JP2020505044A - Ｂ細胞操作 - Google Patents

Abstract

Ｂ細胞ゲノム操作のために、および導入遺伝子の発現のために、および／またはＢ細胞機能のモジュレーションのために使用される構築物が本明細書に記載される。（ａ）１つまたは複数の導入遺伝子、ならびに／または（ｂ）（ｉ）Ｂ細胞受容体遺伝子および／または（ｉｉ）胚中心における細胞相互作用を改変する挿入および／もしくは欠失、ならびに／または（ｃ）病原体の感染またはがんの調節に関連する任意のＢ細胞機能の抑制を阻害する改変を含む１つまたは複数の改変を含む、遺伝子改変されたＢ細胞。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年１月２６日に出願された米国仮出願番号第６２／４５０，９１７号の利益を主張しており、その開示は、その全体が参考として本明細書によって援用される。

技術分野
本開示は、遺伝子治療、特に有益な（治療）タンパク質の発現のためのゲノム編集およびＢ細胞への導入遺伝子コード構築物の標的化送達の分野にある。

背景
遺伝子治療は、１つもしくは複数の不活性化された遺伝子を有するように、および／またはその細胞において以前には産生されなかった産物を細胞に発現させるように細胞を遺伝子操作するため使用され得る（例えば、導入遺伝子挿入を介しておよび／または内因性配列の修正を介して）。導入遺伝子挿入の使用の例には、治療抗体を含む１つもしくは複数の新規治療タンパク質をコードする１つもしくは複数の遺伝子の挿入、細胞もしくは個体において欠如しているタンパク質をコードするコード配列の挿入、変異型遺伝子配列を含有する細胞における野生型遺伝子の挿入、および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡなどの構造核酸をコードする配列の挿入を含むヌクレアーゼ媒介性改変が含まれる。これらの技術はまた、内因性遺伝子の発現をノックアウトするため、および／または細胞の毒性プロファイルを変更するために使用することができる。例えば、米国特許第９，３９４，５４５号；同第９，１５０，８４７号；同第９，２０６，４０４号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９３６，９３６号；同第８，９４５，８６８号；同第８，８７１，９０５号；同第８，５８６，５２６号；同第８，５６３，３１４号；同第８，３２９，９８６号；同第８，３９９，２１８号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号および同第２０１５００５６７０５号を参照のこと。

Ｂ細胞は、多様な抗原に対する抗体を分泌することによって液性免疫において機能する。それらは、専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、ヘルパーＴ細胞によって活性化され、大量の抗原特異的抗体を産生する形質細胞へと分化する。Ｂ細胞の発生は、胎児肝臓および骨髄の両方で起こり、Ｂ細胞発生の重要なステップは、独自の重鎖および軽鎖を含む複合構造であるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の生成である。ＢＣＲ生成プロセスは、Ｂ細胞成熟のプロＢ細胞期の間のＢＣＲ遺伝子の重鎖および軽鎖の両方における様々な免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子セグメントの再編成を含む。プロＢ細胞は、再編成された重鎖および軽鎖の対合が成功した後にプレＢ細胞となり、産生されるプレＢＣＲは、プレＢ細胞の細胞表面上に発現される。プレＢＣＲを通してのシグナル伝達は、さらなるＢ細胞発生を駆動し、プレＢ細胞を肥大させる。最終的に大型プレＢ細胞は、増殖を停止し、さらなる軽鎖再編成が起こり、現在、未成熟Ｂ細胞であると考えられているその細胞表面上に独自のＩｇＭ ＢＣＲを発現させる。次いで、これらの細胞は骨髄から出て、移行Ｂ細胞として末梢中を循環する。

未成熟Ｂ細胞の成熟は、主に脾臓で起こり、ここで自己抗原に対して高い親和性を有する抗体を産生するＢ細胞が破壊されるように選択も起こる（Naradikianら（２０１４年）Drugs Targeting B-Cells in Autoimmune Diseases, Milestones in Drug Therapy（X. Boschら（編））doi 10.1007/978-3-3-0348-0706-7_2、Springer Baselを参照のこと）。循環Ｂ細胞は、二次リンパ節および脾臓に入り、濾胞樹状細胞から抗原を獲得することができる。リンパ節／脾臓に入り、樹状細胞と相互作用すると、Ｂ細胞は抗原を内在化し、抗原のペプチド断片がＭＨＣクラスＩＩ分子を介して、同族ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示されるようにプロセシングされる。これらのＴ細胞は、同じ抗原を提示するＡＰＣによって以前に活性化されている。Ｂ細胞とＴ細胞との間の相互作用によって、Ｔ細胞の完全な活性化を含むいくつかの事象がもたらされ、Ｔ細胞増殖が生じる。次いで、Ｔ細胞は、Ｂ細胞に直接作用するサイトカインを産生し、Ｂ細胞増殖およびＢ細胞表面上に発現される抗体のクラススイッチを誘導する。増殖Ｂ細胞は、「胚中心」として公知のリンパ節および脾臓内の遷移領域でクラスター化する。これらの活性化Ｂ細胞は、いずれかの特殊な抗体分泌細胞（形質芽球または形質細胞）へと分化し、これらは予めプログラムされた分裂回数（典型的に５〜６回）を受けた後にその最終分化段階を終了し、非増殖性の形質細胞となるようである。あるいは、活性化Ｂ細胞は胚中心を離れて、メモリーＢ細胞へと分化する（Zhangら、（２０１６年）Immunol Rev ２７０巻（１号）：８〜１９頁）。

活性化後、ゲノムミューテーター酵素活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）が発現され、これは、抗体遺伝子において体細胞超変異および抗体エフェクター機能を変更するクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）をもたらす。体細胞超変異は、免疫グロブリン可変領域（ＩｇＶ）遺伝子に起こり、抗原に対して様々な親和性を有する抗体変異体のレパートリーを生成する（KleinおよびHeise（２０１５年）Curr Opin Hematol ２２巻（４号）：３７９〜３８７頁）。このプロセスは、胚中心内のいわゆる「ダークゾーン」で起こる。分化したＢ細胞は、「ライトゾーン」へと遊走し、そこでより高親和性の抗体を産生するＢ細胞は、それらがそのＢ細胞受容体を通して生存シグナルを受けるように、利用可能な抗原および／またはＴ細胞ヘルプに関して競合する。より低親和性の抗体を産生するＢ細胞は、そのより高親和性を生じるＢ細胞兄弟（sibling）と競合することができないことから、これらの生存シグナルを受けず、それらはアポトーシスを受ける。次いで、より高親和性の抗体を産生するＢ細胞は、さらなるラウンドの増殖および体細胞超変異のためにダークゾーンに再度入ることができるか、胚中心を離れて形質芽球へと分化することができるか、または寿命の長いメモリーＢ細胞へと分化することができる（RecaldinおよびFear（２０１５年）Clin and Exp Immunol １８３巻：６５〜７５頁）。

このように、非常に複雑なプロセスにおいて、Ｂ細胞は、いくつかの潜在的脅威から身体を保護するために抗原に対して大量の抗体を発現するように誘導される。興味深いことに、抗体応答を失わせる可能性があるいくつかの病原体（例えば、寄生虫、細菌、ウイルス）が存在する。これらの病原体は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＨＩＶ、ＨＣＶ、およびＨＢＶが含まれるがこれらに限定されない多数のヒト疾患の原因であるいくつかの病原体（agent）を含む（BorhisおよびRichard（２０１５年）BMC Immunology １６巻：１５頁 doi 10.1186/s12865-015-0079-y）。抗体応答の病原体媒介性の抑制の背後にある機構は全てが既知ではないが、ある特定の病原体が、異常なＢ細胞サブタイプの産生を誘導し、そのＢ細胞サブタイプが細胞の微小環境を変更し、Ｂ細胞およびＴ細胞の両方の抑制をもたらすようである。例えば、ＨＢＶは、樹状細胞が、低減されたＩＦＮ−α（Ｂ細胞が増殖してＩｇＭを分泌するように誘導することが知られている）を産生するように、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）を通しての刺激に干渉することが示されている。ＨＢＶは、Ｂリンパ球におけるＴＬＲ９発現を選択的に阻害することができるようである（Vincentら（２０１１年）PLoS ONE ６巻（１０号）：ｅ２６３１５頁、doi:10.1371/journal.pone.0026315）。

過去十年の間に、研究により、マウスおよびヒトの両方において別個のサブセットの免疫調節Ｂ細胞に関する根拠の十分な証拠が提供されている。これらのサプレッサーＢ細胞は、免疫寛容を維持し、病理学的な自己免疫および炎症性免疫応答を抑制する能力、ならびに抗炎症性メディエーター、例えばインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の放出および阻害性分子、例えばＰＤ−Ｌ１の発現を通して、がんの免疫監視の間の応答を抑制する能力を有する。これらの研究により、免疫寛容においてサプレッサーの役割を有するＢ細胞のプールが存在するという結論がもたらされ、このプールは、現在では調節Ｂ細胞または「Ｂｒｅｇ」と呼ばれている。ヒトＢｒｅｇに関連する他の表現型は、自己免疫炎症の抑制およびアレルゲン寛容における役割を含む。より最近の研究により、Ｂ細胞ががんの進行において矛盾する役割を果たし得ることが実証されている。例えば、リツキシマブで処置したＣＬＬ患者から単離したＩＬ−１０産生ＣＤ１ｄ^ｈｉｇｈＣＤ５＋Ｂ細胞は、抗ＣＤ２０媒介性Ｂ細胞の枯渇によって、Ｂｒｅｇプールが主に富化されることを明らかにした。富化されたＢｒｅｇは、抗ＣＤ２０結合腫瘍細胞のクリアランスにとって必要な抗腫瘍免疫を抑制し、患者に、抗ＣＤ２０治療に対するリンパ腫抵抗性を発生させる、かつ／または最終的にがんの進行の増強の結果としての再発が起こると仮定された（Bodogaiら、（２０１３年）Cancer Res ７３巻：２１２７〜２１３８頁）。

ヒトＢ細胞が、腫瘍の成長を負にモジュレートするという発見は、卵巣がん、非小細胞肺癌、および子宮頸がんにおけるＣＤ２０＋Ｂ細胞腫瘍浸潤リンパ球の存在が、生存の改善およびより低い再発率に相関する場合に認められた。これらの研究は、腫瘍浸潤性Ｂ細胞が、好ましい転帰と相関することを示した。Ｂｒｅｇは、抗炎症性メディエーター、例えばＩＬ−１０の分泌を通してＴ細胞を含む多様な細胞サブタイプを抑制することができ、Ｔ細胞の調節Ｔ細胞への変換を促進して、このように抗腫瘍免疫応答を減弱させ得る。Ｂ細胞の抗腫瘍免疫の基礎となる潜在的な機構は、Ｔｈ１もしくはＴｈ２応答に向けてＴ細胞を分極させる、または抗原提示細胞としてのその役割を通してＴ細胞応答を促進することができるエフェクターサイトカイン、例えばＩＦＮ−γのＢ細胞による分泌を含み得る（Sarvariaら（２０１７年）Cell Mol Immunol １４巻（８号）：６６２〜６７４頁）。

しかし、ヒトＢ細胞はまた、腫瘍の進行を助長することも示されている。ヒト腫瘍組織における活性化ＳＴＡＴ３と共にＢ細胞の存在は、腫瘍の血管新生の重症度に相関した。同様に、転移性卵巣癌を有する患者におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞の浸潤または上皮性卵巣がんを有する患者におけるＣＤ２０＋およびＣＤ１３８＋Ｂ細胞の浸潤の増加は、不良な疾患の予後および転帰に関連する。さらに、リツキシマブによる部分的Ｂ細胞低減後の腫瘍負荷の低減は、進行性結腸直腸がんを有する患者の５０％に見出された。このように、Ｂｒｅｇががんにおいて果たす正確な役割は依然として不明であるが、Ｂｒｅｇのサブタイプの活性と関連する可能性が最も高い（Sarvaria、同書）。

かなりの数の障害が、分泌された遺伝子産物が不十分であることによって引き起こされるか、または治療タンパク質の分泌によって処置可能である。例えば、凝固障害は、凝固カスケードにおける因子が何らかの様式で異常である、すなわち発現が欠如しているかまたは変異体タンパク質が産生されているかなり一般的な遺伝障害である。ほとんどの凝固障害によって、血友病、例えば血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）、または血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠損症）が生じる。これらの障害の処置は、多くの場合、重症度に関連する。軽度の血友病の場合、処置は、過小発現されている因子の発現を増加させるように設計した治療薬を伴い得るが、より重度の血友病では、出血エピソードを予防するために、治療は、欠けている凝固因子の定期的な注入（しばしば、酵素補充療法（ＥＲＴ）により週に２〜３回）を伴う。重度の血友病を有する患者は、多くの種類のスポーツに参加することを止められる場合が多く、日々の損傷を避けるために特に注意しなければならない。

アルファ１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症は、アルファ１−アンチトリプシンの産生の欠如によって引き起こされる常染色体劣性疾患であり、これは血液および肺において不適切なＡ１ＡＴレベルをもたらす。これは、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および肝臓障害の発生に関連し得る。現在、この欠損症に関連する疾患の処置は、外因性Ａ１ＡＴの注入および肺または肝臓移植を伴い得る。

リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、脂質老廃物、糖タンパク質、およびムコ多糖の分解に通常関与する機能的な個々のリソソームタンパク質の欠如によって特徴付けられる稀な代謝性一遺伝子性の疾患群である。これらの疾患は、特異的酵素の機能不全によりそれらをリサイクルのためにプロセシングできないことによる、細胞におけるこれらの化合物の蓄積によって特徴付けられる。一般的な例には、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ欠損症−遺伝子名：ＧＢＡ）、ファブリー病（αガラクトシダーゼ欠損症−ＧＬＡ）、ハンター病（イズロン酸−２−スルファターゼ欠損症−ＩＤＳ）、ハーラー病（アルファ−Ｌイズロニダーゼ欠損症−ＩＤＵＡ）、およびニーマン−ピック病（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１欠損症−ＳＭＰＤ１）が挙げられる。

Ｉ型糖尿病は、膵臓ベータ細胞の免疫媒介性破壊によって、これらの細胞の主な分泌産物であるインスリンの極度の欠損が起こる障害である。ベースラインインスリンレベルの回復は、この障害のより重篤な合併症の多くからの実質的な軽減を提供し、これらの合併症には、大血管を伴う「大血管」合併症：虚血性心疾患（狭心症および心筋梗塞）、卒中、および末梢血管疾患、ならびに小血管に対する損傷による「微小血管」合併症が含まれ得る。微小血管合併症には、眼の網膜における血管形成に影響を与え、視力症状、視力低下、および失明の可能性をもたらし得る糖尿病性網膜症、ならびに腎臓組織における瘢痕の変化、尿中の少量または次第に増量するタンパク質の喪失、および最終的に透析を必要とする慢性腎疾患を伴い得る糖尿病性腎症が含まれ得る。

しかし、対象における障害を処置するための治療タンパク質の提供は、対象におけるＢ細胞による抗体の産生を含む、治療タンパク質に対する対象自身の免疫応答によって制限されることがあり、このことはそのような処置の有効性を制限し得る。例えば、欠損または欠如している凝固因子（複数可）（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子など）のＥＲＴを受けている血友病患者は、これらの必要なタンパク質に対する抗体（例えば、抗Ｆ９抗体）を発生させ得る。血友病Ａ患者の１５〜５０％が治療第８因子タンパク質に対する阻害性抗体を発生させると推定されている（Krudysz-Ambloら、（２００９年）Blood １１３巻（１１号）：２５８７〜２５９４頁）。一部の例では、反応は、必要なＥＲＴが患者において有害な副作用を引き起こす状況をもたらす重度（アナフィラキシーショック）であり得る（例えば、JM Lusher（２０００年）Semin Thromb Hemost ２６巻（２号）：１７９〜１８８頁を参照のこと）。
さらに、抗体は、その結合の可塑性が多様な範囲の治療の開発に利用されている分泌タンパク質産物である。治療抗体は、疾患を直接引き起こす標的タンパク質（例えば、黄斑変性におけるＶＥＧＦ）を中和するために、ならびにその存続および複製が宿主を危険にさらす細胞（例えば、がん細胞、ならびに自己抗原に対する抗体を産生するＢ細胞を含む、自己免疫疾患におけるある特定の免疫細胞）を高度に選択的に殺滅するために使用することができる。そのような適用では、治療抗体は、標的タンパク質または抗体の標的抗原を有する細胞の選択的殺滅、中和、またはクリアランスを達成するために、それ自体の抗体に対する身体の正常な応答を利用する。このように、抗体治療は、腫瘍学、リウマチ学、移植、および眼疾患を含む多くのヒトの状態に広く適用されている。
このように、任意の関連する毒性を処置および／または回避することを含め、血友病、糖尿病、リソソーム蓄積症、および／またはＡ１ＡＴ欠損症などの遺伝疾患を処置するための、対象において治療関連レベルで所望の導入遺伝子を発現させるために使用することができる追加の方法および組成物が依然として必要とされており、それらは、生来のＢ細胞応答を制限することによるなど、所望の組織型への導入遺伝子または治療タンパク質の発現を制限し得る。さらに、がんなどの他の疾患の処置のために治療関連レベルで所望の導入遺伝子（例えば、抗体）を発現させるための追加の方法および組成物が依然として必要とされている。

米国特許第９，３９４，５４５号明細書 米国特許第９，１５０，８４７号明細書 米国特許第９，２０６，４０４号明細書 米国特許第９，０４５，７６３号明細書 米国特許第９，００５，９７３号明細書 米国特許第８，９５６，８２８号明細書 米国特許第８，９３６，９３６号明細書 米国特許第８，９４５，８６８号明細書 米国特許第８，８７１，９０５号明細書 米国特許第８，５８６，５２６号明細書 米国特許第８，５６３，３１４号明細書 米国特許第８，３２９，９８６号明細書 米国特許第８，３９９，２１８号明細書 米国特許第６，５３４，２６１号明細書 米国特許第６，５９９，６９２号明細書 米国特許第６，５０３，７１７号明細書 米国特許第６，６８９，５５８号明細書 米国特許第７，０６７，３１７号明細書 米国特許第７，２６２，０５４号明細書 米国特許第７，８８８，１２１号明細書 米国特許第７，９７２，８５４号明細書 米国特許第７，９１４，７９６号明細書 米国特許第７，９５１，９２５号明細書 米国特許第８，１１０，３７９号明細書 米国特許第８，４０９，８６１号明細書 米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書 米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書 米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書 米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書 米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書 米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書 米国特許出願公開第２０１０／０２１８２６４号明細書 米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書 米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書 米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号明細書

Naradikianら（２０１４年）Drugs Targeting B-Cells in Autoimmune Diseases, Milestones in Drug Therapy（X. Boschら（編））doi 10.1007/978-3-3-0348-0706-7_2、Springer Basel Zhangら、（２０１６年）Immunol Rev ２７０巻（１号）：８〜１９頁 KleinおよびHeise（２０１５年）Curr Opin Hematol ２２巻（４号）：３７９〜３８７頁 RecaldinおよびFear（２０１５年）Clin and Exp Immunol １８３巻：６５〜７５頁 BorhisおよびRichard（２０１５年）BMC Immunology １６巻：１５頁 doi 10.1186/s12865-015-0079-y Vincentら（２０１１年）PLoS ONE ６巻（１０号）：ｅ２６３１５頁、doi:10.1371/journal.pone.0026315 Bodogaiら、（２０１３年）Cancer Res ７３巻：２１２７〜２１３８頁 Sarvariaら（２０１７年）Cell Mol Immunol １４巻（８号）：６６２〜６７４頁 Krudysz-Ambloら、（２００９年）Blood １１３巻（１１号）：２５８７〜２５９４頁 JM Lusher（２０００年）Semin Thromb Hemost ２６巻（２号）：１７９〜１８８頁

概要
１つまたは複数の遺伝子座でのＢ細胞の部位特異的改変は、Ｂ細胞機能（これらの細胞による抗体産生を増強すること、および／または不要な生来の免疫応答を制限するタンパク質を産生するようにＢ細胞を標的化することを含む）、形質芽球への分化能、および生着能を増強すると予想される。標的遺伝子の改変を介してＢ細胞を制御すること（例えば、破壊および／またはゲノムもしくはエピソームでの遺伝子付加）によって、効率的でより毒性の低いタンパク質補充療法が可能となり、さらに胚中心内の情報伝達をプログラムすることが可能となる。

本発明は、Ｂ細胞において標的遺伝子の発現をモジュレートする、および／またはＢ細胞（誘導性の形質芽球または形質細胞を含む）において導入遺伝子を発現させるための組成物および方法を記載する。このように、以下の改変：細胞に１つまたは複数の導入遺伝子を含むこと；ならびに／または（ｉ）Ｂ細胞受容体遺伝子および／または（ｉｉ）胚中心における細胞相互作用を改変する挿入および／もしくは欠失、ならびに／または（ｃ）病原体の感染またはがんの調節に関連する任意のＢ細胞機能の抑制を阻害する改変のうちの１つまたは複数を含む、遺伝子改変されたＢ細胞（遺伝子改変された造血幹細胞または他のＢ細胞前駆体の子孫であるＢ細胞を含む）が、本明細書で提供される。導入遺伝子（複数可）は、染色体外で（エピソームで）発現されてもよいし、および／またはＢ細胞のゲノム中に（例えば、例えばセーフハーバー遺伝子座へのヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みを介して）組み込まれてもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数の導入遺伝子はエピソームで維持され、１つまたは複数の導入遺伝子は細胞（Ｂ細胞またはＢ細胞に分化するＨＳＣ）のゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、導入遺伝子は、凝固カスケードに関与するタンパク質をコードする。他の実施形態では、導入遺伝子は、リソソーム蓄積障害において欠損している酵素をコードするか、または治療抗体をコードする。他の実施形態では、導入遺伝子は、望ましくない抗体、例えば内因性タンパク質（例えば、自己免疫疾患における自己抗体）および／または外因性タンパク質（例えば、凝固因子などの、ＥＲＴによって供給されるタンパク質）に対する抗体が含まれるがこれらに限定されない、治療タンパク質に対する抗体を産生するＢ細胞を標的とする分子をコードする。例えば、導入遺伝子は、望ましいタンパク質に対する望ましくない抗体を産生しているＢ細胞集団を標的とするために望ましいタンパク質（自己免疫疾患における内因性タンパク質および／またはＥＲＴ供給タンパク質）に対して感受性であるＢ細胞上のＢ細胞受容体を認識する抗体をコードすることができる。そのような抗体の非限定的な例には、血友病における凝固因子などのＥＲＴ供給タンパク質に対する抗体を産生するＢ細胞（例えば、抗Ｆ９抗体または抗Ｆ８抗体を産生するＢ細胞）に関連するＢ細胞受容体を認識する；ならびに／またはＭＳにおけるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）における抗核抗体（ＡＮＡ）、急性リウマチ熱における心臓、関節、および他の組織における糖タンパク質、関節リウマチ（ＲＡ）におけるＩｇＧのＦｃ部分に対する抗体が含まれるがこれらに限定されない自己（ａｕｔｏ／ｓｅｌｆ）抗原に対する抗体を産生するＢ細胞、およびライター症候群、シェーグレン症候群、全身性硬化症（強皮症）、炎症性ミオパチー、結節性多発動脈炎（Polyarteritis nodos）、グレーヴス病、Ｉ型糖尿病などにおける自己抗体を産生するＢ細胞上のＢ細胞受容体を認識する抗体が含まれる。本明細書に記載される組成物および方法によって、ｉｎ ｖｉｖｏで臨床的に意義のある（治療）効果を示すために十分なレベルで含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で高レベルのタンパク質産生が得られる。

一態様では、１つまたは複数の導入遺伝子の発現を駆動する少なくとも１つのＢ細胞特異的プロモーターを含むポリヌクレオチド発現構築物が本明細書に記載される。Ｂ細胞プロモーターは、免疫グロブリンカッパ鎖プロモーター（Ｉｇк、Laurieら（２００７年）Gene Ther １４巻（２３号）：１６２３〜３１頁）、Ｂ２９（Hermansonら（１９８９年）Proc Nat'l Acad Sci ８６巻：７３４１〜７３４５頁）、ＢＣＬ６（Ramachandrareddyら（２０１０年）Proc Nat'l Acad Sci １０７巻（２６号）：１１９３０〜１１９３５頁）、ＣＩＩＴＡプロモーターＩＩＩ（Deffernnesら（２００１年）J. Immunol １６７巻（１号）：９８〜１０６頁）、ｍｂ−１（例えば、MaloneおよびWall（２００１年）J. Immunol １６８巻（７号）：３３６９〜３３７５頁を参照のこと）、ならびにイントロンエンハンサー（ｉＥκ）、ＭＡＲ、および３’エンハンサー（３’Ｅκ）が先行する軽鎖プロモーター（ＶＫｐ）を含むＥＥＫプロモーター（米国特許第８１３３７２７号を参照のこと）が含まれるがこれらに限定されない、Ｂ細胞において活性である任意のプロモーターから選択することができる。一部の実施形態では、使用されるＢ細胞特異的プロモーターは、通常、細胞が胚中心に存在する場合に導入遺伝子が発現されるように、胚中心において発現される（例えば、ＢＣＬ６、Bassoら（２０１０年）Blood １１５巻（５号）：９７５〜９８４頁）。一部の実施形態では、導入遺伝子は、それが細胞のゲノムにおいてＢ細胞特異的プロモーターによって制御されるように、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みを介して挿入される。他の実施形態では、Ｂ細胞プロモーター−導入遺伝子構築物は、染色体外で維持されるＤＮＡベクターの一部である。一部の実施形態では、Ｂ細胞プロモーター−導入遺伝子構築物は、アルブミン遺伝子もしくはＴ細胞受容体のサブユニット（例えば、ＴＣＲＡまたはＴＣＲＢ）をコードする遺伝子へなど、Ｂ細胞ゲノムの転写サイレント領域および／またはセーフハーバー領域に挿入される。

一部の態様では、導入遺伝子は、対象において欠如しているまたは不十分である酵素をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、または第ＸＩＩ因子などの凝固因子をコードする。他の実施形態では、導入遺伝子は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、αガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、アルファ−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（ＳＭＰＤ１）、またはアルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）が含まれるがこれらに限定されない、リソソーム蓄積症において欠損している酵素をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子はＡ１ＡＴをコードする。本明細書に記載されるように発現され得るタンパク質の非限定的な例にはまた、フィブリノーゲン、プロトロンビン、組織因子、第Ｖ因子、フォンヴィルブランド因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（フィッツジェラルド因子）、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリンコファクターＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼインヒビター、プラスミノーゲン、アルファ２−アンチプラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−２、ＭＭＡＡ、ＭＭＡＢ、ＭＭＡＣＨＣ、ＭＭＡＤＨＣ（Ｃ２ｏｒｆ２５）、ＭＴＲＲ、ＬＭＢＲＤ１、ＭＴＲ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）（ＰＣＣＡおよび／またはＰＣＣＢサブユニット）、グルコース−６−リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）タンパク質またはグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）、ＡｐｏＢ、ＬＤＬＲＡＰ−１、ＰＣＳＫ９、ミトコンドリアタンパク質、例えば、ＮＡＧＳ（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ）、ＣＰＳ１（カルバモイルリン酸シンテターゼＩ）、およびＯＴＣ（オルニチントランスカルバミラーゼ）、ＡＳＳ（アルギニノコハク酸シンテターゼ）、ＡＳＬ（アルギニノコハク酸（argininosuccinase acid）リアーゼ）および／もしくはＡＲＧ１（アルギナーゼ）、ならびに／または溶質輸送体ファミリー２５（ＳＬＣ２５Ａ１３、アスパラギン酸／グルタミン酸輸送体）タンパク質、ＵＧＴ１Ａ１もしくはＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（glucuronsyltransferase）ポリペプチドＡ１、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（hydrolyase）（ＦＡＨ）、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）タンパク質、グリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ）タンパク質、トランスサイレチン遺伝子（ＴＴＲ）タンパク質、ＡＴＰ７Ｂタンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質、リポタンパク質リアーゼ（ＬＰＬ）タンパク質、操作されたヌクレアーゼ、操作された転写因子、ならびに／または操作された単鎖可変断片抗体（ダイアボディ、ラクダなど）が含まれる。一つの好ましい実施形態では、導入遺伝子はＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドは、Ｂドメインの欠失を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の導入遺伝子からの１つまたは複数の治療タンパク質の治療関連レベルを発現させる方法および組成物が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、補充タンパク質をコードする導入遺伝子構築物の発現によって、産生されるタンパク質の正常レベルの１％が得られるが、他方では、タンパク質の正常レベルの２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、８０％、１００％、１５０％、２００％、またはそれより多くが産生される。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ウイルス、細菌、または寄生虫による抗体応答の阻害を回避するポリペプチドをコードする。

ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質芽球および形質細胞へと分化したＣＤ１９陽性Ｂ細胞は、１０，０００ｎｇ／ｍＬより多い抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ）を産生する。このように、一部の態様では、導入遺伝子は、単鎖抗体などの治療タンパク質をコードする。一部の実施形態では、単鎖抗体はｓｃＦｖであり、他方では単鎖抗体は、ラクダ抗体またはナノボディである（例えば、Mejiasら（２０１６年）Sci Reports ６巻：srep24913, doi:10:1038を参照のこと）。他の態様では、１つより多くの導入遺伝子がＢ細胞において発現される。一実施形態では、１つより多くの導入遺伝子は、完全な抗体もしくはその断片を発現するために必要な配列、または別の抗原結合性タンパク質（例えば、モノボディ、アプタマー、ＤＡＲＰｉｎ、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、クニッツ型インヒビターなど（GebauerおよびSkerra（２００９年）Curr Opin Chem Biol １３巻（３号）：２４５〜５５頁）を含む。

一部の実施形態では、目的の治療タンパク質をコードする導入遺伝子を含むＢ細胞の集団を、ｅｘ ｖｉｖｏで操作して、次いでそれを必要とする対象に再導入する。Ｂ細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、リンパ前駆細胞、または成熟Ｂ細胞が含まれるがこれらに限定されない、任意の発達段階で本明細書に記載されるように操作してもよい。幹細胞またはＢ細胞前駆体を操作して、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させ、前駆体（系統特異的Ｂ細胞）または成熟細胞として対象に投与してもよい。あるいは、操作された幹細胞またはＢ細胞前駆体細胞を、本明細書に記載されるようにｉｎ ｖｉｔｒｏで操作して、投与後にｉｎ ｖｉｖｏで成熟Ｂ細胞へと完全に分化させてもよい。このように、ｅｘ ｖｉｖｏ投与の場合、本明細書に記載されるＢ細胞集団は、それらが、様々な発達段階にある幹細胞、前駆細胞、および／または成熟Ｂ細胞を含むという点において不均一であり得る。あるいは、Ｂ細胞の集団は、均一で、幹細胞、前駆細胞、または成熟細胞のみを含んでもよい。なお他の実施形態では、操作されたＢ細胞は、Ｂ細胞を形質導入することができる送達ベクターを使用してｉｎ ｖｉｖｏで作製される。さらなる実施形態では、送達ベクターは、ウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。好ましい実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６ベクターである。他の実施形態では、送達ベクターは、非ウイルス、例えばｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、またはプラスミドベクターである。

さらなる態様では、本明細書に記載される操作されたＢ細胞（Ｂ細胞の集団を含む）は、導入遺伝子によってコードされるタンパク質の産生のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させる。好ましい実施形態では、タンパク質は、抗体もしくは抗原結合性タンパク質（例えば、凝固因子などのＥＲＴ供給タンパク質に対して抗体を産生する内因性Ｂ細胞、および／または自己免疫障害において自己タンパク質に対する抗体を産生するＢ細胞を含む、対象において望ましくない抗体を産生する内因性Ｂ細胞に結合する抗体）、または不要な抗体を中和する抗体である。Ｂ細胞から産生されたタンパク質を単離して、望ましくない抗体（例えば、ＥＲＴ後に発生する抗ＥＲＴ抗体）の生来の産生を低減および／または排除するために、酵素補充療法などのタンパク質治療のために、および／または酵素補充療法と併せて使用してもよい。

一部の態様では、本発明は、ＣＮＳの疾患またはＣＮＳに影響を与える疾患の処置および／もしくは予防にとって有用な、血液脳関門を通過する導入遺伝子を発現するＢ細胞または形質細胞を送達する方法および組成物を提供する。一部の実施形態では、導入遺伝子は、リソソーム蓄積障害を有する対象において欠如している酵素をコードする。さらなる実施形態では、導入遺伝子は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、αガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、アルファ−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（ＳＭＰＤ１）、またはアルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードし、それぞれ、ゴーシェ病（Baeら、（２０１５年）Exp Mol Med ４７巻、ｅ１５３頁； doi:10:1038/emm.2014.128）、ファブリー病、ＶＩＩ型ＭＰＳ（Slyら（１９７３年）J Pediatr、１９７３年２月；８２巻（２号）：２４９〜５７頁）、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ Ｉ、ニーマン−ピック病、またはポンペ病に関連するＣＮＳ疾患を処置または予防するために使用される。

さらなる態様では、本発明の方法および組成物は、導入遺伝子、および１つまたは複数のさらなる改変も含む、改変されたＢ細胞またはＢ細胞派生物（形質芽球、形質細胞）を含む。さらなる改変は、さらなるエピソーム配列またはさらなる組み込み配列（ゲノムにおける同じおよび／または異なる位置に組み込まれ得る）であってもよい。一部の実施形態では、導入遺伝子を含むＢ細胞は、血液脳関門を通過する効率を助けるさらなるタンパク質またはペプチド配列（またはそれらをコードするポリヌクレオチド）をさらに含む。一部の実施形態では、ペプチドは、脳への通過を促進するために当該分野で公知のペプチドを含む。さらなる実施形態では、ペプチドは、トランスフェリン受容体を標的とするＢ細胞表面上に発現される抗体であるが、他の実施形態では、ペプチドはメタロトランスフェリンである（Karkanら（２００８年）PLoS ONE ３巻（６号）：ｅ２４６９頁 doi:10.1371/journal.poine.0002469）。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−８Ｒａ（ＣＸＣＲ１）、またはＩＬ−８Ｒｂ（ＣＸＣＲ２）などの受容体である（Alterら（２００３年）J. Immunol １７０巻：４４９７〜４５０５頁）。これらの実施形態のいずれかでは、導入遺伝子は、酵素がそれを必要とする対象のＣＮＳに送達されるように、上記の酵素などのリソソーム蓄積症において欠如している酵素をコードし得る。

一部の態様では、本発明の操作されたＢ細胞は、移植後の生着を助けるさらなる改変（例えば、変異）を含む。一部の実施形態では、生着および／または胚中心のサイズを増加させるために、特定の遺伝子の発現を阻害する（例えば、一過性の抑制または永続的なノックアウトを介して）。そのような阻害に供される遺伝子には、イノシトールヘキサキスホスフェートキナーゼ（inositol hexakisphosphate kinase）（Zhangら（２０１４年）Basic Res Cardio １０９巻（４号）：４１７頁）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β、Koら（２０１１年）Stem Cells ２９巻（１号）：１０８〜１８頁を参照のこと）、ＣＤ２６（ＤＰＰＩＶ／ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）ペプチダーゼ（Tianら（２００６年）Gene Ther １３巻（７号）：６５２〜８頁）、ＲｈｏＡ（Ghiaurら（２００６年）Blood １０８巻（６号）：２０８７〜９４頁）、ＥＡＦ２（Liら、（２０１６年）Nat Com ７巻；doi: 10.1038/ncomms10836）、Ａｔｇ５などのオートファジータンパク質（Pengoら、（２０１３年）Nat Immunol １４巻（３号）：２９８〜３０５頁）などが含まれるがこれらに限定されない。さらなる実施形態では、操作されたＢ細胞は、移植片対宿主反応の誘導に関連する遺伝子を抑制（例えば、ノックアウト）するようにさらに操作され得る。一部の実施形態では、Ｂ細胞受容体をコードする遺伝子を、宿主におけるＢ細胞の刺激を予防するためにノックアウトする。

他の態様では、本発明の操作されたＢ細胞は、胚中心における細胞の相互作用（例えば、Ｔ細胞−Ｂ細胞相互作用）を調節する、および／または病原体の感染に関連する任意のＢ細胞機能（例えば、抗体産生、サイトカイン発現、シグナル伝達など）の抑制を阻害するさらなる改変（変異、例えばゲノム挿入および／または欠失、導入遺伝子のエピソーム発現など）を含む。一部の態様では、本発明の操作されたＢ細胞は、発癌挙動に関係するＢ細胞の阻害のためのタンパク質（またはこれらのタンパク質をコードする配列）をさらに含む。例えば、一部の実施形態では、操作されたＢ細胞は、一部の型の大細胞型Ｂ細胞リンパ腫に関与するＢ細胞を抑制するために、ユビキチンヒドロラーゼＵＣＨ−Ｌ１（これをコードする導入遺伝子を含む）に対する表面発現抗体を含む（Bedekovicsら（２０１６年）Blood １２７巻（１２号）：１５６４〜７４頁）。

別の態様では、本明細書に記載される細胞、発現構築物、および／または必要に応じたヌクレアーゼの１つまたは複数を含む医薬組成物が提供される。

Ｂ細胞中の適切な位置への本発明の発現構築物のヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みのために、ヌクレアーゼによって切断された領域（遺伝子）中に発現構築物が組み込まれるように、１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよび／またはＴｔＡｇｏヌクレアーゼが含まれるがこれらに限定されない任意のヌクレアーゼが使用され得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の対のヌクレアーゼが用いられる。ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡの形態で導入され得る、または非ウイルスもしくはウイルスベクターを使用して細胞に投与され得る。一部の態様では、ヌクレアーゼポリヌクレオチドは、レンチウイルスによって、または非組み込みレンチウイルスによって、送達され得る。他の態様では、発現カセットは、ＡＡＶおよび／またはＤＮＡオリゴによって送達され得る。

記載される組成物および方法のいずれかでは、発現カセットおよび／またはヌクレアーゼは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、または偽型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などが含まれるがこれらに限定されないＡＡＶベクター上にあってもよい。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド（発現構築物および／またはヌクレアーゼ）は、同じＡＡＶベクター型を使用して送達される。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、異なるＡＡＶベクター型を使用して送達される。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のベクターを使用して送達され得る。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を介して送達される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、無処置の（intact）動物の脾臓またはリンパ節への投与を介して送達される。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、末梢静脈への静脈内投与を介して送達される。

本明細書に記載される方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで実施され得る。ある特定の実施形態では、組成物は、生きた無処置の哺乳動物中に導入される。哺乳動物は、送達の時点で、任意の発生段階、例えば胚、胎仔（児）、新生仔（児）、乳仔（児）、若年、または成体（人）であり得る。さらに、標的とされる細胞は、健康または病的であり得る。ある特定の実施形態では、組成物の１つまたは複数は、特定の組織（例えば、脾臓またはリンパ節）に、動脈内に、腹腔内に、または筋肉内に送達される。ｅｘ ｖｉｖｏ送達は、幹細胞、Ｂ細胞前駆細胞、および／または成熟Ｂ細胞を含む均一なまたは不均一な細胞の集団によって行ってもよい。

本明細書に記載される発現構築物、ＡＡＶベクター、Ｂ細胞、および／または医薬組成物の１つまたは複数を含むキットもまた提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣａｓおよび改変されたＣａｓタンパク質をコードするＲＮＡ分子、ならびにガイドＲＮＡ）、またはヌクレアーゼタンパク質のアリコート、細胞、本発明の方法を実施するための指示などをさらに含み得る。

これらおよび他の態様は、全体としての本開示に照らして、当業者に容易に明らかとなる。

図１は、従ったｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｂ細胞解凍および分化プロトコールの概要を示す模式図である（Jourdanら（２００９年）Blood １１４巻：５１７３〜５１８１頁を参照のこと）。

図２Ａ〜２Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＢ細胞が、ＩｇＭ抗体（図２Ａ）、ＩｇＧ抗体（図２Ｂ）、およびＩｇＡ抗体（図２Ｃ）を含む抗体を産生する能力を実証するグラフである。試料を、サイトカイン（「＋サイトカイン」）で処置したか、または処置せず、次いで抗体の量をＥＬＩＳＡによって検出した。上清を、ｔ４、ｔ７、およびｔ１０日目に収集し、総ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡ抗体レベルを特異的ＥＬＩＳＡによって定量した。データは、技術的二つ組（technical duplicates）を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。

図３Ａ〜３Ｄは、解凍後０日（図３Ａ）、１日（図３Ｂ）、２日（図３Ｃ）、または３日（図３Ｄ）でのＢ細胞へのｍＲＮＡのエレクトロポレーション後のＧＦＰ陽性細胞のパーセントを示すグラフである。ｍＲＮＡを添加する最適な時点を決定するために、ｔが解凍後の日数に等しいｔ０、ｔ１、ｔ２、およびｔ３に、ＣＤ１９＋Ｂ細胞にｍＲＮＡをエレクトロポレートした。ＣＤ１９＋陽性Ｂ細胞（２．０Ｅ＋０５細胞）をＧＦＰ ｍＲＮＡ（２μｇ）と混合した後、エレクトロポレーションした。細胞を２４時間後に収集し、フローサイトメトリーによって分析し、ＧＦＰレベルを評価した。解凍後２日目（ｔ２）は最高レベルのＧＦＰを有し、これをさらなる研究のために選択した。データは技術的二つ組を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。

図４Ａおよび４Ｂは、形質導入した細胞におけるＧＦＰ発現に関するフローサイトメトリーのゲーティングを示すグラフである。図４Ａは、側方散乱（「ＳＳＣ」）および前方散乱（「ＦＳＣ」）に関連するプロットのエリアを定義する。図４Ｂは、偽処置した一群のＢ細胞（左のパネル）と、ＧＦＰコードｍＲＮＡをエレクトロポレートした一群のＢ細胞（右のパネル）の間の差を例証する。図４Ｂの右のパネルに認められ得るように、ＧＦＰ ｍＲＮＡの発現によって、ゲーティング後に定量可能であり得る（can is quantifiable）ＧＦＰ生成蛍光の増加が生じる。

図５Ａ〜５Ｃは、Ｂ細胞におけるゲノム編集を示すグラフである。複数の遺伝子座でのディープシークエンシングにより、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、およびＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ）を標的化するジンクフィンガーヌクレアーゼを使用してロバストなゲノム編集が実証された。パーセントゲノム改変を、挿入および欠失（インデル）含有配列数を配列総数で除算することによって計算した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞（２．０Ｅ＋５細胞）を、ＺＦＮ ｍＲＮＡ（４μｇ）と混合した後、エレクトロポレーションした。細胞をトランスフェクション後、経時的に（ｔ＝日数）収集した。データは技術的二つ組を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。図５Ａは、４、７、および１０日目でのＡＡＶＳ１遺伝子座でのゲノム編集を示す。図５Ｂは、ＣＣＲ５遺伝子座での同様のデータセットを示し、図５ＣはＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ）遺伝子座でのデータを示す。

図６Ａ〜６Ｃは、Ｂ細胞ゲノム編集に対する一過性の低温ショックの効果を示す。ＣＤ１９＋Ｂ細胞（２．０Ｅ＋５細胞）をＺＦＮ ｍＲＮＡ（０．７５、１．５、３、および６μｇ）と混合した後、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後の細胞を２つの群に分けた。１つの群を３７℃のインキュベーターに４日間入れた。第２の群を３０℃のインキュベーター一晩入れ、次いで３７℃インキュベーターに３日間移した。ディープシークエンシングにより、一過性の低温ショックによって処置した細胞におけるゲノム編集（％インデル）の増加が明らかとなった。

図７Ａおよび７Ｂは、ＣＭＶプロモーター−ＧＦＰドナーのＣＤ１９＋Ｂ細胞への送達に関して試験したいくつかのＡＡＶ血清型の形質導入能を示す。図７Ａは、２．４Ｅ＋６、１．２Ｅ＋６、６．０Ｅ＋５、３．０Ｅ＋５ベクターゲノム（ｖｇ）／細胞のベクター用量で送達したＣＭＶ−ＧＦＰを有する組換えＡＡＶ血清型２、５、６、８、および９の結果を示す。示されるデータは、形質導入後４、７、および１０日目で細胞をＧＦＰ発現に関して分析したｎ＝２の生物学的反復実験（biological replicates）のデータであり、ＡＡＶ６がＢ細胞を容易に形質導入することを実証している。エラーバーは、技術的および生物学的反復実験の標準偏差を表す。図７Ｂは、示した実験に使用した発現カセットの模式図である。

図８は、使用した例示的なＡＡＶ発現カセットを示す。ＡＡＶＳＩ、ＣＣＲ５、およびＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ）遺伝子座に挿入するための例示的なドナーカセットを示す。ＡＡＶＳ１は、長さがそれぞれ、８０１および５６８塩基対からなる左（「ＡＡＶＳ１−Ｌ」）および右（「ＡＡＶＳ１−Ｒ」）相同性アームを有する。ＣＣＲ５は、長さがそれぞれ、４７３および１４３１塩基対からなる左（「ＣＣＲ５−Ｌ」）および右（「ＣＣＲ５−Ｒ」）相同性アームを有する。ＴＣＲＡ（「ＴＲＡＣ」）は、長さがそれぞれ、９２５および９８９塩基対からなる左（「ＴＲＡＣ−Ｌ」）および右（「ＴＲＡＣ−Ｒ」）相同性アームを有する。ドナーは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（「ＰＧＫ」）またはＢ細胞特異的プロモーター（「ＥＥＫ」、イントロンエンハンサー（ｉＥ^κ）、ＭＡＲ、および３エンハンサー（３’Ｅ^κ）が先行する軽鎖プロモーター（ＶＫｐ）を含む；米国特許第８，１３３，７２７号）のいずれかの後に、ＧＦＰコード導入遺伝子（「ＧＦＰ」）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（「ｐＡ」）を含有した。ＡＡＶ２逆方向末端反復（「ＩＴＲ」）を使用して、ＡＡＶカプシドへのパッケージングを可能にした。

図９Ａ〜９Ｃは、ＺＦＮ ｍＲＮＡとｒＡＡＶ２／６ベクターの組合せが、複数の遺伝子座で高レベルの導入遺伝子付加を促進したことを示すグラフである。ＧＦＰの発現レベルを、フローサイトメトリーによって測定した。Ｂ細胞培養物を、ＺＦＮ ｍＲＮＡおよびＡＡＶドナーのＢ細胞への添加後、経時的に（ｔ＝日数）収集した。ＡＡＶＳ１（図９Ａ）、ＣＣＲ５（図９Ｂ）、およびＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ、図９Ｃ）遺伝子座を、導入遺伝子付加に関して評価した。ＺＦＮ：ドナー試料は、持続的なＧＦＰ発現を示すが、ドナーのみの試料は、ＧＦＰ発現の経時的な減少を示す。各グラフの下に、ヌクレアーゼの標的部位を示す（例えば、図９Ａでは「ＺＦＮ：ＡＡＶＳ１」）。同様に、ＧＦＰ導入遺伝子の説明も示す（例えば、図９Ａでは「ドナー：ＰＧＫ−ＡＡＶＳ１」は、ＧＦＰ導入遺伝子がＰＧＫプロモーターから駆動されたこと、およびＧＦＰコード配列がＡＡＶＳ１遺伝子におけるヌクレアーゼ部位に対して相同性を有する相同性アームに隣接したことを示す）。図９Ａ〜９Ｃでは、左のパネルは、トランスフェクション後４日（ｔ４）の収集後の結果を示し、中央のパネルは、トランスフェクション後７日（ｔ７）の収集後の結果を示し、および右のパネルは、トランスフェクション後１０日の収集後の結果を示す。 図９Ａ〜９Ｃは、ＺＦＮ ｍＲＮＡとｒＡＡＶ２／６ベクターの組合せが、複数の遺伝子座で高レベルの導入遺伝子付加を促進したことを示すグラフである。ＧＦＰの発現レベルを、フローサイトメトリーによって測定した。Ｂ細胞培養物を、ＺＦＮ ｍＲＮＡおよびＡＡＶドナーのＢ細胞への添加後、経時的に（ｔ＝日数）収集した。ＡＡＶＳ１（図９Ａ）、ＣＣＲ５（図９Ｂ）、およびＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ、図９Ｃ）遺伝子座を、導入遺伝子付加に関して評価した。ＺＦＮ：ドナー試料は、持続的なＧＦＰ発現を示すが、ドナーのみの試料は、ＧＦＰ発現の経時的な減少を示す。各グラフの下に、ヌクレアーゼの標的部位を示す（例えば、図９Ａでは「ＺＦＮ：ＡＡＶＳ１」）。同様に、ＧＦＰ導入遺伝子の説明も示す（例えば、図９Ａでは「ドナー：ＰＧＫ−ＡＡＶＳ１」は、ＧＦＰ導入遺伝子がＰＧＫプロモーターから駆動されたこと、およびＧＦＰコード配列がＡＡＶＳ１遺伝子におけるヌクレアーゼ部位に対して相同性を有する相同性アームに隣接したことを示す）。図９Ａ〜９Ｃでは、左のパネルは、トランスフェクション後４日（ｔ４）の収集後の結果を示し、中央のパネルは、トランスフェクション後７日（ｔ７）の収集後の結果を示し、および右のパネルは、トランスフェクション後１０日の収集後の結果を示す。 図９Ａ〜９Ｃは、ＺＦＮ ｍＲＮＡとｒＡＡＶ２／６ベクターの組合せが、複数の遺伝子座で高レベルの導入遺伝子付加を促進したことを示すグラフである。ＧＦＰの発現レベルを、フローサイトメトリーによって測定した。Ｂ細胞培養物を、ＺＦＮ ｍＲＮＡおよびＡＡＶドナーのＢ細胞への添加後、経時的に（ｔ＝日数）収集した。ＡＡＶＳ１（図９Ａ）、ＣＣＲ５（図９Ｂ）、およびＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ、図９Ｃ）遺伝子座を、導入遺伝子付加に関して評価した。ＺＦＮ：ドナー試料は、持続的なＧＦＰ発現を示すが、ドナーのみの試料は、ＧＦＰ発現の経時的な減少を示す。各グラフの下に、ヌクレアーゼの標的部位を示す（例えば、図９Ａでは「ＺＦＮ：ＡＡＶＳ１」）。同様に、ＧＦＰ導入遺伝子の説明も示す（例えば、図９Ａでは「ドナー：ＰＧＫ−ＡＡＶＳ１」は、ＧＦＰ導入遺伝子がＰＧＫプロモーターから駆動されたこと、およびＧＦＰコード配列がＡＡＶＳ１遺伝子におけるヌクレアーゼ部位に対して相同性を有する相同性アームに隣接したことを示す）。図９Ａ〜９Ｃでは、左のパネルは、トランスフェクション後４日（ｔ４）の収集後の結果を示し、中央のパネルは、トランスフェクション後７日（ｔ７）の収集後の結果を示し、および右のパネルは、トランスフェクション後１０日の収集後の結果を示す。

図１０Ａおよび１０Ｂは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるＡＡＶＳ１（図１０Ａ）およびＣＣＲ５（図１０Ｂ）遺伝子座でのＧＦＰドナーの標的化組み込みのパーセントを示すグラフである。標的組み込み（導入遺伝子付加）の確認をディープシークエンシングにより行った。パーセント遺伝子改変を、組み込まれた標的含有配列数の総和を総配列数によって除算することによって計算した。Ｂ細胞を、ＺＦＮ ｍＲＮＡおよびＡＡＶドナーのＢ細胞への添加後、経時的に（ｔ＝日数）収集した。ＡＡＶＳＩデータは、３回の独立した実験を表す。ＣＣＲ５データは、２回の独立した実験を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。各グラフの下に、ヌクレアーゼの標的部位および上記のドナーの構成を示す。

図１１は、相同性駆動組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｒｉｖｅｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；ＨＤＲ）、または非相同末端結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ；ＮＨＥＪ）を介する末端捕捉を、Ｂ細胞が標的化組み込みのために使用するかどうかを決定するための結果を示すグラフである。グラフの下の表は、ＺＦＮ特異性およびドナー構成を示す。全てのドナーがＰＧＫプロモーターを使用したが、実験＃１のみが、ヌクレアーゼ切断部位に一致する相同性アームに隣接するドナーＧＦＰ導入遺伝子を有した。ミスマッチＺＦＮおよびドナー相同性アームの試料は、いかなるヌクレアーゼも添加しないドナーのみと類似のＧＦＰ発現を示す。最大の標的化組み込みは、相同性アームがヌクレアーゼ標的部位と一致した場合に起こり、ＨＤＲがＢ細胞における組み込みのために使用されていることを実証する。

図１２は、ＧＦＰ発現を駆動するＰＧＫプロモーターの、ＧＦＰ発現を駆動するＢ細胞特異的プロモーターＥＥＫとの比較を示すグラフである。Ｂ細胞を、ＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ）遺伝子座を標的化するＺＦＮ ｍＲＮＡ（４μｇ）と混合した後、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、次いでＣＤ１９＋Ｂ細胞に、導入遺伝子発現カセットに隣接するＴＲＡＣ相同性アームおよびＧＦＰ導入遺伝子発現を駆動するＰＧＫまたはＢ細胞特異的プロモーター（ＥＥＫ）のいずれかを含有するＡＡＶ６を形質導入した。これらを、２．４Ｅ＋０６ｖｇ／細胞のベクター用量で送達した。データは、Ｂ細胞特異的プロモーター（ＥＥＫ）の使用が、ＰＧＫプロモーターと比較してＧＦＰ発現のわずかな増加を示したことを実証する。

図１３Ａ〜１３Ｄは、ドナーＡＡＶ用量の範囲でのＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるＧＦＰ導入遺伝子の発現量を示すグラフである。全ての場合において、ＧＦＰ導入遺伝子は、ＴＣＲＡ特異的ヌクレアーゼを使用してＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ）遺伝子座に組み込まれていた。同様に、各グラフにおいて、ヌクレアーゼの非存在下で形質導入を行った場合のＧＦＰ発現結果も示す。ドナー構築物は、ＴＣＲＡ特異的相同性アームおよび上記のＥＥＫプロモーターまたはＰＧＫプロモーターのいずれかで構成された。使用したＡＡＶの範囲は、３．０Ｅ＋０５ｖｇ／細胞（図１３Ｄ）、６．０Ｅ＋０５ｖｇ／細胞（図１３Ｃ）、１．２Ｅ＋０６ｖｇ／細胞（図１３Ｂ）、および２．４Ｅ＋０６ｖｇ／細胞（図１３Ａ）を含んだ。ＣＤ１９＋陽性Ｂ細胞を、ＴＣＲＡ遺伝子座を標的化するＺＦＮコードｍＲＮＡ（４μｇ）と混合した後、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、ＣＤ１９＋Ｂ細胞に、ＴＣＲＡ相同性アームを含有するＡＡＶを、ＧＦＰ発現を駆動するＰＧＫまたはＢ細胞特異的（ＥＥＫ）プロモーターのいずれかと共に形質導入した。これらを、２．４Ｅ＋０６、１．２Ｅ＋０６、６．０Ｅ＋０５、および３．０Ｅ＋０５ｖｇ／細胞のベクター用量で送達した。ＰＧＫプロモーターによって駆動されたＧＦＰ発現のパーセンテージは、用量が減少すると減少したが、Ｂ細胞特異的プロモーターは、８倍を超える希釈でＧＦＰ発現を維持した。２つのプロモーターの間には、３．０Ｅ＋０５ｖｇ／細胞でほぼ５倍の差がある。

図１４Ａ〜１４Ｃは、ゲノム編集マニピュレーション後の抗体産生に及ぼす影響を示すグラフであり、マニピュレーションの結果として、ＥＬＩＳＡによって測定した場合にＩｇＧのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生が大きく失われていないことを実証している。分泌された総ＩｇＧレベルは、実験の経過にわたって、処置とは無関係に類似しており（４、７、および１０日目での分泌されたＩｇＧレベルの組合せを表す）、エレクトロポレーションおよび形質導入が、ＩｇＧ産生に負の影響を与えないことを示している。サイトカインの添加は、ＩｇＧ産生にとって必須である。ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ＡＡＶＳ１特異的ＺＦＮ（図１４Ａ）、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮ（図１４Ｂ）、またはＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ）特異的ＺＦＮ（図１４Ｃ）のいずれかで処置した。各データセットのために使用した様々な条件は、一致する相同性アームを有するＧＦＰ導入遺伝子と対合した特異的ＺＦＮ（「ＺＦＮ：ドナー」）、ＧＦＰ導入遺伝子と相同性アーム（「ドナー」）、特異的ＺＦＮ単独（「ＺＦＮ」）、ＢＴＸデバイスにおいて緩衝液のみで処置したＣＤ１９＋Ｂ細胞（「ＢＴＸ細胞」）、未処置ＣＤ１９＋Ｂ細胞プラスサイトカイン（「Ｂ細胞」）、およびサイトカインを含まない未処置ＣＤ１９＋Ｂ細胞（「Ｂ細胞−Ｃｙｔｏｓ」）を含んだ。ＺＦＮ：ドナー、ドナー、ＺＦＮ、ＢＴＸ細胞、およびＢ細胞は全て、サイトカインで処置した。

図１５Ａ〜１５Ｃは、ゲノム編集マニピュレーション後の抗体産生に及ぼす影響を示すグラフであり、ＥＬＩＳＡによって測定したＩｇＭのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生が大きく失われていないことを実証している。ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ＡＡＶＳ１特異的ＺＦＮ（図１５Ａ）、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮ（図１５Ｂ）、またはＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ）特異的ＺＦＮ（図１５Ｃ）のいずれかで処置した。試料は、図１４において上記のとおりである。

図１６は、１人のヒトドナーからの、サイトカインで処置した分化したＣＤ１９＋Ｂ細胞からのＩｇＭ産生を示すグラフである。ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ＡＡＶ２、５、６、８、または９ウイルスによる処置に供した。添加したサイトカインの存在下では、ＥＬＩＳＡによって測定したＩｇＭ産生は、ＡＡＶ２のみで処置した場合「上昇し（boosted）」た。ヒト集団において野生型ＡＡＶに対する抗体の保有率はロバストであり、疾患に関連していない。本明細書において、ＡＡＶによる再感染であると考えられるものによって抗体産生が強化される可能性を示す。

図１７Ａおよび１７Ｂは、ＡＡＶ２「追加刺激（boost）」の結果としてのＩｇＭ発現の増加の潜在的機構を示す例証である。左のパネル（図１７Ａ）にＡＡＶ感染後のＢ細胞における抗体産生の単純化したシナリオを示す。右に示すパネル（図１７Ｂ）は、ＡＡＶが、操作されたＢ細胞において抗体プロモーターから駆動される挿入された導入遺伝子の発現を増加させるためのブースターとして機能するためにどのように利用され得るかを示す例である。

詳細な説明
内因性遺伝子をノックアウトして、導入遺伝子の発現のための発現カセットを挿入する（安定にまたはエピソームで）ステップを含む、Ｂ細胞の遺伝子操作のための方法および組成物が、本明細書に開示される。方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができ、導入遺伝子の１つまたは複数の提供によって寛解され得る任意の疾患または障害の処置および／または予防のための任意の導入遺伝子（複数可）を発現させるために使用することができる。

一般
本明細書に開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、特に示さない限り、当業者の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年および第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年および定期的更新；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、第３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ． ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ． Ｐ． Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、第１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照のこと。

定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖または環状コンフォメーションの、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関しての限定として解釈すべきではない。用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸
部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において改変されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する；即ち、ＡのアナログはＴと塩基対合する。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、相互交換可能に使用される。用語は、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも当てはまる。

「組換え」とは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによる捕捉が含まれるがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同組換え修復機構を介した細胞における二本鎖破断の修復の間に起こるかかる交換の特殊な形態を指す。

本開示のある特定の方法では、本明細書に記載される１つまたは複数の標的化ヌクレアーゼは、所定の部位（例えば、アルブミン遺伝子）において標的配列（例えば、細胞クロマチン）中に二本鎖破断（ＤＳＢ）を創出する。ＤＳＢは、本明細書に記載される構築物の組み込みを媒介する。任意選択で、構築物は、破断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を有する。発現構築物は、物理的に組み込まれ得、あるいは、発現カセットは、相同組換えを介した破断の修復のための鋳型として使用されて、細胞クロマチン中への、発現カセット中と同様のヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入を生じる。従って、細胞クロマチン中の第１の配列は変更され得、ある特定の実施形態では、発現カセット中に存在する配列へと変換され得る。従って、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、別のヌクレオチド配列による１つのヌクレオチド配列の置き換え（即ち、情報的な意味での配列の置き換え）を示すと理解され得、別のポリヌクレオチドによる１つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置き換えを必ずしも要求しない。

本明細書に記載される方法のいずれかでは、外因性ヌクレオチド配列（「発現構築物」または「発現カセット」または「ベクター」）は、目的の領域中のゲノム配列に対して相同であるが同一ではない配列を含有し得、それによって、目的の領域において非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。従って、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列に対して相同な発現カセット配列の部分は、置き換えられるゲノム配列に対して約８０〜９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、発現カセットとゲノム配列との間の相同性は、例えば、１００を超える連続塩基対の、発現カセットの相同性領域とゲノム配列の相同性領域との間で１ヌクレオチドのみが異なる場合、９９％よりも高い。ある特定の場合では、発現カセットの非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含有し得る。これらの例では、非相同配列には一般に、目的の領域中の配列に対して相同または同一である、５０〜１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）の、または１，０００よりも多い任意の数の塩基対の配列が隣接する。

用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、直鎖、環状または分岐鎖であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「導入遺伝子」とは、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、任意の長さ、例えば、２〜１００，０００，０００ヌクレオチド長の間（またはそれらの間もしくはそれを上回る任意の整数値）、好ましくは約１００〜１００，０００ヌクレオチド長の間（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約２０００〜２０，０００ヌクレオチド長の間（またはそれらの間の任意の値）、さらにより好ましくは約５〜１５ｋｂの間（またはそれらの間の任意の値）のものであり得る。

「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部分を構成するクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、細胞のゲノムを構成する全ての染色体の収集であるその核型によって特徴付けられる場合が多い。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含み得る。

「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製性の核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。本明細書に記載される肝臓特異的構築物は、エピソームで維持され得、あるいは、細胞中に安定に組み込まれ得る。

「外因性」分子は、細胞中に通常は存在しないが、１つまたは複数の遺伝学的、生化学的または他の方法によって細胞中に導入され得る分子である。「細胞中の通常の存在」は、特定の発生段階および細胞の環境条件に関して決定される。従って、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、ヒートショックによって誘導される分子は、ヒートショックされていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全性内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能する内因性分子の機能不全性バージョンを含み得る。

外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるような小分子、あるいは高分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の改変された誘導体、または上記分子の１つもしくは複数を含む任意の複合体であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であり得、直鎖、分岐鎖または環状であり得、任意の長さのものであり得る。核酸には、二重鎖を形成することが可能なもの、ならびに三重鎖形成性核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、デユビキチナーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれるがこれらに限定されない。

外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入される感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、これには、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。外因性分子はまた、細胞が由来する種とは異なる種に由来するが、内因性分子と同じ型の分子であり得る。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞系中に導入され得る。

それに反して、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発生段階において、特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。

本明細書で使用する場合、用語「外因性核酸の産物」には、ポリヌクレオチド産物およびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）が含まれる。

「融合」分子は、２つまたはそれよりも多くのサブユニット分子が、好ましくは共有結合によって連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得る、または異なる化学型の分子であり得る。融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合物）、切断ドメインと動作可能に会合したポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）間の融合物、および融合核酸（例えば、融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるがこれらに限定されない。

細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって生じ得、ここで、ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳され、融合タンパク質を生成する。トランス−スプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の別の場所に提示される。

本開示の目的のために、「遺伝子」には、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照のこと）、ならびにそのような調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接していてもいなくても、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域が含まれる。従って、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに必ずしも限定されない。

「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含有される情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって改変されたタンパク質も含まれる。

遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑圧が含まれ得るがこれらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異）は、発現をモジュレートするために使用され得る。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載されるＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較した、遺伝子発現における任意の低減を指す。従って、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。「遺伝子改変された」細胞は、エピソームおよび／またはゲノム改変が含まれるがこれらに限定されない、細胞中の遺伝子材料に対する任意の変化を有する細胞を含む。遺伝子改変の非限定的な例には、細胞内でのタンパク質発現を変更する挿入および／または欠失（例えば、１つまたは複数の導入遺伝子、ＲＮＡ、または非コード配列のエピソームおよび／または標的化組み込み）および／または変異（例えば、点変異、置換など）が含まれる。

「目的の領域」は、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子、または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列などであり、外因性分子を結合することが望ましい。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えの目的のためであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内にあり得る。目的の領域は、単一ヌクレオチド対くらいの小ささ、もしくは最大で２，０００ヌクレオチド対長、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。

「真核生物」細胞には、幹細胞（多能性および多分化能性）を含む、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｂ細胞）が含まれるがこれらに限定されない。

用語「動作可能な連結」および「動作可能に連結した」（または「作動可能に連結した」）は、２つまたはそれよりも多くの構成成分（例えば、配列エレメント）の並置に関して相互交換可能に使用され、構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、構成成分の少なくとも１つが他の構成成分の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介できる可能性を与えるように配置される。例示として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に動作可能に連結している。転写調節配列は一般に、コード配列とシスで動作可能に連結するが、それと直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続していない場合であっても、コード配列に動作可能に連結した転写調節配列である。

タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能をなおも保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応するネイティブ分子よりも多い、少ない、もしくは同じ数の残基を保有し得、および／または１つもしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知である。例えば、Ｂドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子は、完全長の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の機能的断片である。

ポリヌクレオチド「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、「発現構築物」、「発現カセット」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指示することが可能であり、遺伝子配列を標的細胞に移入させることができる、任意の核酸構築物を意味する。従って、用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを含む。

用語「対象」および「患者」は、相互交換可能に使用され、哺乳動物、例えば、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物を指す。従って、用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用する場合、本発明の発現カセットが投与され得る任意の哺乳動物患者または対象を意味する。本発明の対象には、障害を有する対象が含まれる。

Ｂ細胞発現構築物
対象に発現カセット（複数可）の投与（例えば、静脈内送達）後にｉｎ ｖｉｖｏを含むＢ細胞（形質芽球および形質細胞を含む）において導入遺伝子の発現を指示することにおける使用のための発現カセット（構築物）が、本明細書に記載される。発現構築物は、エピソームで維持され、染色体外で導入遺伝子の発現を駆動し得、あるいは、発現構築物は、例えばヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みによって、Ｂ細胞のゲノムに組み込まれ得る。

任意の適したプロモーター配列を、本発明の発現カセットにおいて使用することができる。ある特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、誘導性および／またはＢ細胞特異的プロモーターである。導入遺伝子が内因性Ｂ細胞プロモーターによって駆動されるプロモーターのない構築物も同様に、本明細書に記載される細胞の遺伝子改変のために企図される。

明らかであるように、任意の導入遺伝子が、本明細書に記載される構築物に使用することができる。さらに、本明細書に記載される構築物の個々の発現構築物構成成分（プロモーター、エンハンサー、インスレーター、イントロン、導入遺伝子など）は存在してもしなくてもよく、任意の組合せで混合、およびマッチさせてもよい。

本明細書に記載される構築物は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクター内に含有され得る。構築物は、エピソームで維持され得るまたは細胞のゲノム中に（例えば、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みを介して）組み込まれ得る。

非ウイルスベクターには、ＤＮＡまたはＲＮＡプラスミド、ＤＮＡ ＭＣ、ネイキッド核酸、およびリポソーム、脂質ナノ粒子、ナノ粒子またはポロクサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が含まれる。本明細書に記載される発現カセットを運搬するために使用され得るウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。宿主ゲノムにおける組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法を用いて可能であり、本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ媒介性組み込みによって促進され得る。

ある特定の好ましい実施形態では、構築物は、エピソームで維持またはＢ細胞のゲノム中に（例えば、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みを介して）組み込まれ得るアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターまたはベクター系中に含まれる。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ ８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）；ならびにＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含むいくつかの刊行物中にある。

従って、ある特定の実施形態では、発現構築物は、ＡＡＶ構築物上にあり、本明細書に記載される発現構築物のエレメント（例えば、エンハンサー、プロモーター、任意選択のイントロン、導入遺伝子など）に隣接する５’および３’ＩＴＲをさらに含む。任意選択で、スペーサー分子もまた、発現構築物の構成成分の１つまたは複数の間、例えば、５’ＩＴＲとエンハンサーとの間および／またはポリアデニル化シグナルと３’ＩＴＲとの間に含まれる。スペーサーは、セーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミン）中への組換えを促進するための相同性アームとして機能し得る。ある特定の実施形態では、構築物は、図８に示される構築物である。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶに由来し得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、欠損性および非病原性パルボウイルスであるアデノ随伴２型ウイルスに由来する。全てのかかるベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆位末端リピートのみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノム中への組み込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特色である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３５１巻：９１１７号、１７０２〜３頁（１９９８年）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０ならびに任意の新規ＡＡＶ血清型を含む他のＡＡＶ血清型もまた、本発明に従って使用され得る。特に好ましいのはＡＡＶ６血清型である。一部の実施形態では、ウイルス核酸のＩＴＲ配列のウイルス起源がカプシド配列のウイルス起源にとって異種である、キメラＡＡＶが使用される。非限定的な例には、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲおよびＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来するカプシドを有するキメラウイルス（即ち、それぞれ、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９）が含まれる。

レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）；Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ． １７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。

本明細書に記載される構築物は、アデノウイルスベクター系中にも組み込まれ得る。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高い力価および高いレベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生され得る。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ ８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）；Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）；Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ ９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療的ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。５０％またはそれよりも高い形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージングされたベクターについて観察されている（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）；Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １巻：１１１〜２頁（１９９７年））。

複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）もまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチドと共に使用され得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作される；引き続いて、複製欠損ベクターは、欠失された遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞中で増殖する。Ａｄベクターは、非分裂性の分化した細胞、例えば、肝臓、腎臓および筋肉中で見出される細胞を含む、複数の型の組織をｉｎ ｖｉｖｏで形質導入できる。従来のＡｄベクターは、大きい運搬能を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の一例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４巻：１号、５〜１０頁（１９９６年）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９巻：７号、１０８３〜１０８９頁（１９９８年）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）が含まれる。

パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞には、ＡＡＶおよびアデノウイルスをパッケージングするために使用され得るＨＥＫ２９３細胞およびＳｆ９細胞、ならびにレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産生細胞系によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主中への引き続く組み込み（適用可能な場合）に必要とされる最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノム中への組み込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列のみを保有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠如するヘルパープラスミドを含有する細胞系においてパッケージングされる。細胞系には、ヘルパーとしてのアデノウイルスも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して顕著な量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる混入は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減され得る。一部の実施形態では、ＡＡＶは、バキュロウイルス発現系を使用して産生される（例えば、米国特許６，７２３，５５１および同７，２７１，００２を参照のこと）。

２９３またはバキュロウイルス系からのＡＡＶ粒子の精製は、典型的に、ウイルスを産生する細胞の成長、その後の細胞上清からのウイルス粒子の収集、または細胞の溶解および粗溶解物からのウイルスの収集を伴う。次いで、ＡＡＶを、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、米国特許第７，４１９，８１７号および同第６，９８９，２６４号を参照のこと）、イオン交換クロマトグラフィーとＣｓＣｌ密度遠心分離（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１０９４１９８Ａ１０）、イムノアフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＷＯ２０１６１２８４０８）またはＡＶＢセファロース（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する精製を含む、当該分野で公知の方法によって精製する。

多くの遺伝子治療適用では、特定の組織型に対する高い程度の特異性を有する遺伝子治療ベクターを送達することが望ましい。従って、ウイルスベクターは、ウイルスの外側表面上にウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変され得る。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０と融合したヒトヘレグリンを発現するように改変され得ること、および組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、他のウイルス−標的細胞対に拡張でき、このとき、標的細胞は受容体を発現し、ウイルスは、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する。例えば、繊維状ファージは、事実上任意の選択された細胞受容体に対する特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）をディスプレイするように操作され得る。上の記載は、ウイルスベクターに主に当てはまるが、同じ原理が非ウイルスベクターに適用され得る。かかるベクターは、特異的標的細胞による取込みに有利な特異的取込み配列を含有するように操作され得る。

本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非天然の塩基および／または骨格を含み得る。特に、本明細書に記載される発現カセットは、転写静止の状態を達成するために、目的の領域中にメチル化シトシンを含み得る。

さらに、本明細書に記載される発現構築物は、さらなる転写もしくは翻訳調節または他の配列、例えば、コザック配列、さらなるプロモーター、エンハンサー、インスレーター、イントロン、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、フーリン切断部位および／またはポリアデニル化シグナルもまた含み得る。さらに、目的の遺伝子の制御エレメントは、キメラ遺伝子を創出するためにレポーター遺伝子に作動可能に連結し得る（例えば、レポーター発現カセット）。

改変
以下の改変：（ａ）細胞における１つまたは複数の導入遺伝子の提供（エピソームおよび／または任意の組合せで組み込まれる）；（ｂ）（ｉ）Ｂ細胞受容体遺伝子および／または（ｉｉ）胚中心における細胞相互作用を改変する１つもしくは複数の遺伝子における挿入および／もしくは欠失；ならびに／または（ｃ）病原体の感染またはがんの調節に関連する任意のＢ細胞機能の抑制を阻害する改変（変異）、の１つまたは複数を含む遺伝子改変されたＢ細胞が本明細書に記載される。本明細書に記載される遺伝子改変されたＢ細胞はまた、これらの遺伝子改変の１つまたは複数を含むＨＳＣの子孫であり得る。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される構築物は、任意の導入遺伝子（複数可）のＢ細胞発現のために使用することができる。１つまたは複数の導入遺伝子を、改変されたＢ細胞においてエピソームで、および／または導入遺伝子の１つもしくは複数のヌクレアーゼ媒介性標的化組み込み後に発現させてもよい。例示的な導入遺伝子（目的の遺伝子および／または外因性配列とも呼ばれる）には、任意のポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位および／または様々な型の発現構築物が含まれるがこれらに限定されない。マーカー遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）ならびに増強された細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が含まれるがこれらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたは複数のコピーが含まれる。

好ましい実施形態では、導入遺伝子は、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子、および上記のいずれかの機能的断片が含まれるがこれらに限定されない、細胞におけるその発現が所望される任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。コード配列は、例えばｃＤＮＡであり得る。

ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、リソソーム蓄積障害（例えば、ゴーシェ、ファブリー、ハンター、ハーラー、ニーマン（Ｎｅｉｍａｎｎ）−ピックなど）、代謝障害、ならびに／または血液障害、例えば、血友病およびヘモグロビン異常症などが含まれるがこれらに限定されない任意の遺伝疾患において欠如している欠損したタンパク質の機能的バージョンをコードする。例えば、米国特許出願公開第２０１４００１７２１２号および同第２０１４００９３９１３号；米国特許第９，２５５，２５０号および同第９，１７５，２８０号を参照のこと。

例えば、導入遺伝子は、以下の遺伝疾患のいずれかが含まれるがこれらに限定されない遺伝疾患を有する対象において欠如しているまたは非機能的であるポリペプチドをコードする配列を含み得る：軟骨無形成症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、アルファ−サラセミア、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、不整脈原性右室心筋症、異形成症、毛細血管拡張性運動失調症（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｃｔａｓｉａ）、バース症候群、ベータ−サラセミア、青色ゴム乳首様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成症、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症（ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症（ｇａｌａｃｔｏｓｅｍｉｓ）、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｅｓ）（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、ベータ−グロビンの６番目のコドン中のヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群（Ｋｌｉｎｅｆｌｅｔｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、クラッベ病、ランガー−ギデオン症候群、白血球粘着欠損症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎｓｉｐｄｉｕｓ）、神経線維腫症、ニーマン−ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー−ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン−テイビ症候群、サンフィリッポ症候群、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、シュワッハマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス−マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ−サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャーコリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペル−リンダウ病（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌａｎｄａｕ ｄｉｓｅａｓｅ）、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット−アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）、後天性免疫不全、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病およびテイ−サックス病）、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃａｈｉｄｏｓｉｓ）（例えば、ハンター病、ハーラー病）、ヘモグロビン異常症（例えば、鎌状赤血球症、ＨｂＣ、α−サラセミア、β−サラセミア）および血友病。

本明細書に記載される発現され得るタンパク質（短縮されたバージョンなどのその機能的断片を含む）の非限定的な例には、フィブリノーゲン、プロトロンビン、組織因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、フォンヴィルブランド因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（フィッツジェラルド因子）、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリンコファクターＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン、アルファ２−抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−２、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、イズロン酸スルファターゼ（ＩＤＳ）、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）、ＭＭＡＡ、ＭＭＡＢ、ＭＭＡＣＨＣ、ＭＭＡＤＨＣ（Ｃ２ｏｒｆ２５）、ＭＴＲＲ、ＬＭＢＲＤ１、ＭＴＲ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）（ＰＣＣＡおよび／またはＰＣＣＢサブユニット）、グルコース−６−リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）タンパク質またはグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）、ＡｐｏＢ、ＬＤＬＲＡＰ−１、ＰＣＳＫ９、ミトコンドリアタンパク質、例えば、ＮＡＧＳ（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ）、ＣＰＳ１（カルバモイルリン酸シンテターゼＩ）、およびＯＴＣ（オルニチントランスカルバミラーゼ）、ＡＳＳ（アルギニノコハク酸シンテターゼ）、ＡＳＬ（アルギニノコハク酸（ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｓｅ ａｃｉｄ）リアーゼ）および／もしくはＡＲＧ１（アルギナーゼ）、ならびに／または溶質輸送体ファミリー２５（ＳＬＣ２５Ａ１３、アスパラギン酸／グルタミン酸輸送体）タンパク質、ＵＧＴ１Ａ１もしくはＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｕｒｏｎｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ポリペプチドＡ１、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ｆｕｍａｒｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙａｓｅ）（ＦＡＨ）、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）タンパク質、グリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ）タンパク質、トランスサイレチン遺伝子（ＴＴＲ）タンパク質、ＡＴＰ７Ｂタンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質、リポタンパク質リアーゼ（ＬＰＬ）タンパク質、操作されたヌクレアーゼ、操作された転写因子ならびに／あるいは治療的単鎖抗体が含まれる。

他の実施形態では、本明細書に記載される操作されたＢ細胞は、細胞表面上に発現された特異的分子標的を介して免疫細胞を標的とするように設計された操作された分子である１つまたは複数の抗体をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、操作されたＢ細胞は、内因性Ｂ細胞を標的とするように設計された抗体を発現する。これらの抗体は、Ｂ細胞、または免疫応答の減弱に関与する他の免疫細胞の抗体媒介性殺滅（例えば、ＡＤＣＣまたは補体媒介性殺滅を通して）を誘導し得る。

本明細書に記載されるＢ細胞は、望ましくない抗体を産生するＢ細胞に対して特異的である１つまたは複数の抗体を産生するように遺伝子改変することができる。望ましくない抗体を産生するＢ細胞の非限定的な例には、ＥＲＴにおいて投与されるタンパク質（血友病患者における凝固因子、例えば、Ｆ８、Ｆ９など、および／またはリソソーム蓄積障害において欠如または欠損しているタンパク質）に対する抗体を産生するＢ細胞が含まれる。抗体コード構築物をＢ細胞前駆体またはＢ細胞にｅｘ ｖｉｖｏで導入し、その細胞が患者に再導入されると、抗体産生Ｂ細胞が、操作された抗体が結合するタンパク質（例えば、抗体）を産生する細胞（Ｂ細胞）を特異的に標的とする。ある特定の実施形態では、操作された抗体は、治療タンパク質に対する抗体が中和されるように、外因性に供給された（ＥＲＴおよび／または遺伝子治療を介して）治療タンパク質に対する抗体に対して特異的である。このように、本明細書に記載される組成物および方法は、患者において産生された抗体（例えば、抗Ｆ９抗体）を特異的に標的とする抗体を産生する操作されたＢ細胞を含む。これらの組成物および方法の操作されたＢ細胞を、成熟Ｂ細胞としてまたは投与後に対象において分化する前駆細胞（例えば、ＨＳＣまたはリンパ前駆細胞）として対象に投与してもよく、あるいはｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子操作してもよい。なおさらなる実施形態では、遺伝子改変されたＢ細胞の導入遺伝子から産生されたタンパク質（例えば、抗ＥＲＴ抗体）は、単離されて、それを必要とする対象、例えばその身体が生成した抗ＥＲＴ抗体に対する抗体を必要とする患者に投与される。

なおさらなる実施形態では、導入遺伝子は、自己免疫疾患に関与するタンパク質に対して感受性があるＢ細胞に対して特異的な抗体であり得る。用語「自己免疫疾患」は、対象が、それ自身の組織に対して破壊性の免疫応答を開始する任意の疾患または障害を指す。自己免疫障害は、神経系、消化管系、および内分泌系、ならびに皮膚、および他の結合組織、眼、血液、および血管の疾患が含まれるがこれらに限定されない、対象（例えば、ヒト）におけるほぼあらゆる臓器系に影響を与え得る。自己免疫疾患の例には、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、グレーヴス病、強皮症、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、および糖尿病が含まれるがこれらに限定されない。このように、本明細書に記載されるＢ細胞は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、インスリン、ＡＮＡ、関節または筋タンパク質、甲状腺タンパク質などが含まれるがこれらに限定されない、自己免疫疾患に関与する自己抗原に対して感受性である（およびそれに対する抗体を産生する）、対象におけるＢ細胞集団を対象とする分子（例えば、操作された抗体）を含み得る。

ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、マーカー遺伝子（上記）を含み得、標的化組み込みを受けた細胞、およびさらなる機能性をコードする連結された配列の選択を可能にする。マーカー遺伝子の非限定的な例には、ＧＦＰ、薬物選択マーカーなどが含まれる。

本明細書に記載される構築物は、非コード導入遺伝子の送達にも使用され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列もまた、標的化挿入のために使用され得る。

ある特定の実施形態では、導入遺伝子には、１ｋｂ長よりも大きい、例えば、２〜２００ｋｂの間、２〜１０ｋｂの間（またはそれらの間の任意の値）の配列（例えば、導入遺伝子とも呼ばれるコード配列）が含まれる。導入遺伝子は、１つまたは複数のヌクレアーゼ標的部位もまた含み得る。導入遺伝子はまた、１つまたは複数の相同性アームも含み得る。相同性アームは、ヌクレアーゼ切断標的部位に隣接する配列に対して高い程度の相同性を有する配列を含む。相同性アームは、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００個、またはそれより多くのヌクレオチドまたはその間の任意の値を含み得る。

（例えば、ヌクレアーゼ媒介性組み込みを介して）組み込まれる場合、導入遺伝子は、内因性遺伝子の全て、一部が発現されるように、またはいずれの内因性遺伝子も発現されないように、内因性遺伝子中に挿入され得る。

ヌクレアーゼ
上記のように、発現カセットを、エピソームで維持してもよく、細胞のゲノムに組み込んでもよい。組み込みはランダムであり得る。ある特定の実施形態では、導入遺伝子構築物（複数可）の組み込みは、１つまたは複数のヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（「ＺＦＮ」）、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系、およびホーミングエンドヌクレアーゼ）による標的遺伝子の切断後に特定の遺伝子に標的とされ、構築物は、相同組換え修復（ＨＤＲ）、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）駆動性プロセスの間の末端捕捉のいずれかによって組み込まれる。例えば、全ての目的のためにその開示の全体が本明細書で参照により組み込まれる、米国特許第９，３９４，５４５号；同第９，１５０，８４７号；同第９，２０６，４０４号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９３６，９３６号；同第８，９４５，８６８号；同第８，８７１，９０５号；同第８，５８６，５２６号；同第８，５６３，３１４号；同第８，３２９，９８６号；同第８，３９９，２１８号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号および同第２０１５００５６７０５号を参照のこと。

任意のヌクレアーゼが、導入遺伝子発現構築物の標的化組み込みのために使用され得る。

ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む。例えば、米国特許第９，２５５，２５０号；同第９，２００，２６６号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第９，１５０，８４７号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，７０３，４８９号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号を参照のこと。

他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含むＴＡＬＥＮを含む。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号および米国特許出願公開第２０１３０１９６３７３号を参照のこと。

なおさらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、標的部位の認識のためのシングルガイドＲＮＡおよび１つまたは複数の切断ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む。例えば、米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号を参照のこと。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系が使用される（Fagerlundら、（２０１５年）Genom Bio １６巻：２５１頁を参照のこと）。用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１系の両方を指すと理解される。

ヌクレアーゼの切断ドメインは、偏性ヘテロダイマーを形成する天然に存在しない（操作された）切断ドメインを含む、野生型または変異型であり得る。例えば、米国特許第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号ならびに米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号を参照のこと。

ヌクレアーゼは、標的部位において、１つまたは複数の二本鎖および／または一本鎖カットを作製し得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒的に不活性な切断ドメインを含む（例えば、ＦｏｋＩおよび／またはＣａｓタンパク質）。例えば、米国特許第９，２００，２６６号；同第８，７０３，４８９号およびＧｕｉｌｌｉｎｇｅｒら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ３２巻（６号）：５７７〜５８２頁を参照のこと。触媒的に不活性な切断ドメインは、触媒的に活性なドメインと組み合わさって、ニッカーゼとして、一本鎖カットを作製するように作用し得る。従って、２つのニッカーゼが組み合わせて使用されて、特異的領域において二本鎖カットを作製し得る。ＭｃＣａｆｆｅｒｙら（２０１６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４４巻（２号）：ｅ１１頁． ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ８７８．２０１５年１０月１９日に電子出版など、さらなるニッカーゼもまた当該分野で公知である。

ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、セーフハーバー遺伝子（例えば、ＣＣＲ５、Ｒｏｓａ、アルブミン、ＡＡＶＳ１、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢなど）を切断する。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号を参照のこと。好ましい実施形態では、発現カセットが肝臓細胞の内因性アルブミン遺伝子座中に組み込まれるように、ヌクレアーゼは、内因性アルブミン遺伝子を切断する。アルブミン特異的ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第９，１５０，８４７号；ならびに米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号および同第２０１５００５６７０５号に記載されている。

送達
本明細書に記載される構築物（および／またはヌクレアーゼ）は、任意の細胞型、好ましくは脾臓または二次リンパ節に、任意の適切な手段によってｉｎ ｖｉｖｏで送達され得る。同様に、標的化組み込みのためにヌクレアーゼと組み合わせて使用される場合、ヌクレアーゼは、例えば、非ウイルスベクター（複数可）、ウイルスベクター（複数可）を使用してポリヌクレオチドおよび／もしくはタンパク質形態で、ならびに／またはＲＮＡ形態で、例えばｍＲＮＡとして、送達され得る。

核酸の非ウイルス送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、脂質ナノ粒子、イムノリポソーム、他のナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強性の取込みが含まれる。例えばＳｏｎｉｔｒｏｎ ２０００系（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）もまた、核酸の送達に使用され得る。さらなる例示的な核酸送達系には、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によって提供されるものが含まれる（例えば、ＵＳ６００８３３６を参照のこと）。

好ましい実施形態では、発現構築物はＡＡＶベクターである。必要に応じたヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ形態で、または１つもしくは複数のウイルスベクター（ＡＡＶ、Ａｄなど）を使用して投与されてもよい。投与は、ポリヌクレオチドが所望の標的細胞に送達される任意の手段によってであり得る。ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの両方の方法が企図される。末梢血管における静脈内注射は、投与の好ましい方法である。他のｉｎ ｖｉｖｏ投与様式には、例えば、リンパ節、骨髄、血漿、リンパ系、および脾臓を含むＢ細胞を含む組織への直接注射が含まれる。

１つよりも多いポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載される構築物およびポリヌクレオチド形態のヌクレアーゼ）の送達を含む系では、２つまたはそれよりも多くのポリヌクレオチドが、１つまたは複数の同じおよび／または異なるベクターを使用して送達される。例えば、ポリヌクレオチド形態のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡの形態で送達され得、本明細書に記載されるＢ細胞特異的構築物は、他のモダリティ、例えば、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）、ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、リポソーム、脂質ナノ粒子、ナノ粒子などを介して送達され得る。

薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、一部決定される。従って、以下に記載されるような、医薬組成物の広範な種々の適切な製剤が利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照のこと）。

投与される発現カセット（ならびに任意選択のヌクレアーゼおよび／または改変された細胞）の有効量は、患者ごとに変動する。従って、有効量は、組成物（例えば、細胞）を投与する医師によって最良に決定され、適切な投薬量は、当業者によって容易に決定され得る。治療的ポリペプチドの血清、血漿または他の組織レベルの分析、および投与前の初期レベルとの比較は、投与されている量が低すぎるか、正しい範囲内か、高すぎるかを決定できる。初回および引き続く投与のための適切なレジームも変動し得るが、初回投与とその後の必要に応じた引き続く投与によって代表される。引き続く投与は、毎日から毎年から数年ごとまでの範囲の、変動する間隔で投与され得る。当業者は、適切な免疫抑制技術が、送達ベクターの免疫抑制によって形質導入の阻害または遮断を回避するために推奨され得ることを理解する。例えば、Ｖｉｌｑｕｉｎら、（１９９５年）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、６巻：１３９１〜１４０１頁を参照のこと。

ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方の投与のための製剤には、液体または乳化された液体中の懸濁液（例えば、遺伝子改変された細胞、リポソーム、脂質ナノ粒子またはナノ粒子の）が含まれる。活性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合性の賦形剤と混合される場合が多い。適切な賦形剤には、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せが含まれる。さらに、組成物は、微量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬を含有し得る。

用途
本明細書に開示される方法および組成物は、疾患において欠如または欠損している産物、またはそうでなければ疾患を処置もしくは予防する産物を発現する導入遺伝子の提供によって、任意の疾患に関する治療を提供するためである。細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで改変されてもよく、ｅｘ ｖｉｖｏで改変されて、その後対象に投与されてもよい。このように、方法および組成物は、そのような遺伝疾患の処置および／または予防を提供する。さらに、本明細書に開示される方法および組成物は、これらの細胞が、改変された毒性、抗体産生、および／またはプロセシング特徴を示すように、Ｂ細胞の改変を可能にする。

以下の実施例は、必要に応じて使用されるヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、本開示の例示的な実施形態を含む。これが例証のみを目的としており、他のヌクレアーゼ、例えば、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、ならびに／または操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）の天然に存在するＤＮＡ結合ドメイン（naturally occurring of engineered homing endonucleases (meganucleases) DNA-binding domains）および異種切断ドメインの融合物、ならびに／またはメガヌクレアーゼおよびＴＡＬＥタンパク質の融合物が使用され得ることが理解される。さらに、本明細書に記載される発現構築物を（ＡＡＶ以外の）他のベクター上に備え、不十分なタンパク質産生によって引き起こされる障害の処置および／または予防において同じ結果を生じさせ得ることが理解される。

（実施例１）
方法
細胞培養
凍結したヒト末梢血ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｂ細胞分化培養系（図１を参照のこと）は、以前に記載されている（Jourdanら、同書）。全ての培養は、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）、および１０％ウシ胎児血清（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）中で実施した。

細胞を２４ウェルプレートにおいて、培養培地０．５ｍＬ中でウェルあたり２．０Ｅ＋５細胞の密度で培養した。細胞を解凍して、抗Ｈｉｓ Ａｂ（５μｇ／ｍＬ）、ＯＤＮ（１０μｇ／ｍＬ）、ｓＣＤ４０Ｌ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＢ細胞活性化培地中で４日間培養した。培養４日目に、細胞を回収し、上清を収集し、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、次いで、ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（４０〜５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有する形質芽球（ＰＢ）生成培地に移した。培養７日目に、細胞を回収し、上清を収集し、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、次いで、ＩＬ−６（４０〜５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮ−α（５００Ｕ／ｍＬ）を含有する形質細胞（ＰＣ）生成培地に移した。培養１０日目に、細胞を回収し、上清を収集した。

Ｂ細胞遺伝子改変
ＺＦＮ試薬：
ＺＦＮを、ＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ、ＳＢＳ５３９０９、およびＳＢＳ５３８８５、米国特許出願公開第ＵＳ−２０１７−０２１１０７５−Ａ１を参照のこと）、ＣＣＲ５（ＳＢＳ８２６６およびＳＢＳ８１９６、米国特許第７，９２５，９２１号を参照のこと）、およびＡＡＶＳ１（ＳＢＳ３００３５およびＳＢＳ３００５４、米国特許第８，１１０，３７９号を参照のこと）を標的とするように設計した。ＣＣＲ５およびＡＡＶＳ１ ＺＦＮコード配列を、挿入された遺伝子配列の３’に６４個のアデニン配列を含有する改変されたバージョンのプラスミドｐＧＥＭ４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）（Boczkowskiら（２０００年）Canc Res ６０巻：１０２８〜１０３４頁）にクローニングし、これをＳｐｅＩ消化によって線形にし、ｍＲＮＡ合成のための鋳型を生成した。ＴＲＡＣ ＺＦＮ ｍＲＮＡを、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ ＰＦＸ ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、ＺＦＮコード配列のＰＣＲ増幅を介して線形ＤＮＡ鋳型（各ＺＦＮについて１つ）から産生した。ＰＣＲ産物を、ｍＲＮＡ合成の鋳型として使用した。ｍＲＮＡを、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵＬＴＲＡキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、製造元のプロトコールに従って調製した。

簡潔に述べると、ＺＦＮをコードするＤＮＡ １．０μｇを、ｍＲＮＡ合成の鋳型として使用し、供給された緩衝液中、３７℃で２時間インキュベートした後、キットで供給されたＤＮアーゼにより消化した。ｉｎ ｖｉｔｒｏポリ−Ａテーリング反応は、ポリ−ＴテールがＴＲＡＣ鋳型のＰＣＲ生成の際にＤＮＡ鋳型に取り込まれていることから実施しなかった。ＡＡＶＳ１およびＣＣＲ５鋳型は、ベクター中にポリ−Ｔ鋳型を含有する。次いで、ｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、製造元のプロトコールに従って精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）において定量した。ｍＲＮＡ鋳型のために使用したプライマーは、フォワードプライマー：５’ＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧ（配列番号１）およびリバースプライマー：５’ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧ（配列番号２）であった。

ＡＡＶベクター：
全てのＡＡＶベクターを、以下に記載するように、Ｓａｎｇａｍｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓで産生した。ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、およびＴＲＡＣのためのＡＡＶドナー鋳型は、その標的遺伝子座に対する相同性アームを含有した。ＡＡＶＳ１は、長さがそれぞれ、８０１および５６８塩基対の左および右の相同性アームを有した。ＣＣＲ５は、長さがそれぞれ、４７３および１４３１塩基対の左および右の相同性アームを有した。ＴＲＡＣは、長さがそれぞれ、９２５および９８９塩基対の左および右の相同性アームを有した。プロモーター、ＧＦＰ配列、およびヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｈＧＨｐＡ）を含むＧＦＰ発現カセットを、右および左の相同性アーム間でクローニングした。プロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）またはＢ細胞特異的（ＥＥＫ）プロモーターのいずれかであった。Ｂ細胞特異的（ＥＥＫ）プロモーターは、ヒトκ軽鎖プロモーターの上流の３’−エンハンサー、ＭＡＲ、およびイントロンエンハンサーからなった（Luoら（２００９年）Blood １１３巻：１４２２〜１４３１頁）。ＴＲＡＣドナー鋳型をｐＡＡＶベクターにクローニングした。ＡＡＶＳ１およびＣＣＲ５ドナー鋳型を、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に由来するカスタム化したプラスミドｐＲＳ１６５（Lombardoら（２０１１年）Nat Methods ８巻：８６１〜８６９頁；Wangら（２０１２年）Genome Res ２２巻：１３１６〜１３２６頁）にクローニングした。ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）を使用して、トリプルトランスフェクション法を使用してＡＡＶベクターとしてのパッケージングを可能にした（XiaoおよびSamulski（１９９８年）J. Virol ７２巻：２２２４〜２２３２頁）。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞を、１０層のＣｅｌｌＳＴＡＣＫチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）に播種し、８０％の密度に３日間成長させ、次いで、リン酸カルシウム法を使用して、ＡＡＶ２ Ｒｅｐおよび血清型特異的Ｃａｐ遺伝子を発現するＡＡＶヘルパープラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド、およびＩＴＲ含有ドナーベクタープラスミドをトランスフェクトした。３日後、細胞を３ラウンドの凍結／融解によって溶解し、細胞デブリを遠心分離によって除去した。ＡＡＶベクターを、ポリエチレングリコールを使用して溶解物から沈殿させ、塩化セシウム勾配での一晩の超遠心分離によって精製した。ベクターを透析および濾過滅菌によって製剤化した。

ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ ＥＬＩＳＡ：
Ｂ細胞活性化、形質芽球生成、および形質細胞生成培養ステップの終了時に上清を収集した。ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡを、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）を使用して、製造元のプロトコールに従ってアッセイした。簡潔に述べると、上清をプレートに添加し、室温で揺り動かしながら１時間インキュベートした後、キットに提供される緩衝液で４回洗浄した。キットで提供される検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした後、キットに提供される洗浄緩衝液で４回洗浄した。キットで提供される西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を添加し、室温で３０分間インキュベートした後、キットに提供される緩衝液で４回洗浄した。キットで提供されるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、３０分間発色させた。キットで提供される停止溶液で反応を停止させ、プレートリーダーを使用して、４５０ｎＭでの吸光度を読み取った。

（実施例２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養Ｂ細胞における抗体産生
ＣＤ１９＋ Ｂ細胞を解凍し、上記のようにおよび図１に例証するように培養した。培養上清を、ｔ４、ｔ７、およびｔ１０日目に収集し、総ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡを、上記のようにＥＬＩＳＡによって検出した。

結果（図２Ａ〜２Ｃ）は、細胞が、抗体産生のサイトカイン刺激に応答して、予想されるように、抗体を産生していることを実証した。

（実施例３）
ｍＲＮＡのエレクトロポレーション
培養Ｂ細胞を、導入遺伝子（ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡで処置し、ｍＲＮＡの導入のための最善の時間枠を決定した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞（２．０Ｅ＋０５細胞）に、ｔ０が細胞を解凍した日であるｔ０、ｔ１、ｔ２、またはｔ３日目にＧＦＰ ｍＲＮＡ ２μｇをエレクトロポレートした（図１）。エレクトロポレートした細胞を、図４に示すようにゲーティングを行うＦＡＣＳ分析によって分析した。結果（図３Ａ〜３Ｄ）から、ｔ２日目でのエレクトロポレーションによって、最高のＧＦＰ発現が得られたことが実証され、この時間枠を後続の研究のために選択した。

（実施例４）
培養Ｂ細胞のヌクレアーゼ切断
３つの遺伝子座、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、およびＴＣＲＡに対して特異的なＺＦＮを使用して、培養Ｂ細胞におけるそれらの標的を切断した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞を解凍し、Ｂ細胞活性化培地中で２日間培養した。細胞を、ＤＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＢＴＸｐｒｅｓｓ高性能エレクトロポレーション溶液（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）に、２．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの最終密度に再懸濁した。細胞（１００μＬ）およびエレクトロポレーション溶液を、ＺＦＮ ｍＲＮＡ（４μｇ）と共に混合した後、ＢＴＸ ＥＣＭ８３０矩形波エレクトロポレーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）中、ＭＯＳ ９６マルチウェルエレクトロポレーションプレート２ｍｍ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）においてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を２４ウェルプレートにおけるＢ細胞活性化培地に２日間移した。２日後、細胞を回収し、上清を収集し、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、次いで、形質芽球生成培地に移した。３日後、細胞を回収し、上清を収集し、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、次いで、形質細胞生成培地に移した。細胞を、ディープシークエンシングによるＺＦＮ活性の分析のために、ｔ４、ｔ７、およびｔ１０日目に、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離のために収集した。簡潔に述べると、ＣＤ１９＋Ｂ細胞（２．０Ｅ＋５細胞）をＺＦＮ ｍＲＮＡ（４μｇ）と混合した後、エレクトロポレーションした。

ＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ）、ＣＣＲ５、およびＡＡＶＳ１遺伝子座でのＺＦＮ活性を測定するために、ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって製造元の指示に従って単離した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）１００ナノグラムを使用した。次いで、ＡＡＶＳ１およびＴＲＡＣ遺伝子座の２ステップＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して実施した。３ステップＰＣＲをＣＣＲ５遺伝子座のために使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシークエンシングは、各遺伝子座でインデルを測定した。各遺伝子座に関して使用したプライマーを以下に示す。

ＡＡＶＳ１プライマー：
ＡＡＶＳ１フォワード
ＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＣＣＧＧＴＴＡＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴ（配列番号３）

ＡＡＶＳ１リバース
ＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＧＡＣＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＴ（配列番号４）。

ＡＡＶＳ１アンプリコンは、
５’ＮＮＮＮＧＡＣＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＴＡＡＧＧＡＴＧＧＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＧＴＧＧＣＣＣＣＡＣＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＴＡＡＡＡＧＴＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＣＧＧＮＮＮＮ（配列番号５）であった。

ＣＣＲ５プライマー：
ＣＣＲ５フォワード１：ＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＧＣ（配列番号６）、

ＣＣＲ５リバース１：ＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣ（配列番号７）、

ＣＣＲ５フォワード２：ＣＴＧＣＣＴＣＡＴＡＡＧＧＴＴＧＣＣＣＴＡＡＧ（配列番号８）、

ＣＣＲ５リバース２：ＣＣＡＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＡＡＡＴＴＣＣ（配列番号９）、

ＣＣＲ５フォワード３：ＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＧＣＣＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧ（配列番号１０）、

ＣＣＲ５リバース３：ＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＴ（配列番号１１）。

ＣＣＲ５アンプリコンは、
５’ＮＮＮＮＮＧＣＣＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴＴＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＧＣ（配列番号１２）であった。

ＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ）プライマー：
ＴＣＲＡフォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’ＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＣＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＣ（配列番号１３）

ＴＣＲＡリバース：５’ＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＣ（配列番号１４）

ＴＣＲＡアンプリコンは、
５’ＮＮＮＮＣＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＧ（配列番号１５）であった。

これらの研究の結果を、図５Ａ〜５Ｃに示し、ヌクレアーゼが、これらの方法を使用して培養Ｂ細胞において活性であったこと、および８０％より多くの改変が多数の遺伝子座で達成されたことを実証する。

一過性の（一晩）低温ショック（米国特許第８，７７２，００８号を参照のこと）がヌクレアーゼの切断活性に及ぼす影響を試験する実験も同様に行った。これらの研究において、０．７５〜６μｇの範囲の投入ｍＲＮＡ量を使用した。エレクトロポレーション後、培養物を分割し、１つの部分を３７℃のインキュベーターに４日間入れた。第２の群を３０℃のインキュベーターに一晩入れ、次いで、３７℃のインキュベーターに３日間移した。ディープシークエンシングを実施して、ヌクレアーゼ切断の結果として検出された％インデルを測定した。

結果（図６Ａ〜６Ｃに示す）は、低温ショック手順が全体的な切断活性を増加させることを実証した。

（実施例５）
Ｂ細胞ＡＡＶ血清型形質導入の比較
導入遺伝子（ＧＦＰ）発現カセットを含むＡＡＶウイルスを使用して、異なるＡＡＶ血清型が培養Ｂ細胞を形質導入する能力を比較した。簡潔に述べると、細胞を解凍し、２４ウェルプレートにおけるＢ細胞活性化培地中、２．０Ｅ＋５細胞／ウェルの密度で２日間培養した。細胞を収集し、計数し、次いで、２４ウェルプレートにおいて２．０Ｅ＋５細胞／ウェルの密度で播種した。Ｂ細胞に、ＡＡＶ血清型２、５、６、８、および９を、２．４Ｅ＋６、１．２Ｅ＋６、６．０Ｅ＋５、３．０Ｅ＋５ベクターゲノム（ｖｇ）／細胞のベクター用量で形質導入した。ＡＡＶベクターゲノムは、ＣＭＶプロモーター駆動性ｅＧＦＰ発現カセットおよび逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含有した、図７Ｂを参照のこと。ＡＡＶベクターは、Ｓａｎｇａｍｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓで産生した。細胞培養物（２４ウェルプレートの単一ウェル中５００μＬからの２５μＬ）を収集し、ｔ４、ｔ７、およびｔ１０日目にＤＰＢＳ（１７５μＬ）と混合し、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してＧＦＰ発現に関して分析した。データをＩｎＣｙｔｅ、バージョン２．５（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して分析した。

結果（図７Ａ）は、形質芽球および形質細胞への分化プロセスの間に培養Ｂ細胞を形質導入することにおいて、ＡＡＶ６が最も効率的なＡＡＶ血清型であることを実証した。

（実施例６）
ヌクレアーゼ駆動性標的化組み込み
次いで、上記のヌクレアーゼを、導入遺伝子ドナー（ＧＦＰ、対象において欠如または欠損しているタンパク質、および／または目的の治療抗体）と組み合わせて使用し、系がドナーのゲノムへの標的化組み込みを支持する能力を試験した。いくつかの例示的なドナーを、相同性アームが隣接するＧＦＰ導入遺伝子を含むＧＦＰで作製したが（図８）、ここで該アームは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、またはＴＣＲＡ切断標的のいずれかを囲む領域に対して相同性を有していた。さらに、２つの異なるプロモーター、ＰＧＫまたはＥＥＫのいずれかを試験した。

ＣＤ１９＋Ｂ細胞を解凍し、Ｂ細胞活性化培地中で２日間培養した。ＺＦＮ ｍＲＮＡとＡＡＶドナーまたは同じ遺伝子座（ＡＡＶＳ１、ＴＣＲＡ、ＣＣＲ５、アルブミン、ＨＰＲＴなど）を標的化するｍＲＮＡドナーの組合せを使用した。細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＢＴＸｐｒｅｓｓ高性能エレクトロポレーション溶液（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）に、２．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの最終密度に再懸濁した。細胞（１００μＬ）およびエレクトロポレーション溶液を、ＺＦＮ ｍＲＮＡ（４μｇ）と共に混合した後、ＢＴＸ ＥＣＭ８３０矩形波エレクトロポレーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）中、ＭＯＳ ９６マルチウェルエレクトロポレーションプレート２ｍｍ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）においてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を２４ウェルプレートにおけるＢ細胞活性化培地０．５ｍＬに移した。次いで、標的遺伝子座に関して相同なドナー鋳型を含有するＡＡＶを、２．４×１０^６ｖｇ／細胞で添加した。プレートを２分間穏やかに揺り動かした。２日後、細胞培養物を回収し、細胞培養物２５μＬを収集して、フローサイトメトリー分析のためにＤＰＢＳ（１７５μＬ）と混合し、残りの細胞培養物を卓上型遠心分離機で遠心沈降させ、上清を収集し、細胞をＤＰＢＳで洗浄した後、形質芽球生成培地に移した。３日後、細胞培養物を回収し、細胞培養物２５μＬを収集し、フローサイトメトリー分析のためにＤＰＢＳ（１７５μＬ）と混合し、残りの細胞培養物を卓上型遠心分離機で遠心沈降させ、上清を収集し、細胞をＤＰＢＳで洗浄後、形質細胞生成培地に移した。３日後、実験を終了し、細胞培養物（２４ウェルプレートの単一ウェル中５００μＬからの２５μＬ）を収集し、フローサイトメトリー分析のためにＰＢＳ（１７５μＬ）と混合し、残りの細胞培養物を卓上型遠心分離機で遠心沈降させ、上清を収集し、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ｇＤＮＡのために回収した。

フローサイトメトリーのために、細胞培養物（２４ウェルプレートの単一ウェル中５００μＬからの２５μＬ）を収集し、ｍＲＮＡおよびＡＡＶドナーの投与後２、５、および８日目にＰＢＳ（１７５μＬ）と混合した。ＧＦＰ発現を、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。データをＩｎＣｙｔｅ、バージョン２．５（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して分析した。結果（図９Ａ〜９Ｃ）は、全ての場合においてＧＦＰ導入遺伝子の組み込みがあったこと、および特異的ヌクレアーゼの使用によって、ＧＦＰ陽性細胞の最高のパーセントがもたらされたことを実証している。

ＣＣＲ５およびＡＡＶＳ１ドナーの標的組み込みを測定するために、ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）によって、製造元の指示に従って単離した。ｇＤＮＡ １００ナノグラムを使用し、次いで、３ステップＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）およびＨｏｔＳｔａｒｔＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して実行した。Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシークエンシングは、各遺伝子座での標的組み込みを測定した。各ステップのプライマーを以下に示す。

ＡＡＳＶ１プライマー：
ステップ１ ＰＣＲプライマー：
ＡＡＶＳ１フォワード１：５’ＣＧＧＡＡＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＴＡＡＣＧ（配列番号１６）。

ＡＡＶＳ１リバース１：５’ＧＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＴＡＡＧＧＡＡＴＣＴＧ（配列番号１７）。

ステップ２ ＰＣＲプライマー：
ＡＡＶＳ１フォワード２：５’ＣＧＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＡＧＴＣＣＧ（配列番号１８）。

ＡＡＶＳ１リバース２：５’ＧＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＴＡＡＧＧＡＡＴＣＴＧ（配列番号１７）。

ステップ３ ＰＣＲプライマー：
ＡＡＶＳ１フォワード３：５’ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴＴＡＴＣＴＧ（配列番号１９）。

ＡＡＶＳ１リバース３：５’ＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＴＡＡＧＧＡＡＴＣＴＧ（配列番号２０）。

ＡＡＶＳ１野生型アンプリコン配列：
５’ＮＮＮＮＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＡＧＴＣＴＣＣＴＧＡＴＡＴＴＧＧＧＴＣＴＡＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＡＧＡＴＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＣ（配列番号２１）。

ＡＡＶＳ１ ＧＦＰ−ＴＩ配列（配列番号２２）：
５’ＮＮＮＮＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴＴＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＡＴＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＣ

ＣＣＲ５プライマー
ステップ１ ＰＣＲプライマー：
ＣＣＲ５フォワード１：５’ＧＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＴ（配列番号１２）。

ＣＣＲ５リバース１：５’ＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣ（配列番号７）。

ステップ２ ＰＣＲプライマー：
ＣＣＲ５フォワード２：５’ＧＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＴ（配列番号１２）。

ＣＣＲ５リバース２：５’ＣＣＡＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＡＡＡＴＴＣＣ（配列番号９）。

ステップ３ ＰＣＲプライマー：
ＣＣＲ５フォワード３：５’ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＧＣＣＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧ（配列番号２３）。

ＣＣＲ５リバース３：５’ＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＴ（配列番号１１）。

ＣＣＲ５アンプリコン野生型配列：
５’ＮＮＮＮＮＧＣＣＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴＴＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＧＣ（配列番号１２）

ＣＣＲ５ ＴＩ−ＧＦＰ配列：
５’ＮＮＮＮＮＧＣＣＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＧＣ（配列番号２４）

結果（図１０Ａおよび１０Ｂに示す）は、これらの遺伝子座に関して３８％〜５０％の間の標的化組み込みを実証した。

一致していない導入遺伝子ドナーを使用した実験も実施した。これらの一致していないドナーにおける相同性アームは、共導入した（co-introduced）ヌクレアーゼのヌクレアーゼ標的部位に隣接する配列と相同性を有さなかった。例えば、ＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ）特異的ＺＦＮを、ＣＣＲ５相同性アームを含むＧＦＰ導入遺伝子ドナーと組み合わせて使用した。このドナーを、ＡＡＶＳ１特異的ＺＦＮとも組み合わせて使用した。一致するＺＦＮ標的部位およびドナー相同性アームについて組み込みの増加が見出されたことは、少なくとも一部には、導入遺伝子の組み込みが相同性依存的組換え反応に依拠することを示している。結果（図１１）は、ドナーに、ヌクレアーゼ切断部位を囲む領域に一致する相同性アームが隣接する場合、ドナー組み込みの増加が起こることを実証したが、このように、培養Ｂ細胞が標的化組み込みに関して主に相同組換えに依拠することを示している。組み込みは、一致していないドナーでは低レベルで認められ、組み込みが同様にＮＨＥＪを使用する末端捕捉によって起こり得ることを示している。

２つの代替のプロモーターを含むドナー構築物を形質導入した細胞も同様に比較した。ＧＦＰ発現を上記のようにフローサイトメトリーによって分析し（図１２を参照のこと）、結果は、ＥＥＫプロモーターが、Ｂ細胞においてＰＧＫプロモーターよりも高いＧＦＰ発現を駆動することを実証した。

様々な量のＡＡＶ−ドナー構築物を比較する滴定を、一定用量のＺＦＮ ｍＲＮＡを使用して行った。培養Ｂ細胞を、エレクトロポレーションによってＴＣＲＡ（ＴＲＡＣ）特異的ＺＦＮ４μで処置し、次いで、３．０Ｅ＋０５〜２．４Ｅ＋０６ｖｇ／細胞の範囲のドナーＡＡＶを形質導入した。さらに、２つのプロモーターをこれらの条件で同様に比較した。結果（図１３Ａ〜１３Ｄ）は、より低いドナー濃度では、ＥＥＫプロモーターが、Ｂ細胞の形質芽球および形質細胞への進行の間に８倍を超える希釈でＧＦＰ発現を維持したことを実証した。実験はまた、標的化組み込みを駆動するためのヌクレアーゼの使用によって、Ｂ細胞においてより高いＧＦＰ発現が生じたことも確認した。

（実施例７）
ゲノム編集の間の抗体発現
ＩｇＧおよびＩｇＭレベルを、ＺＦＮ対および同様にＧＦＰドナーの送達のためにエレクトロポレーションを受けた培養Ｂ細胞に関して上記のようにＥＬＩＳＡによって分析した。結果（図１４および１５）は、Ｂ細胞によって産生された抗体レベルがエレクトロポレーションによって、およびエレクトロポレーション後のＡＡＶ−ドナー形質導入によってあまり影響を受けなかったことを実証する。

（実施例８）
培養Ｂ細胞におけるＡＡＶの潜在的ブースター機能
抗ＡＡＶ抗体を発現する培養Ｂ細胞において、Ｂ細胞が反応性であるＡＡＶ血清型にそのＢ細胞を再曝露すると、「ブースター」効果を引き起こし、抗ＡＡＶ抗体産生の増加を誘導し得る可能性がある。１人のヒトドナーからの１つのＣＤ１９＋Ｂ細胞集団は、ＡＡＶ２による処置後のＩｇＭ分泌の増加を実証した。抗ＡＡＶ２抗体は、ＡＡＶ２が広く存在することにより、ヒト集団においてロバストな保有率を有することが知られている。このように、本研究では、抗ＡＡＶ２抗体を潜在的に発現する１人のヒトドナーからのＣＤ１９＋Ｂ細胞集団は、ＡＡＶ２に曝露後、ＩｇＭ産生の増加を誘導することが示されたが、他のＡＡＶ血清型では誘導しなかった（図１６）。

抗体発現増加の潜在的機構を図１７に示し、目的の導入遺伝子の発現のためにこの系の使用を実証する。

（実施例９）
ｉｎ ｖｉｖｏでＡＡＶ２曝露後の導入遺伝子発現の強化
導入遺伝子ドナーカセットを、Ｂ細胞プロモーターの下流で導入遺伝子の挿入のために構築する。Ｂ細胞を、特異的ヌクレアーゼ、および目的の導入遺伝子に連結させた抗体特異的プロモーターを含むドナー構築物で、ｅｘ ｖｉｖｏで処置した。この作業のために選択したＢ細胞は、抗ＡＡＶ２抗体を産生することが以前に確認されている。細胞を対象に再導入し、短期間生着させた後、対象を、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ２ペプチドで処置する。ＡＡＶ追加刺激（boost）は、抗体プロモーターを上方調節し、導入遺伝子発現において増加を引き起こす。

（実施例１０）
Ｂ細胞特異的抗体の標的化組み込みによるＢ細胞改変
導入遺伝子ドナーカセット（ＡＡＶ、ｍＲＮＡ、プラスミドなど）を、抗体が、ＥＲＴによって送達されるタンパク質（または自己抗原）に対して望ましくない抗体（例えばインヒビター）を産生するＢ細胞、例えばＦ９などの凝固因子に対する抗体（抗Ｆ９抗体）を産生するＢ細胞に対して特異的である抗体コード導入遺伝子を挿入するために構築する。ドナーカセットは、ヌクレアーゼ標的遺伝子座（例えば、アルブミン、ＴＣＲＡ、ＣＣＲ５、ＡＡＶＳ１など）に対する相同性アームを含むことができ、該カセットを、適したヌクレアーゼと組み合わせてｉｎ ｖｉｖｏで、それを必要とする対象（抗Ｆ９抗体を有する血友病患者）に投与する、および／またはｅｘ ｖｉｖｏでＢ細胞集団（成熟、幹、および／またはＢ細胞前駆細胞集団）に投与する。

ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ改変後、抗体産生Ｂ細胞は標的化抗体を分泌し、その抗体は、望ましくない抗体を産生するＢ細胞に結合する。次いで、これらの標的化抗体は、抗体依存的細胞傷害性細胞の動員および活性化を通して、または補体媒介性溶解を通して溶解を媒介する。このように、患者において、これらの導入されたＢ細胞は、例えばＥＲＴによって送達されるタンパク質または自己抗原に対する望ましくない抗体を産生している内因性Ｂ細胞の低減を引き起こす。

本明細書で言及される全ての特許、特許出願および刊行物は、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。

本開示は、理解の明確さを目的として例示および例としていくらか詳細に提供されてきたが、種々の変化および改変が、本開示の精神または範囲から逸脱することなく実施され得ることが、当業者に明らかである。従って、上述の説明および例は、限定として解釈すべきではない。

Claims (18)

1. （ａ）１つまたは複数の導入遺伝子、ならびに／または
   （ｂ）（ｉ）Ｂ細胞受容体遺伝子および／または（ｉｉ）胚中心における細胞相互作用を改変する挿入および／もしくは欠失、ならびに／または
   （ｃ）病原体の感染またはがんの調節に関連する任意のＢ細胞機能の抑制を阻害する改変
   を含む１つまたは複数の改変を含む、遺伝子改変されたＢ細胞。
2. 前記導入遺伝子の１つまたは複数が、前記Ｂ細胞の内因性遺伝子座に組み込まれる、請求項１に記載の遺伝子改変されたＢ細胞。
3. 前記導入遺伝子が、血友病、リソソーム蓄積症を有する対象において欠如または欠損しているタンパク質、治療抗体、および／または治療タンパク質に融合した場合に血液脳関門の通過を促進するペプチドをコードする、請求項１または請求項２に記載の遺伝子改変されたＢ細胞。
4. 前記治療抗体が、酵素補充療法（ＥＲＴ）によって提供されたタンパク質に対する阻害性抗体を生成する、または自己免疫疾患において作用するＢ細胞に対して特異的である、請求項３に記載の遺伝子改変されたＢ細胞。
5. 前記治療抗体が、抗腫瘍応答を減弱させることができる調節Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）に対して特異的である、請求項３に記載の遺伝子改変されたＢ細胞。
6. ＥＲＴによって提供される前記タンパク質が凝固因子である、請求項４に記載の遺伝子改変されたＢ細胞。
7. 前記凝固因子が第ＩＸ因子（Ｆ９）である、請求項６に記載の遺伝子改変されたＢ細胞。
8. 前記導入遺伝子が、該導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の遺伝子改変されたＢ細胞。
9. 前記プロモーターが、系列特異的Ｂ細胞プロモーターである、請求項８に記載の遺伝子改変されたＢ細胞。
10. 導入遺伝子が前記細胞において発現される、請求項１から９のいずれかに記載の遺伝子改変されたＢ細胞。
11. 前記導入遺伝子が、ＡＡＶＳ１、ＴＣＲＡ、ＣＣＲ５、またはアルブミンからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座に組み込まれる、請求項１０に記載の遺伝子改変されたＢ細胞。
12. 遺伝子改変された造血幹細胞の子孫である、請求項１から１１のいずれかに記載の遺伝子改変されたＢ細胞。
13. タンパク質の産生を必要とする対象においてタンパク質を産生する方法であって、請求項１から１２のいずれかに記載のＢ細胞の集団を該対象に投与するステップを含む、方法。
14. 前記タンパク質が、前記対象において抗体応答をモジュレートする、請求項１３に記載の方法。
15. 対象においてタンパク質を産生する方法における請求項１から１２のいずれかに記載の遺伝子改変されたＢ細胞の使用であって、該方法が、該Ｂ細胞が該対象において該タンパク質を産生するような条件下で、該Ｂ細胞またはその前駆細胞を該対象に導入するステップを含む、使用。
16. 前記タンパク質が、血友病またはリソソーム蓄積症または自己免疫疾患などの疾患または障害において欠如または欠損しているタンパク質であるか、またはＥＲＴにおいて供給される治療タンパク質に対する抗体を産生するＢ細胞に対して特異的な抗体である、請求項１５に記載の使用。
17. ＥＲＴにおいて供給される前記治療タンパク質が、第ＩＸ因子（Ｆ９）などの凝固因子であり、前記抗体が、抗凝固因子（抗Ｆ９）抗体を産生するＢ細胞に対して特異的である、請求項１６に記載の使用。
18. 請求項１から１２のいずれかに記載のＢ細胞の１つまたは複数を含むキット。