的细胞浓度是约1×103个、2×103个、3×103个、4×103个、5×103个、6×103个、7×103个、8×103个、9×103个、1×104个、2×104个、3×104个、4×104个、5×104个、6×104个、7×104个、8×104个、9×104个、1×105个、2×105个、3×105个、4×105个、5×105个、6×105个、7×105个、8×105个、9×105个、1×106个、2×106个、3×106个、4×106个、5×106个、6×106个、7×106个、8×106个、9×106个、1×107个、2×107个、3×107个、4×107个、5×107个、6×107个、7×107个、8×107个、9×107个、1×108个、2×108个、3×108个、4×108个、5×108个、6×108个、7×108个、8×108个、9×108个、1×109个、2×109个、3×109个、4×109个、5×109个、6×109个、7×109个、8×109个或9×109个细胞/mL。在一些实施方案中，扩增前的细胞浓度是至少约1×103个、2×103个、3×103个、4×103个、5×103个、6×103个、7×103个、8×103个、9×103个、1×104个、2×104个、3×104个、4×104个、5×104个、6×104个、7×104个、8×104个、9×104个、1×105个、2×105个、3×105个、4×105个、5×105个、6×105个、7×105个、8×105个、9×105个、1×106个、2×106个、3×106个、4×106个、5×106个、6×106个、7×106个、8×106个、9×106个、1×107个、2×107个、3×107个、4×107个、5×107个、6×107个、7×107个、8×107个、9×107个、1×108个、2×108个、3×108个、4×108个、5×108个、6×108个、7×108个、8×108个、9×108个、1×109个、2×109个、3×109个、4×109个、5×109个、6×109个、7×109个、8×109个或9×109个细胞/mL。
在一些实施方案中，将混合物培养或扩增约几小时(例如，约3小时)至约21天或之间的任何小时整数值。在一些实施方案中，将细胞培养或扩增，例如，约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时、72小时、73小时、74小时、75小时、76小时、77小时、78小时、79小时、80小时、81小时、82小时、83小时、84小时、85小时、86小时、87小时、88小时、89小时、90小时、91小时、92小时、93小时、94小时、95小时、96小时、97小时、98小时、99小时、100小时、102小时、108小时、114小时、120小时、126小时、132小时、138小时、144小时、150小时、156小时、162小时、168小时、174小时、180小时、186小时、192小时、198小时、204小时、210小时、216小时、222小时、228小时、234小时、240小时、246小时、252小时、258小时、264小时、270小时、276小时、282小时、288小时、294小时、300小时、306小时、312小时、318小时、324小时、330小时、336小时、342小时、348小时、354小时、360小时、366小时、372小时、378小时、384小时、390小时、396小时、402小时、408小时、414小时、420小时、426小时、432小时、438小时、444小时、450小时、456小时、462小时、468小时、474小时、480小时、486小时、492小时、498小时、504小时、510小时、516小时、522小时、528小时或更多小时。在一些实施方案中，可以将细胞培养或扩增，例如，约1-96小时、1-72小时、1-48小时、1-24小时、1-12小时、1-6小时、1-3小时、2-96小时、2-72小时、2-48小时、2-24小时、2-12小时、2-6小时、2-3小时、3-96小时、3-72小时、3-78小时、3-24小时、3-12小时或3-6小时。
在一些实施方案中，将细胞培养或扩增约48小时。在一些实施方案中，将细胞培养或扩增约72小时。
在一些实施方案中，适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 5(Lonza))，在一些实施方案中，所述适当的培养基包含增殖和存活力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人类血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-21、IL-15、TGFβ和TGFα或任何其他用于细胞生长的添加剂。其他用于细胞生长的添加剂包括，但不限于，表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)、S-2-羟基戊二酸和还原剂诸如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、A1 M-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 15、X-Vivo 20、Optimizer，其中添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组规定的激素，和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。在一些实施方案中，抗生素，例如青霉素和链霉素被包括在实验培养物中。在一些实施方案中，抗生素，例如，青霉素和链霉素，被包括在待输注到受试者的细胞培养物中。在一些实施方案中，抗生素，例如，青霉素和链霉素，不被包括在待输注到受试者的细胞培养物中。在一些实施方案中，将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下；例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。在一些情况下，已经被暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。在一些实施方案中，使用对CD3、CD28、CD2或其任何组合特异性的抗原或抗原结合片段。在一些实施方案中，使用针对人类CD3、CD28、CD2或其任何组合的可溶性四聚体抗体。
在一些实施方案中，本公开内容的细胞在本文描述的其他过程之前或之后扩增，例如，在基因破坏之前或之后、在转基因导入之前或之后、在富集之前或之后(或其任何组合)扩增。
在一些实施方案中，本公开内容的细胞在扩增之前或扩增之后冷冻保存，并且随后解冻并恢复以用于进一步使用(例如，用于基因破坏、转基因引入、共培养测定、功能评价或其组合)。例如，在一些实施方案中，如本文描述的，细胞在扩增前冷冻保存，然后解冻和扩增。在一些实施方案中，如本文描述的，将细胞扩增，然后冷冻保存。在一些实施方案中，如本文描述的，将细胞冷冻保存，随后解冻和扩增，并且扩增的细胞可以被冷冻保存。可以使用例如二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂来冷冻保存细胞。可以将细胞在包含例如约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、21％、22％、23％或25％DMSO的培养基或缓冲液中冷冻保存。在一种实施方案中，将细胞在包含约90％胎牛血清和约10％DMSO的培养基中冷冻保存。
转基因介绍
T细胞功能的一个重要部分是T细胞受体(TCR)对MHC-I或MHC-II呈递的同源抗原的识别。同源抗原的识别可以导致活化、增殖和效应功能(例如，杀伤靶细胞、产生炎性细胞因子)。为了便于筛选参与T细胞识别同源抗原的免疫调节基因，可以使用转基因将具有已知特异性的外源TCR引入T细胞中。
a.免疫调节转基因
在一些实施方案中，所述转基因是免疫调节转基因。在一些实施方案中，所述免疫调节转基因编码改变免疫细胞功能的蛋白。在一些实施方案中，所述免疫调节转基因编码增强或改善免疫细胞免疫功能的蛋白。在一些实施方案中，所述免疫调节转基因编码下调或抑制免疫细胞免疫功能的蛋白。在一些实施方案中，所述免疫调节转基因编码改变T细胞功能的蛋白。在一些实施方案中，所述免疫调节转基因编码增强或改善T细胞功能的蛋白。在一些实施方案中，所述免疫调节转基因编码下调或抑制T细胞功能的蛋白。在一些实施方案中，所述免疫调节转基因编码改善T细胞功能的蛋白，其中所述蛋白是磷酸二酯酶1C(PDE1C)、rhotekin 2(RTKN2)、神经生长因子受体(NGFR)或参与选择的胸腺细胞表达分子(THEMIS)。
在一些实施方案中，所述转基因被随机插入基因组中。在一些实施方案中，所述转基因的插入靶向预先选择的基因组基因座。在一些实施方案中，所述基因组基因座是安全港位点。在一些实施方案中，所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5、hROSA26。在一些实施方案中，所述基因组基因座编码负调节免疫细胞的免疫功能或免疫应答的蛋白。在一些实施方案中，所述基因组基因座编码负调节T细胞的免疫功能或免疫应答的蛋白。在一些实施方案中，负调节T细胞的免疫功能或免疫应答的所述蛋白是免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述免疫检查点基因是PD1、CTLA-4、TCRA、TRAC、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)或蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。在一些实施方案中，将所述转基因插入编码负调节T细胞的免疫功能或免疫应答的蛋白的所述基因组基因座下调或完全抑制由所述基因组基因座编码的功能蛋白的表达。在一些实施方案中，将所述转基因插入编码免疫检查点基因的所述基因组基因座下调或完全抑制功能免疫检查点蛋白的表达。
在一些实施方案中，替代或除了转基因的插入之外，内源基因的表达被增强。在一些实施方案中，所述内源基因编码增强或改善免疫细胞功能的蛋白。在一些实施方案中，所述内源基因编码增强或改善T细胞功能的蛋白。在一些实施方案中，所述内源基因编码磷酸二酯酶1C(PDE1C)、rhotekin 2(RTKN2)、神经生长因子受体(NGFR)或参与选择的胸腺细胞表达分子(THEMIS)。在一些实施方案中，所述增强的表达由CRISPR活化(CRISPRa)介导。CRISPRa通过使用与基因启动子区或转录起始位点结合或邻近的gRNA来介导增强的表达。
b.T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施方案中，T细胞包含一种或更多种转基因。在一些实施方案中，一种或更多种转基因表达TCRα、TCRβ、TCRγ和/或TCRδ链蛋白，并且TCR识别来自已知抗原的表位(例如，G12D KRAS)。
在一些实施方案中，TCR包含如本文定义的α链和β链序列。在一些实施方案中，TCR包含如本文定义的γ链和δ链序列。
在一些实施方案中，TCR包含维持至少基本生物活性的融合蛋白。在一些实施方案中，在TCR的α链和β链的情况下，这可以意味着两条链仍然能够形成发挥其生物学功能，特别地结合至TCR的特定肽-MHC复合体和/或活化时的功能信号转导的T细胞受体(具有未修饰的α链和/或β链，或者具有另一种融合蛋白α链和/或β链)。在一些实施方案中，在TCR的γ链和δ链的情况下，这意味着两条链仍然能够形成发挥其生物学功能，特别地结合至TCR的特定肽-MHC复合体或其他配体和/或配体识别时的功能信号转导的T细胞受体(具有未修饰的γ链和/或δ链或者具有另一种融合蛋白γ链和/或δ链)。
在一些实施方案中，T细胞包含一种或更多种TCR。在一些实施方案中，T细胞包含对多于一种靶特异性的单个TCR。
在一些实施方案中，转基因(例如，TCR基因)被插入在安全港基因座。安全港基因座包含转基因可以整合并发挥作用而不干扰内源活性的基因组位置。例如，在一些实施方案中，一种或更多种转基因被插入HPRT、AAVS位点(例如AAVS1、AAVS2等)、CCR5、hROSA26中的任一种，和/或其任何组合中。在一些实施方案中，转基因(例如，TCR基因)被插入内源免疫调节基因中。在一些实施方案中，内源免疫调节基因是刺激性免疫调节基因或抑制性免疫调节基因。在一些实施方案中，转基因(例如，TCR基因)被插入刺激性免疫调节基因，诸如CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28或ICOS中。免疫调节基因位置可以使用基因组参考联盟人类构建38(the Genome Reference Consortium Human Build 38)补丁发布2(GRCh38.p2)组件来提供。在一些实施方案中，转基因(例如，TCR基因)被插入内源抑制性免疫调节基因，诸如A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA或CISH中。在一些实施方案中，例如，将一种或更多种转基因插入CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA、HPRT、AAVS位点(例如AAVS1、AAVS2等)、PHD1、PHD2、PHD3、CCR5、CISH、PPP1R12C、SIRT2、PTPN1中的任一种和/或其任何组合中。在一些实施方案中，转基因被插入内源TCR基因，例如，TRAC或TRB中。在一些实施方案中，转基因被插入编码基因组区域内。在一些实施方案中，转基因被插入非编码基因组区域内。在一些实施方案中，转基因在没有同源重组的情况下被插入基因组。在一些实施方案中，转基因被插入AAV整合位点。在一些实施方案中，在一些情况下，AAV整合位点是安全港。可能存在替代的AAV整合位点，诸如5号染色体上的AAVS2或3号染色体上的AAVS3。另外的AAV整合位点诸如AAVS 2、AAVS3、AAVS4、AAVS5、AAVS6、AAVS7、AAVS8等也被认为是用于外源受体诸如TCR的可能整合位点。如本文使用的，AAVS可以指AAVS1以及相关的腺相关病毒(AAVS)整合位点。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)由细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和控制T细胞活化的信号传导区域构成。在一些实施方案中，细胞外抗原识别结构域来源于鼠、人源化或完全人类单克隆抗体。在一些实施方案中，细胞外抗原识别结构域由单克隆抗体的重链和轻链的可变区构成(所述单克隆抗体以单链可变片段(scFv)的形式克隆)，并且通过铰链和跨膜结构域连接至T细胞受体(TCR)复合体的细胞内信号传导结构域和至少一个来自共刺激分子的结构域。在一些实施方案中，所述CAR包含共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CAR不包含共刺激结构域。
在一些实施方案中，本公开内容的CAR存在于真核细胞例如哺乳动物细胞的质膜中，其中合适的哺乳动物细胞包括，但不限于，细胞毒性细胞、T淋巴细胞、干细胞、干细胞的后代、祖细胞、祖细胞的后代、NK细胞和NKT细胞。在一些实施方案中，当存在于真核细胞的质膜中时，CAR在存在其结合靶的情况下是活性的。在一些实施方案中，靶在膜上表达。在一些实施方案中，靶是可溶性的(例如，未与细胞结合)。在一些实施方案中，靶存在于细胞诸如靶细胞的表面上。在一些实施方案中，靶呈现在固体表面，诸如脂双层上；等等。在一些实施方案中，靶是可溶性的，诸如可溶性的抗原。在一些实施方案中，靶是抗原。在一些实施方案中，抗原存在于细胞诸如靶细胞的表面上。在一些实施方案中，抗原呈现在固体表面，诸如脂双层上；等等。在一些实施方案中，靶是抗原的表位。在一些实施方案中，靶是癌症新抗原。
c.位点特异性插入
在一些实施方案中，在本文公开的任何方法中插入一种或更多种转基因是位点特异性的。在一些实施方案中，转基因包含启动子(例如，MND启动子)。在一些实施方案中，转基因被插入以便利用基因组中已经存在的启动子。例如，在一些实施方案中，一种或更多种具有启动子的转基因(例如，TCR)被插入基因组中。在一些实施方案中，一种或更多种缺乏启动子的转基因(例如，TCR)被插入在启动子的邻近或附近。在一些实施方案中，缺乏启动子的转基因利用例如剪接接纳体插入靶序列。在一些实施方案中，一种或更多种转基因被插入在基因(例如，TRAC)的外显子的邻近、附近或内部。这样的插入可以用于在破坏内源基因(例如，TRAC)的同时敲入转基因(例如，具有已知抗原特异性的TCR转基因，诸如对G12DKRAS特异性的TCR转基因)。在另一个实例中，一种或更多种转基因可以被插入在基因的内含子的邻近、附近或内部。在一些实施方案中，将转基因使用AAV病毒载体引入，并且整合到靶向的基因组位置中。在一些实施方案中，转基因(诸如TCR)被插入TRAC基因座或TCRB基因座。在一些实施方案中，转基因(诸如TCR)被插入免疫检查点基因，诸如CISH、CTLA-4和/或PD-1。通过将TCR插入免疫检查点基因，可以测定免疫细胞(诸如T细胞)对癌细胞具有协同细胞毒性(细胞溶解)作用的基因。例如，可以测定T细胞的CISH破坏和第二(候选)基因破坏之间的协同作用。
在一些实施方案中，待插入的转基因的侧翼是类似于基因组中靶向双链断裂位点的工程化位点，以从多核酸中切离转基因，使得转基因可以插入在双链断裂区域处。在一些实施方案中，转基因以病毒方式引入。例如，可以利用AAV病毒将转基因递送至细胞。在一些实施方案中，使用修饰的或工程化的AAV病毒将转基因引入细胞。在一些实施方案中，修饰的或野生型AAV包含至少一个基因组位置的同源臂。
位点特异性基因编辑可以使用非病毒基因编辑来实现，所述非病毒基因编辑诸如CRISPR、TALEN(参见美国专利第9,393,257号)、Argonaute(例如，能够在中温(mesophilictemperature)破坏基因组的Argonaute系统)、基于转座子的、锌指(ZFN)、兆核酸酶或Mega-TAL或基于转座子的系统。例如，可以使用PiggyBac(参见Moriaty，B.S.，等人，“Modularassembly of transposon integratable multigene vectors using RecWay assembly,”Nucleic Acids Research(8):e92(2013)或睡美人(参见Aronovich，E.L，等人，“TheSleeping Beauty transposon system:a non-viral vector for gene therapy,”Hum.Mol.Genet.,20(R1):R14–R20.(2011)转座子系统。在一些实施方案中，位点特异性基因编辑用两部分系统完成，例如，包括靶向部分(例如，催化死亡的Cas蛋白诸如dCas9)和破坏部分(例如，内切核酸酶，诸如ZFN、TALEN或在中温是活性的Argonaute)。在这方面，本领域技术人员将理解，尽管CRISPR/Cas系统在破坏效率方面提供了某些优点，但本文描述的多种系统也可以用于在候选基因中产生破坏。
位点特异性基因编辑也可以在没有同源重组的情况下实现。外源多核酸可以在不使用同源重组的情况下引入细胞基因组中。在一些情况下，转基因的侧翼可以是与基因组中靶向双链断裂区域互补的工程化位点。转基因可以从多核酸中切离，使得转基因可以在没有同源重组的情况下插入在双链断裂区域处。
在一些实施方案中，转基因的侧翼是一个或更多个与基因组中靶向双链断裂区域互补的工程化位点。在一些实施方案中，工程化位点不是重组臂。在一些实施方案中，工程化位点与双链断裂区域具有同源性。在一些实施方案中，工程化位点与基因具有同源性。在一些实施方案中，工程化位点与编码基因组区域具有同源性。在一些实施方案中，工程化位点与非编码基因组区域具有同源性。在一些实施方案中，转基因从多核酸中切离，使得转基因可以在没有同源重组的情况下插入在双链断裂区域处。在一些实施方案中，转基因在没有同源重组的情况下整合到双链断裂中。
在一些实施方案中，转基因包含与其被放置的基因组序列不同的序列。在一些实施方案中，供体转基因包含侧翼有两个同源区域的非同源序列，以允许在感兴趣的位置处进行有效的同源定向修复(HDR)。在一些实施方案中，转基因的侧翼是重组臂。在一些实施方案中，重组臂包含将转基因靶向期望的整合位点的互补区域。此外，在一些实施方案中，转基因序列包含含有与细胞染色质中感兴趣区域不同源的序列的载体分子。在一些实施方案中，转基因包含若干与细胞染色质同源的不连续区域。例如，对于通常不存在于感兴趣区域中的序列的靶向插入，序列可以存在于供体核酸分子中，并且侧翼是与感兴趣区域中的序列同源的区域。在一些实施方案中，转基因包含剪接接纳体。
在一些实施方案中，多核酸包括转基因。在一些实施方案中，转基因编码外源受体。例如，在一些实施方案中，本文公开了一种多核酸，所述多核酸包含至少一个外源T细胞受体(TCR)序列(侧翼是具有与基因组序列内是TRAC的多核苷酸互补的序列的至少两个重组臂)、腺苷A2a受体、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1、B和T淋巴细胞相关因子、细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4、吲哚胺2,3-双加氧酶1、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1、淋巴细胞活化基因3、程序性细胞死亡1、甲型肝炎病毒细胞受体2、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子或自然杀伤细胞受体2B4。
d.随机插入
在一些实施方案中，本文描述的方法的一种或更多种转基因被随机插入细胞基因组。如果将这些转基因插入基因组的任何地方，它们都可以发挥功能。例如，转基因可以编码其自己的启动子，或者可以插入到在内源启动子控制下的位置。可选地，可以将转基因插入基因，诸如基因的内含子、基因的外显子、启动子或非编码区。
编码转基因序列的核酸例如RNA可以随机插入细胞的染色体中。随机整合可以由任何将核酸，例如RNA引入细胞的方法产生。例如，方法可以是但不限于电穿孔、声穿孔(sonoporation)、基因枪的使用、脂质体转染、磷酸钙转染、树枝状大分子的使用、显微注射、病毒载体(包括腺病毒载体、AAV病毒载体和逆转录病毒载体)的使用，和/或II组核酶。
e.转基因表达、组成和起源
转基因可以用于表达感兴趣的基因。在一些实施方案中，转基因用于内源基因的过表达。在一些实施方案中，转基因用于外源基因，例如在转基因引入前的基因组中不存在的基因的表达。转基因也可以包含其他类型的基因，例如，显性负性基因。
在一些实施方案中，包含转基因的多核酸载体包含促进转基因表达的转基因启动子。在一些实施方案中，包含转基因的多核酸载体缺乏转基因启动子，例如，导致转基因仅在被整合到基因组中包含上游启动子的位置处或在包含上游启动子的开放阅读框序列内时才表达。使用包含转基因且缺乏转基因启动子的多核酸载体可以例如导致转基因附加体(episomal)表达减少，允许选择包含转基因整合和表达的细胞，或其组合。
在一些实施方案中，编码转基因的核酸被设计成包含报道物基因，从而可以通过报道物基因的活化来检测转基因或其表达产物的存在。可以使用任何报道物基因，诸如荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白GFP)或萤光素酶。包含转基因的细胞可以基于报道物基因的表达来选择。
转基因的表达可以通过表达测定例如qPCR来验证，或通过测量RNA的水平来验证。表达水平也可以指示拷贝数。例如，如果表达水平极高，这可能指示基因组中整合了多于一个拷贝的转基因。可选地，高表达可以指示转基因被整合在高转录区，例如，高表达启动子附近。表达也可以通过测量蛋白水平来验证，诸如通过蛋白质印迹来验证。在一些情况下，剪接接纳体测定可以与报道物系统一起用于测量转基因整合。
转基因多核酸可以是单链或双链的DNA或RNA，并且可以以线性或环状形式引入细胞中。一种或更多种转基因序列可以被包含在DNA小环(DNAmini-circle)中，DNA小环可以以环状或线形的形式引入细胞中。如果以线性形式引入，转基因序列的末端可以通过任何方法保护(例如，免于外切核酸酶降解)。例如，一个或更多个双脱氧核苷酸残基可以添加至线性分子的3’末端，和/或自互补寡核苷酸可以连接至一个末端或两个末端。保护外源多核苷酸免于降解的另外的方法包括但不限于添加一个或更多个末端氨基基团和使用修饰的核苷酸间连接，诸如，例如，硫代磷酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidate)和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。
通常，转基因是指包含多个核苷酸亚单位的线性聚合物。转基因可以包含任何数目的核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含少于约100个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含至少约100个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含至少约200个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含至少约300个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含至少约400个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含至少约500个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含至少约1000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含至少约5000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含至少约10,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含至少约20,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含至少约30,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含至少约40,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含至少约50,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含约500个和约5000个之间的核苷酸。在一些情况下，转基因可以包含约5000个和约10,000个之间的核苷酸。在本文公开的任何情况下，转基因可以包括DNA、RNA或DNA和RNA的杂合体(hybrid of DNA and RNA)。在一些情况下，转基因可以是单链的。在一些情况下，转基因可以是双链的。
一种或更多种转基因可以来自不同的物种。例如，一种或更多种转基因可以包括人类基因、小鼠基因、大鼠基因、猪基因、牛基因、犬基因、猫基因、猴基因、黑猩猩基因或其任何组合。例如，转基因可以来自人类，具有人类遗传序列。一种或更多种转基因可以包括人类基因。在一些情况下，一种或更多种转基因不是腺病毒基因。
f.用于转基因引入的实验考虑
本公开内容的转基因可以被递送至任何数目的细胞。转基因可以被递送至例如约1×103个、2×103个、3×103个、4×103个、5×103个、6×103个、7×103个、8×103个、9×103个、1×104个、2×104个、3×104个、4×104个、5×104个、6×104个、7×104个、8×104个、9×104个、1×105个、2×105个、3×105个、4×105个、5×105个、6×105个、7×105个、8×105个、9×105个、1×106个、2×106个、3×106个、4×106个、5×106个、6×106个、7×106个、8×106个、9×106个、1×107个、2×107个、3×107个、4×107个、5×107个、6×107个、7×107个、8×107个、9×107个、1×108个、2×108个、3×108个、4×108个、5×108个、6×108个、7×108个、8×108个、9×108个、1×109个、2×109个、3×109个、4×109个、5×109个、6×109个、7×109个、8×109个或9×109个细胞。
在一些实施方案中，转基因可以通过用病毒载体转导来递送。在一些实施方案中，转基因可以通过逆转录病毒，诸如慢病毒载体来递送。在一些实施方案中，转基因可以通过腺病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒(AAV))、逆转录病毒、疱疹病毒或整合酶缺陷型慢病毒(IDLV)来递送。病毒载体可以用于以以下的感染复数将转基因递送至靶细胞：例如，约5×1010:1、1×1010:1、5×109:1、1×109:1、5×108:1、1×108:1、5×107:1、1×107:1、5×106:1、1×106:1、5×105:1、1×105:1、5×104:1、1×104:1、5×103:1、1×103:1、900:1、800:1、700:1、600:1、500:1、400:1、300:1、250:1、200:1、150:1、100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1×103、1:5×103、1:1×104、1:5×104、1:1×105、1:5×105、1:1×106、1:5×106、1:1×107、1:5×107、1:1×108、1:5×108、1:1×109、1:5×109、1:1×1010或1:5×1010。在一些实施方案中，转基因可以通过电穿孔来递送。
在转基因引入之后、后续处理之前，可以允许本公开内容的细胞恢复。例如，在转基因引入之后，在扩增、刺激、富集、冷冻保存、共培养测定或功能评价之前，细胞可以通过在完全培养基中培养来恢复。细胞可以在转基因引入之后、后续处理之前恢复持续，例如，约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时、72小时、73小时、74小时、75小时、76小时、77小时、78小时、79小时、80小时、81小时、82小时、83小时、84小时、85小时、86小时、87小时、88小时、89小时、90小时、91小时、92小时、93小时、94小时、95小时、96小时、97小时、98小时、99小时、100小时、102小时、108小时、114小时、120小时、126小时、132小时、138小时、144小时、150小时、156小时、162小时、168小时、174小时、180小时、186小时、192小时、198小时、204小时、210小时、216小时、222小时、228小时、234小时、240小时、246小时、252小时、258小时、264小时、270小时、276小时、282小时、288小时、294小时、300小时、306小时、312小时、318小时、324小时、330小时、336小时、342小时、348小时、354小时、360小时、366小时、372小时、378小时、384小时、390小时、396小时、402小时、408小时、414小时、420小时、426小时、432小时、438小时、444小时、450小时、456小时、462小时、468小时、474小时、480小时、486小时、492小时、498小时、504小时、510小时、516小时、522小时、528小时或更多小时。
本公开内容的细胞可以在转基因引入之前或之后冷冻保存。例如，细胞可以冷冻保存，然后解冻，培养，并如本文描述引入转基因。转基因可以如本文描述引入细胞，并且包含引入的转基因的细胞可以随后冷冻保存。细胞可以冷冻保存，随后解冻并进行转基因引入，并且在转基因引入后冷冻保存。在解冻之后、后续使用之前，细胞可以在培养基中恢复。
基因破坏
本文尤其公开了用于鉴定免疫调节基因的方法。为了筛选T细胞中的免疫调节基因，可以使用基因破坏(敲除)技术，并且可以测试基因破坏对T细胞功能的影响(例如，用于杀伤靶细胞的细胞毒性测定)。基因破坏技术也可以用于破坏已知的免疫调节基因，例如，用作对照，或寻找加性效应。此外，基因破坏技术可以用于促进转基因整合到基因组中的期望位置(例如，将G12D KRAS特异性的TCR整合到TRAC基因座中)。
在一些实施方案中，基因破坏技术包括基因编辑。例如，基因编辑可以使用核酸酶进行，所述核酸酶包括CRISPR相关蛋白(Cas蛋白，例如，Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute核酸酶和兆核酸酶。核酸酶包括，但不限于，天然存在的、遗传修饰的和/或重组的核酸酶。基因编辑也可以使用基于转座子的系统(例如，PiggyBac、睡美人)进行。例如，在一些实施方案中，基因编辑使用转座酶进行。
在一些实施方案中，使用CRISPR系统在靶基因中产生双链断裂，以破坏候选免疫调节基因、促进转基因的整合或其组合。在一些实施方案中，CRISPR相关(Cas)蛋白包括酶活性以在DNA中在由指导RNA (gRNA)确定的位点处产生双链断裂(DSB)。靶DNA的位点特异性裂解发生在由1)和2)二者确定的位置处，1)指导RNA和靶DNA (也称为前间区)之间的碱基配对互补性和2)靶DNA中称为前间区邻近基序(PAM)的短基序。例如，工程化细胞可以使用CRISPR系统，例如，II型CRISPR系统来产生。在本文公开的方法中使用的Cas酶可以是Cas9，其催化DNA裂解。通过来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9或任何密切相关的Cas9的酶促作用可以在靶位点序列处产生双链断裂，靶位点序列与指导序列的20个核苷酸杂交，并且在靶序列的20个核苷酸后具有前间区邻近基序(PAM)。CRISPR系统在本申请的其他地方被更详细地描述。
指导RNA(gRNA)的文库或阵列可以与Cas蛋白一起使用来破坏多于一种基因。例如，可以使用RNA阵列破坏T细胞中的多于一种候选免疫调节基因，并且基因破坏对免疫功能的影响可以例如通过在细胞毒性测定中测量杀伤靶细胞的能力来评价。
在一些实施方案中，T细胞包含一种或更多种断裂的基因和一种或更多种转基因。在一些实施方案中，内源TCR被破坏，并且编码具有已知特异性的TCR的转基因被敲入。在一些实施方案中，具有已知特异性的TCR可以靶向肿瘤抗原或新抗原。在一些实施方案中，内源TCR被破坏，并且编码G12D KRAS特异性TCR的转基因被敲入。
在一些实施方案中，候选免疫调节基因是尚未被鉴定为免疫调节基因的基因。因此，在一些实施方案中，gRNA阵列包括靶向多于一种基因或甚至基因组中所有基因的gRNA。在一些实施方案中，gRNA阵列包括靶向可药化基因组的gRNA。在一些实施方案中，gRNA阵列包括靶向靶基因选集(a selection of target genes)的gRNA。在一些实施方案中，gRNA阵列包括靶向通过如本文描述的算法选择的基因的gRNA。
在一些实施方案中，gRNA通过用病毒载体转导来递送。在一些实施方案中，gRNA通过逆转录病毒，诸如慢病毒载体来递送。在一些实施方案中，gRNA通过腺病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒(AAV))、逆转录病毒、疱疹病毒或整合酶缺陷型慢病毒(IDLV)来递送。在一些实施方案中，gRNA通过电穿孔来递送。在一些实施方案中，掺入赋予细胞内酶促降解抗性的RNA碱基修饰(诸如在单个或多于一个末端RNA碱基上掺入的2’-O-甲基3’硫代磷酸酯)的合成gRNA通过电穿孔或其他转染方法来递送。
在一些实施方案中，已知的免疫调节基因被破坏，例如，与一种或更多种候选基因的破坏组合。在一些实施方案中，已知的免疫调节基因位置使用基因组参考联盟人类构建38补丁发布2(GRCh38.p2)组件来提供。
在一些实施方案中，待敲除的基因使用数据库选择。在一些情况下，某些内源基因更适于基因组工程化。在一些实施方案中，数据库包括表观遗传容许的靶位点。在一些情况下，数据库可以是ENCODE(DNA元件百科全书)(http://www.genome.gov/10005107)。在一些实施方案中，数据库可以鉴定具有开放染色质的对基因组工程化更容许的区域。
例如，在一些实施方案中，其表达被破坏的一种或更多种基因包括以下中的任一种：腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、程序性细胞死亡1(PD-1)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点(AAVS位点(例如AAVS1、AAVS2等))或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)或蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)或其任何组合。例如，仅仅为了说明各种组合，其表达被破坏的一种或更多种基因可以包括PD-1、CLTA-4和CISH。在一些实施方案中，PD-1、CTLA-4、CISH、另外的候选免疫调节基因或其一些组合的表达被破坏。
在一些实施方案中，其表达被破坏的一种或更多种基因包括以下中的任一种：CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、PHD1、PHD2、PHD3、VISTA、CISH、PPP1R12C、SIRT2、PTPN1或其任何组合。
可以被破坏的基因的实例包括表1中提供的基因。
表1：破坏靶
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Figure BDA0003190278790000721
Figure BDA0003190278790000731
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Figure BDA0003190278790000751
Figure BDA0003190278790000761
在一些实施方案中，将多于一种基因在一个实验中破坏。在一些实施方案中，将多于一种基因在细胞的单个群体或细胞的不同群体中破坏。在一些实施方案中，将不同的基因在96孔板的每个孔中破坏。在一些实施方案中，在单个实验中破坏的不同基因的数目大于至少约1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种、50种、51种、52种、53种、54种、55种、56种、57种、58种、59种、60种、61种、62种、63种、64种、65种、66种、67种、68种、69种、70种、71种、72种、73种、74种、75种、76种、77种、78种、79种、80种、81种、82种、83种、84种、85种、86种、87种、88种、89种、90种、91种、92种、93种、94种、95种、96种、97种、98种、99种、100种、105种、110种、115种、120种、125种、130种、135种、140种、145种、150种、160种、170种、180种、190种、192种、200种、250种、288种、300种、384种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2500种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种、15000种、20000种、25000种或30000种基因。在一些实施方案中，在单个实验中破坏的基因的数目是最多约1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种、50种、51种、52种、53种、54种、55种、56种、57种、58种、59种、60种、61种、62种、63种、64种、65种、66种、67种、68种、69种、70种、71种、72种、73种、74种、75种、76种、77种、78种、79种、80种、81种、82种、83种、84种、85种、86种、87种、88种、89种、90种、91种、92种、93种、94种、95种、96种、97种、98种、99种、100种、105种、110种、115种、120种、125种、130种、135种、140种、145种、150种、160种、170种、180种、190种、192种、200种、250种、288种、300种、384种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2500种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种、15000种、20000种、25000种或30000种基因。
在一些实施方案中，将细胞中的一种或更多种基因使用任何方法敲除或破坏。例如，T细胞中的一种或更多种候选免疫调节基因可以被敲除或破坏，并且所得的T细胞可以，例如，通过在细胞毒性测定中测量杀伤靶细胞的能力进行功能评价。在一些实施方案中，敲除一种或更多种基因包括破坏来自T细胞基因组中的一种或更多种基因。在一些实施方案中，敲除还包括从T细胞中去除基因序列的全部或一部分。在一些实施方案中，敲除包括用一个或更多个核苷酸替代T细胞基因组中基因的全部或一部分。在一些实施方案中，敲除一种或更多种基因包括在一种或更多种基因中插入序列，从而破坏一种或更多种基因的表达。例如，在一些实施方案中，插入序列可以在一种或更多种基因的中间产生终止密码子。插入序列也可以使一种或更多种基因的开放阅读框移码。
如本文公开的基因破坏方法可以应用于任何数目的细胞。基因破坏方法可以利用例如约1×103个、2×103个、3×103个、4×103个、5×103个、6×103个、7×103个、8×103个、9×103个、1×104个、2×104个、3×104个、4×104个、5×104个、6×104个、7×104个、8×104个、9×104个、1×105个、2×105个、3×105个、4×105个、5×105个、6×105个、7×105个、8×105个、9×105个、1×106个、2×106个、3×106个、4×106个、5×106个、6×106个、7×106个、8×106个、9×106个、1×107个、2×107个、3×107个、4×107个、5×107个、6×107个、7×107个、8×107个、9×107个、1×108个、2×108个、3×108个、4×108个、5×108个、6×108个、7×108个、8×108个、9×108个、1×109个、2×109个、3×109个、4×109个、5×109个、6×109个、7×109个、8×109个或9×109个靶细胞或更多个靶细胞来进行。
在一些实施方案中，在基因破坏之后、后续处理之前，允许本公开内容的细胞恢复。例如，在一些实施方案中，在基因破坏之后，在扩增、刺激、富集、冷冻保存、共培养测定或功能评价之前，细胞通过在完全培养基中培养来恢复。在一些实施方案中，细胞在转基因破坏之后、后续处理之前恢复持续，例如，约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时、72小时、73小时、74小时、75小时、76小时、77小时、78小时、79小时、80小时、81小时、82小时、83小时、84小时、85小时、86小时、87小时、88小时、89小时、90小时、91小时、92小时、93小时、94小时、95小时、96小时、97小时、98小时、99小时、100小时、102小时、108小时、114小时、120小时、126小时、132小时、138小时、144小时、150小时、156小时、162小时、168小时、174小时、180小时、186小时、192小时、198小时、204小时、210小时、216小时、222小时、228小时、234小时、240小时、246小时、252小时、258小时、264小时、270小时、276小时、282小时、288小时、294小时、300小时、306小时、312小时、318小时、324小时、330小时、336小时、342小时、348小时、354小时、360小时、366小时、372小时、378小时、384小时、390小时、396小时、402小时、408小时、414小时、420小时、426小时、432小时、438小时、444小时、450小时、456小时、462小时、468小时、474小时、480小时、486小时、492小时、498小时、504小时、510小时、516小时、522小时、528小时或更多小时。
在一些实施方案中，本公开内容的细胞在基因破坏之前或之后冷冻保存。例如，在一些实施方案中，将细胞冷冻保存，然后解冻、培养，并且基因如本文描述进行破坏。在一些实施方案中，将基因如本文描述在细胞中破坏，并且随后将包含破坏的基因的细胞冷冻保存。在一些实施方案中，将细胞冷冻保存，随后解冻，进行基因破坏，并且在基因破坏之后冷冻保存。
基因抑制也可以通过多种方式实现。例如，基因表达可以通过敲除、改变基因启动子和/或施用干扰RNA来抑制。这可以在生物体水平或组织、器官和/或细胞水平实现。如果一种或更多种基因在细胞、组织和/或器官中被敲低，则该一种或更多种基因可以通过施用RNA干扰试剂(例如，siRNA、shRNA或微RNA)来抑制。例如，可以表达shRNA的核酸可以被稳定地转染到细胞中以敲低表达。此外，可以表达shRNA的核酸可以被插入T细胞的基因组，从而敲低T细胞内的基因。
编辑的细胞的富集、质量控制和储存
本文尤其公开了鉴定免疫调节基因的筛选测定。具有期望细胞的高度富集群体可以有助于这些测定的灵敏度。例如，与T细胞的异质群体相比，主要包含表达具有已知特异性的TCR的T细胞的群体将有助于更好地识别靶细胞(例如，在用表达同源抗原的细胞进行的细胞毒性测定中)。
在一些实施方案中，将包含基因破坏或转基因插入的细胞使用以下来富集：例如，使用具有阳性或阴性选择的荧光活化细胞分选(FACS)、具有正选择或负选择的磁性活化细胞分选(MACS)、基于培养的方法(例如，培养中的选择性扩增、化学选择(例如，抗生素抗性))或其组合。在一些实施方案中，报道物基因表达的获得或丧失是富集的基础(例如，荧光蛋白或萤光素酶)。
在一些实施方案中，将包含表达具有已知特异性的TCR或包含感兴趣的基因破坏的细胞的细胞群体用荧光缀合抗体或肽-MHC多聚体进行染色，并且通过FACS进行分选。
在一些实施方案中，将包含表达具有已知特异性的TCR的细胞的细胞群体通过在培养物中选择性扩增来富集表达TCR的细胞。例如，在一些实施方案中，如本公开内容中描述的，将编码具有已知特异性的TCR的转基因引入细胞群体中。在一些实施方案中，将表达TCR的细胞使用特异性活化引入的TCR但不活化缺乏该TCR的细胞的方法选择性扩增。在一些实施方案中，引入的TCR例如通过特异性结合引入的TCR的抗体或其片段、特异性结合引入的TCR的肽-MHC多聚体、特异性结合引入的TCR的单链肽-MHC多聚体、特异性结合该TCR的人工抗原呈递细胞或呈递与引入的TCR同源的抗原的抗原呈递细胞来活化。
在一些实施方案中，引入的转基因编码包含与内源TCR不同的氨基酸序列的TCR。在一些实施方案中，不同的氨基酸是TCR的可变区或恒定区域的一部分。在一些实施方案中，不同的氨基酸是包含引入的TCR的细胞选择性扩增的基础。在一些实施方案中，引入的转基因包含来自不同于人类TCR的鼠TCR的一个或更多个氨基酸序列。
在一些实施方案中，培养物中的选择性扩增还包括一种或更多种共受体，例如，CD28、ICOS、CD27或4-1BB(CD137)的活化。选择性扩增还可以包括细胞因子信号，例如，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、TNF-α、IFN-γ或其任何组合。
在一些实施方案中，如本文描述的细胞的选择性扩增包括将细胞培养，例如，至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时、72小时、73小时、74小时、75小时、76小时、77小时、78小时、79小时、80小时、81小时、82小时、83小时、84小时、85小时、86小时、87小时、88小时、89小时、90小时、91小时、92小时、93小时、94小时、95小时、96小时、97小时、98小时、99小时、100小时、102小时、108小时、114小时、120小时、126小时、132小时、138小时、144小时、150小时、156小时、162小时、168小时、174小时、180小时、186小时、192小时、198小时、204小时、210小时、216小时、222小时、228小时、234小时、240小时、246小时、252小时、258小时、264小时、270小时、276小时、282小时、288小时、294小时、300小时、306小时、312小时、318小时、324小时、330小时、336小时、342小时、348小时、354小时、360小时、366小时、372小时、378小时、384小时、390小时、396小时、402小时、408小时、414小时、420小时、426小时、432小时、438小时、444小时、450小时、456小时、462小时、468小时、474小时、480小时、486小时、492小时、498小时、504小时、510小时、516小时、522小时、528小时或更多小时。
在一些实施方案中，如本文描述的细胞的选择性扩增包括将细胞培养，例如，至多约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时、72小时、73小时、74小时、75小时、76小时、77小时、78小时、79小时、80小时、81小时、82小时、83小时、84小时、85小时、86小时、87小时、88小时、89小时、90小时、91小时、92小时、93小时、94小时、95小时、96小时、97小时、98小时、99小时、100小时、102小时、108小时、114小时、120小时、126小时、132小时、138小时、144小时、150小时、156小时、162小时、168小时、174小时、180小时、186小时、192小时、198小时、204小时、210小时、216小时、222小时、228小时、234小时、240小时、246小时、252小时、258小时、264小时、270小时、276小时、282小时、288小时、294小时、300小时、306小时、312小时、318小时、324小时、330小时、336小时、342小时、348小时、354小时、360小时、366小时、372小时、378小时、384小时、390小时、396小时、402小时、408小时、414小时、420小时、426小时、432小时、438小时、444小时、450小时、456小时、462小时、468小时、474小时、480小时、486小时、492小时、498小时、504小时、510小时、516小时、522小时、528小时或更少小时。
在一些实施方案中，如本文描述的细胞的选择性扩增包括将细胞培养，例如，以下的时间：约6-240小时之间、12-168小时之间、24-168小时之间、36-168小时之间、48-168小时之间、72-168小时之间、96-168小时之间、120-168小时之间、144-168小时之间、12-144小时之间、24-144小时之间、36-144小时之间、48-144小时之间、60-144小时之间、72-144小时之间、96-144小时之间、120-144小时之间、12-120小时之间、24-120小时之间、36-120小时之间、48-120小时之间、60-120小时之间、72-120小时之间、84-120小时之间、96-120小时之间、108-120小时之间、12-108小时之间、24-108小时之间、36-108小时之间、48-108小时之间、60-108小时之间、72-108小时之间、84-108小时之间、96-108小时之间、12-96小时之间、24-96小时之间、36-96小时之间、48-96小时之间、60-96小时之间、72-96小时之间、84-96小时之间、12-84小时之间、24-84小时之间、36-84小时之间、48-84小时之间、60-84小时之间、72-84小时之间、12-72小时之间、24-72小时之间、36-72小时之间、48-72小时之间、60-72小时之间、12-60小时之间、24-60小时之间、36-60小时之间、48-60小时之间、12-48小时之间、24-48小时之间、36-48小时之间、42-48小时之间、12-42小时之间、18-42小时之间、24-42小时之间、30-42小时之间、36-42小时之间、12-36小时之间、18-36小时之间、24-36小时之间或12-24小时之间。
在一些实施方案中，选择性扩增在物理细胞分选(例如，通过FACS或MACS)之前或之后进行。在一些实施方案中，在选择性扩增之后，不对细胞进行物理细胞分选。
在一些实施方案中，进行质量控制测定以验证基因编辑，例如，具有已知特异性的TCR的敲入、感兴趣基因的破坏或其组合。在一些实施方案中，质量控制测定包括，例如，流式细胞术、蛋白质印迹、通过分解追踪插入缺失(TIDE)、聚合酶链式反应(PCR)、核酸测序或其组合。
在一些实施方案中，将群体中包含基因破坏或转基因插入的细胞的百分比定量。在一些实施方案中，将群体中包含基因破坏或转基因插入的细胞的百分比在如本文描述的富集之前或之后定量。在一些实施方案中，细胞群体包含至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％或更多的包含基因破坏或转基因插入的细胞。
在一些实施方案中，在如本文描述的富集之前或之后，细胞群体包含至多约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％或更多的包含基因破坏或转基因插入的细胞。
在一些实施方案中，在如本文描述的富集之前或之后，细胞群体包含约5％至100％之间、10％至100％之间、15％至100％之间、20％至100％之间、25％至100％之间、30％至100％之间、35％至100％之间、40％至100％之间、45％至100％之间、50％至100％之间、55％至100％之间、60％至100％之间、65％至100％之间、70％至100％之间、75％至100％之间、80％至100％之间、85％至100％之间、90％至100％之间、95％至100％之间、96％至100％之间、97％至100％之间、98％至100％之间、99％至100％之间、99.5％至100％之间、5％至95％之间、10％至95％之间、15％至95％之间、20％至95％之间、25％至95％之间、30％至95％之间、35％至95％之间、40％至95％之间、45％至95％之间、50％至95％之间、55％至95％之间、60％至95％之间、65％至95％之间、70％至95％之间、75％至95％之间、80％至95％之间、85％至95％之间、90％至95％之间、5％至90％之间、10％至90％之间、15％至90％之间、20％至90％之间、25％至90％之间、30％至90％之间、35％至90％之间、40％至90％之间、45％至90％之间、50％至90％之间、55％至90％之间、60％至90％之间、65％至90％之间、70％至90％之间、75％至90％之间、80％至90％之间、85％至90％之间、5％至85％之间、10％至85％之间、15％至85％之间、20％至85％之间、25％至85％之间、30％至85％之间、35％至85％之间、40％至85％之间、45％至85％之间、50％至85％之间、55％至85％之间、60％至85％之间、65％至85％之间、70％至85％之间、75％至85％之间、80％至85％之间、5％至80％之间、10％至80％之间、15％至80％之间、20％至80％之间、25％至80％之间、30％至80％之间、35％至80％之间、40％至80％之间、45％至80％之间、50％至80％之间、55％至80％之间、60％至80％之间、65％至80％之间、70％至80％之间、75％至80％之间、5％至75％之间、10％至75％之间、15％至75％之间、20％至75％之间、25％至75％之间、30％至75％之间、35％至75％之间、40％至75％之间、45％至75％之间、50％至75％之间、55％至75％之间、60％至75％之间、65％至75％之间、70％至75％之间、5％至70％之间、10％至70％之间、15％至70％之间、20％至70％之间、25％至70％之间、30％至70％之间、35％至70％之间、40％至70％之间、45％至70％之间、50％至70％之间、55％至70％之间、60％至70％之间、65％至70％之间、5％至65％之间、10％至65％之间、15％至65％之间、20％至65％之间、25％至65％之间、30％至65％之间、35％至65％之间、40％至65％之间、45％至65％之间、50％至65％之间、55％至65％之间、60％至65％之间、5％至60％之间、10％至60％之间、15％至60％之间、20％至60％之间、25％至60％之间、30％至60％之间、35％至60％之间、40％至60％之间、45％至60％之间、50％至60％之间、55％至60％之间、5％至55％之间、10％至55％之间、15％至55％之间、20％至55％之间、25％至55％之间、30％至55％之间、35％至55％之间、40％至55％之间、45％至55％之间、50％至55％之间、5％至50％之间、10％至50％之间、15％至50％之间、20％至50％之间、25％至50％之间、30％至50％之间、35％至50％之间、40％至50％之间、45％至50％之间、5％至45％之间、10％至45％之间、15％至45％之间、20％至45％之间、25％至45％之间、30％至45％之间、35％至45％之间、40％至45％之间、5％至40％之间、10％至40％之间、15％至40％之间、20％至40％之间、25％至40％之间、30％至40％之间、35％至40％之间、5％至100％之间、10％至35％之间、15％至35％之间、20％至35％之间、25％至35％之间、30％至35％之间、5％至30％之间、10％至30％之间、15％至30％之间、20％至30％之间、25％至30％之间、5％至25％之间、10％至25％之间、15％至25％之间、20％至25％之间、5％至20％之间、10％至20％之间、15％至20％之间、5％至15％之间、10％至15％之间或5％至10％之间的包含基因破坏或转基因插入的细胞。
在一些实施方案中，将本公开内容的编辑的细胞新鲜使用，或冷冻保存并且稍后恢复以用于使用。在一些实施方案中，使用例如二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂来冷冻保存细胞。在一种实施方案中，将细胞在包含约90％胎牛血清和约10％DMSO的培养基中冷冻保存。
共培养测定
为了评价破坏候选免疫调节基因的功能影响，T细胞可以与表达或呈递抗原，例如，由具有已知特异性的TCR识别的同源抗原的细胞共培养。在一些实施方案中，抗原或同源抗原是新抗原。在一些实施方案中，T细胞对表达或呈递抗原的细胞(例如，癌细胞)的应答，例如，通过定量细胞毒性/细胞溶解活性、细胞因子产生、增殖、活化、向记忆或效应子亚群的成熟、基因表达、蛋白表达、信号转导通路的活化或其任何组合来评价。例如，在一些实施方案中，将T细胞与表达特定抗原的癌细胞共培养，并且可以测量细胞溶解活性和另一种应答二者。如以上描述的，测定细胞溶解活性可以是特别有益的，并且添加一种或更多种其他类型的读取可以增强这种有益效果。在一些实施方案中，对应答的评估是二元的(例如，表达T细胞受体或其部分的同源抗原的细胞在与具有被测试基因中的破坏的细胞共培养时被杀伤，但在与没有该破坏的相当细胞共培养时不被杀伤)。在一些实施方案中，对应答的评估是分级的(例如，表达T细胞受体或其部分的同源抗原的细胞在与具有被测试基因中的破坏的细胞共培养时具有较低的存活/存活力，而在与没有该破坏的相当细胞共培养时具有较高的存活/存活力)。
在一些实施方案中，将T细胞与通过MHC-I、MHC-II或其组合呈递抗原的细胞共培养。在一些实施方案中，将抗原呈递细胞用抗原脉冲，并且与T细胞共培养。在一些实施方案中，将原代细胞或细胞系工程化为表达抗原或通过MHC-I、MHC-II或其组合呈递抗原。在一些实施方案中，使用已知表达抗原的原代细胞或癌细胞系。在一些实施方案中，原代细胞是原代癌细胞。
在一些实施方案中，将T细胞与表达或呈递G12D突变体KRAS的细胞共培养。在一些实施方案中，将T细胞与通过MHC-I、MHC-II或其组合呈递G12D突变体KRAS的细胞共培养。在一些实施方案中，将抗原呈递细胞用G12D突变体KRAS脉冲，并且与T细胞共培养。在一些实施方案中，将原代细胞或细胞系工程化为表达G12D突变体KRAS或通过MHC-I、MHC-II或其组合呈递G12D突变体KRAS。在一些实施方案中，使用已知表达G12D突变体KRAS的原代细胞或癌细胞系。
在一些实施方案中，将T细胞与抗原呈递细胞(APC)共培养。原代细胞或细胞系可以是APC。在一些实施方案中，APC表达T细胞受体的同源抗原和共刺激分子，并且可以活化T细胞。在一些实施方案中，APC可以活化CD4 T细胞。例如，可以将APC工程化为模拟MHC II类限制性CD4 T细胞的抗原加工和呈递通路。在一些实施方案中，APC可以活化CD8 T细胞。在一些实施方案中，APC可以活化CD4 T细胞和CD8 T细胞。可以将APC工程化为表达HLA-D、DPα链、DPβ链、Ii、DMα、DMβ、CD80、CD83或其任何组合。例如，可以将COS-7细胞工程化为表达人类MHC-I，并且用G12D突变体KRAS脉冲。
可以将APC工程为表达任何用于T细胞活化的基因。APC可以将信号递送至T细胞。例如，APC可以递送信号1、信号2、信号3或其任何组合。信号1可以是抗原识别信号。例如，信号1可以通过肽-MHC复合体连接TCR，或者结合针对CD3的激动性抗体，这可以导致CD3信号转导复合体的活化。信号2可以是共刺激信号。例如，共刺激信号可以与CD28或与诱导型共刺激因子(ICOS)、CD27或4-1BB(CD137)结合，诱导型共刺激因子(ICOS)、CD27和4-1BB(CD137)分别与ICOS-L、CD70和4-1BBL结合。信号3可以是细胞因子信号。细胞因子可以是任何细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、TNF-α、IFN-γ或其任何组合。
可以进行共培养测定，其中一种细胞类型与另一种细胞类型(例如，T细胞与靶细胞或T细胞与APC)的比例是例如约500:1、400:1、300:1、250:1、200:1、150:1、100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:400或1:500。
共培养测定可以包括将两种或更多种细胞类型孵育，例如，持续至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时、72小时、73小时、74小时、75小时、76小时、77小时、78小时、79小时、80小时、81小时、82小时、83小时、84小时、85小时、86小时、87小时、88小时、89小时、90小时、91小时、92小时、93小时、94小时、95小时、96小时、97小时、98小时、99小时、100小时、102小时、108小时、114小时、120小时、126小时、132小时、138小时、144小时、150小时、156小时、162小时、168小时、174小时、180小时、186小时、192小时、198小时、204小时、210小时、216小时、222小时、228小时、234小时、240小时或更多小时。
共培养测定可以包括将两种或更多种细胞类型孵育，例如，持续至多约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时、72小时、73小时、74小时、75小时、76小时、77小时、78小时、79小时、80小时、81小时、82小时、83小时、84小时、85小时、86小时、87小时、88小时、89小时、90小时、91小时、92小时、93小时、94小时、95小时、96小时、97小时、98小时、99小时、100小时、102小时、108小时、114小时、120小时、126小时、132小时、138小时、144小时、150小时、156小时、162小时、168小时、174小时、180小时、186小时、192小时、198小时、204小时、210小时、216小时、222小时、228小时、234小时、240小时或更少小时。
共培养测定可以包括将两种或更多种细胞类型孵育，例如，持续以下的时间：约2-240小时之间、6-120小时之间、12-96小时之间、12-72小时之间、12-48小时之间、12-36小时之间、12-24小时之间、12-16小时之间、16-96小时之间、16-72小时之间、16-48小时之间、16-42小时之间、16-36小时之间、16-30小时之间、16-24小时之间、16-20小时之间、16-18小时之间、20-96小时之间、20-72小时之间、20-48小时之间、20-42小时之间、20-36小时之间、20-30小时之间、20-24小时之间、24-96小时之间、24-72小时之间、24-48小时之间、24-42小时之间、24-36小时之间、24-30小时之间、28-96小时之间、28-72小时之间、28-48小时之间、28-42小时之间、28-36小时之间、28-30小时之间、32-96小时之间、32-72小时之间、32-48小时之间、32-32小时之间、32-36小时之间、36-96小时之间、36-72小时之间、36-48小时之间、36-42小时之间、40-96小时之间、40-72小时之间、40-48小时之间、40-42小时之间、40-36小时之间、40-30小时之间、40-24小时之间、40-18小时之间、44-96小时之间、44-72小时之间、44-48小时之间、48-96小时之间、48-72小时之间、52-96小时之间、52-72小时之间、56-96小时之间、56-72小时之间、60-96小时之间或60-72小时之间。
已知表达G12D突变体KRAS的癌细胞系的非限制性实例包括AsPC-1(胰腺源性，ATCC)、GP2d(大肠源性，Sigma)、HPAF-II(胰腺源性，ATCC)、LS 180(大肠源性，ATCC)、LS513(大肠源性，ATCC)、Panc 02.03(胰腺源性，ATCC)、Panc 04.03(胰腺源性，ATCC)、Panc08.13(胰腺源性，ATCC)、Panc 10.05(胰腺源性，ATCC)、PK-1(胰腺源性，RIKEN)、PK-45H(胰腺源性，RIKEN),PK-59(胰腺源性，RIKEN)、SK-LU-1(肺源性,ATCC)、SNU-407(大肠源性，Korean Cell Line Bank)、SNU-C2A (大肠源性，ATCC)、SU.86.86(胰腺源性，ATCC)、SW1990(胰腺源性，ATCC)和T3M-10(肺源性,RIKEN)或任何已经通过基因编辑技术引入KRASG12D突变或其他相关遗传变化的遗传工程化等基因细胞系。
在一些实施方案中，共培养测定在存在抑制因子或条件(例如，降低T细胞对同源抗原或CD3/CD28共刺激的应答的因子或条件)的情况下进行。抑制因子或条件的非限制性实例包括腺苷受体激动剂、抑制性细胞因子(例如，IL-10、TGF-β)、抑制性细胞(例如，Treg、MDSC)、细胞抑制剂(cytostatics)、烷化剂、抗代谢物、糖皮质激素、氨甲蝶呤、他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢菌素、营养物耗尽及其组合。
在一些实施方案中，将T细胞与无细胞刺激物(acellular stimulus)，诸如靶向CD2、CD3、CD28或其任何组合的抗体或珠共培养。在一些实施方案中，T细胞被肽-MHC多聚体，例如，四聚体或五聚体活化。
在一些实施方案中，将共培养测定中的一种或更多种细胞类型工程化为表达一种或更多种报道物基因，例如，荧光蛋白或萤光素酶。
T细胞的功能评价
本文尤其提供了用于鉴定免疫调节基因的方法，所述方法包括例如，破坏候选免疫调节基因，并且然后测试破坏对T细胞功能的影响。可以将候选免疫调节基因在表达具有已知特异性的TCR的T细胞中破坏。在一些实施方案中，然后将T细胞与靶细胞共培养，并且使用一系列测定来评价在识别呈递靶抗原的细胞时基因破坏对T细胞应答的影响。
在一些实施方案中，使用细胞毒性测定评价T细胞杀伤表达或呈递同源抗原的细胞的能力。在一些实施方案中，使用基于死细胞释放的细胞内酶(例如，乳酸脱氢酶、腺苷酸激酶、蛋白酶或萤光素酶)的细胞毒性测定。在一些实施方案中，使用基于完整细胞膜对染料的排斥的细胞毒性测定(例如，
Figure BDA0003190278790000911
绿色核酸染料、
Figure BDA0003190278790000912
DEAD GreenTM存活力染料、7-AAD、碘化丙啶、胺反应性染料、台盼蓝排斥)。在一些实施方案中，使用细胞毒性测定，其中仅代谢活性细胞产生信号(例如，钙黄绿素AM水解为钙黄绿素，MT细胞存活力底物的还原，刃天青转化为试卤灵(resorufin)，四唑鎓化合物转化为甲臜，活细胞蛋白酶活性)。在一些实施方案中，使用细胞毒性测定，其中ATP被定量。在一些实施方案中，使用细胞毒性测定，其中使用时差显微术，并且测量细胞汇合、报道物基因(例如GFP)表达或半胱天冬酶活化。在一些实施方案中，细胞毒性通过使用铬释放测定来确定，其中靶细胞装载有铬，并且细胞杀伤时的铬释放用γ计数器来测量。在一些实施方案中，细胞毒性测定包括细胞的流式细胞术分析，伴有或不伴有鉴定其他感兴趣的标志物的另外的抗体。在一些实施方案中，将靶细胞修饰或工程化为促进细胞毒性测量，例如，工程化为表达细胞质萤光素酶，允许用适当的试剂和读板器方便地检测萤光素酶的释放。
在一些实施方案中，对T细胞响应于表达或呈递同源抗原的细胞而产生细胞因子的能力进行定量。用于定量细胞因子产生的方法的非限制性实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、多重免疫测定、细胞内细胞因子染色、蛋白质印迹和定量实时PCR。可以检测的细胞因子的非限制性实例包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、TNF-α、IFN-γ或其任何组合。
在一些实施方案中，对T细胞响应于表达或呈递同源抗原的细胞而增殖的能力进行定量。在一些实施方案中，增殖测定包括DNA复制的定量(例如BrdU掺入测定、EdU掺入测定)。在一些实施方案中，增殖测定包括细胞分裂时的染料稀释(例如，CFSE、CytoPainter或CellTrace染料稀释)。在一些实施方案中，增殖测定包括细胞的流式细胞术分析，伴有或不伴有鉴定其他感兴趣的标志物的另外的抗体。
在一些实施方案中，将T细胞记忆或活化标志物在与表达或呈递同源抗原的细胞共培养之后进行评价。在一些实施方案中，T细胞活化或记忆性标志物测定包括细胞的流式细胞术分析，伴有或不伴有鉴定其他感兴趣的标志物的另外的抗体。可以鉴定的T细胞亚群的非限制性实例包括幼稚T细胞、效应记忆性(TEM)T细胞、中枢记忆性(TCM)T细胞、活化的T细胞、TH1、TH2、TH9、TH17和Treg细胞。可以用于这些测定的T细胞标志物的非限制性实例包括CCR4、CCR6、CCR7、CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD57、CD62L、CD69、CD107a、CD122、CD 154、CD197、Crth2、CXCR3、CXCR5、p-ERK、p-p38、p-Stat1、p-Stat3、p-Stat5、p-Stat6、颗粒酶B和XCL1。
癌细胞的遗传调节和筛选
在一些实施方案中，使用本文描述的测定筛选癌细胞，以确定当在所述癌细胞中调节时，哪些基因改善了免疫细胞(例如，T细胞)识别和/或杀伤癌细胞的能力。在一些实施方案中，所述测定包括利用靶向所述癌细胞中的基因的gRNA文库和/或引入一种或更多种转基因。在一些实施方案中，癌细胞是原代癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞是癌细胞系。测定可以以与本文描述用于筛选免疫细胞类似的方式运行，并且癌细胞而不是免疫细胞包含基因组破坏和/或转基因。在一些实施方案中，被破坏的基因编码是免疫应答的负调节因子的蛋白。在一些实施方案中，基因编码检查点抑制剂配体。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂配体是针对以下的一种的配体：PD1、CTLA-4、TCRA、TRAC、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)或蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。
在一些实施方案中，将本文描述的测定配置为通过免疫细胞(例如，T细胞)和癌细胞二者中靶基因的组合调节，同时测试免疫细胞(例如，T细胞)和靶癌细胞二者中靶的组合。两种细胞群体的基因调节可以包括转基因的敲入、内源基因的调节或内源基因的敲除或其任何组合。这种组合测定可以鉴定加性的或协同的靶，其对免疫细胞(例如，T细胞)和癌细胞二者的调节可以使免疫细胞(例如，T细胞)更快速地杀伤癌细胞或具有更有效的应答，或者二者。
算法与人工智能
本文尤其提供了用于鉴定免疫调节基因的方法。在一些实施方案中，算法用于辅助候选免疫调节基因的预测、排序、选择或鉴定，如通过图3示出的。例如，可以将测试候选免疫调节基因破坏影响的测定结果输入到算法中，该算法可以将该数据与其他数据(例如，先前的测定结果或数据库条目)组合，并且提供排序的基因的输出用于后续实验。在一些实施方案中，算法用于基于筛选测定和其他加权参数对候选免疫调节基因进行排序，如通过实施例24和图5A示出的。在一些实施方案中，算法用于候选免疫调节基因的迭代选择以进行筛选，如通过实施例25和图5B示出的。在一些实施方案中，算法用于鉴定与是不良药物靶的候选基因相关的可药化免疫调节基因，如通过实施例26和图5C示出的。
在一些实施方案中，算法和/或人工智能被用于对候选免疫调节基因进行排序或选择候选免疫调节基因用于迭代轮筛选。可能的算法工作流程的非限制性实例提供于图5A-图5C中。在一些实施方案中，算法使用评分系统来对候选免疫调节基因进行排序。评分可以来源于以下：例如，测定(例如，用被破坏的候选免疫调节基因评价T细胞的细胞毒性的测定)、关于给定基因的科学知识、功能结构域的存在、生物通路中的成员资格、信号传导通路中的成员资格、蛋白超家族/家族/亚家族中的成员资格、被指定为“可药化”或“可药化基因组”的一部分、亚细胞定位、在T细胞中的表达、在感兴趣的组织中的表达、晶体结构数据的可用性、被指定为受体、临床试验史、被指定为现有药物的靶、被指定为先前药物开发候选物的靶、被指定为当前正在开发的药物的靶、与已知疾病的相关、与人类疾病相关的功能丧失、小鼠中功能表型丧失、对被CRISPR/gRNA靶向的适应性或其任何组合。
在一些实施方案中，应用加权因子，使得一些评分参数比其他评分参数对最终评分和排序贡献更大。例如，可以对来自细胞毒性测定的评分加权以比来源于小鼠中功能表型丧失的评分对最终评分的贡献更大。
在一些实施方案中，评分系统包括来源于测定的评分。在一些实施方案中，评分系统不包括来源于测定的评分。在一些实施方案中，将来自测定的结果输入到算法中，该算法将结果转换为评分，添加来源于其他来源的另外的评分，对评分进行加权，并且根据加权评分的组合对基因进行排序。在一些实施方案中，使用基因的排序列表确定后续实验或分析中被靶向的基因。
在一些实施方案中，在后续实验或分析中被靶向的基因数目大于至少约1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种、50种、51种、52种、53种、54种、55种、56种、57种、58种、59种、60种、61种、62种、63种、64种、65种、66种、67种、68种、69种、70种、71种、72种、73种、74种、75种、76种、77种、78种、79种、80种、81种、82种、83种、84种、85种、86种、87种、88种、89种、90种、91种、92种、93种、94种、95种、96种、97种、98种、99种、100种、105种、110种、115种、120种、125种、130种、135种、140种、145种、150种、160种、170种、180种、190种、192种、200种、250种、288种、300种、384种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2500种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种、15000种、20000种、25000种或30000种基因。在一些实施方案中，在后续实验或分析中被靶向的基因数目是最多约1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种、50种、51种、52种、53种、54种、55种、56种、57种、58种、59种、60种、61种、62种、63种、64种、65种、66种、67种、68种、69种、70种、71种、72种、73种、74种、75种、76种、77种、78种、79种、80种、81种、82种、83种、84种、85种、86种、87种、88种、89种、90种、91种、92种、93种、94种、95种、96种、97种、98种、99种、100种、105种、110种、115种、120种、125种、130种、135种、140种、145种、150种、160种、170种、180种、190种、192种、200种、250种、288种、300种、384种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2500种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种、15000种、20000种、25000种或30000种基因。
在一些实施方案中，评分来源于从数据库提取的基因特征。数据库的非限制性实例包括AmiGO、BiND、BioCarta、BioGPS、CAZy、CDD、COG、COMPARTMENTS、CTD、DAVID、DGIdb、DisGeNet、drugbank、eDGAR、EndoNet、Ensembl、Entrez、ExPASy、Expression Atlas、GAD、基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus)、Gene Ontology、GeneWiki、GoGene、GXD、HAPMAP、HMGD、HOGENOM、HSLS、HUGO、HumanCyc、ImmunoDB、iPathwayGuide、京都基因和基因组百科全书(the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)、KEGG PATHWAY、KEGG BRITE、KEGG MODULE、KEGG ORTHOLOGY、KEGG GENOME、KEGG GENES、KEGG COMPOUND、KEGG GLYCAN、KEGG REACTION、KEGG ENZYME、KEGG NETWORK、KEGG DISEASE、KEGG DRUG、KOG、人类蛋白质表达图集(the Human Protein Atlas)、LHDGN、LocDB、LOCATE、MalaCards、MetaCyc、METAGENE、MGD、MGI、MouseMine、NCBI、NCBI-基因(NCBI-gene)、NCBI-蛋白质(NCBI-protein)、NCBI-结构(NCBI-structure)、NetDecoder、OMIM、OMMBID、OrthoDB、PANTHER、PathJam、Pathguide、Pathway Commons、Pfam、photon、Phyre2、PSORTdb、PID、PRK、ProDom、PROFESS、PROSITE、reactome、RefSeq、SIFT、SMART、SMPDB、SPATIAL、STRING、SuperTarget、Swiss-MODEL、Swiss-Prot、TIGR、Treefam、TTD和UniProt。
在一些实施方案中，算法包括以下中的一项或更多项：机器学习算法、隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model)、动态编程算法、支持向量机、贝叶斯网络、朴素贝叶斯算法(naive Bayesian algorithm)、网格解码算法、维特比解码算法、期望最大化算法、卡尔曼过滤方法、神经网络算法、k最近邻算法、概念向量算法、遗传算法、互信息特征选择算法、主成分分析算法、偏最小二乘算法、独立成分分析算法或其任何组合。
说明性算法还包括但不限于直接处理大量变量的方法，诸如统计方法和基于机器学习技术的方法。统计方法包括惩罚逻辑回归、基于缩小重心(shrunken centroids)的方法、支持向量机分析、相关分析和正则化线性判别分析。机器学习技术包括装袋(bagging)程序、提升(boosting)程序、随机森林算法及其组合。
在一些实施方案中，使用机器学习算法。在一些实施方案中，机器学习算法包括训练步骤，例如，使用已知免疫调节基因的参考集或者来自早期轮筛选的结果(其中候选免疫调节基因被破坏并且对所得T细胞进行功能评价)。在一些实施方案中，机器学习算法是有监督的或无监督的。
在一些实施方案中，算法包括隐马尔可夫模型(HMM)，其是一种统计马尔可夫模型，其中被建模的系统被认为是具有未观察的(隐的)状态的马尔可夫过程。在简单的马尔可夫模型(如马尔可夫链)中，状态对观察者是直接可见的，并且因此状态转换概率是唯一的参数。在隐马尔可夫模型中，状态不是直接可见的，但是依赖于状态的输出是可见的。每个状态在可能的输出令牌上都具有概率分布。因此，由HMM生成的令牌的顺序可以给出关于状态顺序的一些信息。隐马尔可夫模型可以被认为是混合模型的概括，其中隐变量(或潜变量)通过马尔可夫过程相关，而不是彼此独立，所述隐变量(或潜变量)控制混合成分对于每个观察进行选择。HMM通常由一组隐状态、状态转换概率矩阵和发射概率矩阵定义。构建这种模型的一般方法包括但不限于隐马尔可夫模型(HMM)、人工神经网络、贝叶斯网络、支持向量机和随机森林。这种方法是本领域普通技术人员已知的，并且详细描述于Mohri等人，Foundations of Machine Learning,published by MIT Press(2012)中，该文献在此通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，算法使用贝叶斯后分析方法对基因进行排序。例如，数据可以经历特征选择步骤。在一些实施方案中，然后数据经历分类步骤，该步骤包括本文提供的任何算法或方法，例如，支持向量机或随机森林算法。在一些实施方案中，然后根据后验概率函数对分类器算法的结果进行排序。例如，后验概率函数可以通过检查已知的免疫调节基因推导出先验概率来进行推导。然后这些先验概率可以与由本文公开的方法提供的数据集组合，以估计后验概率。后验概率估计可以与由本文公开的方法提供的第二数据集组合，以制定另外的后验概率。在一些实施方案中，使用后验概率对分类器算法提供的基因进行排序。在一些实施方案中，将基因根据基因的后验概率进行排序，并且可以选择那些通过所选阈值的基因。示例性阈值包括但不限于0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.925、0.95、0.975、0.98、0.985、0.99、0.995或更高的概率。
基因编辑技术
在一些实施方案中，将本公开内容的细胞遗传编辑，例如，以产生可以被筛选以鉴定新的免疫调节基因的原代T细胞群体。
在一些实施方案中，对本公开内容的细胞进行遗传编辑，例如，以产生表达具有已知特异性的T细胞受体(TCR)的原代T细胞、以破坏内源TCR的表达、以破坏已知免疫调节基因的表达、以破坏候选免疫调节基因的表达、以产生将活化表达具有已知特异性的TCR的T细胞的细胞、以产生包含感兴趣的多核苷酸的细胞、以产生包含被破坏的感兴趣的多核苷酸的细胞、以破坏感兴趣的基因的表达或其任何组合。在一些实施方案中，对细胞进行遗传编辑以产生包含具有已知特异性的TCR、内源TCR的表达被破坏和候选免疫调节基因的表达被破坏的细胞。在一些实施方案中，对细胞进行遗传编辑以产生包含具有已知特异性的TCR、内源TCR的表达被破坏和已知免疫调节基因(例如PD-1)的表达被破坏的细胞。在一些实施方案中，对细胞进行遗传编辑以产生包含具有已知特异性的TCR、内源TCR的表达被破坏、候选免疫调节基因的表达被破坏和已知免疫检查点基因(例如PD-1)的表达被破坏的细胞。
多核酸和多核酸修饰
在一些实施方案中，本文公开的方法包括将一个或更多个核酸引入细胞。在一些实施方案中，将核酸引入细胞，例如，作为遗传编辑T细胞以破坏内源TCR、引入编码具有已知特异性的TCR的基因、破坏候选免疫调节基因、破坏已知免疫调节基因或其任何组合的过程的一部分。
在一些实施方案中，核酸是多核酸。本领域技术人员将理解，核酸通常可以指其分子由长链中连接的许多核苷酸组成的物质。多核酸的非限制性实例包括，但不限于，人工核酸类似物(例如，肽核酸、吗啉代寡聚物、锁核酸、乙二醇核酸或苏糖核酸)、环状核酸、DNA、单链DNA、双链DNA、基因组DNA、质粒、质粒DNA、病毒DNA、病毒载体、γ-逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、RNA、短发夹RNA、psiRNA和/或其杂合体或组合。在一些实施方案中，多核酸是合成的。在一些实施方案中，样品包含多核酸，并且多核酸是片段化的。在一些实施方案中，多核酸是小环的。
在一些实施方案中，如本文描述的多核酸被修饰。可以在多核酸的任何位置进行修饰。可以对单个多核酸进行多于一次修饰。多核酸可以在修饰之后经历质量控制。在一些情况下，质量控制可以包括PAGE、HPLC、MS或其任何组合。
在一些情况下，对多核酸进行修饰，使其免疫原性更低，并且转染细胞时更稳定。在一些实施方案中，修饰的多核酸编码任何数目的基因。在一些情况下，多核酸编码转基因。在一些实施方案中，转基因编码工程化受体。在一些实施方案中，受体是T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些情况下，受体是TCR。
在一些情况下，修饰的聚核酸用于本文描述方法的随后步骤中。例如，在一些实施方案中，修饰的多核酸用于同源重组反应中。在一些实施方案中，同源重组反应包括在细胞基因组中引入编码外源受体的转基因。在一些实施方案中，引入包括将转基因序列引入细胞基因组必需的任何机制。在一些实施方案中，CRISPR用于将受体序列引入细胞基因组的步骤中。
在一些实施方案中，修饰是永久性的。在一些实施方案中，修饰是暂时的。在一些实施方案中，对多核酸进行多种修饰。在一些实施方案中，多核酸修饰改变了多核酸的理化特性，诸如其构象、极性、疏水性、化学反应性、碱基配对相互作用或其任何组合。
在一些实施方案中，修饰是取代、插入、缺失、化学修饰、物理修饰、稳定化、纯化或其任何组合。在一些实施方案中，多核酸被以下修饰：5'腺苷酸、5'鸟苷-三磷酸帽、5'N7-甲基鸟苷-三磷酸帽、5'三磷酸帽、3'磷酸、3'硫代磷酸、5'磷酸、5'硫代磷酸、Cis-Syn胸苷二聚体、三聚体、C12间隔物、C3间隔物、C6间隔物、dSpacer、PC间隔物、rSpacer、间隔物18、间隔物9、3'-3'修饰、5'-5'修饰、无碱基化(abasic)、吖啶、偶氮苯、生物素、生物素BB、生物素TEG、胆固醇基TEG、脱硫生物素TEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-生物素、双重生物素、PC生物素、补骨脂素C2、补骨脂素C6、TINA、3'DABCYL、黑洞猝灭剂1(black hole quencher 1)、黑洞猝灭剂2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDye QC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、羧基接头、硫醇接头、2'脱氧核糖核苷类似嘌呤、2'-脱氧核糖核苷类似嘧啶、核糖核苷类似物、2'-O-甲基核糖核苷类似物、糖修饰的类似物、摆动(wobble)/通用碱基、荧光染料标记物、2'氟RNA、2'O-甲基RNA、甲基膦酸酯、磷酸二酯DNA、磷酸二酯RNA、硫代磷酸酯DNA、硫代磷酸酯RNA、UNA、假尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞嘧啶-5'-三磷酸或其任何组合。
在一些实施方案中，修饰是2-O-甲基3硫代磷酸酯加成。在一些实施方案中，将2-O-甲基3硫代磷酸酯加成添加在从1个碱基至150个碱基上。在一些实施方案中，将2-O-甲基3硫代磷酸酯加成添加在从1个碱基至4个碱基上。在一些实施方案中，将2-O-甲基3硫代磷酸酯加成添加在2个碱基上。在一些实施方案中，将2-O-甲基3硫代磷酸酯加成添加在4个碱基上。在一些实施方案中，修饰是截短。在一些实施方案中，截短是5个碱基的截短。
在一些实施方案中，修饰是硫代磷酸酯取代。在一些实施方案中，天然磷酸二酯键容易被细胞核酸酶快速降解，而使用硫代磷酸酯(PS)键取代对核苷酸间连接的修饰增强稳定性。在一些实施方案中，修饰增加了多核酸的稳定性。在一些实施方案中，修饰增强了生物活性。在一些实施方案中，硫代磷酸酯增强的RNA多核酸抑制RNA酶A、RNA酶T1、小牛血清核酸酶或其任何组合。在一些实施方案中，这些特性允许PS-RNA多核酸用于在体内或体外极有可能暴露于核酸酶的应用中。在一些实施方案中，例如，硫代磷酸酯(PS)键被引入多核酸的5'-末端或3'-末端的最后3-5个核苷酸之间，这抑制外切核酸酶降解。在一些实施方案中，在整个多核酸中添加硫代磷酸酯键，以降低内切核酸酶的攻击。
在一些实施方案中，多核酸通过多种方法组装，例如，通过自动化固相合成组装。在一些实施方案中，多核酸使用标准固相DNA/RNA合成构建。在一些实施方案中，多核酸使用合成程序构建。在一些实施方案中，多核酸手动或以全自动方式合成。在一些实施方案中，使用合成程序，其中5′-羟基寡核苷酸可以最初转化为对应的5′-H-膦酸单酯，随后在存在咪唑的情况下下氧化为活化的5′-磷酸咪唑酯(phosphorimidazolidates)，并且最后在固体支持物上与焦磷酸反应。在一些实施方案中，该程序包括合成之后的纯化步骤，诸如PAGE、HPLC、MS或其任何组合。
核糖核酸系统
一种产生遗传编辑细胞的示例性方法是通过使用核糖核酸(RNA)系统，例如，用于细胞内基因组移植的完整或部分RNA系统。在一些实施方案中，待工程化的细胞用RNA或修饰的RNA而不是DNA进行遗传修饰，以防止有时使用DNA时观察到的DNA (例如，双链或单链DNA)诱导的毒性和免疫原性。在一些实施方案中，RNA/DNA融合多核酸用于基因组工程化。
在一些实施方案中，使用用于人类原代T细胞基因编辑的全RNA多核酸系统。在一些实施方案中，将体外转录的核糖核酸递送并且逆转录为靶细胞内的dsDNA。在一些实施方案中，DNA模板用于细胞内的同源重组(HR)反应。
在一些实施方案中，将包含外源受体序列的转基因通过RNA，例如，信使RNA(mRNA)引入细胞进行基因组工程化。RNA，例如，mRNA可以原位转化为DNA。一种示例性方法利用多核酸的体外转录来产生mRNA多核酸。在一些实施方案中，然后将mRNA多核酸用逆转录酶(RT)(蛋白形式或编码RT的多核酸)转染到细胞中。在一些实施方案中，RT来源于禽成髓性白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus)逆转录酶(AMV RT)、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)逆转录酶(M-MLV RT)、人类免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶(RT)、其衍生物或其组合。在一些实施方案中，转染后，逆转录酶将工程化mRNA多核酸转录为双链DNA (dsDNA)。
在一些实施方案中，逆转录酶(RT)是用于从RNA模板产生互补DNA(cDNA)的酶。在一些实施方案中，将双链DNA用于随后同源重组步骤中。
在一些实施方案中，随后同源重组步骤将外源受体序列引入细胞基因组。
在一些实施方案中，引入的RT靶向引入的多核酸。在一些实施方案中，引入的多核酸是RNA或DNA。在一些实施方案中，引入的多核酸是RNA和DNA的组合。在一些实施方案中，靶向引入的RT通过将独特的序列掺入编码工程化受体的多核酸中来进行。在一些实施方案中，这些独特的序列有助于将RT靶向特定的多核酸。在一些实施方案中，独特的序列可以增加反应效率。
表2描述了将RT靶向工程化多核酸的可能的独特的序列。
表2：独特的序列
SEQ ID NO: 独特的序列5’至3’
1 TAGTCGGTACGCGACTAAGCCG
2 TAGTCGTCGTAACGTACGTCGG
3 CGGCTATAACGCGTCGCGTAG
4 TAGAGCGTACGCGACTAACGAC
在一些实施方案中，逆转录酶通过将多核酸工程化为具有二级结构而靶向工程化多核酸。在一些实施方案中，二级结构是任何结构。在一些实施方案中，利用了多个二级结构。例如，在一些实施方案中，二级结构是双螺旋。在一些实施方案中，二级结构是茎环结构或发夹结构。在一些实施方案中，二级结构是假结(pseudoknot)。
在一些实施方案中，工程化多核酸需要被定位于细胞核。在一些实施方案中，工程化多核酸编码需要被引入细胞基因组的外源或工程化受体序列。在一些实施方案中，将受体序列引入细胞基因组通过将工程化多核酸定位于用于转录的细胞核酸酶来进行。
在一些实施方案中，将工程化RNA多核酸定位于细胞核。在一些实施方案中，定位包括任何数目的技术。在一些实施方案中，使用核定位信号将编码工程化受体的工程化多核酸定位至核。在一些实施方案中，核定位信号是任何内源或工程化序列。
CRISPR系统
在一些实施方案中，本文描述的方法使用CRISPR系统，例如，在靶基因中产生双链断裂，以便敲除候选免疫调节基因、敲除已知免疫调节基因、敲除内源TCR、敲入具有已知特异性的TCR或其任何组合。
存在至少五种类型的CRISPR系统，其全部都包括RNA和CRISPR相关(Cas)蛋白。I型、III型和IV型组装多Cas蛋白复合体，该复合体能够裂解与crRNA互补的核酸。I型和III型二者都需要在将处理过的crRNA组装为多Cas蛋白复合体之前进行预crRNA处理。II型和V型CRISPR系统包含与至少一种指导RNA (gRNA)复合的单个Cas蛋白。
CRISPR系统的一般机制和最新进展在以下中讨论：Cong，L.等人，“Multiplexgenome engineering using CRISPRsystems,”Science,339(6121):819-823(2013)；Fu，Y.等人，“High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleasesin human cells,”Nature Biotechnology,31,822–826(2013)；Chu，VT等人“Increasingthe efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precisegene editing in mammalian cells,”Nature Biotechnology 33,543–548(2015)；Shmakov，S.等人，“Discovery and functional characterization of diverse Class2CRISPR-Cas systems,”Molecular Cell,60,1-13(2015)；Makarova，KS等人，“An updatedevolutionary classification of CRISPR-Cas systems,”,Nature ReviewsMicrobiology,13,1-15(2015)。
靶DNA的位点特异性裂解发生在由1)和2)二者确定的位置处，1)指导RNA和靶DNA(也称为前间区)之间的碱基配对互补性和2)靶DNA中称为前间区邻近基序(PAM)的短基序。例如，工程化细胞可以使用CRISPR系统，例如，II型CRISPR系统来产生。在本文公开的方法中使用的Cas酶可以是催化DNA裂解的Cas9。通过来源于酿脓链球菌的Cas9或任何密切相关的Cas9的酶促作用可以在靶位点序列处产生双链断裂，靶位点序列与指导序列的20个核苷酸杂交，并且在靶序列的20个核苷酸后具有前间区邻近基序(PAM)。
a.Cas蛋白
在一些实施方案中，CRISPR相关(Cas)蛋白包括在DNA中在由指导RNA(gRNA)确定的位点处产生双链断裂(DSB)的酶活性。
在一些实施方案中，方法可以包括选自由以下组成的组的内切核酸酶：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰形式。Cas蛋白可以是Cas9。
在一些实施方案中，载体与编码CRISPR酶(诸如Cas蛋白(CRISPR相关蛋白))的酶编码序列可操作地连接。Cas蛋白的非限制性实例包括，但不限于，Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1或Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰形式。在一些实施方案中，未修饰的CRISPR酶具有DNA裂解活性，诸如Cas9。
在一些实施方案中，CRISPR酶引导靶序列处(诸如在靶序列内和/或靶序列的互补序列内)的一条或两条链的裂解。例如，在一些实施方案中，CRISPR酶引导在以下内或在约以下内的一条或两条链的裂解：距靶序列的第一个核苷酸或最后一个核苷酸1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、100个、200个、500个或更多个碱基对。在一些实施方案中，使用编码CRISPR酶的载体，该CRISPR酶相对于对应的野生型酶被突变，使得突变的CRISPR酶缺乏裂解包含靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。在一些实施方案中，Cas蛋白是高保真Cas蛋白，诸如Cas9HiFi。
在一些实施方案中，使用编码包含一个或更多个核定位序列(NLS)(诸如多于以下或多于约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个NLS)的CRISPR酶的载体。例如，在一些实施方案中，CRISPR酶包含位于氨基末端或在氨基末端附近的多于或多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个NLS，位于羧基末端或在羧基末端附近的多于或多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个NLS，或这些的任何组合(例如，位于N末端的一个或更多个NLS和位于C末端的一个或更多个NLS)。NLS可以定位于多肽链的任何地方，例如在N末端或C末端附近。例如，在一些实施方案中，NLS在以下内或在约以下内：沿着多肽链距N末端或C末端的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个或50个氨基酸。在一些实施方案中，NLS在以下内或在约以下内：距N末端或C末端的50个氨基酸或更多个氨基酸，例如，100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个氨基酸。在一些实施方案中，当存在多于一个NLS时，彼此独立地选择每一个NLS，使得一种NLS可以以多于一个拷贝存在和/或与以一个或更多个拷贝存在的一种或更多种其他NLS组合。
在一些实施方案中，Cas9是指与野生型示例性Cas9多肽(例如，来自酿脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9)具有至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。在一些实施方案中，Cas9是指与野生型示例性Cas9多肽(例如，来自酿脓链球菌)具有至多或至多约50％、60％、70％、80％、90％、100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。在一些实施方案中，Cas9是指Cas9蛋白的野生型或修饰形式，所述修饰形式包含氨基酸改变，诸如缺失、插入、取代、变异、突变、融合、嵌合或其任何组合。
在一些实施方案中，编码内切核酸酶(例如，Cas蛋白诸如Cas9)的多核苷酸被密码子优化以在特定细胞诸如真核细胞中表达。在一些实施方案中，这种类型的优化需要外源(例如，重组)DNA的突变，以在编码相同蛋白的同时模拟预期宿主生物体或细胞的密码子偏好。
在一些实施方案中，内切核酸酶包含与野生型示例性定点(site-directed)多肽(例如，来自酿脓链球菌的Cas9)的核酸酶结构域具有至少或至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
虽然酿脓链球菌Cas9(SpCas9)可以用作用于基因组工程化的CRISPR内切核酸酶，但其他内切核酸酶也可以可用于某些靶切离位点。例如，SpCas9的PAM序列(5′NGG 3′)在整个人类基因组中是丰富的，但是NGG序列可能没有被正确定位为靶向用于修饰的期望基因。在一些实施方案中，使用不同的内切核酸酶来靶向某些基因组靶。在一些实施方案中，使用合成的带有非NGG PAM序列的SpCas9来源的变体。此外，已经鉴定了来自不同物种的其他Cas9直系同源物，并且这些“非SpCas9”结合多种对本公开内容也可以有用的PAM序列。例如，相对较大尺寸的SpCas9(大约4kb编码序列)意指携带该SpCas9 cDNA的质粒在细胞中可能不有效表达。相反，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)的编码序列比SpCas9短大约1千碱基，这可以使其在细胞中高效表达。与SpCas9类似，SaCas9内切核酸酶能够体外修饰哺乳动物细胞的靶基因以及体内修饰小鼠的靶基因。
酿脓链球菌Cas9的替代物包括，但不限于，来自Cpf1家族的RNA指导的内切核酸酶，该内切核酸酶在哺乳动物细胞中展示出裂解活性。与Cas9核酸酶不同，Cpf1介导的DNA裂解的结果是带有短3′突出端的双链断裂。Cpf1的交错裂解模式可以开启定向基因转移的可能性，类似于传统的限制性酶克隆，这可以增加基因编辑的效率。如同上述Cas9变体和直系同源物，Cpf1也可以将能够由CRISPR靶向的位点数目扩大至缺乏SpCas9偏好的NGG PAM位点的富含AT的区域或富含AT的基因组。
任何功能浓度的Cas蛋白都可以引入细胞。例如，在一些实施方案中，将15微克的Cas mRNA引入细胞。在一些实施方案中，引入0.5微克至100微克的Cas mRNA。在一些实施方案中，引入约0.5微克、5微克、10微克、15微克、20微克、25微克、30微克、35微克、40微克、45微克、50微克、55微克、60微克、65微克、70微克、75微克、80微克、85微克、90微克、95微克或100微克的Cas mRNA。
b.指导RNA
如本文使用的，术语“指导RNA(gRNA)”及其语法等同物是指能够对靶DNA有特异性且能够与Cas蛋白形成复合体的RNA。在一些实施方案中，指导RNA包含指导序列或间隔物序列，所述指导序列或间隔物序列指定靶位点并将RNA/Cas复合体指导至特定靶DNA进行裂解。靶DNA的位点特异性裂解发生在由1)和2)二者确定的位置处，1)指导RNA和靶DNA(也称为前间区)之间的碱基配对互补性和2)靶DNA中称为前间区邻近基序(PAM)的短基序。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括将至少一种指导RNA或编码至少一种指导RNA的核酸(例如，DNA)引入细胞中。在一些实施方案中，指导RNA与RNA指导的内切核酸酶相互作用，以将内切核酸酶引导至特定靶位点，在特定位点处，指导RNA的5'末端与染色体序列中的特定前间区序列碱基配对。
在一些实施方案中，指导RNA包含两个RNA，例如，CRISPRRNA(crRNA)和反式活化crRNA(tracrRNA)。在一些实施方案中，指导RNA包含由crRNA和tracrRNA的一部分(例如，功能部分)融合形成的单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方案中，指导RNA是包含crRNA和tracrRNA的双重RNA。在一些实施方案中，指导RNA包含crRNA，但缺乏tracrRNA。此外，在一些实施方案中，crRNA与靶DNA或前间区序列杂交。
如以上讨论的，在一些实施方案中，gRNA是表达产物。例如，在一些实施方案中，编码gRNA的DNA是包含编码gRNA的序列的载体。在一些实施方案中，通过用分离的gRNA或包含编码gRNA的序列和启动子的质粒DNA转染细胞或生物体，将gRNA转移到细胞或生物体中。在一些实施方案中，通过用病毒载体转导将gRNA转移到细胞或生物体中。在一些实施方案中，gRNA通过逆转录病毒，诸如慢病毒载体来递送。在一些实施方案中，gRNA通过腺病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒(AAV))、逆转录病毒、疱疹病毒或整合酶缺陷型慢病毒(IDLV)来递送。在一些实施方案中，gRNA可以通过电穿孔来递送。
在一些实施方案中，指导RNA是分离的。例如，在一些实施方案中，指导RNA以分离的RNA的形式转染到细胞或生物体中。在一些实施方案中，指导RNA使用任何体外转录系统通过体外转录来制备。在一些实施方案中，指导RNA可以以分离的RNA的形式，而不是以包含指导RNA编码序列的质粒的形式，转移到细胞中。
在一些实施方案中，指导RNA包含DNA靶向区段和蛋白结合区段。在一些实施方案中，DNA靶向区段(或DNA靶向序列，或间隔物序列)包含能够与靶DNA内的特定序列互补的核苷酸序列(例如，前间区序列)。在一些实施方案中，蛋白结合区段(或蛋白结合序列)与定点修饰多肽，例如，RNA指导的内切核酸酶诸如Cas蛋白相互作用。在一些实施方案中，区段是分子的区段/部分/区域，例如，RNA中的一段连续核苷酸。在一些实施方案中，区段意指复合体的区域/部分，使得区段可以包含多于一个分子的区域。例如，在一些实施方案中，靶向DNA的RNA的蛋白结合区段是一种RNA分子，并且因此蛋白结合区段包含该RNA分子的一个区域。在一些实施方案中，靶向DNA的RNA的蛋白结合区段包含沿着互补性区域杂交的两个单独的分子。
在一些实施方案中，指导RNA包含两个独立的RNA分子或单个RNA分子。示例性的单分子指导RNA包含DNA靶向区段和蛋白结合区段二者。
示例性双分子靶向DNA的RNA包含crRNA样(“CRISPR RNA”或“靶向器RNA”或“crRNA”或“crRNA重复”)分子和对应的tracrRNA样(“反式作用CRISPR RNA”或“活化因子RNA”或“tracrRNA”)分子。第一RNA分子可以是crRNA样分子(靶向器RNA)，其可以包含DNA靶向区段(例如，间隔物)和可以形成双链RNA(dsRNA)双链体的一半的一段核苷酸，所述双链RNA(dsRNA)双链体包含指导RNA的蛋白结合区段。在一些实施方案中，第二RNA分子是对应的tracrRNA样分子(活化因子RNA)，其包含可以形成指导RNA的蛋白结合区段的dsRNA双链体的另一半的一段核苷酸。换言之，在一些实施方案中，crRNA样分子的一段核苷酸与tracrRNA样分子的一段核苷酸互补并杂交，以形成指导RNA的蛋白结合结构域的dsRNA双链体。因此，在一些实施方案中，每个crRNA样分子具有对应的tracrRNA样分子。在一些实施方案中，crRNA样分子另外提供单链DNA靶向区段或间隔物序列。因此，在一些实施方案中，crRNA样和tracrRNA样分子(作为对应的配对)杂交形成指导RNA。在一些实施方案中，主题双分子指导RNA包含任何对应的crRNA和tracrRNA配对。
在一些实施方案中，指导RNA的DNA靶向区段或间隔物序列与染色体序列中靶位点处的序列(例如，前间区序列)互补，使得指导RNA的DNA靶向区段可以与靶位点或前间区碱基配对。在一些实施方案中，指导RNA的DNA靶向区段包含从或从约10个核苷酸至从或从约25个核苷酸或更多个核苷酸。例如，在一些实施方案中，指导RNA的第一区域和染色体序列中的靶位点之间的碱基配对区域的长度是约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、23个、24个、25个或多于25个核苷酸。在一些实施方案中，指导RNA的第一区域的长度是约19个、20个或21个核苷酸。
在一些实施方案中，指导RNA靶向20个核苷酸或约20个核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，靶核酸少于约20个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸是至少或至少约5个、10个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸是至多或至多约5个、10个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸序列是紧邻PAM第一个核苷酸5’的约20个碱基。在一些实施方案中，指导RNA靶向核酸序列。
在一些实施方案中，指导核酸，例如，指导RNA，是指能够与另一种核酸(例如，细胞基因组中的靶核酸或前间区)杂交的核酸。在一些实施方案中，指导核酸是RNA。在一些实施方案中，指导核酸是DNA。在一些实施方案中，指导核酸被编程或设计为与核酸序列位点特异性地结合。在一些实施方案中，指导核酸包含一条多核苷酸链，并且称为单指导核酸。在一些实施方案中，指导核酸包含两条多核苷酸链，并且称为双重指导核酸。
在一些实施方案中，指导核酸包含一个或更多个修饰，以提供具有新的或增强的特征的核酸。在一些实施方案中，指导核酸包含核酸亲和标签。在一些实施方案中，指导核酸包含合成核苷酸、合成核苷酸类似物、核苷酸衍生物和/或修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，指导核酸，例如，在5’末端或3’末端或在5’末端或3’末端附近包含与靶核酸(例如，前间区)中的序列杂交的核苷酸序列(例如，间隔物)。在一些实施方案中，指导核酸的间隔物通过杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。在一些实施方案中，间隔物序列与位于前间区邻近基序(PAM)5’或3’的靶核酸杂交。在一些实施方案中，间隔物序列的长度是至少或至少约5个、10个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，间隔物序列的长度是至多或至多约5个、10个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个或更多个核苷酸。
在一些实施方案中，指导RNA包含形成二级结构的dsRNA双链体区域。例如，在一些实施方案中，由指导RNA形成的二级结构包含茎(或发夹)和环。在一些实施方案中，环和茎的长度不同。例如，在一些实施方案中，环的长度范围为约3个至约10个核苷酸，并且茎的长度范围为约6个至约20个碱基对。在一些实施方案中，茎包含1个至约10个核苷酸的一个或更多个凸起。在一些实施方案中，第二区域的总长度的长度范围为约16个至约60个核苷酸。例如，在一些实施方案中，环的长度是约4个核苷酸，并且茎的长度是约12个碱基对。在一些实施方案中，dsRNA双链体区域包含与RNA结合蛋白(诸如RNA指导的核酸内切酶，例如，Cas蛋白)形成复合体的蛋白结合区段。
在一些实施方案中，指导RNA在5’末端或3’末端包含主要是单链的尾部区域。例如，在一些实施方案中，尾部区域与感兴趣细胞中的任何染色体序列不互补；并且，在一些实施方案中，与指导RNA的其余部分不互补。此外，尾部区域的长度可以不同。在一些实施方案中，尾部区域的长度多于或多于约4个核苷酸。例如，在一些实施方案中，尾部区域的长度范围为约5个至约60个核苷酸。
在一些实施方案中，将指导RNA作为RNA分子引入细胞中。例如，在一些实施方案中，RNA分子在体外转录和/或可以化学合成。在一些实施方案中，将指导RNA作为RNA分子引入细胞中。在一些实施方案中，将指导RNA以非RNA核酸分子(例如，DNA分子)的形式引入细胞中。例如，在一些实施方案中，编码指导RNA的DNA可操作地连接至启动子控制序列，以用于在感兴趣的细胞或胚胎中表达指导RNA。在一些实施方案中，编码RNA的序列可操作地连接至由RNA聚合酶III(Pol III)识别的启动子序列。
在一些实施方案中，编码指导RNA的DNA分子是线性的。在一些实施方案中，编码指导RNA的DNA分子是环状的。
在一些实施方案中，编码指导RNA的DNA序列是载体的一部分。载体的一些实例包括，但不限于，质粒载体、噬菌粒、黏粒、人工/微型染色体、转座子和病毒载体。例如，在一些实施方案中，编码RNA指导的内切核酸酶的DNA存在于质粒载体中。合适的质粒载体的其他非限制性实例包括，但不限于，pUC、pBR322、pET、pBluescript及其变体。此外，在一些实施方案中，载体包含另外的表达控制序列(例如，增强子序列、Kozak序列、多腺苷酸化序列、转录终止序列等)、选择性标志物序列(例如，抗生素抗性基因)、复制起点等。
在一些实施方案中，当将RNA指导的内切核酸酶和指导RNA二者作为DNA分子引入细胞中时，每个DNA分子是单独分子的一部分(例如，一个载体包含融合蛋白编码序列，并且第二载体包含指导RNA编码序列)。在一些实施方案中，当将RNA指导的内切核酸酶和指导RNA二者作为DNA分子引入细胞中时，二者都是同一分子的一部分(例如，一个载体包含融合蛋白和指导RNA二者的编码(和调节)序列)。
在一些实施方案中，Cas蛋白，诸如Cas9蛋白或其任何衍生物，与指导RNA预复合形成核糖核蛋白(RNP)复合体。在一些实施方案中，将RNP复合体引入原代免疫细胞中。在一些实施方案中，RNP复合体的引入是定时的。在一些实施方案中，细胞可以在细胞周期的G1期、S期和/或M期与其他细胞同步。在一些实施方案中，将RNP复合体在一定的细胞期递送，使得同源定向修复(HDR)增强。RNP复合体可以促进HDR。
在一些实施方案中，指导RNA是修饰的。在一些实施方案中，修饰包括化学改变、合成修饰、核苷酸添加和/或核苷酸减去。在一些实施方案中，修饰增强了CRISPR基因组工程化。在一些实施方案中，修饰改变了gRNA的手性。在一些实施方案中，手性在修饰之后是均匀的或立体纯的。在一些实施方案中，合成了指导RNA。在一些实施方案中，合成的指导RNA增强了CRISPR基因组工程化。在一些实施方案中，将指导RNA截短。在一些实施方案中，使用截短降低不期望的脱靶诱变。在一些实施方案中，截短包括任何数目的核苷酸缺失。例如，在一些实施方案中，截短包括1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导RNA包含任何长度的靶互补区域。例如，在一些实施方案中，靶互补区域的长度少于20个核苷酸。在一些实施方案中，靶互补区域的长度多于20个核苷酸。
在一些实施方案中，使用双切口酶方法引入双链断裂。在一些实施方案中，将Cas蛋白在任一核酸酶结构域内的已知氨基酸处突变，从而缺失一个核酸酶结构域的活性并产生能够产生单链断裂的切口酶Cas蛋白。在一些实施方案中，利用切口酶连同两种不同的靶向相对链的指导RNA在靶位点内产生DSB(通常称为“双切口”或“双切口酶”CRISPR系统)。这种方法可以显著增加靶特异性，因为在足够紧邻的距离内产生引起DSB的两个脱靶切口是不可能的。
在一些实施方案中，进行GUIDE-Seq分析以确定工程化的指导RNA的特异性。由CRISPR系统核酸酶对脱靶裂解的GUIDE-Seq谱型分析的一般机制和方案在以下中讨论：Tsai，S.等人，“GUIDE-Seq enables genome-wide profiling of off-target cleavageby CRISPR system nucleases,”Nature,33:187-197(2015)。
在一些实施方案中，将gRNA以任何功能浓度引入。例如，在一些实施方案中，将gRNA以10微克引入细胞。在一些实施方案中，引入0.5微克至100微克的gRNA。在一些实施方案中，引入0.5微克、5微克、10微克、15微克、20微克、25微克、30微克、35微克、40微克、45微克、50微克、55微克、60微克、65微克、70微克、75微克、80微克、85微克、90微克、95微克或100微克的gRNA。
基因编辑组分的递送
在一些实施方案中，将核酸酶、转录因子、转基因、编码它们的多核苷酸和/或包含本文描述的蛋白和/或多核苷酸的任何组合物通过任何合适的手段递送至靶细胞。
在一些实施方案中，将本公开内容的核酸酶，例如，作为mRNA、可转录的DNA、蛋白或作为核糖核蛋白复合体(RNP)的一部分递送至细胞。在一些实施方案中，将本公开内容的指导RNA作为RNA、可转录的DNA或作为RNP的一部分递送。在一些实施方案中，将本公开内容的转录因子作为蛋白、mRNA或可转录的DNA递送。
合适的靶细胞包括，但不限于，真核细胞和原核细胞和/或细胞系。在一些实施方案中，合适的原代细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)和其他血细胞亚群，诸如但不限于，T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、单核细胞、单核细胞前体细胞、造血干细胞或非多能干细胞。
在一些实施方案中，如本文描述的转录因子、转基因和核酸酶使用载体，例如包含编码本文公开的一种或更多种蛋白的多核苷酸序列的载体递送。可以使用任何载体系统，包括，但不限于，质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等。此外，这些载体中的任何一种都可以包含一种或更多种转录因子、核酸酶和/或转基因。因此，当将一种或更多种CRISPR、TALEN、基于转座子的、ZEN、兆核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因引入细胞中时，CRISPR、TALEN、基于转座子的、ZEN、兆核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因可以被携带在同一载体或不同载体上。当使用多个载体时，每个载体可以包含编码一个或多个CRISPR、TALEN、基于转座子的、ZEN、兆核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因的序列。
传统的基于病毒和非病毒的基因转移方法可以用于将编码工程化CRISPR、TALEN、基于转座子的、ZEN、兆核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因的核酸引入细胞中。这样的方法也可以用于在体外将编码CRISPR、TALEN、基于转座子的、ZEN、兆核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因的核酸施用至细胞。非病毒载体递送系统可以包括DNA质粒、裸核酸和与递送媒介物诸如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸。病毒载体递送系统可以包括DNA病毒和RNA病毒，它们在递送至细胞之后具有游离或整合的基因组。
核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂转染、核转染、金纳米颗粒递送、显微注射、基因枪、病毒微体(virosome)、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、mRNA、人工病毒体和剂增强的DNA摄取。使用，例如，Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声穿孔也可以用于核酸的递送。可以使用电穿孔和/或脂质体转染来转染原代细胞。可以使用电穿孔和/或脂质体转染来转染原代免疫细胞，诸如T细胞。技术人员将理解，电穿孔和/或脂质体转染参数可以被优化以使细胞存活力最大化。这允许技术人员快速且有效地产生本文描述的工程化免疫细胞，尽管存在多轮电穿孔和/或脂质体转染。例如，用外源TCR和候选基因中的破坏工程化细胞可以需要两次单独的电穿孔(例如，如果首先引入TCR，并且然后破坏候选基因)。在一些实施方案中，将电穿孔和/或脂质体转染在管或其他容器中进行，并且将细胞随后转移至板(例如，24孔板或96孔板)用于测定。以这种方式，也可以将细胞大量修饰(例如，可以将一批细胞修饰为表达外源受体，诸如TCR)，并且然后分成更小的样品用于进一步修饰(例如，候选基因的破坏)。
另外的示例性核酸递送系统包括由以下提供的那些：
Figure BDA0003190278790001146
Biosystems(Cologne,Germany)、Life Technologies(Frederick,Md.)、MAXCYTE Inc.(Rockville,Md.)、BTX分子递送系统(Holliston,Mass.)和Copernicus Therapeutics Inc.(参见，例如，美国专利第6,008,336号)。脂质体转染试剂是商业销售的(例如，
Figure BDA0003190278790001144
和
Figure BDA0003190278790001145
)。
在一些情况下，编码外源TCR的载体可以穿梭至细胞核酸酶。例如，载体可以包含核定位序列(NLS)。载体也可以通过蛋白或蛋白复合体穿梭。在一些情况下，Cas9可以用作穿梭小环载体的手段。Cas可以包含NLS。在一些情况下，载体可以在电穿孔前与Cas蛋白预复合。可以用于穿梭的Cas蛋白可以是核酸酶缺陷型Cas9(dCas9)蛋白。可以用于穿梭的Cas蛋白可以是有核酸酶活性(nuclease-competent)的Cas9。在一些情况下，Cas蛋白可以与指导RNA和编码外源TCR的质粒预混合。
在一些实施方案中，用本文描述的任何核酸递送平台，例如，核转染或电穿孔，细胞的转染效率为约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或大于99.9％。
使用例如
Figure BDA0003190278790001151
转染系统(ThermoFisher Scientific)或
Figure BDA0003190278790001152
Nucleofector(
Figure BDA0003190278790001153
Biosystems)的电穿孔也可以用于将核酸递送到细胞中。可以调整电穿孔参数以优化转染效率和/或细胞存活力。电穿孔设备可以具有多种电波形式的脉冲设置，诸如指数衰减、时间常数和方波。每种细胞类型都具有独特的最佳场强(E)，该场强(E)取决于所施加的脉冲参数(例如，电压、电容和电阻)。最佳场强的应用通过诱导跨膜电压引起电透化，这允许核酸穿过细胞膜。在一些情况下，可以调整电穿孔脉冲电压、电穿孔脉冲宽度、脉冲次数、细胞密度和尖头类型，以优化转染效率和/或细胞存活力。
在一些实施方案中，可以改变电穿孔脉冲电压以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些实施方案中，电穿孔电压少于约500伏。在一些实施方案中，电穿孔电压为至少约500伏、至少约600伏、至少约700伏、至少约800伏、至少约900伏、至少约1000伏、至少约1100伏、至少约1200伏、至少约1300伏、至少约1400伏、至少约1500伏、至少约1600伏、至少约1700伏、至少约1800伏、至少约1900伏、至少约2000伏、至少约2100伏、至少约2200伏、至少约2300伏、至少约2400伏、至少约2500伏、至少约2600伏、至少约2700伏、至少约2800伏、至少约2900伏或至少约3000伏。在一些实施方案中，最佳转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔脉冲电压对细胞类型是特异的。例如，在一些实施方案中，1900伏的电穿孔电压对于巨噬细胞是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，在一些实施方案中，约1350伏的电穿孔电压对于Jurkat细胞或原代人类细胞诸如T细胞是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些实施方案中，一定范围的电穿孔电压对于给定的细胞类型是最佳的。例如，在一些实施方案中，约1000伏和约1300伏之间的电穿孔电压对于人类578T细胞是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。
在一些实施方案中，改变电穿孔脉冲宽度以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些实施方案中，电穿孔脉冲宽度少于约5毫秒。在一些实施方案中，电穿孔宽度是至少约5毫秒、至少约6毫秒、至少约7毫秒、至少约8毫秒、至少约9毫秒、至少约10毫秒、至少约11毫秒、至少约12毫秒、至少约13毫秒、至少约14毫秒、至少约15毫秒、至少约16毫秒、至少约17毫秒、至少约18毫秒、至少约19毫秒、至少约20毫秒、至少约21毫秒、至少约22毫秒、至少约23毫秒、至少约24毫秒、至少约25毫秒、至少约26毫秒、至少约27毫秒、至少约28毫秒、至少约29毫秒、至少约30毫秒、至少约31毫秒、至少约32毫秒、至少约33毫秒、至少约34毫秒、至少约35毫秒、至少约36毫秒、至少约37毫秒、至少约38毫秒、至少约39毫秒、至少约40毫秒、至少约41毫秒、至少约42毫秒、至少约43毫秒、至少约44毫秒、至少约45毫秒、至少约46毫秒、至少约47毫秒、至少约48毫秒、至少约49毫秒或至少约50毫秒。在一些实施方案中，最佳转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔脉冲宽度对细胞类型是特异的。例如，在一些实施方案中，30毫秒的电穿孔脉冲宽度对于巨噬细胞是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些实施方案中，约10毫秒的电穿孔宽度对于Jurkat细胞是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些实施方案中，一定范围的电穿孔宽度对于给定的细胞类型是最佳的。例如，在一些实施方案中，约20毫秒和约30毫秒之间的电穿孔宽度对于人类578T细胞是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。
在一些实施方案中，改变电穿孔脉冲的次数以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些实施方案中，电穿孔包括单脉冲。在一些实施方案中，电穿孔包括多于一次脉冲。在一些实施方案中，电穿孔包括2次脉冲、3次脉冲、4次脉冲、5次脉冲、6次脉冲、7次脉冲、8次脉冲、9次脉冲或10次或更多次脉冲。在一些实施方案中，最佳转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔脉冲的次数对细胞类型是特异的。例如，在一些实施方案中，以单脉冲的电穿孔对于巨噬细胞是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些实施方案中，以3次脉冲的电穿孔对于原代细胞是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些实施方案中，一定范围的电穿孔宽度对于给定的细胞类型是最佳的。例如，在一些实施方案中，以约1次至约3次之间脉冲的电穿孔对于人类细胞是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。
在一些实施方案中，将核酸酶在电穿孔之后添加。在一些实施方案中，核酸酶是DNA酶或RNA酶。在一些实施方案中，核酸酶降低细胞结块，并且因此增加基因组修饰后样品的细胞存活力。在一些实施方案中，将DNA酶在电穿孔之后添加，并且在孵育时间段之后去除。在一些实施方案中，孵育时间段是1分钟多达至约2周。在一些实施方案中，孵育是在电穿孔之后约5分钟。在一些实施方案中，将电穿孔用参与双链断裂修复的蛋白进行。例如，在一些实施方案中，引入参与双链断裂修复的蛋白改善了外源多核酸整合到细胞基因组中的效率。
在一些实施方案中，电穿孔细胞包括对细胞施用第一电穿孔步骤以引入核酸酶；和第二电穿孔步骤，该第二电穿孔步骤包括包含与基因的至少一部分互补的区域的指导多核酸和包含细胞受体序列或其部分的外源多核酸。在一些实施方案中，与包含单电穿孔的相当细胞相比，细胞的逐步电穿孔增加了包含细胞受体序列或其部分的外源多核酸的整合。在一些实施方案中，电穿孔步骤在每次电穿孔之间具有孵育时间段。例如，在一些实施方案中，第一电穿孔步骤可以具有约5分钟至约1周的温育，直到对细胞或细胞群体施用第二电穿孔步骤。在一些实施方案中，孵育时间包括添加核酸酶诸如DNA酶，或参与双链断裂修复的蛋白。在一些实施方案中，将参与DNA双链断裂修复的蛋白在能够编码外源受体序列的多核酸之前、期间或之后添加。在一些实施方案中，将参与DNA双链断裂修复的蛋白或其部分在递送编码基因或其部分的多核酸之前约12小时引入细胞群体。在一些实施方案中，将参与DNA双链断裂修复的蛋白或其部分在将多核酸诸如外源TCR引入细胞群体前约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、25小时、30小时、40小时、50小时、60小时或多达约80小时引入细胞群体。
在一些实施方案中，改变电穿孔的起始细胞密度，以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些实施方案中，电穿孔的起始细胞密度少于约1×105个细胞。在一些实施方案中，电穿孔的起始细胞密度是至少约1×105个细胞、至少约2×105个细胞、至少约3×105个细胞、至少约4×105个细胞、至少约5×105个细胞、至少约6×105个细胞、至少约7×105个细胞、至少约8×105个细胞、至少约9×105个细胞、至少约1×106个细胞、至少约1.5×106个细胞、至少约2×106个细胞、至少约2.5×106个细胞、至少约3×106个细胞、至少约3.5×106个细胞、至少约4×106个细胞、至少约4.5×106个细胞、至少约5×106个细胞、至少约5.5×106个细胞、至少约6×106个细胞、至少约6.5×106个细胞、至少约7×106个细胞、至少约7.5×106个细胞、至少约8×106个细胞、至少约8.5×106个细胞、至少约9×106个细胞、至少约9.5×106个细胞、至少约1×107个细胞、至少约1.2×107个细胞、至少约1.4×107个细胞、至少约1.6×107个细胞、至少约1.8×107个细胞、至少约2×107个细胞、至少约2.2×107个细胞、至少约2.4×107个细胞、至少约2.6×107个细胞、至少约2.8×107个细胞、至少约3×107个细胞、至少约3.2×107个细胞、至少约3.4×107个细胞、至少约3.6×107个细胞、至少约3.8×107个细胞、至少约4×107个细胞、至少约4.2×107个细胞、至少约4.4×107个细胞、至少约4.6×107个细胞、至少约4.8×107个细胞或至少约5×107个细胞。在一些实施方案中，最佳转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔起始细胞密度对细胞类型是特异的。例如，在一些实施方案中，1.5×106个细胞的电穿孔起始细胞密度对于巨噬细胞是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，在一些实施方案中，5×106个细胞的电穿孔起始细胞密度对于人类细胞是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些实施方案中，一定范围的电穿孔起始细胞密度对于给定的细胞类型是最佳的。例如，在一些实施方案中，5.6×106个细胞和5×107个细胞之间的电穿孔起始细胞密度对于人类细胞诸如T细胞是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。
在一些实施方案中，电穿孔是相继的。例如，在一些实施方案中，进行至少一次电穿孔。在一些实施方案中，将二次电穿孔在初始电穿孔之后约30分钟至约72小时进行。在一些实施方案中，将二次电穿孔在初始电穿孔之后从约30分钟、45分钟、60分钟、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、45小时、50小时、55小时、60小时、65小时、70小时或多达约72小时进行。
在一些实施方案中，用例如CRISPR系统将编码外源TCR的核酸序列整合到细胞基因组中的效率为约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或多于99.9％。
在一些实施方案中，外源多核酸诸如TCR的整合使用任何技术测量。例如，在一些实施方案中，整合通过流式细胞术、检验员核酸酶测定、通过分解追踪插入缺失(TIDE)、接合PCR或其任何组合来测量。在其他情况下，转基因整合可以通过PCR来测量。
试剂盒
在一方面，本文提供了试剂盒，所述试剂盒包含一种或更多种本文描述的组合物或剂。例如，在一方面，本文描述的试剂盒包含在单独的容器中的多于一种指导核酸(例如，gRNA)，其中所述多于一种指导核酸中的每一种指导核酸结合不同的靶候选基因。在一些实施方案中，所述试剂盒包含至少一种核酸酶(例如本文描述的核酸酶，例如，内切核酸酶)。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于递送所述指导核酸和/或所述核酸酶的试剂。在一些实施方案中，这些试剂包括病毒载体(例如，本文描述的病毒载体)和/或电穿孔试剂(例如，本文描述的试剂)。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于本文描述测定的细胞，包括，但不限于，免疫细胞(例如，T细胞)和/或癌细胞。在一些实施方案中，所述试剂盒包含确定本文描述体外测定(例如，多于一个T细胞的体外细胞溶解活性)的读取的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于进行本文描述的测定的说明。
实施例
实施例1：从PBMC中分离和扩增T细胞
从LeukoPak中分离外周血单个核细胞(PBMC)
本文使用从正常外周血收集的Leukopak。将血细胞用冷冻的1×PBS稀释至3:1。将稀释的血液逐滴(例如，非常缓慢地)添加到50mL锥形瓶中的15mL的LYMPHOPREP(Stem CellTechnologies)上。将细胞在没有制动的情况下以400×G旋转25分钟。将血沉棕黄层慢慢地取出，并且放置于无菌锥形管中。将细胞用冷藏的1×PBS洗涤，并且以400×G旋转10分钟。去除上清液，将细胞重悬于培养基中，计数，并且在冷冻培养基(45mL热灭活FBS和5mLDMSO)中有生存力地冷冻。
CD3+ T细胞的分离
将PBMC解冻并且铺板在培养基(RPMI-1640(没有酚红)，20％FBS(热灭活)和1×Gluta-MAX)中持续1-2小时。收集细胞并计数；将细胞密度调整至5×10^7个细胞/mL，并且转移至无菌的14mL聚苯乙烯圆底管中。使用EasySep人类CD3细胞分离试剂盒(Stem CellTechnologies)，将50uL/mL的分离混合物添加至细胞中。将悬浮液通过移液混合并且在室温孵育5分钟。在孵育之后，将RapidSpheres涡旋30秒，以50uL/mL添加至样品中，并且将样品通过移液混合。对于少于4mL的样品，补充至5mL，或者对于多于4mL的样品，补充至10mL。将无菌聚苯乙烯管添加至“Big Easy”磁体中，并且在室温孵育3分钟。将磁体和试管在一个连续的运动中倒置，将富集的细胞悬浮液倒入新的无菌管中。
CD3+ T细胞的活化和扩增
将分离的CD3+ T细胞计数，并且以2×10^6个细胞/mL的密度铺板在24孔板中。将Dynabeads人类T-活化因子CD3/CD28珠(Gibco,Life Technologies)在使用dynamagnet用具有0.2％BSA的1×PBS洗涤之后以3:1(珠:细胞)添加至细胞中。将IL-2(Peprotech)以300IU/mL的浓度添加。将细胞孵育48小时，并且然后使用dynamagnet去除珠。将细胞培养另外6-12小时然后电穿孔。
实施例2：携带TCR转基因的靶载体的产生
获得TCR转基因序列并且通过IDT以gBlock合成。根据制造商的说明，将gBlock设计为具有用于重组到靶基因座的侧翼序列，通过LR克隆酶反应(Invitrogen)克隆到pENTR1中，并且对序列进行验证。例如，将对G12D K-RAS具有特异性的TCR序列(具有0.5kb、1kb、2kb或4kb的侧翼序列(被设计为靶向整合到TRAC基因座中))以gBlock获得，通过LR克隆酶反应(Invitrogen)根据制造商的说明克隆到pENTR1中，并且对序列进行验证。使用完整质粒或线性DNA(例如，PCR产物)以用于TCR敲入。示例性TCR转基因构建体示于图8A中，其中位于转基因TCR的α链和β链侧翼的左和右同源臂将转基因靶向TRAC基因座。
实施例3：转染T细胞用于TCR敲入
将细胞使用Neon转染系统(10uL试剂盒，Invitrogen，Life Technologies)进行电穿孔。将细胞计数，并且以2×105个细胞的密度重悬于10uL的T缓冲液中。添加1ug、0.5ug、0.3ug、0.2ug、0.1ug或0.05ug编码敲入TCR的质粒或短线性DNA。还将1ug Cas9 mRNA和针对内源TCR的1ug的gRNA添加至细胞混合物中。将细胞以1400V、10毫秒、3次脉冲进行电穿孔。在转染之后，将细胞铺板在48孔板中的200uL培养基中，并且在5％CO2中在30℃孵育24小时。在恢复24小时之后，将T细胞转移至包含抗生素的培养基中，在5％CO2中在37℃培养，并且在存在PBMC饲养细胞和IL-2的情况下，通过使用抗CD3刺激进行为期两周的快速扩增方案(REP)。
实施例4：转染T细胞用于TCR敲入和免疫调节基因敲除
将细胞使用Neon转染系统(10uL试剂盒，Invitrogen，Life Technologies)进行电穿孔。将细胞计数，并且以2×105个细胞的密度重悬于10uL的T缓冲液中。添加1ug、0.5ug、0.3ug、0.2ug、0.1ug或0.05ug编码敲入TCR的质粒或短线性DNA。还将1ug Cas9 mRNA、针对内源TCR的1ug gRNA以及针对PD-1、CTLA-4或CISH的1ug gRNA添加至细胞混合物中。将细胞以1400V、10毫秒、3次脉冲进行电穿孔。在转染之后，将细胞铺板在48孔板中的200uL培养基中，并且在5％CO2中在30℃孵育24小时。在恢复24小时之后，将T细胞转移至包含抗生素的培养基中，在5％CO2中在37℃培养，并且在存在PBMC饲养细胞和IL-2的情况下，通过使用抗CD3刺激进行为期两周的快速扩增方案(REP)。
实施例5：转染T细胞用于TRAC和免疫调节基因敲除，以及AAV转导T细胞用于TCR敲入。
第-3天:复苏与刺激
将10％人类血清添加至X-VIVO15培养基中，并且在37℃预热。将人类PBMC在水浴中解冻。在解冻之后立即将细胞重悬并以300g旋转5-10分钟。将细胞用PBS洗涤，并且通过血细胞计数器计数。然后将细胞以100万个细胞/mL重悬于X-VIVO15+10％人类血清+300U/ml IL-2+5ng/ml IL-7和IL-15中。将抗CD3和抗CD28 Dynabeads以约1比2的细胞:珠的比例添加，用于刺激。将细胞培养3天。
第0天:去除珠、转染和转导
将细胞用PBS洗涤，并且放置于DynaMag15中持续约1分钟。将珠洗去2次，并且然后将细胞沉淀并以100万个细胞/mL重悬于X-VIVO15+血清+IL-2+IL-7+IL-15中。然后将细胞在37℃培养2小时，然后转染。
对于转染，将细胞用PBS洗涤并沉淀。将细胞沉淀物重悬于T缓冲液中。将所需体积的细胞(参见表3)添加到具有Cas9 mRNA和gRNA的无菌微量离心管中。对一些样品，将gRNA设计为靶向TRAC基因座、PD-1、CTLA-4或CISH。将细胞、cas9 mRNA和gRNA通过温和移液混合。将细胞溶液小心地吸到Neon尖头中，确保不存在气泡。将细胞根据设定的条件电击(zap)。在转染之后，将细胞在30℃培养2小时，然后添加包含编码敲入TCR的DNA的AAV病毒。TCR转基因构建体示于图8A中，其中位于转基因TCR的α链和β链侧翼的左和右同源臂将转基因靶向TRAC基因座。
表3：用于Neon系统电穿孔的条件
10ul尖头 100ul尖头
电解缓冲液 E E2
细胞数目 2×10^5个 3×10^6个
用于悬浮的体积 ～10ul/样品 ～100ul/样品
微量离心管中的最佳体积 12ul 115ul
Cas9 mRNA(L-7206)的质量 1.5ug 15ug
gRNA的质量 1ug 10ug
培养基的体积 200 ul 3ml
板的尺寸 平底96wp(或48wp) 6wp
表4：脉冲条件
脉冲电压 脉冲宽度 脉冲次数
1400 10毫秒 3
将细胞以每细胞1e6AAV病毒颗粒的MOI转导，并且在30℃培养过夜。
第1天:培养基更换
转导后24小时，将细胞从转导培养基中取出，并且转移到具有酚红和庆大霉素(红色培养基)-与血清和L-2+IL-7+IL-15的培养基中。将细胞在37℃培养。TCR转基因插入的效率示于图7中，效率达到78％。
实施例6：FACS富集TCR敲入T细胞
通过荧光活化细胞分选(FACS)富集CRISPR编辑的T细胞用于TCR敲入、免疫调节基因敲除、存活细胞或其任何组合。例如，将细胞通过用具有0.5％FBS的冷藏的1×PBS洗涤进行准备，并且用对敲入TCR特异性的荧光缀合的抗体、对PD-1特异性的荧光缀合抗体和碘化丙锭染色。然后，将细胞进行洗涤并用例如FACSAriaTM Fusion sorter(BD Biosciences)分选，以富集TCR敲入阳性细胞、PD-1阴性细胞、存活细胞或其任何组合。将FACS富集的CRISPR编辑的T细胞群体通过在冷冻培养基(90％热灭活的FBS、10％DMSO)中冷冻任选地地冷冻保存。
实施例7：TCR敲入T细胞的选择性扩增
CRISPR编辑的T细胞通过在培养物中的选择性扩增富集TCR敲入。例如，将细胞添加至包被有抗TCRβ抗体(该抗体仅结合并活化包含敲入TCR的T细胞)和另外包被有抗CD28抗体的培养板。将细胞培养3-7天。通过流式细胞术评估富集。在孵育之后，表达具有已知抗原特异性的TCR的T细胞的绝对数目和相对比例增加。
实施例8：免疫调节基因蛋白表达损失的确认
为了确定核酸酶编辑是否导致免疫调节蛋白表达的损失，在用抗CD3/CD28抗体或dynabeads重新刺激细胞之后，进行流式细胞术或蛋白质印迹。将T细胞通过用具有0.5％FBS的冷藏的1×PBS洗涤进行准备，并且用对PD-1或CTLA-4特异性的荧光缀合的抗体染色。然后将细胞洗涤并且使用LSR II Fortessa(BD Biosciences)和FlowJo软件(FlowJo LLC)通过流式细胞术分析。为了评估细胞内蛋白(例如CISH)的损失，用透化法或蛋白质印迹法进行流式细胞术。对于流式细胞术，蛋白表达的损失通过阳性染色细胞百分比的降低或平均荧光强度的降低来确认。对于蛋白质印迹，蛋白表达的损失通过密度测定法评估的免疫调节基因特异性蛋白条带的降低来确认。四种不同靶基因的敲除效率示于图6中，具有至少80％的编辑效率。
实施例9：通过慢病毒转导敲除候选免疫调节基因。
将如以上描述产生的FACS富集的CRISPR编辑的T细胞群体在水浴中解冻，在37℃重悬于具有10％FBS的X-VIVO15培养基中，以300g沉淀5-10分钟，用PBS洗涤，并且以100万个细胞/mL重悬于X-VIVO15+10％人类血清+300U/ml IL-2+5ng/ml IL-7和IL-15中。将细胞通过用抗CD3/CD28 dynabead以约1:2的细胞:珠比例刺激3天来扩增。将细胞用PBS洗涤，并且放置于DynaMag15中持续约1分钟。将珠洗去两次，并且将细胞以100万个细胞/mL重悬于X-VIVO15+血清+IL-2+IL-7+IL-15中，并且在37℃培养2小时，然后转染。
为了转染Cas9 mRNA，将细胞用PBS洗涤并沉淀。将细胞沉淀物重悬于T缓冲液中，并且将所需体积的细胞(表3)添加到具有Cas9 mRNA的无菌微量离心管中。将细胞和Cas9mRNA通过温和移液混合。将细胞溶液小心地吸到Neon尖头中，确保不存在气泡。将细胞根据设定的条件电击。在转染之后，将细胞在30℃培养2小时，然后以100μL/孔转移至96孔板中。
使用LentiArrayTM CRISPRgRNA 96孔板(ThermoFisher)，其中包含编码候选免疫调节基因gRNA的慢病毒。96孔板的每个孔可以包含靶向一种候选免疫调节基因的gRNA，使得每个96孔板可以包含多达96种不同候选免疫调节基因的gRNA。将LentiArrayTM CRISPRgRNA96孔板在37℃水浴中解冻，以300×g离心，收集细胞孔底部的内容物，并且放置于冰上。将先前CRISPR编辑的T细胞用LentiArray慢病毒以1-10的感染复数转导，并且任选地以800×g离心30-120分钟。将转导的T细胞在37℃，5％CO2孵育三天。所得板包含阵列化的敲除T细胞，其中每个孔包含敲除了不同候选免疫调节基因的T细胞。阵列化的T细胞都可以包含先前敲入的突变体G12D KRAS特异性TCR，伴有或不伴有另外敲除已知免疫调节基因诸如PD-1、CTLA-4或CISH。
实施例10：通过核感染敲除候选免疫调节基因。
将表达具有已知特异性的TCR的编辑的T细胞洗涤，并且分配在96孔板中。将Cas9mRNA和合成的gRNA或RNP添加至细胞混合物中，其中不同的gRNA被用于单独孔中的单独基因。将核转染用脉冲码EO-115在16孔比色皿条中进行，其中每个比色皿中在20uL体积的P3缓冲液中有3×105个细胞，或者根据表3和表4中的方案使用Neon转染系统进行。
实施例11：阵列化的敲除T细胞与靶细胞系的共培养。
将表达突变体G12D突变体KRAS的靶细胞系接种在96孔板中。例如，将LS-180细胞(ATCC)以1×104个细胞/孔接种在96孔板中。将敲除了候选免疫调节基因和敲入了G12DKRAS-特异性TCR的阵列化T细胞以1个T细胞对1个靶细胞、1个T细胞对2个靶细胞、或1个T细胞对5个靶细胞、或1个T细胞对10个靶细胞的比例添加至LS-180细胞中，并且在37℃、5％CO2孵育24-72小时。
实施例12：阵列化的敲除T细胞与表达萤光素酶并通过人类MHC-I呈递G12D KRAS的靶细胞系的共培养
将工程化为表达萤光素酶和人类MHC-I的COS-7细胞接种在96孔板中，并且用KRASG12D脉冲。将敲除了候选免疫调节基因和敲入了G12DKRAS特异性TCR的阵列化T细胞以10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5或1:10的比例添加到COS-7细胞中，并且在37℃、5％CO2孵育16-48小时。
实施例13：产生抗原呈递细胞用于靶抗原的MHC II类表达。
将单核细胞来源的未成熟的APC使用塑料粘附法产生。简言之，将单采血液成分术(apheresis)样品解冻、洗涤，用纯AIM-V培养基(Life Technologies)调整至5-10×106个细胞/mL，并且然后在37℃、5％CO2孵育。在90分钟(min)之后，收集未粘附的细胞，并且将烧瓶用AIM-V培养基剧烈洗涤，并且然后与AIM-V培养基一起孵育另外60min。然后将烧瓶再次用AIM-V培养基剧烈洗涤，并且然后将粘附的细胞与APC培养基一起孵育。APC培养基包含含5％人类血清(内部收集和处理)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、800IU/ml GM-CSF和800U/ml IL-4的RPMI(培养基补充剂来自LifeTechnologies，并且细胞因子来自Peprotech)。在第3天，将新鲜的APC培养基添加至培养物中。
在第5-6天，将未成熟的APC使用包含LPS、GM-CSF、IL-4、IL-6、IL-1b、C3、C5和前列腺素E2(Sigma)的细胞因子混合物(“成熟混合物”)成熟1-2天。
实施例14：阵列化的敲除T细胞与单核细胞来源的抗原呈递细胞的共培养。
将成熟的APC收获，洗涤，以1×106个细胞/mL重悬于补充有C3和C5的细胞培养基中，然后与1g/mL的25-mer肽一起在37℃、5％CO2孵育过夜(12-14小时)。在过夜脉冲之后，将APC用PBS洗涤2×，添加T细胞培养基，并且将细胞立即用于共培养测定。所用的肽是：突变的G12DKRAS肽、野生型KRAS肽以及作为阴性对照的突变的ALK肽。将敲除了候选免疫调节基因的阵列化T细胞以1个T细胞对1个APC、1个T细胞对2个APC、1个T细胞对5个APC或1个T细胞对10个APC的比例添加至抗原呈递细胞中，并且在37℃、5％CO2孵育24-72小时。
实施例15：CytoTox-Glo细胞毒性测定
使用CytoTox-GloTM细胞毒性测定(Promega)确定阵列化的敲除T细胞在以上描述的共培养测定中杀伤靶细胞的能力。将50uL的CytoTox-GloTM试剂添加至包含待评估样品的96孔板的所有孔中。将板通过轨道振荡混合，并且在室温孵育15分钟。来自死细胞的细胞外蛋白酶裂解不渗透细胞的肽底物(AAF-aminoluciferin)，导致发光。使用读板器测量发光(实验死细胞发光)。将50uL裂解试剂添加至每个孔中，将板通过轨道振荡混合，并且在室温孵育15分钟。同样使用读板器测量发光(总发光)。存活细胞发光通过从总发光中减去实验死细胞发光来计算。与没有被破坏的免疫调节基因的T细胞相比，具有被破坏的免疫调节基因的T细胞可以表现出增强的细胞毒性。
实施例16：HCS LIVE/DEAD细胞毒性测定
使用HCS LIVE/DEAD绿色试剂盒(Thermo Fisher)确定阵列化的敲除T细胞在以上描述的共培养测定中杀伤靶细胞的能力。染色溶液通过以下构成：将2.1uL
Figure BDA0003190278790001271
DEAD GreenTM存活力染色剂和40uL HCS NuclearMaskTM深红色染色剂添加至待分析的每板6mL完整培养基中。将50uL染色溶液添加至包含待评估样品的96孔板的每个孔中，并且将板在37℃孵育30分钟。去除培养基，将100uL的16％多聚甲醛添加至每个孔中，并且将板在室温孵育15分钟。去除固定溶液，将细胞用PBS洗涤，并且使用读板器或荧光显微镜分析样品的绿色和深红色荧光(激发/发射分别为488/515nm和638/686nm)。Image-iT DEAD绿色存活力染色剂是不渗透细胞的，但可以进入细胞膜受损的细胞，并且在与DNA结合后表现出强的荧光。HCS NuclearMask试剂是渗透细胞的，并且可以将所有细胞染色。与没有被破坏的免疫调节基因的T细胞相比，具有被破坏的免疫调节基因的T细胞可以表现出增强的细胞毒性。
实施例17：基于萤光素酶的细胞毒性测定
使用萤光素酶测定试剂盒和读板器确定阵列化的敲除T细胞杀伤被工程化为表达萤光素酶并如以上描述在人类MHC-I上呈递G12D KRAS的COS-7细胞的能力。在共培养后，将萤光素酶测定试剂添加至培养基上清液中，并且立即使用板读取光度计测量发光。与没有被破坏的免疫调节基因的T细胞相比，具有被破坏的免疫调节基因的T细胞可以表现出增强的细胞毒性。
实施例18：电阻抗测定
可以使用电阻抗测定，诸如xCelligence平台，鉴定被CRISPR灭活时给出T细胞杀伤显著增加的基因。将粘附的靶细胞系，MHCI工程化的COS-7，以150ul DMEM中的5,000个COS-7细胞/孔接种在xCELLigence96孔板中。它们的生长在机器上通过电阻抗读取进行监测(在37℃、5％CO2)。在生长2-3小时之后，将WT或突变体肽(例如G12D KRAS肽)添加至COS-7细胞中，并且将它们通过在37℃、5％CO2孵育1-2小时进行“脉冲”。然后去除上清液，并且将细胞在200ul PBS中洗涤两次，然后添加100ul DMEM生长培养基，并且返回至培养箱和xCELLigence机器中。监测肽脉冲之后的恢复和生长持续一小时，然后将CD8+ T细胞添加至COS-7。每孔添加100ul T细胞培养基(x-vivo培养基+10％人类血清+IL2、IL7和IL15)中的2,500个CD8 T细胞。可以使用不同的效应物与靶比例，例如，0.5:1的效应物与靶比例。
实施例19：通过ELISA的细胞因子定量
将以上描述的共培养测定中产生的细胞因子通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行定量。使用人类IFN-γ定量ELISA试剂盒(R&D Systems)。将100uL测定稀释剂添加至ELISA板的每个孔中。将100uL来自共培养测定的上清液或标准品添加至ELISA板的孔中。将200uL缀合物添加至每个孔中，将板密封并且在室温孵育2小时。将板吸出并洗涤四次，将200uL底物溶液添加至每个孔中，并且将板在黑暗中孵育30分钟。将50uL终止溶液添加至每个孔中，并且读取450nm处的吸光度。与没有被破坏的免疫调节基因的T细胞相比，具有被破坏的免疫调节基因的T细胞在与表达或呈递同源抗原的细胞共培养之后可以产生更高数量的IFN-γ。
实施例20：通过多重免疫测定的细胞因子定量。
将共培养测定中产生的多于一种细胞因子通过多重免疫测定进行定量。使用Bio-Plex ProTM人类炎症测定(Bio-Rad)定量37种细胞因子。在将细胞在4℃以1,000×g沉淀15分钟之后，收集来自共培养测定的细胞培养基上清液，并且立即使用或在约-70℃储存直至使用。将50uL测定缓冲液中的偶联珠添加至Bio-Plex板的每个孔中。将板洗涤两次，并且将50uL的样品、标准品、空白和对照添加至孔中。将板密封，并且在室温以850rpm在振荡器上培养1小时。将板洗涤三次，并且将25uL检测抗体添加至每个孔中，随后在室温以850rpm在振荡器上孵育30分钟。将板洗涤三次，并且将50uL链霉抗生物素蛋白-PE添加至每个孔中，随后在室温以850rpm在振荡器上孵育10分钟。将板洗涤三次，添加125uL测定缓冲液，并且将板在室温以850rpm振荡30秒，以使珠重悬。将板使用Bio-Plex 200系统和Bio-PlexManagerTM软件进行读取，以确定细胞因子浓度。与没有被破坏的免疫调节基因的T细胞相比，具有被破坏的免疫调节基因的T细胞在与表达或呈递同源抗原的细胞共培养之后可以产生更大或更少数量的某些细胞因子。
实施例21：BrdU T细胞增殖测定
使用BrdU细胞增殖ELISA试剂盒(Abcam)测量与表达或呈递同源抗原的细胞共培养的阵列化T细胞的增殖。在共培养测定期间，将BrdU添加至96孔板的孔中。将BrdU掺入分裂细胞的DNA中。在共培养后，将T细胞重悬，转移至新的96孔板中，并且通过以300×g离心5分钟进行沉淀。吸取培养基，并且将200uL固定溶液添加至每孔中，随后在室温孵育1小时。固定溶液使细胞固定并透化，并且使DNA变性。将板洗涤三次，将200uL抗BrdU检测抗体添加至每个孔中，并且将板在室温孵育1小时。将板洗涤三次，并且将100uL过氧化物酶抗小鼠IgG缀合物添加至每个孔中。将板洗涤三次，并且将100uL TMB过氧化物酶底物添加至每个孔中。将板在黑暗中孵育30分钟，将100uL终止溶液添加至每个孔中，并且使用分光光度微量滴定读板器测量450nm处的吸光度。与没有被破坏的免疫调节基因的T细胞相比，具有被破坏的免疫调节基因的T细胞在与表达或呈递同源抗原的细胞共培养之后可以表现出增强的增殖。
实施例22：CFSE T细胞增殖测定
使用CFSE染色和流式细胞术测量与表达或呈递同源抗原的细胞共培养的阵列化T细胞的增殖。将阵列化的T细胞以300×g沉淀，并且重悬于具有5uM CFSE(Thermo Fisher)的CellTrace CFSE染色溶液中，然后与表达或呈递同源抗原的细胞共培养。在37℃孵育20分钟之后，添加OpTimizer T细胞扩增SFM来猝灭任何未结合的染料。在孵育5分钟之后，将细胞以300×g沉淀，重悬于T细胞培养基中，并且与靶细胞系或APC共培养。在共培养后，将T细胞用对CD3、CD4和CD8特异性的荧光缀合的单克隆抗体染色，并且在LSR Fortessa(BDBiosciences)上进行流式细胞分析。将数据使用FlowJo软件(FlowJo LLC)进行分析。与没有被破坏的免疫调节基因的T细胞相比，具有被破坏的免疫调节基因的T细胞在与表达或呈递同源抗原的细胞共培养之后可以表现出增强的增殖。
实施例23：T细胞的流式细胞分析
在共培养后，将T细胞用对IFNγ、IL2、TNFα、CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、CD62L和CD69特异性的荧光缀合的单克隆抗体染色。流式细胞分析在LSR Fortessa(BDBiosciences)上进行。将数据使用FlowJo软件(FlowJo LLC)进行分析。与没有被破坏的免疫调节基因的T细胞相比，具有被破坏的免疫调节基因的T细胞可以表现出分化为TEM的倾向增加、分化为TCM的倾向增加、活化标志物的表达增加或其组合。
实施例24：功能验证
从慢病毒gRNA阵列中鉴定为潜在免疫调节基因的基因通过进一步的实验得到验证。指导RNA(gRNA)是针对基因的期望区域设计的。基于由脱靶位置确定的最高排序值，选择多个引物来产生gRNA。可以将gRNA序列修饰为包含2-O-甲基3硫代磷酸酯加成。gRNA以以下寡核苷酸对的形式排序：5’-CACCG-gRNA序列-3’和5’-AAAC-逆向互补gRNA序列-C-3’。
将gRNA使用靶序列克隆方案克隆在一起。简言之，将寡核苷酸对用以下方案在热循环仪中使用T4 PNK(NEB)和10×T4连接缓冲液(NEB)磷酸化并且退火在一起：37℃30分钟，95℃5分钟，并且然后以5℃/分钟缓降至25℃。将pENTR1-U6-Stuffer-gRNA载体(内部制造)用FastDigest BbsI(Fermentas)、FastAP(Fermentas)消化，并且使用10×Fast DigestBuffer用于连接反应。将消化的pENTR1载体与来自先前步骤的磷酸化且退火的寡双链体(1:200稀释)使用T4 DNA连接酶和缓冲液(NEB)连接在一起。将连接在室温孵育1小时，并且然后转化，并且随后使用GeneJET Plasmid Miniprep试剂盒(Thermo Scientific)进行微型制备。将质粒测序以确认正确的插入。
将HEK293T细胞以1×10^5个细胞/孔的密度铺板在24孔板中。将150uL Opti-MEM培养基与1.5ug gRNA质粒和1.5ug Cas9质粒组合。将另外150uL Opti-MEM培养基与5ulLipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)组合。将溶液组合在一起并且在室温孵育15分钟。将DNA-脂质复合体逐滴添加至24孔板的孔中。将细胞在37℃孵育3天，并且将基因组DNA用GeneJET基因组DNA纯化试剂盒(Thermo Scientific)进行收集。将gRNA的活性通过检测员消化、凝胶电泳和密度测定法来定量(Guschin，D.Y.，等人，“A Rapid and GeneralAssay for Monitoring Endogenous Gene Modification,”Methods in MolecularBiology,649:247-256(2010))。
如其他实施例中概述的，使用在产生双链断裂方面显示出高效率的gRNA破坏候选免疫调节基因。如其他实施例中概述的，将所得的TCR敲入、候选免疫调节敲除T细胞在功能测定中进行评估。
实施例25：基于筛选测定和其他加权参数对候选免疫调节基因进行排序
在T细胞中破坏候选免疫调节基因，将T细胞与靶细胞共培养，并且如以上实施例中概述运行筛选测定(例如，细胞毒性测定)。作为筛选测定的输出，获得了每个被破坏基因的数值数据(例如，反映细胞毒性)。对于每个基因，从相关数据库中提取数据，并且使用算法生成筛选基因的排序列表，其中将基因基于以下逻辑参数进行排序：(a)来自筛选测定的数值数据(例如，敲除T细胞的细胞毒性)；(b)基因在人类T细胞中的表达，(是/否，低/中/高，或数值)；(c)基因蛋白产物的亚细胞定位(核/细胞质/细胞表面)；(d)基因在“可药化基因组”中的指定(是/否)；(e)基因功能丧失与人类疾病的已知相关(是/否)；(f)使用的CRISPR gRNA破坏候选基因的预测的效率(排序顺序)；(g)已知靶向基因的现有药物或开发中的药物(是/否)；(h)小鼠中基因的已知功能丧失表型(是/否)。逻辑参数对最终排序的贡献加权如下：最高加权：(a)；高加权：(b)和(c)；中等加权：(d)和(e)；较低加权：(f)、(g)和(h)。将说明性的算法工作流程提供于图5A中。使用筛选基因的排序列表将靶向基因优先排序用于验证和进一步研究。
实施例26：迭代选择候选免疫调节基因进行筛选
如实施例24中描述的，生成基因的排序列表。针对数据库查询排序靠前的基因，以确定每个基因的以下特征：(a)基因家族中的成员关系；(b)预测或已知的基因功能；和(c)参与信号传导通路。对于每个鉴定的家族、功能和信号传导通路，进行相同家族、功能或信号传导通路的其他基因的全基因组范围的检索。生成包含所有鉴定基因的列表，并且使用算法基于与来自筛选测定的排序靠前的基因共有的特征(家族/功能/信号传导通路)的数目将列表进行排序。
然后将来自列表的排序靠前的基因在T细胞中破坏，将T细胞与靶细胞共培养，并且如以上实施例中概述运行筛选试验(例如，细胞毒性测定)。
使用算法将筛选测定的结果与以上描述的每个特征的击中的盛行率相关联，并且基于相关联的强度计算每个特征的加权。应用特征加权来将鉴定的基因的列表重新排序。
迭代重复基因破坏、共培养、筛选测定、相关联计算、加权计算和列表重新排序步骤，以鉴定和筛选候选免疫调节基因的新的集合。
将说明性的算法工作流程提供于图5B中。
先前筛选的基因可以从随后轮中省略，以使冗余最小化。
实施例27：鉴定与是不良药物靶的候选基因相关联的可药化免疫调节基因
在T细胞中破坏候选免疫调节基因，将T细胞与靶细胞共培养，并且如以上实施例中概述运行筛选测定(例如，细胞毒性测定)。作为筛选测定的输出，获得了每个被破坏基因的数值数据(例如，反映细胞毒性)。
针对数据库查询筛选的基因，以确定每个基因的以下特征：(a)基因蛋白产物的亚细胞定位(核/细胞质/细胞表面)；和(b)基因在“可药化基因组”中的指定(是/否)。选择具有核定位、细胞质定位或对可药化基因组“无”指定的基因用于进一步分析。
使用算法来生成所选择的基因的排序列表，其中基因基于以下逻辑参数进行排序：(a)来自筛选测定的数值数据(例如，敲除T细胞的细胞毒性)；(b)基因在人类T细胞中的表达，(是/否，低/中/高，或数值)；(c)基因功能丧失与人类疾病的已知相关(是/否)；(d)使用的CRISPR gRNA破坏候选基因的预测的效率(排序顺序)；(e)已知靶向基因的现有药物或开发中的药物(是/否)；(f)小鼠中基因的已知功能丧失表型(是/否)。逻辑参数对排序的贡献加权如下：最高加权：(a)；高加权：(b)；中等加权：(c)；较低加权：(d)、(e)和(f)。
针对数据库查询排序靠前的基因，以确定每个基因的以下特征：(a)基因家族中的成员关系；和(b)参与信号传导通路。对于每个鉴定的家族和信号传导通路，对是相同家族的成员或相同信号传导通路上游的其他基因进行全基因组范围的检索。生成包含所有鉴定的基因的列表，并且使用算法基于以下逻辑参数将基因进行排序：(a)基因在人类T细胞中的表达，(是/否，低/中/高，或数值)；(b)基因蛋白产物的亚细胞定位(核/细胞质/细胞表面)；(c)基因在“可药化基因组”中的指定(是/否)；(d)基因功能丧失与人类疾病的已知相关(是/否)；(e)使用的CRISPR gRNA破坏候选基因的预测的效率(排序顺序)；(f)已知靶向基因的现有药物或开发中的药物(是/否)；(g)小鼠中基因的已知功能丧失表型(是/否)。逻辑参数对最终排序的贡献加权如下：高加权：(a)和(b)；中等加权：(c)和(d)；较低加权：(e)、(f)和(g)。使用基因的排序列表将候选基因优先排序用于下一轮筛选。
然后将来自列表的排序靠前的基因在T细胞中破坏，将T细胞与靶细胞共培养，并且如以上实施例中概述运行筛选试验(例如，细胞毒性测定)。然后，可以迭代重复该实施例中的先前步骤，以鉴定和筛选候选免疫调节基因的新的集合。将说明性的算法工作流程提供于图5C中。先前筛选的基因可以从随后轮中省略，以使冗余最小化。
序列表
<110> 因提玛生物科学公司
<120> 鉴定免疫调节基因的方法
<130> 47533-743.601
<140>
<141>
<150> 62/904,283
<151> 2019-09-23
<150> 62/773,767
<151> 2018-11-30
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 1
tagtcggtac gcgactaagc cg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 2
tagtcgtcgt aacgtacgtc gg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 3
cggctataac gcgtcgcgta g 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 4
tagagcgtac gcgactaacg ac 22

Claims (194)

1.一种筛选多于一个单个候选基因的方法，所述方法包括：
a.在免疫细胞的多于一个单独群体中表达外源细胞受体或其功能片段，其中每个群体包含多于一个免疫细胞；
b.将CRISPR系统引入所述免疫细胞的单独群体中的每一个中，所述CRISPR系统包含：
i.指导核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述免疫细胞的单独群体中的每一个是不同的；和
ii.外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸；
从而产生工程化免疫细胞的多于一个单独群体，所述工程化免疫细胞的单独群体包含所述单个候选基因中的基因组破坏，其中所述基因组破坏抑制所述单个候选基因的表达；
c.进行体外测定，包括在体外使所述多于一个工程化免疫细胞与表达所述外源细胞受体或其功能片段的同源抗原的多于一个细胞接触；并且
d.从所述体外测定中获得读取，从而确定抑制所述单个候选基因的表达的所述基因组破坏对所述工程化免疫细胞的多于一个单独群体的影响。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述读取包括确定所述工程化免疫细胞的多于一个单独群体中的每一个的细胞溶解活性水平。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞溶解活性水平通过铬释放测定、电阻抗测定、时差显微术或共培养测定来确定。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述读取包括确定所述工程化免疫细胞的多于一个单独群体中的每一个的增殖水平。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述增殖水平通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)测定、显微术、电阻抗测定或流式细胞术来确定。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述读取包括确定由所述工程化免疫细胞的多于一个单独群体中的每一个表达的因子水平。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述因子是蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白由所述工程化免疫细胞群体分泌。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述蛋白是细胞因子或趋化因子。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白是细胞表面蛋白。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的方法，其中所述表达通过流式细胞术、蛋白质印迹或ELISA来确定。
12.根据前述权利要求所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的免疫细胞包含所述基因组破坏。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少80％的免疫细胞包含所述基因组破坏。
14.根据权利要求12所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少90％的免疫细胞包含所述基因组破坏。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞的单独群体中的每一个的所述免疫细胞百分比通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析来确定。
16.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述外源细胞受体被整合到所述免疫细胞的多于一个单独群体的基因组中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述外源细胞受体被整合到编码内源细胞受体的内源基因序列中。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述外源细胞受体被整合到安全港位点中。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述外源细胞受体被整合到编码起所述多于一个免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。
21.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的免疫细胞表达所述外源细胞受体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少70％的免疫细胞表达所述外源细胞受体。
23.根据权利要求21所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少80％的免疫细胞表达所述外源细胞受体。
24.根据权利要求21所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少90％的免疫细胞表达所述外源细胞受体。
25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞的单独群体中的每一个的所述免疫细胞百分比通过流式细胞术或测序来确定。
26.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述基因组破坏是双链断裂。
27.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述核酸酶使用电穿孔引入。
28.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述核酸酶是内切核酸酶。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述内切核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csx1S、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Cpfl、c2c1、c2c3和Cas9HiFi。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述内切核酸酶是Cas9。
31.根据前述权利要求所述的方法，其中所述指导核酸是指导核糖核酸(gRNA)。
32.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述指导核酸包括硫代磷酸酯(PS)连接、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-O-Me)连接、2-O-甲基3硫代磷酸酯连接、S-约束乙基(cEt)修饰或其任何组合。
33.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述指导核酸使用电穿孔引入。
34.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述外源细胞受体使用电穿孔引入。
35.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述外源细胞受体使用病毒载体引入。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述AAV载体选自由以下组成的组：重组AAV(rAAV)载体、杂合AAV载体、嵌合AAV载体、自身互补AAV(scAAV)载体、修饰的AAV载体及其任何组合。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述AAV载体是嵌合AAV载体。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述嵌合AAV载体包含至少一个AAV衣壳基因序列中的修饰。
40.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述外源细胞受体是T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、NK细胞受体、树突细胞受体、单核细胞受体、巨噬细胞受体、中性粒细胞受体、嗜酸性粒细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述外源细胞受体是T细胞受体(TCR)。
42.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述单个基因是免疫调节基因。
43.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述单个基因是候选免疫检查点基因。
44.根据任一项前述权利要求所述的方法，所述方法还包括冷冻保存所述工程化免疫细胞的单独群体。
45.根据任一项前述权利要求所述的方法，所述方法还包括处理所述读取以鉴定候选免疫调节基因。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述处理包括由以下至少一项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述处理包括由以下至少两项、三项、四项、五项、六项、七项或八项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述处理包括根据所述至少一种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。
50.根据权利要求46或48所述的方法，其中所述处理包括根据所述至少一种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
51.根据权利要求47或49所述的方法，其中所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
52.根据权利要求48或49所述的方法，所述方法还包括选择所述排序的候选免疫调节基因的前10种、20种、30种、40种或50种，从而产生排序的输出。
53.根据权利要求52所述的方法，所述方法还包括从所述排序的输出中鉴定基因家族、基因功能或细胞内信号传导通路中的至少一种，从而产生分析的排序的输出。
54.根据权利要求53所述的方法，所述方法还包括关联所述分析的排序的输出的细胞溶解活性，从而产生细胞溶解相关联的排序的输出。
55.根据权利要求54所述的方法，所述方法还包括根据由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的所述细胞内定位，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。
56.根据权利要求54所述的方法，所述方法还包括根据所述开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物和所述针对所述候选免疫调节基因的现有药物，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。
57.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、NK细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个T细胞。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述多于一个T细胞包括多于一个CD8+T细胞。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述多于一个T细胞包括多于一个CD4+T细胞。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述多于一个T细胞包括多于一个CD4+T细胞和多于一个CD8+T细胞。
62.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个人类细胞。
63.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个原代细胞。
64.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个离体细胞。
65.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述免疫细胞的多于一个单独群体包括免疫细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
66.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的所述每一个包含编码改善所述工程化免疫细胞的免疫调节功能的蛋白的转基因。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述转基因被整合在所述工程化免疫细胞的基因组中。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述转基因被整合到安全港位点。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。
70.根据权利要求67所述的方法，其中所述转基因被整合到编码起所述多于一个免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。
71.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的所述每一个包含增强编码改善所述工程化免疫细胞的免疫调节功能的蛋白的基因表达的遗传修饰。
72.根据权利要求71所述的方法，其中表达所述同源抗原的所述多于一个细胞是癌细胞。
73.根据权利要求71或72所述的方法，其中所述癌细胞是原代癌细胞或来自癌细胞系。
74.根据权利要求71-73中任一项所述的方法，其中所述癌细胞包含至少一种基因中的基因组破坏。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述基因组破坏由CRISPR系统介导，所述CRISPR系统包含与所述基因的一部分结合的gRNA和介导基因组DNA裂解的核酸酶。
76.根据权利要求74或75所述的方法，其中所述基因组破坏是双链断裂。
77.根据权利要求74-76中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因编码是免疫应答的负调节因子的蛋白。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述蛋白是检查点抑制剂的配体。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述蛋白是选自由以下组成的组的检查点抑制剂的配体：程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)和蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。
80.根据权利要求72-79中任一项所述的方法，其中所述癌细胞表达至少一种外源蛋白。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述外源蛋白是细胞表面受体。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述外源蛋白是细胞内蛋白。
83.根据权利要求80-82中任一项所述的方法，其中编码所述外源蛋白的转基因被整合到所述癌细胞的基因组中。
84.根据权利要求80-83中任一项所述的方法，其中所述外源蛋白调节免疫细胞识别和/或杀伤所述癌细胞的能力。
85.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述免疫细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。
86.一种组合物，所述组合物包含免疫细胞的多于一个单独群体，其中免疫细胞的每个单独群体包含多于一个免疫细胞，所述多于一个免疫细胞i)表达外源细胞受体；和ii)包含CRISPR系统，所述CRISPR系统包含指导核酸和外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述免疫细胞的单独群体中的每一个是不同的。
87.根据权利要求86所述的组合物，其中每个单独的群体的所述多于一个免疫细胞的所述群体包含所述单个候选基因中的基因组破坏。
88.根据权利要求87所述的组合物，其中每个单独的群体的所述多于一个免疫细胞的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因中的基因组破坏。
89.根据权利要求86-88中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。
90.根据权利要求86-88中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞的多于一个单独群体包括免疫细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
91.一种组合物，所述组合物包含多于一个单独的细胞群体，每个单独的细胞群体包含i)表达外源细胞受体的多于一个免疫细胞和ii)表达所述外源细胞受体的同源抗原的细胞；其中所述多于一个免疫细胞中的每一个包含单个候选基因的改变的基因组序列，并且其中所述单个候选基因对于所述单独的细胞群体中的每一个是不同的。
92.根据权利要求91所述的组合物，其中每个单独的细胞群体的所述多于一个免疫细胞的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因的所述改变的基因组序列。
93.根据权利要求91或92所述的组合物，其中所述单独的细胞群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。
94.根据权利要求91-93中任一项所述的组合物，其中所述多于一个单独的细胞群体包括至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独的细胞群体。
95.一种筛选多于一个单个候选基因的方法，所述方法包括：
a.获得表达抗原的癌细胞的多于一个单独群体，其中每个群体包括多于一个癌细胞；
b.将CRISPR系统引入所述癌细胞的单独群体中的每一个中，所述CRISPR系统包含：
i.指导核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述癌细胞的单独群体中的每一个是不同的；和
ii.外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸；
从而产生工程化癌细胞的多于一个单独群体，所述工程化癌细胞包含所述单个候选基因中的基因组破坏，其中所述基因组破坏抑制所述单个候选基因的表达；
c.进行体外测定，包括在体外使所述多于一个工程化癌细胞与表达与所述抗原结合的细胞受体或其功能片段的多于一个免疫细胞接触；并且
d.从所述体外测定中获得读取，从而确定抑制所述单个候选基因的表达的所述基因组破坏对所述工程化癌细胞的多于一个单独群体或表达与所述抗原结合的细胞受体或其功能片段的所述免疫细胞的影响。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述读取包括确定所述工程化癌细胞的单独群体中的每一个的细胞死亡水平。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述细胞死亡水平通过流式细胞术或显微术来确定。
98.根据权利要求95所述的方法，其中所述读取包括确定所述工程化癌细胞的单独群体中的每一个的一定百分比的细胞被杀伤的时间。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述细胞死亡水平通过流式细胞术或显微术来确定。
100.根据权利要求95所述的方法，其中所述读取包括确定所述多于一个免疫细胞的细胞溶解活性水平。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述细胞溶解活性水平通过铬释放测定、电阻抗测定、时差显微术或共培养测定来确定。
102.根据权利要求95所述的方法，其中所述读取包括确定所述多于一个免疫细胞的增殖水平。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述增殖水平通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)测定、显微术、电阻抗测定或流式细胞术来确定。
104.根据权利要求95所述的方法，其中所述读取包括确定由所述多于一个免疫细胞表达的因子水平。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述因子是蛋白。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述蛋白由所述工程化免疫细胞群体分泌。
107.根据权利要求104或105所述的方法，其中所述蛋白是细胞因子或趋化因子。
108.根据权利要求104所述的方法，其中所述蛋白是细胞表面蛋白。
109.根据权利要求104-108中任一项所述的方法，其中所述表达通过流式细胞术、蛋白质印迹或ELISA来确定。
110.根据权利要求95-109中任一项所述的方法，其中所述抗原是内源抗原。
111.根据权利要求95-109中任一项所述的方法，其中所述抗原是外源抗原。
112.根据权利要求111所述的方法，其中步骤a.包括在所述癌细胞的单独群体中的每一个中表达所述外源抗原。
113.根据权利要求95-112中任一项所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述癌细胞的单独群体中的每一个的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的癌细胞包含所述基因组破坏。
114.根据权利要求113所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述癌细胞的单独群体中的每一个的至少80％的癌细胞包含所述基因组破坏。
115.根据权利要求113所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述癌细胞的单独群体中的每一个的至少90％的癌细胞包含所述基因组破坏。
116.根据权利要求113-115中任一项所述的方法，其中所述癌细胞的单独群体中的每一个的所述癌细胞百分比通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析来确定。
117.根据权利要求95-116中任一项所述的方法，其中所述细胞受体是免疫调节细胞受体。
118.根据权利要求95-117中任一项所述的方法，其中所述细胞受体是外源细胞受体。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述外源细胞受体被整合到所述多于一个免疫细胞的基因组中。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述外源细胞受体被整合到编码外源细胞受体的内源基因序列中。
121.根据权利要求119所述的方法，其中所述外源细胞受体被整合到安全港位点中。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。
123.根据权利要求120所述的方法，其中所述外源细胞受体被整合到编码起所述多于一个免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述整合减少或抑制起所述多于一个免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的所述蛋白的表达。
125.根据权利要求123或124所述的方法，其中所述基因编码选自由以下组成的组的蛋白：CISH、PD1、CTLA4、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)或蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。
126.根据权利要求95-125中任一项所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述多于一个免疫细胞的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％表达所述细胞受体。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述多于一个免疫细胞的所述免疫细胞百分比通过流式细胞术或测序来确定。
128.根据权利要求95-127中任一项所述的方法，其中所述基因组破坏是双链断裂。
129.根据权利要求95-128中任一项所述的方法，其中所述核酸酶使用电穿孔引入。
130.根据权利要求95-129中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是内切核酸酶。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述内切核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csx1S、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Cpfl、c2c1、c2c3和Cas9HiFi。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述内切核酸酶是Cas9。
133.根据权利要求95-132中任一项所述的方法，其中所述指导核酸是指导核糖核酸(gRNA)。
134.根据权利要求95-133中任一项所述的方法，其中所述指导核酸包括硫代磷酸酯(PS)连接、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-O-Me)连接、2-O-甲基3硫代磷酸酯连接、S-约束乙基(cEt)修饰或其任何组合。
135.根据权利要求95-134中任一项所述的方法，其中所述指导核酸使用电穿孔引入。
136.根据权利要求95-135中任一项所述的方法，其中所述细胞受体是使用电穿孔引入的外源细胞受体。
137.根据权利要求95-135中任一项所述的方法，其中所述细胞受体是使用病毒载体引入的外源细胞受体。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述AAV载体选自由以下组成的组：重组AAV(rAAV)载体、杂合AAV载体、嵌合AAV载体、自身互补AAV(scAAV)载体、修饰的AAV载体及其任何组合。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述AAV载体是嵌合AAV载体。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述嵌合AAV载体包含至少一个AAV衣壳基因序列中的修饰。
142.根据权利要求95-141中任一项所述的方法，其中所述细胞受体是T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、NK细胞受体、树突细胞受体、单核细胞受体、巨噬细胞受体、中性粒细胞受体、嗜酸性粒细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述细胞受体是T细胞受体(TCR)。
144.根据权利要求95-143中任一项所述的方法，其中所述单个基因是免疫调节基因。
145.根据权利要求95-144中任一项所述的方法，其中所述单个基因是候选免疫检查点受体配体基因。
146.根据权利要求95-145中任一项所述的方法，所述方法还包括冷冻保存所述工程化癌细胞的单独群体。
147.根据权利要求95-146中任一项所述的方法，所述方法还包括处理所述读取以鉴定候选免疫调节基因。
148.根据权利要求147所述的方法，其中所述处理包括由以下至少一项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述处理包括由以下至少两项、三项、四项、五项、六项、七项或八项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。
150.根据权利要求148所述的方法，其中所述处理包括根据所述至少一种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。
151.根据权利要求149所述的方法，其中所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。
152.根据权利要求148或150所述的方法，其中所述处理包括根据所述至少一种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
153.根据权利要求149或151所述的方法，其中所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。
154.根据权利要求150或151所述的方法，所述方法还包括选择所述排序的候选免疫调节基因的前10种、20种、30种、40种或50种，从而产生排序的输出。
155.根据权利要求154所述的方法，所述方法还包括从所述排序的输出中鉴定基因家族、基因功能或细胞内信号传导通路中的至少一种，从而产生分析的排序的输出。
156.根据权利要求155所述的方法，所述方法还包括关联所述分析的排序的输出的细胞溶解活性，从而产生细胞溶解相关联的排序的输出。
157.根据权利要求156所述的方法，所述方法还包括根据由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的所述细胞内定位，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。
158.根据权利要求157所述的方法，所述方法还包括根据所述开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物和所述针对所述候选免疫调节基因的现有药物，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。
159.根据权利要求95-158中任一项所述的方法，其中所述多于一个免疫细胞包括多于一个T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、NK细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述多于一个免疫细胞包括多于一个T细胞。
161.根据权利要求160所述的方法，其中所述多于一个T细胞包括多于一个CD8+T细胞。
162.根据权利要求160所述的方法，其中所述多于一个T细胞包括多于一个CD4+T细胞。
163.根据权利要求160所述的方法，其中所述多于一个T细胞包括多于一个CD4+T细胞和多于一个CD8+T细胞。
164.根据权利要求95-163中任一项所述的方法，其中所述多于一个免疫细胞包括多于一个人类细胞。
165.根据权利要求95-164中任一项所述的方法，其中所述多于一个免疫细胞包括多于一个原代细胞。
166.根据权利要求95-165中任一项所述的方法，其中所述多于一个免疫细胞包括多于一个离体细胞。
167.根据权利要求95-166中任一项所述的方法，其中所述癌细胞的多于一个单独群体包括癌细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
168.根据权利要求95-167中任一项所述的方法，其中所述多于一个免疫细胞包含编码改善所述免疫细胞的免疫调节功能的蛋白的转基因。
169.根据权利要求168所述的方法，其中所述转基因被整合在所述免疫细胞的基因组中。
170.根据权利要求169所述的方法，其中所述转基因被整合到安全港位点。
171.根据权利要求170所述的方法，其中所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。
172.根据权利要求95-171中任一项所述的方法，其中所述多于一个免疫细胞包含增强编码改善所述免疫细胞的免疫调节功能的蛋白的基因表达的遗传修饰。
173.根据权利要求172所述的方法，其中所述转基因被整合到编码起所述免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。
174.根据权利要求95-173中任一项所述的方法，其中所述癌细胞的单独群体中的每一个包含至少一种基因中的基因组破坏。
175.根据权利要求174所述的方法，其中所述基因组破坏由CRISPR系统介导，所述CRISPR系统包含与所述基因的一部分结合的gRNA和介导基因组DNA裂解的核酸酶。
176.根据权利要求174或175所述的方法，其中所述基因组破坏是双链断裂。
177.根据权利要求174-176中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因编码是免疫应答的负调节因子的蛋白。
178.根据权利要求177所述的方法，其中所述蛋白是检查点抑制剂的配体。
179.根据权利要求178所述的方法，其中所述蛋白是选自由以下组成的组的检查点抑制剂的配体：程序性细胞死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)和蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。
180.根据权利要求95-179中任一项所述的方法，其中所述癌细胞表达至少一种外源蛋白。
181.根据权利要求180所述的方法，其中所述外源蛋白是细胞表面受体。
182.根据权利要求181所述的方法，其中所述外源蛋白是细胞内蛋白。
183.根据权利要求180-182中任一项所述的方法，其中编码所述外源蛋白的转基因被整合到所述癌细胞的基因组中。
184.根据权利要求180-183中任一项所述的方法，其中所述外源蛋白调节免疫细胞识别和/或杀伤所述癌细胞的能力。
185.根据权利要求95-184中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。
186.一种组合物，所述组合物包含癌细胞的多于一个单独群体，其中癌细胞的每个单独群体包含多于一个癌细胞，所述多于一个癌细胞i)表达抗原；和ii)包含CRISPR系统，所述CRISPR系统包含指导核酸和外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述癌细胞的单独群体中的每一个是不同的。
187.根据权利要求186所述的组合物，其中每个单独的群体的所述多于一个癌细胞的所述群体包含所述单个候选基因中的基因组破坏。
188.根据权利要求187所述的组合物，其中每个单独的群体的所述多于一个癌细胞的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因中的基因组破坏。
189.根据权利要求186-188中任一项所述的组合物，其中所述癌细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。
190.根据权利要求186-189中任一项所述的组合物，其中所述癌细胞的多于一个单独群体包括癌细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。
191.一种组合物，所述组合物包含多于一个单独的细胞群体，每个单独的细胞群体包含：i)表达抗原的多于一个癌细胞和ii)表达与所述抗原结合的细胞受体或其功能片段的细胞；其中所述多于一个癌细胞中的每一个包含单个候选基因的改变的基因组序列，并且其中所述单个候选基因对于所述单独的细胞群体中的每一个是不同的。
192.根据权利要求191所述的组合物，其中每个单独的细胞群体的所述多于一个癌细胞的所述群体的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因的所述改变的基因组序列。
193.根据权利要求191或192所述的组合物，其中所述单独的细胞群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。
194.根据权利要求191-193中任一项所述的组合物，其中所述多于一个单独的细胞群体包括至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独的细胞群体。
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