JP2021040648A - 腫瘍細胞による免疫抑制を低下させるための方法および組成物 - Google Patents

腫瘍細胞による免疫抑制を低下させるための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】腫瘍細胞による免疫抑制を低下させるための方法および組成物を提供する。【解決手段】インビボにおける免疫療法の標的を発見する方法、治療用組成物(例えば、shRNA、shRNAおよび/またはキメラ抗原受容体(CAR)を発現する免疫応答性細胞)、およびそれらの使用方法を提供する。免疫応答性細胞は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞からなる群より選択される。【選択図】図1

Description

関連出願
本出願は、2014年1月21日付けで出願された米国仮出願第61/929,821号、2013年12月27日付けで出願された米国仮出願第61/921,303号、および2013年6月10日付けで出願された米国仮出願第61/833,298号の優先権および利益を主張するものであり、これらの内容は、この参照によりそれらの全体が開示に組み入れられる。
政府支援
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)から付与された認可番
号1R01CA173750−01およびT32AI07386、ならびに国立癌研究所(National Cancer Institute)から付与された認可番号P30−CA14051に基づ
く政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、インビボにおける免疫療法の標的を発見する方法、免疫療法の標的(例えば、shRNA、shRNAを発現する免疫応答性細胞、ならびにいくつかのケースにおいてはがん細胞を標的とする受容体、例えばキメラ抗原受容体(CAR))をモジュレートする治療用組成物、および関連する使用方法に関する。
細胞傷害性T細胞は、免疫介在性のがんの制御において中心的な役割を果たし1〜3、T細胞上の阻害性受容体を標的とするモノクローナル抗体は、進行疾患を有する患者において有意な臨床上の利益を誘導することができる4〜6。腫瘍は、生存のために、それら自身の成長を促進して、宿主の免疫系からうまく逃れて、腫瘍の微環境におけるT細胞の活性を効果的にブロックする多数の免疫抑制メカニズムを発達させてきた。このことは、腫瘍細胞に対する細胞傷害機能を有するCD8T細胞による強い浸潤は複数のタイプのヒトがんにおいて好都合な予後に関連するため1、3、8、腫瘍学における中核的な問題である。この天然の防御機構は、大部分の患者において、腫瘍、その間質、制御性T細胞および骨髄の細胞集団から放出される複数の阻害シグナルによって著しく鈍くなる9〜11。腫瘍回避に関与する様々な分子および細胞免疫抑制メカニズムが同定されている。ある特定のこれらのメカニズムは、免疫系の抗腫瘍性エフェクター細胞を標的とする。しかしながら、免疫抑制性の腫瘍内におけるT細胞機能の喪失を引き起こす調節メカニズムの多くは、依然として不明である。がん免疫療法の限定的な成功を改善するには、宿主の免疫系を逃れるための腫瘍細胞によって開始される免疫抑制経路を阻害する新しいアプローチが必要である。
本発明の開示は、免疫細胞を不活性化および/または抑制するための腫瘍細胞によって使用される免疫抑制経路を阻害するための標的を提供する。
本開示はまた、治療可能性を有するshRNAに関する組成物および方法も提供する。
本開示はまた、T細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることができる少なくとも1種のshRNAまたは他の核酸分子を発現する、T細胞などの免疫応答性細胞(例えば、腫瘍抗原を標的とする細胞)も提供する。
本開示はまた、shRNAおよび腫瘍抗原に向けられた少なくとも1種のキメラ抗原受
容体を発現する少なくとも1種のベクターを含む、T細胞などの免疫応答性細胞も提供する。
いくつかの実施態様において、本開示は、T細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることができるshRNAをコードするベクターを含む、腫瘍特異性を有する免疫応答性細胞を提供する。いくつかの形態において、shRNA配列は、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7またはPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる。別の形態において、shRNAは、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの形態において、免疫応答性細胞は、腫瘍特異的なT細胞受容体をコードするベクターをさらに含む。いくつかの形態において、免疫応答性細胞は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞からなる群より選択される。
いくつかの実施態様において、免疫応答性細胞は、CARをコードするベクターを含み、ここでCARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激性ドメインを含む。いくつかの形態において、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原または病原体抗原と結合する。例示的な腫瘍抗原としては、例えば、前立腺特異的な膜抗原(PSMA)、癌胎児性抗原(CEA)、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD333/IL3Ra、c−Met、グリコリピドF77、EGFRvIII、GD−2、NY−ESO−1 TCR、ERBB2、BIRC5、CEACAM5、WDR46、BAGE、CSAG2、DCT、MAGED4、GAGE1、GAGE2、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GAGE8、IL13RA2、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEA10、MAGEA12、MAGEB1、MAGEB2、MAGEC2、TP53、TYR、TYRP1、SAGE1、SYCP1、SSX2、SSX4、KRAS、PRAME、NRAS、ACTN4、CTNNB1、CASP8、CDC27、CDK4、EEF2、FN1、HSPA1B、LPGAT1、ME1、HHAT、TRAPPC1、MUM3、MYO1B、PAPOLG、OS9、PTPRK、TPI1、ADFP、AFP、AIM2、ANXA2、ART4、CLCA2、CPSF1、PPIB、EPHA2、EPHA3、FGF5、CA9、TERT、MGAT5、CEL、F4.2、CAN、ETV6、BIRC7、CSF1、OGT、MUC1、MUC2、MUM1、CTAG1A、CTAG2、CTAG、MRPL28、FOLH1、RAGE、SFMBT1、KAAG1、SART1、TSPYL1、SART3、SOX10、TRG、WT1、TACSTD1、SILV、SCGB2A2、MC1R、MLANA、GPR143、OCA2、KLK3、SUPT7L、ARTC1、BRAF、CASP5、CDKN2A、UBXD5、EFTUD2、GPNMB、NFYC、PRDX5、ZUBR1、SIRT2、SNRPD1、HERV−K−MEL、CXorf61、CCDC110、VENTXP1、SPA17、KLK4、ANKRD30A、RAB38、CCND1、CYP1B1、MDM2、MMP2、ZNF395、RNF43、SCRN1、STEAP1、707−AP、TGFBR2、PXDNL、AKAP13、PRTN3、PSCA、RHAMM、ACPP、ACRBP、LCK、RCVRN、RPS2、RPL10A、SLC45A3、BCL2L1、DKK1、ENAH、CSPG4、RGS5、BCR、BCR−ABL、ABL−BCR、DEK、DEK−CAN、ETV6−AML1、LDLR−FUT、NPM1−AL
K1、PML−RARA、SYT−SSX1、SYT−SSX2、FLT3、ABL1、AML1、LDLR、FUT1、NPM1、ALK、PML1、RARA、SYT、SSX1、MSLN、UBE2V1、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、WNK2、OAS3、BCL−2、MCL1、CTSH、ABCC3、BST2、MFGE8、TPBG、FMOD、XAGE1、RPSA、COTL1、CALR3、PA2G4、EZH2、FMNL1、HPSE、APC、UBE2A、BCAP31、TOP2A、TOP2B、ITGB8、RPA1、ABI2、CCNI、CDC2、SEPT2、STAT1、LRP1、ADAM17、JUP、DDR1、ITPR2、HMOX1、TPM4、BAAT、DNAJC8、TAPBP、LGALS3BP、PAGE4、PAK2、CDKN1A、PTHLH、SOX2、SOX11、TRPM8、TYMS、ATIC、PGK1、SOX4、TOR3A、TRGC2、BTBD2、SLBP、EGFR、IER3、TTK、LY6K、IGF2BP3、GPC3、SLC35A4、HSMD、H3F3A、ALDH1A1、MFI2、MMP14、SDCBP、PARP12、MET、CCNB1、PAX3−FKHR、PAX3、FOXO1、XBP1、SYND1、ETV5、HSPA1A、HMHA1、TRIM68、およびそれらのあらゆる組み合わせが挙げられる。いくつかの形態において、抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合フラグメント(例えば、FabまたはscFv)である。このようなCARの細胞内ドメインは、T細胞受容体および共刺激分子由来の細胞質内のシグナル伝達ドメインを含有する。
いくつかの実施態様において、ベクターは、プラスミド、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。
いくつかの実施態様において、本開示は、shRNA配列をコードする単離された核酸分子を提供する。別の実施態様において、本開示は、CARをコードする単離された核酸分子を提供する。さらに別の実施態様において、本開示は、CARおよびshRNA配列をコードする単離された核酸分子を提供する。いくつかの形態において、shRNA配列をコードする単離された核酸は、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、またはInpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7またはPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる。別の形態において、単離された核酸は、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含むshRNAをコードする。
いくつかの実施態様において、単離された核酸は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含むCARをコードする。いくつかの実施態様において、抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合フラグメント(例えば、FabまたはscFv)である。いくつかの実施態様において、抗原結合ドメインは、T細胞受容体および共刺激分子由来の細胞質内のシグナル伝達ドメインである。
いくつかの実施態様において、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原(例えば、固形腫瘍、リンパ系の腫瘍、黒色腫、癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病、腎臓がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、結腸がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、脳がん、頭頸部がん、皮膚がん、子宮がん、精巣がん、神経膠腫、食道がん、および肝臓がんに関連する腫瘍抗原)と結合する。
いくつかの実施態様において、本開示は、shRNA配列をコードする単離された核酸
、CARをコードする単離された核酸、またはCARおよびshRNA配列をコードする単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの形態において、ベクターは、プラスミド、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターである。shRNAは、RNAポリメラーゼIIプロモーターまたはRNAポリメラーゼIIIプロモーターに作動可能なように連結できる。
さらに他の実施態様において、本発明は、本発明に係る免疫応答性細胞、および医薬的に許容されるキャリアーを含む組成物を提供する。
いくつかの実施態様において、本開示は、CARをコードする第一のベクターおよびshRNA配列をコードする第二のベクターでトランスフェクトされた免疫応答性細胞を提供する。いくつかの形態において、shRNA配列は、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Map3k3、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7またはPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる。別の形態において、shRNAは、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの形態において、免疫応答性細胞は、腫瘍特異的なT細胞受容体をコードするベクターをさらに含む。いくつかの形態において、免疫応答性細胞は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞からなる群より選択される。
いくつかの実施態様において、本開示は、対象におけるがんの治療方法であって、該方法は、腫瘍特異的なT細胞受容体またはCARおよびshRNAを発現するように改変された自己T細胞を対象に投与することを含み、shRNA配列は、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Map3k3、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7またはPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、上記方法を提供する。いくつかの形態において、shRNA配列は、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含み;CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む。いくつかの形態において、CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む。
いくつかの実施態様において、本開示は、対象におけるがんの治療方法であって、本発明の腫瘍特異的なT細胞受容体またはCARおよびshRNAを発現するように改変された自己T細胞を対象に投与することを含む、上記方法を提供する。さらに別の実施態様において、本開示は、T細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることによる、それを必要とする対象におけるがんの治療方法であって、該方法は、ベクターを含む免疫応答性細胞を対象に投与することを含み、ベクターは、本発明の腫瘍特異的なT細胞受容体またはCARおよびshRNA配列をコードする、上記治療方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本開示は、免疫応答性T細胞の機能を阻害する遺伝子の同定方法であって、shRNAを発現するベクターを内包する免疫応答性T細胞の集団を用意すること、免疫応答性T細胞の集団を免疫抑制性の腫瘍と接触させること、免疫抑制性の腫瘍内でshRNAがT細胞の機能を回復させるかどうかを決定すること、および腫瘍内でT細胞の機能を回復させるshRNAに関連する遺伝子を、腫瘍浸潤T細胞の機能を阻害する遺伝子と同定することを含む、上記同定方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本開示は、それを必要とする対象において免疫反応を増加させるための方法であって、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7およびPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の活性をモジュレートする治療剤を投与することを含む、上記方法を提供する。
いくつかのケースにおいて、shRNAをコードする配列は、配列番号604〜620または配列番号653〜677のいずれかに相補的な15〜25(15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25)ヌクレオチドを含む第一の配列および1つのミスマッチを含むかまたはミスマッチを含まない(すなわち第一の配列に完全に相補的な)第一の配列の逆の相補物である第二の配列、ならびに第一の配列と第二の配列との間に位置する5〜9ヌクレオチドの第三の配列を含む。
特に他の定義がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法および材料が本明細書で説明されるが、当業界において公知の他の好適な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は単なる例示にすぎず、限定することを意図しない。本明細書で述べられた全ての公報、特許出願、特許、配列、データベースの登録、および他の参考文献は、参照によりそれら全体が開示に組み入れられる。矛盾がある場合は、定義を含め本明細書を優先させる。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、さらに特許請求の範囲から明らかであると予想される。
図面の説明
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも1枚の図面を含有する。カラーの図面を含むこの特許または公開特許公報のコピーは、要請と必要料金の支払いに応じて庁により提供される。
図1は、インビボで腫瘍微小環境内におけるT細胞の浸潤および蓄積を強化するshRNAを発見するための例示的なアプローチを示す概略図である。 図2は、shRNAベクターで感染させた後のRag1−/−/OT−ITCRトランスジェニックマウスからのCD8T細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示す一連のグラフである。レンチウイルスベクターによってコードされたThy1.1レポーターの発現に基づいて、形質導入効率を決定した。次いで、LacZ対照shRNAを発現するサイトカイン培養T細胞を、活性化マーカーのパネルで染色した(黒線;アイソタイプ対照、影付き)。感染したT細胞の大部分が、セントラルメモリー表現型を示した(CD62LCD44)。 図3は、ディープシーケンシング分析のために腫瘍および二次リンパ器官からソートしたOT−IT細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示す一連のグラフである(dLN、腫瘍流入領域リンパ節;irLN、無関係のリンパ節)。CD8Vα2Vβ5Thy1.1細胞をソートし、shRNAカセットをPCRで増幅するためにゲノムDNAを抽出した。 図4は、インビボにおけるshRNAプールのスクリーニングにより得られたディープシーケンシングデータを示す一連のグラフである。上の列、プール中の、腫瘍、無関係(irLN)および流入領域リンパ節(dLN)中の全ての遺伝子に関する配列の読み取り;下の列、腫瘍、無関係のリンパ節(irLN)および腫瘍流入領域リンパ節(dLN)における3つの個々の遺伝子(LacZ、陰性対照)が、脾臓と比較してプロットされる。配列の読み取りは、これらの組織と脾臓とを対比してプロットされる。点線は、log2での対角線からの偏差を示す。 図5は、T細胞の機能不全のスクリーニングにより得られたディープシーケンシングデータを示す一連のグラフである。腫瘍(赤色)、無関係のリンパ節(irLN、青色)および腫瘍流入領域リンパ節(dLN、緑色)における、二次スクリーニングで陽性の遺伝子のshRNA配列決定の読み取り値が、脾臓と比較してプロットされ、点線は、log2での対角線からの偏差を示す。データから、脾臓またはリンパ節と比較して、腫瘍でこれらの遺伝子を表す特定のshRNAが濃縮されていることを示す。 図6は、脾臓と比較した腫瘍におけるOT−ICD8T細胞の濃縮のフローサイトメトリーベースの定量化を示すグラフである。shRNAを発現するOT−IT細胞のパーセンテージを、CD8Vα2Vβ5T細胞中のレポータータンパク質でのゲーティングによる腫瘍/脾臓でのフローサイトメトリーによって決定した。LacZのshRNAに対する統計的有意性を、試験用shRNAごとに決定した(腫瘍/脾臓の濃縮倍率(fold enrichment))(n=3;p<0.05、**p<0.01、スチューデントのt検定)。 図7は、shRNAベクター(LacZ、Akap8I、Smad2、Rbks、Dgkz)で形質導入された腫瘍における細胞の濃縮の代表的なフローサイトメトリープロットを示す一連のグラフである。shRNAを発現するOT−IT細胞のパーセンテージを、CD8Vα2Vβ5T細胞中のレポータータンパク質でのゲーティングによる腫瘍/脾臓でのフローサイトメトリーによって決定した。 図8は、腫瘍におけるCD8+T細胞の濃縮のフローサイトメトリーベースの定量化を示す一連のグラフである。腫瘍および脾臓において、Thy1.1レポーターを使用して、shRNAを発現するT細胞を同定した(Thy1.1+CD8T細胞の%、上および下のパネル)。2×10個のshRNAを発現する細胞の移入から7日後に、腫瘍および脾臓において、LacZまたはPpp2r2dのshRNAを発現するT細胞の総数を決定した(右のパネル)。腫瘍におけるPpp2r2d対LacZのshRNAを発現するT細胞の濃縮倍率を示す。 図8は、腫瘍におけるCD4+T細胞の濃縮のフローサイトメトリーベースの定量化を示す一連のグラフである。腫瘍および脾臓において、Thy1.1レポーターを使用して、shRNAを発現するT細胞を同定した(Thy1.1+CD4+T細胞の%、上および下のパネル)。2×10個のshRNAを発現する細胞の移入から7日後に、腫瘍および脾臓において、LacZまたはPpp2r2dのshRNAを発現するT細胞の総数を決定した(右のパネル)。腫瘍におけるPpp2r2d対LacZのshRNAを発現するT細胞の濃縮倍率を示す。 図9は、shRNA結合部位が変異しているがタンパク質配列が保存されているPpp2r2dのcDNAによる、腫瘍におけるPpp2r2dのshRNAが介在するT細胞拡大の逆転を示すグラフである。共発現されたレポーターに基づき3つの細胞集団を同定し、濃縮倍率を、腫瘍対脾臓におけるレポーター陽性の細胞のパーセンテージに基づき計算した。 図10aは、タンパク質配列は保存されているがshRNA結合部位が破壊された変異Ppp2r2dのcDNAの生成を説明する。EL4細胞に、GFPも含有するベクターにおける変異または野生型Ppp2r2dのcDNAを形質導入した。GFP陽性細胞をソートして純化し、Thy1.1レポーターを発現するLacZまたはPpp2r2dのshRNAベクターで形質導入した。shRNAが形質導入された(Thy1.1)細胞を、フローサイトメトリーによってGFP発現に関して分析した。変異Ppp2r2dではなく野生型Ppp2r2dが発現された場合、Ppp2r2dのshRNAは、GFPレベルを低減させた。 図10bは、Ppp2r2d変異cDNAの発現は、Ppp2r2dのshRNAにより誘導された表現型を予防することを実証する。OT−IT細胞を、LacZのshRNA、Ppp2r2dのshRNAまたはPpp2r2dのshRNAと、変異Ppp2r2dのcDNAとをコードするベクターで形質導入した。異なる細胞集団を形質導入効率に関して正規化して、B16−Ova腫瘍を有するマウスに共に注射した。腫瘍および脾臓における各T細胞集団のパーセンテージを、CD8Vα2Vβ5T細胞でのゲーティングによって定量し、形質導入された細胞を、Thy1.1またはアメトリン/GFP蛍光レポーターの発現に基づき検出した(2回の独立した実験からの代表的なデータ、実験1回当たりn=3匹のマウス)。 図10cは、LacZのshRNA、Ppp2r2dのshRNA、およびPpp2r2dのshRNAと、Ppp2r2d変異cDNAとで形質導入されたOT−IT細胞におけるPpp2r2d発現に関するリアルタイムPCR分析を示すグラフである。データは生物学的試験の反復(n=3)の代表値であり、各値は平均±標準偏差を表す。 図11は、LacZのshRNAまたはスクリーニングで同定された3つのPpp2r2dのshRNAのうち1つで形質導入されたOT−IT細胞におけるPpp2r2dのmRNAレベルに関するリアルタイムqPCR分析を示すグラフである。 図12aは、二次スクリーニングからのディープシーケンシング結果に基づき計算した、特定のshRNAの濃縮を腫瘍対脾臓で示す表である。 図12bは、LacZ対照shRNAもしくは5つの試験用shRNAsのうち1つを発現するT細胞または腫瘍によって有意に調節されることが見出されたmRNAの平均発現レベルのクラスター化を示す。発現の有意差は、LacZ対照shRNAまたは5つの試験用shRNA(Alk、Arhgap5、Egr2、Ptpn2またはPpp2r2d)のうち1つを発現するT細胞間におけるAnovaのp値<0.01と定義された(JMP−ゲノミクス6.0、SASインスティテュート社(SAS Institute Inc.))。クラスター化後に、1つまたはそれより多くの治療群において有意に調節されたmRNAが示される(ファストワード)。 図12cは、5つの試験用shRNA(上述したようにAnovaでp<0.01と定義されたシグネチャー)のうち1つで形質導入された腫瘍浸潤T細胞による発現シグネチャー間のオーバーラップを示すベン図である。オーバーラップする楕円で示されるように、5つのシグネチャーのあらゆる組み合わせで多数のオーバーラップするプローブ番号が示される。添付の表に、無作為抽出により予測されるものに対するオーバーラップの有意性(フィッシャーの正確検定)を示す。 図13aは、1日目の腫瘍におけるPpp2r2dまたはLacZのshRNAが形質導入されたCD8T細胞の頻度を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す一連のグラフである。 図13bは、1、3、5、および7日目における、腫瘍中のLacZのshRNAが形質導入されたT細胞と比較した、Ppp2r2dのshRNAが形質導入されたCD8T細胞による増殖の程度(CFSE希釈に基づく)を示すグラフの対である。 図13cは、Ppp2r2dのサイレンシングが、腫瘍細胞と遭遇するときのT細胞のアポトーシスを阻害することを示す一連のグラフである。CFSE標識OT−IT細胞を、B16−Ova腫瘍細胞と72時間共培養した。細胞をCD8およびアネキシンVで染色した。 図13dは、抗アポトーシスタンパク質に関する細胞内染色を示す一連のグラフである。LacZまたはPpp2r2dのshRNAを発現するOT−IT細胞を、B16−Ova腫瘍細胞と48時間共培養し、次いでアイソタイプ対照(灰色)およびホスホ−AKT(Ser473)、ホスホ−Bad(Ser112)またはBcl−2抗体で染色した。 図13eは、Ppp2r2dがサイレンシングされたT細胞によるIFN−γ分泌の増加を示すグラフである。B16−Ova腫瘍を有するマウスから単離したOT−IT細胞を、細胞内染色によってIFN−γ発現に関してアッセイした。 図13fは、Ppp2r2dがサイレンシングされたT細胞は、専門の抗原提示細胞による腫瘍抗原の提示がなかったとしても腫瘍で拡大することを示す一連のグラフである。LacZまたはPpp2r2dのshRNAを発現するOT−IT細胞を、14日目のB16−Ova腫瘍を有するC57BL/6またはb2m−/−マウスに移入させた。shRNAを発現するT細胞を、ティール蛍光タンパク質(TFP:teal fluorescent protein)またはThy1.1の発現に基づき同定した(脾臓と比較した腫瘍における濃縮倍率)。 図13gは、Ppp2r2dのサイレンシングが、腫瘍細胞と遭遇するときのT細胞のアポトーシスを阻害することを示すグラフである。CFSE標識OT−IT細胞を、B16−Ova腫瘍細胞と72時間共培養した(活性化されたカスパーゼ−3)。 図14は、CFSEで標識され、CD3抗体で72時間刺激されたLacZまたはPpp2r2dのshRNAを発現するOT−IT細胞を示す一連のグラフである。次いで細胞をCD8およびアネキシンVで染色し、フローサイトメトリーで分析した。 図15は、腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節ではPpp2r2dのshRNAを発現するT細胞が蓄積したが、二次リンパ器官では蓄積しないことを示す一連のグラフである。Ppp2r2dまたはLacZのshRNAを発現するOT−IT細胞をCFSEで標識し、B16−Ova腫瘍を有するマウスに注射した。1、3、5および7日目にT細胞を表示された臓器から単離して、CSFE色素の希釈に基づきT細胞の蓄積の程度を試験した。 図16aは、Ppp2r2dのサイレンシングは、CD4およびCD8T細胞の抗腫瘍活性を強化することを示す一連のグラフである。T細胞を抗CD3/CD28ビーズで活性化し、LacZまたはPpp2r2dのshRNA発現を駆動するレンチウイルスで感染させて、B16−Ova腫瘍を有するマウスに注射した。T細胞移入後、3日毎に、2本の最長の軸にカリパスを使用して腫瘍のサイズを測定した。12日目のB16−Ova腫瘍を有するマウスに、CD4TRP−1および/またはCD8OT−IT細胞(2×10個)を移入させた(12および17日目)。腫瘍負荷量を査定した。 図16bは、Ppp2r2dのサイレンシングは、CD4およびCD8T細胞の抗腫瘍活性を強化することを示す一連のグラフである。T細胞を抗CD3/CD28ビーズで活性化し、LacZまたはPpp2r2dのshRNA発現を駆動するレンチウイルスで感染させて、B16−Ova腫瘍を有するマウスに注射した。T細胞移入後、3日毎に、2本の最長の軸にカリパスを使用して腫瘍のサイズを測定した。12日目のB16−Ova腫瘍を有するマウスに、CD4TRP−1および/またはCD8OT−IT細胞(2×10個)を移入させた(12および17日目)。生存率を査定した。 図16cは、Ppp2r2dのサイレンシングは、CD4およびCD8T細胞の抗腫瘍活性を強化することを示す一連のグラフである。T細胞を抗CD3/CD28ビーズで活性化し、LacZまたはPpp2r2dのshRNA発現を駆動するレンチウイルスで感染させて、B16腫瘍を有するマウスに注射した。T細胞移入後、3日毎に、2本の最長の軸にカリパスを使用して腫瘍のサイズを測定した。c:10日目のB16腫瘍を有するマウスに、CD4TRP−1およびCD8pmel−1T細胞(3×10個のCD4TRP−1プラス3×10個のCD8pmel−1)を移入させた(10および15日目)。グラフパッド・プリズム(GraphPad Prism)バージョン6を使用して、LacZ対Ppp2r2dのshRNAを発現するT細胞で治療したマウスの生存を比較することにより、ログランク(マンテル−コックス)検定を行った。 図17は、Ppp2r2dまたはCblbshRNAのパネルを発現する細胞に関する脾臓と比較した腫瘍におけるT細胞濃縮のFACS分析を示す一連のグラフである(上のパネル)。T細胞移入の前に、Ppp2r2dおよびCblbのmRNAレベルをqPCRによって測定した(下のパネル)。データは生物学的試験の反復(n=3)の代表値であり、各値は平均±標準偏差を表す。 図18は、標識された合成ペプチドを用いたマススペクトロメトリー(AQUA、内因性ペプチドとAQUAペプチドとの比率)によりPpp2r2dタンパク質定量化を示す一連のグラフである。2回の独立した実験からの代表的なデータ(a〜d);スチューデントの両面t検定、p<0.05、**p<0.01;平均±標準偏差。 図19は、腫瘍浸潤OT−IT細胞(7日目)におけるPpp2r2dのmRNAに関するqPCR分析を示すグラフである。 図20aは、腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節におけるPpp2r2dのshRNAを発現するT細胞の増殖を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示すグラフである。Ppp2r2dまたはLacZのshRNAを発現するOTI T細胞をCFSEで標識して、B16−Ova腫瘍を有するマウスに注射した。1、3、5および7日目にT細胞を表示された臓器から単離して、T細胞増殖の程度をCFSE希釈に基づき試験した。CFSEを希釈しなかったT細胞(非分裂細胞)を定量した(右)。 図20bは、腫瘍浸潤T細胞の生存率を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示すグラフである。Pp2r2dまたはLacZのshRNAを発現するOT−IT細胞を、B16−Ova腫瘍を有するマウスに注射した。7日目にT細胞を単離して、アポトーシスを、活性化されたカスパーゼ−3に特異的な抗体を用いた細胞内染色によって査定した(一部のT細胞死は、腫瘍からの単離手法によって引き起こされた可能性がある)。 図20cは、B16−Ova腫瘍から回収されたLacZおよびPpp2r2dのshRNAを発現するT細胞によるIFNγに関する細胞内サイトカイン染色を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示すグラフである;T細胞を、注射前にCFSEで標識した。全ての実験のデータは、2回の独立した試行を代表するものである。統計的分析を生物学的試験の反復(n=3)で行った;p<0.05、**p<0.01、スチューデントの両側t検定。各値は平均±標準偏差を表す。 図21aは、ナノウェルデバイス(ピコリットル体積の84,672ウェル)を使用した単一細胞レベルでのエクスビボの腫瘍浸潤OT−IT細胞によるサイトカイン産生分析を示す一連のグラフである。ナノウェル中の代表的な単一細胞および対応するサイトカイン分泌パターンである。 図21bは、ナノウェルデバイス(ピコリットル体積の84,672ウェル)を使用した単一細胞レベルでのエクスビボの腫瘍浸潤OT−IT細胞によるサイトカイン産生分析を示す一連のグラフである。表示されたサイトカインを分泌するT細胞のパーセンテージである。 図21cは、ナノウェルデバイス(ピコリットル体積の84,672ウェル)を使用した単一細胞レベルでのエクスビボの腫瘍浸潤OT−IT細胞によるサイトカイン産生分析を示す一連のグラフである。標準曲線から計算したサイトカイン分泌速度である(平均±標準偏差、マン‐ホイットニー検定、p<0.05)。 図22aは、養子導入されたOT−I細胞の大部分が、リンパ節ではメモリー表現型を有するが、腫瘍ではエフェクター表現型を有することを示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す一連のグラフである。サイトカインで前治療した、Ppp2r2dまたはLacZのshRNAを発現する細胞を、14日目のB16−Ova腫瘍を有するマウスに注射した。移入から7日目に、T細胞を表示された臓器から回収して、CD62LおよびCD44抗体で染色した。CD8/Thy1.1二重陽性細胞でのゲーティングによって、shRNAを発現するOT−I細胞のFACS分析を行った。 図22bは、疲弊マーカー(exhaustion marker)の分析を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す一連のグラフである。OT−I細胞を、マウスの流入領域リンパ節および腫瘍から回収して、TIM−3、LAG−3、PD−1およびCD25に特異的な抗体で染色した。全ての実験に関して(n=3の生物学的試験の反復;p<0.05、**p<0.01、スチューデントの両側t検定);各値は平均±標準偏差を表す。 同上。 図23aは、腫瘍流入領域リンパ節および腫瘍中のOT−IT細胞によるグランザイムBの細胞内染色を示す一連のグラフである。 図23bは、shRNAを発現するT細胞の腫瘍への浸潤を示す画像とグラフの対である。OT−IT細胞を、GFPレポーターをコードするLacZまたはPpp2r2dのshRNAベクターで形質導入して、B16−Ova腫瘍を有するマウスに注射した。7日間後、腫瘍を切り出し、凍結切片を抗GFPおよびDAPIで染色して、腫瘍中のshRNA発現OT−IT細胞の数を数えた。 図23cは、組織切片に行われたタネル(TUNEL)免疫組織化学を示す画像およびグラフの対であり、アポトーシス細胞が定量された。 図23dは、腫瘍細胞によるMHCクラスI発現を示す一連のグラフである。腫瘍をコラゲナーゼで消化して、CD45.2およびH−2Kb抗体で染色した。H−2Kb発現のFACS分析を、CD45.2陰性黒色腫細胞でのゲーティングによって行った。データは生物学的試験の反復(n=3)の代表値であり、各値は平均±標準偏差を表す。
本発明の開示は、腫瘍浸潤性T細胞の機能をブロックする遺伝子を同定することを目的とした、プールされた小ヘアピンRNA(shRNA)をスクリーニングするアプローチを使用することにより、免疫抑制性の腫瘍内におけるT細胞機能の喪失を引き起こす調節メカニズムを、インビボで系統的に見出すことができるという観察に部分的に基づく。上記の背景の章で説明したように、腫瘍関連の免疫抑制メカニズムは、腫瘍微小環境中でのT細胞の活性を活発にブロックする。本明細書で説明される方法は、複数の阻害シグナルがあるにもかかわらず、腫瘍中で安定したT細胞の浸潤および蓄積を可能にするshRNAを同定する。後述するように、本方法は、腫瘍による免疫抑制に関与する遺伝子の発現をサイレンシングして、腫瘍における強化されたT細胞の浸潤および蓄積およびアポトーシス耐性をもたらすshRNAを同定する。
いくつかの場合において、本開示は、腫瘍微小環境内におけるT細胞機能の喪失を引き起こす調節メカニズムを具体的に同定するための方法を提供する。これらの方法は、shRNAを発現するベクターを内包するT細胞の集団を用意すること;T細胞の集団を免疫抑制性の腫瘍と接触させること;免疫抑制性の腫瘍内でshRNAがT細胞の機能を回復させる(例えば、腫瘍微小環境内で浸潤および増殖するT細胞の能力を回復させる)かどうかを決定すること;腫瘍内でT細胞の機能を回復させるshRNAに関連する遺伝子を、腫瘍微小環境内でT細胞の機能を阻害する遺伝子と同定することを包含し得る。
本開示は、腫瘍の免疫抑制作用を低減させるための標的遺伝子を提供する。標的遺伝子の発現は、免疫細胞、例えば腫瘍関連抗原を認識するT細胞において低減させることができ、標的遺伝子の発現の低減は、腫瘍関連の免疫抑制メカニズムを逃れる細胞の能力を高めることができる。
本開示は、腫瘍浸潤性T細胞の機能を損なう遺伝子の発現を低減する(例えば、サイレンシングする、除去する、ノックダウンする、ノックアウトする、または減少させる)shRNAを提供する。これらのshRNAは、shRNAで形質導入されたT細胞の腫瘍への移入、それに続く腫瘍およびリンパ系器官における全てのshRNAの提示を定量するためのディープシーケンシングにより同定された。本明細書で開示された代表的なshRNAとしては、例えば、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7およびPpp3ccなどの遺伝子の活性を低減するshRNAが挙げられる。
いくつかの場合において、本開示は、腫瘍浸潤性T細胞の機能をブロックする遺伝子の発現をサイレンシングするshRNAに関する治療用組成物(例えば、単離された核酸分子、shRNAをコードする核酸分子を発現するベクターを包含する)を提供する。他の形態において、本開示は、本明細書で説明されるshRNAを発現することができるベクターを内包する改変免疫応答性細胞(例えば、T細胞、例えばナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、および制御性T細胞など)を提供する。別の形態において、改変免疫応答性細胞は、腫瘍特異的な抗原を標的とする抗原結合ドメインを有するCARを発現することができるベクターをさらに内包する。
RNA干渉
生物医学的調査における最も重要な近年の発見の1つはRNA干渉(RNAi)経路であり、この経路は、多くの遺伝子の活性を調節するための細胞によって使用される。RNAiの原理は、治療標的同定に関する多くの新しい可能性を開いてきた。RNA干渉(RNAi)は、ゲノム−スケール、遺伝子機能のハイスループット分析にとって有効なツールである。用語「RNA干渉」(RNAi)、またはいわゆる転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)は、RNA分子が遺伝子発現を阻害する生物学的プロセスを指す。「RNA干渉剤」は、本明細書で使用される場合、RNA干渉(RNAi)によって、標的遺伝子、例えば本発明の標的遺伝子の発現に干渉するかまたはそれを阻害するあらゆる薬剤と定義される。このようなRNA干渉剤としては、これらに限定されないが、標的遺伝子、例えば本発明の標的遺伝子に相同なRNA分子を包含する核酸分子、またはそれらのフラグメント、短鎖干渉RNA(siRNA)、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)、およびRNA干渉(RNAi)により標的遺伝子の発現に干渉するかまたはそれを阻害する小分子が挙げられる。
「RNA干渉(RNAi)」は、標的遺伝子と同一であるかまたは高度に類似した配列のRNAを発現または導入させることにより、その標的化された遺伝子から転写されたメッセンジャーRNA(mRNA)の配列特異的な分解またはPTGSが起こり、それによって標的遺伝子の発現が阻害されるプロセスである。このプロセスは、植物、無脊椎動物、および哺乳動物細胞で説明されている。またRNAiは、核酸分子、例えば合成siRNAまたはRNA干渉剤を導入して、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングすることによっても開始される。「標的遺伝子発現の阻害」または「マーカー遺伝子発現の阻害」は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子(例えば、本発明のマーカー遺伝子)もしくは標的遺伝子によってコードされたタンパク質、例えば本発明のマーカータンパク質の、発現またはタンパク質活性もしくはレベルにおけるあらゆる減少を包含する。このような減少は、標的遺伝子の発現、またはRNA干渉剤によって標的化されていない標的遺伝子によってコードされたタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも30
%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくは99%またはそれより高い減少であってもよい。
「短鎖干渉RNA」(siRNA)は、本明細書では「短鎖干渉」とも記載されており、標的遺伝子の発現を阻害するように機能する薬剤と定義される。これらは、RNAiを誘導し、RNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)による転写後の遺伝子サイレンシングを起こすためのエフェクター分子である。化学合成可能なsiRNAに加えて、転写後遺伝子サイレンシングのための可能性のあるエフェクター分子の形態の様々な他の系が利用可能であり、このような系としては、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)、長鎖dsRNA、短鎖一過性RNA、およびマイクロRNA(miRNA)が挙げられる。これらのエフェクター分子はいずれも、例えばshRNAのケースのようにsiRNAにプロセシングされるか、またはmiRNAのケースの場合のように直接的に遺伝子サイレンシングを助ける。したがって本発明は、RNAiにより転写後遺伝子サイレンシングを達成するための、shRNA、加えてRNAの他のあらゆる好適な形態の使用を包含する。shRNAの使用は、標的遺伝子の抑制が典型的には長期かつ安定的であるという点で、化学合成されたsiRNAの使用を超える利点を有する。siRNAは、化学合成されてもよいし、インビトロでの転写によって生産されてもよいし、または宿主細胞内で発現されたshRNAから生産されてもよい。
一実施態様において、siRNAは、小ヘアピン(または、いわゆるステムループ)RNA(shRNA)である。これらのshRNAは、短い(例えば、19〜25ヌクレオチドの)アンチセンス鎖、それに続いて5〜9ヌクレオチドのループ、および相補的センス鎖で構成される。その代わりに、ヌクレオチドループ構造の前にセンス鎖が存在し、その後にアンチセンス鎖が続いてもよい。これらのshRNAは、プラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルスに含有されていてもよい。
RNA干渉により誘導された「遺伝子サイレンシング」は、本明細書で使用される場合、細胞における標的遺伝子のmRNAレベルが、RNA干渉が導入されていない細胞で見出されるmRNAレベルの、少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%減少していることを指す。好ましい一実施態様において、mRNAレベルは、少なくとも約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%減少している。
用語「低減した」または「低減する」は、本明細書で使用される場合、一般的に、参照レベルと比較して少なくとも10%の減少、例えば、少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%の減少、またはその値を含め最大100%の減少、または参照レベルと比較して10〜100%の間のあらゆる整数値の減少を意味する。
用語「増加した」または「増加する」は、本明細書で使用される場合、一般的に、参照レベルと比較して少なくとも10%の増加、例えば、少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%の増加、またはその値を含め最大100%の増加、または参照レベルと比較して10〜100%の間のあらゆる整数値の増加、または約2倍、または約3倍、または約4倍、または約5倍または約10倍の増加、または参照レベルと比較して2倍から10倍の間のあらゆる増加、またはそれより多くを意味する。
免疫応答性細胞
いくつかの実施態様において、本開示は、抗原を認識する受容体の少なくとも1種を発現する、T細胞、細胞傷害性T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、調節性(CD4)T細胞、およびナチュラルキラー(NKT)細胞などの免疫応答性細胞を提供する。いずれかの形態において、免疫応答性細胞は、少なくとも1種の腫瘍特異的な抗原を認識する受容体を発現する。いくつかの形態において、腫瘍細胞抗原特異的なT細胞、NKT細胞、TIL、CTL細胞または他の免疫応答性細胞が使用される。免疫応答性細胞の非限定的な例としては、T細胞、例えば、αβ−TCR+T細胞(例えば、CD8+T細胞またはCD4+T細胞)、γδ−TCR+T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞などが挙げられる。
核酸組成物
いくつかの実施態様において、本開示は、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な少なくとも12、15、20または25個の連続したヌクレオチド配列を含むshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。またshRNAは、2つの配列が細胞内でプロセシングされて、配列番号604〜620および653〜677のうち1つによってコードされたタンパク質の発現を阻害するsiRNAを提供することができるステムループshRNAが形成されるような、2つの配列間に位置する連続したヌクレオチド配列および短い配列の逆の相補物、ならびにそれらの組成物も包含する。
表1に、本発明においてT細胞の腫瘍免疫抑制に関与すると同定された遺伝子の一覧を示す。
〔表1〕
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いくつかの形態において、本組成物の核酸は、表2に提供される配列を標的とするshRNA配列をコードする。表2はさらに、ディープシーケンシング分析に基づき選択されたshRNAの腫瘍対脾臓における濃縮(「濃縮倍率」)を示す。
〔表2〕
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脾臓と比較して腫瘍において少なくとも3種以上のshRNAの濃縮倍率を示すshRNAは、より活性な標的配列領域を示す。
いくつかの形態において、本組成物の核酸は、表2aに提供されるヒトPpp2r2dおよびCblb配列を標的とするshRNA配列をコードする。
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他の実施態様において、本開示は、配列番号372、373、374、375、376、377、378、378、379、380、381、382、383、384、385、または386に記載の少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一な、Ppp2r2d標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号372、373、374、375、376、377、378、378、379、380、381、382、383、384、385、または386に記載の、マウス標的配列に対応するヒトPp2r2d配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146または147に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なEif2ak3標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146または147に記載の、マウス標的配列に対応するヒトEif2ak3配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、または42に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なArhgap5標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、または42に記載の、マウス標的配列に対応するヒトArhgap5配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、または490に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なSmad2標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、または490に記載の、マウス標的配列に対応するヒトSmad2配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なAkap8l標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15に記載の、マウス標的配列に対応するヒトAkap8l配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、または445に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なRbks標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、または445に記載の、マウス標的配列に対応するヒトRbks配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、または132に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なEgr2標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、または132に記載の、マウス標的配列に対応するヒトEgr2配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116または117に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、ま
たは少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なDgka標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116または117に記載の、マウス標的配列に対応するヒトDgka配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、または72に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なCblb標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、または72に記載の、マウス標的配列に対応するヒトCblb配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、または299に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なMdfic標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、または299に記載の、マウス標的配列に対応するヒトMdfic配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、または162に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なEntpd1標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、または162に記載の、マウス標的配列に対応するヒトEntpd1配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、または587に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なVamp7標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、または587に
記載の、マウス標的配列に対応するヒトVamp7配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、または222に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なHipk1標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、または222に記載の、マウス標的配列に対応するヒトHipk1配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、または329に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なNuak2標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、または329に記載の、マウス標的配列に対応するヒトNuak2配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、または31に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なAlk標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、または31に記載の、マウス標的配列に対応するヒトAlk配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、または341に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なPdzk1ip1標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、または341に記載の、マウス標的配列に対応するヒトPdzk1ip1配列に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号52、53、54、55、56または57に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なBlvrb標的配列に相補的なshRNA配列をコード
する単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号52、53、54、55、56または57に記載の、マウス標的配列に対応するヒトBlvrbに相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号83、84、85、86または87に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なCdkn2a標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号83、84、85、86または87に記載の、マウス標的配列に対応するヒトCdkn2aに相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号175、176または177に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なF11r標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号175、176または177に記載の、マウス標的配列に対応するヒトF11rに相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号187、191または192に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なFyn標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号187、191または192に記載の、マウス標的配列に対応するヒトFynに相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号204、205、206または207に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なGrk6標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号204、205、206または207に記載の、マウス標的配列に対応するヒトGrk6に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号232、234、235、236または237に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なInpp5b標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号232、234、235、236または237に記載の、マウス標的配列に対応するヒトInpp5bに相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号248、249、250、251または252に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なImpk標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号248、249、250、251または252に記載の、マウス標的配列に対応するヒトImpkに相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号263、264、265、266、267、268または269に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なJun標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号263、264、265、266、267、268または269に記載の、マウス標的配列に対応するヒトJunに相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号281、282、283または284に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なMast2標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号281、282、283または284に記載の、マウス標的配列に対応するヒトMast2に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号311、312、313または314に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なNptxr標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号311、312、313または314に記載の、マウス標的配列に対応するヒトNptxrに相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号351、352、353、354、355または356に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なPkd1標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号351、352、353、354、355または356に記載の、マウス標的配列に対応するヒトPkd1に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号367、368、369、370または371に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なPpm1g標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号367、368、369、370または371に記載の、マウス標的配列に対応するヒトPpm1gに相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号399、400または401に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なPpp3cc標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号399、400または401に記載の、マウス標的配列に対応するヒトPpp3ccに相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号414、415または416に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なPrkab2標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号414、415または416に記載の、マウス標的配列に対応するヒトPrkab2に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号426、427、428、429または430に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なPtpn2標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号426、427、428、429または430に記載の、マウス標的配列に対応するヒトPtpn2に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号457、458、459または460に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なRock1標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号457、458、459または460に記載の、マウス標的配列に対応するヒトRock1に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号470、471、472、473、474または475に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なSbf1標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号470、471、472、473、474または475に記載の、マウス標的配列に対応するヒトSbf1に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号504、505、506、507、508、509または510に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なSocs1標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号504、505、506、507、508、509または510に記載の、マウス標的配列に対応するヒトSocs1に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号524、525、526、527または528に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なSocs3標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号524、525、526、527または528に記載の、マウス標的配列に対応するヒトSocs3に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号539、540、541、542または543に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なStk17b標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号539、540、541、542または543に記載の、マウス標的配列に対応するヒトStk17bに相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号556、557または558に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なTnk1標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号556、557または558に記載の、マウス標的配列に対応するヒトTnk1に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号569、570、571、572または573に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なTrpm7標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号569、570、571、572または573に記載の、マウス標的配列に対応するヒトTrpm7に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号600、601、602または603に記載の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドと同一なYes1標的配列に相補的なshRNA配列をコードする単離された核酸を提供する。
他の実施態様において、本開示は、配列番号600、601、602または603に記載の、マウス標的配列に対応するヒトYes1に相補的な配列を含むshRNAをコードする単離された核酸を提供する。
あらゆる実施態様において、マウス標的配列に対応するヒト配列は、ヒト遺伝子配列に完全に対応する配列であり、例えば、選択されたマウス標的配列の、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドが有し得るヌクレオチドミスマッチは、ゼロ、1、2、3または4個である。
単離された核酸は、例えばDNA分子であってもよく、ただし、天然に存在するゲノム中でそのDNA分子に隣接して通常見出される核酸配列の1つが、除去されているかまたは存在しない。したがって、単離された核酸としては、これらに限定されないが、他の配列から独立した、別の分子として存在するDNA分子(例えば、化学合成された核酸、cDNA、またはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生産されたゲノムDNAフラグメント)、加えて、ベクター、自律複製型プラスミド、ウイルス(例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはヘルペスウイルス)に取り込まれるDNA、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに取り込まれるDNAが挙げられる。加えて、単離された核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸の一部である組換えDNA分子などの加工された核酸を包含し得る。例えばcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリー、またはゲノムDNAの制限酵素消化物を含有するゲル切片中の数百から数百万の他の核酸のなかに存在する核酸は、単離された核酸とはみなされないものとする。
配列同一性パーセントの計算では、2つの配列を並べて、2つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一なマッチの数を決定する。同一なマッチの数を、並べられた領域の長さ(すなわち、並べられたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数)で割り、100を掛けて、配列同一性パーセント値を得る。並べられた領域の長さは、最大で最も短い配列の全長サイズの、一方または両方の配列の一部であり得ることが理解されるものと予想される。また、単一の配列は、1つより多くの他の配列と並べることができ、したがって、並べられた領域ごとに異なる配列同一性パーセント値を有する可能性があることも理解されるものと予想される。同一性値のパーセントは、通常、最も近い整数に概算されることに留意する。例えば、78.1%、78.2%、78.3%、および78.4%は、端数を切り下げて78%にされ、一方で78.5%、78.6%、78.7%、78.8%、および78.9%は、端数を切り上げて79%にされる。また、並べられた領域の長さは常に整数であることにも留意する。
用語「配列同一性パーセント」は、本明細書で使用される場合、いずれかの所与のクエリー配列と対象配列との間の同一性の程度を指す。あらゆるクエリー核酸またはアミノ酸配列、例えば転写因子の、別の対象核酸またはアミノ酸配列に対する同一性パーセントは、以下のように決定することができる。
また、用語「相補的ヌクレオチド配列」は、本明細書で使用される場合、「アンチセンス配列」としても知られており、タンパク質をコードする「センス」核酸の配列に完全に相補的な核酸の配列(例えば、二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的であるか、またはmRNA配列に相補的な)を指す。本明細書では、少なくとも約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチドもしくは全遺伝子コード鎖、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む核酸分子が提供される。
用語「ヌクレオチド配列に対応する」は、本明細書で使用される場合、同一な配列をコードする核酸のヌクレオチド配列を指す。いくつかの場合において、アンチセンスヌクレ
オチド(核酸)またはsiRNA(阻害的低分子RNA)が標的配列にハイブリダイズする場合、特定のアンチセンスまたは阻害的低分子RNA(siRNA)配列は、標的配列に実質的に相補的であり、したがってポリペプチドをコードするmRNAの部分に特異的に結合すると予想される。そのようなものとして、典型的には、そのような核酸の配列はmRNAの標的配列に高度に相補的であると予想され、配列全体が有し得るミスマッチの数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10塩基以下と予想される。多くの例において、核酸の配列にとって、正確なマッチであること、すなわちオリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列に完全に相補的であり、それゆえに相補的ストレッチにわたりミスマッチがゼロであることが望ましい場合がある。高度に相補的な配列は、典型的にはmRNAの標的配列領域に極めて特異的に結合し、それゆえに標的mRNA配列のポリペプチド産物への翻訳を低減させること、および/またはさらには阻害することにおいて高度に効率的であると予想される。
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、あらゆるウイルスまたは非ウイルスベクター、加えて二本鎖または一本鎖の直鎖状または環状の形態のあらゆるプラスミド、コスミド、ファージまたはバイナリーベクターを指し、これらは、自己感染性または可動性であってもよいし、またはそうでなくてもよく、さらに、細胞のゲノムに統合することによって原核または真核宿主細胞を形質転換させることもでき、または染色体外に存在していてもよい(例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド)。本発明の実施における使用のために、当業界において公知のあらゆるベクターが想定される。
ベクターは、ウイルスベクターであってもよいし、または非ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターが使用される場合、ウイルスベクターは複製欠損型であることが好ましく、このようなウイルスベクターは、例えば複製に関してコードする全てのウイルス核酸を除去することによって得ることができる。複製欠損型ウイルスベクターは、それでもなおその感染特性を保持すると予想され、複製アデノウイルスベクターと類似の方式で細胞に入るが、一度細胞に入ると、複製欠損型ウイルスベクターは複製したりまたは繁殖したりすることはない。またベクターは、リポソームおよびナノ粒子、ならびに細胞にDNA分子を送達する他の手段も包含する。
用語「ウイルスベクター」は、細胞への核酸コンストラクトのキャリアーとしての、ウイルス、またはウイルス関連ベクターの使用を指す。コンストラクトは、細胞への感染または形質導入のための、非複製欠損ウイルスゲノム、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、または単純疱疹ウイルス(HSV)またはレトロウイルスやレンチウイルスベクターなどのその他のものに統合およびパッケージ化されていてもよい。ベクターは、細胞のゲノムに取り込まれてもよいし、またはそうでなくてもよい。
「コード」は、規定のヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)または規定のアミノ酸配列およびのいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のテンプレートとしてとして役立つ、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列、例えば遺伝子、cDNA、またはmRNAの本来有する特性と、それにより生じる生物学的な特性を指す。したがって、遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が、細胞または他の生物系中でタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。コード鎖、すなわちそのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常配列リストに記載されているもの、および非コード鎖、すなわち遺伝子またはcDNAの転写用のテンプレートとして使用されるものはどちらも、タンパク質またはその遺伝子またはcDNAの他の産物をコードするということができる。
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および/または翻訳と定義される。
ベクターが作動可能(operatively)なように結合している遺伝子の発現を指令するこ
とができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。したがって、「発現ベクター」は、発現させようとするヌクレオチド配列に作動可能に結合した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む特殊化したベクターである。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞により供給される場合もあるし、またはインビトロでの発現系中で供給される場合もある。発現ベクターは、当業界において公知のあらゆるベクターを包含し、例えば、組換えポリヌクレオチドを取り込んだコスミド、プラスミド(例えば、裸の、またはリポソームに含有された)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)である。
いくつかの形態において、本開示は、本明細書で説明されるshRNAを発現することができるベクターを内包するように改変され、CARを発現するようにさらに改変された細胞を提供する。一形態において、shRNAおよびCARは、同じベクターで発現される。別の形態において、shRNAおよびCARは、別のベクターで発現される。
いくつかの実施態様において、本明細書で説明される改変細胞は、免疫応答性細胞である。いくつかの形態において、免疫応答性細胞は、抗原を認識する受容体の少なくとも1種を発現する。いずれかの形態において、免疫応答性細胞は、少なくとも1種の腫瘍特異的な抗原を認識する受容体を発現する。いくつかの形態において、腫瘍細胞抗原特異的なT細胞、NKT細胞、TIL、CTL細胞または他の免疫応答性細胞が使用される。免疫応答性細胞の非限定的な例としては、T細胞、例えばαβ−TCR+T細胞(例えば、CD8+T細胞またはCD4+T細胞)、γδ−TCR+T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞などが挙げられる。
本発明の免疫応答性細胞(例えば、T細胞、NKT細胞、TIL、CTL細胞、またはそれらの前駆細胞)を含む組成物は、がん治療のために、対象に全身供給されてもよいし、または直接供給されてもよい。一実施態様において、本発明の細胞は、目的の臓器(例えば、がんに罹った臓器)に直接注射される。その代わりに、遺伝子改変免疫応答性細胞を含む組成物は、例えば循環系(例えば、腫瘍の血管系)に投与することによって目的の臓器に間接的に供給される。インビトロまたはインビボでT細胞、NKT細胞、TIL、CTL細胞の産生を増加させるために、細胞への投与の前、その間またはその後に、拡大および分化のための薬剤が供給されてもよい。
改変免疫応答性細胞は、あらゆる生理学的に許容できるビヒクル中で、通常血管内に投与することができるが、これらはまた、細胞が再生および分化にとって適切な部位(例えば、胸腺)を発見することができる骨または他の好都合な部位に導入することもできる。通常、少なくとも1×10個の細胞が投与されると予想され、最終的には1×1010個またはそれより多くに達する。本発明の免疫応答性細胞は、精製した細胞集団を含んでいてもよい。当業者は、様々な周知の方法、例えば蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用して集団中の遺伝子改変免疫応答性細胞のパーセンテージを容易に決定することができる。遺伝子改変免疫応答性細胞を含む集団中の好ましい純度の範囲は、約50〜約55%、約55〜約60%、および約65〜約70%である。より好ましくは、純度は、約70〜約75%、約75〜約80%、約80〜約85%であり、さらにより好ましくは、純度は、約85〜約90%、約90〜約95%、および約95〜約100%である。投薬量は、当業者によって容易に調整することができる(例えば、純度が低い場合は、投薬量の増加を要する場合がある)。
細胞は、注射、カテーテル、または同種のものによって導入されてもよい。必要に応じて、これらに限定されないが、インターロイキン、例えばIL−2、IL−3、IL−6、およびIL−11、同様に他のインターロイキン、コロニー刺激因子、例えばG−、M−およびGM−CSF、インターフェロン、例えばガンマ−インターフェロンおよびエリスロポイエチンなどの要素が包含されていてもよい。
本発明の組成物は、本発明の免疫応答性細胞またはそれらの前駆細胞および医薬的に許容されるキャリアーを含む医薬組成物を包含する。投与は、自己であってもよいし、または異種であってもよい。例えば、免疫応答性細胞、または前駆細胞を1の対象から得て、同じ対象または異なる適合する対象に投与してもよい。
キメラ抗原受容体
いくつかの場合において、本発明は、腫瘍細胞抗原に向けられた抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。CARは、腫瘍細胞抗原を認識する細胞外部分を含有する人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである(例えば、抗体の抗原結合ドメイン(scFv)およびT細胞受容体由来の細胞質内のシグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメイン。(Kalos Mら、Sci Transl Med.2011年8月10日;3
(95))。Kalosらは、CD19を標的とするCART細胞の生成を説明しており、慢性
リンパ球性白血病患者において、CARがT細胞が介在する有力な抗腫瘍作用を改変したことを実証している。CARの特徴としては、T細胞の特異性および反応性をMHCに制限されない方式で選択された標的にリダイレクトして、モノクローナル抗体の抗原−結合特性を利用するそれらの能力が挙げられる。CAR改変T細胞は、インビボで複製する潜在力を有し、長期持続することから持続的な腫瘍制御を可能にし、繰り返しの抗体注入への必要性を回避する。(Kalos Mら、Sci Transl Med.2011年8月10日;3(95))。MH
Cに制限されない抗原認識は、CAR発現T細胞、抗原プロセシングとは独立した抗原認識能力をもたらし、したがって腫瘍回避の主要なメカニズムを迂回する。その上、有利なことに、CARは、T細胞中で発現されると、内因性T細胞受容体(TCR)のアルファおよびベータ鎖と二量体化しない。CAR改変T細胞は、WO2012/079000およびWO2012/09999、ならびにMiloneら、2009年、Mol.Ther.17:1453で詳
細に説明されている。
CARは、標的化される抗原を認識する分子の結合部位(すなわち、「抗原結合ドメイン」)を、リンパ球活性化を引き起こすシグナル伝達の開始に関与する、従来の免疫受容体の1つまたはそれより多くのドメイン(例えば、「刺激性ドメイン」または「シグナル伝達ドメイン」)と組み合わせる。
いくつかの実施態様において、使用される結合部分は、標的化される腫瘍抗原に高親和性を有するモノクローナル抗体(mAb)のFab(抗原結合)フラグメントの構造由来である。Fabは2つの遺伝子の生成物であるため、対応する配列は通常、軽鎖由来のペプチド上に重鎖を折り重ねてそれらの天然立体配置を形成する短いリンカーフラグメントを介して組み合わされ、単鎖フラグメント可変(scFv)領域が作り出される。
Fvまたは(scFv)抗体フラグメントは抗体のVHおよびVLドメインを含み、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、Fvポリペプチドは、VHおよびVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含んでおり、それによりscFvは、抗原結合にとって望ましい構造を形成することができる。
いくつかの実施態様において、使用される結合部分は、T細胞受容体および共刺激分子由来の細胞質内のシグナル伝達ドメイン由来である。
いくつかの実施態様において、CARのシグナル伝達部分は通常、TCR/CD3複合体のゼータ(ζ)鎖25、またはあまり一般的ではないが免疫グロブリン受容体FcεRIのガンマ(γ)鎖26、27、またはCD3−イプシロン(ε)鎖28の細胞内ドメインを含有し、膜貫通領域は、同じ分子由来である。
いくつかの形態において、CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む。本発明のさらなる実施態様は、関連の核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体、またはそれらの抗原結合部分、および本発明のCARに関する医薬組成物を提供する。
一形態において、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞抗原に結合する。用語「腫瘍細胞抗原」または「腫瘍抗原」は、本明細書で使用される場合、免疫反応を誘導できる腫瘍によって発現されるあらゆるポリペプチドを指す。腫瘍抗原の非限定的な例としては、例えば、前立腺特異的な膜抗原(PSMA)、癌胎児性抗原(CEA)、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD333/IL3Ra、c−Met、グリコリピドF77、EGFRvIII、GD−2、NY−ESO−1TCR、ERBB2、BIRC5、CEACAM5、WDR46、BAGE、CSAG2、DCT、MAGED4、GAGE1、GAGE2、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GAGE8、IL13RA2、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEA10、MAGEA12、MAGEB1、MAGEB2、MAGEC2、TP53、TYR、TYRP1、SAGE1、SYCP1、SSX2、SSX4、KRAS、PRAME、NRAS、ACTN4、CTNNB1、CASP8、CDC27、CDK4、EEF2、FN1、HSPA1B、LPGAT1、ME1、HHAT、TRAPPC1、MUM3、MYO1B、PAPOLG、OS9、PTPRK、TPI1、ADFP、AFP、AIM2、ANXA2、ART4、CLCA2、CPSF1、PPIB、EPHA2、EPHA3、FGF5、CA9、TERT、MGAT5、CEL、F4.2、CAN、ETV6、BIRC7、CSF1、OGT、MUC1、MUC2、MUM1、CTAG1A、CTAG2、CTAG、MRPL28、FOLH1、RAGE、SFMBT1、KAAG1、SART1、TSPYL1、SART3、SOX10、TRG、WT1、TACSTD1、SILV、SCGB2A2、MC1R、MLANA、GPR143、OCA2、KLK3、SUPT7L、ARTC1、BRAF、CASP5、CDKN2A、UBXD5、EFTUD2、GPNMB、NFYC、PRDX5、ZUBR1、SIRT2、SNRPD1、HERV−K−MEL、CXorf61、CCDC110、VENTXP1、SPA17、KLK4、ANKRD30A、RAB38、CCND1、CYP1B1、MDM2、MMP2、ZNF395、RNF43、SCRN1、STEAP1、707−AP、TGFBR2、PXDNL、AKAP13、PRTN3、PSCA、RHAMM、ACPP、ACRBP、LCK、RCVRN、RPS2、RPL10A、SLC45A3、BCL2L1、DKK1、ENAH、CSPG4、RGS5、BCR、BCR−ABL、ABL−BCR、DEK、DEK−CAN、ETV6−AML1、LDLR−FUT、NPM1−ALK1、PML−RARA、SYT−SSX1、SYT−SSX2、FLT3、ABL1、AML1、LDLR、FUT1、NPM1、ALK、PML1、RARA、SYT、SSX1、MSLN、UBE2V1、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、WNK2、OAS3、BCL−2、MCL1、CTSH、ABCC3、BST2、MFGE8、TPBG、FMOD、XAGE1、RPSA、COTL1、CALR3、PA2G4、EZH2、FMNL1、HPSE、APC、UBE2A、BCAP31、TOP2A、TOP2B、ITGB8、RPA1、ABI2、CCNI、CDC2、SEPT2、STAT1、LRP1、ADAM17、JUP、DDR1、ITPR2、HMOX1、TPM4、BAAT、DNAJC8、TAPBP、LGALS3BP、PAGE4、PAK2、CDKN1A、PTHLH、SOX2、SOX11、TRPM8、TYMS、ATIC、PGK1、SOX4、TOR3A、TRGC2
、BTBD2、SLBP、EGFR、IER3、TTK、LY6K、IGF2BP3、GPC3、SLC35A4、HSMD、H3F3A、ALDH1A1、MFI2、MMP14、SDCBP、PARP12、MET、CCNB1、PAX3−FKHR、PAX3、FOXO1、XBP1、SYND1、ETV5、HSPA1A、HMHA1、TRIM68、およびそれらのあらゆる組み合わせが挙げられる。
本発明は、一般的に、本発明のshRNAおよび望ましいCARを安定して発現するように遺伝子改変されたT細胞の使用に関する。CAR発現T細胞は、一般的に、CART細胞と称される。CAR発現T細胞は、本明細書では、CART細胞またはCAR改変T細胞と称される。このような細胞は、好ましくは、その表面上で抗体結合ドメインを安定して発現して、MHCとは独立した新規の抗原特異性が付与されるように遺伝子改変されていてもよい。いくつかの場合において、T細胞は、特異的な抗体の抗原認識ドメインを細胞内刺激性ドメイン(例えば、シグナル伝達ドメイン)と組み合わせたCARを安定して発現するように、遺伝子改変される。したがってCARは、抗原結合ドメインに加えて、TCR/CD3複合体のゼータ(ζ)鎖、免疫グロブリン受容体FcεRI26、27のガンマ(γ)鎖、またはCD3−イプシロン(ε)鎖の細胞内ドメインを包含していてもよい。またCARは、同じ分子からの膜貫通領域または他のI型膜貫通タンパク質、例えばCD4、CD8およびCD28を包含していてもよい。
一実施態様において、本発明のCARは、抗原認識ドメインを有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質内ドメインを含む。
一実施態様において、CAR中のドメインのうち1つと自然に会合する膜貫通ドメインが使用される。別の実施態様において、細胞質内ドメインは、刺激性ドメインおよび共刺激ドメインを含むように設計されてもよい。
CARは、CD28、CD134/OX40、CD137/4−1BB、Lck、ICOSまたはDAP10などの共刺激分子の細胞質内部分を包含していてもよい。
本開示はまた、養子細胞治療(ACT)の方策にも関する。ACTは、がんを治療するために、患者に治療用リンパ球を投与する手法である。このアプローチは、エクスビボでの腫瘍特異的なT細胞リンパ球の生成とそれらの患者への注入を必然的に伴う。リンパ球注入に加えて、例えば、宿主を予め調整すること(放射線または化学療法で)やリンパ球増殖因子(例えばIL−2)を投与することといったT細胞の取得およびそれらの免疫反応を支援する他の方法で宿主を処理してもよい。このような腫瘍特異的なリンパ球を生成するための方法の1つは、抗原特異的なT細胞の拡大を含むものである。
一実施態様において、本発明は、本発明のshRNAおよび腫瘍抗原に向けられた望ましいCAR発現T細胞の生成を提供する。改変T細胞は、1)本明細書で説明される標的遺伝子の発現を低減させることができるshRNAと、2)望ましいCARとの両方をコードするベクター(例えば、プラスミド、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター)を細胞に導入することによって生成することができる。本発明の改変T細胞は、インビボで複製することができ、その結果として、腫瘍制御をもたらすことができる長期持久性が生じる。
一形態において、本開示は、T細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることができる組成物を投与することを含む、がんの治療方法を提供する。一実施態様において、本方法は、本発明のshRNAおよび腫瘍抗原に向けられた望ましいCAR発現T細胞の投与に関する。一形態において、投与しようとするT細胞は、本発明のshRNAおよび腫瘍抗原に向けられた望ましいCARをコードするベクターを含む。
医薬製剤
いくつかの場合において、本明細書で開示された治療用組成物は、腫瘍を標的とするT細胞に加えて、がんの治療に使用される化合物、薬物、および/または薬剤を包含していてもよい。このような化合物、薬物、および/または薬剤としては、例えば、所与のがんへの免疫反応を刺激する化学療法薬、小分子薬物または抗体を挙げることができる。他の例において、治療用組成物としては、例えば、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7およびPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の発現および/または活性をサイレンシングする、低減させる、除去する、ノックダウンする、ノックアウトする、または減少させる1種またはそれより多くの小分子阻害剤を挙げることができる。したがって、本発明は、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7またはPpp3ccの、1種またはそれより多くの阻害剤を提供する。
一形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Ppp2r2dの阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Eif2ak3の阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Arhgap5の阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Smad2の阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Akap81の阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Rbksの阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Egr2の阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Dgkaの阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Cblbの阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Map3k3の阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1つまたはそれより多くの、vMdficの阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Entpd1の阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Dgkzの阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Vamp7の阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Nuak2の阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Hipk1の阻害剤を提供する。
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Alkの阻害剤を提供する。一実施態様において、Alkの阻害剤としては、例えば、CH5424802(ホフマン−ラロシュ(Hoffmann-La Roche))、LDK378(ノバルティス(Novartis))、
クリゾチニブおよびPF−02341066(ファイザー(Pfizer))またはAP26113(アリアド・ファーマシューティカルズ(Ariad Pharmaceuticals))が挙げられる
別の形態において、本発明は、1種またはそれより多くの、Pdzk1ip1の阻害剤を提供する。
いくつかの場合において、治療用組成物は、例えば、サイトカイン、ケモカインおよび他の生物学的なシグナル伝達分子、腫瘍特異的なワクチン、細胞がんワクチン(例えば、GM−CSF導入がん細胞)、腫瘍特異的なモノクローナル抗体、自己および同種幹細胞レスキュー(例えば、移植片対腫瘍効果を増大させるため)、他の治療抗体、分子標的療法、抗血管新生療法、治療目的の感染因子(例えば腫瘍局在細菌)、ならびに遺伝子治療を包含していてもよい。
いくつかの場合において、本明細書で開示される治療用組成物は、医薬組成物として、または医薬組成物中で使用するために製剤化することができる。このような組成物は、あらゆる経路、例えば、食品医薬品局(FDA)に承認されたあらゆる経路を介した対象への投与のために製剤化または適合させることができる。例示的な方法は、FDAのCDERデータ標準マニュアル、バージョン番号004(これは、fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htmで利用可能である)で説明されている。
いくつかの場合において、医薬組成物は、有効量の1種またはそれより多くのペプチドを包含し得る。用語「有効量」および「治療するのに有効な」は、本明細書で使用される場合、意図した作用または生理学的な転帰をもたらすためにそれを投与している状況において効果的な期間にわたる1種またはそれより多くのペプチドの量または濃度(短期また
は長期投与および周期的または連続的な投与を包含する)を指す。
本発明の医薬組成物は、あらゆる従来の非毒性の医薬的に許容されるキャリアー、アジュバントまたはビヒクルを含有していてもよい。いくつかのケースにおいて、製剤化された化合物またはその送達形態の安定性を強化するために、調合物のpHを、医薬的に許容される酸、塩基または緩衝液で調整してもよい。
方法
いくつかの場合において、方法は、状態または疾患(例えば、がん)を有するかまたは有していたヒト対象の選択を包含し得る。いくつかの場合において、好適な対象としては、例えば、状態または疾患を有するかまたは有していたが、疾患またはその態様が消散して、疾患の症状の低減を示す対象(例えば、同じ状態または疾患を有する他の対象(例えば、対象の大部分)と比べて)、および/または状態または疾患と共に、例えば無症状の状況で(例えば、同じ状態または疾患を有する他の対象(例えば、対象の大部分)と比べて)、長期間生存している対象(例えば、同じ状態または疾患を有する他の対象(例えば、対象の大部分)と比べて)が挙げられる。
用語「対象」は、本明細書で使用される場合、あらゆる動物を指す。いくつかの場合において、対象は、哺乳動物である。いくつかの場合において、用語「対象」は、本明細書で使用される場合、ヒト(例えば、ヒト、女性、または子供)を指す。本方法で使用するためのサンプルとしては、血清サンプル、例えば選択された対象から得られた血清サンプルが挙げられる。
いくつかの場合において、対象の選択は、対象(例えば、候補対象)からサンプルを得ること、および対象が選択に好適であるという適応に関してサンプルをテストすることを包含していてもよい。いくつかの場合において、健康管理の専門家によって、状態または疾患を過去に有していた、または現在有すると対象を確認または同定することができる。いくつかの場合において、状態または疾患に対する陽性免疫反応の表示は、患者記録、家族歴、および/または陽性免疫反応の適応の検出から作製することができる。いくつかの場合において、対象の選択において複数の団体が包含されてもよい。例えば、第一の団体が、候補対象からサンプルを得てもよいし、第二の団体が、サンプルを試験してもよい。いくつかの場合において、対象は、医師(例えば、一般開業医)により選択および/または紹介されてもよい。いくつかの場合において、対象の選択は、選択された対象からサンプルを得ること、およびサンプルを貯蔵すること、および/または本明細書で開示された方法で使用することを包含し得る。サンプルとしては、例えば、細胞または細胞集団を挙げることができる。
使用方法
いくつかの実施態様において、本開示は、それを必要とする対象において免疫反応を増加させるための方法を提供する。本開示は、がんを有する対象の治療(治療)に特に有用な療法を提供する。いくつかの場合において、本開示は、対象に、本明細書で開示された組成物を投与することを包含する、治療方法を提供する。
本明細書において、対象におけるがんまたはがんの症状を治療および/または予防するための方法であって、治療有効量のT細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることができる組成物(例えば、本発明のshRNAおよび腫瘍抗原に向けられた望ましいCAR発現免疫応答性T細胞)を対象に投与することを含む、方法が提供される。いくつかのケースにおいて、T細胞は、治療しようとする患者由来であり、本明細書で説明される標的遺伝子の発現を低減させるCARおよびshRNAを発現するように改変されている。
いくつかの実施態様において、がんは、癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病など、例えば固形およびリンパ系のがん、腎臓がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、結腸がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、脳がん、頭頸部がん、皮膚がん、子宮がん、精巣がん、神経膠腫、食道がん、および肝臓がん、例えば肝細胞癌、リンパ腫、例えばB急性リンパ芽球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(例えば、バーキット、小細胞、および大細胞リンパ腫)およびホジキンリンパ腫、白血病(例えばAML、ALL、およびCML)、ならびに多発性骨髄腫である。いくつかの実施態様において、がんは、黒色腫である。いくつかの実施態様において、がんは、形質細胞の悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫(MM)または形質細胞の前がん状態である。いくつかの実施態様において、対象は、がんを有する、またはがんに罹りやすいと診断されている。
「がん」は、本明細書で使用される場合、ヒトのがんおよび癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病など、例えば固形およびリンパ系のがん、腎臓がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、結腸がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、脳がん、頭頸部がん、皮膚がん、子宮がん、精巣がん、神経膠腫、食道がん、および肝臓がん、例えば肝細胞癌、リンパ腫、例えばB急性リンパ芽球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(例えば、バーキット、小細胞、および大細胞リンパ腫)およびホジキンリンパ腫、白血病(例えばAML、ALL、およびCML)、ならびに多発性骨髄腫を指す。
用語「抗腫瘍作用」は、本明細書で使用される場合、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、予測寿命の増加、またはがんの状態に関連する様々な生理学的症状の改善によって証明することができる生物学的作用を指す。また「抗腫瘍作用」は、第一の場所における腫瘍出現の予防における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても証明することができる。
用語「治療(処置)」または「治療すること」は、本明細書で使用される場合、対象が罹っている疾患または状態を、部分的または完全に軽減、抑制、改善、および/または緩和することを指す。いくつかの場合において、治療の結果、対象が罹っている疾患または状態が継続的にない状態にすることができる。
一般的に、方法は、状態または疾患の危険性があるかまたはそれを有する対象を選択することを包含する。いくつかの場合において、対象の状態または疾患は、本明細書で開示された医薬組成物で治療することができる。例えば、いくつかの場合において、方法は、がんを有する対象を選択することを包含し、ここで例えば、対象のがんは、腫瘍内でのT細胞の蓄積および浸潤を増加させることによって治療することができる。
いくつかの場合において、治療方法は、対象が罹っている疾患または状態の予防または治療における必要性に応じて、単回投与、複数回投与、および繰り返しの投与を包含し得る。いくつかの場合において、治療方法は、治療の前に、治療中に、および/または治療後に対象における疾患のレベルを査定することを包含し得る。いくつかの場合において、治療は、対象における疾患のレベルの減少が検出されるまで継続することができる。
投与後、対象を評価して、それらの疾患のレベルを検出、査定、または決定することができる。いくつかの場合において、対象における疾患のレベルの変化(例えば、低減)が検出されるまで、治療を継続してもよい。
患者の状態が改善されたら(例えば、対象における疾患のレベルが変化(例えば、減少)したら)、必要に応じて、本発明の化合物、組成物または組み合わせの維持量を投与してもよい。その後、投薬量もしくは投与頻度、またはそれら両方を、症状に応じて、改善
された状態が保持されるレベルに低減させてもよい。しかしながら、患者は、長期的に、何らかの疾患症状の再発時における間欠式治療を必要とする場合もある。
また、本明細書で開示された方法のいずれかおよび組成物のいずれかを、1種またはそれより多くの治療剤と組み合わせることも本発明の範囲内である。治療剤としては、これらに限定されないが、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、化学療法剤および放射線が挙げられる。
また、従来の療法の用量/毒性を低減させること、および/または従来の療法の感度を増加させることのいずれかによりこのような療法の効能を強化するために、本明細書で開示された方法のいずれかおよび組成物のいずれかを、従来のがん療法や様々な薬物と組み合わせることも本発明の範囲内である。従来の療法の1つは、放射線療法の使用である。別の従来の療法は、化学療法薬の使用であり、化学療法薬は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、および抗腫瘍剤に分類することができる。これらの薬物はいずれも、細胞分裂またはDNA合成に作用して、何らかの方式で機能する。他の従来のがん療法は、DNAに直接干渉しない薬剤である。本発明と組み合わせるためのこのような薬剤の例としては、例えば、がん細胞成長に関与する特異的な酵素をブロックする「小分子」薬物を挙げることができる。モノクローナル抗体、がんワクチン、血管形成抑制薬、および遺伝子治療は、がん細胞成長にも干渉することから、本明細書で開示された組成物および方法とも組み合わせることが可能な標的療法である。
試験化合物をスクリーニングする方法
がんの治療において有用な薬剤、例えば、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7およびPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の発現および/または活性をサイレンシングする、低減させる、除去する、ノックダウンする、ノックアウトする、モジュレートする、または減少させる試験化合物を同定するための、試験化合物、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、無機または有機の大分子または小分子試験化合物をスクリーニングするための方法が、本明細書に包含される。
「小分子」は、本明細書で使用される場合、分子量が約3,000ダルトン未満の小さい有機または無機分子を指す。本発明に有用な小分子は、一般的に、3,000ダルトン(Da)未満の分子量を有する。小分子は、例えば、少なくとも約100Da〜約3,000Da(例えば、約100〜約3,000Da、約100〜約2500Da、約100〜約2,000Da、約100〜約1,750Da、約100〜約1,500Da、約100〜約1,250Da、約100〜約1,000Da、約100〜約750Da、約100〜約500Da、約200〜約1500、約500〜約1000、約300〜約1000Da、または約100〜約250Da)であってもよい。
試験化合物は、例えば、天然産物またはコンビナトリアルケミストリーライブラリーの構成要素であってもよい。電荷、芳香族性、水素結合、フレキシビリティー、サイズ、側鎖の長さ、疎水性、および剛性などの様々な機能を取り扱うために、多様な分子の一群が使用されると予想される。小分子の合成に好適なコンビナトリアル技術は、例えば、ObrechtおよびVillalgordo、Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Sm
all-Molecular-Weight Compound Libraries、ペルガモン−エルゼビアサイエンス社(Pergamon-Elsevier Science Limited)(1998)で例示されているように当業界において公知であり、「スプリット・アンド・プール」または「パラレル」合成技術、固相および液相技術、ならびにコーディング技術などの技術が挙げられる(例えば、Czarnik、Curr. Opin. Chem. Bio. 1:60〜6(1997)を参照)。加えて、多数の小分子ライブラリーが市販さ
れている。多数の好適な小分子試験化合物が、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第6,503,713号に列挙されている。
本発明の方法を使用してスクリーニングしたライブラリーは、様々なタイプの試験化合物を含むものでもよい。所与のライブラリーは、構造的に関連する、または関連しない試験化合物の一群を含む可能性がある。いくつかの実施態様において、試験化合物は、ペプチドまたはペプチド模擬体分子である。いくつかの実施態様において、試験化合物は、核酸である。
いくつかの実施態様において、試験化合物およびそれらのライブラリーは、第一の試験化合物、例えば、標的ポリペプチドの公知の天然結合パートナーに構造的に類似する第一の試験化合物、または例えば、当業界において公知の方法もしくは本明細書で説明される方法を使用して、標的ポリペプチドに結合できると同定された第一の小分子の構造を変更し、その構造を結果生じた生物活性と関連付けること、例えば、構造−活性相関研究を行うことにより系統的に得ることができる。当業者は理解していると予想されるように、このような構造−活性相関を作り出すための様々な標準的な方法がある。したがって、一部の例では、その作業の大部分を実験的に行う場合もあるが、他の例では、内因性ポリペプチドまたはそれらの部分の三次元構造を、小分子化合物または化合物の合理的な設計のための開始点として使用することができる。例えば、一実施態様において、一般的な小分子ライブラリーは、例えば、本明細書で説明される方法を使用してスクリーニングされる。
いくつかの実施態様において、試験化合物は、テストサンプル、例えば細胞または生きた組織もしくは臓器、例えば目に適用され、試験化合物の1種またはそれより多くの作用が評価される。培養細胞または初代細胞において、例えば、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7およびPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の発現および/または活性をサイレンシングする、低減させる、除去する、ノックダウンする、ノックアウトする、モジュレートする、または減少させる試験化合物の能力が評価される。
いくつかの実施態様において、テストサンプルは、本明細書で説明されているようなインビボの障害モデルであるか、またはそれに由来するものである(例えば、それから採取したサンプル)。例えば、動物モデル、例えばラットなどのげっ歯類を使用することができる。
これらの作用のそれぞれを評価するための方法は当業界において公知である。例えば、タンパク質の発現をモジュレートする能力は、遺伝子またはタンパク質レベルで、例えば定量PCRまたはイムノアッセイ法を使用して評価することができる。いくつかの実施態様において、ハイスループット法、例えば、当業界において公知の通りのタンパク質または遺伝子チップ(例えば、Griffithsら編、Modern genetic Analysisに記載の第12章、Genomics、1999、W. H. Freeman and Company;EkinsおよびChu、Trends in Biotechnology
、1999、17:217〜218;MacBeathおよびSchreiber、Science 2000、289(5485):1760〜1763;Simpson、Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press;2002;Hardiman、Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts、DNA Press、2003を参照)が、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、
Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7およびPpp3ccの活性または遺伝子発現に対する作用を検出するのに使用することができる。
本明細書で説明される方法によりスクリーニングされ、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7およびPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の発現および/または活性をサイレンシングする、低減させる、除去する、ノックダウンする、ノックアウトする、または減少させることが決定された試験化合物を、候補化合物とみなすことができる。例えばインビボにおけるがんなどの障害のモデルにおいてスクリーニングされ、障害に対して、例えば障害の1つまたはそれより多くの症状に対して望ましい作用を有することが決定された候補化合物を、候補治療剤とみなすことができる。候補治療剤を臨床条件で一度スクリーニングすれば、それは治療剤である。候補化合物、候補治療剤、および治療剤を場合により最適化および/または誘導体化し、生理学的に許容できる添加剤と配合して、医薬組成物を形成してもよい。
したがって、第一のスクリーニングで「ヒット」と同定された試験化合物(例えば、免疫細胞を不活性化および/または抑制するために腫瘍細胞が使用する免疫抑制経路を阻害する試験化合物)を選択し、例えば合理的設計を使用して、結合親和性、結合活性、特異性、または他のパラメーターが最適化されるように系統的に変更することができる。このような最適化はまた、本明細書で説明される方法を使用するためにスクリーニングされてもよい。したがって、一実施態様において、本発明は、当業界において公知の方法および/または本明細書で説明される方法を使用して、化合物の第一のライブラリーをスクリーニングすること、そのライブラリーにおいて1つまたはそれより多くのヒットを同定すること、そのようなヒットを系統的に構造変更させて、そのヒットに構造的に関連した化合物の第二のライブラリーを作り出すこと、および本明細書で説明される方法を使用して第二のライブラリーをスクリーニングすることを包含する。
以下の実施例において本発明をさらに説明するが、実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない。
近年の研究から、細胞傷害性T細胞は、免疫介在性のがんの制御において中心的な役割を果たし1〜3、T細胞上の阻害性受容体を標的とするモノクローナル抗体は、進行疾患を有する患者において有意な臨床上の利益を誘導することができることが示されている4〜6。しかしながら、免疫抑制性の腫瘍内におけるT細胞機能の喪失を引き起こす調節メカニズムの多くが依然として未知のままである。以下の実施例において、本発明者らは、腫瘍微小環境においてこのような調節メカニズムをインビボで系統的に見出すことができ
ることを実証する。本発明者らは、主要な阻害剤を標的とするshRNAが、複数の阻害シグナルがあるにもかかわらず、腫瘍中で安定したT細胞の浸潤および蓄積を可能にするであろうと仮定した。腫瘍浸潤CD8T細胞の機能をブロックする遺伝子を同定することを目的としたプールshRNAスクリーニングアプローチを使用して、shRNAが形質導入されたT細胞を腫瘍を有するマウスに移入し、続いてディープシーケンシングして腫瘍およびリンパ系器官における全てのヘアピンの出現を定量することにより、候補shRNAを発見した。shRNAの大部分が、腫瘍ではT細胞の蓄積を誘導したが、脾臓では誘導しなかったことから、組織各所で示差的な作用を有するshRNAを発見する実行可能性が実証された。標的の1つは、PP2Aホスファターゼの調節サブユニットであるPpp2r2dであった。対照shRNAが形質導入されたT細胞は、黒色腫細胞を認識するとアポトーシスを起こしたが、Ppp2r2dのshRNAが形質導入されたT細胞は、強化された増殖およびアポトーシス耐性のために腫瘍で蓄積された。またPpp2r2dのshRNAを発現するT細胞は、腫瘍増殖も顕著に遅らせた。このインビボでのアプローチは、関連組織の微小環境における複雑な免疫機能を詳細に分析するための広範な用途を有する。
免疫細胞は、全身にわたり複雑な監視機能を実行し、別個の組織微小環境で多くの様々なタイプの細胞と相互作用する。免疫反応をモジュレートするための治療標的は、典型的にはインビトロで同定され、プロセス後期において動物モデルでテストされる。ここで本発明者らは、どのようにして免疫調節のための標的をインビボで系統的に見出すことができるかという課題に取り組んだ。このことは、腫瘍細胞に対する細胞傷害機能を有するCD8T細胞による強い浸潤は複数のタイプのヒトがんにおいて好都合な予後に関連するため、腫瘍学における中核的な問題である1、3、8。残念ながら、この天然の防御機構は、大部分の患者において、腫瘍、その間質、制御性T細胞および骨髄の細胞集団から放出される複数の阻害シグナルによって著しく鈍くなる9〜11
プールされたshRNAライブラリーは、強力な発見ツールであることが示された12〜14。本発明者らは、腫瘍関連抗原によるT細胞受容体の誘発後のT細胞の大規模な増殖能を利用して、CD8T細胞の機能を回復させることができるshRNAをインビボで系統的に見出すことができると推論した。プールからのごく一部のshRNAの部分集合が、T細胞に導入されると、T細胞の増殖を回復させて、結果として腫瘍内におけるそれらの濃縮をもたらすと予想される。各プール中の活性shRNAの過剰出現は、腫瘍および二次リンパ器官からのshRNAカセットをディープシーケンシングすることによって定量することができる(図1)。
実験動物。C57BL/6マウス、TRP−1マウス(チロシナーゼ関連タンパク質1に特異的なT細胞受容体(TCR)を発現するトランスジェニックマウス)23、pmel−1マウス(gp100に特異的なTCRを発現するトランスジェニックマウス)18、およびb2m−/−マウス24を、ジャクソン研究所(Jackson Laboratory)から購入した。Rag1−/−OT−Iマウス16を、タコニック・ファーム社(Taconic Farms,
Inc.)から購入した。ダナ−ファーバー癌研究所(Dana-Farber Cancer Institute)の
動物施設でマウスを飼育した。全ての実験手法は、ダナ−ファーバー癌研究所の動物管理使用委員会によって承認された。
細胞株。治療困難な高侵襲性の腫瘍であるB16黒色腫は、OT−IT細胞受容体トランスジェニックマウスからのCD8T細胞によって認識される代用の腫瘍抗原オバルブミン(Ova)を発現する16,17。EL4胸腺腫38およびB16−F10黒色腫15細胞を、10%FBS、2mMのL−グルタミン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび100μg/mlのペニシリンが補充されたRPMI1640中で維持した。600μg/mLのG418(インビトロジェン(Invitrogen))が添加された同じ培地中
で、オバルブミンを発現するB16腫瘍細胞(B16−Ova)を維持した。
ベクターおよびshRNA配列。機能不全性のT細胞(アネルギーまたは疲弊)で過剰発現された255種の遺伝子に関してshRNAを選択した。RNAiコンソーシアムからpLKO.3Gベクターを得た。GFPを対応するレポーター遺伝子で置き換えてpLKO.3Gベクターを改造することにより、pLKO−Thy1.1、pLKO−アメトリン、pLKO−RFP、pLKO−TFPベクターを得た。表3に、10種の選択されたshRNAによって標的化されたマウスのPpp2r2dおよびCblb配列を示す(shRNA活性の順に(最大から最小に)列挙)。対照shRNAによって標的化されたLacZ標的配列も列挙する。全ての他の標的配列は、表2で見ることができる。
Figure 2021040648
抗体およびフローサイトメトリー。単一細胞の懸濁液を、PBS、2%FBS中で、標識抗体で4℃で20分間染色し、続いて氷冷PBS、2%FBSで2回洗浄した。FACSAria(BDバイオサイエンス(BD Biosciences))およびFlowJoソフトウェア(トリスター(TriStar))を使用して細胞を分析/ソートした。使用された抗体は、
CD4、CD8、Vα2、Vβ5.1/5.2、Thy1.1、CD25、CD44、CD62L、CD69、CD122、CD127、IFNγ、TNFα(バイオレジェンド(BioLegend))、PD−1、TIM−3、LAG−3、グランザイムB、およびH−2
Kb(バイオレジェンド)、Vα3.2(イーバイオサイエンス(eBioscience))、V
β13、Vβ14(BDバイオサイエンス)、ホスホ−Akt(Ser473)およびホスホ−Bad(Ser112)(セル・シグナリング(Cell Signaling))に特異的なものであった。アネキシンV(バイオレジェンド)または活性化されたカスパーゼ−3抗体(セル・シグナリング)で標識することによってアポトーシス細胞を検出した。マウス抗CD3/CD28ビーズを、インビトロジェン(Invitrogen)から購入した。
腫瘍からのT細胞の単離。5mLのPBS、2%FBSを含有するペトリ皿中でB16−Ova黒色腫を小片に切断し、PBSで洗浄した。2%FBS、50U/mLのIV型コラゲナーゼ(インビトロジェン)、20U/mLのDNアーゼ(ロシュ(Roche))が
補充されたRPMI(15mL)中に腫瘍を再懸濁し、サンプルを37℃で2時間インキュベートし、ジェントルMACSディソシエーター(gentleMACS Dissociator)(ミルテニー・バイオテク(Miltenyi Biotech))を使用して組織をさらに解離させた。懸濁液をでPBS3回洗浄し、70μMのろ過器を通過させた。密度勾配遠心分離によってリンパ球を単離し、次いでFACSAria(BDバイオサイエンス)を使用したフローサイトメトリーによって分析またはソートのどちらかを行った。
T細胞アポトーシス。サイトカインで前治療したOT−I細胞を、LacZまたはPpp2r2dのshRNAで形質導入し、14日目のB16−Ova腫瘍を有するマウスに注射した。7日後、活性化されたカスパーゼ−3抗体(セル・シグナリング)を使用して細胞内染色を行い、FACS分析でCD8/Thy1.1二重陽性T細胞をゲーティングした。
免疫蛍光法および免疫組織化学。LacZまたはPpp2r2dのshRNAを発現するOT−IT細胞(GFP発現ベクター)で治療したマウスからのB16−Ova腫瘍を、最適切削温度 (O.C.T.:optimal cutting temperature)化合物(ティシュー・テック(Tissue-Tek))中で低温保存した。低温保存した腫瘍からの10μmの切片を0.2%トリトン(Triton)X−100で膜透過化し、4%パラホルムアルデヒド中で固定して、DAPIと組み合わせたGFP抗体(モレキュラー・プローブス(Molecular Probes))で染色した。タネル検出のために、TACS2TdTブルー標識(トレビゲン(Trevigen))で製造元の指示に基づき切片を染色した。レーザー走査共焦点顕微鏡(ライカ(Leica)SP5X)を使用してサンプルを可視化し、ImageJソフトウェア(NIH)を
用いて分析した。
qRT−PCRアッセイ。TRIzol試薬(インビトロジェン)を使用してトータルRNAを抽出した。ハイキャパシティーcDNA逆転写キット(アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems))でRNAを逆転写した。ABI7900HT機器をSYBRグリーン(ABI)と共に使用してリアルタイム定量PCR反応を3連で行った。正規化のためにRpl23のレベルを使用した。以下のプライマーを使用した:Ppp2r2dフォワードGGAAGCCGACATCATCTCCAC(配列番号622)、Ppp2r2dリバースGTGAGCGCGGCCTTTATTCT(配列番号623);CblbフォワードGGTCGCATTTTGGGGATTATTGA(配列番号624)、CblbリバースTTTGGCACAGTCTTACCACTTT(配列番号625);Rpl23フォワードCTGTGAAGGGAATCAAGGGA(配列番号626)およびRpl23リバースTGTCGAATTACCACTGCTGG(配列番号627)。
マイクロアレイ分析。IL−7/IL−15と培養したOT−IT細胞を、5種の試験用shRNA(Ppp2r2d、Arhgap5、Alk、Egr2、Ptpn2)のうち1種またはLacZ対照shRNAで形質導入した。感染細胞を、レポーターとしてベクターによってコードされたGFPを使用してソートして純化した。14日目のB16−Ova腫瘍を有するマウスにT細胞(5×10個)を静脈内注射した。7日後、shRNAを発現するOT−IT細胞(CD8+GFP+)を腫瘍および脾臓から単離した。細胞を2回ソートして高純度にし、アフィメトリックス(Affymetrix)の遺伝子発現プロファイリング(マウスゲノム430 2.0アレイ)用に、TRIzol試薬(インビトロジェン)を使用してトータルRNAを抽出した。各shRNAのアレイを3連で実行した
(マウス6匹/グループ)。
単一細胞レベルでのナノウェルにおけるサイトカイン産生分析
材料。T細胞活性化に使用された抗体は、抗マウスCD3および抗マウスCD28(バイオレジェンド)であった。分泌されたサイトカインを捕獲するのに使用された抗体は、抗マウスIFNγ(バイオレジェンド)、抗マウスIL−2(バイオレジェンド)、抗マウスTNFα(バイオレジェンド)および抗マウスGM−CSF(バイオレジェンド)であった。検出抗体は、抗マウスIFNγ(バイオレジェンド)、抗マウスIL−2(バイオレジェンド)、抗マウスTNFα(バイオレジェンド)および抗マウスGM−CSF(バイオレジェンド)であり、これらを、適切なアレクサフルオロ(Alexa Fluor)色素(
インビトロジェン)で製造元の説明書に従って蛍光標識した。支持された二重層を調製するのに使用された脂質は、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DOPC)および1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−(capビオチニル)(ビオチニルCap PE)(アバンティ・ポーラー・リピッド(Avanti Polar Lipids))であった。
ナノウェルのPDMSアレイの製作および支持された脂質二重層の調製。10:1のベース/触媒重量比に調製されたポリジメチルシロキサン(PDMS、ダウ・コーニング(Dow Corning))を、マイクロパターンを有するシリコンマスターを包み込む特注の型に
注入することによってナノウェルのアレイを製造した。ナノウェルのアレイを70℃で4〜16時間硬化した。各アレイは72×24個のブロックで構成され、それぞれ7×7(50μm×50μm×50μm)個のナノウェルのサブアレイを含有する(合計84,672ウェル)。PDMSアレイを3インチ×1インチのスライドガラスに直接接着させ、厚さ1mmの層を形成した。支持された脂質二重層を、上述したようにして(14)調製した。ナノウェルのPDMSアレイに2モル%ビオチン−Cap−PE脂質を含有するDOPCリポソームを適用することによって二重層を生成した。表面を脱イオン水で濯いで、過量のリポソームを除去した。使用前、脂質二重層をPBS中のBSA(100μg/mL)で45分間ブロックした。次いで二重層を、100μg/mLのBSAのPBS溶液中で1μg/mLのストレプトアビジンとインキュベートし、続いてビオチン化CD3およびCD28抗体とインキュベートした。細胞を添加する前、デバイスを広範囲にわたりPBSで濯いだ。
マイクロエングレービング(Microengraving)。ホウ酸緩衝液(50mMホウ酸ナトリウム、8mMスクロース、および50mMのNaCl、pH9.0)で捕捉抗体を10μg/mLの最終濃度まで希釈し、エポキシ改変スライドの表面上に室温で1時間堆積させた。スライドを、PBST(0.05%(v/v)トゥイーン(Tween)20を含むPB
S)中の3%無脂肪乳で室温で30分間ブロックし、PBSで洗浄し、その後、それらをナノウェルのPDMSアレイとの接触に適用した。T細胞の懸濁液をナノウェル表面上に分配し、媒体中の支持された脂質二重層で改変して、そのままウェルに定着させた。アレイに適用された懸濁細胞の密度を経験的に最適化して、単一細胞によるウェルの占有率を最大化した(典型的にはウェルの約30%)。細胞がローディングされたウェルをインキュベートした後、捕捉抗体でコーティングされたスライドガラスを、サイトカイン捕捉のためにローディング済みアレイに設置した。マイクロアレイとスライドガラスとを、ハイブリダイゼーションチャンバー(アジレント・テクノロジーズ(Agilent Technologies)、G2534A)中での圧縮によって一体化し、37℃、5%COで1時間インキュベートした。次いでスライドガラスをアレイから分離し、PBS中に入れた。
マイクロエングレービング後、スライドを、ブロッキング緩衝液(PBS、10mg/mLのBSA、0.05%(v/v)トゥイーン−20、2%マウス血清および2mMアジ化ナトリウム)と共に30分間インキュベートし、PBST(PBS+0.05%v/
vトゥイーン−20)で洗浄し、次いで1μg/mLの蛍光検出抗体と共に25℃で45分間インキュベートした。スライドをPBSTおよびPBSで洗浄し、水で簡単に濯ぎ、Nストリームを用いて乾燥させた。各実験の最後に、プリントされたスライドに使用された同じ検出抗体を用いて参照スライドを生成した。参照スライドの場合、抗体を水で希釈し、ブランクのポリ−L−リシンスライド(1μL/スポット)にスポットし、参照スライドを真空中で乾燥させた。ジーンピックス(Genepix)4200ALマイクロアレイ
スキャナー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices))を使用してスライドをスキ
ャンした。ジーンピックス・プロ(Genepix Pro)を使用して各スポットの蛍光強度の中
央値を抽出した。
チップ上の画像ベースの血球計算法。イメージングの前に、T細胞を、セルマスク(CellMask(商標))プラズマメンブレンステイン(インビトロジェン、ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies))およびSYTOXグリーン(死細胞検出用、ライフ・テク
ノロジーズ)で染色した。顕微鏡上に、カバースリップをアレイ上面に置いた、細胞をローディングしたナノウェルのアレイを、上向きにマウントした。自動式倒立落射蛍光顕微鏡(カール・ツァイス(Carl Zeiss))で画像を得た。透過光および落射蛍光顕微鏡写真を、ブロックごとに収集した(ブロック1つ当たり7×7個のマイクロウェル)。各ウェルに存在する細胞の数および各標識の平均蛍光強度を決定できるように特注されたプログラムを使用して、結果得られた画像のコレクションを分析した。生存可能なT細胞のみを分析対象とした。それらの細胞はGFPを発現していたが、利用された顕微鏡取得設定では、死細胞の同定を可能にするSYTOXグリーンと比較して、GFPの蛍光強度は無視できる程度であった。
データ分析。チップ上の血球計算法とプリントされたサイトカインの両方から抽出されたデータを、マイクロソフトエクセルで、アレイ内の各ウェルに割り当てられた一意識別子を使用して突き合わせた。単一細胞のみを含有するウェルが含まれるようにデータセットをフィルタリングした。シグナルの漏れを補って、所与の細胞から捕捉されたサイトカインに関して測定された蛍光強度を分泌速度に変換するために、以前にせつめいされたようにして、公知の量の検出抗体を用いて作成された標準検量線(参照スライドより)からのデータを使用して、測定された強度を多数の分子に変換した(Han, Q.ら、Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab Chip 10、1391〜1400、doi:10.1039/b926849a(2010)。
実施例1:インビボでの免疫療法標的のRNAiの発見
2回の大規模な一次スクリーニングを行い、第一のスクリーニングは、機能不全性のT細胞で過剰発現された遺伝子(アネルギーまたは疲弊したT細胞;255種の遺伝子、1,275種のshRNAを2つのプールに分割した)に焦点を当て、第二のスクリーニングは、キナーゼ/ホスファターゼ(1,307種の遺伝子、6,535種のshRNAを7つのプールに分割した)に焦点を当てた(表4)。これらの一次スクリーニングにおいて、各遺伝子は約5種のshRNAによって表された。
Figure 2021040648
機能不全性のT細胞(アネルギーまたは疲弊した状況)31〜37で過剰発現された255種の遺伝子を標的とするshRNAと1,307種のキナーゼ/ホスファターゼ遺伝子(遺伝子1種当たり約5種のshRNA)を、RNAiコンソーシアム(TRC;ブロードインスティテュート(Broad Institute)、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)
から得た。9つのプールを作り出し、shRNAをpLKO−Thy1.1レンチウイルスベクターにサブクローニングした。また各プールは、85種の陰性対照のshRNA(shRNAの数:GFP、24;LacZ、20;ルシフェラーゼ、25;RFP、16)も含有していた。陰性選択(ステムセルテクノロジーズ(Stemcell Technologies))
によって単離されたOT−IT細胞を、完全RPMI培地(RPMI1640、10%FBS、20mMのHEPES、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.05mMの2−メルカプトエタノール、2mMのL−グルタミン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび100μg/mlのペニシリン)中のIL−7(5ng/mL、ペプロテック(Peprotech))およびIL−15(100ng/mL、ペプロテック)と共に培養した。2日
目、レトロネクチン(5μg/mL)でコーティングされた24−ウェルプレート中の硫酸プロタミン(5μg/mL)が補充されたレンチウイルスのプール(9つのレンチウイルスshRNAプールおよびLacZ対照shRNAレンチウイルスベクター対照)で、OT−IT細胞を15の重複感染度(MOI)でスピンインフェクションした。典型的には、プールごとに約5×10個のOT−1 T細胞を感染させた。
感染後、完全RPMI培地中のIL−7(2.5ng/mL)、IL−15(50ng/mL)およびIL−2(2ng/mL)でOT−I細胞を培養した。5日目、生きたshRNAが形質導入されたTを、死細胞除去キット(ミルテニー)を使用して濃縮し、Thy1.1マーカー(ステムセルテクノロジーズ)に基づき50〜60%のThy1.1陽性率に達するまで感染細胞を陽性選択した。Thy1.1レポーターの表面発現によって形質導入成功をモニターした(図2)。14日目のB16−Ova腫瘍を有するC57BL/6マウス(shRNAプール1つ当たり15匹のマウス)(これは、T細胞単離およびPCRに十分な細胞が提供されるように選ばれた動物の数である)にT細胞(5´10)を静脈内注射した。ディープシーケンシング用の開始集団として5×10個の濃縮OT−I細胞をゲノムDNAから単離した。7日後、ゲノムDNAの単離のために腫瘍、脾臓、腫瘍流入領域リンパ節および無関係のリンパ節からフローサイトメトリーを行い、続いてshRNAカセットのPCR増幅を行うことによって、shRNAを発現するT細胞(CD8Vα2Vβ5Thy1.1)を単離した。(図3)ゲノムDNAを単離し(キアゲン(Qiagen))、shRNAカセットのPCRによってディープシーケンシングテンプレートを生成した。各プール中でのshRNAの出現を、イルミナ(Illumina)ゲノムアナライザーを使用したディープシーケンシングによって分析した30。各プールにおける対照shRNAの平均読み取り値を使用してデータを正規化した。T細胞に
おける発現レベルに基づく第二のスクリーニングのためにキナーゼ/ホスファターゼ遺伝子を選択した。
開始のT細胞集団(例えばSHP−1)と比較して、テストされた全組織で所定の遺伝子に関してshRNAが過剰出現されたが、これは、腫瘍抗原のTCR認識から独立した強化された増殖の指標である。他の遺伝子に関して、腫瘍内におけるshRNAの選択的な喪失が見られた(例えばZAP−70、これは、T細胞活性化経路における重要なキナーゼ)。本発明者らは、そのshRNAが腫瘍で実質的な過剰出現を示したが、脾臓、二次リンパ器官ではそうではなかった遺伝子に、本発明者らの分析を集中させた。多数のshRNAについて、腫瘍における実質的なT細胞の蓄積が、免疫抑制性の環境にもかかわらず観察された。二次スクリーニングのために、本発明者らは、約15種のshRNAによって各候補遺伝子が提示された集中プールを作り出した。
図4に、この分析からの一次データを、3種の遺伝子、すなわち:LacZ(陰性対照)、Cblb(T細胞受容体の内在化を誘導するE3ユビキチンリガーゼ)19およびPpp2r2d(T細胞中で、これまで研究されていない)に関して示す。Ppp2r2dおよびCblbの両方に関して、5種のshRNAが、脾臓と比較して腫瘍で(赤色)実質的に増加したが、LacZのshRNAについて濃縮は観察されなかった。総合すると、43種の遺伝子が、脾臓と比較して腫瘍において3種またはそれより多くのshRNAについて、以下の基準:4倍以上の濃縮を満たした(表5、図4、図5)。その群は、本発明者らのアプローチを立証する、これまでT細胞受容体シグナル伝達の阻害剤として同定された遺伝子産物(Cblb、Dgka、Dgkz、Ptpn2を包含する)、加えて他の周知のT細胞の機能の阻害剤として同定された遺伝子産物(例えばSmad2、Socs1、Socs3、Egr2)、(表5、表6)20〜22を包含する。表5に、第二のスクリーニングからの候補遺伝子の機能的な分類を記載する。
Figure 2021040648
腫瘍における実質的な過剰出現を示したが、脾臓、二次リンパ器官では示さなかったshRNAを有する遺伝子に焦点を当てて、二次スクリーニングを行った。免疫抑制性の環
境にもかかわらず、腫瘍における実質的なT細胞の蓄積を多数のshRNAについて観察した。これらの二次スクリーニングに関して、遺伝子1つ当たり合計約15種のshRNAが得られるように各遺伝子(IDT)につき約10種の追加のshRNAを合成した。これらの集中プールは、85種の陰性対照shRNAを含有していた。2種の対照shRNA(1つはRFPに関し、1つはルシフェラーゼに関する)は、脾臓と比較して腫瘍において一定の濃縮を示した(それぞれ4.0倍と5.1倍)。第二のスクリーニングにおけるカットオフを、脾臓と比較して腫瘍において4倍以上の濃縮を示す3種以上のshRNAと定義した。T細胞に、レポータータンパク質(GFP、TFP、RFPまたはアメトリン蛍光タンパク質、Thy1.1)と共に個々のshRNAを導入することによって、スクリーニング結果を細胞レベルで検証した。このアプローチは、動物(グループ1つ当たり3匹のマウス)において5種のshRNAを同時に試験することが可能であった。24時間後、加えて3、5および7日後に、shRNAが形質導入されたT細胞の増殖を、CFSE希釈に基づき可視化した。加えて3、5および7日目に、IFNγ、TNFαおよびアイソタイプ対照に関して細胞内染色を行った。表6に、機能不全のT細胞プールshRNAライブラリーの一次および二次スクリーニングからの結果を示す。少なくとも3種のshRNAが腫瘍において4倍を超える濃縮を示した遺伝子をそれらの機能の簡単な説明と共に列挙する。表7に、キナーゼおよびホスファターゼshRNAライブラリーの二次スクリーニングからの結果を示す。
Figure 2021040648
Figure 2021040648
実施例2:B16黒色腫におけるshRNAによって駆動されるCD4およびCD8T細胞の拡大
ディープシーケンシング分析からの陽性shRNAを、5つの異なるレポータータンパク質(GFP、TFP、RFPまたはアメトリン蛍光タンパク質、Thy1.1)をコードするレンチウイルスベクターにクローニングした。サイトカインで前処理したOT−IT細胞を、単一のshRNAとレポータータンパク質との発現を駆動するレンチウイルスベクターで形質導入し、各集団の1×10個のT細胞を混合し、14日目のB16−Ova腫瘍を有するC57BL/6マウスに共に静脈内注射した。7日後、腫瘍、脾臓および
リンパ節からT細胞を単離し、レポーター陽性のCD8Vα2Vβ5T細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって共に導入されたレポーターに基づき決定した。脾臓と比較した腫瘍における濃縮倍率を、特定のレポーターを発現する各臓器におけるOT−IT細胞のパーセンテージに基づき計算した。CD8OT−IT細胞中で対照であるLacZのshRNAを発現させた場合、shRNA発現CD8OT−IT細胞の頻度は、脾臓と比較して腫瘍でより低かった(約2分の1)。対照的に、試験用shRNAは、腫瘍ではCD8OT−IT細胞の蓄積を誘導したが、脾臓では誘導しなかった(図6、図7)。これらのshRNAのうち7種(例えば、Ppp2r2D、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap8I、RbksおよびEgr2)について、腫瘍におけるT細胞の蓄積は、脾臓と比較して10倍より多かった。PP2Aホスファターゼ7の調節サブユニットであるPpp2r2dを標的とするshRNAで、最も強い表現型が観察された。
Ppp2r2dまたはLacZのshRNAを発現するCD8OT−IまたはCD4TRP−1T細胞を、14日目のB16−Ova腫瘍を有するマウスに注射した。腫瘍および脾臓において、Thy1.1レポーターを使用して、shRNAを発現するT細胞を同定した(図8、Thy1.1CD8T細胞の%、左のパネル)。2×10個のshRNAを発現する細胞の移入から7日後に、腫瘍および脾臓において、LacZまたはPpp2r2dのshRNAを発現するT細胞の総数を決定した(図8、右のパネル)。腫瘍におけるPpp2r2d対LacZのshRNAを発現するT細胞の濃縮倍率を示す。Ppp2r2dのshRNAは、OT−ICD8T細胞の蓄積を誘導しただけでなく、CD4T細胞の蓄積も誘導し(TRP−1TCRトランスジェニックマウス由来)23、腫瘍におけるT細胞数は、LacZのshRNAではなくPpp2r2dを発現した場合により有意に高かった(CD8の場合、36.3倍;CD4T細胞の場合、16.2倍)(図8)。
Ppp2r2dまたはCblbのshRNAのパネルを発現する細胞に関する脾臓と比較した腫瘍におけるT細胞の濃縮(図17、上のパネル)、Ppp2r2dおよびCblbのmRNAレベルも、T細胞移入前にqPCRによって測定した(図17、下のパネル)。shRNAに関して最も強い腫瘍におけるT細胞濃縮が観察され、ノックダウン効率はmRNAレベルで80%より大きかった(Ppp2r2dおよびCblbの両方についてshRNA番号1および2)。CD8T細胞の蓄積は、Ppp2r2dのノックダウンの程度と相関しており、最大のインビボ活性を有する2種のPpp2r2dのshRNAは、最小レベルのPpp2r2dのmRNAを誘導した(図17)。
またPpp2r2dのノックダウンも、定量的マススペクトロメトリーアプローチを使用してタンパク質レベルで確認された(図18)。マススペクトロメトリーによる細胞溶解産物由来タンパク質の絶対定量(AQUA)に関してこれまでに報告されているアプローチを使用して、タンパク質レベルにおけるPpp2r2dのshRNA発現の作用を測定した(Gerber, S.A.、Rush, J.、Stemman, O.、Kirschner, M.W.およびGygi, S.P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem
MS. PNAS、100、6940〜6945(2003)。この方策は、マススペクトロメトリー分析のための内部標準として安定な同位体が取り込まれた合成ペプチドを使用する「選択的反応をモニターする」アプローチに基づく。LacZまたはPpp2r2dのshRNAを発現するOT−I細胞を、FACSを使用してソートして純化した。プロテアーゼ阻害剤カクテル(シグマ(Sigma))、1mMのEDTAおよび1mMのPMSFを含有する1mlの
MPER抽出試薬(ピアース(Pierce))中で、細胞(1×10個)を、氷上で15分間、時々ボルテックス混合しながら溶解させた。死細胞片を遠心分離で除去し、タンパク質上清をろ過した(0.2μmのSpinX遠心分離機フィルター、コースター(Costar))。タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイ(Biorad)およびUV280nm分
析(ナノドロップ(Nanodrop)の機器)によって決定した。SDS−PAGEによって0.1mgの細胞タンパク質を分離し、クーマシーブルー試薬(ピアース)で染色した。45〜60kDaの分子量範囲に相当するゲルのバンドを切り出し、続いてトリプシンを用いてタンパク質をゲル中で消化した。溶出したペプチドを、LCMS/MS(LTQ XLオービトラップ(Orbitrap)、サーモ・サイエンティフィック)による定量化のために、300fmolの同位体標識Ppp2r2d(FFEEPEDPSS[13C−15N−R]−OH)(配列番号628)およびアクチンB(GYSFTTTAE[13C−15N−R]−OH)(配列番号629)ペプチド(21センチュリーバイオケミカルズ(21st Century Biochemicals))でスパイクした。PP2Aの他の調節サブユニットとは
異なるタンパク質の領域から、Ppp2r2dペプチドを選択した。最初に、LacZのshRNAサンプルのLC−MS/MS実行を分析して、モニターしていたPpp2r2dおよびアクチンBペプチドの場所を特定した。逆相カラムから対応する内因性ペプチドで共に溶出させた絶対定量AQUAペプチドは、なおより高いMW(10Da)を有することから、豊富なペプチドのフラグメントイオンを使用して、内因性およびAQUAペプチドに関してピーク強度の比率を決定することを可能にした。3連のサンプルをSDS−PAGE−LC−MS/MSによって分析し、スチューデントの両側t検定を使用したグラフパッド・プリズム6.0ソフトウェアを使用して統計的有意性を決定した(F検定、p=0.0062)。
Ppp2r2dのshRNAの特異性を決定した。変異Ppp2r2dのcDNA(野生型タンパク質配列を有するが、shRNA結合部位に変異したDNA配列を有する)がPpp2r2dのshRNAと共に導入された場合、表現型が逆転することから、Ppp2r2dのshRNA活性は特異的であった(図9、10a〜c)。さらに、OT−ICD8T細胞は、脾臓と比較して腫瘍においてPpp2r2dを過剰発現したころから(あらゆるshRNA発現の非存在下で)、OT−ICD8T細胞は、腫瘍においてT細胞の機能を阻害するシグナル伝達ネットワークの固有の構成要素であることが示唆される(図19)。
OT−IT細胞を、LacZのshRNA、Ppp2r2dのshRNA、Ppp2r2dのshRNAの発現を駆動するレンチウイルスベクターで形質導入した。タンパク質配列は保存されているがshRNA結合部位が破壊された変異Ppp2r2dのcDNAを生成した。フォワードプライマー:GGATCCATGGCAGGAGCTGGAGGC(配列番号630)およびリバースプライマー:GCTAGCATTAATTTTGTCCTGGAATATATACAAGTTATTGGTGG(配列番号631)を使用したRT−PCRにより、野生型Ppp2r2dのcDNAを単離した。フォワードプライマー:TCCATCCCCACCAATGTAACGTGTTTGTTTACAGCAGCAGCAAGG(配列番号634)およびリバースプライマー:AAACAAACACGTTACATTGGTGGGGATGGAACTCTGCGGCAGTGA(配列番号635)を使用したオーバーラップPCR(タンパク質のコード配列を保護する)により、Ppp2r2dのshRNAの標的配列、CCCACATCAGTGCAATGTATT(配列番号632)をTCCCCACCAATGTAACGTGTT(配列番号633)に変異させた(図10a)。野生型と変異Ppp2r2d両方のcDNAを、2Aリボゾームスキップペプチド−GFP配列(細胞中で化学量論的なPpp2r2dおよびGFP発現をもたらす)を用いて改変pLKO.3ベクターにクローニングした。コンストラクトをEL4胸腺腫細胞に導入した。GFP発現EL4細胞をソートして純化し、次いでThy1.1レポーターの発現を駆動するLacZまたはPpp2r2dのshRNAレンチウイルスベクターで形質導入した。shRNAが形質導入された(Thy1.1)細胞を、フローサイトメトリーによってGFP発現に関して分析した。Ppp2r2dのshRNAは、野生型Ppp2r2dの場合、GFPレベルを低減させた。Ppp2r2dのshRNAは、変異Ppp2r2dのcDNAを発現する細胞中でGFPレポーター
の発現を低減させることができなかったことから、shRNA結合部位がうまく変異したことが実証された(図10a)。
またPpp2r2d変異cDNAの発現も、Ppp2r2dのshRNAにより誘導された表現型を予防する(図10b)。1つのベクターでPpp2r2dのshRNAと変異Ppp2r2dのcDNAとの共発現をもたらす変異Ppp2r2dのcDNA−2A−GFPコンストラクトに、Ppp2r2dのshRNAをクローニングした。LacZのshRNA(Thy1.1)、Ppp2r2dのshRNA(アメトリン)またはPpp2r2dのshRNAに加えて変異Ppp2r2dのcDNA(GFP)をコードするレンチウイルスで、OT−IT細胞を別々に感染させた(図10b)。次いでこれらの3つの集団を同じ比率で混合し、14日目のB16−Ova腫瘍を有するマウスに注射した。7日目に、各T細胞集団を、腫瘍および脾臓においてOT−I(CD8Vα2Vβ5)T細胞でのゲーティングにより定量し、続いてThy1.1、アメトリンまたはGFP発現でマーキングされた集団を分析した。腫瘍および脾臓における各T細胞集団のパーセンテージを、Vα2Vβ5T細胞でのゲーティングによって定量し、形質導入された細胞を、Thy1.1またはアメトリン/GFP蛍光レポーターの発現に基づき検出した。図10bに結果を示す。(2回の独立した実験からの代表的なデータ、実験1回当たりn=3匹のマウス)。
図10cは、LacZのshRNA、Ppp2r2dのshRNA、およびPpp2r2dのshRNAに加えてPpp2r2d変異cDNAで形質導入されたOT−IT細胞におけるPpp2r2d発現に関するリアルタイムPCR分析を示す。最大のインビボ活性を有するPpp2r2dのshRNAも、最小レベルのPpp2r2dのmRNAと関連していた(図11)。
試験用または対照shRNAを発現する腫瘍浸潤T細胞のマイクロアレイ分析によれば、各shRNAは、別個の群の遺伝子発現変化を誘導し、一部は特定のshRNA間でオーバーラップしていたことが示された(図12a〜c)。2種の遺伝子(Egr2およびPtpn2)は、T細胞において公知の機能を有する。腫瘍対脾臓における濃縮を、二次スクリーニングからのディープシーケンシング結果に基づき計算した(図12a)。mRNAの平均発現レベルのクラスター化は、LacZ対照shRNAもしくは5つの試験用shRNAsのうち1つを発現する脾臓中のT細胞または腫瘍によって有意に調節されることが見出された(図12b)。有意な発現の差は、LacZ対照shRNAまたは5つの試験用shRNA(Alk、Arhgap5、Egr2、Ptpn2またはPpp2r2d)のうち1つを発現するT細胞間におけるAnovaのp値として、<0.01と定義された(JMP−ゲノミクス6.0、SASインスティテュート社)。クラスター化後に、1つまたはそれより多くの治療群において有意に調節されたmRNAが示される(ファストワード)。図12cは、5つの試験用shRNA(上述したようにAnovaでp<0.01と定義されたシグネチャー)のうち1つで形質導入された腫瘍浸潤T細胞による発現シグネチャー間のオーバーラップを示すベン図である。オーバーラップする楕円で示されるように、5つのシグネチャーのあらゆる組み合わせで多数のオーバーラップするプローブ番号が示される。添付の表に、無作為抽出により予測されるものに対するオーバーラップの有意性(フィッシャーの正確検定)を示す。
実施例3:Ppp2r2dにより誘導されたT細胞の機能の変化
この実施例で、腫瘍におけるPpp2r2dのshRNAにより、T細胞の蓄積、具体的にはT細胞の浸潤、蓄積およびアポトーシスを駆動する細胞メカニズムを試験した。細胞質色素であるCFSEで標識されたOT−ICD8T細胞の移入によって、腫瘍へのT細胞浸潤を査定した。Ppp2r2dまたはLacZのshRNAを発現するOT−IT細胞をCFSEで標識し、B16−Ova腫瘍を有するマウスに注射した。24時間後、形
質導入されたT細胞を腫瘍および脾臓から単離し、フローサイトメトリーによって定量した。LacZまたはPpp2r2dのshRNAを発現するOT−IT細胞を、Thy1.1レポーターを使用して精製し、サイトカインが添加されていない完全RPMI培地中で24時間培養した。フィコール密度勾配遠心分離(シグマ)によって単離された生細胞をCFSE(カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル、インビトロジェン)で標識し、2×10個の標識細胞を、14日目のB16−Ova腫瘍を有するマウスに注射した。CFSE希釈を、移入から24時間ならびに3、5および7日目にフローサイトメトリーによって定量した。加えて、3、5および7日目に、IFNγ、TNFαおよびアイソタイプ対照(BD)に関して細胞内染色を行った。1日目の腫瘍では、Ppp2r2dまたはLacZのshRNAが形質導入されたCD8T細胞の頻度において差は観察されず、これは、T細胞浸潤への実質的な作用の反論となった(図13a)。しかしながら、その後のタイムポイント(3および5日目)の分析から、LacZのshRNAが形質導入されたT細胞と比較した、Ppp2r2dによるより高い程度の増殖(CFSE希釈に基づく)が実証された(図13b、図20a)。またPpp2r2dのshRNAが形質導入されたT細胞は、抗腫瘍免疫にとって重要なサイトカインであるより高いレベルのインターフェロン−γも産生した(図13e)。T細胞の蓄積は、腫瘍では強化されたが腫瘍流入領域リンパ節ではそれより低い程度にしか強化されなかったたことから、Ppp2r2dの作用はT細胞受容体活性化の下流であった。対照的に、関連抗原がT細胞に提示されない無関係のリンパ節または脾臓では、蓄積は観察されなかった(図15)。LacZのshRNAが形質導入されたT細胞については、腫瘍中にこのような細胞は少数しか存在しないにもかかわらず、かなりの程度のT細胞の蓄積も観察された(7日目までにCFSE色素は十分希釈された)。これは、LacZのshRNAが形質導入されたT細胞はアポトーシスによって失われたことを示唆していた。実際に、LacZ対照shRNA(Ppp2r2dのshRNAではなく)が発現された場合(図13g、図20b)、より大きなパーセンテージの腫瘍浸潤T細胞が、活性なカスパーゼ−3に特異的な抗体で標識された。さらに、CD8T細胞とB16−Ova腫瘍細胞との共培養から、LacZのshRNAを発現するT細胞の大部分がアポトーシスを起こしたが(65.7%)、ほとんどのPpp2r2dのshRNAが形質導入されたT細胞が生存可能であった(89.5%、図13c)ことが示された。
LacZまたはPpp2r2dのshRNAを発現するOT−IT細胞を、上述したようにThy1.1発現に基づき精製し、CFSEで標識した。CFSE標識OT−IT細胞(1×10個)を、96−ウェルプレート中のウェル1つ当たり5×10個のB16−Ova細胞と共に72時間培養した。アッセイ前に、B16−Ova細胞を1ng/mLのIFNγに48時間晒し(インビトロで発現されないMHCクラスIを誘導するため)、3回洗浄した。CD8細胞のアネキシンV標識化によって、OT−IT細胞のアポトーシスを検出した(図13c)。BD細胞内染色キットを使用して、ホスホ−AKT(Ser473)、ホスホ−Bad(Ser112)、Bcl−2およびアイソタイプ対照の細胞内染色を48時間行った。CD8T細胞とB16−Ova腫瘍細胞との共培養から、実際に、LacZのshRNAを発現するT細胞の大部分がアポトーシスを起こしたが(65.7%)、Ppp2r2dのshRNAが形質導入されたT細胞の大部分は生存可能であった(89.5%、図13c)ことが示された。CD28共刺激の非存在下でPpp2r2dおよびLacZのshRNAを発現するT細胞を固定されたCD3抗体で刺激したところ、類似の表現型が観察された(図14)。具体的に言えば、B16−Ova細胞(2×10個)を雌C57BL/6マウス(10週齢)の皮下に注射した。12日目に、マウスが保持する類似サイズの腫瘍を7つのグループに分割した(マウス7〜8匹/グループ)。12日目および17日目に、Ppp2r2dまたはLacZのshRNAベクターで感染させた抗CD3/CD28ビーズ活性化CD4TRP−1または/およびCD8OT−IT細胞(それぞれ2×10個のT細胞)を静脈内注射した。B16腫瘍の治療のために、10日目に、Ppp2r2dまたはLacZのshRNAを発現する抗
CD3/CD28ビーズ活性化CD4TRP−1およびCD8pmel−1T細胞(それぞれ3×10個のT細胞)でマウスを治療した。移入後3日毎に腫瘍のサイズを測定し、長さ×幅として計算した。最も長い軸で20mm以上の腫瘍を有するマウスを殺した。
これらの結果から、Ppp2r2dのshRNAが形質導入されたCD8T細胞は、B16−Ova腫瘍細胞によって直接提示されたそれらの抗原を認識する場合であっても、それらは増殖して生存できる可能性があることが示唆された。この概念は、MHCクラスIタンパク質の発現が欠失したb2m−/−マウスへの腫瘍細胞の埋め込みによって試験された24。このようなマウスにおいて、宿主の専門の抗原提示細胞ではなく腫瘍細胞のみが、腫瘍抗原をT細胞に提示することができる。実際に、Ppp2r2dのshRNAが形質導入されたOT−ICD8T細胞は、b2m−/−マウスにおいてB16−Ova腫瘍内では大量の蓄積を示したが(図12f)、Ova抗原の発現が欠失した反対に位置するB16腫瘍では極めて少数のT細胞しか存在しなかった。したがってPpp2r2dのshRNAを発現するT細胞は、好適な共刺激シグナルの欠失および阻害性の微小環境にもかかわらず、腫瘍細胞に応答して効果的に増殖し生存することができた。
また、ナノウェルデバイスを使用した単一細胞レベルでの腫瘍浸潤T細胞のエクスビボの分析も、Ppp2r2dのサイレンシングは、T細胞によるサイトカイン産生を増加させることを実証した(図21a〜c)。脂質二重層において、CD3/CD28抗体によりT細胞を3時間活性化し、続いて抗体でコーティングしたスライド上で1時間サイトカイン捕捉を行った。CD8T細胞は、IFNγ、IL−2およびGM−CSFについてはより高い分泌速度を示し、より大きい割合のT細胞が1種より多くのサイトカインを示した(図21b、c)。細胞内サイトカイン染色によって、より多数のIFNγ産生T細胞の存在が確認された(図21d、図20)。
PP2Aホスファターゼは、触媒サブユニットおよび足場サブユニットで構成され、その基質特異性は、多くの調節サブユニットの1つによって決定される。Ppp2r2dは、分裂間期と後期の際にPP2AをCdk1基質に向かわせることにより、有糸分裂に入らないようにして有糸分裂からの退出を誘導する25。PP2Aは、BAD介在アポトーシスにとってゲートキーパー的な役割を果たす。リン酸化BADは、14−3−3によってサイトゾル中にその不活性型で隔離されるが、脱リン酸化BADはミトコンドリアに標的化されて、そこでBcl−XおよびBcl−2との結合によって細胞死を引き起こす26。またPP2Aホスファターゼは、CD28およびCTLA−4の細胞質内ドメイン、加えてCarma1(NF−κB経路上流)と相互作用することも示されたが、調節サブユニットがこれらの活性に必要であることは知られていなかった。必要な生化学研究に好適なPpp2r2d抗体は現在のところ入手が不可能である。
実施例4:Ppp2r2dのサイレンシングはCD4およびCD8T細胞の抗腫瘍活性を強化する
養子T細胞治療の効能を強化するPpp2r2dのshRNAの能力を査定した。B16−Ova腫瘍細胞(2×10個)を、雌C57BL/6マウス(10週齢)の皮下に注射した。12日目に、マウスが保持する類似サイズの腫瘍を7つのグループ(マウス7〜8匹/グループ)に分割し、それらを、T細胞なし、2×10個のshRNAが形質導入されたTRP−1CD4T細胞、2×10個のshRNAで感染させたOT−ICD8T細胞のいずれか、またはCD4およびCD8T細胞の両方(12日目および17日目)で処理した。12日目および17日目に、グループに応じて、抗CD3/CD28ビーズによって活性化されたCD4TRP−1、または/およびPpp2r2dもしくはLacZのshRNAベクターで感染させたCD8OT−IT細胞(それぞれ2×10個のT細胞)を静脈内注射した。B16腫瘍の治療のために、10日目に、Ppp2r2dまたはLacZのshRNAを発現する抗CD3/CD28ビーズ活性化CD4TRP−1
およびCD8pmel−1T細胞(それぞれ3×10個のT細胞)で、マウスを治療した。移入後3日毎に腫瘍のサイズを測定し、長さ×幅として計算した。最も長い軸で20mm以上の腫瘍を有するマウスを殺した。Ppp2r2d−サイレンシングはCD4およびCD8T細胞の治療活性を改善し、Ppp2r2dのshRNAが形質導入されたCD4およびCD8T細胞を共に投与した場合に相乗効果が観察された(図16a、b)。またPpp2r2dのshRNAは、内因性腫瘍抗原に特異的なT細胞(pmel−1CD8T細胞およびTRP−1CD4T細胞)に導入した場合に抗腫瘍応答も強化した(図16c)。
Ppp2r2dがサイレンシングされたT細胞は、腫瘍においてエフェクター表現型を獲得し(図22a)、細胞の30%より多くがグランザイムBを発現した(図23a)。腫瘍におけるこのようなエフェクターT細胞の著しい増加と一致して(図23b)、タネル染色から、LacZのshRNAではなくPpp2r2dを発現するT細胞が存在する場合、腫瘍においてアポトーシスが増加することが実証された(図23c)。B16黒色腫は高侵襲性の腫瘍であるが、その理由の一つはMHCクラスI発現が極めて低いためである。興味深いことに、LacZのshRNAではなくPpp2r2dを発現するT細胞は、腫瘍細胞によってMHCクラスI発現(H−2Kb)を有意に増加させ(図23d)、これは場合により、T細胞によるIFNγ分泌の増加が観察されたことに起因する可能性がある(図21a〜c、図13e)。Ppp2r2dのshRNAは、腫瘍浸潤T細胞における阻害性PD−1またはLAG−3受容体の発現を低減させないことから、その作用機序は、これらの公知のT細胞の機能の負の調節因子とは異なることが実証される(図22b)。この発見から、これらの細胞内と細胞表面分子とを標的とする組み合わせのアプローチが示唆される。
これらの結果は、複合組織の微小環境における免疫療法のための、新規の標的のインビボにおける発見の実行可能性を確立する。本発明者らは、二次リンパ器官と比較した腫瘍におけるT細胞の蓄積で例示されるような組織間で示差的な作用を有する遺伝子を発見することが可能であることを示した。組織選択的な作用を有する遺伝子について、T細胞の蓄積および生存は、T細胞受容体の制御下である可能性が高いために、関連抗原の提示がない組織では起こらない。インビボで特定の免疫細胞機能の制御を調査するために、本明細書に記載されたアプローチの多くのバリエーションを想定することができる。例えば、腫瘍において重要なT細胞エフェクター機能を制御する遺伝子を発見するために、サイトカインまたは細胞傷害性分子の発現のための蛍光レポーター(グランザイムB、パーフォリン)を本発明者らのアプローチに統合してもよい。
主要な調節スイッチを標的化することは、がんおよび他の病理におけるT細胞の活性を改変する新しいアプローチを提供する可能性がある。このようなT細胞ベースの療法の効能は、腫瘍微小環境におけるT細胞の機能を阻害する遺伝子のshRNA介在サイレンシングによって強化される可能性がある。
他の実施態様
本発明をそれらの詳細な説明と共に説明したが、前述の説明は、本発明の範囲を例示するものであり、それらを限定しないことが意図されており、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されることが理解されるものとする。他の形態、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
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他の実施態様
本発明をそれらの詳細な説明と共に説明したが、前述の説明は、本発明の範囲を例示するものであり、それらを限定しないことが意図されており、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されることが理解されるものとする。他の形態、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
国際出願時の特許請求の範囲の請求項(1)〜(51)
(1) ベクターを含む腫瘍特異性を有する免疫応答性細胞であって、ベクターは、shRNAをコードする配列を含み、shRNAは、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含む、上記免疫応答性細胞。
(2) 免疫応答性細胞が、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞からなる群より選択される、請求項1に記載の免疫応答性細胞。
(3) 免疫応答性細胞が、腫瘍特異的なT細胞受容体を発現する、請求項1に記載の免疫応答性細胞。
(4) 免疫応答性細胞が、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするベクターをさらに含み、CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激性ドメインを含む、請求項1に記載の免疫応答性細胞。
(5) shRNA配列が、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7またはPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、請求項1に記載の免疫応答性細胞。
(6) shRNAが、切断依存性shRNAまたは切断非依存性shRNAから選択される、請求項1に記載の免疫応答性細胞。
(7) 抗原結合ドメインが、腫瘍抗原または病原体抗原と結合する、請求項4に記載の免疫応答性細胞。
(8) 腫瘍抗原が、前立腺特異的な膜抗原(PSMA)、癌胎児性抗原(CEA)、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD333/IL3Ra、c−Met、グリコリピドF77、EGFRvIII、GD−2、NY−ESO−1TCR、ERBB2、BIRC5、CEACAM5、WDR46、BAGE、CSAG2、DCT、MAGED4、GAGE1、GAGE2、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GAGE8、IL13RA2、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEA10、MAGEA12、MAGEB1、MAGEB2、MAGEC2、TP53、TYR、TYRP1、SAGE1、SYCP1、SSX2、SSX4、KRAS、PRAME、NRAS、ACTN4、CTNNB1、CASP8、CDC27、CDK4、EEF2、FN1、HSPA1B、LPGAT1、ME1、HHAT、TRAPPC1、MUM3、MYO1B、PAPOLG、OS9、PTPRK、TPI1、ADFP、AFP、AIM2、ANXA2、ART4、CLCA2、CPSF1、PPIB、EPHA2、EPHA3、FGF5、CA9、TERT、MGAT5、CEL、F4.2、CAN、ETV6、BIRC7、CSF1、OGT、MUC1、MUC2、MUM1、CTAG1A、CTAG2、CTAG、MRPL28、FOLH1、RAGE、SFMBT1、KAAG1、SART1、TSPYL1、SART3、SOX10、TRG、WT1、TACSTD1、SILV、SCGB2A2、MC1R、MLANA、GPR143、OCA2、KLK3、SUPT7L、ARTC1、BRAF、CASP5、CDKN2A、UBXD5、EFTUD2、GPNMB、NFYC、PRDX5、ZUBR1、SIRT2、SNRPD1、HERV−K−MEL、CXorf61、CCDC110、VENTXP1、SPA17、KLK4、ANKRD30A、RAB38、CCND1、CYP1B1、MDM2、MMP2、ZNF395、RNF43、SCRN1、STEAP1、707−AP、TGFBR2、PXDNL、AKAP13、PRTN3、PSCA、RHAMM、ACPP、ACRBP、LCK、RCVRN、RPS2、RPL10A、SLC45A3、BCL2L1、DKK1、ENAH、CSPG4、RGS5、BCR、BCR−ABL、ABL−BCR、DEK、DEK−CAN、ETV6−AML1、LDLR−FUT、NPM1−ALK1、PML−RARA、SYT−SSX1、SYT−SSX2、FLT3、ABL1、AML1、LDLR、FUT1、NPM1、ALK、PML1、RARA、SYT、SSX1、MSLN、UBE2V1、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、WNK2、OAS3、BCL−2、MCL1、CTSH、ABCC3、BST2、MFGE8、TPBG、FMOD、XAGE1、RPSA、COTL1、CALR3、PA2G4、EZH2、FMNL1、HPSE、APC、UBE2A、BCAP31、TOP2A、TOP2B、ITGB8、RPA1、ABI2、CCNI、CDC2、SEPT2、STAT1、LRP1、ADAM17、JUP、DDR1、ITPR2、HMOX1、TPM4、BAAT、DNAJC8、TAPBP、LGALS3BP、PAGE4、PAK2、CDKN1A、PTHLH、SOX2、SOX11、TRPM8、TYMS、ATIC、PGK1、SOX4、TOR3A、TRGC2、BTBD2、SLBP、EGFR、IER3、TTK、LY6K、IGF2BP3、GPC3、SLC35A4、HSMD、H3F3A、ALDH1A1、MFI2、MMP14、SDCBP、PARP12、MET、CCNB1、PAX3−FKHR、PAX3、FOXO1、XBP1、SYND1、ETV5、HSPA1A、HMHA1、TRIM68、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群より選択される、請求項7に記載の免疫応答性細胞。
(9) 抗原結合ドメインが、抗体の抗原結合フラグメントである、請求項4に記載の免疫応答性細胞。
(10) 抗原結合フラグメントが、FabまたはscFvである、請求項9に記載の免疫応答性細胞。
(11) CARが、共刺激ドメインをさらに含む、請求項4に記載の免疫応答性細胞。
(12) ベクターが、プラスミド、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項4に記載の免疫応答性細胞。
(13) キメラ抗原受容体(CAR)およびshRNAをコードする配列をコードする単離された核酸であって、shRNAは、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含み、CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む、上記核酸。
(14) shRNA配列が、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7およびPpp3cc shRNAからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、請求項13に記載の単離された核酸。
(15) 抗原結合ドメインが、抗体の抗原結合フラグメントである、請求項4に記載の単離された核酸。
(16) 抗原結合フラグメントが、FabまたはscFvである、請求項15に記載の単離された核酸。
(17) 抗原結合ドメインが、腫瘍抗原と結合する、請求項13に記載の単離された核酸。
(18) 腫瘍抗原が、黒色腫、癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病、腎臓がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、結腸がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、脳がん、頭頸部がん、皮膚がん、子宮がん、精巣がん、神経膠腫、食道がん、および肝臓がんに関連する、請求項17に記載の単離された核酸。
(19) 腫瘍抗原が、固形腫瘍またはリンパ系の腫瘍に関連する、請求項17に記載の単離された核酸。
(20) 請求項13に記載の核酸を含むベクター。
(21) ベクターが、プラスミド、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項20に記載のベクター。
(22) shRNAをコードする配列が、RNAポリメラーゼIIプロモーターまたはRNAポリメラーゼIIIプロモーターに作動可能に連結している、請求項20に記載のベクター。
(23) 請求項13に記載の核酸を含む、免疫応答性細胞。
(24) 免疫応答性細胞が腫瘍特異的である、請求項23に記載の免疫応答性細胞。
(25) 免疫応答性細胞が、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞からなる群より選択される、請求項24に記載の免疫応答性細胞。
(26) 請求項1または請求項23に記載の免疫応答性細胞および医薬的に許容されるキャリアーを含む組成物。
(27) Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7またはPpp3ccの阻害剤をさらに含む、請求項26に記載の組成物。
(28) 免疫応答性T細胞が、CD8またはCD4T細胞である、請求項26に記載の組成物。
(29) 免疫応答性T細胞が、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞からなる群より選択され、ここで抗原は、腫瘍または病原体抗原である、請求項26に記載の組成物。
(30) キメラ抗原受容体(CAR)をコードする第一のベクターおよびshRNAをコードする配列を含む第二のベクターでトランスフェクトされた免疫応答性細胞であって、shRNAは、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含み;CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む、上記免疫応答性細胞。
(31) 請求項13に記載の核酸分子を内包するヒトT細胞。
(32) 対象におけるがんの治療方法であって、該方法は、腫瘍特異的なT細胞受容体またはキメラ抗原受容体(CAR)およびshRNAを発現するように改変された自己T細胞を対象に投与することを含み、shRNAは、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含み;CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む、上記治療方法。
(33) T細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることによる、それを必要とする対象におけるがんの治療方法であって、該方法は、ベクターを含む免疫応答性細胞を対象に投与することを含み、ここでベクターは、腫瘍特異的なT細胞受容体またはキメラ抗原受容体(CAR)およびshRNA配列をコードし、shRNA配列は、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列によってコードされたmRNA配列に相補的な少なくとも12/15/20/25個の連続したヌクレオチドの配列を含み;CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む、上記治療方法。
(34) ベクターが、プラスミド、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項33に記載の方法。
(35) shRNA配列が、Cblb、Dgka、Dgkz、Entpd1、Fyn、Ptpn2、Smad2、Socs1またはSocs3からなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、請求項1に記載の免疫応答性細胞。
(36) T細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることによる、それを必要とする対象におけるがんの治療方法であって、該方法は、ベクターを含む免疫応答性細胞を対象に投与することを含み、ベクターは、腫瘍特異的なT細胞受容体またはキメラ抗原受容体(CAR)およびshRNA配列をコードし、shRNA配列は、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列によってコードされたmRNA配列に相補的な少なくとも12/15/20/25個の連続したヌクレオチドの配列を含む、上記治療方法。
(37) 免疫応答性T細胞の機能を阻害する遺伝子の同定方法であって、shRNAを発現するベクターを内包する免疫応答性T細胞の集団を用意すること;免疫応答性T細胞の集団を免疫抑制性の腫瘍と接触させること;免疫抑制性の腫瘍内でshRNAがT細胞の機能を回復させるかどうかを決定すること;腫瘍内でT細胞の機能を回復させるshRNAに関連する遺伝子を、腫瘍浸潤T細胞の機能を阻害する遺伝子と同定すること、を含む、上記同定方法。
(38) それを必要とする対象において免疫反応を増加させるための方法であって、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7およびPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の活性をモジュレートする治療剤を投与することを含む、方法。
(39) 治療剤が、小分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される、請求項38に記載の方法。
(40) 腫瘍特異性および免疫抑制に対する増加した耐性を有する免疫応答性細胞を調製するための方法であって、該方法は、腫瘍特異性を有する免疫応答性細胞を提供すること;および、該細胞にshRNAをコードする配列を含むベクターを導入することを含み、shRNAは、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含む、上記方法。
(41) 免疫応答性細胞が、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞からなる群より選択される、請求項40に記載の方法。
(42) 免疫応答性細胞が、腫瘍特異的なT細胞受容体を発現する、請求項40に記載の方法。
(43) 免疫応答性細胞が、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするベクターを含み、
CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激性ドメインを含む、請求項40に記載の方法。
(44) shRNA配列が、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7またはPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、請求項40に記載の方法。
(45) shRNAが、切断依存性shRNAまたは切断非依存性shRNAから選択される、請求項39に記載の方法。
(46) shRNAをコードする配列が、配列番号604〜620または配列番号653〜677のいずれかに相補的な15〜25ヌクレオチドを含む第一の配列および1つのミスマッチを含むかまたはミスマッチを含まない第一の配列の逆の相補物である第二の配列、ならびに第一の配列と第二の配列との間に位置する5〜9ヌクレオチドの第三の配列を含む、請求項1または30に記載の免疫応答性細胞。
(47) 第一の配列が、配列番号604〜620または配列番号653〜677のいずれかに相補的な19〜25ヌクレオチドを含む、請求項46に記載の免疫応答性細胞。
(48) 第二の配列が、第二の配列に完全に相補的である、請求項46に記載の免疫応答性細胞。
(49) shRNAをコードする配列が、配列番号604〜620または配列番号653〜677のいずれかに相補的な15〜25ヌクレオチドを含む第一の配列および1つのミスマッチを含むかまたはミスマッチを含まない第一の配列の逆の相補物である第二の配列、ならびに第一の配列と第二の配列との間に位置する5〜9ヌクレオチドの第三の配列を含む、請求項13に記載の単離された核酸分子。
(50) 第一の配列が、配列番号604〜620または配列番号653〜677のいずれかに相補的な19〜25ヌクレオチドを含む、請求項49に記載の単離された核酸分子。
(51) 第二の配列が、第二の配列に完全に相補的である、請求項49に記載の単離された核酸分子。

Claims (51)

  1. ベクターを含む腫瘍特異性を有する免疫応答性細胞であって、ベクターは、shRNAをコードする配列を含み、
    shRNAは、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含む、上記免疫応答性細胞。
  2. 免疫応答性細胞が、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞からなる群より選択される、請求項1に記載の免疫応答性細胞。
  3. 免疫応答性細胞が、腫瘍特異的なT細胞受容体を発現する、請求項1に記載の免疫応答性細胞。
  4. 免疫応答性細胞が、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするベクターをさらに含み、
    CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激性ドメインを含む、請求項1に記載の免疫応答性細胞。
  5. shRNA配列が、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7またはPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、請求項1に記載の免疫応答性細胞。
  6. shRNAが、切断依存性shRNAまたは切断非依存性shRNAから選択される、請求項1に記載の免疫応答性細胞。
  7. 抗原結合ドメインが、腫瘍抗原または病原体抗原と結合する、請求項4に記載の免疫応答性細胞。
  8. 腫瘍抗原が、前立腺特異的な膜抗原(PSMA)、癌胎児性抗原(CEA)、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD333/IL3Ra、c−Met、グリコリピドF77、EGFRvIII、GD−2、NY−ESO−1TCR、ERBB2、BIRC5、CEACAM5、WDR46、BAGE、CSAG2、DCT、MAGED4、GAGE1、GAGE2、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GAGE8、IL13RA2、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEA10、MAGEA12、MAGEB1、MAGEB2、MAGEC2、TP53、TYR、TYRP1、SAGE1、SYCP1、SSX2、SSX4、KRAS、PRAME、NRAS、ACTN4、CTNNB1、CASP8、CDC27、CDK4、EEF2、FN1、HSPA1B、LPGAT1、ME1、HHAT、TRAPPC1、MUM3、MYO1B、PAPOLG、OS9、PTPRK、TPI1、ADFP、AFP、AIM2、ANXA2、ART4、CLCA2、CPSF1、PPIB、EPHA2、EPHA3、FGF5、CA9、TERT、MGAT5、CEL、F4.2、CAN、ETV6、BIRC7、CSF1、OGT、MUC1、MUC2、MUM1、CTAG1A、CTAG2、CTAG、MRPL28、FOLH1、RAGE、SFMBT1、KAAG1、SART1、TSPYL1、SART3、SOX10、TRG、WT1、TACSTD1、SILV、SCGB2A2、
    MC1R、MLANA、GPR143、OCA2、KLK3、SUPT7L、ARTC1、BRAF、CASP5、CDKN2A、UBXD5、EFTUD2、GPNMB、NFYC、PRDX5、ZUBR1、SIRT2、SNRPD1、HERV−K−MEL、CXorf61、CCDC110、VENTXP1、SPA17、KLK4、ANKRD30A、RAB38、CCND1、CYP1B1、MDM2、MMP2、ZNF395、RNF43、SCRN1、STEAP1、707−AP、TGFBR2、PXDNL、AKAP13、PRTN3、PSCA、RHAMM、ACPP、ACRBP、LCK、RCVRN、RPS2、RPL10A、SLC45A3、BCL2L1、DKK1、ENAH、CSPG4、RGS5、BCR、BCR−ABL、ABL−BCR、DEK、DEK−CAN、ETV6−AML1、LDLR−FUT、NPM1−ALK1、PML−RARA、SYT−SSX1、SYT−SSX2、FLT3、ABL1、AML1、LDLR、FUT1、NPM1、ALK、PML1、RARA、SYT、SSX1、MSLN、UBE2V1、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、WNK2、OAS3、BCL−2、MCL1、CTSH、ABCC3、BST2、MFGE8、TPBG、FMOD、XAGE1、RPSA、COTL1、CALR3、PA2G4、EZH2、FMNL1、HPSE、APC、UBE2A、BCAP31、TOP2A、TOP2B、ITGB8、RPA1、ABI2、CCNI、CDC2、SEPT2、STAT1、LRP1、ADAM17、JUP、DDR1、ITPR2、HMOX1、TPM4、BAAT、DNAJC8、TAPBP、LGALS3BP、PAGE4、PAK2、CDKN1A、PTHLH、SOX2、SOX11、TRPM8、TYMS、ATIC、PGK1、SOX4、TOR3A、TRGC2、BTBD2、SLBP、EGFR、IER3、TTK、LY6K、IGF2BP3、GPC3、SLC35A4、HSMD、H3F3A、ALDH1A1、MFI2、MMP14、SDCBP、PARP12、MET、CCNB1、PAX3−FKHR、PAX3、FOXO1、XBP1、SYND1、ETV5、HSPA1A、HMHA1、TRIM68、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群より選択される、請求項7に記載の免疫応答性細胞。
  9. 抗原結合ドメインが、抗体の抗原結合フラグメントである、請求項4に記載の免疫応答性細胞。
  10. 抗原結合フラグメントが、FabまたはscFvである、請求項9に記載の免疫応答性細胞。
  11. CARが、共刺激ドメインをさらに含む、請求項4に記載の免疫応答性細胞。
  12. ベクターが、プラスミド、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項4に記載の免疫応答性細胞。
  13. キメラ抗原受容体(CAR)およびshRNAをコードする配列をコードする単離された核酸であって、
    shRNAは、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含み、
    CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む、上記核酸。
  14. shRNA配列が、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、
    Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7およびPpp3cc shRNAからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、請求項13に記載の単離された核酸。
  15. 抗原結合ドメインが、抗体の抗原結合フラグメントである、請求項4に記載の単離された核酸。
  16. 抗原結合フラグメントが、FabまたはscFvである、請求項15に記載の単離された核酸。
  17. 抗原結合ドメインが、腫瘍抗原と結合する、請求項13に記載の単離された核酸。
  18. 腫瘍抗原が、黒色腫、癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病、腎臓がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、結腸がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、脳がん、頭頸部がん、皮膚がん、子宮がん、精巣がん、神経膠腫、食道がん、および肝臓がんに関連する、請求項17に記載の単離された核酸。
  19. 腫瘍抗原が、固形腫瘍またはリンパ系の腫瘍に関連する、請求項17に記載の単離された核酸。
  20. 請求項13に記載の核酸を含むベクター。
  21. ベクターが、プラスミド、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項20に記載のベクター。
  22. shRNAをコードする配列が、RNAポリメラーゼIIプロモーターまたはRNAポリメラーゼIIIプロモーターに作動可能に連結している、請求項20に記載のベクター。
  23. 請求項13に記載の核酸を含む、免疫応答性細胞。
  24. 免疫応答性細胞が腫瘍特異的である、請求項23に記載の免疫応答性細胞。
  25. 免疫応答性細胞が、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞からなる群より選択される、請求項24に記載の免疫応答性細胞。
  26. 請求項1または請求項23に記載の免疫応答性細胞および医薬的に許容されるキャリアーを含む組成物。
  27. Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7またはPpp3ccの阻害剤をさらに含む、請求項26に記載の組成物。
  28. 免疫応答性T細胞が、CD8またはCD4T細胞である、請求項26に記載の組成物。
  29. 免疫応答性T細胞が、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞からなる群より選択され、ここで抗原は、腫瘍または病原体抗原である、請求項26に記載の組成物。
  30. キメラ抗原受容体(CAR)をコードする第一のベクターおよびshRNAをコードする配列を含む第二のベクターでトランスフェクトされた免疫応答性細胞であって、
    shRNAは、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含み;
    CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む、上記免疫応答性細胞。
  31. 請求項13に記載の核酸分子を内包するヒトT細胞。
  32. 対象におけるがんの治療方法であって、該方法は、腫瘍特異的なT細胞受容体またはキメラ抗原受容体(CAR)およびshRNAを発現するように改変された自己T細胞を対象に投与することを含み、
    shRNAは、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含み;
    CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む、上記治療方法。
  33. T細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることによる、それを必要とする対象におけるがんの治療方法であって、
    該方法は、ベクターを含む免疫応答性細胞を対象に投与することを含み、ここでベクターは、腫瘍特異的なT細胞受容体またはキメラ抗原受容体(CAR)およびshRNA配列をコードし、
    shRNA配列は、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列によってコードされたmRNA配列に相補的な少なくとも12/15/20/25個の連続したヌクレオチドの配列を含み;
    CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む、上記治療方法。
  34. ベクターが、プラスミド、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項33に記載の方法。
  35. shRNA配列が、Cblb、Dgka、Dgkz、Entpd1、Fyn、Ptpn2、Smad2、Socs1またはSocs3からなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、請求項1に記載の免疫応答性細胞。
  36. T細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることによる、それを必要とする対象におけるがんの治療方法であって、
    該方法は、ベクターを含む免疫応答性細胞を対象に投与することを含み、ベクターは、腫瘍特異的なT細胞受容体またはキメラ抗原受容体(CAR)およびshRNA配列をコードし、
    shRNA配列は、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列によってコードされたmRNA配列に相補的な少なくとも12/15/20/25個の連続したヌクレオチドの配列を含む、上記治療方法。
  37. 免疫応答性T細胞の機能を阻害する遺伝子の同定方法であって、
    shRNAを発現するベクターを内包する免疫応答性T細胞の集団を用意すること;
    免疫応答性T細胞の集団を免疫抑制性の腫瘍と接触させること;
    免疫抑制性の腫瘍内でshRNAがT細胞の機能を回復させるかどうかを決定すること;
    腫瘍内でT細胞の機能を回復させるshRNAに関連する遺伝子を、腫瘍浸潤T細胞の機能を阻害する遺伝子と同定すること
    を含む、上記同定方法。
  38. それを必要とする対象において免疫反応を増加させるための方法であって、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7およびPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の活性をモジュレートする治療剤を投与することを含む、方法。
  39. 治療剤が、小分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される、請求項38に記載の方法。
  40. 腫瘍特異性および免疫抑制に対する増加した耐性を有する免疫応答性細胞を調製するための方法であって、該方法は、
    腫瘍特異性を有する免疫応答性細胞を提供すること;および
    該細胞にshRNAをコードする配列を含むベクターを導入すること
    を含み、
    shRNAは、配列番号604〜620および653〜677からなる群より選択される核酸配列に相補的な15個の連続したヌクレオチドを含む、上記方法。
  41. 免疫応答性細胞が、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびCD4T細胞からなる群より選択される、請求項40に記載の方法。
  42. 免疫応答性細胞が、腫瘍特異的なT細胞受容体を発現する、請求項40に記載の方法。
  43. 免疫応答性細胞が、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするベクターを含み、
    CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激性ドメインを含む、請求項40に記載の方法。
  44. shRNA配列が、Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7またはPpp3ccからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、請求項40に記載の方法。
  45. shRNAが、切断依存性shRNAまたは切断非依存性shRNAから選択される、請求項39に記載の方法。
  46. shRNAをコードする配列が、配列番号604〜620または配列番号653〜677のいずれかに相補的な15〜25ヌクレオチドを含む第一の配列および1つのミスマッチを含むかまたはミスマッチを含まない第一の配列の逆の相補物である第二の配列、ならびに第一の配列と第二の配列との間に位置する5〜9ヌクレオチドの第三の配列を含む、請求項1または30に記載の免疫応答性細胞。
  47. 第一の配列が、配列番号604〜620または配列番号653〜677のいずれかに相補的な19〜25ヌクレオチドを含む、請求項46に記載の免疫応答性細胞。
  48. 第二の配列が、第二の配列に完全に相補的である、請求項46に記載の免疫応答性細胞。
  49. shRNAをコードする配列が、配列番号604〜620または配列番号653〜677のいずれかに相補的な15〜25ヌクレオチドを含む第一の配列および1つのミスマッチを含むかまたはミスマッチを含まない第一の配列の逆の相補物である第二の配列、ならびに第一の配列と第二の配列との間に位置する5〜9ヌクレオチドの第三の配列を含む、請求項13に記載の単離された核酸分子。
  50. 第一の配列が、配列番号604〜620または配列番号653〜677のいずれかに相補的な19〜25ヌクレオチドを含む、請求項49に記載の単離された核酸分子。
  51. 第二の配列が、第二の配列に完全に相補的である、請求項49に記載の単離された核酸分子。
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