WO2022190566A1

WO2022190566A1 - 関節症治療剤の製造方法及び関節症治療剤

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Publication number: WO2022190566A1
Application number: PCT/JP2021/047431
Authority: WO
Inventors: 健太郎中村; 俊弼富永; 一郎関矢; 満水野; 尚子片野; 信武大関
Original assignee: 富士フイルム株式会社; 国立大学法人東京医科歯科大学
Priority date: 2021-03-12
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2022-09-15
Also published as: AU2021432587A1; US20230414669A1; KR20230145129A; CN117355314A; EP4292599A1; JPWO2022190566A1

Abstract

培養している複数の間葉系幹細胞を含む集団を撮影することにより、細胞画像を取得し、細胞画像を解析することにより、細胞画像内の間葉系幹細胞の密度情報を導出し、密度情報に基づいて、集団において間葉系幹細胞が形成するコロニーを検出し、検出されるコロニーから導出される平均コロニーサイズ又はコロニー形成単位に基づいて、集団の選別を行う、関節症治療剤の製造方法、及び上記関節症治療剤の製造方法により製造される関節症治療剤。

Description

関節症治療剤の製造方法及び関節症治療剤

　本開示は、関節症治療剤の製造方法及び関節症治療剤に関する。

　整形外科領域において、関節軟骨損傷及び半月板損傷等の関節症は、日常的な診療行為の対象として頻繁に見られ、多数の患者がいる疾病として広く認識されている。
　軟骨損傷又は半月板損傷に対する外科的治療の一例として、損傷部における破片を取り除く外科的処置が行われる。
　上記処置により、病状の進行が抑制されるともに組織の自己再生を促されるが、組織の自己再生は十分ではなかった。

　一方、近年の再生医療技術の進歩により、細胞治療が盛んになっている。特に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ）は、有用な細胞治療の細胞源として期待されている。間葉系幹細胞は、種々の生体組織から採取が可能であり、骨髄組織（Prockop, D.J., 1997, Science. 276:71-4）、脂肪組織（Zuk, P.A. et al., 2002, Mol Biol Cell. 13:4279-95）、筋肉組織（Cao et al., 2003, Nat Cell Biol. 5:640-6）、滑膜組織（De Bari, C. et al., 2001, Arthritis Rheum. 44:1928-42）及び骨膜組織（Fukumoto, T. et al., 2003, OsteoarthritisCartilage. 11:55-64）等から単離できることが報告されている。
　また、滑膜由来間葉系幹細胞は、骨髄等のさまざまな間葉系組織由来の間葉系幹細胞に比べて優れた増殖能及び軟骨形成能を有することが報告されている（Sakaguchi, et al. , 2005, Arthritis Rhum. 52:2521-9）。

　間葉系幹細胞は、培養により所望の数となるまで増殖が実施された後に、関節症治療剤として、損傷部への移植が行われるが、間葉系幹細胞が、移植を実施する日までに所望の数に達するか否かの情報は重要であり、培養期間の途中で上記の情報が得られることが強く望まれる。

　上記要求に対し、例えば、特開２０１９－４７９４号公報では、第１時点の間葉系幹細胞の培養状態に基づいて、間葉系幹細胞の将来の増殖状態を予測するための指標を算出する算出ステップと、指標と判別式とに基づいて、第１時点よりも後の第２時点の間葉系幹細胞の増殖状態を予測する予測ステップと、を含む増殖予測方法が提案される。

　間葉系幹細胞が形成するコロニーは、上皮様細胞及びリンパ芽球様細胞等の他の細胞のコロニーとは異なり、境界が不明瞭である。
　特開２０１９－４７９４号公報においては、ある細胞から一定の距離に存在する細胞数をカウントし、４つ以上の細胞が確認されたときにコロニーであると判定している。
　本発明者らは、特開２０１９－４７９４号公報の増殖予測方法において採用されるコロニー判定方法では、増殖した間葉系幹細胞が密集して存在する場合には、これらの細胞は１つのコロニーに属すると判定されることとなり、１つのコロニーに属する細胞数が大きくなりすぎ、正確な増殖予測が困難となるおそれがあるという新たな知見を見出した。

　本開示は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、培養の途中において間葉系幹細胞の増殖予測を優れた精度で行うことができ、関節症治療に適した関節症治療剤を製造することができる、関節症治療剤の製造方法及び上記関節症治療剤の製造方法により製造される関節症治療剤を提供することである。

＜１＞　培養している複数の間葉系幹細胞を含む集団を撮影することにより、細胞画像を取得し、
　細胞画像を解析することにより、細胞画像内の間葉系幹細胞の密度情報を導出し、
　密度情報に基づいて、集団において間葉系幹細胞が形成するコロニーを検出し、
　検出されるコロニーから導出される平均コロニーサイズ及びコロニー形成単位の少なくとも一方に基づいて、集団の選別を行う、
関節症治療剤の製造方法。
＜２＞　密度情報が、カーネル密度推定により導出される、細胞画像における間葉系幹細胞の推定密度分布である、＜１＞に記載の関節症治療剤の製造方法。
＜３＞　コロニーの検出が、推定密度分布を参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行い、推定密度分布内の同じ極大点に収束する間葉系幹細胞の集まりをコロニーとして検出することにより行われる、＜２＞に記載の関節症治療剤の製造方法。
＜４＞　コロニーの検出が、培養開始日から４日目～６日目において行われ、
　集団の選別が、下記条件ａ１）及び条件ｂ１）の少なくとも一方を満たす集団を選別することにより行われる、＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の関節症治療剤の製造方法。
ａ１）培養開始日から４日目～６日目のいずれかの時点における集団に含まれる間葉系幹細胞の平均コロニーサイズが０．７４０ｍｍ以上である。
ｂ１）培養開始日から４日目～６日目のいずれかの時点における集団に含まれる間葉系幹細胞のコロニー形成単位が０．２５０／ｍｍ^２以上である。
＜５＞　間葉系幹細胞が、生体組織を酵素により処理することにより得られる、＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の関節症治療剤の製造方法。
＜６＞　生体組織の酵素による処理において、コラゲナーゼ及び中性プロテアーゼを少なくとも１種ずつ含む、酵素混合物が使用される、＜５＞に記載の関節症治療剤の製造方法。
＜７＞　生体組織の酵素による処理において、酵素の使用量に対する生体組織の使用量の比が、質量基準で、１０～１０００である、＜５＞又は＜６＞に記載の関節症治療剤の製造方法。
＜８＞　間葉系幹細胞が、生体組織の酵素による処理により得られる組織消化液を、上清中の残存酵素濃度が０．５ｎｇ／ｍＬ以下となるまで洗浄することにより得られる、＜５＞～＜７＞のいずれか１つに記載の関節症治療剤の製造方法。
＜９＞　間葉系幹細胞が、滑膜由来の細胞である、＜１＞～＜８＞のいずれか１つに記載の関節症治療剤の製造方法。
＜１０＞　間葉系幹細胞が、ヒト由来の細胞である、＜１＞～＜９＞のいずれか１つに記載の関節症治療剤の製造方法。
＜１１＞　＜１＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の関節症治療剤の製造方法により製造される、関節症治療剤。

　本開示によれば、培養の途中において間葉系幹細胞の増殖予測を優れた精度で行うことができ、関節症治療に適した関節症治療剤を製造することができる、関節症治療剤の製造方法及び上記関節症治療剤の製造方法により製造される関節症治療剤を提供することができる。

図１は、細胞画像解析装置等を示す図である。図２は、細胞画像解析装置を構成するコンピュータを示すブロック図である。図３は、細胞画像解析装置のＣＰＵの処理部を示すブロック図である。図４は、密度情報導出部の詳細を示す図である。図５は、カーネル密度推定の概略を示すグラフである。図６は、ｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔの概略を示すグラフである。図７は、ｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔの概略を示すグラフである。図８は、検出結果の詳細を示す図である。図９は、評価情報の詳細を示す図である。図１０は、コロニーのサイズを示す図である。図１１は、細胞画像表示画面を示す図である。図１２は、解析結果表示画面を示す図である。図１３は、特定領域に対して、３種のバンド幅にてカーネル密度推定を行うことにより、３種の推定密度分布を導出する様子を示す図である。図１４は、特定領域に対して、３種の推定密度分布のそれぞれを参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行うことにより、３種の推定密度分布に対応する３種のコロニーの検出結果を出力する様子を示す図である。図１５は、指定画面を示す図である。図１６は、指示受付部においてバンド幅の指定を受け付ける様子を示す図である。図１７は、細胞画像解析装置の処理手順を示すフローチャートである。図１８は、細胞画像解析装置の処理手順を示すフローチャートである。図１９は、評価情報の別の例を示す図である。図２０は、評価情報のさらに別の例を示す図である。図２１は、１培養日数当たりの平均コロニーサイズの変化量が閾値未満であった場合に、警告を表示する態様を示す図である。図２２は、指定バンド幅の指定方法の別の例を示すフローチャートである。図２３は、細胞画像における線維芽様細胞の面積率が設定範囲内であった場合に限り、密度情報の導出およびコロニーの検出を実行する第２実施形態を示す図である。図２４は、第２実施形態の別の例を示す図である。図２５は、第２実施形態のさらに別の例を示す図である。図２６は、図２３～図２５で示した態様を、縦軸を面積率、横軸を培養日数としたグラフにまとめた図である。図２７は、面積率が設定範囲外であった場合の細胞画像表示画面を示す図である。図２８は、予め設定された探索枠内の線維芽様細胞の個数を、密度情報として導出する第３実施形態を示す図である。図２９は、細胞画像内の複数の領域に探索枠を順次走査する様子を示す図である。図３０は、探索枠内の線維芽様細胞の個数がコロニー条件を満たした場合を示す図である。図３１は、機械学習モデルを用いて画像解析を行う第４実施形態を示す図である。図３２は、機械学習モデルの学習フェーズにおける処理の概要を示す図である。

　以下、本開示を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本開示は下記実施形態に限定されるものではない。下記実施形態において、その構成要素は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本開示を制限するものではない。

　本開示において「間葉系幹細胞」とは、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞である。
　間葉系幹細胞は骨髄、滑膜、骨膜、脂肪組織、筋肉組織に存在することが知られており、そして骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、及び筋細胞に分化する能力を有することが知られている。間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化に関連して、ＢＭＰ又はＴＧＦ－βを培養液に添加することにより、未分化間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化が促進され、そして軟骨組織がｉｎ　ｖｉｔｒｏ条件下で再生できることが知られている。

　間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞に特徴的な分子（酵素、レセプター及び低分子化合物等）を検出して確認することができる。
　間葉系幹細胞に特徴的な分子としては、細胞表面マーカー（ポジティブマーカー）であるＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　また、間葉系幹細胞には発現していない細胞表面マーカー（ネガティブマーカー）としては、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄ－Ｒｅｌａｔｅｄ）、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　上記ポジティブマーカー及びネガティブマーカーを利用して、間葉系幹細胞であることを確認することができる。
　これらのマーカーの検出には免疫学的方法を利用できるが、各分子のｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。

　本開示において、「集団」とは、間葉系幹細胞の培養を実施する系を意味し、集団内において、間葉系幹細胞は、コロニーを形成する。

　本開示において、「平均コロニーサイズ」とは、間葉系幹細胞が形成するコロニーのサイズの平均値を意味する。
　コロニーサイズが一定以下の場合、孤立した細胞や培地中のゴミが検出される可能性が高くなる。そのため、本開示においては、平均コロニーサイズの測定は、コロニーサイズ０．５４ｍｍ超のコロニーに対して実施する。
　本開示において、「コロニー形成単位」は、ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ　Ｆｏｒｍｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）とも呼ばれ、細胞画像１ｍｍ^２あたりにおけるコロニーの個数を意味する。なお、細胞画像については、後述する。

　本開示において、「関節症」とは、関節の損傷、損害又は炎症を伴う疾患である。
　より具体的には、関節症としては、例えば、半月板損傷、外傷性軟骨損傷、離断性骨軟骨炎、無腐性骨壊死、変形性関節症（例えば、変形性膝関節症、変形性肘関節症及び変形性肩関節症等）、関節リウマチ（例えば、慢性関節リウマチ）、痛風、反応性関節炎、乾癖性関節炎、若年性関節炎、炎症性関節炎及び関節軟骨欠損などが挙げられるが、これらに限定するものではない。

　本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
　本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。

（関節症治療剤の製造方法）
　本開示に係る関節症治療剤の製造方法は、
　培養している複数の間葉系幹細胞を含む集団を撮影することにより、細胞画像を取得し、
　細胞画像を解析することにより、細胞画像内の間葉系幹細胞の密度情報を導出し、
　密度情報に基づいて、集団における間葉系幹細胞のコロニーを検出し、
　検出されるコロニーから導出される平均コロニーサイズ及びコロニー形成単位の少なくとも一方に基づいて、集団の選別を行う。

　本開示の関節症治療剤の製造方法によれば、培養の途中において間葉系幹細胞の増殖予測を優れた精度で行うことができ、関節症治療に適した関節症治療剤を製造することができる、関節症治療剤の製造方法を提供することができる。

　上記効果が奏される理由は以下のように推測されるが、これに限定されない。
　上記したように、特開２０１９－４７９４号公報等で提案される従来の間葉系幹細胞の増殖予測は、間葉系幹細胞が形成するコロニーの境界の不明瞭さから、コロニーの検出を優れた精度で行うことが困難な場合があり、増殖予測の正確性に改善の余地があった。
　本開示の関節症治療剤の製造方法においては、間葉系幹細胞の密度情報を導出し、密度情報に基づいて間葉系幹細胞のコロニーを検出しており、間葉系幹細胞のコロニーを優れた精度で検出することが可能である。
　優れた精度で検出されたコロニーの情報から、平均コロニーサイズ及びコロニー形成単位を導出し、これに基づき、間葉系幹細胞の増殖の程度及び増殖速度等に優れる集団の選別を実施することにより、関節症治療に適した関節症治療剤を製造することができると推測される。

　（間葉系幹細胞の培養）
　間葉系幹細胞の培養は、通常の動物細胞の培養に用いられる培地を使用することができる。
　培地としては、例えば、α－ＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ及びＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２＝１：１）、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＲＰＭＩ１６４０培地等）、ＤＭＥＭ及びＦ１２の混合培地とＲＰＭＩ培地との混合培地（ＤＭＥＭ及びＦ１２の混合培地：ＲＰＭＩ培地＝１：１）等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　なお、括弧内の比は、質量基準の比である。

　培地は、血清を含む培地でもあってもよく、血清を含まない培地であってもよい。
　生体への移植を目的として、自己の組織から間葉系幹細胞を製造する場合には、培地は、同種血清を含有するものであってもよい。
　即ち、ヒトへの移植を目的として、ヒトの組織から間葉系幹細胞を製造する場合には、ヒト血清を含む培地を使用してもよい。
　血清を使用する場合、自己の血清であってもよいし、同種異型の血清であってもよいが、好ましくは自己の血清である。血清を使用する場合には、培地における血清の添加量は、２０体積％以下であることが好ましく、１０体積％以下であることがより好ましい。

　細胞の培養条件は特に限定されず、通常の細胞培養の条件を採用できる。
　例えば、細胞培養の温度は、３０℃～４０℃とすることができる。
　また、細胞培養のＣＯ_２濃度は、３％～７％とすることができる。
　一例としては、温度３７℃、ＣＯ_２濃度５％の条件とすることができるが、これに限定されるものではない。

　培養期間中は、培地の交換を行わないことが好ましい。
　また、培養期間が１０日間以上となる場合、間葉系幹細胞以外の他の細胞と共培養されることなく、間葉系幹細胞が培養されることが好ましい。

　間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化は、培養期間が長くなるほど進行する。
　そのため、培養期間が特定の長さを超えると間葉系幹細胞のｉｎ　ｓｉｔｕでの軟骨形成能は低下することが知られている。
　間葉系幹細胞を未分化かつ良好なｉｎ　ｓｉｔｕ軟骨形成能を有する状態で増殖させるために、培養期間を調整することが好ましい。
　また、移植した間葉系幹細胞により患部を再生させるためには、集団は、未分化の間葉系幹細胞をある程度含んでいる必要がある。
　これらを考慮すると、培養期間は、５日間以上であることが好ましく、７日間以上であることがより好ましく、１０日間以上であることがさらに好ましい。
　また、培養期間は２８日以下であることが好ましく、２１日以下であることがより好ましく、１７日以下であることがさらに好ましい。

　間葉系幹細胞を、トランスフォーミング増殖因子β３（ＴＧＦ－β３）、デキサメタゾン又は骨形成因子２（ＢＭＰ－２）を添加した培地で培養することにより、軟骨細胞に分化し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで軟骨組織を製造可能であることが知られている。
　従って、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化抑制の観点からは、上記した培地は、ＴＧＦ－β３、デキサメタゾン及びＢＭＰ－２を含まないことが好ましい。

　間葉系幹細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの間葉系幹細胞の継代数と反比例して、ｉｎ　ｓｉｔｕ軟骨形成能が低下することも知られている。
　そのため、製造される間葉系幹細胞は、初代又は第１継代の間葉系幹細胞であることが好ましい。

　酵素処理後の間葉系幹細胞を培地へ播種する際、細胞密度が、１００個／ｃｍ^２～５０００個／ｃｍ^２となるように播種することが好ましく、２００個／ｃｍ^２～４５００個／ｃｍ^２となるように播種することがより好ましく、３００個／ｃｍ^２～２５００個／ｃｍ^２となるように播種することがさらに好ましく、４００個／ｃｍ^２～２０００個／ｃｍ^２となるように播種することが特に好ましい。

　関節症治療剤としての適性の観点から、培養終了時に回収される細胞数は、０．５×１０^７個が好ましく、１．０×１０^７個以上がより好ましく、２．０×１０^７個以上がさらに好ましい。
　また、培養終了時に回収される細胞数は、３．０×１０^７細胞以上であってもよく、４．０×１０^７細胞以上であってもよく、５．０×１０^７細胞以上であってもよく、６．０×１０^７細胞以上であってもよい。

　以下、本開示の関節症治療剤の製造方法に使用する間葉系幹細胞について説明するが、これに限定されるものではない。
　間葉系幹細胞の由来生物は、特に限定されるものではないが、哺乳類動物由来の細胞であることが好ましく、霊長類動物由来の細胞であることがより好ましく、ヒト由来の細胞であることが特に好ましい。

　間葉系幹細胞は、生体組織を酵素処理することにより得ることができる。
　生体組織としては、例えば、滑膜組織、骨髄組織、骨膜組織、脂肪組織及び筋肉組織等が挙げられる。これらの中でも、製造される関節症治療剤が、半月板治療剤及び変形性関節症治療剤等の関節症に特に有用であるという観点から、滑膜組織を酵素処理することにより得られる間葉系幹細胞（滑膜由来の間葉系幹細胞）が好ましい。
　例えば、滑膜組織は、麻酔下で関節の非荷重部分から採取することができる。

　滑膜由来の間葉系幹細胞であるか否かは、例えば、細胞表面マーカー発現の有無及び軟骨分化能を確認することにより判定可能である。
　滑膜由来間葉系幹細胞は、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５陰性であり、軟骨分化能を有する。

　生体組織は、単一ドナー由来の生体組織であってもよく、複数のドナーに由来する生体組織であってもよいが、好ましくは単一ドナー由来の生体組織である。

　ヒトへの移植を目的として、滑膜由来間葉系幹細胞を製造する場合、好ましくは患者と組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された生体組織を使用することが好ましい。
　より好ましくは、滑膜が採取される対象と、滑膜由来間葉系幹細胞が移植される対象とが、同一対象である。即ち、患者自身より採取された滑膜組織を使用すること（自家移植）が好ましい。

　生体組織の採取量は、ドナーの種類及び必要とされる間葉系幹細胞の量を考慮し、適宜変更することが好ましい。
　例えば、採取量は、０．１０ｇ～１０.００ｇが好ましく、０．２０ｇ～５．００ｇがより好ましく、０．３０ｇ～４．５０ｇがさらに好ましい。
　採取した生体組織は、必要に応じてハサミ等で細断した後、後記する酵素処理に供される。

　酵素としては、プロテアーゼを含む酵素であれば特に限定されないが、生体組織での消化速度の観点から、好ましくは、コラゲナーゼ及び中性プロテアーゼを少なくとも１種ずつ含む混合酵素である。
　特に好ましい酵素は、リベラーゼである。リベラーゼとしては、例えば、リベラーゼＭＮＰ－Ｓ（エフ・ホフマン・ラ・ロシュ製）を使用することができるが、これはコラゲナーゼクラスＩとコラゲナーゼクラスＩＩと中性プロテアーゼ（サーモシリン）とを含む酵素である。

　酵素反応は、酵素を含む水溶液中で行うことができ、ヒト血清を含む水溶液を用いても
よい。ヒト血清は、自己の血清であってもよいし、同種異型の血清であってもよいが、好
ましくは自己の血清である。
　水溶液における酵素濃度は、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは０．５ｍ
ｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌであり、さらに一層好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ～５．０ｍｇ
／ｍｌであり、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌであり、最も好まし
くは０．７ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌである。

　生体組織の酵素による処理において、酵素の使用量に対する生体組織の使用量の比（生体組織の使用量／酵素の使用量）は、質量基準で、１０～１０００であることが好ましく、２０～５００であることがより好ましく、４０～２００であることがさらに好ましい。

　酵素反応温度は、１５℃～４５℃が好ましく、２０℃～４３℃がより好ましく、２５℃～４０℃がさらに好ましい。
　酵素反応時間は、４５分～１８０分が好ましく、６０分～１８０分がより好ましく、９０分～１８０分がさらに好ましく、１２０分～１８０分が特に好ましい。
　生体組織を酵素処理することにより得られる混合物（以下、組織消化液ともいう。）には、間葉系幹細胞が含まれており、セルストレーナーを通して遠沈管に移し、遠心処理することにより、間葉系幹細胞を回収することができる。
　遠心条件は、特に限定されるものではないが、例えば、遠心力２００ｇ～６００ｇ、遠心時間１分間～１０分間とすることができる。

　酵素処理により得られた混合物に対し、洗浄を１回以上行ってもよい。洗浄を複数回行うことが好ましく、洗浄を２回行うことがより好ましい。
　洗浄は、上記した遠心処理により回収した間葉系幹細胞を培地に懸濁し、再度、遠心処理することにより行うことができる。
　遠心条件は、特に限定されるものではないが、例えば、遠心力２００ｇ～６００ｇ、遠心時間１分間～１０分間とすることができる。

　培地は、特に限定されるものではなく、例えば、α改変型イーグル最小必須培地（α－ＭＥＭ：Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ　Ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用することができる。

　混合物の洗浄は、上清中の残存酵素濃度が０．５ｎｇ／ｍＬ以下になるまで行うことが好ましく、０．３ｎｇ／ｍＬ以下になるまで行うことがより好ましく、０．２ｎｇ／ｍＬ以下になるまで行うことがさらに好ましく、０．１ｎｇ／ｍＬ以下になるまで行うことが特に好ましい。

　（細胞画像の取得、密度情報の導出及びコロニー検出）
　本開示の関節症治療剤の製造方法においては、培養している、複数の間葉系幹細胞の細胞画像を取得し、細胞画像を解析することにより、細胞画像内の間葉系幹細胞の密度情報を導出し、導出される密度情報に基づいて、集団における間葉系幹細胞のコロニーを検出し、検出されるコロニーから導出される平均コロニーサイズ及びコロニー形成単位の少なくとも一方に基づいて、集団の選別が行われる。

　細胞画像の取得方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の撮影装置により行うことができる。
　導出される密度情報は、カーネル密度推定により導出される、細胞画像における間葉系幹細胞の推定密度分布であることが好ましい。
　また、コロニーの検出は、推定密度分布を参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行い、推定密度分布内の同じ極大点に収束する間葉系幹細胞の集まりをコロニーとして検出することにより行われることが好ましい。

　細胞画像の取得、密度情報の導出及びコロニー検出は、少なくとも１つのプロセッサを備える細胞画像解析装置を使用することにより行うことができる。

　以下に、細胞画像解析装置の一実施形態（第１実施形態ともいう。）を、図１～図２２を参照しながら説明する。
　以下の細胞画像解析装置を使用する関節症治療剤の製造方法によれば、タイムラプス画像を使用する必要がない。そのため、専用機器を準備する必要がなく、コストを削減することができる。また、タイムラプス画像を使用する必要がないため、画像取得の時間を短縮することができる。さらに、タイムラプス画像を使用する必要がないため、解析負荷及びデータ保存のコストを抑えることができる。

　図１において、細胞画像解析装置１０は、例えば、デスクトップ型のパーソナルコンピュータであり、撮影装置１１が接続されている。撮影装置１１は、例えば、位相差顕微鏡又は明視野顕微鏡であり、培養容器１２内で培養中の間葉系幹細胞１３を撮影する。そして、これにより得られた細胞画像１４を細胞画像解析装置１０に送信する。

　間葉系幹細胞を適当な数含む集団が培地に播種される。そして、集団において、間葉系幹細胞は経時的に増殖し、コロニーを形成する。細胞画像解析装置１０は、細胞画像１４からコロニーを検出する。
　間葉系幹細胞の培養方法については下記する。

　図２において、細胞画像解析装置１０を構成するコンピュータは、ストレージデバイス３０、メモリ３１、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）３２、通信部３３、ディスプレイ３４及び入力デバイス３５を備えている。これらはバスライン３６を介して相互接続されている。

　ストレージデバイス３０は、細胞画像解析装置１０を構成するコンピュータに内蔵される又はケーブル、ネットワークを通じて接続されるハードディスクドライブである。もしくはストレージデバイス３０は、ハードディスクドライブを複数台連装したディスクアレイである。ストレージデバイス３０には、オペレーティングシステム等の制御プログラム、各種アプリケーションプログラム及びこれらのプログラムに付随する各種データ等が記憶されている。なお、ハードディスクドライブに代えてソリッドステートドライブを用いてもよい。

　メモリ３１は、ＣＰＵ３２が処理を実行するためのワークメモリである。ＣＰＵ３２は、ストレージデバイス３０に記憶されたプログラムをメモリ３１へロードして、プログラムに従った処理を実行することにより、コンピュータの各部を統括的に制御する。

　通信部３３は、ＬＡＮ（Ｌｏｃａｌ　Ａｒｅａ　Ｎｅｔｗｏｒｋ）等のネットワークを介した各種情報の伝送制御を行うネットワークインターフェースである。ディスプレイ３４は各種画面を表示する。細胞画像解析装置１０を構成するコンピュータは、各種画面を通じて、入力デバイス３５からの操作指示の入力を受け付ける。入力デバイス３５は、キーボード、マウス又はタッチパネル等である。

　図３において、細胞画像解析装置１０のストレージデバイス３０には、作動プログラム４０が記憶されている。作動プログラム４０は、コンピュータを細胞画像解析装置１０として機能させるためのアプリケーションプログラムである。
　ストレージデバイス３０には、細胞画像１４、指定バンド幅４１、コロニーの検出結果４２及び間葉系幹細胞１３の増殖能を表す評価情報４３も記憶される。

　作動プログラム４０が起動されると、細胞画像解析装置１０を構成するコンピュータのＣＰＵ３２は、メモリ３１等と協働して、リードライト（以下、ＲＷ（Ｒｅａｄ　Ｗｒｉｔｅ）と略す）制御部５０、指示受付部５１、密度情報導出部５２、検出部５３、評価情報導出部５４及び表示制御部５５として機能する。ＣＰＵ３２は、「プロセッサ」の一例である。

　ＲＷ制御部５０は、ストレージデバイス３０への各種データの記憶及びストレージデバイス３０内の各種データの読み出しを制御する。例えば、ＲＷ制御部５０は、撮影装置１１からの細胞画像１４を受け取り、ストレージデバイス３０に記憶する。また、ＲＷ制御部５０は、細胞画像１４をストレージデバイス３０から読み出し、密度情報導出部５２に出力する。すなわち、ＲＷ制御部５０は、「取得部」の一例である。

　指示受付部５１は、密度情報導出部５２で行うカーネル密度推定のバンド幅ＢＷの、入力デバイス３５を介したユーザによる指定を受け付ける。指示受付部５１は、受け付けたバンド幅ＢＷを、指定バンド幅４１としてＲＷ制御部５０に出力する。ＲＷ制御部５０は、指定バンド幅４１をストレージデバイス３０に記憶する。また、ＲＷ制御部５０は、指定バンド幅４１をストレージデバイス３０から読み出し、細胞画像１４とともに密度情報導出部５２に出力する。

　指定バンド幅４１は、ある１人の患者から採取された細胞を元に生成された間葉系幹細胞１３の培養プロジェクト毎に指定される。このため、１つの培養プロジェクトにおいては、一度指定された指定バンド幅４１が、培養プロジェクトを通じて繰り返し使用される。

　密度情報導出部５２は、細胞画像１４を画像解析して、細胞画像１４内の間葉系幹細胞１３の密度情報を導出する。
　より詳しくは、密度情報導出部５２は、指定バンド幅４１にてカーネル密度推定を行うことにより、細胞画像１４における間葉系幹細胞１３の推定密度分布６０を導出する。
　密度情報導出部５２は、導出した推定密度分布６０を、密度情報として検出部５３に出力する。密度情報導出部５２は、「導出部」の一例である。

　検出部５３は、推定密度分布６０に基づいて間葉系幹細胞１３のコロニーを検出する。検出部５３は、コロニーの検出結果４２をＲＷ制御部５０及び評価情報導出部５４に出力する。ＲＷ制御部５０は、検出結果４２をストレージデバイス３０に記憶する。検出結果４２は、細胞画像１４と関連付けて記憶される。

　評価情報導出部は、検出結果に基づいて評価情報を導出する。評価情報導出部は、評価情報をＲＷ制御部に出力する。ＲＷ制御部は、評価情報をストレージデバイスに記憶する。評価情報４３は、検出結果４２と同じく、細胞画像１４と関連付けて記憶される。

　ＲＷ制御部５０は、関連付けて記憶された細胞画像１４、検出結果４２及び評価情報４３のセットをストレージデバイス３０から読み出し、表示制御部５５に出力する。
　表示制御部５５は、ディスプレイ３４に各種画面を表示する制御を行う。各種画面には、細胞画像１４を表示する細胞画像表示画面８０（図１１参照）、細胞画像１４、検出結果４２及び評価情報４３を表示する解析結果表示画面８５（図１２参照）等が含まれる。

　図４において、密度情報導出部５２は、細胞重心位置抽出部６５とカーネル密度推定部６６とを有する。細胞重心位置抽出部６５は、細胞画像１４に対して二値化処理を行う。
　二値化処理は、まず、細胞画像１４内の間葉系幹細胞１３とそれ以外の領域とを分ける輝度値の閾値を設定する。そして、細胞画像１４の各画素について、輝度値が閾値未満であれば間葉系幹細胞１３であるとして画素値を０に、輝度値が閾値以上であれば間葉系幹細胞１３以外の領域であるとして画素値を１にそれぞれ置換する。

　二値化処理後、細胞重心位置抽出部６５は、間葉系幹細胞１３であるとして画素値を０に置換した領域に対して、個々の間葉系幹細胞１３を認識する周知の画像認識処理を行う。そして、これにより認識した個々の間葉系幹細胞１３の重心６８（十字マークで示す）を抽出する。細胞重心位置抽出部６５は、重心６８の抽出結果をカーネル密度推定部６６に出力する。重心６８の抽出結果は、具体的には、細胞画像１４の長辺に沿う軸をＸ軸、短辺に沿う軸をＹ軸とし、細胞画像１４の左上隅を原点とした場合の重心６８のＸＹ座標である。

　カーネル密度推定部６６は、重心６８を標本点としたカーネル密度推定を行って、その結果として推定密度分布６０を出力する。より詳しくは図５に示すように、カーネル密度推定部６６は、カーネル関数として、破線で示すガウス関数を用いる。ガウス関数は指定バンド幅４１を有する。カーネル密度推定部６６は、複数の重心６８の各々に対してガウス関数を宛がい、宛がった複数のガウス関数を足し合わせる（畳み込む）ことで推定密度分布６０を算出する。推定密度分布６０は、重心６８の情報も含む。なお、カーネル関数としては、ガウス関数に代えて、矩形関数又は三角形関数を用いてもよい。

　図６及び図７に示すように、検出部５３は、推定密度分布を参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行う。
　ｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔは、各重心６８を中心とする半径Ｒの探索円７０を用いる。ｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔでは、ある重心６８を始点として、推定密度分布６０を手掛かりに間葉系幹細胞１３の密度が高い方向に順次探索円７０を移動させていき、最終的に、当該重心６８が収束する間葉系幹細胞１３の密度の極大点７１を探索する。
　検出部５３は、各々の重心６８についてｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行う。検出部５３は、重心６８が推定密度分布６０内の同じ極大点７１に収束した間葉系幹細胞１３の集まりを、コロニーとして検出する。
　図６及び図７では、重心６８が極大点７１＿１に収束した間葉系幹細胞１３の集まりと、重心６８が極大点７１＿２に収束した間葉系幹細胞１３の集まりを、それぞれコロニーとして検出した例を示す。

　図８に示すように、検出部５３は、検出したコロニー毎に、Ｎｏ．１、Ｎｏ．２といったナンバーを付す。また、検出部５３は、検出したコロニー毎に、間葉系幹細胞１３の重心６８に外接する矩形枠７５を生成する。そして、ナンバーとともに、矩形枠７５の左上隅と右下隅の対角点ＰＡ、ＰＢのＸＹ座標を、検出結果４２として出力する。図８では、コロニーＮｏ．１の矩形枠７５＿１の対角点ＰＡ＿１及びＰＢ＿１、並びにコロニーＮｏ．２の矩形枠７５＿２の対角点ＰＡ＿２及びＰＢ＿２を含む検出結果４２を例示している。

　図９に示すように、評価情報導出部５４は、検出部５３が検出したコロニーの個数、コロニー形成単位（ＣＦＵ：Ｃｏｌｏｎｙ　Ｆｏｒｍｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）及び平均コロニーサイズを、評価情報４３として導出する。
　このように、評価情報４３は、１つの時点におけるコロニーの個数、ＣＦＵ及び平均コロニーサイズのうちの少なくとも１つに関する情報である。

　また、培養液の希釈倍数及び播種した間葉系幹細胞１３の量は、入力デバイス３５を介してユーザにより入力される。

　コロニーのサイズは、図１０に示すように、矩形枠７５のＸ軸方向の幅ＷＸとＹ軸方向の幅ＷＹを加算して、２で除算した値である。平均コロニーサイズは、こうして算出したコロニーサイズの積算値を、コロニーの個数で除算した値である。

　図１１は、表示制御部５５の制御の下、ディスプレイ３４に表示される細胞画像表示画面８０を示す。細胞画像表示画面８０には、ユーザの求めに応じた細胞画像１４が表示される。

　細胞画像表示画面８０の下部には、解析ボタン８１が設けられている。細胞画像１４の画像解析を行いたい場合、ユーザは解析ボタン８１を選択する。解析ボタン８１が選択された場合、画像解析指示が指示受付部５１で受け付けられる。これにより、密度情報導出部５２による推定密度分布６０の導出、検出部５３によるコロニーの検出及び評価情報導出部５４による評価情報４３の導出が行われる。

　図１２は、表示制御部５５の制御の下、ディスプレイ３４に表示される解析結果表示画面８５を示す。解析結果表示画面８５には、検出部５３で検出したコロニー毎に、ナンバー及び矩形枠７５が重畳された細胞画像１４が表示される。すなわち、コロニーの検出結果４２がユーザに提示される。細胞画像１４の下部には、評価情報４３が表示される。すなわち、評価情報４３がユーザに提示される。

　解析結果表示画面８５の下部には、確認ボタン８６が設けられている。確認ボタン８６が選択された場合、表示消去指示が指示受付部５１で受け付けられる。この場合、表示制御部５５は、解析結果表示画面８５の表示を消す。

　図１３～図１６は、指定バンド幅４１を指定する一連の処理を示す。まず、図１３に示すように、密度情報導出部５２は、細胞重心位置抽出部６５により、細胞画像１４の一部の特定領域９０における間葉系幹細胞１３の重心６８を抽出する。特定領域９０は、細胞画像１４の１／２のサイズで、かつ細胞画像１４と中心が一致する矩形枠内の領域である。

　カーネル密度推定部６６は、特定領域９０に対して、バンド幅ＢＷ＿Ｌのガウス関数を用いたカーネル密度推定と、バンド幅ＢＷ＿Ｍのガウス関数を用いたカーネル密度推定と、バンド幅ＢＷ＿Ｓのガウス関数を用いたカーネル密度推定とを行う。すなわち、カーネル密度推定部６６は、複数種のバンド幅ＢＷにてカーネル密度推定を行う。

　バンド幅ＢＷ＿Ｌ、ＢＷ＿Ｍ及びＢＷ＿Ｓには、下式（１）に示す大小関係がある。
　ＢＷ＿Ｌ＞ＢＷ＿Ｍ＞ＢＷ＿Ｓ・・・（１）
　つまり、バンド幅ＢＷ＿Ｌが最も大きく、バンド幅ＢＷ＿Ｓが最も小さい。そして、バンド幅ＢＷ＿Ｍは、バンド幅ＢＷ＿Ｌ及びＢＷ＿Ｓの間の大きさである。なお、バンド幅ＢＷは３種に限らない。２種でもよいし、４種以上でもよい。

　カーネル密度推定部６６は、バンド幅ＢＷ＿Ｌに対応する推定密度分布６０＿Ｌ、バンド幅ＢＷ＿Ｍに対応する推定密度分布６０＿Ｍ、及びバンド幅ＢＷ＿Ｓに対応する推定密度分布６０＿Ｓをそれぞれ導出する。
　すなわち、カーネル密度推定部６６は、複数種の推定密度分布６０を導出する。推定密度分布６０＿Ｌは最も滑らかな形状であり、推定密度分布６０＿Ｓは最も尖った形状をしている。推定密度分布６０＿Ｍは、推定密度分布６０＿Ｌ及び６０＿Ｓの中間の形状をしている。

　図１４に示すように、検出部５３は、特定領域９０に対して、推定密度分布６０＿Ｌ、６０＿Ｍ及び６０＿Ｓのそれぞれを参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行うことにより、推定密度分布６０＿Ｌ、６０＿Ｍ及び６０＿Ｓに対応するコロニーの検出結果４２を出力する。
　より詳しくは、検出部５３は、推定密度分布６０＿Ｌを参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行うことにより検出したコロニーの矩形枠７５＿Ｌ（２点鎖線で示す）の対角点ＰＡ＿Ｌ及びＰＢ＿ＬのＸＹ座標を、検出結果４２として出力する。
　また、検出部５３は、推定密度分布６０＿Ｍを参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行うことにより検出したコロニーの矩形枠７５＿Ｍ（実線で示す）の対角点ＰＡ＿Ｍ及びＰＢ＿ＭのＸＹ座標を、検出結果４２として出力する。
　さらに、検出部５３は、推定密度分布６０＿Ｓを参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行うことにより検出したコロニーの矩形枠７５＿Ｓ（破線で示す）の対角点ＰＡ＿Ｓ及びＰＢ＿ＳのＸＹ座標を、検出結果４２として出力する。
　矩形枠７５＿Ｌは比較的大きくなり、矩形枠７５＿Ｓは比較的小さくなる。矩形枠７５＿Ｍは、矩形枠７５＿Ｌ及び７５＿Ｓの中間の大きさとなる。これらの検出結果４２は、表示制御部５５に出力される。

　表示制御部５５は、図１５に示す指定画面９５をディスプレイ３４に表示する。指定画面９５には、検出結果４２としての矩形枠７５＿Ｌ、７５＿Ｍ、７５＿Ｓが重畳された特定領域９０が表示される。矩形枠７５＿Ｌ、７５＿Ｍ、７５＿Ｓは、色分けして表示される（例えば、矩形枠７５＿Ｌが青色、矩形枠７５＿Ｍが黄色、矩形枠７５＿Ｓが緑色等）。

　特定領域９０の下部には、コロニーとして適切と考えられる矩形枠７５を指定する旨のメッセージとともに、枠指定ボタン９６Ｌ、９６Ｍ、９６Ｓが設けられている。枠指定ボタン９６Ｌは矩形枠７５＿Ｌ、枠指定ボタン９６Ｍは矩形枠７５＿Ｍ、枠指定ボタン９６Ｓは矩形枠７５＿Ｓにそれぞれ対応する。枠指定ボタン９６Ｌ、９６Ｍ、９６Ｓは、１つを選択したら他の２つは選択することができない択一的なボタンである。すなわち、表示制御部５５は、複数種の検出結果４２をユーザに提示し、複数種の検出結果４２のうちの１つをユーザに選択させる。枠指定ボタン９６Ｌ、９６Ｍ、９６Ｓの下部にはさらに、指定ボタン９７が設けられている。

　図１６に示すように、枠指定ボタン９６Ｌ、９６Ｍ及び９６Ｓのうちの１つが選択された状態で指定ボタン９７が選択された場合、指示受付部５１はバンド幅ＢＷの指定を受け付ける。指示受付部５１は、ユーザが選択した１つの枠指定ボタン９６に対応するバンド幅ＢＷを、指定バンド幅４１とする。すなわち、指示受付部５１は、ユーザが選択した１つの検出結果４２に対応するバンド幅ＢＷを、指定バンド幅４１とする。図１６では、枠指定ボタン９６Ｍがユーザにより選択されて、バンド幅ＢＷ＿Ｍが指定バンド幅４１とされた場合を例示している。

　次に、上記構成による作用について、図１７及び図１８のフローチャートを参照して説明する。
　まず、細胞画像解析装置１０において作動プログラム４０が起動されると、図３で示したように、細胞画像解析装置１０のＣＰＵ３２は、ＲＷ制御部５０、指示受付部５１、密度情報導出部５２、検出部５３、評価情報導出部５４及び表示制御部５５として機能される。

　ＲＷ制御部５０により、ストレージデバイス３０から、ユーザの求めに応じた細胞画像１４が読み出される（ステップＳＴ１００）。細胞画像１４は、ＲＷ制御部５０から表示制御部５５に出力される。

　表示制御部５５の制御の下、図１１で示した細胞画像表示画面８０がディスプレイ３４に表示される（ステップＳＴ１１０）。これにより細胞画像１４がユーザに提示される。

　ユーザにより解析ボタン８１が選択されて画像解析指示が指示受付部５１で受け付けられ（ステップＳＴ１２０でＹＥＳ）、かつストレージデバイス３０に既に指定バンド幅４１が記憶されていた場合（ステップＳＴ１３０でＹＥＳ）、ＲＷ制御部５０により、ストレージデバイス３０から細胞画像１４及び指定バンド幅４１が読み出される（ステップＳＴ１４０）。細胞画像１４及び指定バンド幅４１は、ＲＷ制御部５０から密度情報導出部５２に出力される。なお、ステップＳＴ１４０は、「取得ステップ」の一例である。

　図４及び図５で示したように、密度情報導出部５２において、指定バンド幅４１にてカーネル密度推定が行われる。これにより、推定密度分布６０が密度情報として導出される（ステップＳＴ１５０）。推定密度分布６０は、密度情報導出部５２から検出部５３に出力される。ステップＳＴ１５０は、「導出ステップ」の一例である。

　図６及び図７で示したように、検出部５３において、推定密度分布６０を参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔが行われる。これにより、細胞画像１４内の間葉系幹細胞１３のコロニーが検出される（ステップＳＴ１６０）。コロニーの検出結果４２は、検出部５３からＲＷ制御部５０に出力され、ストレージデバイス３０に記憶される。また、コロニーの検出結果４２は、検出部５３から評価情報導出部５４に出力される。ステップＳＴ１６０は、「検出ステップ」の一例である。

　図９で示したように、評価情報導出部５４では、検出結果４２に基づいて、コロニーの個数、コロニー形成単位及び平均コロニーサイズが評価情報４３として導出される（ステップＳＴ１７０）。評価情報４３は、評価情報導出部５４からＲＷ制御部５０に出力され、ストレージデバイス３０に記憶される。

　検出結果４２及び評価情報４３は、ＲＷ制御部５０によりストレージデバイス３０から読み出され、表示制御部５５に出力される。そして、表示制御部５５の制御の下、図１２で示した解析結果表示画面８５がディスプレイ３４に表示される（ステップＳＴ１８０）。これにより検出結果４２及び評価情報４３がユーザに提示される。解析結果表示画面８５は、確認ボタン８６が選択されて、指示受付部５１にて表示消去指示が受け付けられた場合（ステップＳＴ１９０でＹＥＳ）に、表示が消される。そして、処理が終了される。

　なお、指示受付部５１にて画像解析指示が受け付けられず（ステップＳＴ１２０でＮＯ）、かつ終了指示が受け付けられない場合（ステップＳＴ２００でＮＯ）、細胞画像表示画面８０の表示が継続される。指示受付部５１にて終了指示が受け付けられた場合（ステップＳＴ２００でＹＥＳ）は、細胞画像表示画面８０の表示が消され、処理が終了される。

　ストレージデバイス３０に指定バンド幅４１が記憶されていなかった場合（ステップＳＴ１３０でＮＯ）は、図１８に示す処理が行われる。
　具体的には、まず、図１３で示したように、密度情報導出部５２において、特定領域９０に対して、３種のバンド幅ＢＷ＿Ｌ、ＢＷ＿Ｍ及びＢＷ＿Ｓにてカーネル密度推定が行われ、これにより３種の推定密度分布６０＿Ｌ、６０＿Ｍ及び６０＿Ｓが導出される（ステップＳＴ１３０１）。

　続いて、図１４で示したように、検出部５３において、特定領域９０に対して、３種の推定密度分布６０＿Ｌ、６０＿Ｍ及び６０＿Ｓのそれぞれを参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔが行われ、これにより３種の推定密度分布６０＿Ｌ、６０＿Ｍ及び６０＿Ｓに対応する３種のコロニーの検出結果４２が出力される（ステップＳＴ１３０２）。
　３種のコロニーの検出結果４２は、具体的には、矩形枠７５＿Ｌの対角点ＰＡ＿Ｌ及びＰＢ＿Ｌ、矩形枠７５＿Ｍの対角点ＰＡ＿Ｍ及びＰＢ＿Ｍ、並びに矩形枠７５＿Ｓの対角点ＰＡ＿Ｓ及びＰＢ＿ＳのＸＹ座標である。

　次に、図１５で示したように、表示制御部５５の制御の下、指定画面９５がディスプレイ３４に表示される（ステップＳＴ１３０３）。指定画面９５には、３種の矩形枠７５＿Ｌ、７５＿Ｍ及び７５＿Ｓにそれぞれ対応する枠指定ボタン９６Ｌ、９６Ｍ及び９６Ｓが、択一的に選択可能に設けられている。

　図１６で示したように、ユーザは、コロニーとして適切と考えられる矩形枠７５に対応する枠指定ボタン９６を選択し、指定ボタン９７を選択する。これにより、指示受付部５１でバンド幅ＢＷの指定が受け付けられる（ステップＳＴ１３０４）。指示受付部５１によって、ユーザが選択した枠指定ボタン９６に対応するバンド幅ＢＷが、指定バンド幅４１とされる。指定バンド幅４１は、指示受付部５１からＲＷ制御部５０に出力され、ＲＷ制御部５０によりストレージデバイス３０に記憶される（ステップＳＴ１３０５）。

　以上説明したように、細胞画像解析装置１０は、取得部としてのＲＷ制御部５０と、導出部としての密度情報導出部５２と、検出部５３とを備える。ＲＷ制御部５０は、間葉系幹細胞１３を撮影装置１１で撮影して得られた細胞画像１４を、ストレージデバイス３０から読み出すことで取得する。密度情報導出部５２は、細胞画像１４を画像解析して、細胞画像１４内の間葉系幹細胞１３の密度情報としての推定密度分布６０を導出する。検出部５３は、推定密度分布６０に基づいて間葉系幹細胞１３のコロニーを検出する。

　密度情報導出部５２は、カーネル密度推定を行うことにより、細胞画像１４における間葉系幹細胞１３の推定密度分布６０を導出し、推定密度分布６０を密度情報として出力する。カーネル密度推定というよく使われる方法で推定密度分布６０を導出し、これを密度情報とするので、間葉系幹細胞１３の密度を比較的正確に表した密度情報を、簡単に得ることができる。

　検出部５３は、推定密度分布６０を参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行うことにより、推定密度分布６０内の同じ極大点７１に収束した間葉系幹細胞１３の集まりを、コロニーとして検出する。ｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔも、カーネル密度推定とともによく使われる方法である。このため、比較的高い確度で、簡単にコロニーを検出することができる。また、ユーザの目視によるコロニーの検出に比べ、一貫した基準で迷うことなくコロニーを検出することができる。

　指示受付部５１は、カーネル密度推定のバンド幅ＢＷのユーザによる指定を受け付ける。密度情報導出部５２は、指示受付部５１が受け付けたバンド幅ＢＷである指定バンド幅４１にてカーネル密度推定を行う。このため、推定密度分布６０の妥当性を高めることができる。また、結果的に、ユーザの感覚に一致したコロニーを検出することができる。

　密度情報導出部５２は、細胞画像１４の一部の特定領域９０に対して、複数種のバンド幅ＢＷにてカーネル密度推定を行うことにより、複数種の推定密度分布６０を導出する。検出部５３は、複数種の推定密度分布６０のそれぞれを参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行うことにより、複数種の推定密度分布６０に対応する複数種のコロニーの検出結果４２を出力する。表示制御部５５は、複数種の検出結果４２をユーザに提示し、複数種の検出結果４２のうちの１つをユーザに選択させる。指示受付部５１は、ユーザが選択した１つの検出結果４２に対応するバンド幅ＢＷを、指定バンド幅４１とする。ユーザは、複数種の検出結果４２を比較しながら、自らがコロニーとして適切と思われる検出結果４２を選択することができる。このため検出結果４２の選択がしやすい。

　表示制御部５５は、コロニーの検出結果４２をユーザに提示する。このためユーザはコロニーの検出結果４２を確認することができる。

　評価情報導出部５４は、コロニーの検出結果４２に基づいて、間葉系幹細胞１３の増殖能を表す評価情報４３を導出する。表示制御部５５は、評価情報４３をユーザに提示する。このため、ユーザは評価情報４３を確認することができ、評価情報４３を参照して間葉系幹細胞１３の増殖能を評価することができる。

　評価情報４３は、１つの時点におけるコロニーの個数、ＣＦＵ及び平均コロニーサイズのうちの少なくともいずれかに関する情報である。このため、ユーザは、１つの時点における間葉系幹細胞１３の増殖能を評価することができる。
　また、導出される評価情報４３が一定の大きさを超えるコロニーサイズを有する間葉系幹細胞１３の情報に限定されるように、検出部５３を設定しておくことが可能である。
　具体的には、コロニーサイズ０．５４ｍｍ超のコロニーについての平均コロニーサイズを導出するように、検出部５３を設定することができる。

　なお、評価情報は、図９で例示したコロニーの個数、ＣＦＵ及び平均コロニーサイズ以外の評価情報を含んでいてもよい。
　例えば、評価情報は、コロニーを構成する間葉系幹細胞１３の個数の平均値又は矩形枠７５の幅ＷＸと幅ＷＹとの比（ＷＸ／ＷＹ）の平均値等でもよい。
　矩形枠７５の幅ＷＸと幅ＷＹとの比が１に近い程、すなわち矩形枠７５が正方形に近い程、コロニーを構成する間葉系幹細胞１３が均一に増殖しているといえるため好ましい。
　また、図１９に示す評価情報１００のように、縦軸の度数をコロニーの個数、横軸の階級をコロニーのサイズとしたヒストグラム１０１等の統計的な情報を含んでいてもよい。なお、符号１０２は、平均コロニーサイズを示す線分である。

　また、評価情報は、１つの時点における情報に限らず、複数の時点における情報であってもよい。
　例えば、図２０に示す評価情報１０５のように、平均コロニーサイズを縦軸、間葉系幹細胞１３の培養日数を横軸とした、平均コロニーサイズの時系列変化を示すグラフ１０６を含んでいてもよい。
　グラフ１０６には、各培養日数に対する平均コロニーサイズのプロット（×印で示す）１０７、各プロット１０７の近似直線１０８及び吹き出し１０９が表示される。吹き出し１０９内には、１培養日数当たりの平均コロニーサイズの変化量が記される。

　また、平均コロニーサイズ変化量に閾値を設定してもよい。そして、平均コロニーサイズ変化量が閾値未満であった場合に、図２１に示すように警告１１０を表示してもよい。閾値は経験的な見地から設定された値であり、培養終了後の間葉系幹細胞１３の品質が出荷可能レベルに達しないことが明らかな値である。こうすることで、間葉系幹細胞１３の培養を中止したり、培地の成分を変更する等して間葉系幹細胞１３の品質を出荷レベルに上げるといった様々な対応をユーザに促すことができる。

　指定バンド幅４１の指定方法としては、図２２に示す態様を採用してもよい。
　まず、バンド幅ＢＷが初期値である第１バンド幅ＢＷ＿Ｉ（図示省略）に設定される（ステップＳＴ１３１０）。第１バンド幅ＢＷ＿Ｉは、例えば、上のバンド幅ＢＷ＿Ｌである。
　次いで、密度情報導出部５２において、特定領域９０に対して、第１バンド幅ＢＷ＿Ｉにてカーネル密度推定が行われ、これにより推定密度分布６０＿Ｉ（図示省略）が導出される（ステップＳＴ１３１１）。

　続いて、検出部５３において、特定領域９０に対して、推定密度分布６０＿Ｉを参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔが行われ、これにより推定密度分布６０＿Ｉに対応するコロニーの検出結果４２が出力される（ステップＳＴ１３１２）。コロニーの検出結果４２は、具体的には、矩形枠７５＿Ｉ（図示省略）の対角点ＰＡ＿Ｉ、ＰＢ＿Ｉ（図示省略）のＸＹ座標である。

　次に、表示制御部５５の制御の下、コロニーの検出結果４２である矩形枠７５＿Ｉが重畳された細胞画像１４の表示画面がディスプレイ３４に表示される（ステップＳＴ１３１３）。表示画面には、矩形枠７５＿Ｉで示される領域がコロニーとして適切であるか否かを、ユーザに選択させるためのボタンが設けられている。

　矩形枠７５＿Ｉで示される領域がコロニーとして適切でないことを示すボタンがユーザにより選択された場合（ステップＳＴ１３１４でＮＯ）、バンド幅ＢＷが第１バンド幅ＢＷ＿Ｉから第２バンド幅ＢＷ＿ＳＥ（図示省略）に変更される（ステップＳＴ１３１５）。第２バンド幅ＢＷ＿ＳＥは、例えば上記第１実施形態のバンド幅ＢＷ＿Ｍである。そして、第２バンド幅ＢＷ＿ＳＥにてステップＳＴ１３１１の処理が行われ、さらにステップＳＴ１３１２、ＳＴ１３１３の処理も行われる。これらステップＳＴ１３１５からステップＳＴ１３１３までの一連の処理は、矩形枠７５で示される領域がコロニーとして適切であることを示すボタンがユーザにより選択されるまで、繰り返し続けられる。

　矩形枠７５で示される領域がコロニーとして適切であることを示すボタンがユーザにより選択された場合（ステップＳＴ１３１４でＹＥＳ）、指示受付部５１によって、その際設定されていたバンド幅ＢＷが、指定バンド幅４１とされる。指定バンド幅４１は、指示受付部５１からＲＷ制御部５０に出力され、ＲＷ制御部５０によりストレージデバイス３０に記憶される（ステップＳＴ１３１６）。

　このように、バンド幅ＢＷを段階的に変更し、その都度コロニーの検出結果４２としての矩形枠７５をユーザに提示して、矩形枠７５で示される領域がコロニーとして適切であるか否かを、ユーザに選択させてもよい。なお、コロニーとして適切と考えられる矩形枠７５をユーザに入力させ、入力された矩形枠７５に応じたバンド幅ＢＷを指定バンド幅４１としてもよい。

　細胞画像解析装置の別の形態（以下、第２実施形態ともいう）を、図２３～図２７を参照しながら説明する。
　第２実施形態では、細胞画像１４における間葉系幹細胞１３の増殖の程度を示す指数が設定範囲１２３内であった場合に限り、密度情報の導出及びコロニーの検出が実行される。

　図２３～図２５において、細胞画像解析装置のＣＰＵは、上記第１実施形態の各処理部５０～５５に加えて、面積率算出部１２０及び判定部１２１として機能する。
　面積率算出部１２０は、細胞画像１４における間葉系幹細胞１３の面積率１２２を算出する。具体的には、面積率算出部１２０は、細胞重心位置抽出部６５と同じく、細胞画像１４に対して二値化処理を行う。
　次に、間葉系幹細胞１３であるとして画素値を０に置換した画素数をカウントする。そして、カウントした画素数を細胞画像１４の全画素数で除算することで、間葉系幹細胞１３の面積率１２２を算出する。面積率算出部１２０は、算出した面積率１２２を判定部１２１に出力する。面積率１２２は、「指数」の一例である。

　判定部１２１は、面積率算出部１２０からの面積率１２２が、設定範囲１２３内であるか否かを判定する。設定範囲１２３はストレージデバイス３０に記憶されており、ＲＷ制御部５０によりストレージデバイス３０から読み出されて判定部１２１に受け渡される。

　図２３に示すように、判定部１２１は、面積率１２２が設定範囲１２３内であった場合、「密度情報の導出及びコロニーの検出を実行する」という内容の判定結果１２４Ａを出力する。
　この場合、密度情報導出部５２は密度情報である推定密度分布６０の導出を実行し、検出部５３もコロニーの検出を実行する。

　図２４及び図２５に示すように、判定部１２１は、面積率１２２が設定範囲１２３外であった場合、「密度情報の導出及びコロニーの検出を実行しない」という内容の判定結果１２４Ｂを出力する。
　この場合、密度情報導出部５２は密度情報である推定密度分布６０の導出を実行せず、検出部５３もコロニーの検出を実行しない。

　図２３～図２５では、面積率の設定範囲１２３を２５％～７５％に設定した場合を例示している。
　図２３は、面積率１２２が４１％で設定範囲１２３内であり、判定部１２１が判定結果１２４Ａを出力する例を示す。図２４は、面積率１２２が１４％で設定範囲１２３外であり、判定部１２１が判定結果１２４Ｂを出力する例を示す。図２５は、面積率１２２が７９％で設定範囲１２３外であり、判定部１２１が判定結果１２４Ｂを出力する例を示す。

　図２６は、図２３～図２５で示した態様を、縦軸を面積率、横軸を培養日数としたグラフにまとめたものである。
　間葉系幹細胞１３は、増殖速度が非常に高い傾向にあり、平均コロニーサイズが比較的早期にプラトーに達する。
　しかしながら、培養初期の段階では、コロニーと言えるほどの数は密集していない。
　このため、培養初期の段階といえる、面積率１２２が２５％未満の場合、判定部１２１は、「密度情報の導出及びコロニーの検出を実行しない」という内容の判定結果１２４Ｂを出力する。
　また、平均コロニーサイズがプラトーに達する培養の最終段階では、コロニーが培養容器１２の略全体にわたっていて、コロニーを区別する意味がなくなる。このため、培養の最終段階といえる、面積率１２２が７５％よりも大きい場合も、判定部１２１は、「密度情報の導出及びコロニーの検出を実行しない」という内容の判定結果１２４Ｂを出力する。

　図２７は、面積率１２２が設定範囲１２３外で、判定部１２１が判定結果１２４Ｂを出力した場合の細胞画像表示画面８０を示す。この場合、解析ボタン８１が選択されると、表示制御部５５は、警告ウィンドウ１３０をポップアップ表示する。警告ウィンドウ１３０には、面積率１２２が設定範囲１２３外であるため、解析ができない旨のメッセージが表示される。警告ウィンドウ１３０は、ＯＫボタン１３１を選択することにより表示が消える。

　このように、第２実施形態では、細胞画像１４における間葉系幹細胞１３の増殖の程度を示す指数である面積率１２２が設定範囲１２３内であった場合に限り、密度情報の導出及びコロニーの検出が実行される。
　このため、培養の初期段階（間葉系幹細胞１３がコロニーを形成していない段階）及び培養の最終段階（間葉系幹細胞１３が培養容器１２の略全体にわたる大きなコロニーを形成している段階）等、画像解析の実行に意味がない場合の不要な画像解析を避けることができる。換言すれば、間葉系幹細胞１３の増殖能の評価に適切な期間に限って、画像解析を実行することができる。

　なお、細胞画像１４における間葉系幹細胞１３の増殖の程度を示す指数としては、例示の面積率１２２に限らない。細胞画像１４内の間葉系幹細胞１３の個数であってもよい。

　細胞画像解析装置のさらに別の形態（以下、第３実施形態ともいう）を、図２８～図３０を参照しながら説明する。

　図２８において、密度情報導出部１４０は、予め設定された探索枠１４１内の間葉系幹細胞１３の個数（以下、枠内細胞数という）１４２を、密度情報として導出する。探索枠１４１は、例えば上記第１実施形態の矩形枠７５＿Ｍと同等の大きさを有する。あるいは、探索枠１４１はユーザが設定する。枠内細胞数１４２は、例えば、探索枠１４１内に存在する間葉系幹細胞１３の重心６８の個数をカウントすることで得られる。密度情報導出部１４０は、枠内細胞数１４２を検出部１４３に出力する。

　検出部１４３は、枠内細胞数１４２及びコロニー条件１４４に基づいてコロニーを検出し、その検出結果１４５を出力する。コロニー条件１４４はストレージデバイス３０に記憶されており、ＲＷ制御部５０によりストレージデバイス３０から読み出されて検出部１４３に受け渡される。

　図２９に示すように、密度情報導出部１４０は、細胞画像１４内の複数の領域ＲＥ１＿１、ＲＥ１＿２、・・・、ＲＥ２＿１、・・・、ＲＥＭ＿Ｎに探索枠１４１を順次走査し、各領域において枠内細胞数１４２を導出する。
　検出部１４３は、各領域ＲＥにおける枠内細胞数１４２がコロニー条件１４４を満たすか否かによって、各領域ＲＥがコロニーの領域であるか否かを検出する。なお、領域ＲＥ１＿２は、領域ＲＥ１＿１からＸ軸方向に、探索枠１４１を半分ずらした領域である。また、領域ＲＥ２＿１は、領域ＲＥ１＿１からＹ軸方向に、探索枠１４１を半分ずらした領域である。

　例えば、図３０に示すように、領域ＲＥ２＿１における枠内細胞数１４２が５２個で、コロニー条件１４４が枠内細胞数≧５０個という内容であった場合、検出部１４３は、領域ＲＥ２＿１をコロニーの領域として検出する。

　このように、第３実施形態では、推定密度分布６０の代わりに、枠内細胞数１４２を密度情報として導出する。このため、推定密度分布６０と比較して、簡単に密度情報を導出することができる。

　なお、探索枠１４１は１種に限らない。大きさ又は形状等が異なる複数種の探索枠１４１を設定し、各探索枠１４１についてコロニーを検出してもよい。

　細胞画像解析装置のさらに別の形態（以下、第４実施形態ともいう）を、図３１及び図３２を参照しながら説明する。
　第４実施形態では、機械学習モデル１５０を用いて画像解析を行う。

　図３１において、機械学習モデル１５０は、細胞画像１４を入力画像とし、コロニーの検出結果４２としての矩形枠７５が重畳された細胞画像１４を出力画像とするモデルである。機械学習モデル１５０は、例えば、Ｕ－Ｎｅｔ（Ｕ－Ｓｈａｐｅｄ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｎｅｔｗｏｒｋ）、ＳｅｇＮｅｔ、ＲｅｓＮｅｔ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ　Ｎｅｔｗｏｒｋ）又はＤｅｎｓｅＮｅｔ（Ｄｅｎｓｅｌｙ　Ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ　Ｃｏｎｖｏｌｕｓｉｏｎａｌ　Ｎｅｔｗｏｒｋ）等の畳み込みニューラルネットワークである。

　図３２は、機械学習モデル１５０の学習フェーズにおける処理の概要を示す。学習フェーズにおいて、機械学習モデル１５０は、学習データ１５５を与えられて学習される。学習データ１５５は、学習用細胞画像１４Ｌと、当該学習用細胞画像１４Ｌに対応する正解画像１４ＣＡとの組である。正解画像１４ＣＡは、学習用細胞画像１４Ｌのコロニーと思われる領域に、ユーザが手動で矩形枠７５を書き込んだ画像である。

　学習フェーズにおいて、機械学習モデル１５０には、学習用細胞画像１４Ｌが入力される。機械学習モデル１５０は、学習用細胞画像１４Ｌに対して学習用出力画像１４ＯＬを出力する。学習用出力画像１４ＯＬは、機械学習モデル１５０においてコロニーと推定した領域に矩形枠７５が重畳された学習用細胞画像１４Ｌである。この学習用出力画像１４ＯＬ及び正解画像１４ＣＡに基づいて、機械学習モデル１５０の損失演算がなされる。そして、損失演算の結果に応じて機械学習モデル１５０の各種係数の更新設定がなされ、更新設定に従って機械学習モデル１５０が更新される。学習用出力画像１４ＯＬの矩形枠７５と、正解画像１４ＣＡの矩形枠７５との間に大きな隔たりがある場合は、損失は大きくなり、機械学習モデル１５０の更新度合いも大きくなる。逆に学習用出力画像１４ＯＬの矩形枠７５と、正解画像１４ＣＡの矩形枠７５との間にほとんど隔たりがない場合は、損失は小さくなり、機械学習モデル１５０の更新度合いも小さくなる。

　学習フェーズにおいては、学習用細胞画像１４Ｌの機械学習モデル１５０への入力、機械学習モデル１５０からの学習用出力画像１４ＯＬの出力、損失演算、更新設定及び機械学習モデル１５０の更新の上記一連の処理が、学習データ１５５が交換されつつ繰り返し行われる。
　上記一連の処理の繰り返しは、学習用出力画像１４ＯＬの矩形枠７５の推定精度が、予め定められた設定レベルまで達した場合に終了される。こうして矩形枠７５の推定精度が設定レベルまでに達した機械学習モデル１５０が、ストレージデバイス３０に記憶されて用いられる。

　このように、第４実施形態では、機械学習モデル１５０を用いてコロニーを検出する。このため、より効率的にコロニーを検出することができる。

　なお、正解画像１４ＣＡに代えて、学習用細胞画像１４Ｌのコロニーと思われる矩形領域７５の対角点ＰＡ、ＰＢのＸＹ座標を、学習データ１５５として用いてもよい。

　培養プロジェクト毎ではなく、細胞画像１４毎に指定バンド幅４１を変更してもよい。また、間葉系幹細胞１３の種類によって指定バンド幅４１を変更してもよい（例えば、Ａ細胞は指定バンド幅４１をバンド幅ＢＷ＿Ｍとし、Ｂ細胞は指定バンド幅４１をバンド幅ＢＷ＿Ｓとする等）。

　コロニーの検出結果４２としては、例示の矩形枠７５に限られず、例えば、検出したコロニーの領域を囲う曲線の枠（円形又は楕円形の枠等）としてもよい。

　バンド幅ＢＷと同様に、ｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔで用いる探索円７０の半径Ｒをユーザに指定させてもよい。

　コロニーの検出結果４２をユーザに提示する態様としては、矩形枠７５が重畳された細胞画像１４をディスプレイ３４に表示する態様に限らない。
　例えば、矩形枠７５が重畳された細胞画像１４をプリントアウトする態様又は矩形枠７５が重畳された細胞画像１４を、ユーザが所有する端末に電子メール等で配信する態様を採用してもよい。
　評価情報４３をユーザに提示する態様も同様に、評価情報４３をディスプレイ３４に表示する態様に限らない。
　例えば、評価情報４３をプリントアウトする態様又は評価情報４３をユーザが所有する端末に電子メール等で配信する態様を採用してもよい。

　細胞画像解析装置１０を構成するコンピュータのハードウェア構成は種々の変形が可能である。細胞画像解析装置１０を、処理能力及び信頼性の向上を目的として、ハードウェアとして分離された複数台のコンピュータで構成することも可能である。例えば、密度情報導出部５２及び検出部５３の機能と、評価情報導出部５４の機能とを、２台のコンピュータに分散して担わせる。この場合は２台のコンピュータで細胞画像解析装置１０を構成する。

　このように、細胞画像解析装置１０のコンピュータのハードウェア構成は、処理能力、安全性及び信頼性等の要求される性能に応じて適宜変更することができる。
　さらに、ハードウェアに限らず、作動プログラム４０等のアプリケーションプログラムについても、安全性及び信頼性の確保を目的として、二重化及び複数のストレージデバイスに分散格納等を実施することができる。

　上記各実施形態において、例えば、ＲＷ制御部５０、指示受付部５１、密度情報導出部５２、１４０、検出部５３、１４３、評価情報導出部５４、表示制御部５５、細胞重心位置抽出部６５、カーネル密度推定部６６、面積率算出部１２０及び判定部１２１といった各種の処理を実行する処理部（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）のハードウェア的な構造としては、次に示す各種のプロセッサを用いることができる。
　各種のプロセッサには、上記したように、ソフトウェア（作動プログラム４０）を実行して各種の処理部として機能する汎用的なプロセッサであるＣＰＵ３２に加えて、ＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｇａｔｅ　Ａｒｒａｙ）等の製造後に回路構成を変更可能なプロセッサであるプログラマブルロジックデバイス（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｌｏｇｉｃ　Ｄｅｖｉｃｅ:ＰＬＤ）及びＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｃｉｒｃｕｉｔ）等の特定の処理を実行させるために専用に設計された回路構成を有するプロセッサである専用電気回路等が含まれる。

　１つの処理部は、これらの各種のプロセッサのうちの１つで構成されてもよいし、同種又は異種の２つ以上のプロセッサの組み合わせ（例えば、複数のＦＰＧＡの組み合わせ及びＣＰＵとＦＰＧＡとの組み合わせ等）で構成されてもよい。また、複数の処理部を１つのプロセッサで構成してもよい。

　複数の処理部を１つのプロセッサで構成する例としては、第１に、クライアント及びサーバ等のコンピュータに代表されるように、１つ以上のＣＰＵとソフトウェアとの組み合わせで１つのプロセッサを構成し、このプロセッサが複数の処理部として機能する形態がある。
　第２に、システムオンチップ（Ｓｙｓｔｅｍ　Ｏｎ　Ｃｈｉｐ:ＳｏＣ）等に代表されるように、複数の処理部を含むシステム全体の機能を１つのＩＣ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｃｉｒｃｕｉｔ）チップで実現するプロセッサを使用する形態がある。
　このように、各種の処理部は、ハードウェア的な構造として、上記各種のプロセッサの１つ以上を用いて構成される。

　さらに、これらの各種のプロセッサのハードウェア的な構造としては、より具体的には、半導体素子等の回路素子を組み合わせた電気回路（ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）を用いることができる。

　以上に示した記載内容及び図示内容は、本開示の技術の一例に過ぎない。例えば、上記の構成、機能、作用、及び効果に関する説明は、本開示の技術に係る部分の構成、機能、作用及び効果の一例に関する説明である。よって、本開示の技術の主旨を逸脱しない範囲内において、以上に示した記載内容及び図示内容に対して、不要な部分を削除したり、新たな要素を追加したり、置き換えたりしてもよいことはいうまでもない。
　また、錯綜を回避し、本開示の技術に係る部分の理解を容易にするために、以上に示した記載内容及び図示内容では、本開示の技術の実施を可能にする上で特に説明を要しない技術常識等に関する説明は省略されている。

　（集団の選別）
　本開示の関節症治療剤の製造方法においては、検出されるコロニーから導出される平均コロニーサイズ及びコロニー形成単位の少なくとも一方に基づいて、集団の選別を行う。
　具体例として、評価情報導出部から導出される、平均コロニーサイズ及びコロニー形成単位の評価情報に基づいて、集団の選別を行うことができる。

　より具体的には、コロニーの検出が、培養開始日から４日目～６日目において行われ、集団の選別が、下記条件ａ１）及び条件ｂ１）の少なくとも一方を満たす集団を選別することにより行われることが好ましく、下記条件ａ１’）及び条件ｂ１’）の少なくとも一方を満たす集団を選別することにより行われることがより好ましく、下記条件ａ１’’）及び条件ｂ１’’）の少なくとも一方を満たす集団を選別することにより行われることがさらに好ましい。
ａ１）培養開始日から４日目～６日目のいずれかの時点における集団に含まれる間葉系幹細胞の平均コロニーサイズが０．７４０ｍｍ以上である。
ｂ１）培養開始日から４日目～６日目のいずれかの時点における集団に含まれる間葉系幹細胞のコロニー形成単位が０．２５０／ｍｍ^２以上である。
ａ１’）培養開始日から４日目～６日目のいずれかの時点における集団に含まれる間葉系幹細胞の平均コロニーサイズが０．７５０ｍｍ以上である。
ｂ１’）培養開始日から４日目～６日目のいずれかの時点における集団に含まれる間葉系幹細胞のコロニー形成単位が０．２７０／ｍｍ^２以上である。
ａ１’’）培養開始日から４日目～６日目のいずれかの時点における集団に含まれる間葉系幹細胞の平均コロニーサイズが０．８００ｍｍ以上である。
ｂ１’’）培養開始日から４日目～６日目のいずれかの時点における集団に含まれる間葉系幹細胞のコロニー形成単位が０．３００／ｍｍ^２以上である。
　下記条件ａ１）及び条件ｂ１）の少なくとも一方を満たす集団は、移植を実施する日までに間葉系幹細胞が所望の数に達することが予測され、このような選別を行い製造される関節症治療剤は、関節症治療に適したものである。

　（その他）
　培養が終了した滑膜由来間葉系幹細胞に対し、医薬的に許容される担体を混合し、懸濁液又はゲル状物質とし、関節症治療剤に使用してもよい。
　また、培養が終了した滑膜由来間葉系幹細胞に対し、担体を混合することなく、細胞シート等として、関節症治療剤に使用してもよい。

　医薬的に許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール及び塩化ナトリウム等を含む等張液といった水性担体が挙げられる。
　また、医薬的に許容される担体として、ゼラチン及びコラーゲン等の生体吸収性のゲルを使用してもよい。

　関節症治療剤は、医薬的に許容される添加剤を含んでいてもよく、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン及びポリエチレングリコール等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム及び塩酸プロカイン等）、保存剤及び酸化防止剤などが挙げられる。

（関節症治療剤）
　本開示に係る関節症治療剤は、上記した関節症治療剤の製造方法により製造される関節症治療剤である。
　関節症治療剤については上記したため、ここでは記載を省略する。

　以下に、本開示に係る関節症治療剤の使用方法（関節症の治療方法）の一例について説明するが、これに限定されるものではない。

　関節症治療剤は、軟骨損傷部又は半月板損傷部を間葉系幹細胞により覆うように、関節症治療剤（間葉系幹細胞を含む懸濁液、間葉系幹細胞の細胞シート又はゼラチン又はコラーゲン等の担体によりゲル状物質とした間葉系幹細胞等）を移植し、損傷部において間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させ、ｉｎ　ｓｉｔｕで軟骨組織を再生させることにより関節症の治療に使用することができる。

　間葉系幹細胞のｉｎ　ｓｉｔｕでの軟骨形成過程の間、局所微小環境（栄養供給及びサイトカイン環境等）に従って、軟骨組織が再生するため、外部からの操作は必要とされない。間葉系幹細胞のｉｎ　ｓｉｔｕ軟骨形成の結果、軟骨組織が軟骨損傷部又は半月板損傷部にて再生されて、損傷が修復される。具体的には、軟骨損傷の場合には、骨領域、軟骨と骨との境界、軟骨中心部、表面領域、元の軟骨に隣接する領域が、元の軟骨組織として形成され、半月板損傷の場合には、半月板軟骨が形成される。

　間葉系幹細胞の移植は、軟骨損傷部又は半月板損傷部を、外科的処置により露出させた後、上記損傷部を、関節症治療剤により覆うことにより行うことができる。
　間葉系幹細胞の移植方法は、上記に限定されるものではなく、例えば、関節に、間葉系幹細胞を含む懸濁液を注射することにより行ってもよい。

　外科的処置としては、観血的手術又は関節鏡視下手術により行うことができる。侵襲を出来る限り小さくできるため、関節鏡視下手術が好ましい。

　損傷部への間葉系幹細胞の接着性の観点から、損傷部を、関節症治療剤により覆う時間は、１０分間以上であることが好ましく、１５分間以上であることがより好ましい。

　損傷部への間葉系幹細胞の接着性をより向上させるため、関節症治療剤により覆った箇所を、骨膜でさらに覆うことができる。

　間葉系幹細胞を患者に移植する際、関節症の治療効率の観点から、損傷部に移植する関節症治療剤に含まれる間葉系幹細胞の数は、０．５０×１０^７個以上であることが好ましく、１．００×１０^７個以上であることがより好ましく、２．００×１０^７個以上であることがさらに好ましい。また、損傷部に移植する関節症治療剤に含まれる間葉系幹細胞の数は、２．５０１０^７個以上であってもよく、３．００１０^７個以上であってもよく、４．００１０^７個以上であってもよい。
　また、損傷部に移植する関節症治療剤に含まれる間葉系幹細胞の数の上限値は、特に限定されるものではないが、例えば、１．０×１０^１１個以下であってもよく、１．０×１０^１０個以下であってもよく、１．０×１０^９個以下であってもよく、１．０×１０^８個以下であってもよい

　２０２１年３月１２日に出願された日本国特許出願２０２１－０４０６４８号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願及び技術規格は、個々の文献、特許出願お及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

　以下、上記実施形態を実施例により具体的に説明するが、上記実施形態はこれらの実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
　半月板損傷患者のヒト検体を用いて、滑膜組織の消毒を行った後に、滑膜由来間葉系幹細胞を作製した。
　具体的には、Ｍ１検体（滑膜組織０．８５ｇ）の組織をハサミで細断し、リベラーゼ水溶液５．０ｍＬに浸漬させ、酵素反応を行った。
　なお、リベラーゼ水溶液は、コラゲナーゼ及び中性プロテアーゼを含む酵素混合物を含むリベラーゼＭＮＰ－Ｓ（エフ・ホフマン・ラ・ロシュ製）５．０ｍｇを、最終濃度２０％ヒト自己血清を含む注射用水５．０ｍＬに溶解したものを用いた。
　酵素反応は、３７℃において１時間３０分間行った。
　また、酵素反応において、酵素の使用量に対するＭ１検体の使用量の比は、質量基準で、１７０である。

　Ｍ１検体を酵素反応させることにより得られた、滑膜由来間葉系幹細胞を含む組織消化液を、セルストレーナーを通して、５０ｍＬ遠沈管に移して、遠心力を４００ｇに設定し、５分間遠心した。

　上清を除き、得られた滑膜由来間葉系幹細胞を含む懸濁液を培地に懸濁させ、フラスコへ全量を播種した（１．４４×１０^７個、１８８０個／ｃｍ^２）。
　なお、培地はα改変型イーグル最小必須培地（α－ＭＥＭ）に最終濃度１０体積％ヒト自己血清を溶解させたものを用いた。
　また、培養はＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）にて行い、２週間後にフラスコから滑膜由来間葉系幹細胞を回収した。
　培養期間中、培地交換を実施しなかった。

　培地に残存したリベラ―ゼ量を定量したところ、５９．８ｎｇ／ｍＬであった。

　回収した滑膜由来間葉系幹細胞の細胞数は０．８０×１０^７個であり、半月板治療剤又は変形性関節症治療剤への適用を検討できるレベルであった。表１中において、治療適用性評価はＢ評価とした。
　なお、播種時の細胞数に対する２週間後に回収された細胞数の比（増殖倍率）は、０．６であった。
　なお、回収した細胞数の測定は、目視による細胞カウント及びデュアル蛍光光学セルカウンターＬＵＮＡ－ＦＬ（登録商標）（ｌｏｇｏｓ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。

　培養開始日（播種）から４日目に、滑膜由来間葉系幹細胞を含む集団の細胞画像を取得し、細胞画像から滑膜由来間葉系幹細胞の密度情報（推定密度分布）を、カーネル密度推定により導出した。
　次いで、推定密度分布を参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行い推定密度分布内の同じ極大点に収束した間葉系幹細胞の集まりをコロニーとして検出した。
　検出したコロニーから、平均コロニーサイズ及びコロニー形成単位（ＣＦＵ）を導出した結果、平均コロニーサイズは０．７４３ｍｍであり、ＣＦＵは０．２５６／ｍｍ^２であった。
　なお、細胞画像の取得方法、推定密度分布の導出方法、コロニー検出方法、並びに平均コロニーサイズ及びＣＦＵの導出は、上記した第１の実施形態に係る細胞画像解析装置を使用することにより行った。
　また、平均コロニーサイズの測定は、コロニーサイズ０．５４ｍｍ超のコロニーに対して実施した。
　以下の実施例２についても同様の方法により、平均コロニーサイズ等の測定を実施した。

　回収された滑膜由来間葉系幹細胞に特有の細胞表面マーカーの発現を、抗原抗体反応により行ったところ、ＣＤ９０陽性であり、ＣＤ４５陰性であった。
　また、回収された滑膜由来間葉系幹細胞に対して、アルシアンブルー染色を行ったところ、軟骨細胞への分化能が確認された。
　以上から、回収された細胞は、滑膜由来間葉系幹細胞であることが確認された。

＜実施例２＞
　半月板損傷患者のヒト検体を用いて、滑膜組織の消毒を行うことなく、滑膜由来間葉系幹細胞を作製した。
　具体的には、Ｇ０検体（滑膜組織０．８０ｇ）、Ｇ１検体（滑膜組織０．４２ｇ）、Ｇ２検体（滑膜組織０．６０ｇ）、Ｇ３検体（滑膜組織０．６６ｇ）、Ｇ４検体（滑膜組織０．８６ｇ）及びＧ５検体（滑膜組織０．３３ｇ）の各組織をハサミで細断し、それぞれ、実施例１でも使用したリベラーゼ水溶液５．０ｍＬに浸漬させ、酵素反応を行った。
　酵素反応は、３７℃において３時間行った。
　また、酵素反応において、酵素の使用量に対するＧ０検体、Ｇ１検体、Ｇ２検体、Ｇ３検体、Ｇ４検体及びＧ５検体の使用量の比は、質量基準で、それぞれ、１６０、８４、１２０、１３２、１７２、６６とした。

　Ｇ０検体、Ｇ１検体、Ｇ２検体、Ｇ３検体、Ｇ４検体及びＧ５検体のそれぞれを酵素反応させることにより得られた、滑膜由来間葉系幹細胞を含む組織消化液を、セルストレーナーを通して、５０ｍＬ遠沈管に移して、遠心力を４００ｇに設定して、５分間遠心した。

　さらにその後、洗浄工程として、上清を廃棄して２０ｍＬのα－ＭＥＭで再懸濁して遠心力を４００ｇに設定して、５分間遠心した。この洗浄工程は計２回繰り返し行った。

　上清を除き、得られた滑膜由来間葉系幹細胞を含む懸濁液のそれぞれを培地に懸濁させ、フラスコへ全量を播種した（Ｇ０検体が１．４３×１０^７個、１８７４個／ｃｍ^２、Ｇ１検体が０．５３×１０^７個、６９０個／ｃｍ^２、Ｇ２検体が０．８１×１０^７個、１０５９個／ｃｍ^２、Ｇ３検体が１．５２×１０^７個、１９８７個／ｃｍ^２、Ｇ４検体が０．７９×１０^７個、１０２８個／ｃｍ^２、Ｇ５検体が０．６０×１０^７個、７８７個／ｃｍ^２）。
　なお、培地は実施例１と同様に、α－ＭＥＭを使用した。
　また、培養はＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）にて行い、２週間後にフラスコから滑膜由来間葉系幹細胞を回収した。
　培養期間中、培地交換を実施しなかった。

　培地に残存したリベラ―ゼ量を定量したところ、Ｇ０検体～Ｇ５検体はいずれも０．１ｎｇ／ｍＬ以下（測定キットの検出限界以下）であった。

　回収した滑膜由来間葉系幹細胞の細胞数はＧ０検体が４．９×１０^７個、Ｇ１検体が４．９×１０^７個、Ｇ２検体が７．６×１０^７個、Ｇ３検体が５．８×１０^７個、Ｇ４検体が７．０×１０^７個、Ｇ５検体が６．５×１０^７個であった。
　回収した滑膜由来間葉系幹細胞の細胞数の合計は、１．０×１０^７個を大幅に上回っており、治療に必要な細胞量を十分に、かつ安定に提供出来る水準であった。
　なお、増殖倍率は、Ｇ０検体が３．５、Ｇ１検体が９．５、Ｇ２検体が９．６、Ｇ３検体が３．９、Ｇ４検体が９．１、Ｇ５検体が１１．０であり、顕著な増殖倍率の向上効果が認められた。表１中において、治療適用性評価はＡ評価とした。

　培養開始日（播種）から４日目～６日目に、滑膜由来間葉系幹細胞を含む集団の細胞画像を取得し、細胞画像から滑膜由来間葉系幹細胞の密度情報（推定密度分布）を、カーネル密度推定により導出した。
　次いで、推定密度分布を参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行い推定密度分布内の同じ極大点に収束した間葉系幹細胞の集まりをコロニーとして検出した。
　検出したコロニーから、平均コロニーサイズ及びコロニー形成単位（ＣＦＵ）を導出した結果、以下の通りとなった。
・Ｇ０検体：培養開始日から６日後にコロニー検出、平均コロニーサイズ１．１５０ｍｍ、ＣＦＵ０．９４７／ｍｍ^２
・Ｇ１検体：培養開始日から５日後にコロニー検出、平均コロニーサイズ０．８３０ｍｍ、ＣＦＵ０．３４４／ｍｍ^２
・Ｇ２検体：培養開始日から４日後にコロニー検出、平均コロニーサイズ０．７８２ｍｍ、ＣＦＵ０．３６８／ｍｍ^２
・Ｇ３検体：培養開始日から４日後にコロニー検出、平均コロニーサイズ０．８１６ｍｍ、ＣＦＵ０．３１１／ｍｍ^２
・Ｇ４検体：培養開始日から６日後にコロニー検出、平均コロニーサイズ１．０３０ｍｍＣＦＵ０．５７５／ｍｍ^２
・Ｇ５検体：培養開始日から４日後にコロニー検出、平均コロニーサイズ０．７７７ｍｍ、ＣＦＵ０．３４０／ｍｍ^２

　表１に記した結果から、本開示の関節症治療剤の製造方法により製造される関節症治療剤は、培養の途中において間葉系幹細胞の増殖予測を優れた精度で行うことができ、関節症治療に適した関節症治療剤を製造可能であることが分かる。
　また、回収細胞数及び増殖倍率には、培養中の間葉系幹細胞の平均コロニーサイズ及びＣＦＵが寄与することが分かる。

＜＜半月板治療剤としての適用＞＞
　実施例２においてＧ０検体～Ｇ５検体から製造された滑膜由来間葉系幹細胞を、自家細胞治療として半月板損傷患者の半月板損傷箇所に移植した。
　滑膜由来間葉系幹細胞が移植された半月板損傷患者において、移植５２週後までに良好な症状緩和が認められた。
　症状のスコアとして知られるリスホルムスコア（下記表２を参照、評価担当者が実施）において、治療前と比較し移植５２週後では、２２点以上の改善が確認され、ＭＲＩ（磁気共鳴画像診断）での半月板確認においても、整復されていることが認められ、良好な治療成績を示すことが分かった。

Claims

　培養している複数の間葉系幹細胞を含む集団を撮影することにより、細胞画像を取得し、
　前記細胞画像を解析することにより、前記細胞画像内の前記間葉系幹細胞の密度情報を導出し、
　前記密度情報に基づいて、前記集団において前記間葉系幹細胞が形成するコロニーを検出し、
　検出されるコロニーから導出される平均コロニーサイズ及びコロニー形成単位の少なくとも一方に基づいて、前記集団の選別を行う、
関節症治療剤の製造方法。
　前記密度情報が、カーネル密度推定により導出される、前記細胞画像における前記間葉系幹細胞の推定密度分布である、請求項１に記載の関節症治療剤の製造方法。
　前記コロニーの検出が、前記推定密度分布を参照したｍｅａｎ－ｓｈｉｆｔを行い、前記推定密度分布内の同じ極大点に収束する前記間葉系幹細胞の集まりをコロニーとして検出することにより行われる、請求項２に記載の関節症治療剤の製造方法。
　前記コロニーの検出が、培養開始日から４日目～６日目において行われ、
　前記集団の選別が、下記条件ａ１）及び条件ｂ１）の少なくとも一方を満たす集団を選別することにより行われる、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の関節症治療剤の製造方法。
ａ１）培養開始日から４日目～６日目のいずれかの時点における前記集団に含まれる前記間葉系幹細胞の平均コロニーサイズが０．７４０ｍｍ以上である。
ｂ１）培養開始日から４日目～６日目のいずれかの時点における前記集団に含まれる前記間葉系幹細胞のコロニー形成単位が０．２５０／ｍｍ^２以上である。
　前記間葉系幹細胞が、生体組織を酵素により処理することにより得られる、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の関節症治療剤の製造方法。
　前記生体組織の酵素による処理において、コラゲナーゼ及び中性プロテアーゼを少なくとも１種ずつ含む、酵素混合物が使用される、請求項５に記載の関節症治療剤の製造方法。
　前記生体組織の酵素による処理において、前記酵素の使用量に対する前記生体組織の使用量の比が、質量基準で、１０～１０００である、請求項５又は請求項６に記載の関節症治療剤の製造方法。
　前記間葉系幹細胞が、前記生体組織の酵素による処理により得られる組織消化液を、上清中の残存酵素濃度が０．５ｎｇ／ｍＬ以下となるまで洗浄することにより得られる、請求項５～請求項７のいずれか一項に記載の関節症治療剤の製造方法。
　前記間葉系幹細胞が、滑膜由来の細胞である、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の関節症治療剤の製造方法。
　前記間葉系幹細胞が、ヒト由来の細胞である、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の関節症治療剤の製造方法。
　請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載の関節症治療剤の製造方法により製造される、関節症治療剤。