BR112019015355A2 - modificação genética de células b - Google Patents

modificação genética de células b Download PDF

Info

Publication number
BR112019015355A2
BR112019015355A2 BR112019015355A BR112019015355A BR112019015355A2 BR 112019015355 A2 BR112019015355 A2 BR 112019015355A2 BR 112019015355 A BR112019015355 A BR 112019015355A BR 112019015355 A BR112019015355 A BR 112019015355A BR 112019015355 A2 BR112019015355 A2 BR 112019015355A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
cells
cell
protein
genetically modified
fact
Prior art date
Application number
BR112019015355A
Other languages
English (en)
Inventor
E Riley Brigit
C Holmes Michael
AMORA Rainier
Original Assignee
Sangamo Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sangamo Therapeutics Inc filed Critical Sangamo Therapeutics Inc
Publication of BR112019015355A2 publication Critical patent/BR112019015355A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4612—B-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

neste pedido estão descritos construtos usados para a modificação genética de células b e para a expressão de um transgene e/ou para a modulação da função das células b.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CODIFICAÇÃO GENÉTICA DE CÉLULAS B.
Referência Remissiva a Pedidos Relacionados
[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US N° 62/450,917 depositado em 26 de janeiro de 2017, cuja íntegra está aqui incorporada a título de referência.
Campo Técnico
[0002] A presente invenção reside na área de terapia genética, particularmente na edição de genomas e distribuição vetorizada de construtos codificadores de transgenes para expressão de proteínas benéficas (terapêuticas) em células B.
Antecedentes
[0003] A terapia genética pode ser usada para modificar geneticamente uma célula para ter um ou mais genes inativados e/ou para fazer com que a célula expresse um produto que antes não era produzido naquela célula (por exemplo, por meio de inserção de transgenes e/ou por meio de correção de uma sequência endógena). Exemplos de usos de inserção de transgenes incluem modificação mediada por nucleases incluindo a inserção de um ou mais genes codificando uma ou mais proteínas terapêuticas novas, incluindo anticorpos terapêuticos, inserção de uma sequência codificadora codificando uma proteína que esteja faltando na célula ou no indivíduo, inserção de um gene do tipo selvagem em uma célula contendo uma sequência gênica mutada, e/ou inserção de uma sequência que codifica um ácido nucleico estrutural tal como um microRNA ou siRNA. Estas técnicas também podem ser usadas para nocautear a expressão de um gene endógeno e/ou para alterar o pefil de toxicidade da célula. Vide, por exemplo, Patentes US Nos 9,394,545: 9,150,847; 9,206,404; 9,045,763; 9,005,973; 8,956,828; 8,936,936; 8,945,868; 8,871,905; 8,586,526; 8,563,314;
8,329,986; 8,399,218; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558;
7,067,317; 7,262,054; 7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925;
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 44/118
2/70
8,110,379; 8,409,861; Publicações de Patente US 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060063231;
20080159996; 20100218264; 20120017290; 20110265198;
20130137104; 20130122591; 20130177983 e 20130177960 e 20150056705.
[0004] As células B funcionam na imunidade humoral secretando anticorpos contra uma variedade de antígenos. Elas são células apresentadoras de antígeno (APC) profissionais e são ativadas por células T auxiliares para diferenciarem em células plasmáticas que produzem grandes quantidades de anticorpos antígeno-específicos. O desenvolvimento de células B ocorre tanto no fígado fetal como na medula óssea, e uma etapa crítica no desenvolvimento de células B é a produção de um receptor de células B (BCR), uma estrutura complexa compreendendo cadeias pesadas e cadeias leves únicas. O processo de produção de BCR inclui o rearranjo de vários segmentos gênicos de imunoglobulina (Ig) tanto nas cadeias pesadas quanto nas cadeias leves dos genes do BCR durante a fase pro-células B de maturação das células B. As pro-células B transformam-se em pré-células B depois do pareamento bem-sucedido das cadeias pesadas e cadeias leves rearranjadas onde o pré-BCR produzido é expresso na superfície celular das pré-células B. Sinalização através do pré-BCR induz ainda o desenvolvimento de células B levando as pré-células B a aumentarem. Eventualmente, as pré-células B grandes interrompem a proliferação e ocorre um rearranjo adicional das cadeias leves levando à expressão de um IgM BCR único na superfície celular daquilo que agora é considerado uma célula B imatura. Estas células então deixam a medula óssea e circulam na periferia como células B transicionais.
[0005] A maturação das células B imaturas ocorre principalmente no baço onde também ocorre a seleção para que as células B produzindo anticorpos com alta afinidade para autoantígenos sejam destruídas (vide Naradikian et a/. (2014) in Drugs Targeting B-Cells in Auto
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 45/118
3/70 immune Diseases, Milestones in Drug Therapy (X. Bosch et al. (eds)) doi 10,1007/978-3-3-0348-0706-7__2, Springer Basel). As células B circulantes são capazes de penetrar os linfonodos secundários e o baço e adquirir antígeno proveniente de células dendríticas foliculares. Depois da entrada no linfonodo/baço e interação com as células dendríticas, as células B internalizam o antígeno e ele é processado de modo que fragmentos peptídicos do antígeno são apresentados via moléculas de MHC classe II às células T CD4+ cognatas. Estas células T foram previamente ativadas por um APC apesentando o mesmo antígeno. A interação entre células B e células T leva a inúmeros eventos, incluindo a ativação completa da célula T, resultando em proliferação da célula T. As células T então produzem citocinas que agem diretamente nas células B para induzir a proliferação de células B e troca de classe do anticorpo expresso na superfície das células B. As células B proliferantes se agrupam em regiões transitórias nos linfonodos e baço conhecidas como ‘centros germinativos'. Essas células B ativadas se diferenciam em células secretoras de um anticorpo particular (plasmoblasto ou célula plasmática) que parecer sofrer inúmeras divisões préprogramadas (tipicamente 5-6) antes de completarem seu estágio final de diferenciação para se tomarem células plasmáticas não proliferantes. Alternativamente, as células B ativadas saem do centro germinativo e se diferenciam em células B de memória (Zhang et al., (2016) Immunol Rev 270(1): 8-19).
[0006] Após a ativação, a cltidina desaminase induzida por ativação (AID) da enzima mutadora do genoma é expressa, o que leva à hipermutação somática nos genes do anticorpo e à recombinação com troca de classe (CSR) alterando a função efetora do anticorpo. A hipermutação somática ocorre no gene da região variável da imunoglobulina (IgV) para gerar um repertório de mutantes do anticorpo com afinidades variáveis para o antígeno (Klein and Heise (2015) CurrOpin Hematol 22(4): 379-387). Este processo ocorre na chamada ‘zona es
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 46/118
4/70 cura’ no centro germinativo. As células B diferenciadas migram para a ‘zona clara' onde células B produzindo anticorpos de afinidade mais alta competem pela ajuda do antígeno e/ou da célula T disponível para que elas recebam sinais de sobrevivência através dos seus receptores de células B. Células B produtoras de anticorpo de afinidade mais baixa não recebem esses sinais de sobrevivência porque elas não conseguem competir com suas irmãs células B produtoras de anticorpos de afinidade mais alta, e assim elas sofrem apoptose. As células B produtoras de anticorpos de afinidade mais alta podem então entrar novamente na zona escura para rodadas adicionais de proliferação e hlpermutação somática, podem sair do centro germinativo e se diferenciar em plasmoblastos ou podem se diferenciar em células B de memória de vida longa (Recaldin and Fear (2015) Clin and Exp Immunol 183:65-75).
[0007] Assim, em um processo muito complexo, as células B são induzidas a expressar grandes quantidades de anticorpos contra antígenos para proteção do corpo contra inúmeras ameaças em potencial. Curiosamente, existem inúmeros patógenos (por exemplo, parasitas, bactérias, vírus) que são capazes de destruir a resposta do anticorpo. Esses patógenos incluem inúmeros agentes responsáveis por um grande número de doenças humanas incluindo, porém sem limitação, Plasmodium, Schistosomia, Mycobacterium, HIV, HCV e HBV (Borhls and Richard (2015) BMC Immunology 16:15 doi 10,1186/s12865-0150079-y). Nem todos os mecanismos em jogo por trás da supressão mediada por patógeno da resposta do anticorpo são conhecidos, mas parece que certos patógenos induzem a produção de subtipos incomuns de células B, subtipos de células B estes que alteram o microambiente celular, levando à supressão tanto de células B como de células T. Por exemplo, já foi mostrado que o HBV interfere na estimulação através do receptor semelhante a Toll 9 (TLR9) de modo que as células dendríticas produzem IFN-α reduzido (que se sabe induzir as
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 47/118
5/70 células B a proliferarem e secretarem IgMs). Parece que o HBV pode inibir seletivamente a expressão de TLR9 em linfócitos B (Vincent et al. (2011) PLoS ΟΛ/Ε 6(10):e26315. doi:10,1371/journal.pone,0026315).
[0008] Durante a última década, estudos apresentaram evidências bem fundamentadas de subconjuntos distintos de células B imunorreguladoras em camundongos e seres humanos. Essas células B supressoras têm a capacidade de manter a tolerância imunológica e suprimir respostas autoimunes patológicas e respostas imunes inflamatórias, assim como de suprimir as respostas durante a vigilância imunológica contra o câncer, através da liberação de mediadores antiinflamatórios, tais como interleucina-10 (IL-10) e a expressão de moléculas inibidoras, tal como PD-L1. Esses estudos levaram à conclusão de que há um grupo de células B que têm um papel supressor na tolerância imunológica, e este grupo será doravante denominado células B reguladoras ou Bregs. Outros fenótipos associados a Bregs humanas incluem supressão de inflamação autoimune e um papel em tolerância a alérgenos. Estudos mais recentes demonstraram que as células B podem desempenhar papéis contraditórios na evolução do câncer. Por exemplo, células B CD1dh9hCD5+ produtoras de IL-10 isoladas de pacientes com CLL tratados com rituximab revelaram que a depleção de células B mediada por anti~CD20 enriqueceu principalmente um grupo de Breg. Postulou-se que as Bregs enriquecidas suprimiam a imunidade antitumoral necessária para a depuração de células tumorais ligados ao anti-CD20, fazendo com os pacientes desenvolvessem resistência a linfoma voltada para terapia anti-CD20 e/ou ocasionalmente reincidência como resultado da evolução melhorada do câncer (Bodogal et al., (2013) Cancer Res 73:2127-2138).
[0009] Achados de células B humanas modulam negativamente o crescimento tumoral foram observados quando a presença de linfócitos infiltrantes de tumor de células B CD20+ em câncer de ovário, carcinoma de pulmão nâo-pequenas células e câncer cervical estava relaci
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 48/118
6/70 onada à sobrevida melhorada e taxas de reincidência mais baixas. Estes estudos mostraram que células B infiltrantes de tumor estavam correlacionadas com resultados favoráveis. As Bregs podem suprimir diversos subtipos de células, inclusive células T, através da secreção de mediadores anti-inflamatórios, tal como IL-10, e podem facilitar a conversão de células T em células T reguladoras, dessa forma atenuando respostas imunológicas antitumorais. Os potenciais mecanismos subjacentes à imunidade antitumoral das células B pode envolver a secreção de citocinas efetoras, tal como IFN-y, por células B, o que poderia polarizar as células T para uma resposta Th1 ou Th2 ou promover respostas das células T através de seu papel como células apresentadoras de antígeno (Sarvaria et al. (2017) Ce// Mol Immunol 14(8):662674).
[0010] Entretanto, também foi mostrado que células B humanas favorecem a evolução do tumor. A presença de células B com STAT3 ativado em tecidos tumorais humanos pôde ser correlacionada com a severidade da angiogênese tumoral. A infiltração de células B CD19+ em pacientes com carcinoma de ovário metastático; ou a infiltração aumentada de células B CD20+ e CD138+ em pacientes com câncer de ovário epitelial esá associada a um prognóstico e um resultado pobre da doença. Além disso, carga tumoral reduzida subsequente à redução parcial de células B com rituximab foi observada em 50% dos pacientes com câncer colorretal avançado. Assim sendo, a papel exato desempenhado pelas Bregs no câncer ainda não está claro, mas o mais provável é que esteja relacionado com a atividade dos subtipos de Bregs (Sarvaria, ibid).
[0011] Um número considerável de distúrbios ou são causados por uma insuficiência de um produto gênico secretado ou são tratáveis por secreção de uma proteína terapêutica. Distúrbios de coagulação, por exemplo, são distúrbios genéticos bastante comuns onde os fatores na cascata de coagulação são de alguma forma aberrantes, i.e., falta de
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 49/118
7/70 expressão ou produção de uma proteína mutante. A maioria dos distúrbios de coagulação resulta em hemofilias tais como hemofilia A (deficiência do fator VIII), hemofilia B (deficiência do fator IX), ou hemofilia C (deficiência do fator XI). O tratamento para estes distúrbios geralmente está relacionado com a severidade. Para hemofilias leves, os tratamentos podem envolver terápicos criados para aumentar a expressão do fator subexpresso, enquanto que para hemofilias mais severas, a terapia envolve infusão regular do fator de coagulação faltante (geralmente 2-3 vezes por semana via terapia de reposição enzimática (ERT)) para prevenir episódios de hemorragia. Pacientes com hemofilia severa com frequência são desencorajados de participar de muitos tipos de esportes e devem tomar precauções extras para evitar ferimentos do dia a dia.
[0012] Deficiência em alfa-1 antitripsina (A1AT) é uma doença recessiva autossômica causada pela produção defeituosa de alfa 1antitripsina que leva a níveis inadequados de A1AT no sangue e nos pulmões. Ela pode estar associada à doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e distúrbios hepáticos. Atualmente, tratamento das doenças associadas a essa doença podem envolver infusão de A1AT exógeno e transplante do pulmão ou fígado.
[0013] Doenças do armazenamento lisossômico (LSDs) constituem um grupo de doenças monogênlcas metabólicas raras caracterizadas pela falta de proteínas lisossômicas individuais funcionais normalmente envolvidas na decomposição de lipídios, glicoproteínas e mucopolissacarídeos residuais. Essas doenças caracterizam-se por um acúmulo desses compostos na célula já que ela é incapaz de processar os mesmos para reciclagem devido ao mal funcionamento de uma enzima específica. Exemplos comuns incluem as doenças de Gaucher (deficiência de glicocerebrosidase - nome do gene: GBA), de Fabry (deficiência de a galactosidase - GLA), de Hunter (deficiência de lduronato-2sulfatase - IDS), de Hurler (deficiência de alfa-L iduronidase - IDUA), e
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 50/118
8/70 de Niemann-Pick (deficiência de esfingomielina fosfodiesterase 1 SMPD1).
[0014] Diabetes tipo 1 é um distúrbio no qual a destruição imunomediada de células B pancreáticas resulta em uma profunda deficiência de insulina, que é o principal produto secretado dessas células. Restauração dos níveis basais de insulina proporciona substancial alívio de muitas das complicações graves deste distúrbio que podem incluir complicações macrovascu lares envolvendo os vasos grandes; doenças isquêmicas do coração (angina e infarto do miocárdio), derrame e doenças vasculares periféricas, assim como complicações microvasculares resultantes de danos aos vasos sanguíneos pequenos. Complicações microvasculares podem incluir retinopatia diabética, que afeta a formação de vasos sanguíneos na retina do olho, e pode levar a sintomas visuais, visão reduzida, e potencialmente cegueira, e nefropatia diabética, que envolve alterações cicatriciais no tecido renal, perda de quantidades pequenas ou progressivamente maiores de proteína na urina, e ocasionalmente doenças renais crônicas que requerem diálise.
[0015] No entanto, a apresentação de proteínas terapêuticas para tratar distúrbios em um indivíduo pode ser limitada pela própria resposta imunológica do indivíduo à proteína terapêutica, incluindo a produção de anticorpos pelas células B no indivíduo, o que deve limitar a eficácia de tais tratamentos. Por exemplo, pacientes com hemofilia recebendo ERT dos fatores de coagulação que são deficitários ou ausentes (por exemplo, Fator VIII, Fator IX, etc.) podem desenvolver anticorpos para essas proteínas necessárias (por exemplo, anticorpos anti-F9). Estima-se que 15- 50% dos pacientes com hemofilia A desenvolvem anticorpos inibidores contra a proteína terapêutica Fator 8 (KrudyszAmblo et al., (2009) Blood 113(11):2587-2594). Em alguns casos, as reações podem ser severas (choque anafilático) levando a uma situação em que a ERT necessária causa efeitos colaterais nocivos ao pa
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 51/118
9/70 ciente (vide, por exemplo, JM Lusher (2000) Semin Thromb Hemost 26(2):179-188).
[0016] Além disso, anticorpos são produtos proteicos secretados cuja plasticidade de ligação fora explorada para o desenvolvimento de diversos tipos de terapias. Anticorpos terapêuticos podem ser usados para neutralização de proteínas alvo que causam diretamente uma doença (por exemplo, VEGF em degeneração macular) assim como para eliminação altamente seletiva de células cuja persistência e replicação comprometem o indivíduo (por exemplo, células cancerosas, assim como certas células imunes em doenças autoimunes, incluindo células B que produzem anticorpos para autoantígenos). Em tais aplicações, os anticorpos terapêuticos se se beneficiam da resposta normal do corpo aos seus próprios anticorpos para efetuar eliminação seletiva, neutralização, ou depuração das proteínas alvo ou de células portadores do antígeno alvo do anticorpo. Por conseguinte, a terapia com anticorpos vem sendo amplamente aplicada a muitas condições humanas incluindo oncologia, reumatologia, transplante, e doenças oculares.
[0017] Portanto, continuam sendo necessários métodos e composições adicionais que possam ser usados para expressar i, transgene desejado em um nível terapeuticamente relevante em um indivíduo para tratar doenças genéticas tais como hemofilias, diabetes, doenças do armazenamento lisossômico e/ou deficiência de A1AT, inclusive tratar e/ou evitar qualquer toxicidade associada e que possa limitar a expressão do transgene ou proteína terapêutica ao tipo de tecido desejado, inclusive litando respostas inatas das células B. Adicionalmente, continuam sendo necessários métodos e composições para expressar um transgene desejado (por exemplo, um anticorpo) em um nível terapeuticamente relevante para o tratamento de outras doenças tais como cânceres.
Sumário
[0018] A modificação sítio-específica de células B em um ou mais
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 52/118
10/70 locos genéticos potencializaria a função das céluias B (inclusive aumentando a produção de anticorpos por essas células e/ou vetorizando células B para produzir proteínas que limitam as respostas imunológicas inatas indesejadas), diferenciação em plasmoblastos e capacidade de enxertia. O controle das células B por meio de modificação genética vetorizada (por exemplo, rompimento e/ou adição de genes genômicos ou epissômicos) possibilita o uso de terapias de reposição proteica eficiente e menos tóxica e permite ainda a comunicação nos centros germinativos a serem programados.
[0019] A presente invenção descreve composições e métodos para modular a expressão de um gene alvo em uma célula B e/ou expressar um transgene em uma célula B (incluindo plasmoblastos ou células plasmáticas). Por conseguinte, são apresentados neste pedido células B modificadas geneticamente (incluindo células B descendentes de células-tronco hematopoiéticas modificadas geneticamente ou outros precursores de células B) compreendendo uma ou mais das seguintes modificações: inclusão de um ou mais transgenes na célula; e/ou inserções e/ou deleções que modificam (I) genes do receptor de células B, e/ou (ii) interações celulares em centros germinativos; e/ou (c) modificações que inibem a supressão de qualquer função das células B associada à infecção patogênica ou regulação de um câncer. Os transgenes podem ser expressos extracromossomicamente (epissomicamente) e/ou podem ser integrados no genoma da célula B (por exemplo, por integração mediada por nuclease, por exemplo, em um locos de porto seguro). Em algumas modalidades, um ou mais transgenes são mantidos epissomacamente e um ou mais transgenes são integrados no genoma da célula (célula B ou HSC que é diferenciada em uma célula B). Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína envolvida na cascata de coagulação. Em outras modalidades, o transgene codifica uma enzima defeituosa em um distúrbio de armazenamento lisossômica ou codifica um anticorpo terapêutico. Em outras
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 53/118
11/70 modalidades, o transgene codifica uma molécula que vetoriza uma célula B produzindo um anticorpo indesejável, por exemplo, um anticorpo contra uma proteína terapêutica, incluindo, porém sem limitação, anticorpos contra uma proteína endógena (por exemplo, anticorpos em uma doença autoimune) e/ou uma proteína exógena (por exemplo, uma proteína fornecida por ERT tal como um fator de coagulaçâo). Por exemplo, o transgene pode codificar um anticorpo que reconhece o receptor de célula B em células B que são sensíveis à proteína desejável (proteína endógena em doenças autoimunes e/ou proteína fornecida por ERT) para vetorizar a população de células B que está produzindo os anticorpos indesejáveis contra a proteína desejável. Exemplos não limitativos de tais anticorpos incluem anticorpos que reconhecem um receptor de célula B associado a uma célula B produzindo anticorpos contra proteínas fornecidas por ERT tal como fatores de coagulação em hemofilia (por exemplo, células B que produzem anticorpos anti-F9 ou anti-F8); e/ou que reconhecem um receptor de célula B em uma célula B produzindo anticorpos contra autoantígenos incluindo, porém sem limitação, proteína básica de mielina (MBP) em MS, anticorpos antinucleares (ANAs) em lúpus eritematoso sistêmico (SLE), glicoproteínas no coração, articulações e outros tecidos em febre reumática aguda, anticorpos para a porção Fc da IgG em artrite reumatoide (RA), assim como células B produzindo autoanticorpos em síndrome de Reiter, síndrome de Sjogren, esclerose sistêmica (esclerodermia), miopatias inflamatórias, poharterite nodosa, doença de Graves, diabetes tipo I entre outras. As composições e os métodos descritos neste pedido resultam em níveis elevados de produção de proteínas tanto in vitro quanto in vivo, incluindo em níveis suficientes para apresentar efeitos clinicamente relevantes (terapêuticos) in vivo.
[0020] Em um aspecto, neste pedido está descrito um construto de expressão polinucleotídico compreendendo pelo menos um promotor específico para células B, o qual induz a expressão de um ou mais
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 54/118
12/70 transgenes. O promotor de células B pode ser selecionado dentre qualquer promotor que seja ativo em células B, incluindo, porém sem limitação, o promotor da cadeia capa da imunoglobulína (IgK, Laurie et al. (2007) Gene 77?er 14(23): 1623-31), B29 (Hermanson et al. (1989) Proc Nat’l Acad Sei 86: 7341-7345), BCL6 (Ramachandrareddy et al. (2010) Proc NatlAcad Sei 107(26):11930-11935), o promotor III de ClITA (Deffernnes et al. (2001) J. Immunol 167(1): 98-106), mb-1 (vide e.g. Malone e Wall (2001) J. Immunol 168(7):3369-3375) e o promotor EEK de CIITA, compreendendo o promotor leve (VKp) precedido por um potencializador intrônico (íEk), um MAR, e um 3'potencializador (3Έκ) (vide Patente US 8133727). Em algumas modalidades, o promotor específico para células B usado normalmente é expresso no centro germinativo para que o transgene seja expresso quando a célula estiver em um centro germinativo (por exemplo, BCL6, Basso et al. (2010) Blood 115(5):975-984). Em algumas modalidades, o transgene é inserido por integração mediada por nuclease para que ele seja controlado pelo promotor específico para células B. Em outras modalidades, o construto promotor de células B-transgene faz parte de um vetor de DNA que é mantido extracromossomicamente. Em algumas modalidades, o construto promotor de células B-transgene é inserido em uma região transcricionalmente silenciosa e/ou de porto seguro do genoma da célula B tal como em um gene de albumina ou um gene codificando uma subunidade do receptor de células T (por exemplo, TCRA ou TCRB).
[0021] Em alguns aspectos, o transgene codifica uma proteína que falta ou é insuficiente no indivíduo. Em algumas modalidades, o transgene codifica um fator de coagulação tal como Fator VII, Fator VIII, Fator IX, Fator X, Fator XI ou Fator XII. Em outras modalidades, o transgene codifica uma enzima deficiente em uma doença do armazenamento lisossômico, incluindo, porém sem limitação, glicocerebrosidase (GBA), a galactosidase (GLA), β-glicuronidase (GUSB), iduronato-2
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 55/118
13/70 sulfatase (IDS), alfa-L Iduronidase (IDUA), esfingomielina fosfodiesterase 1 (SMPD1), ou alfa-glicosidase (GAA). Em algumas modalidades, o transgene codifica A1AT. Exemplos não limitativos de proteínas que podem ser expressas da maneira descrita neste pedido também incluem fibrinogênio, protrombina, fator tecidual, Fator V, fator de von Willebrand, precalicreína, cininogênio de alto peso molecular (fator de Fitzgerald), fibronectina, antitrombina III, cofator II da heparina, proteína C, proteína S, proteína Z, inibidor da protease relacionada com proteína Z, plasminogênio, alfa 2-antiplasmina, ativador de plasminogênio tecidual, uroquinase, inibidor-1 do ativador de plasminogênio, inibidor-2 do ativador de plasminogênio, MMAA, MMAB, MMACHC, MMADHC (C2orf25), MTRR, LMBRD1, MTR, propionil-CoA carboxilase (PCC) (subunidades PCCA e/ou PCCB), uma proteína transportadora de glicose-6-fosfato (G6PT) ou glicose-6-fosfatase (G6Pase), um receptor de LDL (LDLR), ApoB, LDLRAP-1, a PCSK9, uma proteína mitocondrial tal como NAGS (N-acetilglutamato sintetase), CPS1 (carbamoil fosfato sintetase I), e OTC (ornitina transcarbamilase), ASS (ácido argininossuccínico sinthetase), ASL (argininosuccinase ácido liase) e/ou ARG1 (arginase), e/ou uma proteína da família 25 de veículos de soluto (SLC25A13, um veículo de aspartato/glutamato), um polipeptídeo A1 da glicuronsiltransferase UGT1A1 ou UDP, uma fumarilacetoacetato hidroliase (FAH), uma proteína alanina-glioxilato aminotransferase (AGXT), uma proteína glioxilato redutase/hidroxipiruvato redutase (GRHPR), uma proteína do gene de transtiretina (TTR), uma proteína ATP7B, uma proteína fenilalanina hidroxilase (PAH), uma proteína lipoproteína liase (LPL), uma nuclease modificada geneticamente, um fator de transcrição modificado geneticamente, e/ou um anticorpo de fragmento variável de cadeia simples modificado geneticamente (diacorpo, camelídeo, etc.). Em uma modalidade preferida, o transgene codifica um polipeptídeo FVIII. Em algumas modalidades, o polipeptídeo FVIil compreende uma deleção do domínio B. Em algumas moda
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 56/118
14/70 lidades, são apresentados neste pedido métodos e composições para expressar níveis terapeuticamente relevantes de uma ou mais proteínas terapêuticas de um ou mais transgenes. Em certas modalidades, a expressão de um construto de transgene codificando uma proteína de substituição resulta em 1% de níveis normais da proteína produzida, ao passo que em outras são produzidos 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 150%, 200%, ou mais dos níveis normais. Em algumas modalidades, o transgene codifica um polipeptídeo que frustra a inibição da resposta do anticorpo pelo vírus, bactéria ou parasita.
[0022] Células B positivas para CD19 diferenciadas /n vitro em plasmoblastos e células plasmáticas produzem mais de 10.000 ng/mL de anticorpos (IgG, IgM, IgA). Por conseguinte, em alguns aspectos, o transgene codifica uma proteína terapêutica tal como um anticorpo de cadeia simples. Em algumas modalidades, o anticorpo de cadeia simples é um scFv, ao passo que em outro o anticorpo de cadeia simples é um anticorpo camelídeo ou um nanocorpo (vide, por exemplo, Mejias et a/. (2016) Sci Reports 6: srep24913, doi: 10:1038). Em outros aspectos, mais de um transgene é expresso na célula B. Em uma modalidade, os mais de um transgenes incluem as sequências necessárias para expressar um anticorpo inteiro ou um fragmento mesmo, ou uma outra proteína de ligação de antígeno (por exemplo, monocorpo, aptâmero, darpina, adnectinas, aficorpos, anticalinas, inibidores do tipo kunitz etc. (Gebauer and Skerra (2009) CurrOpin Chem Biol 13(3):245-55).
[0023] Em algumas modalidades, uma população de células B compreendendo um transgene codificando uma proteína terapêutica de interesse é modificada geneticamente ex vivo e então reintroduzida em um indivíduo com necessidade da mesma. A população de células B pode ser modificada geneticamente da maneira neste pedido em qualquer estágio de desenvolvimento, incluindo, porém sem limitação, como uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 57/118
15/70 de linfoides ou uma célula B madura. As células-tronco ou progenitoras de células B podem ser modificadas geneticamente e então diferenciadas in vitro e administradas a um indivíduo como células progenitoras (células B de linhagem comprometida) ou como células maduras. AItemativamente, as células-tronco ou progenitoras de células B podem ser modificadas in vitro da maneira descrita neste pedido e completamente diferenciadas em células B maduras in vivo subsequente à administração. Por conseguinte, para administrações ex vivo, as populações de células B descritas neste pedido podem ser heterogêneas no sentido de que elas incluem células-tronco, células progenitora e/ou células B maduras em vários estágios de desenvolvimento. Alternativamente, as populações de células B podem ser homogêneas e incluem somente células-tronco, células progenitoras ou células maduras. Em ainda outras modalidades, as células B modificadas geneticamente são feitas in vivo usando um vetor de distribuição que consegue transduzir células B. Em outras modalidades, o vetor de distribuição é um vetor viral, de preferência um vírus adenoassociado (AAV). Em modalidades preferidas, o vetor de AAV é um vetor de AAV6. Em outras modalidades, o vetor de distribuição é não viral, por exemplo, mRNA, uma nanopartícula lipídica (LNP) ou um vetor plasmídico.
[0024] Em um outro aspecto, as células B modificadas geneticamente descritas neste pedido (inclusive populações de células B) são cultivadas in vitro para a produção de uma proteína codificada por um transgene. Em modalidades preferidas, a proteína é um anticorpo ou uma proteína de ligação de antígeno (por exemplo, um anticorpo que se liga a células B produzindo anticorpos indesejáveis no indivíduo, incluindo células B endógenas produzindo anticorpos contra proteínas fornecidas por ERT tais como fatores de coagulação e/ou células B produzindo anticorpos contra autoproteínas em distúrbios autoimunes), ou um anticorpo que neutraliza os anticorpos indesejados. A proteína produzida a partir das células B pode ser isolada e usada para terapia
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 58/118
16/70 proteica tal como terapia de reposição enzimática e/ou em conjunto com terapia de reposição enzimática para reduzir e/ou eliminar a produção de anticorpos indesejáveis (por exemplo, anticorpos anti-ERT desenvolvidos subsequente à ERT).
[0025] Em alguns aspectos, a invenção apresenta métodos e composições para distribuir uma célula B ou uma célula plasmática que expressa um transgene que atravessa a barreira hematoencefálica, útil para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença do SNC ou que impacta o SNC. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma enzima que falta em um indivíduo com um distúrbio do armazenamento lísossômico. Em outras modalidades, o transgene codifica glicocerebrosidase (GBA), a galactosidase (GLA), β-glicuronidase (GUSB), idu~ ronato-2-sulfatase (IDS), alfa-L iduronidase (IDUA), esfingomielina fosfodiesterase 1 (SMPD1), ou alfa-glicosidase (GAA) e é usado para tratar ou prevenir a doença do SNC associada à doença de Gaucher (Bae et al., (2015) Exp Mol Med 47, e153; doi:10:1038/emm,2014,128), doença de Fabry, MPS tipo VII (Sly et al. (1973) J Pediatr. 1973 Feb; 82(2):249-57), MPS H, MPS I, doença de Niemann-Pick ou de Pompe, respectivamente.
[0026] Em outros aspectos, os métodos e as composições da invenção incluem uma célula B modificada ou um derivado de célula B (plasmoblasto, célula plasmática) compreendendo um transgene e também uma ou mais outras modificações. A outra modificação pode ser sequências epissômicas adicionais ou sequências integradas adicionais (que podem ser integradas nas mesmas localizações e/ou em localizações diferentes no genoma). Em algumas modalidades, as células B compreendendo transgenes compreendem ainda sequências proteicas ou peptídicas adicionais (ou polinucleotídeos codificando as mesmas) que auxiliam na eficiência de atravessar a barreira hematoencefálica. Em algumas modalidades, o peptídeo compreende um peptídeo que sabidamente atravessa o cérebro. Em outras modalidades, o
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 59/118
17/70 peptídeo é um anticorpo expresso na superfície de células B que vetoriza o receptor de transferrina, ao passo que em outras modalidades, o peptídeo é uma metalotransferrina (Karkan et aí (2008) PLoS ONE 3(6):e2469. doi:10,1371/journal.poine,0002469. Em algumas modalidades, o peptídeo é um receptor tal como VLA-4, ICAM-1, IL-8Ra (CXCR1), ou IL-8Rb (CXCR2) (Alter et at. (2003) J. Immunol 170:44974505). Em qualquer uma dessas modalidades, o transgene pode codificar uma enzima faltante em uma doença do armazenamento lisossômico tal como aquelas descritas acima para que a enzima seja distribuída para o SNC de um indivíduo com necessidade da mesma.
[0027] Em alguns aspectos, as células B modificadas geneticamente da invenção compreendem outras modificações (por exemplo, mutações) que auxiliam na enxertia depois do transplante. Em algumas modalidades, a expressão de genes específicos é inibida (por exemplo, via repressão transitória ou nocaute permanente) para aumentar a enxertia e/ou o tamanho do centro germinativo. Genes sujeitos à tal inibição incluem, porém sem limitação, inositol hexacsfosfato quinases (Zhang et al. (2014) Basic Res Cardio 109(4): 417), glicogênio sintase quinase-3p (GSK-3p, vide Ko et al. (2011) Stem Cells 29(1):108-18), CD26 (DPPIV/dipeptidilpeptidase IV) peptidase, (Tian et al. (2006) Gene Ther 13(7):652-8), RhoA (Ghiaur et al. (2006) Blood 108(6):208794), EAF2 (Li et a/.,(2016) Nat Com 7; del: 10,1038/ncomms10836), proteínas autofágicas tais como Atg5 (Pengo et al..,(2013) Nat Immunol 14(3):298-305) entre outras. Em outras modalidades, as células B modificadas geneticamente podem ser ainda modificadas geneticamente para reprimir (por exemplo, nocautear) genes associados à indução de uma reação de enxerto-versus-hospedeiro. Em algumas modalidades, genes codificando o receptor de células B são nocauteados para prevenir a estimulação de uma célula B em um hospedeiro.
[0028] Em outros aspectos, as células B modificadas geneticamente da invenção compreendem ainda modificações (mutações tais como
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 60/118
18/70 inserções e/ou deleções genômicas: expressão epissômica de transgenes, etc.) que regulam interações celulares (por exemplo, interações células T-células B) em centros germinativos e/ou inibem a supressão de qualquer função das células B (por exemplo, produção de anticorpos, expressão de citocinas, sinalização, etc.) associada à infecção patogênica. Em alguns aspectos, as células B modificadas geneticamente da invenção compreendem ainda proteínas (ou sequências codificando essas proteínas) para a inibição de células B que estão envolvidas no comportamento oncogênico. Por exemplo, em algumas modalidades, as células B modificadas geneticamente compreender um anticorpo expresso superficialmente contra ubiquitina hidrolase UCH-L1 (incluindo um transgene codificando a mesma) para suprimir células B envolvidas em alguns tipos de linfoma de células B grandes (Bedekovics etal· (2016) Blood 127(12):1564-74).
[0029] Em um outro aspecto, são fornecidas composições farmacêuticas compreendendo uma ou mais das células, construções de expressão e/ou nucleases opcionais descritos neste pedido.
[0030] Para integração mediada por nuclease dos construtos de expressão da presente invenção em uma localização adequada em uma célula B, pode-se usar qualquer nuclease, incluindo, porém sem limitação, uma ou mais nucleases dedo-de-zinco (ZFNs), TALENs, nucleases CRISPR/Cas e/ou nucleases TtAgo, de modo que o construto de expressão é integrado na região (gene) clivada pelas nucleases. Em certas modalidades, são empregados um ou mais pares de nucleases. As nucleases podem ser introduzidas na forma de mRNA ou podem ser administradas à célula por meio de vetores não virais ou virais. Em alguns aspectos, os polinucleotídeos nuclease podem ser distribuídos por lentivírus ou por lentivírus não integrantes. Em outros aspectos, o cassete de expressão pode ser distribuído por AAV e/ou DNA oligos.
[0031] Em qualquer uma das composições e métodos descritos, os
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 61/118
19/70 cassetes de expressão e/ou as nucleases podem ser transportados em um vetor de AAV, incluindo, porém sem limitação, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 e AAVrhW ou AAV pseudotipificado tal como AAV2/8, AAV8,2, AAV2/5 e AAV2/6 entre outros. Em certas modalidades, os polinucleotídeos (construtos de expressão e/ou nucleases) são distribuídos usando os mesmos tipos de vetor de AAV. Em outras modalidades, os polinucleotídeos são distribuídos usandos tipos diferentes de vetor de AAV. Os polinucleotídeos podem ser distribuídos usando um ou mais vetores. Em outras modalidades, os polinucleotídeos são distribuídos via uma nanopartícula lipídica (LNP). Em certas modalidades, os polinucleotídeos são distribuídos via administração no baço ou no linfonodo de um animal intacto. Em outras modalidades, os polinucleotídeos são distribuídos via administração intravenosa em uma veia periférica.
[0032] Os métodos descritos neste pedido podem ser praticados in vitro, ex vivo ou in vivo. Em certas modalidades, as composições são introduzidas em um mamífero intacto vivo. O mamífero pode estar em qualquer estágio de desenvolvimento no momento da distribuição, por exemplo, embrionário, fetal, neonatal, infantil, juvenil ou adulto. Adicionalmente, as células vetorizadas podem ser saudáveis ou doentes. Em certas modalidades, uma ou mais das composições são distribuídos para um tecido específico (por exemplo, baço ou linfonodo) por via intra-arterial, intraperitoneal, ou intramuscular. A distribuição ex vivo pode ser feita com populações homogêneas ou heterogêneas de células incluindo células-tronco, células progenitoras de células B e/ou células B maduras.
[0033] Também é apresentado um kit, compreendendo um ou mais dos construtos de expressão, vetores de AAV, e/ou composições farmacêuticas descritos neste pedido. O kit pode compreender ainda ácidos nuclelcos codificando nucleases, (por exemplo, moléculas de RNA codificando ZFNs, TALENs ou Cas e proteínas Cas modificadas, e
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 62/118
20/70
RNAs guias), ou alíquotas de uma proteína nuclease, células, instruções para realização dos métodos da invenção, entre outros.
[0034] Estes e outros aspectos tornar-se-ão evidentes para o especialista na técnica à luz da descrição como um todo.
Breve Descrição dos Desenhos
[0035] A Figura 1 é uma representação esquemática mostrando um panorama global do protocolo de descongelamento e diferenciação de células B /n vitro seguido (vide Jourdan et a!. (2009) Blood 114:5173-5181).
[0036] As Figuras 2A a 2C são gráficos demonstrando a capacidade das células B diferenciadas in vitro de produzir anticorpos, incluindo anticorpos IgM (Figura 2A), anticorpos IgG (Figura 2B) e anticorpos IgA (Figura 2C). As amostras foram tratadas com citocinas (citocinas +) ou não, e então a quantidade de anticorpo detectado por ELISA. Os sobrenadantes foram recolhidos nos dias t4, t7 e 110 os níveis de anticorpo IgM, IgG, e IgA total foram quantificados por ELISA. Os dados representam duplicatas técnicas. As barras de erro representam o desvio-padrâo.
[0037] As Figuras 3A a 3D são gráficos representando a percentagem de células positivas para GFP subsequente à eletroporação de mRNA nas células B 0 dia (Figura 3A), 1 dia (Figura 3B), 2 dias (Figura 3C) ou 3 dias (Figura 3D) depois do descongelamento. Células B CD19+ foram eletroporadas com mRNA em to, t1, t2 e t3 onde t é igual ao número de dias depois do descongelamento para determinar o instante ideal para a adição de mRNA. Células B postivas para CD19+ (2,0E+05 células) foram misturadas com GFP mRNA (2 pg) seguido por eletroporação. As células foram coletadas 24 horas depois e analisadas por citometria de fluxo para avaliar os níveis de GFP. No dia 2 após o descongelamento (t2) foram observados os níveis mais altos de GFP e foram escolhidos para estudos posteriores. Os dados represen
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 63/118
21/70 tam duplicatas técnicas. As barras de erro representam o desvio padrão.
[0038] As Figuras 4A e 4B são gráficos representando o acesso por citometria de fluxo para expressão de GFP em células transduzidas. A Figura 4A define as áreas do gráfico associadas à dispersão lateral (SSC) e à dispersão frontal (FSC). A Figura 4B exemplifica as diferenças entre um conjunto pseudo-tratado de células B (painel esquerdo) e aquelas eletroporadas com GFP codificando mRNA (painel direito). Como se pode ser no painel direito da Figura 4B, a expressão do GFP mRNA resulta em um aumento na fluorescência gerada pelo GFP que pode ser quantificada subsequente ao acesso.
[0039] As Figuras 5A a 5C são gráficos representando a edição de genoma em células B. Sequenciamento profundo em múltiplos locos demonstrou edição robusta do genoma usando nucleases dedode~zinco vetorizando AAVS1, CCR5 e TCRA (TRAC). A percentagem de modificação do genoma foi calculada dividindo-se a contagem de sequências contendo inserções e deleções (indels) pela contagem total de sequências. Células B CD19+ B (2,0E+5 células) foram misturadas com ZFN mRNA (4 pg) seguido por eletroporação. Células foram coletadas ao longo do tempo (t dias) subsequente à transfecção. Os dados representam duplicatas técnicas. As barras de erro representam o desvio padrão. A Figura 5A representa a edição de genoma no locus AAVS1 nos dias 4, 7, e 10. A Figura 5B mostra um conjunto de dados similares no locus CCR5 ao passo que a Figura 5C mostra os dados no locus TCRA (TRAC).
[0040] As Figuras 6A a 6C mostram o efeito de um choque frio transitório na edição de genoma em células B. Células B CD19+ (2,0E+5 células) foram misturadas com ZFN mRNA (0,75, 1,5, 3 e 6 pg) seguido por eletroporação. Depois da eletroporação as células foram divididas em dois grupos. Um grupo foi colocado em uma incuba
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 64/118
22/70 dora a 37°C por 4 dias. O segundo grupo foi colocado em uma incubadora a 30°C por uma noite, e então transferido para uma incubadora a 37°C por 3 dias. Sequenciamento profundo revelou um aumento na edição de genoma (% indels) nas células tratadas com o choque frio transitório.
[0041] As Figuras 7A e 7B representam a capacidade de transdução de vários tipos de AAV testados quanto à distribuição de um promotor de CMV-doador de GFP em células B CD19+. A Figura 7A mostra os resultados para os sorotipos 2, 5, 6, 8 e 9 de AAV recombinante ancorando CMV-GFP distribuído em doses vetoriais de 2,4E+6, 1,2E+6, 6,0E+5, 3,0E+5 genomas vetorials (vg)Zcélula. Os dados mostrados são de n =2 réplicas biológicas onde as células foram analisadas quanto à expressão de GFP nos dias 4, 7 e 10 depois da transdução, e demonstram que o AAV6 transduz prontamente células B. As barras de erro representam o desvio padrão de réplicas técnicas e biológicas. A Figura 7B é uma representação esquemática do cassete de expressão usado nos experimentos mostrados.
[0042] A Figura 8 representa cassetes de expressão de AAV exemplificativos usados. Estão mostrados cassetes doadores exemplificativos para inserção nos locos AAVSI, CCR5 e TCRA (TRAC). AAVS1 tem um braço de homologia esquerdo (AAVS1-L) e um braço de homologia direito (AAVS1-R) consistindo em 801 e 568 pares de base de comprimento, respectivamente. CCR5 um braço de homologia esquerdo (CCR5-L) e um braço de homologia direito (CCR5-R) consistindo em 473 e 1431 pares de base de comprimento, respectlvamente. TCRA (TRAC) um braço de homologia esquerdo (TRACL) e um braço de homologia direito (TRAC-R) consistindo em 925 e 989 pares de base de comprimento, respectivamente. Os doadores continham um promotor específico para fosfoglicerato quinase (PGK) ou um promotor específico para células B (ΈΕΚ, compreendendo o promotor de cadeia leve (VKp) precedido por um potencializador intrô
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 65/118
23/70 nico (ϊΕκ), um MAR, e um 3 potencializador (3'Ek); Patente US 8,133,727) seguido por um transgene codificador de GFP (GFP) e um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (pA). Repetições terminais invertidas de AAV2 (ITRs) foram usadas para possibilitar o acondicionamento em capsídeos de AAV.
[0043] As Figuras 9A a 9C são gráficos mostrando que uma combinação de ZFN mRNA e vetores de rAAV2/6 promoveu níveis elevados de adição de transgenes em múltiplos locos. Os níveis de expressão de GFP foram medidos por citometria de fluxo. As culturas de células B foram coletadas ao longo do tempo (t dias) subsequente à adição de ZFN mRNA e de doador de AAV às células B. Os locos AAVS1 (Figura 9A), CCR5 (Figura 9B) e TCRA (TRAC, Figura 9C) foram avaliados quanto à adição de transgenes. As amostras de ZFNOoador mostram expressão durável de GFP ao passo que as amostras apenas com Doador mostram uma redução na expressão de GFP ao longo do tempo. Abaixo de cada gráfico está mostrado o sítio alvo para as nucleases (por exemplo, na Figura 9A, ZFN: AAVS1). Também é apresentada uma descrição do transgene de GFP (por exemplo, na Figura 9A, Doador: PGK-AAVS1 indica que o transgene de GFP foi induzido a partir do promotor PGK, e que a sequência codificadora de GFP foi flanqueada por braços de homologia como homologia para um sítio de nuclease no gene de AAVS1). Nas Figuras 9A a 9C, o painel esquerdo mostra os resultados subsequentes à coleta 4 dias (t4) depois da transfecção; o painel do meio mostra os resultados subsequentes à coleta 7 dias (t7) depois da transfecção; e o painel direito mostra os resultados subsequentes à coleta 10 dias depois da transfecção.
[0044] As Figuras 10A e 10B são gráficos mostrando a percentagem de integração vetorizada do doador de GFP nos locos AAVS1 (Figura 10A) e CCR5 (Figura 10B) nas células B CD19+. A confirmação da integração vetorizada (adição de transgenes) foi feita por sequenciamento profundo. A percentagem de modificação gênica foi calculada
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 66/118
24/70 dividindo-se a contagem de sequências contendo o alvo integrado pela contagem total de sequências. As células B foram coletadas ao longo do tempo (t ™ dias) subsequente à adição de ZFN mRNA e doador de AAV às células B. Os dados de AAVSI representam 3 experimentos independentes. Os dados de CCR5 representam 2 experimentos independentes. As barras de erro representam o desvio padrão. Abaixo de cada gráfico está mostrado o sítio alvo para as nucleases e a configuração do doador descrito acima.
[0045] A Figura 11 é um gráfico representando os resultados para determinar se a recombinação induzida por homologia (HDR) ou a captura de extremidades via união de extremidades não homólogas (NHEJ) são usadas pelas células B para integração vetorizada. A tabela abaixo do gráfico mostra a especificidade da ZFN e a configuração do doador. Todos os doadores usaram o promotor PGK, mas apenas o experimento #1 tinha o transgene de GFP doador flanqueado por braços de homologia correspondentes a um sítio de corte de nuclease. As amostras com ZFN e braços de homologia do doador não correspondentes apresentam expressão similar de GFP como doador apenas sem qualquer nuclease adicionada. A maior integração vetorizada ocorreu quando os braços de homologia corresponderam a um sítio alvo de nuclease, demonstrando que a HDR é usada para integração em células B.
[0046] A Figura 12 é um gráfico representando a comparação do promotor PGK induzindo a expressão de GFP com um promotor EEK específico para células B induzindo a expressão de GFP. Células B foram misturadas com ZFN mRNA (4 pg) vetorizando o locus TCRA (TRAC), seguido por eletroporação. Subsequente à eletroporação, as células B CD19+ foram então transduzidas com AAV6 contendo braços de homologia TRAC flanqueando o cassete de expressão transgênica e um promotor PGK ou um promotor específico para células B (EEK) induzindo a expressão transgênica de GFP. Estes foram distribuídos
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 67/118
25/70 em uma dose vetorial de 2,4E+06 vg/célula. Os dados demonstram que o uso do promotor específico para células B (EEK) apresentou um ligeiro aumento na expressão de GFP em relação ao promotor PGK. [0047] As Figuras 13A a 13D são gráficos representando a quantidade de expressão transgênica de GFP nas células B CD19* em uma gama de doses de AAV doador. Em todos os casos, o transgene de GFP foi integrado no locus TCRA (TRAC) usando nucleases TORAespecíficas. Também estão mostrados em cada gráfico os resultados da expressão de GFP quando a transdução foi feita na ausência das nucleases. Os construtos doadores compreendiam braços de homologia TCRA-específicos e ou um promotor EEK descrito acima ou um promotor PGK. A gama de AAV usado incluía 3,0E+05 vg/célula (Figura 13D), 6,0E+05 vg/célula (Figura 13C), 1,2E+06 vg/célula (Figura 13B) e 2,4E+06 vg/célula (Figura 13A). Células B positivas para CD19+ foram misturadas com mRNA codificando ZFN (4 pg) vetorlzando o locus TCRA, seguido por eletroporação. Depois da eletroporação, as células B CD19+ foram transduzidas com AAV contendo braços de homologia de TCRA, seja com um promotor PGK ou com um promotor específico para células B (EEK) induzindo a expressão de GFP. Estes foram distribuídos em doses vetoriais de 2,4E+06, 1,2E+06, 6,0E+05 e 3,0E+05 vg/célula. A percentagem de expressão de GFP induzida pelo promotor PGK diminuía quando a dose diminuía ao passo que o promotor específico para células B manteve a expressão de GFP até uma diluição de 1 para 8. Há uma diferença de quase 5 vezes a 3,0E+05 vg/célula entre os dois promotores.
[0048] As Figuras 14A a 14C são gráficos representando o impacto na produção de anticorpos subsequente às manipulações de edição de genoma demonstrando que não ocorre perda significativa da produção de IgG in vitro segundo medido por ELISA como resultado das manipulações. Os níveis de IgG secretada total são similares independente de tratamento no decorrer do experimento (representando níveis
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 68/118
26/70 combinados de IgG secretada nos dias 4, 7 e 10) indicando que a eletroporação e a transduçâo não têm impacto negativo na produção de IgG. A adição de citocínas é essencial para a produção de IgG. Células B CD 19+ foram tratadas com ZFN específica para AAVS1 (Figura 14A), ZFN específica para CCR5 (Figura 14B) ou ZFN específica para TCRA (TRAC) (Figura 14C). As várias condições usadas para cada conjunto de dados incluíam a ZFN específica pareada com o transgene de GFP com os braços de homologia correspondentes (ZFNOoador), transgene de GFP e braços de homologia (Doador), ZFN específica isoladamente (ZFN), células B CD19+ tratadas com o dispositivo BTX apenas com tampão (células BTX), células B CD19+ não tratadas mais citocinas (células B) e células B CD19+ não tratadas sem citocinas (células B-Cytos). Todos os ZFN:Doador, Doador, ZFN, células BTX e células B foram tratados com citocinas.
[0049] As Figuras 15A a 15C são gráficos representando o impacto na produção de anticorpos subsequente às manipulações de edição de genoma demonstrando que não ocorre perda significativa da produção de IgM in vitro segundo medido por ELISA. Células B CD19+ foram tratadas com ZFN específica para AAVS1 (Figura 15A), ZFN específica para CCR5 (Figura 15B) ou ZFN específica para TCRA (TRAC) (Figura 15C). As amostras são aquelas descritas acima na Figura 14.
[0050] A Figura 16 é um gráfico representando a produção de IgM a partir de células B CD19+ diferenciadas tratadas com citocinas de um único doador humano. Células B CD19+ foram submetidas a tratamento com o vírus AAV2, 5, 6, 8 ou 9. Na presença de citocinas adicionadas, a produção de IgM, segundo medida por ELISA, foi ‘reforçada' quando tratadas apenas com o AAV2. A prevalência de anticorpos para o AAV do tipo selvagem na população humana é robusta e ainda não foi associada a doenças. Nesta figura está mostrado um potencial reforço da produção de anticorpos devido ao que seria considerado
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 69/118
27/70 reinfecção por AAV.
[0051] As Figuras 17A e 17B são ilustrações representando um potencial mecanismo para a expressão aumentada de IgM como resultado do ‘reforço' de AAV2. No painel esquerdo (Figura 17A) está representado um cenário simplificado da produção de anticorpos em uma célula B subsequente à infecção com AAV. O painel mostrado à direita (Figura 17B) é um exemplo indicando como o AAV podería ser utilizado para funcionar como um reforçador para aumentar a expressão de um transgene inserido induzido a partir de um promotor de anticorpo em uma célula B modificada geneticamente.
Descrição Detalhada
[0052] Neste pedido são divulgados métodos e composições para modificação genética de uma célula B, incluindo nocaute de genes en~ dógenos e inserção (estável ou epissômica) de cassetes de expressão para expressão de um transgene. Os métodos podem ser realizados in vitro, ex vivo ou in vivo e podem ser usados para expressar quaisquer transgenes para o tratamento e/ou a prevenção de qualquer doença ou distúrbio que possa ser melhorado pela apresentação de um ou mais dos transgenes.
Generalidades
[0053] A prática dos métodos, assim como a preparação e o uso das composições divulgadas neste pedido empregam, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais em biologia molecular, bioquímica, estrutura e análise da cromatina, e química computacional, cultura de células, DNA recombinante e áreas relacionadas de conhecimento dos especialistas na técnica. Estas técnicas estão largamente explicadas na literatura. Vide, por exemplo, Sambrook et al.. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 e atualizações periódicas; a série
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 70/118
28/70
METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, Chromatin (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; e METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.
Definições
[0054] Os termos ácido nucleico, polinucleotideo e oligonucleotídeo são usados Intercambiavelmente e referem-se a um polímero de desoximbonucleotídeo ou rlbonucleotídeo, em conformação linear ou circular, e na forma de fita simples ou de fita dupla. Para os efeitos da presente invenção, esses termos não devem ser interpretados como limitativos em relação ao comprimento de um polímero. Os termos podem abranger análogos conhecidos de nucleotídeos naturais, assim como nucleotídeos que são modificados nas porções base, açúcar e/ou fosfato (por exemplo, esqueletos de fosforotioato). Em geral, um análogo de um nucleotídeo particular tem a mesma especificidade de pareamento de bases; i.e., um análogo de A vai formar pares de bases com T.
[0055] Os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína são usados intercambiavelmente para indicar um polímero de resíduos aminoacídicos. O termo também se aplica a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais aminoácidos são análogos químicos ou derivados modificados de um aminoácido de ocorrência natural correspondente.
[0056] Recombinação refere-se a um processo de troca de informações genéticas entre dois pollnucleotídeos, incluindo, porém sem limitação, captura por união de extremidades não homólogas (NHEJ) e recombinação homóloga. Para os efeitos deste pedido, recombinação homóloga (HR) refere-se à forma particular com que tal troca ocorre, por exemplo, durante reparo de rupturas de fita dupla em células por
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 71/118
29/70 mecanismos de reparo direcionados para homologia.
[0057] Em certos métodos da invenção, uma ou mais nucleases vetorizadas descritas neste pedido criam uma ruptura de fita dupla (DSB) na sequência alvo (por exemplo, cromatina celular) em um sítio predeterminado (por exemplo, gene de albumina). A DSB medeia a integração de um construto descrito neste pedido. Opcionalmente, o construto tem homologia para a sequência nucleotídica na região da ruptura. O construto de expressão pode ser integrado fisicamente ou, alternativamente, o cassete de expressão é usado como um modelo para reparo da ruptura por recombinação homóloga, resultando na introdução de toda ou parte da sequência nucleotídica como no cassete de expressão na cromatina celular. Assim sendo, uma primeira sequência na cromatina celular pode ser alterada e, em certas modalidades, pode ser convertida em uma sequência presente em um cassete de expressão. Assim sendo, o uso dos termos substituir ou substituição pode ser interpretado como representando a substituição de uma sequência nucleotídica por outra, (i.e., substituição de uma sequência no sentido informacional), e não requer necessariamente a substituição física ou química de um polinucleotídeo por outro.
[0058] Em qualquer um dos métodos descritos neste pedido, a sequência nucleotídica (o construto de expressão ou cassete de expressão ou vetor) exógena pode conter sequências que sejam homólogas, mas não idênticas, a sequências genômicas na região de interesse, estimulando assim a recombinação homóloga para inserir uma sequência não idêntica na região de interesse. Portanto, em certas modalidades, porções da sequência do cassete de expressão que são homólogas a sequências na região de interesse apresentam entre cerca de 80 e 99% (ou qualquer valor inteiro entre estes) de identidade de sequência com a sequência genômica que é substituída. Em outras modalidades, a homologia entre o cassete de expressão e a sequência genômica é maior que 99%, por exemplo, se apenas 1 nucleotídeo é
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 72/118
30/70 diferente entre as regiões de homolog ia do cassete de expressão e as sequências genômicas de mais 100 pares de bases contíguos. Em certos casos, uma porção não homóloga do cassete de expressão pode conter sequências não presentes na região de interesse, de modo que novas sequências são introduzidas na região de interesse. Nestes casos, a sequência não homóloga geralmente é flanqueada por sequências de 50-1.000 pares de bases (ou qualquer valor inteiro entre estes) ou qualquer número de pares de bases maior que 1.000, que homólogas ou idênticas a sequências na região de interesse.
[0059] O termo sequência refere-se a uma sequência nucleotídica de qualquer comprimento, que pode ser DNA ou RNA; pode ser linear, circular ou ramificada e pode ser de fita simples ou de fita dupla. O termo transgene refere-se a uma sequência nucleotídica que é inserida em um genoma. Um transgene pode ser de qualquer comprimento, por exemplo, entre 2 e 100.000.000 nucleotídeos de comprimento (ou qualquer valor inteiro entre estes ou acima destes), de preferência entre cerca de 100 e 100.000 nucleotídeos de comprimento (ou qualquer inteiro entre estes), mais preferivelmente entre cerca de 2000 e 20.000 nucleotídeos de comprimento (ou qualquer inteiro entre estes) e ainda mais preferivelmente, entre cerca de 5 e 15 kb (ou qualquer valor entre estes).
[0060] Um cromossoma é um complexo de cromatina compreendendo todo ou parte do genoma de uma célula. O genoma de uma célula geralmente é caracterizado por seu cariótipo, que é a coleção de todos os cromossomas que compreendem o genoma da célula. O genoma de uma célula pode compreender um ou mais cromossomas.
[0061] Um epissoma é um ácido nucleico replicante, um complexo nucleoproteico ou outra estrutura compreendendo um ácido nucleico que não faz parte do cariótipo cromossômico de uma célula. Exemplos de epissomas incluem plasmídios e certos genomas vitais. Os construtos específicos para fígado descritos neste pedido podem ser
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 73/118
31/70 mantidos epissomicamente ou, alternativamente, podem ser integrados de forma estável na célula.
[0062] Uma molécula exógena é uma molécula que normalmente não está presente em uma célula, mas pode ser introduzida em uma célula por um ou mais métodos genéticos, bioquímicos ou outros métodos. Presença normal na célula é determinada em relação ao estágio de desenvolvimento particular e às condições ambientais da célula. Assim, por exemplo, uma molécula que só está presente durante o desenvolvimento embrionário do músculo é uma molécula exógena em relação a uma célula muscular adulta. Similarmente, uma molécula induzida por choque térmico é uma molécula exógena em relação a uma célula sem choque térmico. Uma molécula exógena pode compreender, por exemplo, uma versão funcionante de uma molécula endógena mal funcionante ou uma versão mal funcionante de uma molécula endógena normalmente funcionante.
[0063] Uma molécula exógena pode ser, entre outras coisas, uma molécula pequena, tal como gerada por um processo químico combinatorial, ou uma macromolécula tal como uma proteína, ácido nucleico, carboidrato, lipídio, glicoproteína, lipoproteína, polissacarídeo, qualquer derivado modificado das moléculas acima, ou qualquer complexo compreendendo uma ou mais das moléculas acima. Ácidos nucleicos incluem DNA e RNA, podem ser de fita simples ou de fita dupla, podem ser lineares, ramificados ou circulares, e podem ser de qualquer comprimento. Ácidos nucleicos incluem aqueles capazes de formar dúplexes, assim como ácidos nucleicos formadores de triplexes. Vide, por exemplo, Patentes US Nos 5,176,996 e 5,422,251. Proteínas incluem, porém sem limitação, proteínas de ligação de DNA, fatores de transcrição, fatores de remodelagem de cretina, proteínas de ligação de DNA metiladas, polimerases, metilases, desmetilases, acetilases, desacetilases, quinases, fosfatases, ligases, desubiquitinases, integrases, recombinases, ligases, topoisomerases, girases e helicases.
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 74/118
32/70
[0064] Uma molécula exógena pode ser o mesmo tipo de molécula que uma molécula endógena, por exemplo, uma proteína ou ácido nucleico exógeno. Por exemplo, um ácido nucleico exógeno pode compreender um genoma viral infectante, um plasmídio ou epissoma introduzido em uma célula, ou um cromossoma que normalmente não está presente na célula. Métodos para a introdução de moléculas exógenas em células são conhecidos pelos especialistas na técnica e incluem, porém sem limitação, transferência mediada por lipídios (i.e., lipossomas, incluindo lipídios neutros e catiônicos), eletroporação, injeção direta, fusão de células, bombardeamento de partículas, coprecipitação com fosfato de cálcio, transferência mediada por DEAE-dextrana e transferência mediada por vetor viral. Uma molécula exógena também pode ser o mesmo tipo de molécula que uma molécula endógena, porém derivada de uma espécie diferente daquela da qual a célula deriva. Por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos humana pode ser introduzida em uma linhagem celular originalmente derivado de um camundongo ou hamster.
[0065] Ao contrário, uma molécula endógena é uma molécula que normalmente está presente em uma célula particular em um estágio de desenvolvimento particular em condições ambientais particulares. Por exemplo, um ácido nucleico endógeno pode compreender um cromossoma, o genoma de uma mitocôndria, cloroplasto ou outra organela, ou um ácido nucleico epissômico de ocorrência natural. Moléculas endógenas adicionais podem incluir proteínas, por exemplo, fatores de transcrição e enzimas.
[0066] Conforme usado neste pedido, o termo produto de um ácido nucleico exógeno inclui produtos tanto polinucleotídicos quanto polipeptídicos, por exemplo, produtos de transcrição (polinucleotídeos tais como RNA) e produtos de translação (polipeptídeos).
[0067] Uma molécula de fusão na qual duas ou mais moléculas subunitárias são ligadas, de preferência covalentemente. As moléculas
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 75/118
33/70 subunitárias podem ser do mesmo tipo químico de molécula ou podem ser moléculas de tipos químicos diferentes. Exemplos de moléculas de fusão incluem, porém sem limitação, proteínas de fusão (por exemplo, uma fusão entre um domínio de ligação de DNA proteico e um domínio de divagem), fusões entre um domínio de ligação de DNA polinucleotídico (por exemplo, sgRNA) operacionalmente associado a um domínio de divagem, e ácidos nucieicos de fusão (por exemplo, um ácido nucleico codificando a proteína de fusão).
[0068] A expressão de uma proteína de fusão em uma célula pode ser resultado da distribuição da proteína de fusão para a célula ou da distribuição de um polinucleotídeo codificando a proteína de fusão para uma célula, em que o polinucleotídeo é transcrito, e o transcrito é transladado, para gerar a proteína de fusão. Trans-emenda, divagem de polipeptídeos e ligação de polipeptídeos também podem estar envolvidas na expressão de uma proteína em uma célula. Métodos para distribuição de polinucleotídeos e polipeptídeos para células estão apresentados em outra parte deste pedido.
[0069] Um gene, para efeitos da presente invenção, inclui uma região de DNA codificando um produto gênico (vide infra), assim como todas as regiões de DNA que regulam a produção do produto gênico, sejam essas sequências reguladoras adjacentes ou não às sequências codificadoras e/ou transcritas. Por exemplo, um gene inclui, mas se limita necessariamente a, sequências promotoras, terminadores, sequências reguladoras de translação tais como sítios de ligação de ribossoma e sítios de entrada de ribossoma interno, potencializadores, silenciadores, isolantes, elementos fronteiriços, regiões de replicação, sítios de ligação de matriz e regiões de controle de locos.
[0070] Expressão gênica refere-se a conversão das informações, contidas em um gene, em um produto gênico. Um produto gênico pode ser um produto transcricional direto de um gene (por exemplo, mRNA, tRNA, rRNA, RNA antissenso, ribozima, RNA estrutural ou qualquer
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 76/118
34/70 outro tipo de RNA) ou uma proteína produzida por translação de um mRNA. Produtos gênicos também incluem RNAs que sâo modificados por processos tais como capeamento, poliadenilação, metilação, e edição, e proteínas modificadas por, por exemplo, metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, ribosilação de ADP, miristilação, e glicosilação.
[0071] Modulação de expressão gênica refere-se a uma alteração na atividade de um gene. Modulação de expressão pode incluir, porém sem limitação, ativação gênica e repressão gênica. Edição de genoma (por exemplo, divagem, alteração, inativação, mutação aleatória) pode ser usada para modular a expressão. Inativação gênica refere~se a qualquer redução na expressão gênica comparada a uma célula hospedeira que não inclui um ZFP, TALE ou sistema CRISPR/Cas descrito neste pedido. Assim sendo, a inativação gênica pode ser parcial ou completa. Uma célula modificada geneticamente inclui células com qualquer alteração no material genético da célula, incluindo, porém sem limitação, modificações epissômicas e/ou genômicas. Exemplos não limitativos de modificações genéticas incluem inserções e/ou deleções (por exemplo, integração epissômica e/ou vetorizada de um ou mais transgenes, RNAs ou sequências não codificadoras) e/ou mutações (por exemplo, mutações pontuais, substituições, etc.) que alteram a expressão proteica na célula).
[0072] Uma região de interesse é qualquer região de cromatina celular, tal como, por exemplo, um gene ou uma sequência não codificadora em um gene ou adjacente ao mesmo, na qual é desejável ligar uma molécula exógena. A ligação pode ter a finalidade de divagem vetorizada de DNA e/ou de recombinação vetorizada. Uma região de interesse pode estar presente em um cromossoma, um epissoma, um genoma organelar (por exemplo, mitocondrial, cloroplasto), ou um genoma viral infectante, por exemplo. Uma região de interesse pode estar no interior da região codificadora de um gene, no interior de regiões
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 77/118
35/70 não codificadores transcritas tais como, por exemplo, sequências condutoras, sequências rebocadoras ou introns, ou no interior de regiões não transcritas, seja a montante ou a jusante da região codificadora. Uma região de interesse pode sertão pequena quanto um único par de nucieotídeos até 2.000 pares de nucleotídeos de comprimento, ou qualquer valor inteiro de pares de nucleotídeos.
[0073] Células eucarióticas incluem, porém sem limitação, células fúngicas (tais como leveduras), células vegetais, células animais, células de mamífero e células humanas (por exemplo, células B), incluindo células-tronco (pluripotentes e multipotentes).
[0074] Os termos ligação operacional e operacionalmente ligado (ou operativamente ligado) são usados intercambiavelmente com referência a uma justaposição de dois ou mais componentes (tais como elementos de sequências), nos quais os componentes são dispostos de tal modo que ambos os componentes funcionem normalmente e oferecem a possibilidade de que pelo menos um dos componentes possa mediar uma função que seja exercida em pelo menos um dos outros componentes. A título de ilustração, uma sequência reguladora de transcrição, tal como um promotor, está operacionalmente ligada a uma sequência codificadora se a sequência reguladora de transcrição controlar o nível de transcrição da sequência codificadora em resposta à presença ou ausência de um ou mais fatores reguladores de transcrição. Uma sequência reguladora de transcrição geralmente é operacionalmente ligada em cis com uma sequência codificadora, mas não precisar ser diretamente adjacente à mesma. Por exemplo, um potencializador é uma sequência reguladora de transcrição que está operacionalmente ligada a uma sequência codificadora, mesmo que elas não sejam contíguas.
[0075] Um fragmento funcional de uma proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico é uma proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico cuja sequência não é idêntica à proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico de
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 78/118
36/70 comprimento ainda, e ainda assim conserva a mesma função que a proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico de comprimento integral. Um fragmento funcional pode possuir mais, menos, ou o mesmo número de resíduos que a molécula nativa correspondente, e/ou pode conter uma ou mais substituições aminoacídicas ou nucleotídicas. Métodos para determinação da função de um ácido nucleico (por exemplo, função codificadora, capacidade de hibridizar para outro ácido nucleico) são bastante conhecidos na técnica. De maneira similar, métodos para determinação da função de proteínas são bastante conhecidos. Por exemplo, o Fator VIII humano de domínio B deletado é fragmento funcional da proteína Fator VIII de comprimento integral.
[0076] Um vetor ou construto polinucleotídico é capaz de transferir sequências gênicas para células alvo. Tipicamente, construto vetorial, vetor de expressão, construto de expressão, cassete de expressão, e vetor de transferência de gene significam qualquer construto de ácido nucleico capaz de direcionar a expressão de um gene de interesse e que pode transferir sequências gênicas para células alvo. Portanto, o termo inclui clonagem, e veículos de expressão, assim como vetores de integração.
[0077] Os termos indivíduo e paciente são usados intercambiavelmente e referem-se a mamíferos tais como pacientes humanos e primatas não humanos, assim como animais experimentais tais como coelhos, cachorros, gatos, ratos, camundongos, e outros animais. Por conseguinte, o termo indivíduo ou paciente, conforme usado neste pedido, significa qualquer paciente ou indivíduo mamífero ao qual os cassetes de expressão da invenção podem ser admdinistrados. Os indivíduos da presente invenção incluem aqueles com algum distúrbio. Construtos de expressão de células B
[0078] Neste pedido estão descritos cassetes (construtos) de expressão para uso no direcionamento da expressão de um transgene em uma célula B (incluindo plasmoblastos e células plasmáticas), in
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 79/118
37/70 cluindo a administração subsequente in vivo dos cassetes de expressão ao indivíduo (por exemplo, distribuição intravenosa). O construto de expressão pode ser mantido epíssomicamente e induzir a expressão transgênica extracromossomicamente ou, alternativamente, o construto de expressão pode ser integrado no genoma de uma célula B, por exemplo, por integração vetorizada mediada por nuclease.
[0079] Qualquer sequência promotora adequada pode ser usada nos cassetes de expressão da invenção. Em certas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em outras modalidades, o promotor é um promotor induzível e/ou é um promotor específico para células
B. Construtos sem promotor nos quais o transgene é induzido por um promotor de células B endógeno também são contemplados para modificação genética das células descritas neste pedido.
[0080] Como ficará evidente, qualquer transgene pode ser usado nos construtos descritos neste pedido. Além disso, os componentes individuais do construto de expressão (promotor, potencializador, isolante, íntron, transgene, etc.) dos construtos descritos neste pedido podem estar ou não presentes, e podem ser misturados e combinados em qualquer combinação.
[0081] Os construtos descritos neste pedido podem estar contidos em qualquer vetor viral ou não viral. Os construtos podem ser mantidos epissomicamente ou podem ser integrados no genoma da célula (por exemplo, via integração vetorizada mediada por nuclease).
[0082] Vetores não virais incluem plasmídios de DNA ou de RNA, DNA MCs, ácido nucleico nu, e ácido nucleico complexo com um veículo de distribuição tal como um lipossoma, uma nanopartícula lipídica, uma nanopartícula ou um poloxâmero. Vetores virais que podem ser usados para transportar os cassetes de expressão descritos neste pedido incluem, porém sem limitação, vetores retrovirais, lentivirais, adenovirais, vetores do vírus adenoassociado, vetores do vírus da vacínia e do herpes simples. A integração no genoma hospedeiro é possível
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 80/118
38/70 com métodos de transferência de genes de retrovirus, de lentivirus, e de vírus adenoassociado, e como descrito neste pedido pode ser facilitada por integração mediada por nuclease.
[0083] Em certas modalidades preferidas, os construtos são incluídos em um vetor ou sistema vetorial de vírus adenoassociado (AAV) que pode ser mantido epissomicamente ou integrado no genoma de uma célula B (por exemplo, por integração mediada por nuclease). A construção de vetores de AAV recombinantes está descrita em inúmeras publicações, incluindo Patente US N° 5,173,414; Tratschin et ah, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); e Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).
[0084] Assim sendo, em certas modalidades, o construto de expressão é carregado em um construto de AAV e compreende ainda 5' e 3' ITRs flanqueando os elementos do construto de expressão (por exemplo, potencializador, promotor, íntron opcional, transgene, etc.) como descrito neste pedido. Opcionalmente, moléculas espaçadoras também são incluídas entre um ou mais dos componentes do construto de expressão, por exemplo, entre a 5' ITR e o potencializador e/ou entre o sinal de poliadenilação e a 3' ITR. Os espaçadores podem funcionar como braços de homologia para facilitar a recombinação em um locus de porto seguro (por exemplo, albumina). Em certas modalidades, o construto é um construto como mostrado na Figura 8.
[0085] Em certas modalidades, os vetores de AAV descritos neste pedido podem ser derivados de qualquer AAV. Em certas modalidades, o vetor de AAV é derivado do vírus adeno-associado tipo 2 parvovirus defeituoso e não patogênico. Todos esses vetores são derivados de um plasmídio que conserva apenas as repetições terminais invertidas de 145 bp do AAV flanqueando o cassete de expressão transgênica. A transferência eficiente de genes e a distribuição estável de transgenes devido à integração nos genomas da célula transduzida são atributos
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 81/118
39/70 essenciais para este sistema vetoriai. (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). Outros sorotipos de AAV, incluindo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 e AAVrh,10 e qualquer sorotipo novo de AAV também podem ser usados de acordo com a presente invenção. Especialmente preferidos são os sorotipos AAV6. Em algumas modalidades, usa-se AAV quimérico onde as origens viraís das sequências de ITR do ácido nucleico viral são heterólogas à origem viral das sequências de capsídeos. Exemplos não limitativos incluem vírus quimérico com ITR derivada de AAV2 e capsídeos derivados de AAV5, AAV6, AAV8 ou AAV9 (i.e., AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8 e AAV2/9, respectivamente). [0086] Vetores retrovirais incluem aqueles baseados no vírus da leucemia murina (MuLV), vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV), vírus da imunodeficiência símia (SIV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), e combinações dos mesmos (vide, por exemplo, Buchscher et al.,J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al.,J. Virol. 66:16351640 (1992); Sommerfelt et a!.,Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al.,J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al.,J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).
[0087] Os construtos descritos neste pedido também podem ser incorporados em sistema vetorial adenoviral. Vetores adenovirais são capazes de eficiência de transdução multo alta em muitos tipos de células e não requerem divisão celular. Com tais vetores, foram obtidos titulação elevada e altos níveis de expressão. Esse vetor pode ser produzido em grandes quantidades em um sistema relativamente simples. [0088] pLASN e MFG-S são exemplos de vetores retrovirais que foram usados em ensaios clínicos (Dunbar et al.,Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al.,Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al.,PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN foi o primeiro vetor terapêutico usado em um ensaio de terapia genética. (Blaese et al.,Science 270:475-480 (1995)). Foram observadas eficiências de transdução de
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 82/118
40/70
50% ou mais para vetores acondicionados em MFG-S. (Ellem et al.,Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al.,Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).
[0089] Vetores adenovirais recombinantes deficientes de replicação (Ad) também podem ser usados com os polinucleotídeos descritos neste pedido. A maioria dos vetores adenovirais é modificada geneticamente para que um transgene substitua os genes E1a, E1 b, e/ou E3 de Ad; subsequentemente o vetor de replicação defeituoso é propagada em células 293 humanas que suprem a função do gene deletado em trans. Os vetores Ad podem transduzir múltiplos tipos de tecidos in vivo, incluindo células diferenciadas não divididas tais como aquelas encontradas no fígado, no rim e no músculo. Os vetores Ad convencionais têm grande capacidade de transporte. Um exemplo do uso de um vetor Ad em um ensaio clínico envolveu terapia polinucleotídica para imunização contra tumores com injeção intramuscular (Sterman et al.,Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). Exemplos adicionais do uso de vetores adenovirais para transferência de genes em ensaios clínicos incluem Rosenecker et al.,Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al.,Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al.,Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al.,Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al.,Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al.,Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).
[0090] Células acondicionadoras são usadas para formar partículas virais que são capazes de infectar uma célula hospedeira. Tais células incluem células HEK293 e Sf9, que podem ser usadas para acondicionar AAV e adenovirus, e células ψ2 ou células PA317, que acondicionam retrovirus. Os vetores virais usados em terapia genética normalmente são gerados por uma linhagem celular produtora que acondiciona um vetor de ácido nucleico em uma partícula viral. Os vetores contêm tipicamente as sequências virais mínimas necessárias para acondicionamento e subsequente integração em um hospedeiro
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 83/118
41/70 (se aplicável), outras sequências virais sendo substituídas por um cassete de expressão codificando a proteína a ser expressa. As funções virais que faltam são supridas em trans pela linhagem celular acondicionadora. Por exemplo, os vetores de AAV usados em terapia genética possuem apenas sequências de repetições terminais invertidas (ITR) provenientes do genoma de AAV que são necessárias para acendidonamento e integração no genoma hospedeiro. DNA viral é acondicionado em uma linhagem celular que contém um plasmídio auxiliar codificando os outros genes de AAV, a saber, rep e cap, mas que não possui sequências de ITR. A linhagem celular também é infectada com adenovirus como um auxiliar. O vírus auxiliar promove a replicação do vetor de AAV e a expressão de genes de AAV a partir do plasmídio auxiliar. O plasmídio auxiliar não é acondidonado em quantidades significativas devido a uma falta de sequências de ITR. A contaminação com adenovirus pode ser reduzida por, por exemplo, um tratamento térmico ao qual o adenovirus é mais sensível que o AAV. Em algumas modalidades, o AAV é produzido usando-se um sistema de expressão de baculovírus (vide, por exemplo, Patentes US 6,723,551 e 7,271,002).
[0091] A purificação de partículas de AAV a partir de um sistema de 293 ou de baculovírus tipicamente envolve o crescimento das células que produzem o vírus, seguido pela coleta das partículas vitais do sobrenadante celular ou lise das células e coleta do vírus do lisado bruto. O AAV é então purificado por métodos conhecidos na literatura incluindo cromatografia de troca iônica (vide, por exemplo, Patentes US 7,419,817 e 6,989,264), cromatografia de troca iônica e centrifugação por gradiente de densidade de CsCI (por exemplo, publicação PCT WO2011094198A10), cromatografia por afinidade (por exemplo, WO2016128408) ou purificação usando AVB Sepharose (por exemplo, GE Healthcare Life Sciences).
[0092] Em muitas aplicações de terapia genética, é desejável que o vetor da terapia genética seja distribuído com um alto grau de especi
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 84/118
42/70 ficidade para um tipo de tecido particular. Por conseguinte, um vetor viral pode ser modificado para ter especificidade para um dado tipo de célula por expressão de um ligando como uma proteína de fusão com uma proteína do revestimento viral na superfície externa do vírus. O ligando é escolhido para ter afinidade para um receptor sabidamente presente no tipo de célula de interesse. Por exemplo, Han et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:9747-9751 (1995), relataram que o vírus da leucemia murina de Moloney pode ser modificado para expressar a heregulina humana fundida ao gp70, e o vírus recombinante infecta certas células de câncer de mama humano expressando o receptor do fator de crescimento epidérmico humano. Este princípio pode ser estendido a outros pares de células alvo do vírus, nos quais a célula alvo expressa um receptor e o vírus expressa uma proteína de fusão compreendendo um ligando para o receptor de superfície celular. Por exemplo, fago filamentoso pode ser modificado geneticamente para apresentar fragmentos de anticorpos (por exemplo, FAB ou Fv) tendo afinidade de ligação específica para virtualmente qualquer receptor celular escolhido. Embora a descrição acima se aplique principalmente a vetores virais, os mesmos princípios podem ser aplicados a vetores não virais. Tais vetores podem ser modificados geneticamente para conter sequências de absorção específicas que favorecem a absorção por células alvo específicas.
[0093] Os polinucleotídeos descritos neste pedido podem incluir uma ou mais bases e/ou esqueletos não naturais. Em particular, um de descrito neste pedido pode incluir citosinas metiladas para atingir um estado de quiescência transcricional em uma região de interesse.
[0094] Além disso, os construtos de expressão descritos neste pedido também podem incluir sequências reguladoras de transcrição ou translação adicionais ou outras sequências, por exemplo, sequências Kozak, promotores adicionais, potencializadores, isolantes, introns, sítios de entrada de ribossoma interno, sequências codificando peptí
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 85/118
43/70 deos 2A, sítios de divagem de furina e/ou sinais de poliadenilação. Além disso, os elementos de controle dos genes de interesse podem ser operacionalmente ligados a genes repórteres para criar genes quiméricos (por exemplo, cassetes de expressão repórteres). Modificações
[0095] Neste pedido estão descritas células B modificadas geneticamente compreendendo uma ou mais das seguintes modificações: (a) a apresentação de um ou mais transgenes (epissômicos e/ou integrados em qualquer combinação) na célula; (b) inserções e/ou deleções em um ou mais genes que modificam (i) genes do receptor de células B, e/ou (ii) interações celulares em centros germinativos; e/ou (c) modificações (mutações) que inibem a supressão de qualquer função das células B associada à infecção patogênica ou regulação de um câncer. As células B modificadas geneticamente descritas neste pedido também podem ser descendentes de HSCs compreendendo uma ou mais dessas modificações genéticas.
[0096] Em certas modalidades, os construtos descritos neste pedido podem ser usados para expressão de quaisquer transgenes em células B. Um ou mais transgenes podem ser expressos epissomicamente nas células B modificadas e/ou subsequente à integração vetorizada mediada por nuclease de um ou mais dos transgenes. Transgenes (também chamados de genes de Interesse e/ou sequências exógenas) exemplificativos incluem, porém sem limitação, qualquer sequência codificadora de polipeptídeo (por exemplo, cDNAs), sequências promotoras, sequências potencializadoras, etiquetas epitópicas, genes marcadores, sítios de reconhecimento de enzimas de divagem e/ou vários tipos de construtos de expressão. Genes marcadores incluem, porém sem limitação, sequências codificando proteínas que medeiam a resistência a antibióticos (por exemplo, resistência à ampicilina, resistência à neomicina, resistência a G418, resistência à puromicina), sequências codificando proteínas coloridas ou fluorescentes ou luminescentes (por
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 86/118
44/70 exemplo, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde intensificada, proteína fluorescente vermelha, luciferase), e proteínas que medeiam o crescimento celular intensificado e/ou a amplificação gênica (por exemplo, di~hidrofolato redutase). Etiquetas epitópicas incluem, por exemplo, uma ou mais cópias de FLAG, His, myc, Tap, HA ou qualquer sequência de aminoácidos detectável.
[0097] Em uma modalidade preferida, o transgene compreende um polinucleotídeo codificando qualquer polipeptídeo cuja expressão na célula é desejada, incluindo, porém sem limitação, anticorpos, antígenos, enzimas, receptores (da superfície celular ou nucleares), hormônios, linfocinas, citocinas, polipeptídeos repórteres, fatores de crescimento, e fragmentos funcionais de qualquer um dos acima. As sequências codificadoras podem ser, por exemplo, cDNAs.
[0098] Em certas modalidades, os transgenes codificam versões funcionais de proteínas faltantes ou deficientes em qualquer doença genética, incluindo, por exemplo, distúrbios de armazenamento lisossômico (por exemplo, Gaucher, Fabry, Hunter, Hurler, Neimann-Pick, etc.), distúrbios metabólicos, e/ou distúrbios sanguíneos tais como hemofilias e hemoglobinopatias, etc. Vide, por exemplo, Publicação US N° 20140017212 e 20140093913; Patentes US Nos 9,255,250 e 9,175,280.
[0099] Por exemplo, o transgene pode compreender uma sequência codificando um polipeptídeo que falta ou é não funcional no indivíduo com uma doença genética, incluindo, porém sem limitação, qualquer uma das seguintes doenças genéticas: acondroplasia, acromatopsia, deficiência de maltase ácida, deficiência de adenosina deaminase (OMIM No. 102700), adrenoleucodistrofia, síndrome de Aicardi, deficiência de antitripsina alfa-1, alfa-talassemia, síndrome de insensibilidade a androgênio, síndrome de Apert, displasia arritmogênica do ventrículo direito, ataxia telangictasia, síndrome de Barth, beta-talassemia, síndrome do nevo em bolha de borracha azul, doença de Canavan,
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 87/118
45/70 doenças granulomatoses crônicas (CGD), síndrome do miado do gato, fibrose cística, doença de Dercum, displasia ectodérmica, anemia de Fanconi, fibrodisplasia ossificante progressiva, síndrome do X frágil, galactosemia, doença de Gaucher, gangliosidoses generalizadas (por exemplo, GM1), hemocromatose, a mutação da hemoglobina C no 6o códon da beta-globina (HbC), hemofilia, doença de Huntington, síndrome de Hurler, hipofosfatasia, síndrome de Klinefleter, doença de Krabbes, síndrome de Langer-Giedion, deficiência de adesão leucocitária (LAD, OMIM No. 116920), leucodistrofia, síndrome do QT longo, síndrome de Marfan, síndrome de Moebius, mucopolissacaridose (MPS), síndrome da unha-patela, diabetes insípido nefrogênico, neurofibromatose, doença de Neimann-Pick, osteogênese imperfeita, porfíria, síndrome de Prader-Willi, progeria, síndrome de Proteus, retinoblastoma, síndrome de Rett, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Sanfilippo, imunodeficiência combinada severa (SCID), síndrome de Shwachman, doença de células falciformes (anemia de células falciformes), síndrome de Smith-Magenis, síndrome de Stickler, doença de Tay-Sachs, síndrome da trombocitopenia e agenesia de rádio (TAR), síndrome de Treacher Collins, trissomia, esclerose tuberosa, síndrome de Turner, distúrbio do ciclo da ureía, doença de von Hippel-Landau, síndrome de Waardenburg, síndrome de Williams, doença de Wilson, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome linfoproliferativa ligada ao fator X (XLP, OMIM No. 308240), imunodeficiências adquiridas, doenças de armazenamento lisossômico (por exemplo, doença de Gaucher, GM1, doença de Fabry e doença de Tay-Sachs), mucopolissacaridose (por exemplo, doença de Hunter, doença de Hurler), hemoglobinopatias (por exemplo, doenças de células falciformes, HbC, α-talassemia, βtalassemia) e hemofílías.
[0100] Exemplos não limitativos de proteínas (incluindo fragmentos funcionais das mesmas tais como versões truncadas) que podem ser expressas da maneira descrita neste pedido incluem fibrinogênio, pro
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 88/118
46/70 trombina, fator tecidual, Fator V, Fator VIL Fator VIII, Fator IX, Fator X, Fator XI, Fator XII (fator de Hageman), Fator XIII (fator estabilizador de fibrina), fator de von Willebrand, precalicreína, cininogênio de alto peso molecular (fator de Fitzgerald), fibronectina, antitrombina III, cofator heparínico II, proteína C, proteína S, proteína Z, inibidor da protease relacionada com a proteína Z, plasminogênio, 2-antiplasmina alfa, ativador de plasminogênio tecidual, uroquinase, inibidor-1 do ativador de plasminogênio, inibidor~2 do ativador de plasminogênio, glicocerebrosidase (GBA), o-galactosidase A (GLA), iduronato sulfatase (IDS), iduronidase (IDUA), esfingomielinase ácida (SMPD1), MMAA, MMAB, MMACHC, MMADHC (C2orf25), MTRR, LMBRD1, MTR, propionil-CoA carboxilase (PCC) (subunidades PCCA e/ou PCCB), uma proteína transportadora de glicose-6-fosfato (G6PT) ou glicose-6-fosfatase (G6Pase), um receptor de LDL (LDLR), ApoB, LDLRAP-1, uma PCSK9, uma proteína mitocondrial tal como NAGS (N-acetilglutamate sintetase), CPS1 (carbamoil fosfato sintetase I), e OTC (ornitina transcarbamilase), ASS (ácido argininossuccínico sintetase), ASL (argininossuccinato liase) e/ou ARG1 (arginase), e/ou uma proteína da família 25 de veículos de soluto (SLC25A13, um veículo de aspartato/glutamato), um polipeptídeo A1 de glucuronsiltransferase UGT1A1 ou UDP, uma fumarilacetoacetato hidroliase (FAH), uma proteína alanina-glioxilato aminotransferase (AGXT), uma proteína glioxilato redutase/hidroxipiruvato redutase (GRHPR), uma proteína do gene da transtiretina (TTR), uma proteína ATP7B, uma proteína fenilalanina hidroxilase (PAH), uma proteína lipoproteína liase (LPL), uma nuclease modificada geneticamente, um fator de transcrição modificado geneticamente e/ou um anticorpo de cadeia simples terapêutico.
[0101] Em outras modalidades, as células B modificadas geneticamente descritas neste pedido incluem um ou mais transgenes codificando um ou mais anticorpos que são moléculas modificadas geneticamente desenhadas para vetorizar células imunes via alvos molecula
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 89/118
47/70 res específicos expressos nas superfícies celulares. Em algumas modalidades, as células B modificadas geneticamente expressam anticorpos desenhados para vetorizar células B endógenas. Estes anticorpos podem induzir a eliminação mediada por anticorpos (por exemplo, através de eliminação mediada por ADCC ou pelo complemento) de células B ou outras células imunes envolvidas na atenuação de uma resposta imunológica.
[0102] As células B descritas neste pedido podem ser modificadas geneticamente para produzir um ou mais anticorpos que são específicos para células B produzindo anticorpos indesejáveis. Exemplos não limitativos de células B produzindo anticorpos indesejáveis incluem células B produzindo anticorpos contra proteínas administradas na ERT (fatores de coagulação tais como F8, F9, etc. em pacientes hemofílicos, e/ou proteínas faltantes ou deficientes em distúrbios de armazenamento lisossômico). Construtos codificadores de anticorpos são introduzidos no precursor de células B ou na célula B ex vivo, de modo que quando a célula é reintroduzida no paciente as células B produtoras de anticorpos vetorizam especialmente as células (células B) produzindo a proteína (por exemplo, anticorpo) ligada pelo anticorpo modificado geneticamente. Em certas modalidades, o anticorpo modificado geneticamente é específico para anticorpos direcionados contra uma proteína terapêutica fornecida exogenamente (via ERT e/ou terapia genética) para que os anticorpos contra as proteínas terapêuticas sejam neutralizados. Portanto, as composições e os métodos descritos neste pedido incluem células B modificadas geneticamente que produzem anticorpos que vetorizam especificamente os anticorpos (por exemplo, os anticorpos anti-F9) produzidos pelo paciente. As células B modificadas geneticamente dessas composições e métodos podem ser administradas ao indivíduo como células B maduras, ou como células precursoras (tais como HSCs ou células progenitoras de linfoides) que são diferenciadas no indivíduo depois da administração ou, alternati
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 90/118
48/70 vamente, podem ser modificadas geneticamente in vivo. Em ainda outras modalidades, as proteínas produzidas a partir dos transgenes (por exemplo, anticorpos anti-ERT) das células B modificadas geneticamente são isoladas e administrados ao indivíduo com necessidade das mesmas, por exemplo, um paciente com necessidade de anticorpos para os anticorpos anti-ERT gerados pelo seu corpo.
[0103] Em ainda outras modalidades, o transgene pode ser um anticorpo específico para célula B que seja sensível a uma proteína envolvida em uma doença autoimune. O termo doença autoimune refere-se a qualquer doença ou distúrbio no qual o indivíduo produz uma resposta imunológica destrutiva contra seu próprio tecido. Os distúrbios autoimunes podem afetar praticamente todo sistema orgânico no indivíduo (por exemplo, um ser humano), incluindo, porém sem limitação, doenças dos sistemas nervoso, gastrointestinal, e endócrino, assim como a pele e outros tecidos conjuntivos, olhos, sangue e vasos sanguíneos. Exemplos de doenças autoimunes incluem, porém sem limitação, tireoidite de Hashimoto, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjogren, doença de Graves, esclerodermia, artrite reumatoide, esclerose múltipla, miastenia grave e diabetes. Assim sendo, as células B descritas neste pedido podem compreender uma molécula (por exemplo, um anticorpo modificado geneticamente) direcionado para uma população de células B em um indivíduo que é sensível a (e produz anticorpos contra) um autoantígeno envolvido em uma doença autoimune, incluindo, porém sem limitação, proteína básica de mielina (MBP), insulina, ANA, proteínas de articulação ou músculo, proteínas de tireoide, entre outras.
[0104] Em certas modalidades, o transgene pode compreender um gene marcador (descrito acima), permitindo a seleção de células que sofreram integração vetorizada, e uma sequência ligada codificando uma funcionalidade adicional, exemplos não Hmitativos de genes marcadores incluem GFP, marcadores de seleção de droga, entre outros.
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 91/118
49/70
[0105] Os construtos descritos neste pedido também podem ser usados para distribuição de transgenes não codificadore. Sequências codificando RNAs antissenso, RNAi, shRNAs e micro RNAs (miRNAs) também podem ser usadas para inserções vetorizadas.
[0106] Em certas modalidades, o transgene inclui sequências (por exemplo, sequências codificadoras, também chamadas de transgenes) com mais de 1 kb de comprimento, por exemplo, entre 2 e 200 kb, entre 2 e 10 kb (ou qualquer valor entre estes). O transgene também pode incluir um ou mais sítios alvo de nuclease. O transgene também pode compreender um ou mais braços de homologia. Os braços de homologia compreendem sequências com um alto grau de homologia com aqueles que flanqueiam um sítio alvo de divagem de nuclease. Um braço de homologia pode compreender 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 ou mais nucleotídeos ou qualquer valor entre estes.
[0107] Quando integrado (por exemplo, via integração mediada por nuclease), o transgene pode ser inserido em um gene endógeno de modo que todos, alguns ou nenhum dos genes endógenos seja expresso.
Nucleases
[0108] Como observado acima, os cassetes de expressão podem ser mantidos epissomicamente ou podem ser integrados no genoma da célula. A integração pode ser aleatória. Em certas modalidades, a integração dos construtos de transgene é vetorizada para um gene específico subsequente à divagem do gene alvo por uma ou mais nucleases (por exemplo, nucleases dedo-de~zinco (ZFNs), TALENs, TtAgo, sistemas de nucleases CRISPR/Cas, e endonucleases zeladoras) e o construto é integrado por reparo direcionado por homologia (HDR) ou por captura de extremidade durante processos induzidos pela união de extremidades não homólogas (NHEJ). Vide, por exemplo, Patentes US Nos 9,394,545; 9,150,847; 9,206,404; 9,045,763; 9,005,973; 8,956,828; 8,936,936; 8,945,868; 8,871,905; 8,586,526; 8,563,314; 8,329,986;
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 92/118
50/70
8,399,218; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,067,317; 7,262,054; 7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; Publicações de Patente US 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060063231; 20080159996;
20100218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104;
20130122591; 20130177983 e 20130177960 e 20150056705, cujas descrições estão aqui incorporadas em sua íntegra a título de referência para todos os fins.
[0109] Qualquer nuclease pode ser usada para integração vetorizada do construto de expressão transgênica.
[0110] Em certas modalidades, a nuclease compreende uma nuclease dedo-de~zinco (ZFN), que compreende um domínio de ligação de DNA dedo-de-zinco e um domínio de divagem (nuclease). Vide, por exemplo, Patentes US Nos 9,255,250; 9,200,266; 9,045,763; 9,005,973; 9,150,847; 8,956,828; 8,945,868; 8,703,489; 8,586,526; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,067,317; 7,262,054; 7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861.
[0111] Em outras modalidades, a nuclease compreende uma TALEN, que compreende um domínio de ligação de DNA efetor de TAL e um domínio de divagem (nuclease). Vide, por exemplo, Patente US N° 8,586,526 e Publicação US N° 20130196373.
[0112] Em ainda outras modalidades, a nuclease compreende um sistema de nudease CRISPR/Cas, que inclui um único RNA guia para reconhecimento do sítio alvo e um ou mais domínios de divagem. Vide, por exemplo, Publicação de Patente US N° 20150056705. Em algumas modalidades, usa-se o sistema CRISPR-Cpf1 (vide Fagerlund et al., (2015) Genom Bio 16:251). Fica entendido que o termo sistema CRISPR/Cas refere-se tanto a sistemas CRISPR/Cas quanto sistemas CRISPR/Cfpl.
[0113] Os domínios de divagem das nucleases podem ser do tipo selvagem ou mutados, incluindo domínios de divagem de ocorrência
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 93/118
51/70 não natural (modificados geneticamente) que foram heterodímeros obrigatórios. Vide, por exemplo, Patentes US Nos 8,623,618; 7,888,121; 7,914,796; e 8,034,598 e Publicação US N° 20110201055. [0114] As nucleases podem fazer um ou mais cortes de fita dupla e/ou de fita simples no sítio alvo. Em certas modalidades, a nuclease compreende um domínio de divagem cataliticamente inativo (por exemplo, proteína Fokl e/ou Cas). Vide, por exemplo, Patente US N° 9,200,266; 8,703,489 e Guillinger et a/.. (2014) Nature Biotech. 32(6): 577-582. O domínio de divagem cataliticamente inativo pode, combinado com domínio cataliticamente ativo, agir como uma nicase para fazer um corte de fita simples. Por conseguinte, duas nicases podem ser usadas combinadas para fazer um corte de fita dupla em uma região específica. Nicases adicionais também são conhecidas na literatura, por exemplo, McCaffery et ai.. (2016) Nucleic Acids Res. 44(2):e11. doi: 10,1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19.
[0115] Em certas modalidades, a nuclease diva um gene de porto seguro (por exemplo, CCR5, Rosa, albumina, AAVS1, TCRA, TCRB, etc. Vide, por exemplo, Patentes US Nos 7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; 8,586,526; Publicações de Patente US 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198;
20130137104; 20130122591; 20130177983 and 20130177960. Em modalidades preferidas, a nuclease cliva um gene de albumina endógena para que o cassete de expressão seja integrado no locus da albumina endógena de uma célula hepática. Nucleases albuminaespecíficas estão descritas, por exemplo, na Patente US N° 9,150,847; e Publicações US Nos 20130177983 e 20150056705.
Distribuição
[0116] Os construtos descritos neste pedido (e/ou nucleases) podem ser distribuídos in vivo por qualquer adequado para qualquer tipo de célula, de preferência para o baço ou linfonodos secundários. De
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 94/118
52/70 maneira similar, quando usados em combinação com nucleases para integração vetorizada, as nucleases podem ser distribuídas na forma de polinucleotídeos e/ou proteínas, por exemplo, usando vetores não virais, vetores virais e/ou na forma de RNA, por exemplo, como mRNA. [0117] Métodos de distribuição não viral de ácidos nucleicos incluem eletroporação, lipofecção, microinjeção, biolística, virossomas, lipossomas, nanopartículas lipídicas, imunolipossomas, outras nanopartículas, conjugados de policárion ou lipídio:ácido nucleico, DNA nu, virions artificiais, absorção de DNA melhorada por um agente. Também é possível usar sonoporação usando, por exemplo, o sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) para distribuição de ácidos nucleicos. Sistemas de ácidos nucleicos exemplificativos adicionais incluem aqueles fornecidos pela Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) e Copernicus Therapeutics Inc., (vide, por exemplo, o documento US6008336).
[0118] Em modalidades preferidas, os construtos de expressão são vetores de AAV. As nucleases opcionais podem ser administradas na forma de mRNA ou por meio de um ou mais vetores virais (AAV, Ad, etc.). A administração pode ser por qualquer melo pelo qual os polinucleotídeos são distribuídos para as células-alvo desejadas. Métodos tanto in vivo como ex vivo são contemplados. Injeção intravenosa em um vaso sanguíneo periférico é um método de administração preferido. Outros modos de administração in vivo incluem, por exemplo, injeção direta em tecidos compreendendo células B incluindo linfonodos, medula óssea, plasma, sistema linfático e o baço.
[0119] Em sistemas que envolvem a distribuição de mais de polinucleotideo (por exemplo, o construto descrito neste pedido e nuclease na forma de polinucleotideo), o um ou mais polinucleotídeos são distribuídos usando um ou mais dos mesmos vetores e/ou vetores diferentes. Por exemplo, a nuclease na forma de polinucleotideo pode ser dis
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 95/118
53/70 tribuída na forma de mRNA e os construtos células B-específicos descritos neste pedido podem ser distribuídos por outras modalidades tais como vetores virais (por exemplo, AAV), DNA minicircular, DNA plasmídico, DNA linear, lipossomas, nanopartículas lipídicas, nanopartícuIas, entre outros.
[0120] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis sâo em parte determinados pela composição particular sendo administrada, assim como pelo método particular usado para administrar a composição. Por conseguinte, existe uma ampla variedade de formulações adequadas de composições disponíveis, como descrito abaixo (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989).
[0121] A quantidade eficaz de cassete de expressão (e nucleases opcionais, e/ou células modificadas) a ser administrada vai variar de paciente para paciente. Por conseguinte, as quantidades eficazes são mais bem determinadas pelo médico que estiver administrando as composições (por exemplo, células) e as dosagens apropriadas podem ser facilmente determinadas por um especialista na técnica. Análise dos níveis séricos, plasmáticos ou outros níveis teciduais do polipeptídeo terapêutico e comparação com o nível inicial antes da administração podem determinar se a quantidade sendo administrada é baixa demais, se está dentro do limite certo ou se é alta demais. As posologias adequadas para a administração inicial e as administrações subsequentes também são variáveis, mas são tipificadas por uma administração inicial seguida por administrações subsequentes, se necessário. As administrações subsequentes podem ser feitas em intervalos variáveis, variando de uma vez ao dia a uma vez ao ano a intervalos de vários anos. Um especialista na técnica vai perceber que podem ser recomendadas técnicas imunossupressoras apropriadas para evitar a inibição ou o bloqueio de transdução por imunossupressão dos vetores de distribuição, vide, por exemplo, Vilquin et al.,(1995) Human Gene Then, 6:1391-1401.
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 96/118
54/70
[0122] Formulações para administração ex vivo e in vivo incluem suspensões (por exemplo, de células modificadas geneticamente, lipossomas, nanopartículas lipídicas ou nanopartículas) em líquido ou líquidos emulsificados. Os princípios ativos geralmente são misturados com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o princípio ativo. Excipientes adequados incluem, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, entre outros, e combinações dos mesmos. Além disso, a composição pode conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, agentes estabilizantes ou outros reagentes que melhoram a eficácia da composição farmacêutica.
Aplicações
[0123] Os métodos e as composições descritos neste pedido oferecem terapias para qualquer doença por meio da apresentação de um transgene que expressa um produto faltante ou deficiente na doença ou de alguma forma trata ou previne a doença. A célula pode ser modificada in vivo ou pode ser modificada ex vivo e subsequentemente administrada a um indivíduo. Assim sendo, os métodos e as composições oferecem o tratamento e/ou a prevenção de tais doenças genéticas. Além disso, os métodos e as composições apresentados neste pedido permitem a modificação de células B de modo que estas células exibam toxicidade, produção de anticorpos e/ou características de processamento modificadas.
[0124] Os exemplos a seguir incluem modalidades exemplificativas da presente invenção nas quais a nuclease opcionalmente usada compreende uma nuclease dedo-de-zinco (ZFN). Será apreciado que nuclease tem apenas o propósito de exemplificação e outras nucleases podem ser usadas, por exemplo, TALENs, sistemas CRISPR/Cas, endonucleases zeladoras (meganucleases) com domínios de ligação de DNA modificados geneticamente e/ou fusões de ocorrência natural de
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 97/118
55/70 endonucleases zeladoras modificadas geneticamente (meganucleases) com domínios de ligação de DNA e domínios de divagem heterologos e/ou fusões de meganucleases e proteínas TALE. Além disso, será apreciado que os construtos de expressão descritos neste pedido podem ser conduzidos em outros vetores (que não AAV) para produzir os mesmos resultados no tratamento e/ou na prevenção de distúrbios causados por produção deficiente de proteínas.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Métodos Cultura de células [0125] Células B CD19+ congeladas de sangue periférico humano foram adquiridas na STEMCELL Technologies (Vancouver, Canadá). Um sistema de cultura de diferenciação de células B in vitro (vide Figura 1) já fora descrito (Jourdan et al., ibid). Todas as culturas foram feitas em meio Dulbecco modificado por Iscove (Coming, Coming, NY) e 10% soro bovino fetal (VWR, Radnor, PA).
[0126] As células foram cultivadas em uma placa de 24 poços a uma densidade de 2,0E+5 células por poço em 0,5 mL de meio de cultura. As células descongeladas e cultivadas por 4 dias em meio de ativação de células B contendo Anti-His Ab (5 pg/mL), ODN (10 pg/mL), SCD40L (50 ng/mL), IL-2 (10 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL), e IL-15 (10 ng/mL). No 4o dia de cultura, as células foram coletadas, os sobrenadantes foram recolhidos, as células foram lavadas com DPBS e então transferidas para o meio de geração de jatos de plasma (Plasma Blast) (PB) contendo IL-2 (10 ng/mL), IL-6 (40-50 ng/mL), IL-10 (50ng/mL), e IL-15 (10 ng/mL). No 7o dia de cultura, as células foram coletadas, os sobrenadantes foram recolhidos, as células foram lavadas com DPBS e então transferidas para o meio de geração de células plasmáticas (PC) contendo IL-6 (40-50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL), IFN-a (500 U/mL). No 10° dia de cultura, as células foram coletadas e os sobrenadantes foram recolhidos.
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 98/118
56/70
Modificação genética de células B
Reagentes ZFN:
[0127] Foram criados ZFNs para vetorizar TCRA (TRAC, SBS53909 e SBS53885, vide publicação de Patente US N° US-20170211075-A1), CCR5 (SBS8266 e SBS8196, vide Patente US N° 7,925,921) e AAVS1 (SBS30035 e SBS30054, vide Patente US N° 8,110,379). As sequências codificadoras dos ZFNs CCR5 e AAVS1 ZFN foram clonadas em uma versão modificada do plasmídio pGEM4Z (Promega, Madison, Wl) contendo uma sequência de 64 adeninas 3' da sequência gênica inserida (Boczkowski et a/. (2000) Cane Res 60:1028-1034), que foi linearizada por digestão com Spel para gerar modelos para a síntese de mRNA. TRAC ZFN mRNA foi produzido a partir de modelos de DNA (um para cada ZFN) via amplificação por PCR da sequência codificadora de ZFN com o kit Accuprime PFX DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os produtos de PCR foram usados como modelos para síntese de mRNA. mRNA foi preparado usando o kit mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.
[0128] Em suma, 1,0 pg de DNA codificando o ZFN foi usado como modelo para síntese de mRNA, incubado a 37°C por duas horas no tampão fornecido, seguido por digestão com DNAse fornecido com o kit. A reação de formação de cauda de poli-A in vitro não foi efetuada porque uma cauda de poli-T foi incorporada no modelo de DNA durante a geração por PCR do modelo de TRAC. Oa modelos AAVS1 e CCR5 contêm um modelo de poli-T no vetor. mRNA foi então purificado usando o mini kit RNeasy (Qiagen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante e quantificado no Nanodrop 8000 (ThermoScientific, Waltham, MA). Os iniciadores usados para os modelos de mRNA foram o iniclador dianteiro: 5s GCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAG (SEQ ID NO:1) e o Iniciador Reverso: 5,TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 99/118
57/70 TTTTTTTTTTTCTGGCAACTAGAAGGCACAG (SEQ |D N0;2)
Vetores de AAV:
[0129] Todos os vetores de AAV foram produzidos na Sangamo Therapeutics da maneira descrita abaixo. Modelos de doadores de AAV para AAVS1, CCR5 e TRAC continham braços de homologia com seus locus alvo. AAVS1 tinha um braço de homologia esquerdo e urn direito de 801 e 568 pares de base de comprimento, respectivamente. CCR5 tinha um braço de homologia esquerdo e um direito de 473 e 1431 pares de base de comprimento, respectivamente. TRAC tinha um braço de homoiogia esquerdo e um direito de 925 e 989 pares de base de comprimento, respectivamente. Um cassete de expressão de GFP compreendendo um promotor, uma sequência de GFP e um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento humano (hGHpA) foi clonado entre o braço de homologia direito e o esquerdo. O promotor foi um promotor específico para fosfoglicerato quinase (PGK) para células B (EEK). O promotor específico para células B (EEK) consistia em um 3'-potencializador, um MAR, e um potencializador intrônico a montante de um promotor da cadeia leve κ humana (Luo et a/. (2009) Blood 113:1422-1431). O modelo de doador de TRAC foi clonado em um vetor de pAAV. Os modelos de doadores de AAVS1 e CCR5 foram clonados em um plasmídio customizado pRS165 (Lombardo eta/. (2011) Nat Methods 8:861-869: Wang et al. (2012) Genome Res 22:13161326) derivado de pAAV-MCS (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). As repetições de terminal invertido de AAV2 (ITRs) foram usadas para permitir o acondicionamento como vetores de AAV usando o método de transfecção tripla (Xiao and Samulski (1998) J. Virol 72:2224-2232). Em suma, células HEK 293 foram plaqueadas em câmaras CellSTACK de 10 camadas (Corning, Acton, MA), cultivadas por 3 dias até atingir uma densidade de 80%, e então transfectadas usando o método do fosfato de cálcio com um plasmídio auxiliar de AAV expressando AAV2 Rep e genes Cap sorotipo-específicos, um plasmídio auxiliar de ade
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 100/118
58/70 novírus, e um plasmídio do vetor doador contendo ITR. Depois de 3 dias as células foram lisadas por três rodadas de congelamento/descongelamento, e os detritos celulares foram removidos por centrifugação. Os vetores de AAV foram precipitados dos Usados usando polietileno glicol, e purificados por ultracentrifugação por uma noite em um gradiente de cloreto de césio. Os vetores foram formulados por diálise e esterilizados em filtro.
ELISA de IqM, IgG, IgA:
[0130] Os sobrenadantes foram recolhidos ao final das etapas de ativação das células B, geração de jato de plasma, e cultura da geração de células plasmáticas. IgM, IgG, IgA foram analisadas com a ajuda de kits comerciais de ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA) (Bethyl Laboratories; Montgomery, TX) de acordo com o protocolo do fabricante. Em suma, sobrenadante foi adicionado à placa, incubado com agitação à temperatura ambiente por uma hora, seguido por lavagem quatro vezes com o tampão fornecido com o kit. Anticorpo de detecção fornecido com o kit foi adicionado e incubado por 1 hora à temperatura ambiente, seguido por lavagem quatro vezes com o tampão de lavagem fornecido com o kit. Peroxidase de rábano silvestre (HRP) fornecida com o kit foi adicionada e incubada por 30 minutos à temperatura ambiente, seguido por lavagem quatro vezes com o tampão fornecido com o kit. O substrato tetrametilbenzidina (TMB) fornecido com o kit foi adicionado e deixado desenvolver por 30 minutos. A reação foi interrompida com a solução de terminação fornecida com o kit e a absorvência foi lida a 450 nM usando uma leitora de placa. Exemplo 2: Produção de anticorpo em células B cultivadas in vitro
[0131] As células B CD19+ foram descongeladas e cultivadas da maneira descrita acima e ilustrada na Figura 1. Os sobrenadantes da cultura foram recolhidos nos dias t4, t7 e t10 e IgM, IgG e IgA total foram detectadas por ELISA da maneira descrita acima.
[0132] Os resultados (Figura 2A-2C) demonstraram que as células
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 101/118
59/70 são sensíveis à estimulação de citocinas da produção de anticorpos e são produtoras de anticorpos como seria esperado.
Exemplo 3: Eletroporação de mRNA
[0133] As células B cultivadas foram tratadas com mRNAs codificando um transgene (GFP) para determinar a melhor janela de tempo para introdução do mRNA. As células B CD19+ (2,0E+05 células) foram eletroporadas com 2 pg de GFP mRNA nos dias tO, t1, t2 out3, onde tO é o dia em que as células foram descongeladas (Figura 1). As células eletroporadas foram analisadas por análise FACs onde o acesso (gating) foi feito como mostrado na Figura 4. Os resultados (Figuras 3A-3D) demonstraram que a eletroporação no dia t2 resultou na expressão mais alta de GFP e assim esta janela de tempo foi escolhida para estudos de acompanhamento.
Exemplo 4: Clivagem com nuclease das células B cultivadas
[0134] ZFNs específicos para três locos, AAVS1, CCR5 e TCRA foram usados para clivar seus alvos nas células B cultivadas. Células B CD19+ foram descongeladas e cultivadas por 2 dias no meio de ativação de células B. As células foram lavadas 2 vezes com DPBS e então ressuspendidas em solução de eletroporação de alta eficiência BTXpress (Harvard Apparatus, Holliston, MA) até uma densidade final de 2,0E*6 células/mL As células (100 pL) e a solução de eletroporação foram misturadas com ZFN mRNA (4 pg) seguido por eletroporação em um eletroporador BTX ECM830 Square Wave (Harvard Apparatus) em uma placa de eletroporação MOS 96 de múltiplos poços 2mm (Harvard Apparatus). Depois da eletroporação, as células foram transferidas para o meio de ativação de células B em uma placa de 24 poços por dois dias. Depois de 2 dias, as células foram coletadas, os sobrenadantes foram recolhidos e as células foram lavadas com DPBS e então transferidas para o meio de geração de jato de plasma. Depois de 3 dias, as células foram coletadas, os sobrenadantes foram recolhidos e as células foram lavadas com DPBS e então transferidas para o
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 102/118
60/70 meio de geração de jato de plasma. Células para isolamento de DNA genômico (gDNA) foram coletadas nos dias t4, t7 e t10 para análise da atividade de ZFN por sequenciamento profundo. Em suma, células B CD19+ (2,0Ε*5 células) foram misturadas com ZFN mRNA (4 pg) seguido por eletroporação.
[0135] Para medir a atividade do ZFN nos locos TCRA (TRAC), CCR5, e AAVS1, DNA foi isolado pelo kit QIAamp DNA mini (Qiagen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Foram usados cem nanogramas de DNA genômico (gDNA). Uma PCR de duas etapas para os locos AAVS1 e TRAC foi então realizada usando a Polimerase Phusion®Hot Start Flex (New England Biolabs, Ipswich, MA). Uma PCR de três etapas foi usada para os locos CCR5. O sequencimento profundo Illumina mediu os indels em cada locus. Os iniciadores usados para cada locus estão mostrados abaixo:
Iniciador para AAVS1:
[0136] AAVS1 Dianteiro:
GACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNCCGGTTAATGTGGCTCTGGT (SEQ ID NO:3)
[0137] AAVS1 Reverso:
ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGACTAGGAAGGAGGAGGCCT (SEQ ID NO:4).
[0138] O amplicon para AAVS1 foi: 5'NNNNGACTAGGAAGGAGGAGGCCTAAGGATGGGGCTTTTCTGT CACCAATCCTGTCCCTAGTGGCCCCACTGTGGGGTGGAGGGGAC AGATAAAAGTACCCAGAACCAGAGCCACATTAACCGGNNNN (SEQ ID NO:5).
Iniciadores para CCR5:
[0139] CCR5 Dianteiro 1: CTGTGCTTCAAGGTCCTTGTCTGC (SEQ ID NO:6),
[0140] CCR5 Reverso 1: CTCTGTCTCCTTCTACAGCCAAGC (SEQ ID NO:7),
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 103/118
61/70
[0141] CCR5 Dianteiro 2: CTGCCTCATAAGGTTGCCCTAAG (SEQ ID NO:8),
[0142] CCR5 Reverso2:
CCAGCAATAGATGATCCAACTCAAATTCC (SEQ ID NO:9),
[0143] CCR5 Dianteiro3:
ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGCCAGGTTGAGCAGGTAGAT G (SEQ ID NO:10),
[0144] CCR5 Reverso3:
AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTT (SEQ ID NO:11).
[0145] O amplicon para CCR5 foi: 5'NNNNNGCCAGGTTGAGCAGGTAGATGTCAGTCATGCTCTTCAG CCTTTTGCAGTTTATCAGGATGAGGATGACCAGCATGTTGCCCAC AAAACCAAAGATGAACACCAGTGAGTAGAGC (SEQ ID NO: 12).
Iniciadores para TCRA (TRAC):
[0146] TCRA Dianteiro:
5'ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNCCTCTTGGTTTTACAGATAC
GAAC (SEQ ID NO: 13)
[0147] TCRA Reverso:
5'GACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCACCTCAGCTGGACCAC (SEQ
ID NO:14)
[0148] O amplicon para TCRA foi:
5'NNNNCCTCTTGGTTTTACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCT GTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTT TAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGAGGTGAG (SEQ ID NO:15).
[0149] Os resultados desses estudos estão mostrados nas Figuras 5A-5C e demonstram que as nucleases foram ativas nas células B cultivadas usando esses métodos, e que foram atingidos mais de 80% de modificação em múltiplos locos.
[0150] Também foram feitos experimentos para testar o impacto de
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 104/118
62/70 um choque frio transitório (de um dia para o outro (vide Patente US 8,772,008) na atividade de divagem das nucleases. Nestes estudos, foi usada uma gama de quantidades de mRNA de entrada de 0,75 a 6 pg. Depois da eletroporação, as culturas foram divididas e uma porção foi colocada em uma incubadora a 37°C por 4 dias. O segundo grupo foi colocado em uma incubadora a 30°C de um dia para o outro, e então transferido para uma incubadora a 37°C por 3 dias. Sequenciamento profundo foi realizado para medir a % de indels detectados como resultado da divagem com nuclease.
[0151] Os resultados (mostrados nas Figuras 6A -6C) demonstraram que o procedimento de choque frio aumentou a atividade de desobstrução global.
Exemplo 5: Comparação da transdução de células B por sorotipos de AAV
[0152] Vírus AAV compreendendo um cassete de expressão transgênica (GFP) foram usados para comparar a habilidade de diferentes sorotipos de AAV para transduzir as células B cultivadas. Em suma, células foram descongeladas e cultivadas por 2 dias no meio de ativação de células B em uma placa de 24 poços a uma densidade de 2,0E+5 células/poço. As células foram coletadas, contadas e então plaqueadas em uma placa de 24 poços a uma densidade de 2,OE-H5 células/poço. As células B foram transfectados com os sorotipos 2, 5, 6, 8 e 9 de AAV em doses de vetor de 2,4E+6, 1,2E+6, 6,0E+5, 3,0E+5 genomas vetoriais (vg)Zcélula. Os genomas vetoriais de AAV continham o cassete de expressão de eGFP induzido pelo promotor de CMV e as repetições terminais invertidas (ITRs), vide Figura 7B. Os vetores de AAV foram produzidos na Sangamo Therapeutics. A cultura de células (25 pL dos 500 pL em um único poço de uma placa de 24 poços) foi coletada e misturada com DPBS (175 pL) nos dias 14, Í7 e t10 e analisada quanto à expressão de GFP usando um Guava EasyCyte 5HT (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Os dados foram anallPetição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 105/118
63/70 sados com a ajuda do InCyte versão 2.5 (EMD Millipore).
[0153] Os resultados (Figura 7A) demonstraram que o AAV6 foi ο sorotipo de AAV mais eficiente na transdução das células B cultivadas durante o processo de diferenciação para plasmoblastos e células plasmáticas.
Exemplo 6: Integração vetorizada induzida por nuclease
[0154] As nucleases descritas acima foram então usadas em combinação com um doador de transgene (GFP, proteínas faltantes ou deficientes em um indivíduo e/ou anticorpos terapêuticos de interesse) para testar a capacidade do sistema de suportar a integração vetorizada de um doador no genoma. Diversos doadores exemplificativos foram feitos com GFP (Figura 8), compreendendo um transgene de GFP flanqueado por braços de homologia onde os braços apresentavam homologia com região em tomo do alvo de divagem AAVS1, CCR5 ou TCRA. Além disso, foram testados dois promotores diferentes, PGK ou EEK.
[0155] Células B CD19+ foram descongeladas e cultivadas por 2 dias no meio de ativação de células B. Foi usada uma combinação de ZFN mRNA e doador de AAV ou doador de mRNA visando os mesmos locos (AAVS1, TCRA, CCR5, albumina, HPRT, etc.). As células foram lavadas 2 vezes com DPBS e então ressuspendidas na solução de eletroporação de alta eficiência BTXpress (Harvard Apparatus, Holliston, MA) até uma densidade final de 2,0E+6 células/mL As células (100 pL) e a solução de eletroporação foram misturadas com ZFN mRNA (4 pg) seguido por eletroporação em um eletroporador BTX ECM830 Square Wave (Harvard Apparatus) em uma placa de eletroporação MOS 96 de múltiplos poços 2mm (Harvard Apparatus). Depois da eletroporação, as células foram transferidas para 0,5 mL de meio de ativação de células B em uma placa de 24 poços. AAV contendo modelos de doadores homólogos para os locos alvo foi então adicionado a 2,4 x 106 vg/células. As placas foram delicadamente agitadas por 2 minutos.
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 106/118
64/70
Depois de 2 dias, a cultura de células foi coletada, 25 pL de cultura de células foram recolhidos, misturados DPBS (175 pL) para análise por citometria de fluxo, o restante da cultura de células foi centrifugado em uma centrífuga superior de mesa, os sobrenadantes foram recolhidos, e as células foram lavadas com DPBS antes de serem transferidas para o meio de geração de jato de plasma. Depois de 3 dias, a cultura de células foi coletada, 25 pL de cultura de células foram recolhidos, misturados com DPBS (175 pL) para análise por citometria de fluxo, o restante da cultura de células foi centrifugado em uma centrífuga superior de mesa, os sobrenadantes foram recolhidos, e as células foram lavadas com DPBS antes de serem transferidas para o meio de geração de células plasmáticas. Depois de 3 dias de concluído o experimento, a cultura de células (25 pL dos 500 pL em um único poço de uma placa de 24 poços) foi recolhida e misturada com PBS (175 pL) para análise por citometria de fluxo, o restante da cultura de células foi centrifugado em uma centrífuga superior de mesa, os sobrenadantes foram recolhidos, e as células foram lavadas com DPBS coletadas para gDNA.
[0156] Para a citometria de fluxo, a cultura de células (25 pL dos 500 pL em um único poço de uma placa de 24 poços) foi recolhida e misturada com PBS (175 pL) nos dias 2, 5 e 8 subsequente à administração de doador de mRNA e doador de AAV. A expressão de GFP foi analisada usando um Guava EasyCyte 5HT (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Os dados foram analisados usando o InCyte versão 2.5 (EMD Millipore). Os resultados (Figuras 9A a 9C) demonstram que houve integração do transgene de GFP em todos os casos, e que o uso de nucleases específicas leva à percentagem mais alta de células GFP-positivas.
[0157] Para medir a integração alvo de doadores de CCR5 e de AAVS1, DNA foi isolado por um kit QIAamp DNA mini (Qiagen, Carlsbad CA) de acordo com as instruções do fabricante. Foram usados cem nanogramas de gDNA e uma PCR de três etapas foi então reali
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 107/118
65/70 zada usando a Polimerase Phusion®Hot Start Flex (New England Biolabs, Ipswich, MA) e o kit HotStartTaq Master Mix (Qiagen, Carlsbad, CA). O sequencimento profundo Illumina mediu a integração alvo em cada locos. Os iniciadores para cada etapa estão mostrados abaixo: Iniciadores para AASV1:
Iniciadores na etapa 1 de PCR:
[0158] AAVS1 Dianteiro 1: 5’CGGAACTCTGCCCTCTAACG (SEQ ID NO:16).
[0159] AAVS1 Reverso 1: 5'GTGTGTCACCAGATAAGGAATCTG (SEQ ID NO:17).
Iniciadores na etapa 2 de PCR:
[0160] AAVS1 Dianteiro 2: 5’CGTCTCTCTCCTGAGTCCG (SEQ ID NO:18).
[0161] AAVS1 Reverso 2: 5'GTGTGTCACCAGATAAGGAATCTG (SEQ ID NO:17).
Iniciadores na etapa 3 de PCR:
[0162] AAVS1 Dianteiro 3: 5'CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNCTCTGGTTCT GGGTACTTTTATCTG (SEQ ID NO: 19).
[0163] AAVS1 Reverso 3: 5'AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGTGTCACCAGATAAGGAATCT G (SEQ ID NO:20).
[0164] Sequência do amplicon do tipo selvagem para AAVS1: 5'NNNNCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCAC AGTGGGGCCACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACAC (SEQ ID NO:21).
[0165] Sequência de AAVS1 GFP-ΤΙ (SEQ ID NO:22): 5’NNNNCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCAC AGTGGGGCAAGCTTCGAGCCATCAGGGCCTGGTTCTTTCCGPetição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 108/118
66/70
CCTCAGAAGGCCTTTTGCAGTTTATCAGGATGAGGATGACCAGCATGTTGCCCACAAAACCAAAGATGAACACCAGATTCCTTATCTGGTGACACAC
Iniciadores para CCR5
Iniciadores na etapa 1 de PCR:
[0166] CCR5 Dianteiro 1: 5’GCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTT (SEQ ID NO:12).
[0167] CCR5 Reverso 1: 5'CTCTGTCTCCTTCTACAGCCAAGC (SEQ ID NO:7).
Iniciadores na etapa 2 de PCR:
[0168] CCR5 Dianteiro 2: 5'GCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTT (SEQ ID NO:12).
[0169] CCR5 Reverso 2:
5'CCAGCAATAGATGATCCAACTCAAATTCC (SEQ ID NO:9). Iniciadores na etapa 3 de PCR:
[0170] CCR5 Dianteiro 3: 5'ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGCCAGG TTGAGCAGGTAGATG (SEQ ID NO:23).
[0171] CCR5 Reverso 3: 5'AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTT
T (SEQ ID NO:11).
[0172] Sequência do amplicon do tipo selvagem para CCR5: 5'NNNNNGCCAGGTTGAGCAGGTAGATGTCAGTCATGCTCTTCAG CCTTTTGCAGTTTATCAGGATGAGGATGACCAGCATGTTGCCCACAAAACCAAAGATGAACACCAGTGAGTAGAGC (SEQ ID NO: 12) [0173] Sequência de CCR5 TI-GFP:
5'NNNNNGCCAGGTTGAGCAGGTAGATGTCAGTCATGCTCTTCAG CCTTTTGCAGTTTCTCGAGCCATCAGGGCCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAGTAGAAAGATGAACACCAGTGAGTAGAGC (SEQ ID NO:24)
[0174] Os resultados (mostrados nas Figuras 10A e 10B) demons
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 109/118
67/70 traram entre 38% e 50% da integração vetorizada para esses locos. [0175] Também foram realizados experimentos com doadores de transgene não correspondentes. Os braços de homologia nestes doadores não correspondentes não apresentavam homologia com sequências flanqueando o sítio de alvo de nuclease da nuclease cointroduzida. Por exemplo, foram usados ZFNs TCRA (TRAC)-especificos em combinação com um doador de transgene de GFP compreendendo braços de homologia de CCR5. Este doador também usado em combinação com ZFN AAVS1-específico. Maior integração encontrada com um sítio alvo de ZFN correspondente e braços de homologia do doador indicaria que, pelo menos em parte, a integração do transgene depende de uma reação de recombinação dependente da homologia. Os resultados (Figura 11) demonstraram que maior integração do doador ocorre quando o doador é flanqueado por braços de homologia que correspondente à região que envolve o sítio de corte da nuclease, e assim indica que as células B cultivadas dependem predominantemente de recombinação homóloga para a integração vetorizada. Foi observada integração em um nível baixo para doadores não correspondentes, indicando que a integração também pode ocorrer por captura da extremidade usando NHEJ.
[0176] As células transduzidas com construtos doadores compreendendo os dois promotores alternativos também foram comparadas. A expressão de GFP foi analisada por citometria de fluxo como descrito acima (vide Figura 12) e os resultados demonstraram que o promotor EEK induziu maior expressão de GFP nas células B do que o promotor PGK.
[0177] Foi realizada uma titulação comparando quantidades variáveis do construto doador de AAV usando uma dose constante de ZFN mRNA. As células B cultivadas foram tratadas com 4μ de ZFN TCRA (TRAC)-específico por eletroporação, e então tranduzidas com uma faixa de de AAV doador, de 3,0E+05 a 2,4E+06 vg/célula. Além disso,
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 110/118
68/70 os dois promotores também foram comparados nestas condições. Os resultados (Figuras 13A-13D) demonstraram que nas concentrações mais baixas de doador, o promotor EEK mantinha a expressão de GFP até uma diluição de 1 para 8 durante a progressão da célula B para plasmoblasto e célula plasmática. O experimento também constatou que o uso das nucleases para induzir integração vetorizada resultou em maior expressão de GFP nas células B.
Exemplo 7: Expressão de anticorpos durante edição de genoma
[0178] Os níveis de IgG e IgM foram analisados por ELISA da maneira descrita acima para as células B cultivadas que haviam sofrido eletroporação para distribuição dos pares de ZFN e também para o doador de GFP. Os resultados (Figuras 14 e 15) demonstram que os níveis de anticorpos produzidos pelas células B não foram altamente impactados pela eletroporação ou pela eletroporação seguida pela transdução do doador de AAV.
Exemplo 8: Potencial função de reforço do AAV em células B cultivadas [0179] Em uma célula B cultivada que expressa um anticorpo antiAAV, seria possível que nova exposição da célula B ao sorotipo de AAV contra o qual a célula B é reativa pudesse causar um efeito de ‘reforço' e induzir um aumento na produção de anticorpos anti-AAV. Uma população de células B CD19* proveniente de um doador humano demonstrou um aumento na secreção de IgM depois de tratamento com AAV2. Sabe-se que anticorpos anti-AAV2 apresentam uma prevalência robusta na população humana devido à presença ubíqua do AAV2. Portanto, neste estudo foi mostrado que uma célula B CD19+ proveniente de um doador humano potencialmente expressando anticorpos anti-AAV2 induzia um pico na produção de IgM subsequente à exposição ao AAV2, mas não a outros sorotipos de AAV (Figura 16).
[0180] Um potencial mecanismo para o pico de expressão de anticorpos está mostrado na Figura 17, e demonstra o uso deste sistema de expressão de um transgene de interesse.
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 111/118
69/70
Exemplo 9: Reforço da expressão transgênica subsequente à exposição ao AAV2 in vivo.
[0181] Cassetes doadores de transgene são construídos para inserção de um transgene a jusante de um promotor de células B. as células B são tratadas ex vivo com uma nuclease específica, e um construto doador compreendendo um promotor específico para anticorpos ligado a um transgene de interesse. Foi previamente verificado que as células B escolhidas para este trabalho produziam anticorpos antiAAV2. As células foram reintroduzidas em um indivíduo e depois de um curto período de tempo para enxerto, o indivíduos foi tratado com AAV2, ou com peptídeos de AAV2. O reforço de AAV suprarregula o promotor de anticorpos causando um pico na expressão transgênica.
Exemplo 10: Modificação de células B por integração vetorizada de anticorpos célula B-específico
[0182] São construídos cassetes doadores de transgene (AAV, mRNA, plasmídio, etc.) para inserção de transgenes codificadores de anticorpo nos quais o anticorpo é específico para células B produzindo anticorpos indesejáveis (por exemplo, inibidores) contra uma proteína distribuída por ERT (ou um autoantígeno), por exemplo células B produzindo anticorpos contra um fator de coagulação tal como F9 (anticorpos anti-F9). Cassetes doadores podem incluir braços de homologla para sítios alvo de nuclease (por exemplo, albumina, TCRA, CCR5, AAVS1, etc.) e são administrados in vivo em combinação com a nuclease adequada e/ou ex vivo a populações de células B (populações de células maduras, células-tronco e/ou células progenltoras de células B) a um indivíduo com necessidade dos mesmos (pacientes hemofílicos com anticorpos anti-F9).
[0183] Depois da modificação ex vivo ou in vivo, as células B produtoras de anticorpos secretam os anticorpos alvo que se ligam às células B produzindo anticorpos indesejáveis. Estes anticorpos alvo medeiam então a lise através de mobilização e ativação de células citotó
Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 112/118
70/70 xicas dependentes de anticorpos ou ainda a lise mediada pelo complemento. Assim sendo, nos pacientes, essas células B introduzidas causam uma redução nas células B endógenas que estiverem produzindo anticorpos indesejáveis, por exemplo, contra proteínas distribuídas pelo ERT ou o autoantígeno.
[0184] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações mencionadas neste pedido estão aqui incorporados em sua íntegra a título de referência.
[0185] Embora a descrição tenha sido apresentada com alguns detalhes a título ilustrativo e exemplificativo para fins de clareza de compreensão, ficará evidente para os especialistas na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito ou escopo da descrição. Por conseguinte, as descrições e os exemplos acima não devem ser interpretados como limitativos.

Claims (18)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Célula B modificada geneticamente caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais modificações compreendendo:
    (a) um ou mais transgenes, e/ou (b) inserções e/ou deleções que modificam (i) genes do receptor de células B, e/ou (il) interações celulares em centros germinativos, e/ou (c) modificações que inibem a supressão de qualquer função das células B associada à infecção patogênica ou regulação de um câncer.
  2. 2. Célula B modificada geneticamente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos transgenes são integrados em um locus endógeno da célula B.
  3. 3. Célula B modificada geneticamente de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o transgene codifica uma proteína faltante ou deficiente em um indivíduo com uma hemofilia, uma doença do armazenamento lisossômico, um anticorpo terapêutico e/ou um peptídeo que facilita atravessa a barreira hematoencefálica quando fundido a uma proteína terapêutica.
  4. 4. Célula B modificada geneticamente de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o anticorpo terapêutico é específico para uma célula B que gera anticorpos inibidores para uma proteína fornecida pela terapia de reposição enzimátlca (ERT) ou age em uma doença autoimune.
  5. 5. Célula B modificada geneticamente de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o anticorpo terapêutico é específico para uma célula B reguladora (Breg) capaz de atenuar uma resposta antitumoral.
  6. 6. Célula B modificada geneticamente de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a proteína fornecida pela ERT é um fator de coagulação.
    Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 114/118
    2/3
  7. 7. Célula B modificada geneticamente de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o fator de coagulação é o fator IX (F9).
  8. 8. Célula B modificada geneticamente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o transgene compreende ainda um promotor que induz a expressão transgênlca.
  9. 9. Célula B modificada geneticamente de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor linhagem de célula B-específico.
  10. 10. Célula B modificada geneticamente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que um transgene é expresso na célula.
  11. 11. Célula B modificada geneticamente de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o transgene é Integrado em um locus de porto seguro selecionado do grupo que consiste em AAVS1, TCRA, CCR5 ou albumina.
  12. 12. Célula B modificada geneticamente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que é descendente de uma célula-tronco hematopoiética modificada geneticamente.
  13. 13. Método para produzir uma proteína em um indivíduo com necessidade da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma população de células B como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ao indivíduo.
  14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a proteína modula a resposta de um anticorpo no indivíduo.
  15. 15. Uso das células B modificadas geneticamente como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 em um método para a produção de uma proteína em um indivíduo, caracterizado pelo fato
    Petição 870190071137, de 25/07/2019, pág. 115/118
    3/3 de que compreende: introduzir no indivíduo as células B ou células precursoras das mesmas em condições tais que a célula B produza a proteína no indivíduo.
  16. 16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma proteína faltante ou deficiente em uma doença ou distúrbio tal como uma hemofilia ou uma doença do armazenamento lisossômico ou uma doença autoimune ou um anticorpo específico para uma célula B que produz anticorpos para uma proteína terapêutica fornecida na ERT.
  17. 17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica fornecida na ERT é um fator de coagulação tal como o fator IX (F9) e o anticorpo é específico para células B que produzem anticorpos para o fator anticoagulante (anti-F9).
  18. 18. Kit caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais das células B como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
BR112019015355A 2017-01-26 2018-01-25 modificação genética de células b BR112019015355A2 (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762450917P 2017-01-26 2017-01-26
PCT/US2018/015180 WO2018140573A1 (en) 2017-01-26 2018-01-25 B-cell engineering

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112019015355A2 true BR112019015355A2 (pt) 2020-05-19

Family

ID=62979713

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112019015355A BR112019015355A2 (pt) 2017-01-26 2018-01-25 modificação genética de células b

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20190352614A1 (pt)
EP (1) EP3573464A4 (pt)
JP (2) JP2020505044A (pt)
KR (1) KR20190111063A (pt)
CN (1) CN110536963A (pt)
AU (1) AU2018212652B2 (pt)
BR (1) BR112019015355A2 (pt)
CA (1) CA3051113A1 (pt)
IL (1) IL268110B2 (pt)
MX (1) MX2019008844A (pt)
WO (1) WO2018140573A1 (pt)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
WO2015105955A1 (en) 2014-01-08 2015-07-16 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
AU2018212652B2 (en) * 2017-01-26 2024-03-28 Sangamo Therapeutics, Inc. B-cell engineering
EP3595681A4 (en) * 2017-03-16 2020-12-16 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) TRANSPLANT CELL-BASED IMMUNOTHERAPY FOR LONG-PERIOD ADMINISTRATION OF THERAPEUTIC PROTEIN
KR102439221B1 (ko) 2017-12-14 2022-09-01 프로디자인 소닉스, 인크. 음향 트랜스듀서 구동기 및 제어기
EP4070855A4 (en) * 2019-11-01 2024-04-03 Kyoto Prefectural Public University Corporation B LYMPOCYTE ANTIBODY RECEPTOR AND ITS USE
EP4127188A4 (en) 2020-03-31 2024-08-21 Walking Fish Therapeutics MODIFIED B CELLS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2023192936A2 (en) * 2022-03-30 2023-10-05 Fred Hutchinson Cancer Center Systems and methods to produce b cells that express selected antibodies and gene products
WO2024151683A2 (en) * 2023-01-09 2024-07-18 Walking Fish Therapeutics, Inc. HUMAN B CELL ENGINEERED TO EXPRESS IgA AND IgM ANTIBODIES FOR THERAPEUTIC USE

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003901511A0 (en) * 2003-03-28 2003-04-17 Bionomics Limited Nucleic acid molecules associated with angiogenesis II
DK1804839T3 (da) * 2004-09-22 2012-04-10 St Jude Childrens Res Hospital Forbedret ekspression af faktor ix i genterapivektorer
US9834787B2 (en) * 2009-04-09 2017-12-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted integration into stem cells
JP2016521975A (ja) * 2013-05-15 2016-07-28 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 遺伝的状態の処置のための方法および組成物
WO2016014837A1 (en) * 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Gene editing for hiv gene therapy
ES2886012T3 (es) * 2014-09-16 2021-12-16 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para la ingeniería y corrección de genomas mediadas por nucleasas en células madre hematopoyéticas
EP3234107B1 (en) * 2014-12-19 2022-09-14 Immusoft Corporation B cells for in vivo delivery of therapeutic agents
EP3277823B1 (en) * 2015-04-03 2023-09-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of b-cells
MD3313441T2 (ro) * 2015-06-24 2024-08-31 Janssen Biotech Inc Modularea imună și tratament al tumorilor solide cu anticorpi care leagă specific CD38
US10450585B2 (en) * 2015-07-13 2019-10-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
BR112018014288A2 (pt) * 2016-01-15 2018-12-18 Univ Minnesota métodos e composições para o tratamento de doença neurológica
AU2018212652B2 (en) * 2017-01-26 2024-03-28 Sangamo Therapeutics, Inc. B-cell engineering
SG10202100324YA (en) * 2017-04-10 2021-02-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against leukemias and other cancers
CA3066641A1 (en) * 2017-06-16 2018-12-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of t cell and/or hla receptors
AU2018313167A1 (en) * 2017-08-08 2020-02-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor mediated cell targeting
US11661611B2 (en) * 2017-11-09 2023-05-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Genetic modification of cytokine inducible SH2-containing protein (CISH) gene
WO2019149743A1 (en) * 2018-01-30 2019-08-08 Cellectis Combination comprising allogeneic immune cells deficient for an antigen present on both t-cells and pathological cells and therapeutic antibody against said antigen
CN112639102B (zh) * 2018-08-29 2024-03-01 南京传奇生物科技有限公司 抗间皮素嵌合抗原受体(car)构建体及其用途
WO2020112860A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 Intima Bioscience, Inc. Methods of identifying immunomodulatory genes

Also Published As

Publication number Publication date
US20190352614A1 (en) 2019-11-21
MX2019008844A (es) 2019-09-10
EP3573464A4 (en) 2020-12-30
CN110536963A (zh) 2019-12-03
WO2018140573A1 (en) 2018-08-02
AU2018212652B2 (en) 2024-03-28
CA3051113A1 (en) 2018-08-02
KR20190111063A (ko) 2019-10-01
RU2019126606A3 (pt) 2021-06-11
IL268110B2 (en) 2024-01-01
AU2018212652A1 (en) 2019-08-01
EP3573464A1 (en) 2019-12-04
IL268110B1 (en) 2023-09-01
JP2020505044A (ja) 2020-02-20
JP2022191524A (ja) 2022-12-27
RU2019126606A (ru) 2021-02-26
IL268110A (en) 2019-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018212652B2 (en) B-cell engineering
US20230119850A1 (en) Liver-specific constructs, factor viii expression cassettes and methods of use thereof
Lim et al. Treatment of a mouse model of ALS by in vivo base editing
US11634463B2 (en) Methods and compositions for treating hemophilia
AU2016291778A1 (en) Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
Tay et al. Translating CRISPR-Cas therapeutics: approaches and challenges
Liu et al. Advances in CRISPR/Cas gene therapy for inborn errors of immunity
RU2783116C2 (ru) Модификация b-клеток
RU2774874C2 (ru) Печень-специфичные конструкции, экспрессионные кассеты фактора viii и способы их применения

Legal Events

Date Code Title Description
B15K Others concerning applications: alteration of classification

Free format text: AS CLASSIFICACOES ANTERIORES ERAM: A01N 63/00 , A61K 35/00 , A61K 35/17 , A61K 35/28 , A61K 38/00 , A61K 38/37

Ipc: A61K 35/17 (2015.01), A61K 35/00 (2006.01), A61K 3

B15K Others concerning applications: alteration of classification

Free format text: AS CLASSIFICACOES ANTERIORES ERAM: A61K 35/17 , A61K 35/00 , A61K 35/28 , A61K 38/00 , A61K 38/37 , A61P 7/02

Ipc: C12N 15/85 (2006.01), A61K 35/17 (2015.01), C12N 1

B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]