CN108025025A - 癌症治疗靶点的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了筛选癌症治疗的靶点的体外和体内方法。这些方法预期筛选有助于肿瘤细胞的免疫抑制环境的靶点，特别是与放射治疗相关的那些靶点。因而，本文提供的方法对于鉴定潜在的靶点是有用的，所述靶点对于提供可以单独使用或与放射治疗组合使用的癌症治疗试剂是有用的。

Description

癌症治疗靶点的筛选方法
1.领域
本文提供的是鉴定癌症治疗的潜在靶点的方法。
2.背景
由于存在骨髓衍生的抑制细胞(“MDSC”)和调节性T细胞(“T-reg”)，它们浸润肿瘤并起作用来抑制免疫反应，肿瘤微环境本质上是抑制性的。另外，T细胞和抗原递呈细胞(APC)上某些抑制性分子的表达可能限制有效的免疫反应。放射通过诱导肿瘤细胞凋亡、衰老和自体吞噬来介导抗肿瘤效应。放射可以通过一些因子调节肿瘤微环境，这些因子可以充当癌症治疗的靶点。因而，筛选这些因子的方法和通过靶向这些因子来治疗癌症的方法是未被满足的需求。本文所提供的方法满足了这些需求，并提供了其他相关的优点。
3.概述
本文提供的是利用T细胞抑制分析与放射治疗组合来鉴定癌症治疗靶点的体外高通量筛选方法。
本文还提供的是利用T细胞抑制分析与放射治疗组合来筛选癌症治疗靶向的体外筛选方法，其中利用细胞培养物中表达的靶点库(target pools)来进行分析。
本文还提供的是利用T细胞抑制分析与放射治疗组合在植入肿瘤的对象中鉴定癌症治疗靶点的体内筛选方法。
在某些实施方式中，本文提供的体外和体内筛选方法可以组合使用，例如，依次进行本文提供的体外方法，随后使用从体外方法鉴定的候选靶点进行本文提供的体内方法。
3.1.定义
如本文使用的，除非另作说明，词语“一”和“所述”是指一个或超过一个的所述词语的语法对象。举例来说，一T细胞是指一个T细胞或超过一个T细胞。
如本文使用的，除非另作说明，术语“癌症”或“癌的”是指特征一般在于对象中不受调节的细胞生长的生理状况。癌症的实例包括但不限于血液癌症和实体肿瘤。
如本文使用的，除非另作说明，术语“治疗”在涉及癌症患者使用时，是指降低癌症的严重度、或延迟或减缓癌症发展的活动，包括(a)抑制癌症生长、或延缓癌症发展，和(b)引起癌症衰退，或延迟或最小化与癌症的存在相关的一种或更多种症状。癌症治疗可以涉及一种治疗或两种或更多种不同类型治疗的组合，包括手术、化疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗，等。
放射治疗是一种癌症治疗，其使用强能量的波束来伤害或杀死癌细胞。放射治疗可以使用X射线、质子或其他类型的能量。放射治疗在许多情况下是指外粒子束放射治疗。在这种类型的放射期间，通过患者身体之外的机器产生高能波束，将波束瞄准肿瘤的精确位点。在其他类型的放射治疗例如短程治疗中，放射源也可以置于患者身体的内部。
如本文使用的，除非另作说明，术语“对象”或“患者”是指作为治疗、观察和/或实验的对象的动物。“动物”包括脊椎动物和无脊椎动物，例如，鱼类、贝类、爬行动物、禽类，和特别是哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬、猫、绵羊、山羊、牛、马、灵长类，例如，猴、黑猩猩、猿和人类。对象可以指用于体内试验或实验的动物。测试或实验的对象还可以称为“测试对象”。
如本文使用的，除非另作说明，术语“荷瘤对象”是指在身体内有肿瘤或肿瘤细胞的对象。这些肿瘤细胞可以是所述对象之外的，为了实验目的接种到所述对象中。荷瘤对象可以有超过一个肿瘤。如本文使用的，除非另作说明，术语“双肿瘤模型”是指一种动物模型，其中荷瘤动物具有至少两个肿瘤，两个肿瘤在位置上远离。两个肿瘤相互间可以是对侧的。位置远离的两个肿瘤可以是相似或相同的大小。可以在例如与放射相关的研究中使用双肿瘤模型。
如本文使用的，除非另作说明，术语“已照射对象”是指已经接受放射的对象。放射可以是靶向肿瘤的放射。在双肿瘤模型中，所述已照射对象可以指在两个远离的肿瘤中仅一个接受放射的对象。如本文使用的，除非另作说明，术语“未照射对象”是指没有接受放射的对象。“未照射对象”和“已照射对象”可以指照射之前和之后的同一对象。“未照射对象”和“已照射对象”还可以指在平行实验中研究放射效果的两个测试对象。平行实验中的这类测试对象可以是有相同遗传背景、和/或除放射之外接受相同治疗的对象。
如本文使用的，除非另作说明，术语“基因”是指核酸分子，当置于合适的调节或控制序列的控制下时，其在体外或体内被转录(对于DNA来说)和翻译(对于mRNA来说)成多肽。基因的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子确定。基因可以包括，但不限于，来自原核或真核mRNA的cDNA，来自原核或真核DNA的基因组DNA序列，以及甚至合成的DNA序列。转录终止序列通常位于基因序列的3'。
如本文使用的，除非另作说明，术语“候选基因”是指经历本文提供的筛选方法的基因。候选基因可以被敲除或敲低以评估该基因与放射治疗组合在调节T细胞免疫应答方面的牵连。取决于筛选的结果，“候选基因”或““候选基因”编码的蛋白质被鉴定为适合的癌症治疗潜在靶点。
如本文使用的，除非另作说明，术语“目标基因”是指可以充当癌症治疗靶点的基因。“目标基因”可以通过本文公开的方法从候选基因中鉴定。
如本文使用的，除非另作说明，术语“敲除”在与基因一起使用时，意思是所标明基因的表达被完全或几乎完全地消除。在细胞或组织中被敲除的标明基因的表达相比它在所述细胞或组织中的正常表达水平可以降低至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或100％。在某些实施方式中，在细胞中被敲除的基因的表达水平使用本领域已知的普通基因表达检测手段是不可检测的。
如本文使用的，除非另作说明，术语“敲低”在与基因一起使用时，意思是所标明基因的表达被显著降低。在细胞或组织中被敲低的标明基因的表达相比它在所述细胞或组织中的正常表达水平可以降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。在某些实施方式中，在细胞或组织中被敲低的基因的表达水平与该基因在所述细胞或组织中的正常表达水平相比降低至少50％。
如本文使用的，除非另作说明，术语“分离”是指一种过程，在所述过程期间标明的对象与该对象通常存在的天然环境中的至少一种成分分离。当与细胞或细胞群体一起使用时，术语“分离”可以指从对象的身体获得含有细胞或细胞群体的样品的过程，和/或所述细胞或细胞群体与含有所述细胞或细胞群体的样品中其他细胞或其他内容物分离的过程。
如本文使用的，除非另作说明，术语“接触”在与细胞一起使用时是指一种过程，在其中细胞被置于紧密接近所标明的物质，从而所述细胞可以与所述物质相互作用，和/或受到该物质的存在的影响。所述接触可以是暂时的或短暂的。所述接触还可以持续一段时间或是永久性的。例如，T细胞与抑制细胞接触可以指T细胞和抑制细胞在体外容器中培养在一起的过程，其中细胞紧密接近从而它们表面的受体分子可以相互作用。接触可以持续与体外培养的时间一样长。T细胞与抑制细胞接触还可以指T细胞被注射到具有抑制细胞的对象的过程，抑制细胞将与注射的T细胞相互作用。这样的接触可以是短暂的。
如本文使用的，除非另作说明，术语“载体”是指运载体，DNA或RNA序列(例如，外源基因)可以通过所述运载体导入宿主细胞，以促进导入的序列的表达(例如，转录和/或翻译)，或通过重组或其他机制敲低或敲除目标基因。载体包括质粒、噬菌体、病毒、伪病毒，等。
如本文使用的，除非另作说明，术语“转染”意图包括任何手段，例如但不限于，吸附、显微注射、电穿孔、脂转染等，用于将外源核酸分子导入宿主细胞。
如本文使用的，除非另作说明，术语“T细胞”是指在胸腺中完成成熟的白细胞的类型，其在免疫系统中具有各种作用，包括身体中特定外源抗原的鉴定，以及其他免疫细胞的活化和钝化。根据功能，T细胞具有许多亚型，包括细胞毒性T细胞、辅助T细胞(Th)和调节性T细胞(Treg)。细胞表面上标志物的差异表达提供了对T细胞的各种性质和功能的有价值的提示，可以充当分离T细胞或T细胞的特定亚型的有用工具。例如，T细胞可以通过用流式细胞计选择CD3+细胞来分离。除了表面标志物之外，T细胞的不同亚型还可以具有不同的功能和细胞因子分泌分布。例如，CD8+细胞毒性T细胞通过释放穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素(granulysin)来破坏受感染的目标细胞，而CD4+ T辅助细胞具有一定细胞毒性活性，分泌细胞因子作用于其他白细胞，例如B细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞或嗜中性细胞。Treg通过几种机制抑制T细胞功能，包括结合效应物T细胞子集和阻止它们分泌细胞因子。
除非另作说明，T细胞可以是任何类型的T细胞，可以是任何发育阶段，包括但不限于，CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如，Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞、初始T细胞、调节T细胞、gamma delta T细胞(γδT细胞)，等。其他类型的辅助T细胞包括细胞如Th3、Th17、Th9或Tfh细胞。其他类型的记忆T细胞包括细胞例如中央记忆T细胞(TCM细胞)、效应物记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。
如本文使用的，除非另作说明，术语“未修饰T细胞”是指对于被测试或筛选的候选基因没有被遗传修饰的T细胞。未修饰T细胞可以是野生型T细胞。未修饰T细胞还可以是用对照基因遗传修饰的参考T细胞。例如，参考T细胞可以是用带有对照基因如LacZ的shRNA的病毒载体感染的T细胞。未修饰T细胞可以直接分离自天然来源，例如，来自动物对象的血液样品，或通过体外培养T细胞系来获得。未修饰T细胞还可以通过诱导分化在体外从多能细胞中分化。
如本文使用的，除非另作说明，术语“已修饰T细胞”是指被遗传工程化的T细胞。与野生型T细胞相比，已修饰T细胞可以过量表达或低表达基因。已修饰T细胞可以具有被敲低或敲除的候选基因，已修饰T细胞的群体可以是具有不同遗传修饰的T细胞的群体。例如，已修饰T细胞的群体可以各自具有不同的遗传标志，与野生型T细胞相比有最多一个基因被敲低或敲除。
如本文使用的，除非另作说明，术语“活性”是指T细胞的细胞活性。所述活性可以是增殖活性，其可以是增强的细胞周期活化，抑制的细胞死亡(例如，抑制的细胞凋亡)，和/或促进细胞增殖的任何其他活性。所述活性还可以是效应物T细胞的免疫性，包括例如细胞毒性活性或细胞因子生产活性。所述活性还可以是一般抗肿瘤活性，其可以通过例如肿瘤大小降低或荷瘤对象的存活率提高来测量。
如本文使用的，除非另作说明，术语“抑制细胞(suppressor cell)”是指抑制T细胞活性的细胞群体。例如，抑制细胞可以抑制T细胞增殖。抑制细胞还可以抑制或拮抗T细胞引发的天然免疫应答。“抑制细胞”包括但不限于调节T细胞(Treg)和骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)。
4-附图的简要说明
以下附图形成了本说明书的部分，被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些附图并结合在此呈现的具体实施方式的详细说明，可以更好地理解本发明。
附图1——附图1描绘了伴随放射的免疫调节物的shRNA筛选的示范性流程。如所示，该流程包括制备有阴性对照的shRNA文库，在第0天对B5小鼠的腿部和肋部(flank)皮内注射1.5×105个B16-Ova细胞；在第6天分离OT-1T细胞；在第8天用编码Thy1.1的shRNA文库感染OT-1T细胞；在第10天以12Gy照射腿部肿瘤(5mm)；在第11天进行感染性OT-1 T细胞(5×106)的承继转移；在第18天从肿瘤、从脾脏、淋巴结和引流淋巴结收获T细胞；进行Thy1.1+ T细胞的FACS分选；通过PCR、NGS和数据反卷积来分析Thy 1.1+ T细胞的基因组DNA。并且每两天测量肿瘤大小。
附图2——附图2描绘了用于整合的shRNA的PCR扩增的示范性的嵌套引物集。如所示，初级PCR引物(294bp)可以是
5'-AAT GGA CTA TCA TAT GCT TAC CGT AAC TTG AAA GTA TTT CG-3'
5'-CTT TAG TTT GTA TGT CTG TTG CTA TTA TGT CTA CTA TTC TTT CCC-3'；
二级PCR引物(124bp)可以是
SecPCR_F:5'-CGAAAC ACC GGT CCG CAG GTATGC-3'
SecPCR_R:5'-CCATTT GTC TCG AGG TCG AAAACT GG-3'
5.详细说明
本文提供的是用于鉴定癌症治疗的基因靶点的体外和体内筛选方法。不受特定理论的限制，相信的是许多因素促成了肿瘤细胞的免疫抑制性微环境，这样的因素可以通过放射来调节，包括但不限于肿瘤靶向的放射。因而，本文提供的是体外和体内筛选这类因子的方法，来充当基因靶点用于单独的或与放射治疗组合的癌症治疗。在某些实施方式中，本文提供的是通过测量未修饰T细胞和已修饰T细胞的活性鉴定用于癌症治疗的目标基因的方法；其中所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞各自与来自已照射的荷瘤对象的抑制细胞接触；以及其中所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因。如果比较所述已修饰T细胞和所述未修饰T细胞所述活性提高，所述候选基因则被鉴定为癌症治疗的目标基因。
在某些情况下，放射可以将肿瘤细胞置于“应激”状态，其可以引起免疫抑制因子的进一步活化和/或增量调节。因而，本文提供的还有目标基因的筛选方法，所述目标基因是被放射治疗活化和/或增量调节的免疫抑制因子。由于放射可以特异性地局限于肿瘤微环境，肿瘤内由于放射的任何扰动引起感兴趣靶点的增量调节，作用于T细胞诱导T细胞抑制，可以使用本文描述的筛选方法来揭露。所述方法可以进一步包括验证所鉴定的目标基因在调节免疫抑制方面的功能。
在某些情况下，放射可以引起远端效应，通过该生理过程，原发性肿瘤的靶向放射诱导辐射场外的远处部位的抗肿瘤响应。至少部分地，远端效应可能涉及肿瘤抗原向T细胞的增强呈递，以及刺激局部和全身性免疫反应的细胞因子和其他前炎症因子的释放。因而，本文提供的还有涉及远端效应的基因靶点的筛选方法。通过本文公开的方法鉴定的基因靶点可以是促进肿瘤微环境的免疫抑制性质的因子。
由于免疫系统的常规检查被阻断，活化免疫系统一般以破坏癌症细胞的免疫治疗在某些情况下可能引起全身毒性。本文提供的还有一些因子的筛选方法，所述因子在被单独靶向时不引起全身性免疫活化，但是在与放射治疗组合使用时可以引发显著的抗肿瘤免疫。因而，靶向这些基因因子的试剂可以模拟或增强远端效应，改善放射治疗的治疗效果，并具有降低的潜在免疫相关副作用。
通过抑制可能抑制T细胞活性的目标基因，荷瘤对象中抗肿瘤反应的免疫调节试剂可以至少部分地活化免疫系统。
5.1筛选方法
本文提供的是通过测量未修饰T细胞和已修饰T细胞的活性鉴定用于癌症治疗的目标基因的方法；其中所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞已经各自与肿瘤微环境接触；和其中所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；其中如果所述已修饰T细胞与所述未修饰T细胞相比，如果所述活性提高，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
本文提供的是通过测量未修饰T细胞和已修饰T细胞的活性鉴定用于癌症治疗的目标基因的方法；其中所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞已经各自与抑制细胞接触；和其中所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；其中如果所述已修饰T细胞与所述未修饰T细胞相比，如果所述活性提高，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
在某些实施方式中，本文公开的方法中测量的活性可以是增殖活性。在某些实施方式中，所述增殖活性通过细胞周期活化来测量，其中增强的细胞周期活性表明细胞增殖活性的提高。在某些实施方式中，所述增殖活性通过细胞死亡抑制来测量，其中细胞死亡的降低表明细胞增殖活性的提高。在某些实施方式中，所述增殖活性通过细胞凋亡抑制来测量，其中细胞凋亡的降低表明细胞增殖活性的提高。
因而，本文提供的是通过测量未修饰T细胞和已修饰T细胞的增殖活性鉴定用于癌症治疗的目标基因的方法；其中所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞已经各自与抑制细胞或肿瘤微环境接触；其中所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；其中如果与所述未修饰T细胞相比所述已修饰T细胞具有更高的增殖活性，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
在某些实施方式中，本文公开的方法中测量的活性可以是效应物T细胞的免疫性。在某些实施方式中，本文公开的方法中测量的活性是细胞毒性活性。在某些实施方式中，本文公开的方法中测量的活性是细胞因子生产活性。在某些实施方式中，本文公开的方法中测量的活性是抗肿瘤活性。
因而，本文提供的是通过测量未修饰T细胞和已修饰T细胞的免疫性鉴定用于癌症治疗的目标基因的方法；其中所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞已经各自与抑制细胞或肿瘤微环境接触；其中所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；其中如果与所述未修饰T细胞相比所述已修饰T细胞具有更高的免疫性，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
本文提供的是通过测量未修饰T细胞和已修饰T细胞的细胞毒性活性鉴定用于癌症治疗的目标基因的方法；其中所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞已经各自与抑制细胞或肿瘤微环境接触；其中所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；其中如果与所述未修饰T细胞相比所述已修饰T细胞具有更高的细胞毒性活性，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
本文还提供的是通过测量未修饰T细胞和已修饰T细胞的细胞因子生产活性鉴定用于癌症治疗的目标基因的方法；其中所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞已经各自与抑制细胞或肿瘤微环境接触；其中所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；其中如果与所述未修饰T细胞相比所述已修饰T细胞具有更高的细胞因子生产活性，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
本文还提供的是通过测量未修饰T细胞和已修饰T细胞的抗肿瘤活性鉴定用于癌症治疗的目标基因的方法；其中所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞已经各自与抑制细胞或肿瘤微环境接触；其中所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；其中如果与所述未修饰T细胞相比所述已修饰T细胞具有更高的抗肿瘤活性，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
在某些实施方式中，本文描述的方法进一步包括从来源获得T细胞。本文提供的方法可以进一步包括制备未修饰T细胞和已修饰T细胞。在某些实施方式中，所述来源是来自对象的样品。在某些实施方式中，所述来源是体外培养的细胞系。
在某些实施方式中，本文描述的方法包括测量未修饰T细胞和已修饰T细胞的活性，所述未修饰T细胞和已修饰T细胞已经各自与来自已照射的荷瘤对象和未照射的荷瘤对象两者的肿瘤微环境接触；其中当T细胞与已照射的荷瘤对象的肿瘤微环境接触时，相比T细胞与未照射的荷瘤对象的肿瘤微环境接触时，如果将所述已修饰T细胞与所述未修饰T细胞比较，活性的提高更为显著，所述候选基因被鉴定为目标基因。在某些实施方式中，所述已经各自与未照射的荷瘤对象的肿瘤微环境接触的、未修饰T细胞和已修饰T细胞的活性是基本上相同的。
在某些实施方式中，本文描述的方法包括使用来自未照射的荷瘤对象的第一抑制细胞群体，和来自已照射的荷瘤对象的第二抑制细胞群体。所述方法可以包括将已经各自与所述第一抑制细胞群体接触的已修饰T细胞与未修饰T细胞比较，测量活性的提高，以及将已经各自与第二抑制细胞群体接触的已修饰T细胞与未修饰T细胞比较，测量活性的提高；其中如果与T细胞接触第一抑制细胞群体时相比当T细胞接触第二抑制细胞群体时所述提高更为显著，所述候选基因被鉴定为目标基因。在某些实施方式中，当T细胞与第一抑制细胞群体接触时比较所述已修饰T细胞和所述未修饰T细胞时所述活性是基本上相同的，但是当T细胞与第二抑制细胞群体接触时在所述已修饰T细胞中更高。
在某些实施方式中，本文描述的方法中使用的T细胞分离自从动物对象直接获得的样品。所述样品可以是血液样品。所述血液样品可以是全血样品、部分纯化的血液样品、或外周血样品。所述样品还可以是骨髓样品。T细胞可以通过它的表面标志物从样品中分离。在某些实施方式中，本文描述的方法中使用的T细胞是CD3+细胞。在某些实施方式中，本文描述的方法中使用的T细胞是CD8+细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是CD4+细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是初始T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是初始CD8+ T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是初始CD4+ T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是CD4+/CD8+双阳性T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是PBMC。在某些实施方式中，所述T细胞是PBL。在某些实施方式中，所述T细胞是TIL。在某些实施方式中，所述T细胞是记忆T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是gamma delta T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是Th3、Th17、Th9或Tfh细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是TCM细胞、TEM细胞或TEMRA细胞。所述T细胞还可以是本文提及的或本领域已知的特定T细胞类型的任何组合。
在某些实施方式中，所述T细胞分离自对象。所述对象可以是哺乳动物。在某些实施方式中，所述T细胞分离自小鼠。所述小鼠可以是野生型小鼠或遗传工程化的小鼠。在某些实施方式中，所述小鼠被遗传工程化以表达T细胞受体。所述T细胞可以特异于小鼠中不天然存在的抗原。在某些实施方式中，所述抗原可以是卵白蛋白。在某些实施方式中，所述对象可以是被遗传工程化以表达特异于卵清蛋白的T细胞受体的小鼠。
在某些实施方式中，本文提供的是通过测量未修饰CD8+ T细胞和已修饰CD8+ T细胞的活性鉴定用于癌症治疗的目标基因的方法，所述未修饰CD8+ T细胞和所述已修饰CD8+T细胞已经各自与抑制细胞接触；其中所述已修饰CD8+ T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；其中如果与所述未修饰CD8+ T细胞相比所述已修饰CD8+ T细胞中所述活性提高，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
在某些实施方式中，所述T细胞通过从干细胞或祖细胞的诱导分化来产生。所述干细胞或祖细胞可以是造血干细胞或造血祖细胞。所述干细胞或祖细胞还可以是诱导的多能干细胞。
所述未修饰T细胞可以使用本文描述的或本领域已知的方法遗传修饰来产生已修饰T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞通过用含有shRNA的病毒载体感染来修饰以具有被敲除或敲低的候选基因。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞是具有被敲除或敲低的对照基因的参考T细胞。在一个实施方式中，所述病毒载体是来自慢病毒的载体。在某些实施方式中，所述病毒载体是SMART载体、GIPZ、TRIPZ或TRC慢病毒shRNA载体(GE Dharmacon)。在某些实施方式中，所述分离的T细胞中的所述基因通过使用转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)来敲除或敲低。在某些实施方式中，所述分离的T细胞中的所述基因通过使用CAS9(CRISPR)来敲除或敲低。本领域的普通技术人员将理解，本文描述的或本领域已知的遗传调节T细胞的任何方法可以用于本文描述的筛选方法中。
在某些实施方式中，所述未修饰T细胞在经历本文描述的遗传修饰或筛选方法之前在体外扩增。在某些实施方式中，所述已修饰T细胞在经历本文描述的筛选方法之前在体外扩增。
在一个实施方式中，本文描述的方法中使用的T细胞是标记的。在某些实施方式中，T细胞用荧光剂标记。在某些实施方式中，T细胞用微米级的颗粒标记。在某些实施方式中，T细胞用羰基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记。在某些实施方式中，T细胞用微米级的氧化铁颗粒(MPIO)标记。在某些实施方式中，T细胞用磁性纳粒标记。标记T细胞的各种方法是本领域公知的。
所述候选基因可以是T细胞的基因组中天然存在的任何基因。所述候选基因可以是人类基因。所述候选基因还可以是来自模型动物的基因。例如，所述候选基因还可以是小鼠T细胞的基因。
在某些实施方式中，本文提供的筛选方法包括制备起始T细胞群体，包括用shRNA文库感染未修饰T细胞。在某些实施方式中，所述shRNA文库是基因组文库，其包括可以筛选T细胞基因组的所有基因的病毒载体。在某些实施方式中，所述shRNA文库是亚基因组文库，其包括T细胞基因组的基因选集。在某些实施方式中，所述shRNA文库包括病毒载体，所述病毒载体靶向编码具有特定结构/功能特征的某些蛋白质的基因。示范性的文库包括但不限于，G蛋白偶联受体(GPCR)文库、肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族文库、免疫球蛋白超家族(IgSF)文库、转录因子文库、激酶文库、磷酸酶文库、血管生成文库、细胞周期文库、细胞凋亡文库和/或遍在蛋白-连接酶文库。示范性的文库还可以集中于已知在功能障碍的T细胞中过量表达或过低表达的基因。例如，候选基因的文库可以是在T细胞失能或耗竭中过量表达的基因的文库。本文公开的方法中使用的文库还可以是本文描述的或本领域已知的文库的任何组合。
在某些实施方式中，所述抑制细胞包括Treg细胞。在某些实施方式中，所述抑制细胞包括MDSC。在某些实施方式中，所述抑制细胞包括Treg细胞和MSDC两者。在某些实施方式中，其中所述筛选方法在体外进行，所述抑制细胞可以分离自对象。所述动物可以是哺乳动物。在某些实施方式中，所述抑制细胞可以分离自小鼠。在某些实施方式中，所述对象可以是已照射对象。在某些实施方式中，所述对象可以是未照射对象。在某些实施方式中，所述抑制细胞来自已照射小鼠。在某些实施方式中，所述抑制细胞来自未照射小鼠。在某些实施方式中，所述小鼠可以是荷瘤小鼠。所述小鼠可以是未照射的荷瘤小鼠。所述小鼠可以是已照射的荷瘤小鼠。在某些实施方式中，所述对象是具有至少两个肿瘤的小鼠，其中仅一个肿瘤接受了消融剂量的照射。
在某些实施方式中，所述抑制细胞分离自血液样品。所述血液样品可以是全血样品、部分纯化的血液样品、或外周血样品。从样品获得分离的抑制细胞用于T细胞抑制分析的方法是本领域公知的。在某些实施方式中，其中所述筛选方法在体内进行，所述抑制细胞可以是所述测试对象中天然存在的抑制细胞，其还可以包括Treg、MSDC、或这两者。所述对象可以是已照射对象或未照射对象。
在某些实施方式中，所述抑制细胞来自未照射的荷瘤对象。在某些实施方式中，所述抑制细胞来自已照射的荷瘤对象。在某些实施方式中，所述已照射的荷瘤对象已经接受了靶向肿瘤的放射。在某些实施方式中，所述放射以消融剂量给予。在某些实施方式中，所述放射以1Gy到45Gy、5Gy到35Gy、10Gy到25Gy、1Gy到25Gy、1Gy到20Gy或5Gy到15Gy的剂量给予。在某些实施方式中，所述放射以1Gy到20Gy的剂量给予。在某些实施方式中，所述放射以1Gy、2Gy、3Gy、4Gy、5Gy、6Gy、7Gy、8Gy、9Gy、10Gy、11Gy、12Gy、13Gy、14Gy、15Gy、16Gy、17Gy、18Gy、19Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy、40Gy或45Gy的剂量给予。在某些实施方式中，所述抑制细胞来自荷瘤对象，所述对象已经接受了靶向其原发肿瘤的消融剂量的放射。
在某些实施方式中，所述荷瘤对象具有一个肿瘤。在某些实施方式中，所述荷瘤对象具有两个或更多个肿瘤。在某些实施方式中，所述荷瘤对象是双肿瘤模型。在某些实施方式中，所述具有两个或更多个肿瘤的已照射的荷瘤对象已经接受了靶向其仅一个肿瘤的放射。接受放射的肿瘤可以是所述荷瘤对象的原发肿瘤。
在某些实施方式中，所述对象可以是小鼠。所述小鼠可以是野生型小鼠或遗传工程化的小鼠。在某些实施方式中，所述小鼠被遗传工程化以表达T细胞受体。所述T细胞可以特异于小鼠中不天然存在的抗原。在某些实施方式中，所述抗原可以是卵白蛋白。在某些实施方式中，所述对象可以是被遗传工程化以表达特异于卵清蛋白的T细胞受体的小鼠。在某些实施方式中，所述小鼠可以是荷瘤小鼠。所述小鼠可以是未照射的荷瘤小鼠。所述小鼠可以是已照射的荷瘤小鼠。在某些实施方式中，所述对象是具有至少两个肿瘤的小鼠，其中仅一个肿瘤接受了消融剂量的照射。
本文提供的筛选方法包括体外方法和体内方法。本领域的普通技术人员将理解，本文描述的不同体外和体内方法可以单独地或组合地使用。通过超过一种方法的组合鉴定出的基因靶点可能潜在地是更完全和更精确的。另外，本文描述的方法可以是高通量形式的库筛选分析(pool screening assay)。例如，可以首先进行本文提供的体外筛选试验来鉴定一组候选基因充当癌症治疗剂的靶点，随后进行体内功能试验来进一步证实它们的功用。
5.1.3体内分析
在某些实施方式中，本文描述的是筛选癌症治疗的目标基因的体内方法。所述体内分析可以在测试对象上进行。所述测试对象可以是动物模型。所述动物模型可以是双肿瘤模型。在某些实施方式中，所述动物模型是小鼠。在某些实施方式中，所述动物模型是荷瘤动物模型。所述动物模型可以是荷瘤小鼠。所述荷瘤小鼠可以是已照射的或未照射的。在某些实施方式中，所述动物模型是具有处在对侧位置的两个肿瘤的小鼠，其中仅一个肿瘤接受了消融剂量的照射。
因而，本文提供的是鉴定癌症治疗的目标基因的体内方法，包括(i)向测试对象注射未修饰T细胞和已修饰T细胞，所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；和(ii)测量所述测试对象中所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞的活性，其中如果将所述已修饰T细胞与所述未修饰T细胞比较，所述活性提高，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。所述测试对象可以是已照射的测试对象。所述测试对象可以是未照射的测试对象。在某些实施方式中，所述已照射的测试对象在T细胞注射之前接受照射。在某些实施方式中，所述已照射测试对象在T细胞注射之后但在测量活性之前接受照射。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞和已修饰T细胞被注射入同一测试对象。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞和已修饰T细胞被注射入独立的测试对象。在某些实施方式中，本文描述的方法中使用的T细胞是标记的。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞是参考T细胞。
在某些实施方式中，所述已照射的荷瘤对象已经接受了靶向肿瘤的放射。在某些实施方式中，所述放射以消融剂量给予。在某些实施方式中，所述放射以1Gy到45Gy、5Gy到35Gy、10Gy到25Gy、1Gy到25Gy、1Gy到20Gy或5Gy到15Gy的剂量给予。在某些实施方式中，所述放射以1Gy到20Gy的剂量给予。在某些实施方式中，所述放射以1Gy、2Gy、3Gy、4Gy、5Gy、6Gy、7Gy、8Gy、9Gy、10Gy、11Gy、12Gy、13Gy、14Gy、15Gy、16Gy、17Gy、18Gy、19Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy、40Gy或45Gy的剂量给予。在某些实施方式中，所述荷瘤对象是接受了靶向其仅一个肿瘤的消融剂量放射的双肿瘤模型。
本文公开的体内筛选方法中使用的T细胞可以是本文描述的方法或本领域已知的任何特定类型的T细胞。例如，在某些实施方式中，本文描述的方法中使用的T细胞是CD3+细胞。在某些实施方式中，本文描述的方法中使用的T细胞是CD8+细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是CD4+细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是初始T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是初始CD8+T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是初始CD4+ T细胞。
在某些实施方式中，所述测量步骤包括从所述测试对象获得样品。所述样品可以是肿瘤样品、组织样品或血液样品。所述组织样品可以是淋巴结样品、脾脏样品、肝脏样品或肾脏样品。所述淋巴结样品可以是引流淋巴结或非引流淋巴结。所述肿瘤样品可以是来自已照射肿瘤的样品。所述肿瘤样品还可以是来自未照射肿瘤的样品。所述未照射肿瘤可以来自具有已照射肿瘤的测试对象。
在某些实施方式中，本文描述的体内筛选方法包括使用未照射对象和已照射对象。所述方法可以包括将注射到未照射对象的已修饰T细胞与未修饰T细胞比较，测量活性的提高，以及将注射到已照射对象的已修饰T细胞与未修饰T细胞比较，测量活性的提高；其中如果当T细胞注射到已照射对象时与T细胞注射到未照射对象时相比，所述提高更为显著，所述候选基因被鉴定为目标基因。在某些实施方式中，当T细胞注射到未照射对象时比较所述已修饰T细胞和所述未修饰T细胞，T细胞的活性是基本上相同的，但是当T细胞注射到已照射对象时与所述未修饰T细胞相比在所述已修饰T细胞中更高。
在某些实施方式中，本文描述的体内方法测量的活性可以是T细胞的增殖活性。在某些实施方式中，本文描述的体内方法测量的活性可以是T细胞的抗肿瘤活性。T细胞的增殖活性可以通过注射后被注射入测试对象的T细胞的积累来测量。T细胞的积累可以在注射后24小时、注射后2天、注射后3天、注射后4天、注射后5天、注射后6天、注射后7天、注射后8天、注射后9天、注射后10天、注射后11天、注射后12天、注射后13天、注射后14天、注射后2.5周、注射后3周、注射后3.5周、注射后4周、注射后5周、注射后6周、注射后7周、注射后2个月、注射后3个月、注射后3个月或更久进行测量。
所述对象中T细胞的积累可以通过本领域已知的多种途径来测量。在某些实施方式中，所述测试对象中注射的T细胞的积累可以通过细胞计数来测量。在某些实施方式中，所述测试对象中T细胞的积累可以通过来自积累T细胞的基因组DNA的下一代测序(NGS)来测量。
因而，本文提供的是鉴定癌症治疗的目标基因的体内方法，包括(i)向测试对象注射未修饰T细胞和已修饰T细胞，所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；和(ii)测量所述测试对象中所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞的积累，其中如果与所述未修饰T细胞相比，所述已修饰T细胞积累了更大数量，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞是参考T细胞。所述测试对象可以是小鼠。所述测试对象可以是荷瘤的。所述测试对象可以是已照射荷瘤测试对象。在某些实施方式中，所述已照射的测试对象在T细胞注射之前接受照射。在某些实施方式中，所述已照射测试对象在T细胞注射之后但在测量活性之前接受照射。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞和已修饰T细胞被注射入同一测试对象。
在某些实施方式中，本文提供的是鉴定癌症治疗的目标基因的体内方法，包括(i)向测试对象注射未修饰T细胞和已修饰T细胞，所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；和(ii)测量所述测试对象中肿瘤浸润性未修饰T细胞的数量和肿瘤浸润性已修饰T细胞的数量，其中如果与所述肿瘤浸润性未修饰T细胞的数量相比，所述肿瘤浸润性已修饰T细胞的数量更高，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞是参考T细胞。所述测试对象可以是荷瘤小鼠。所述测试对象可以是已照射荷瘤测试对象。在某些实施方式中，所述已照射的测试对象在T细胞注射之前接受照射。在某些实施方式中，所述已照射测试对象在T细胞注射之后但在测量活性之前接受照射。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞和已修饰T细胞被注射入同一测试对象。
在某些实施方式中，本文提供的方法进一步包括从所述测试对象分离由所述注射的T细胞积累/增殖而来的T细胞。这种分离步骤可以包括从所述测试对象获得样品。所述样品可以是肿瘤样品、血液样品或组织样品。所述肿瘤样品可以是来自已照射肿瘤或未照射肿瘤的样品。所述未照射肿瘤可以来自具有已照射肿瘤的测试对象。所述血液样品可以是外周血、全血或部分纯化血液的样品。所述组织样品可以是脾脏样品或淋巴结样品。所述淋巴结样品可以是引流淋巴结样品或非引流淋巴结样品。
在某些实施方式中，本文描述的体内方法测量的活性可以是所述注射的T细胞的抗肿瘤活性。所述抗肿瘤活性可以通过一段时间内的肿瘤大小降低来测量。所述一段时间可以是24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、2.5周、3周、3.5周、4周、5周、6周、7周、2个月、3个月或更久。
所述抗肿瘤活性还可以通过测试对象群体的存活率来测量。因而，本文提供的是鉴定癌症治疗的目标基因的体内方法，包括(i)向独立的测试对象注射未修饰T细胞和已修饰T细胞，所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；和(ii)测量注射未修饰T细胞的所述对象和注射已修饰T细胞的所述对象的肿瘤大小，其中如果与注射未修饰T细胞的测试对象中的相比，注射已修饰T细胞的测试对象中肿瘤大小的降低更多，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞是参考T细胞。所述测试对象可以是荷瘤小鼠。所述测试对象可以是已照射荷瘤测试对象。在某些实施方式中，所述已照射的测试对象在T细胞注射之前接受照射。在某些实施方式中，所述已照射测试对象在T细胞注射之后但在测量肿瘤大小之前接受照射。在某些实施方式中，所述测试对象是双肿瘤模型，其中仅一个肿瘤接受靶向的照射。在某些实施方式中，测量所述已照射肿瘤的大小。在某些实施方式中，测量所述未照射肿瘤的大小。
本文还提供的是鉴定癌症治疗的目标基因的体内方法，包括(i)向荷瘤对象群体单独地注射未修饰T细胞和已修饰T细胞，所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；和(ii)测量注射未修饰T细胞的荷瘤对象群体的存活率和注射已修饰T细胞的荷瘤对象群体的存活率，其中如果与注射未修饰T细胞的对象群体相比，注射已修饰T细胞的对象群体中实现了更高的存活率，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞是参考T细胞。所述测试对象可以是已照射的测试对象。在某些实施方式中，所述已照射的测试对象在T细胞注射之前接受照射。在某些实施方式中，所述已照射的测试对象在T细胞注射后接受照射。在某些实施方式中，所述测试对象是双肿瘤模型，其中仅一个肿瘤接受靶向的照射。在某些实施方式中，所述测试对象是小鼠。
在某些实施方式中，本文提供的是鉴定癌症治疗靶点的方法，包括：
(1)从对象分离T细胞；
(2)制备T细胞的集，其中候选基因在所述分离的T细胞中被选择性敲除或敲低；
(3)向一组测试对象的每一个中植入两个肿瘤，其中所述两个肿瘤远端地植入；
(4)提供第一组测试对象，其中肿瘤没有用放射处理，以及第二组测试对象，其中仅一个肿瘤用放射处理；
(5)将所述T细胞转移入第一组的对象并评估肿瘤的降低；和
(6)将所述T细胞转移入第二组的对象并评估没有用放射处理的肿瘤的降低；
其中如果在步骤(6)中观察到的肿瘤降低高于步骤(5)中观察到的降低，所述T细胞中被敲除或敲低的基因、或其编码的蛋白质被鉴定为癌症治疗的靶点。
在一个实施方式中，所述对象是小鼠。在另一个实施方式中，所述小鼠是转基因小鼠。在另一个实施方式中，所述小鼠是通过产生抗原特异性T细胞的单克隆群体被工程化以扩大T细胞免疫应答的转基因小鼠。
在一个实施方式中，所述第二组测试对象中的肿瘤已经用1Gy到45Gy、5Gy到35Gy、10Gy到25Gy、1Gy到25Gy、1Gy到20Gy或5Gy到15Gy剂量的放射处理。在一个实施方式中，所述剂量是1Gy到20Gy。
在一个实施方式中，所述分离的T细胞中的基因通过用含有shRNA的病毒载体感染所述T细胞来敲除或敲低。在一个实施方式中，所述病毒载体是来自慢病毒的载体。在另一个实施方式中，所述分离的T细胞中的所述基因通过使用转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)来敲除或敲低。在另一个实施方式中，所述分离的T细胞中的所述基因通过使用CAS9(CRISPR)来敲除或敲低。
5.1.2体外分析
在某些实施方式中，本文描述的是筛选癌症治疗的目标基因的体外方法。所述体外分析可以是T细胞抑制分析。所述体外分析可以包括用抑制细胞培养T细胞。在某些实施方式中，本文提供的方法进一步包括从对象分离抑制细胞。所述对象可以是已照射对象或未照射对象。
因而，在某些实施方式中，本文提供的是筛选癌症治疗的目标基因的体外方法，包括单独地培养(a)未修饰T细胞和抑制细胞；以及(b)已修饰T细胞和抑制细胞；其中所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；以及测量所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞的活性，其中如果将所述已修饰T细胞与所述未修饰T细胞比较，所述活性提高，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞是参考T细胞。所述方法可以包括提供分离的抑制细胞。所述抑制细胞可以从来自对象的样品分离。所述对象可以是小鼠。所述样品可以是血液样品。所述抑制细胞可以根据它的表面标志物来分离。
所述T细胞和抑制细胞可以培养一段时间。所述一段时间可以是30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更久。
在某些实施方式中，在存在抑制细胞的情况下，在各种T细胞比抑制细胞比例下，T细胞用抗-CD3和抗-CD28活化。在某些实施方式中，用抗-CD3和抗-CD28活化T细胞。在某些实施方式中，所述方法包括以大约10:1、5:1、2:1、1:1、1:2或1:5的比例培养T细胞和抑制细胞。在某些实施方式中，所述方法包括以大约1:1的比例培养T细胞和抑制细胞。
在一个实施方式中，本文描述的方法中使用的T细胞是标记的。在某些实施方式中，T细胞用荧光剂标记。在某些实施方式中，T细胞用微米级颗粒标记。在某些实施方式中，T细胞用羰基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记。在某些实施方式中，T细胞用微米级的氧化铁颗粒(MPIO)标记。在某些实施方式中，T细胞用磁性纳粒标记。标记T细胞的各种方法是本领域公知的。
所述体外筛选方法可以测量活性，包括但不限于增殖、细胞周期活化、细胞死亡、细胞因子生产和/或细胞毒性活性。
本文提供的抑制细胞(例如Treg和MDSC)对T细胞的抑制可以利用本领域公知的各种方法来分析。这样的方法包括但不限于Dolcetti et al.,Current Protocols ofImmunology,14.17.1-14.17.25(2010)；Bayne et al.,Cold Spring Harb Protoc,doi:10.1101/pdb.prot077214(2013)；Kruisbeek et al,Current Protocols in Immunology,3.12.1-3.12.20(2004)和Collison et al.Methods Mol Biol.707:21-37(2011)中描述的那些，它们每一个的整体通过引用合并在本文中。
在某些实施方式中，所述抑制细胞包括Treg细胞。在某些实施方式中，所述抑制细胞包括MDSC。在某些实施方式中，所述抑制细胞包括Treg细胞和MSDC两者。在某些实施方式中，其中所述筛选方法在体外进行，所述抑制细胞可以分离自对象。所述动物可以是哺乳动物。在某些实施方式中，所述抑制细胞可以分离自小鼠。在某些实施方式中，所述对象可以是已照射对象。在某些实施方式中，所述对象可以是未照射对象。在某些实施方式中，所述抑制细胞来自已照射小鼠。在某些实施方式中，所述抑制细胞来自未照射小鼠。
在某些实施方式中，本文描述的体外筛选方法包括使用分离自未照射荷瘤对象的第一抑制细胞群体和分离自已照射荷瘤对象的第二抑制细胞群体。所述方法可以包括将各自与所述第一抑制细胞群体培养的已修饰T细胞与未修饰T细胞比较，测量所述活性的提高，以及还将各自与所述第二抑制细胞群体培养的已修饰T细胞与未修饰T细胞比较，测量所述活性的提高；其中如果与T细胞与第一抑制细胞群体培养时相比，当T细胞与第二抑制细胞群体培养时所述提高更为显著，所述候选基因被鉴定为目标基因。在某些实施方式中，当T细胞与第一抑制细胞群体培养时比较所述已修饰T细胞和所述未修饰T细胞，T细胞的活性是基本上相同的，但是当T细胞与第二抑制细胞群体培养时与所述未修饰T细胞相比在所述已修饰T细胞中更高。
在某些实施方式中，本文提供的是通过测试T细胞的细胞周期活化来筛选癌症治疗的目标基因的体外方法。所述方法可以包括单独地培养(a)未修饰T细胞和抑制细胞；和(b)已修饰T细胞和抑制细胞；其中所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；以及测量所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞的细胞周期活化，其中如果与所述未修饰T细胞相比所述已修饰T细胞中的细胞周期活化增强，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。在某些实施方式中，所述细胞周期活化通过向T细胞的DNA中掺入3[H]-胸腺嘧啶核苷来测量。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞是参考T细胞。在某些实施方式中，所述方法包括用抗-CD3和抗-CD28活化T细胞。
在某些实施方式中，本文提供的是通过测试T细胞的细胞死亡来筛选癌症治疗的目标基因的体外方法。在某些实施方式中，所述方法包括用抗-CD3和抗-CD28活化T细胞。所述方法可以包括单独地培养(a)未修饰T细胞和抑制细胞；和(b)已修饰T细胞和抑制细胞；其中所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；以及测量所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞的细胞死亡，其中如果与所述未修饰T细胞相比所述已修饰T细胞中的细胞死亡降低，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。在某些实施方式中，所述未修饰T细胞是参考T细胞。
所述细胞死亡可以是细胞凋亡、有丝分裂的细胞死亡和坏死。在某些实施方式中，本文提供的方法测量细胞凋亡。在某些实施方式中，本文提供的方法测量细胞凋亡、有丝分裂的细胞死亡。在某些实施方式中，本文提供的方法测量坏死。使用商业上可获得的试剂盒，测量细胞死亡的各种分析是本领域已知的。在某些实施方式中，细胞死亡通过半胱天冬酶分析来测量。在某些实施方式中，细胞死亡通过DNA段裂或链破裂来测量。在某些实施方式中，细胞死亡通过细胞计来测量。在某些实施方式中，细胞死亡通过ELISA来测量。
在其他实施方式中，本文提供的是评估响应于抗原特异性活化的T细胞效应物功能发育的方法。评估通过体外抗原特异性刺激引发的T细胞的细胞毒性活性，容许人们评估效应细胞的功能性细胞溶解潜力。在某些实施方式中，人们可以评估具有微小修饰的同种抗原刺激或抗原特异性触发。在某些实施方式中，通过51Cr释放评估细胞溶解活性可以用于评估T细胞特异性效应物功能以及它通过免疫调节细胞的调节/抑制，同时保留分析的简单性并容许研究员使用多种可变的和罕见的细胞群体。铬释放分析可以提供更具体的功能读取结果。
在某些实施方式中，溶胞单位转化(lytic unit transformation)测量没有抑制细胞时正常化为内部对照的抑制程度，提供了更有用的结果呈现，容许比较和平均化来自不同实验的结果。评估L.U.是比增殖分析或单个效应物比靶点比例细胞毒性值更为有效的测量，因为它包括了对功能活性(培养物的细胞溶解活性)和细胞增殖(每个培养物中回收的细胞数量)两者的估计。
在某些实施方式中，所述抗原是目标细胞中不天然存在的蛋白质。在一个实施方式中，所述抗原是卵白蛋白。
在某些实施方式中，本文提供的是通过测试T细胞的细胞因子生产来筛选癌症治疗的目标基因的体外方法。在某些实施方式中，所述方法包括用抗-CD3和抗-CD28活化T细胞。所述方法可以包括单独地培养(a)未修饰T细胞和抑制细胞；和(b)已修饰T细胞和抑制细胞；其中所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；以及测量所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞的细胞因子生产，其中如果与所述未修饰T细胞相比所述已修饰T细胞中的细胞因子生产增强，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。在某些实施方式中，本文描述的方法中测量的细胞因子包括干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-2、粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)，或其任何组合。测试细胞因子生产的各种方法是本领域已知的。例如，细胞因子可以通过免疫印迹(IB)分析、免疫荧光法(IF)分析、FACS、ELISA或细胞内细胞因子染色(ICS)来测量。测试细胞因子生产的试剂盒也是商业上可获得的。
在一个实施方式中，本文提供的是鉴定癌症治疗靶点的方法，包括：
(1)从对象分离T细胞；
(2)提供第一组T细胞，其中在分离的T细胞中不进行修饰，
以及第二组T细胞，其中在分离的T细胞中选择性地敲除或敲低候选基因；
(3)用分离自荷瘤对象的抑制细胞接触所述第一组T细胞，其中所述肿瘤没有被放射处理，并测定样品中T细胞抑制的程度；
(4)用分离自荷瘤对象的抑制细胞接触所述第一组T细胞，其中所述肿瘤已被放射处理，并测定样品中T细胞抑制的程度；
(5)用分离自荷瘤对象的抑制细胞接触所述第二组T细胞，其中所述肿瘤已被放射处理，并测定样品中T细胞抑制的程度；
(6)确定与步骤(3)相比在步骤(4)中T细胞抑制的降低；
(7)确定与步骤(3)相比在步骤(5)中T细胞抑制的降低；
和
(8)比较步骤(6)中确定的降低的差与步骤(7)中确定的降低的差；
其中如果步骤(7)中确定的T细胞抑制降低的差大于步骤(6)中确定的降低，所述T细胞中被敲除或敲低的基因、或其编码的蛋白质被鉴定为癌症治疗的靶点。
在一个实施方式中，所述对象是小鼠。
在另一个实施方式中，所述小鼠被遗传工程化以具有带有特定抗原特异性的T细胞受体。在另一个实施方式中，所述抗原是小鼠中不天然存在的蛋白质。在另一个实施方式中，所述抗原是卵白蛋白。
在一个实施方式中，所述T细胞是标记的。在另一个实施方式中，所述T细胞用羰基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记。
在一个实施方式中，所述肿瘤已经用消融剂量的放射处理。在另一个实施方式中，所述肿瘤已经用1Gy到45Gy、5Gy到35Gy、10Gy到25Gy、1Gy到25Gy、1Gy到20Gy或5Gy到15Gy剂量的放射处理。在一个实施方式中，所述肿瘤已经用1Gy到20Gy剂量的放射处理。
在一个实施方式中，所述分离的T细胞中的候选基因通过用含有shRNA的病毒载体感染所述T细胞来敲除或敲低。在一个实施方式中，所述病毒载体是来自慢病毒的载体。在某些实施方式中，所述病毒载体是SMART载体、GIPZ、TRIPZ或TRC慢病毒shRNA载体(GEDharmacon)。在另一个实施方式中，所述分离的T细胞中的所述基因通过使用转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)来敲除或敲低。在另一个实施方式中，所述分离的T细胞中的所述基因通过使用CAS9(CRISPR)来敲除或敲低。
在一个实施方式中，T细胞抑制通过监视T细胞的增殖来评估。在一个实施方式中，T细胞的增殖在存在抗-CD3+抗-CD28的情况下评估。在一个实施方式中，T细胞的增殖通过掺入3[H]-胸腺嘧啶核苷来测定。在另一个实施方式中，所述增殖通过用羰基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记的T细胞的流式细胞计分析来测定。
在一个实施方式中，T细胞抑制通过测量T细胞的细胞毒性活性来评估。在一个实施方式中，所述细胞毒性活性通过抗原特异性刺激来引发。在一个实施方式中，所述抗原是卵白蛋白。
在一个实施方式中，所述方法在高通量场景下以阵列形式进行。
在某些实施方式中，本文提供的是鉴定癌症治疗靶点的方法，包括：
(1)从对象分离T细胞；
(2)在第一细胞培养物中，将所述T细胞与分离自荷瘤对象的抑制细胞共同培养，其中所述肿瘤没有被放射处理；
(3)在第二细胞培养物中，将所述T细胞与分离自荷瘤对象的抑制细胞共同培养，其中所述肿瘤已经被放射处理；
(4)用病毒载体感染所述第一和第二培养物，所述病毒载体被设计以引入候选基因的一系列敲低或敲除，并进一步培养所述细胞；
和
(5)确定所述培养物中特定基因构建体的相对水平；
其中与所述第一培养物相比，在所述第二培养物中被确定以更高水平呈现的基因构建体，或由其编码的蛋白质，被鉴定为靶点。
在一个实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。
在另一个实施方式中，所述特定基因构建体的相对水平通过对所述载体测序来确定。在一个实施方式中，所述测序是下一代测序。
本领域的普通技术人员将理解，本文提供的筛选方法可以包括使用本文描述的或本领域已知的体外分析的任何组合来测量一种或更多种类型的T细胞活性。
5.1.3库分析(pool assays)
本文提供的还有用于鉴定癌症治疗的目标基因的高通量的库筛选方法。所述库筛选方法可以包括(i)制备具有不同遗传修饰的起始T细胞群体，其中每个T细胞具有被敲低或敲除的一个候选基因；和(ii)使所述起始T细胞群体与肿瘤微环境接触一段时间以产生选择的T细胞群体；其中在所述选择的T细胞群体中被敲低或敲除的候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。在某些实施方式中，所述起始群体中的每个T细胞具有最多一个被敲低或敲除的候选基因。
本文提供的还有用于鉴定癌症治疗的目标基因的高通量库筛选方法。所述库筛选方法可以包括(i)制备具有不同遗传修饰的起始T细胞群体，其中每个T细胞具有被敲低或敲除的一个候选基因；和(ii)使所述起始T细胞群体与抑制细胞接触一段时间以产生选择的T细胞群体；其中在所述选择的T细胞群体中被敲低或敲除的候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。在某些实施方式中，所述起始群体中的每个T细胞具有最多一个被敲低或敲除的候选基因。
本文公开的库筛选方法中使用的T细胞可以是本文描述的方法或本领域已知的任何特定类型的T细胞。例如，在某些实施方式中，本文描述的方法中使用的T细胞是CD3+细胞。在某些实施方式中，本文描述的方法中使用的T细胞是CD8+细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是CD4+细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是初始T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是初始CD8+T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是初始CD4+ T细胞。
在某些实施方式中，所述T细胞分离自对象。所述对象可以是哺乳动物。在某些实施方式中，所述T细胞分离自小鼠。所述小鼠可以是野生型小鼠或遗传工程化的小鼠。在某些实施方式中，所述小鼠被遗传工程化以表达T细胞受体。所述T细胞可以特异于小鼠中不天然存在的抗原。在某些实施方式中，所述抗原可以是卵白蛋白。在某些实施方式中，所述对象可以是被遗传工程化以表达特异于卵清蛋白的T细胞受体的小鼠。
在一个实施方式中，本文描述的方法中使用的T细胞是标记的。在某些实施方式中，T细胞用荧光剂标记。在某些实施方式中，T细胞用微米级颗粒标记。在某些实施方式中，T细胞用羰基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记。在某些实施方式中，T细胞用微米级的氧化铁颗粒(MPIO)标记。在某些实施方式中，T细胞是标记的磁性纳粒。标记T细胞的各种方法是本领域公知的。
所述选择的T细胞群体产自所述起始T细胞群体的增殖。具有提高T细胞增殖的遗传修饰的T细胞在所述选择的T细胞群体中积累。因而，在所述选择的T细胞群体中被敲低或敲除的候选基因表明靶向这些基因可以增强荷瘤对象中的T细胞增殖。在某些实施方式中，所述荷瘤对象可以是已照射荷瘤对象。
在某些实施方式中，在所述选择的T细胞群体中被敲低或敲除的候选基因通过分离自所述选择的T细胞群体的基因组DNA的NGS来鉴定。
在某些实施方式中，制备起始T细胞群体包括用shRNA文库感染未修饰T细胞。在某些实施方式中，所述shRNA文库是基因组文库，其包括可以筛选T细胞基因组的所有基因的病毒载体。在某些实施方式中，所述shRNA文库是亚基因组文库，其包括T细胞基因组的基因选集。在某些实施方式中，所述shRNA文库包括病毒载体，所述病毒载体靶向编码具有特定结构/功能特征的某些蛋白质的基因。示范性的文库包括但不限于，G蛋白偶联受体(GPCR)文库、肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族文库、免疫球蛋白超家族(IgSF)文库、转录因子文库、激酶文库、磷酸酶文库、血管生成文库、细胞周期文库、细胞凋亡文库和/或遍在蛋白-连接酶文库。示范性的文库还可以集中于已知在功能障碍的T细胞中过量表达或过低表达的基因。例如，候选基因的文库可以是在T细胞失能或耗竭中过量表达的基因的文库。本文公开的方法中使用的文库还可以是本文描述的或本领域已知的文库的任何组合。
在某些实施方式中，所述shRNA文库可以包括对照shRNA，例如LacZ shRNA。
在某些实施方式中，制备起始T细胞群体包括使用转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)。在某些实施方式中，制备起始T细胞群体包括使用CAS9(CRISPR)。在某些实施方式中，制备起始T细胞群体包括用shRNA文库感染T细胞。在某些实施方式中，所述shRNA文库是慢病毒载体文库。
在某些实施方式中，本文描述的所述库筛选方法可以是体外方法，其中所述接触步骤包括体外培养所述起始T细胞群体和抑制细胞。在某些实施方式中，所述抑制细胞可以分离自已照射荷瘤对象。在某些实施方式中，所述抑制细胞可以分离自未照射荷瘤对象。
在某些实施方式中，在存在抑制细胞的情况下，在各种T细胞比抑制细胞比例下，T细胞用抗-CD3和抗-CD28活化。在某些实施方式中，用抗-CD3和抗-CD28活化T细胞。在某些实施方式中，所述方法包括以大约10:1、5:1、2:1、1:1、1:2或1:5的比例培养T细胞和抑制细胞。在某些实施方式中，所述方法包括以1:1的比例培养T细胞和抑制细胞。
在某些实施方式中，所述抑制细胞来自已照射的荷瘤对象。在某些实施方式中，所述抑制细胞来自未照射的荷瘤对象。
因而，本文提供的是用于鉴定癌症治疗的目标基因的体外高通量库筛选方法。所述体外库筛选方法可以包括(i)制备具有不同遗传修饰的起始T细胞群体，其中每个T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；和(ii)培养所述起始T细胞群体和抑制细胞一段时间以产生选择的T细胞群体；其中在所述选择的T细胞群体中被敲低或敲除的候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。在某些实施方式中，所述起始群体中的每个T细胞具有最多一个被敲低或敲除的候选基因。在某些实施方式中，所述方法进一步包括从已照射荷瘤对象分离抑制细胞。在某些实施方式中，所述方法进一步包括从未照射荷瘤对象分离抑制细胞。
在某些实施方式中，培养所述T细胞和所述抑制细胞的所述一段时间可以是24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、2.5周、3周、3.5周、4周、5周、6周、7周、2个月、3个月或更久。
本领域的普通技术人员将理解，上文的章节中描述的体外筛选方法的任何排列组合也适用于这些体外库筛选方法。
在某些实施方式中，本文描述的库筛选方法可以是体内方法，其中所述接触步骤包括将所述起始T细胞群体注射到荷瘤测试对象中。因而，本文提供的是用于鉴定癌症治疗的目标基因的体内高通量库筛选方法。所述体内库筛选方法可以包括(i)制备具有不同遗传修饰的起始T细胞群体，其中每个T细胞具有最多一个被敲低或敲除的候选基因；和(ii)将所述起始T细胞群体和抑制细胞注射到荷瘤测试对象中以产生选择的T细胞群体；其中在所述选择的T细胞群体中被敲低或敲除的候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
所述测试对象可以是动物模型。所述动物模型可以是双肿瘤模型。在某些实施方式中，所述动物模型是小鼠。所述荷瘤小鼠可以是已照射的或未照射的。在某些实施方式中，所述动物模型是双肿瘤模型。在某些实施方式中，所述动物模型是具有处在对侧位置的两个肿瘤的小鼠，其中仅一个肿瘤接受了消融剂量的照射。
所述方法还可以包括在注射之后从所述对象分离选择的T细胞库。所述选择的T细胞库可以分离自所述测试对象的样品。所述样品可以是肿瘤样品、血液样品或组织样品。所述肿瘤样品可以是来自已照射肿瘤或未照射肿瘤的样品。所述血液样品可以是外周血、全血或部分纯化血液的样品。所述组织样品可以是脾脏样品或淋巴结样品。所述淋巴结样品可以是引流淋巴结样品或非引流淋巴结样品。
在某些实施方式中，所述方法包括在注射后24小时、注射后2天、注射后3天、注射后4天、注射后5天、注射后6天、注射后7天、注射后8天、注射后9天、注射后10天、注射后11天、注射后12天、注射后13天、注射后14天、注射后2.5周、注射后3周、注射后3.5周、注射后4周、注射后5周、注射后6周、注射后7周、注射后2个月、注射后3个月、注射后3个月或更久从所述测试对象分离所述选择的T细胞群体。
所述对象中选择的T细胞群体可以通过本领域已知的多种途径来测量。在某些实施方式中，所述测试对象中注射的T细胞的积累可以通过细胞计数来测量。在某些实施方式中，所述测试对象中T细胞的积累可以通过来自积累T细胞的基因组DNA的下一代测序(NGS)来测量。
在某些实施方式中，所述起始群体的每个T细胞具有最多一个候选基因的shRNA，如果与所述起始T细胞群体相比在所述选择的T细胞群体中所述候选基因的shRNA富集，候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。具有被敲低或敲除的这些目标基因的T细胞可以具有独立于肿瘤抗原的TCR识别的增强的增殖。在某些实施方式中，与所述起始T细胞群体相比，所述选择的T细胞群体中所述候选基因富集约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约12倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍或约50倍。在某些实施方式中，与所述起始T细胞群体相比，在所述选择的T细胞群体中所述候选基因富集至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多。
在肿瘤中恢复T细胞增殖的shRNA可以在肿瘤中而不是在其他组织如第二淋巴器官(例如脾脏)中富集。因而，在某些实施方式中，与非肿瘤组织样品相比，如果候选基因的shRNA在获自肿瘤样品的选择的T细胞群体中富集，候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。所述肿瘤样品可以是来自已照射肿瘤或未照射肿瘤的样品。所述组织样品可以是第二淋巴器官样品，例如，脾脏样品、或淋巴结样品。所述淋巴结样品可以是引流淋巴结样品或非引流淋巴结样品。
在某些实施方式中，与非肿瘤组织样品相比，在肿瘤样品中所述候选基因富集约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约12倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍或约50倍。在某些实施方式中，与所述起始T细胞群体相比，在所述选择的T细胞群体中所述候选基因富集至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多。
在某些实施方式中，定量所述选择的T细胞群体中的shRNA可以包括使用NGS。
本领域的普通技术人员将理解，上文的章节中描述的体内筛选方法的任何排列组合也适用于这些体内库筛选方法。
本领域的普通技术人员将理解，本文描述的库筛选方法还可以包括进一步的功能测试来证实其中鉴定的目标基因。
5.2T细胞中候选基因的敲除或敲低
在某些实施方式中，在T细胞中候选基因被敲除或敲低，以评估与放射组合时缺少特定蛋白质在调节T细胞功能方面的作用。用于基因编辑的本领域已知的任何常规方法可以与本文提供的方法一起使用。
5.2.1基于RNA的敲除或敲低
敲除或敲低(一起称为“沉默”)候选基因可以利用化学合成的或体外转录的小干扰RNA(siRNA)、以及PCR或基于DNA载体的短发夹RNA(shRNA)在多种细胞系统中实现。已经报道了少数启动子驱动细胞中的shRNA表达，包括基于RNA聚合酶III的启动子，U6和H1，以及RNA聚合酶II启动子，CMV。此外，本文提供的shRNA分子可以可操作连接到T细胞特异性启动子，来实现shRNA分子的T细胞特异性靶向以实现候选基因的沉默。
在某些实施方式中，本文提供的是通过RNA干扰候选基因的基因沉默方法。所述方法涉及创建编码干扰(沉默)RNA的构建体，在其中在要递送构建体的细胞类型(例如T细胞)中有活性的启动子被用于驱动shRNA的表达。
在本文提供的方法中使用的shRNA构建体中，存在着针对所述候选基因的小的核苷酸延伸，用于调节编码所述候选基因的核酸分子的表达。候选基因的抑制通过提供寡聚化合物来实现，所述寡聚化合物与编码所述候选基因的一个或更多个目标核酸分子杂交。
反义技术背后的原理是，与目标核酸杂交的反义化合物调节基因表达活性，例如转录或翻译。这种序列特异性使得反义化合物作为靶点验证和基因功能化的工具是非常有吸引力的。
不受特定理论的限制，沉默候选基因的作用机制涉及shRNA化合物与目标核酸杂交，其中该杂交的结果或作用是靶点降解或靶点占据，伴随细胞机制的停止，涉及例如候选基因的转录或剪切。
基于占据的反义机制中反义化合物杂交而又不引发靶点的裂解，其实例包括但不限于抑制翻译、调节剪切、调节多聚(A)位置选择、和破坏调节性RNA结构。通过使细胞与反义化合物接触，经由非裂解事件起作用，通过调节mRNA靶点加工来控制细胞行为的方法描述于例如美国专利No.6,210,892和美国公开No.20020049173。
一般地，snRNA的正义序列长度是约19个到约22个核苷酸(例如，约19、20、21或22个核苷酸)，反义序列长度是约19个到22个核苷酸(例如，约19、20、21或22个核苷酸)，环区域长度是约3个到约19个核苷酸(例如，约3个直到约19个)。在某些实施方式中，所述正义和反义序列是相同长度的，即，shRNA将形成对称的发夹。在其他实施方式中，所述正义或反义链可以短于它的互补链，可以形成不对称的发夹。在某些实施方式中，所述正义和反义序列之间的碱基配对是精确的。在其他实施方式中，序列之间的一定错配是可以耐受的，或甚至是期望的，例如，以降低两条链之间氢键键合的强度。在某些实施方式中，shRNA分子还可以包含5'-末端磷酸基团，其可以被化学修饰。此外，shRNA分子的环部分可以包含，例如，核苷酸、非核苷酸、接头分子、接合分子等。
任何适合的载体可以与候选基因的RNAi沉默一起使用。实例包括但不限于：基于病毒的载体，例如，腺病毒、慢病毒、腺相关病毒和逆转录病毒载体；以及基于质粒的载体和其他载体，例如，杆状病毒、噬菌体、噬菌粒(phagemide)、粘粒(cosmid)、噬粘粒(phosmid)、细菌人造染色体、基于P1的人造染色体、酵母质粒、和酵母人造染色体。
在一个实施方式中，所述载体是病毒载体。在另一个实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。
shRNA表达载体的递送可以通过施用给目标细胞，或通过容许导入期望的目标细胞或组织的任何其他方式，例如，转染或转导。
5.2.2基于TALEN的敲除或敲低
在其他实施方式中，候选基因可以使用基于转录激活物样效应物和核酸酶(TALEN)的系统来沉默。通过组装重复可变双残基(repeat variable-diresidue，RVD)的序列，可以组装转录激活物样(TAL)效应物序列来特异性结合DNA靶点。TAL效应物和核酸酶(TALEN)的融合蛋白可以在细胞的DNA中产生靶向的双链破裂，其可以用于产生对细胞的特异性遗传修饰。已经报道了TALEN对于产生稳定修饰的细胞是有用的。
结合目标DNA内的特定核苷酸序列的TAL效应物结构域可以包含10个或更多个DNA结合重复，或15个或更多个DNA结合重复。每个DNA结合重复可以包括RVD，其决定目标DNA序列中碱基对的识别，其中每个DNA结合重复负责识别目标DNA序列中的一个碱基对，其中RVD包括一个或更多个的：识别C的HD；识别T的NG；识别A的NI；识别G或A的NN；识别A或C或G或T的NS；识别C或T的N*，其中*代表RVD的第二位置中的缺口；识别T的HG；识别T的H*，其中*代表RVD的第二位置中的缺口；识别T的IG；识别G的NK；识别C的HA；识别C的ND；识别C的HI；识别G的HN；识别G的NA；识别G或A的SN；以及识别T的YG。
在某些实施方式中，TALEN可以包含核酸内切酶结构域和特异于目标DNA的TAL效应物DNA结合结构域，其中所述DNA结合结构域包含多个DNA结合重复，每个重复包含RVD，其决定所述目标DNA中碱基对的识别，其中每个DNA结合重复负责识别目标DNA中的一个碱基对，其中所述TALEN包含一个或更多个以下RVD：识别C的HD；识别T的NG；识别A的NI；识别G或A的NN；识别A或C或G或T的NS；识别C或T的N*；识别T的HG；识别T的H*；识别T的IG；识别G的NK；识别C的HA；识别C的ND；识别C的HI；识别G的HN；识别G的NA；识别G或A的SN；以及识别T的YG所述TALEN可以包含一个或更多个以下RVD：识别C的HA；识别C的ND；识别C的HI；识别G的HN；识别G的NA；识别G或A的SN；识别T的YG；和识别G的NK，以及一个或更多个的：识别C的HD；识别T的NG；识别A的NI；识别G或A的NN；识别A或C或G或T的NS；识别C或T的N*；识别T的HG；识别T的H*；和识别T的IG。所述核酸内切酶结构域可以来自II型限制性内切酶(例如，FokI)。
在某些实施方式中，细胞可以被瞬时转化，从而所述构建体不整合到它的基因组中。例如，含有TALEN编码序列的质粒载体可以被导入细胞，从而所述TALEN编码序列被表达，但是所述载体不被稳定整合到基因组中。瞬时转化的细胞一般随每次细胞分裂损失一些或全部的被导入的核酸构建体，从而在足够数量的细胞分裂之后在子代细胞中不能检出导入的核酸。然而，TALEN编码序列的表达可以足够实现供体序列和内源目标序列之间的同源重组。瞬时转化的和稳定转化的细胞在本文提供的方法中都是有用的。
所述多核苷酸和/或重组载体可以使用本领域已知的任何常规方法导入宿主的基因组，包括但不限于，电穿孔、显微注射和基因枪法。另外，本领域公知的任何其他基因转移和转化技术也可以与本文提供的方法一起使用。这样的技术包括但不限于，通过钙或PEG的原生质体转化，电穿孔介导的裸DNA摄取、脂质体介导的转染、电穿孔、病毒载体介导的转化以及微弹轰击(参见美国专利No.5,538,880、5,204,253、5,591,616和6,329,571，所有这些通过引用合并在本文中)。在某些实施方式中，DNA修饰酶(例如，TALEN)可以直接导入细胞中。例如，多肽可以通过机械注射、经细菌III型分泌系统递送、或通过电穿孔导入细胞中。
在某些实施方式中，例如，核酸结合与效应物结构域连接，包括但不限于转座酶、整合酶、重组酶、解离酶(resolvase)、转化酶、蛋白酶、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、核酸酶、转录抑制物、转录激活物、转录因子征募、蛋白质核定位信号或细胞摄取信号。
在某些实施方式中，所述效应物结构域是展现活性的蛋白质结构域，包括但不限于转座酶活性、整合酶活性、重组酶活性、解离酶活性、转化酶活性、蛋白酶活性、DNA甲基转移酶活性、DNA脱甲基酶活性、组蛋白乙酰基转移酶活性、组蛋白脱乙酰酶活性、核酸酶活性、核定位信号活性、转录抑制物活性、转录激活物活性、转录因子征募活性或细胞摄取信号活性。其他实施方式可以包括本文描述的活性的任何组合。
任何适合的载体，包括克隆载体和表达载体，以及病毒载体和整合载体，可以与本文提供的方法一起使用。“表达载体”是一种包括一个或更多个表达控制序列的载体，“表达控制序列”是控制和调节其他DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。适合的表达载体包括但不限于质粒以及衍生自例如噬菌体、杆状病毒、烟草花叶病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒的病毒载体。许多的载体和表达系统是商业上可获得的。举例来说，重组DNA技术中使用的一些载体容许实体如DNA的片段(例如异源DNA片段，如异源cDNA片段)传递到目标细胞中。
载体可能具有一个或更多个限制性内切酶识别位点(I型、II型或IIs型)，在此序列可以以可确定的方式插入而不损失载体的必需生物学功能，核酸片段可以被剪接或插入其中以实现它的复制和克隆。载体还可以包含一个或更多个重组位点，其允许在两个核酸分子之间交换核酸序列。载体可以进一步提供引物位点，例如，用于PCR、转录和/或翻译起始、和/或调节位点、重组信号、复制子和可选择标记物。载体可以进一步含有一个或更多个可选择标记物，适用于鉴定用该载体转化的细胞。
在某些实施方式中，当需要翻译期望的核酸序列时，例如，编码TALE多肽的mRNA，载体还可以包含核酸序列的适当翻译所需的序列。
在某些实施方式中，表达载体常常是“质粒”的形式，这是指环形的双链DNA环，其在它们的载体形式下不结合染色体。在某些实施方式中，给定的TALE多肽的所有部件可以编码在单个载体中。例如，在某些实施方式中，可以构建载体，其含有或可以包含功能性TALE多肽所必需的所有部件。在某些实施方式中，单独的部件(例如，一个或更多个单体单位和一个或更多个效应物结构域)可以单独编码在不同的载体中，单独地导入一个或更多个细胞。此外，本文描述的任何载体本身可以在任何位置或位置组合上包含预定的TALE多肽编码部件序列，例如，效应物结构域和/或TALE单体单位。
载体的实例包括但不限于质粒、游离体(episomes)、噬菌体或病毒载体，这样的载体可以整合到宿主细胞的基因组中，或在所使用的特定细胞系统中自主复制。在某些实施方式中，所使用的载体是游离载体，即，能够在染色体外复制的核酸，可以包括来自细菌、病毒或噬菌体的序列。在其他实施方式中，载体来源于细菌质粒、噬菌体、酵母游离体、酵母染色体元件和病毒，来自这些组合的载体，例如，衍生自质粒和噬菌体遗传元件、粘粒和噬菌粒的那些。在某些实施方式中，载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体(BAC)、或酵母人工染色体(YAC)。载体可以是单链或双链的DNA、RNA或噬菌体载体。
病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体，例如，慢病毒载体或gamma逆转录病毒载体、腺病毒载体和杆状病毒载体。例如，慢病毒载体可以以慢病毒颗粒的形式使用。也可以使用提供了等价的功能的、本领域技术人员已知的其他形式的表达载体。表达载体可以用于要表达的核酸序列所编码的多肽的稳定表达或瞬时表达。载体可以是自我复制性的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。在一个实施方式中，载体是基因组整合的载体，或“整合载体”，其可以变为整合到宿主细胞、细胞系统或非细胞系统的染色体DNA或RNA中。在某些实施方式中，编码TALE多肽或部件序列的核酸序列与载体序列的部件一起整合到宿主细胞、细胞系统或非细胞系统的染色体DNA或RNA中。
本文提供的重组表达载体可以包含以适合于宿主细胞中核酸表达形式存在的TALE核酸，这表明所述重组表达载体包括一个或更多个根据用于表达的宿主细胞选择的调节序列，所述调节序列与要表达的核酸序列可操作连接。
5.23基于CRISPR/CAS9的敲除或敲低
在某些实施方式中，使用规律成簇的间隔短回文重复(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)/CAS9系统沉默候选基因，描述于例如Wiedenheft et al,Nature 482(7385):331-8(2012)中，通过引用将其全部合并在本文中。
简要地说，提供了一种工程化的、可编程的、非天然发生的CRISPR-Cas系统，其包含Cas9蛋白和一个或更多个向导RNA，向导RNA靶向真核细胞中编码一个或更多个基因产物的DNA分子的基因组座位，Cas9蛋白裂解编码所述一个或更多个基因产物的DNA分子的基因组座位，改变所述一个或更多个基因产物的表达(参见美国专利No.8,697,359，通过引用将其完全合并在本文中)。
载体可以被设计为用于在原核或真核细胞中表达CRISPR转录产物(例如，核酸转录产物、蛋白质或酶)。例如，CRISPR转录产物可以在细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞(利用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。在Goeddei,GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中进一步讨论了适合的宿主细胞。做为选择，重组表达载体可以体外转录和翻译，例如，使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
载体可以被导入原核生物并在其中增殖。在某些实施方式中，原核生物被用于扩增要被导入真核细胞的载体拷贝，或作为要导入真核细胞中的载体生产的中间载体(例如，扩增作为病毒载体包装系统部分的质粒)。在某些实施方式中，原核生物被用于扩增载体拷贝和表达一个或更多个核酸，例如，提供一个或更多个蛋白质的源用于递送到宿主细胞或宿主生物体。
在某些实施方式中，所述载体是融合表达载体。这类载体的实例包括但不限于商业上可获得的载体，例如pGEX(Pharmacia Biotech Inc)、pMAL(New England Biolabs)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合到目标重组蛋白质。适合的可诱导非融合E.coli表达载体的实例包括但不限于pTrc(Amrann et al,Gene 69:301-315(1988))和pET 11d(Studier et al,GENEEXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.60-89(1990))。
在某些实施方式中，载体是酵母表达载体。这类载体的实例包括但不限于pYepSec1(Baldari et al,EMBO J.6:229-234(1987))、pMFa(Kuijan and Herskowitz,1982.Cell 30:933-943)、pJRY88(Schultz et al,Gene 54:113-123(1987))、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif)和picZ(Invitrogen Corp,San Diego,Calif)。
在某些实施方式中，载体是哺乳动物表达载体。这类载体的实例包括但不限于pCDM8(Seed,Nature 329:840(1987))和pMT2PC(Kaufman et al,EMBO J.6:187-195(1987))。当在哺乳动物细胞中使用时，一般通过一个或更多个调节元件来提供表达载体的控制功能。例如，常用的启动子来源于多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒、猿猴病毒40，以及本领域已知的其他的。
在某些实施方式中，调节元件可操作连接到CRISPR系统的一个或更多个元件，以便驱动CRISPR系统的一个或更多个元件的表达。CRISPR基因座已经在超过40种原核生物中鉴定出，包括但不限于气热菌属(Aeropyrum)、热棒菌属(Pyrobaculum)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、古生球菌属(Archaeoglobus)、小盒菌属(Halocarcula)、甲烷杆菌属(Methanobacteriumn)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、火球菌属(Pyrococcus)、嗜酸菌属(Picrophilus)、Thernioplasnia、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptomyces)、产液菌属(Aquifrx)、卟啉单胞菌属(Porphvromonas)、绿菌属(Chlorobium)、栖热菌属(Thermus)、芽胞杆菌属(Bacillus)、李斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、高温厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、支原体属(Mycoplasma)、梭杆菌属(Fusobacterium)、Azarcus、色杆菌属(Chromobacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、地杆菌属(Geobacter)、Myrococcus、弯曲杆菌属(Campylobacter)、沃廉菌属(Wolinella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希杆菌属(Escherichia)、军团菌属(Legionella)、甲基球菌属(Methylococcus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、发光菌属(Photobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、密螺旋体属(Treponema)和栖热袍菌属(Thermotoga)。
在某些实施方式中，CRISPR系统的一个或更多个元件来源于I型、II型或III型CRISPR系统。在某些实施方式中，CRISPR系统的一个或更多个元件来源于包含内源CRISPR系统的特定微生物，例如，化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)。
一般地，CRISPR系统的特征在于促进目标序列的位点处CRISPR复合物形成的元件(在内源CRISPR系统的场景下也称为前间区(protospacer))。术语“目标序列”与CRISPR系统一起使用时，是指设计向导序列使得与之具有互补性的序列，其中目标序列和向导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。在某些实施方式中，完全的互补性不是必需的，只要存在足够的互补性以引起杂交和促进CRISPR复合物的形成。
目标序列可以包含任何多核苷酸，例如，DNA或RNA多核苷酸。在某些实施方式中，目标序列位于细胞的核中或细胞质中。在某些实施方式中，目标序列位于真核细胞的细胞器内，例如，线粒体或叶绿体。
在某些实施方式中，载体包含一个或更多个插入位点，例如，限制性内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在某些实施方式中，一个或更多个插入位点(例如，大约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个插入位点)位于一个或更多个载体的一个或更多个序列元件的上游和/或下游。在某些实施方式中，载体包含tracr配偶序列上游的，任选地与tracr配偶序列可操作连接的调节元件下游的插入位点，从而在向导序列插入所述插入位点之后以及在表达时，所述向导序列指导CRISPR复合物对真核细胞中目标序列的序列特异性结合。在某些实施方式中，载体包含两个或更多个插入位点，每个插入位点位于两个tracr配偶序列之间，从而容许向导序列插入每个位点。在这样的布置中，两个或更多个向导序列可以包含单个向导序列的两个或更多个拷贝，两个或更多个不同的向导序列或这些的组合。当使用多个不同的向导序列时，单个表达构建体可以用于将CRISPR活性靶向细胞内多个不同的、相应的目标序列。例如，单个载体可以包含大约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个向导序列。在某些实施方式中，可以提供大约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个这种含有向导序列的载体，任选地递送给细胞。
在某些实施方式中，载体包含调节元件，其与编码CRISPR酶例如Cas蛋白的酶编码序列可操作连接。Cas蛋白的实例包括但不限于Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4以及其同源物或衍生物。
在某些实施方式中，所述CRISPR酶是Cas9，以及可以是Cas9。在某些实施方式中，所述CRISPR酶直接裂解目标序列的位置处的一条或两条链，例如，处于目标序列之内的和/或处于目标序列的互补物之内的。在某些实施方式中，所述CRISPR酶指导来自目标序列的第一个和最后一个核苷酸的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对之内的一条或两条链的裂解。在某些实施方式中，载体编码CRISPR酶，其相对于相应地野生型酶被突变从而所述突变的CRISPR酶缺乏裂解含目标序列的目标多核苷酸的一条链或两条链的能力。
在某些实施方式中，编码CRISPR酶的酶编码序列被密码子优化用于在特定细胞例如真核细胞中表达。真核细胞可以是来自特定生物体的那些，例如，哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类。密码子优化是指通过用宿主细胞的基因中更频繁使用或最频繁使用的密码子替换天然序列中的至少一个密码子，同时保持天然氨基酸序列的一种修饰核酸序列以在目标宿主细胞中增强表达的过程。
对特定氨基酸的某些密码子，各个物种展现了特定的偏好。密码子偏好(生物体之间密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而这随之被认为取决于特别是被翻译的密码子的性质和特定转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中选择的tRNA的优势一般是肽合成中最常使用的密码子的反映。因而，可以基于密码子优化来修整基因以在给定生物体中最优基因表达。
可以选择向导序列来靶向任何目标序列。在某些实施方式中，所述目标序列是细胞的基因组内的序列。示范性的目标序列包括目标基因组中唯一的那些。例如，对于S.pyogenes Cas9，基因组中的唯一目标序列可以包括MMMMMMMMNNKNNNNKNNNNXGG形式的Cas9目标位点，其中NNNNNKNNNNNNXGG(N是A、G、T或C；X可以是任意)具有基因组中的单独发生。
几种用于基因编辑的商业上可获得的CRISPR/Cas9系统是本领域可获得的。任何这样的系统以及其变体可以与本文提供的方法一起使用。
5.3使用方法
本文还提供的是使用本文描述的筛选方法鉴定的基因靶点的方法。例如，本文提供的是通过抑制本文描述的筛选方法鉴定的目标基因来活化T细胞的方法。在某些实施方式中，T细胞存在于荷瘤对象中。荷瘤对象可以在抑制本文描述的筛选方法鉴定的目标基因的治疗之前、同时或之后接受肿瘤靶向放射。
在某些实施方式中，本文提供的还有通过抑制本文描述的筛选方法鉴定的目标基因治疗有需要的对象的癌症的方法。在某些实施方式中，本文提供的还有通过使用本文描述的筛选方法鉴定的目标基因被敲低或敲除的T细胞进行T细胞治疗，在有需要的对象中治疗癌症的方法。在某些实施方式中，所述方法可以进一步包括施用肿瘤靶向性放射治疗。
6.实施例
参考以下实施例可以更完整地理解本文提供的实施方式。这些实施例意图说明本文提供的药物组合物和剂型，但无论如何不是限制性的。
6.1实施例1：高通量体外筛选
为了鉴定癌症治疗的靶点，即，与调节抑制细胞的抑制机制相关的分子，从非荷瘤的、遗传工程化或非遗传工程化小鼠中分离原初T细胞，置于96孔板中。通过用含有上文所述的目标shRNA的慢病毒载体感染T细胞，或通过使用可以敲除目标基因的系统，例如也在上文描述的TALEN或CRISPR/CAS9系统，所述原初T细胞被工程化以含有被敲低或敲除的特定目标基因。特定候选基因的敲低或敲除一次进行一个反应孔。
在获得稳定的表型之后，shRNA处理的T细胞在存在抗原或抗-CD3+抗-CD28的情况下与抑制细胞孵育，使用两组抑制细胞：(1)分离自已照射动物的抑制细胞；和(2)分离自未照射动物的抑制细胞。然后利用基本上类似于Dolcetti et al.,Current Protocols inImmunlogy,14.17.1-14.17.25(2010)中描述的过程，通过引用合并在本文中，通过监视3[H]胸腺嘧啶核苷掺入来评估单个反应孔中的T细胞增殖。
预期的是增殖将在用非靶点对照shRNAs处理的T细胞中被抑制，而负调节(抑制)免疫应答的目标基因的灭活将引起增强的反应(降低的抑制)。进一步的，在同一体外抑制分析中比较T细胞和/或分离自已照射vs.未照射动物的抑制细胞的反应。预期的是，当与分离自已照射动物的抑制细胞组合时，在含有涉及T细胞反应抑制的基因敲除或敲低的样品中，观察到显著更好的T细胞增殖(即，降低的T细胞抑制)。这样的基因被鉴定为癌症治疗的靶点，特别是，鉴定为对它的抑制可能潜在地诱导远端效应的靶点。
6.2实施例2：库化体外筛选
另一种体外途径基本上可以使用与上文所述相同的方法，只是不在96孔板中以阵列形式进行，而是以与抑制细胞共培养的T细胞的库来进行。用带有载体的慢病毒感染T细胞，其可以介导候选基因的敲低或敲除，并且一个细胞将精确地仅减弱一个基因。每个基因将在至少500-1000个细胞中呈现。作为库来进行T细胞抑制分析，从而可能在抑制性微环境中逃避抑制并增殖的任何细胞将被富集。携带目标载体的细胞将在基因组中整合，因而对载体的测序将确定库中每个载体的相对呈现，确定特定载体的任何过高呈现(或过低呈现)来评估候选基因在对T细胞免疫的抑制作用方面的关联。
6.3实施例3：诱导远端效应的靶点的体内筛选
在某些情况下，对于从上文描述的体外分析鉴定出的那些候选基因，候选基因作为远端效应的介体的功能在体内系统中测试，其中将两个肿瘤远离地植入动物，仅照射一个肿瘤。将测量对未照射肿瘤的抗肿瘤效应。如果所述基因对于介导伴随放射的免疫抑制反应是重要的，在T细胞中将其敲低或敲除将大大地增强未处理肿瘤的抗肿瘤效应。
初始T细胞从野生型或TCR工程化小鼠中分离，与上文描述的体外库筛选方法类似，利用库化慢病毒方法用目标慢病毒载体转导。在目标载体向T细胞中稳定转导之后，每个基因呈现500-1000次，将这些细胞注射回带有双肿瘤的小鼠。
对于一组动物，两个肿瘤中的仅一个以1到20Gy的单次照射剂量进行照射。对于第二组动物，肿瘤不进行照射。在照射后7-20天，从引流淋巴结、非引流淋巴结、脾脏和未照射肿瘤分离转导的T细胞(其可以通过细胞表面上的特定同系标志物的表达来鉴定，所述标志物不被来自荷瘤动物的内源T细胞表达，或者所述标志物通过导入细胞的载体被共表达)。
从T细胞提取基因组DNA，扩增特定的载体，使用下一代测序进行测序。含有涉及远端效应诱导的候选基因的T细胞预计显示增强的增殖。预期的是T细胞活化和扩增仅在目标基因被敲低或敲除并且在存在原发肿瘤的消融性照射的情况下发生。因而，当对侧肿瘤被照射和目标基因被敲低时，在浸润了未处理肿瘤的T细胞中，以及在未处理肿瘤的皱缩中这种活化应当是明显的。相比之下，在未照射的小鼠中T细胞活化预计是低的或可忽略的。
6.4实施例4：体内shRNA筛选
在双肿瘤小鼠模型中进行体内筛选，靶向G蛋白偶联受体(GPCR)、肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)和免疫球蛋白超家族文库(IgSF)。筛选了总共134个候选基因，由650个shRNA呈现，这些家族的每个候选基因由4到5个shRNA呈现。对于许多基因，相比起始T细胞群体，shRNA在测试组织中过量表达，表明当测试对象的一个肿瘤接受靶向照射时，独立于肿瘤抗原的TCR识别，掺入shRNA的T细胞克隆具有增强的增殖和积累。因而，这些基因被鉴定为癌症治疗的靶点，单独地或与放射组合地。鉴定出的这些靶点的有效性可以进一步用附加测试来证实。另一方面，测试组织中具有shRNA的选择性损失的基因表明，这些基因可能在T细胞活化和抑制中起到重要作用。
构建库化shRNA文库。靶向G蛋白偶联受体(GPCR)、肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)和免疫球蛋白超家族文库(IgSF)的三个shRNA库通过针对每个目标基因亚克隆4到5个shRNA来创建。设计所有shRNA构建体，通过将退火的寡核苷酸连接到pLKO.3-Thy1.1来构建，通过小鼠初始CD8+ T细胞的慢病毒转导，其共表达Thy 1.1和shRNA。每个shRNA库含有82个阴性对照shRNA，包括21种绿色荧光蛋白(GFP)、16种红色荧光蛋白(RFP)和25中荧光素酶和20种LacZ。
原代小鼠初始CD8+ T细胞的慢病毒转导。使用小鼠初始CD8+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，从OT-1转基因小鼠(C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J，The Jacksonlaboratory)分离原代小鼠初始CD8+ T细胞，以低的感染复数(MOI)用慢病毒库转导。在慢病毒转导之前，分离的初始CD8+T细胞与IL-7(5ng/ml)和IL 15(100ng/ml)在完全RPMI培养基(RPMI1640，10％FBS，20mM HEPES，1mM丙酮酸钠，0.05mM 2-巯基-乙醇，2mM L-谷氨酰胺，100μg/ml链霉素和100μg/ml青霉素)中孵育48小时。将补充有鱼精蛋白硫酸酯(5μg/ml)的CD8+ T细胞(每反应孔8×106个细胞)和慢病毒库播种到RetroNectin试剂预包被的6-孔平板(5μg/ml)中，通过旋转接种(spinoculation)以25到50的MOI感染。OT-1 CD8+ T细胞进一步在含有IL-7(2.5ng/ml)、IL-15(50ng/ml)和IL-2(2ng/ml)的完全RPMI培养基中培养，之后慢病毒感染。感染后48小时，通过Thy1.1表达来检查病毒感染性，使用抗-Thy 1.1-PE抗体通过流式细胞计来分析。
通过CD8+ T细胞向荷瘤小鼠承继转移来治疗肿瘤B16-Ova细胞(50μl中1.5×105个细胞)通过表皮注射到雄性C57BL/6小鼠(10周龄)中来接种，接种后每三天测量肿瘤大小，记为长度×宽度。在第9天，在腿部和肋部具有相似肿瘤大小的30只荷瘤小鼠分为2组，非照射(non-IR)和照射(IR)。照射组在第9天使用shepherd Cesium辐照器在右腿肿瘤上用12Gy IR治疗。在第11天，在感染后72小时，使用Thy1.1作为选择标志物(EasySepTPE阳性选择试剂盒，Stem Cells Technologies)通过PE-阳性选择来分离shRNA库感染的Thy1.1阳性CD8+ T细胞。通过眼窝后注射将具有90％Thy1.1阳性的分离的CD8+ T细胞(200μl中5×106个细胞)注射到带有B16-Ova肿瘤的C57BL/6小鼠中。在转移后每两天测量肿瘤大小，记为长度×宽度。具有最长轴>20mm的肿瘤的小鼠进行安乐死。
从承继转移的荷瘤C57BL/6小鼠中分离Thy1.1阳性CD8+ T细胞。从non-IR和IR小鼠的脾脏、引流淋巴结、非引流淋巴结分离淋巴细胞。从腿部和肋部肿瘤纯化浸润肿瘤的淋巴细胞(tumor-infiltrated lymphocyte，TTL)，从小鼠采集B16-Ova肿瘤，用2％FBS的PBS洗涤。将肿瘤重悬浮在含有2％FBS、50U/ml IV型胶原酶(Invitrogen)和20U/ml DNasel(Roche)的15ml RPMI中，在37℃孵育2h。使用Lympholyte-M(Cedarlane Laboratories)进一步分离TIL。使用抗-Vα2-FITC、抗-Thy1.1-PE、抗-β5V-PerCP、抗-CD45-APC和抗-CD8-eFlour450抗体对纯化的淋巴细胞进行荧光标记。使用FACSAria(BD Biosciences)，通过荧光活化的细胞分选(FACS)来分选表达shRNA的Thy1.1阳性CD8+ T细胞(CD8+Vα2+Vβ5+Thy1.1+)。
使用Illumina MiSeq遗传分析仪进行深度测序。分离所采集样品的基因组DNA(DNeasy blood&tissue试剂盒，QIAGEN)，充当模板来产生来自shRNA盒的PCR扩增子，用于深度测序分析。利用Illumina的MiSeq，通过深度测序来分析每个库中shRNA的呈现。使用每个库中的对照shRNA的平均读数将数据正常化。
深度测序数据的统计分析。使用Bowtie2将读取结果绘制到库shRNA文库的FASTA文件中。为了避免在计算倍数改变时除以零，给每个克隆的原始计数加上1个单位。然后，对于每个样品，将计数数据正常化为该样品的读取结果的总数。每个克隆的正常化的读取结果计数表示为每百万次读取的读数(Reads-per-Million，“RPM”)。正常化的读取结果计数用于计算倍数改变。
如下文表1-3中显示的，在覆盖了134种基因(650个shRNA克隆)的这次筛选期间鉴定了许多基因靶点。例如，鉴定出22个目标基因，在腿部肿瘤接受放射的小鼠中，与从脾脏获得的相比，从腿部肿瘤获得的Thy1.1阳性CD8+ T细胞中两种相关的shRNA克隆的表达水平更高超过2倍。
表1:细胞的shRNA表达方面的倍数差异：未照射的腿部肿瘤对比未照射的脾脏
NR:未照射的
NR-Leg:来自未照射的腿部的肿瘤
NR-Spleen:来自未照射小鼠的脾脏
*仅腿部肿瘤被照射，肋部肿瘤没有
表2:T细胞的shRNA表达方面的倍数差异：未照射的肋部肿瘤对比未照射的脾脏
NR:未照射的
NR-Leg:来自未照射的腿部的肿瘤
NR-Spleen:来自未照射小鼠的脾脏
*仅腿部肿瘤被照射，肋部肿瘤没有
表3:T细胞的shRNA表达方面的倍数差异：已照射的腿部肿瘤对比照射了腿部肿瘤的脾脏
R-Leg:来自已照射腿部肿瘤的肿瘤
R-Spleen:来自腿部肿瘤已照射的小鼠的脾脏
*仅腿部肿瘤被照射，肋部肿瘤没有
虽然本文提供了某些特定实施方式的实施例，对于本领域技术人员显而易见的是可以进行各种改变和修改。这样的修改也意图落入本公开的范围内。

Claims (58)

1.一种鉴定癌症治疗的目标基因的方法，包括测量未修饰T细胞和已修饰T细胞的活性；所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞各自与来自已照射荷瘤对象的肿瘤微环境接触；所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；其中将所述已修饰T细胞与所述未修饰T细胞比较，如果所述活性提高，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
2.权利要求1的方法，其中所述对象接受了1Gy到20Gy剂量的靶向肿瘤的照射。
3.权利要求1或2的方法，其中所述活性选自增殖、细胞周期活化、细胞死亡抑制、细胞因子生产和细胞毒性活性。
4.权利要求1到3的任一项的方法，进一步包括测量所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞的所述活性，所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞已经各自与来自未照射荷瘤对象的肿瘤微环境接触；其中所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞中的所述活性是基本上相同的。
5.一种鉴定癌症治疗的目标基因的体内方法，包括
(i)向已照射荷瘤测试对象注射未修饰T细胞和已修饰T细胞；所述已修饰T细胞具有被敲低或敲除的候选基因；和
(ii)测量所述测试对象中所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞的活性，其中所述活性是增殖活性或抗肿瘤活性；
其中将所述已修饰T细胞与所述未修饰T细胞比较，如果所述活性提高，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
6.权利要求5的方法，其中所述已修饰T细胞是参考T细胞。
7.权利要求5的方法，其中所述对象接受了1Gy到20Gy剂量的靶向肿瘤的照射。
8.权利要求5的方法，进一步包括向未照射测试对象注射所述未修饰T细胞和所述已修饰T细胞，其中在所述未照射测试对象中将所述已修饰T细胞与所述未修饰T细胞比较所述活性是基本上相同的。
9.权利要求5到8的任一项的方法，其中所述活性是通过注射的T细胞的积累来测量的增殖活性。
10.权利要求5到8的任一项的方法，其中所述活性是通过肿瘤细胞死亡或肿瘤大小降低来测量的抗肿瘤活性。
11.权利要求5到8的任一项的方法，其中所述活性是通过测试对象的提高的存活来测量的抗肿瘤活性。
12.权利要求5到11的任一项的方法，其中所述测试对象是小鼠。
13.权利要求12的任一项的方法，其中所述小鼠是双肿瘤小鼠，其中仅一个肿瘤接受了靶向放射。
14.权利要求13的方法，其中所述活性是通过未照射肿瘤的大小降低来测量的抗肿瘤活性。
15.权利要求1到14的任一项的方法，其中所述T细胞是初始T细胞。
16.权利要求1到14的任一项的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
17.权利要求1到14的任一项的方法，其中所述T细胞分离自小鼠。
18.权利要求17的方法，其中所述小鼠是野生型的。
19.权利要求17的方法，其中所述小鼠被遗传工程化以表达特异于小鼠中非天然存在的抗原的T细胞受体。
20.权利要求19的方法，其中所述抗原是卵白蛋白。
21.权利要求1到20的任一项的方法，其中所述T细胞是标记的。
22.权利要求21的方法，其中所述标记是羰基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)。
23.权利要求1到22的任一项的方法，其中所述候选基因通过shRNA敲低或敲除。
24.权利要求23的方法，其中病毒载体是慢病毒载体。
25.权利要求1到22的任一项的方法，其中所述候选基因通过使用转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)在所述已修饰T细胞中敲低或敲除。
26.权利要求1到22的任一项的方法，其中所述候选基因通过使用CAS9(CRISPR)在所述已修饰T细胞中敲低或敲除。
27.一种鉴定癌症治疗的目标基因的库筛选方法，包括
(i)制备具有不同遗传修饰的起始T细胞群体，其中每个T细胞有最多一个被敲低或敲除的候选基因；和
(ii)使所述起始T细胞群体与来自已照射荷瘤对象的肿瘤微环境接触一段时间以产生选择的T细胞群体；
其中在所述选择的T细胞群体中被敲低或敲除的候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
28.一种鉴定癌症治疗的目标基因的体内库筛选方法，包括
(i)制备具有不同遗传修饰的起始T细胞群体，其中每个T细胞有最多一个被敲低或敲除的候选基因；和
(ii)向已照射荷瘤对象注射所述起始T细胞群体，在其中所述起始T细胞群体产生选择的T细胞群体；
其中在所述选择的T细胞群体中被敲低或敲除的候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
29.权利要求27或28的库筛选方法，其中制备起始T细胞群体包括使用转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)。
30.权利要求27或28的库筛选方法，其中制备起始T细胞群体包括使用CAS9(CRISPR)。
31.权利要求27或28的库筛选方法，其中制备起始T细胞群体包括用shRNA文库感染T细胞。
32.权利要求31的库筛选方法，其中所述shRNA文库是慢病毒载体文库。
33.权利要求27到32的任一项的库筛选方法，其中所述起始T细胞群体是初始T细胞。
34.权利要求27到33的任一项的库筛选方法，其中所述起始T细胞群体是CD8+T细胞。
35.权利要求27到34的任一项的库筛选方法，其中所述起始T细胞群体分离自小鼠。
36.权利要求35的库筛选方法，其中所述小鼠是野生型的。
37.权利要求35的库筛选方法，其中所述小鼠被遗传工程化以表达特异于小鼠中非天然存在的抗原的T细胞受体。
38.权利要求37的库筛选方法，其中所述抗原是卵白蛋白。
39.权利要求27到38的任一项的库筛选方法，其中所述起始T细胞群体是标记的。
40.权利要求39的库筛选方法，其中所述标记是羰基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)。
41.权利要求27到40的任一项的库筛选方法，包括从所述测试对象的样品分离所述选择的T细胞群体。
42.权利要求41的库筛选方法，其中所述样品是肿瘤样品。
43.权利要求42的库筛选方法，其中所述肿瘤样品接受了靶向放射。
44.权利要求42的库筛选方法，其中所述测试对象是双肿瘤模型，所述肿瘤样品没有接受靶向放射。
45.权利要求41的库筛选方法，其中所述样品是非肿瘤样品。
46.权利要求45的库筛选方法，其中所述非肿瘤组织样品是脾脏样品或淋巴结样品。
47.权利要求27到46的任一项的库筛选方法，其中在所述选择的T细胞群体中被敲低或敲除的候选基因通过分离自所述选择的T细胞群体的基因组DNA的NGS来鉴定。
48.权利要求31到46的任一项的库筛选方法，其中所述起始群体的每个T细胞具有候选基因的最多一个shRNA，如果相比所述起始T细胞群体，在所述选择的T细胞群体中所述候选基因的shRNA富集，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
49.权利要求48的库筛选方法，其中如果与非肿瘤组织样品相比从肿瘤样品获得的所述选择的T细胞群体中所述候选基因的shRNA富集，所述候选基因被鉴定为癌症治疗的目标基因。
50.权利要求48的库筛选方法，其中如果与所述非肿瘤组织样品相比在所述肿瘤样品中所述候选基因的shRNA富集超过2倍，所述候选基因被鉴定为目标基因。
51.权利要求48的库筛选方法，其中如果与所述非肿瘤组织样品相比在所述肿瘤样品中所述候选基因的shRNA富集超过3倍、超过4倍、超过5倍、超过10倍、超过15倍、或超过20倍，所述候选基因被鉴定为目标基因。
52.权利要求48到51的任一项的库筛选方法，包括通过NGS定量所述选择的T细胞群体中的shRNA。
53.一种通过抑制T细胞的权利要求1到52的任一项中鉴定的目标基因来活化所述T细胞的方法。
54.权利要求53的方法，其中所述T细胞存在于荷瘤对象中。
55.权利要求54的方法，其中所述荷瘤对象是已照射的。
56.一种治疗有需要的对象的癌症的方法，包括抑制权利要求1到52的任一项中鉴定的目标基因。
57.一种治疗有需要的对象的癌症的方法，包括利用T细胞向所述对象施用T细胞治疗，所述T细胞被敲低或敲除了权利要求1到52的任一项中鉴定的所述目标基因。
58.权利要求56或57的方法，进一步包括向所述对象施用肿瘤靶向放射。
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