CN110283782A - 一种人骨髓间充质干细胞株的建立方法和诱导分化应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人骨髓间充质干细胞株的建立方法和诱导分化应用，本发明提取的股骨干髓腔来源的骨髓间充质干细胞纯度高、活性好，完全能够满足干细胞成骨诱导分化等一系列实验，提取的骨质疏松患者骨髓间充质干细胞与正常人的相比转录组学上存在表达差异，为进一步揭示骨髓间充质干细胞在骨质疏松症的发病机制和寻找新的治疗靶点，提供了新的思路和方法。同时，针对骨质疏松症等骨髓间充质干细胞含量较少的样本，本技术亦能有效增加提取后的细胞获得量，增加贴壁细胞数量，促进细胞更快进入对数生长期，减少培养时间，降低培养成本，更易于保持骨髓间充质干细胞的细胞干性，从而满足成骨分化、干细胞治疗等一系列实验需求。

Description

一种人骨髓间充质干细胞株的建立方法和诱导分化应用

技术领域

本发明涉及骨科疾病治疗方法的相关领域，具体为一种人骨髓间充质干细胞株的建立方法和诱导分化应用。

背景技术

原发性骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构退化为特征，随着骨的脆性增高、发生骨折危险性增加的一种全身性骨病。目前的研究认为造成骨质疏松症的原因是骨组织中骨形成明显减少、骨吸收过程相对增强。而骨髓间充质干细胞的数量减少及分化能力的减弱，导致了分化为成骨细胞及骨细胞减少，使得成骨活性减弱，因此在原发性骨质疏松症疾病模型的研究中，骨髓间充质干细胞是其发病机制的重要的研究对象。同时，骨髓间充质干细胞是一种存在于骨髓基质中并能分化为成骨、软骨、脂肪、神经和肌肉细胞等的多潜能细胞，具有高度的自我更新和低分化特性。因而提取高纯度、高细胞活性的骨髓间充质干细胞，在支持机体造血、生物基因工程、疾病模型研究等方面具有广阔的应用前景和重要临床价值。

既往较为成熟的针对人骨髓间充质干细胞分离提纯培养的技术，采用的方法是从自愿捐献的正常人髂前上棘进行穿刺，抽取红骨髓约5-10ml，之后通过全骨髓贴壁法、密度梯度离心法或磁珠分选法获得纯度较高的人骨髓间充质干细胞。该种方法获得的是自愿捐献的正常成年人的骨髓间充质干细胞，提取步骤繁复、耗时较长、细胞容易污染、成本较高，针对一些特殊病理模型，尤其是老年性骨质疏松患者髂前上棘的骨髓间充质干细胞含量较低时，创伤较大、获取困难、适用性较差。

目前的一些研究发现，在卵巢切除的骨质疏松动物模型和人类衰老引发的老年性骨质疏松症中，骨密度的降低伴随着骨髓脂肪化，同时骨髓髓腔的红骨髓比例也进一步降低。这种骨髓“老化”现象导致的是松质骨及大段长骨中所含有的骨髓间充质干细胞数量减少，脂肪细胞、基质细胞等其他细胞比例增加，加大了提取大量骨髓间充质干细胞的难度。同时在体内受氧化应激、激素水平下降、机体功能衰退等因素的影响，骨髓间充质干细胞细胞表现为活性下降、分化功能降低且相对脆弱，使得分离和培养骨质疏松患者的骨髓间充质干细胞比正常人的更为困难。因此，采用一般的分离方法更加容易导致细胞破裂和凋亡坏死，并且出现培养成活率低、细胞纯度达不到实验要求等情况，对于骨质疏松症的研究造成了困扰。然而对于现有的方法技术，尚缺乏一种能够针对骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞更好的提取方法和技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人骨髓间充质干细胞株的建立方法和诱导分化应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种人骨髓间充质干细胞株的建立方法，包括预先准备、骨髓间充质干细胞分离液配制以及骨髓间充质干细胞的分离培养，具体地，包括如下方法步骤：

预先准备：预先准备包括招募针对骨质疏松患者的实验对象、确定实验仪器以及准备所需试剂；

骨髓间充质干细胞分离液配制：配制包括右旋糖酐40氯化钠注射液275ml，碘海醇注射液150ml，稀释缓冲液约100ml的骨髓间充质干细胞分离液，在配制溶液中加入适量细胞营养物质；

骨髓间充质干细胞的分离培养：事先制备三种不同浓度的骨髓间充质干细胞分离液，与市面上购买的常规淋巴细胞分离液一起验证细胞获得率，将其分为四组，依据分组情况事先对骨髓间充质干细胞分离液或淋巴细胞分离液进行分装，每个离心管放入3ml备用；在纳入对象中，于实施髓内钉内固定或髋关节置换手术中抽取股骨髓腔内的红骨髓5-10ml，加入含肝素钠的抗凝管中4℃保存，收集的红骨髓在2小时内转移至实验室完成骨髓间充质干细胞的分离提取工作，在无菌工作台上，将红骨髓与磷酸盐缓冲液按照2：1比例稀释后经灭菌的200目细胞筛过滤，去除脂肪组织、骨组织，制成细胞悬浮液，将约3ml细胞悬浮液加入缓慢加入装有不同密度的骨髓间充质干细胞分离液或淋巴细胞分离液的离心管中，经500g，20℃离心20min后，用吸管小心吸取第二层环装乳白色细胞层至新的无菌15ml离心管中，向所得离心管中加入约10ml PBS混匀，经过250g，20℃离心10min后弃上清，加入5ml含10％FBS的DMEM细胞培养液轻轻吹打混匀，取20μL细胞悬液加入细胞计数板内，于Countstar自动细胞计数仪上对各组细胞进行计数；将剩余细胞悬液种植于T25细胞培养瓶，置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养，种植后的24h进行细胞换液，除去死亡的或未贴壁的细胞及漂浮的细胞团块等，以后每2-3天换液一次，以获得生长呈旋涡状、形态扁平梭状等多型性的骨髓间充质干细胞，并进行传代培养，在不同密度的分离液获得的贴壁细胞中，分别在种植后24h、72h和144h于显倒置显微镜下随机选择三个视野进行拍摄，计数四个组别的细胞数量和增殖情况。

优选的是，骨髓间充质干细胞分离液配制中的具体配制步骤为：将右旋糖酐40氯化钠注射液275ml、碘海醇注射液150ml进行混合，之后缓慢加入稀释缓冲液约100ml，搅拌均匀，在液体密度测定仪上测定混合后溶液密度，并用适量稀释液调整至1.077-1.089g/ml，滤过除菌后放入2-4℃冰箱保存备用。

一种人骨髓间充质干细胞株的诱导分化应用，包括基于上述针对骨质疏松患者的配置的骨髓间充质干细胞分离液的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提取的股骨干髓腔来源的骨髓间充质干细胞纯度高、活性好，完全能够满足干细胞成骨诱导分化等一系列实验，提取的骨质疏松患者骨髓间充质干细胞与正常人的相比转录组学上存在表达差异，为进一步揭示骨髓间充质干细胞在骨质疏松症的发病机制和寻找新的治疗靶点，提供了新的思路和方法，具体地，通过对股骨颈/股骨粗隆间/股骨干骨折的患者在手术中抽取少量红骨髓提取骨髓间充质干细胞，满足对骨质疏松症等特殊类型疾病的人类来源的细胞系构建，较常规提取方法能够有效保持骨髓间充质干细胞离体后的活性，避免因提取时间过长或提取步骤过多造成细胞活性下降、纯度降低等问题，进一步造成分离提取失败。同时，针对骨质疏松症等骨髓间充质干细胞含量较少的样本，本技术亦能有效增加提取后的细胞获得量，增加贴壁细胞数量，促进细胞更快进入对数生长期，减少培养时间，降低培养成本，更易于保持骨髓间充质干细胞的细胞干性，从而满足成骨分化、干细胞治疗等一系列实验需求，具有较大的应用前景和社会效益。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种人骨髓间充质干细胞株的建立方法，包括预先准备、骨髓间充质干细胞分离液配制以及骨髓间充质干细胞的分离培养，具体地，包括如下方法步骤：

预先准备：预先准备包括招募实验对象、确定实验仪器以及准备所需试剂，以实现骨髓间充质干细胞的分离提取，具体地，招募实验对象包括如下步骤：按照一定的纳入标准和排除标准，招募昆明医科大学第二附属医院创伤外科2018年06月至2019年01月收治的成年患者作为纳入对象，所有纳入对象在入院后均接受昆明医科大学第二附属医院双能X线骨密度仪的检测及相关术前检查，包括BMD检测，除常规术前检查外，完善包括生化全套、维生素D及骨代谢四项等检查，最终，本实验共纳入了5例骨密度正常及15例患有骨质疏松的研究对象，采集研究对象的原代骨髓间充质干细胞并收集临床资料，该方案已经昆明医科大学第二附属医院医学伦理委员会审批通过，其中，伦理审批号为审-PJ-2018-35，所有受试患者及法定代表人充分理解病情及本临床研究相关风险，均同意并签署知情同意书；确定实验仪器即准备实验所需的仪器，并标注厂商，确保来源正规；准备所需试剂即准备实验所需的试剂和材料；

骨髓间充质干细胞分离液配制：本研究参考常规淋巴细胞分离液的组成成分进行改良，在配制溶液中加入适量细胞营养物质，保证分离过程中骨髓间充质干细胞的细胞活性，配制的骨髓间充质干细胞分离液中包含有右旋糖酐40氯化钠注射液275ml，碘海醇注射液150ml，稀释缓冲液约100ml；

骨髓间充质干细胞的分离培养：本实验事先制备了三种不同浓度的骨髓间充质干细胞分离液，其密度分别为1.077g/ml、1.083g/ml、1.089g/ml，与市面上购买的常规淋巴细胞分离液，密度约1.080g/ml，一起验证细胞获得率，分组情况为A组：密度为1.077g/ml骨髓间充质干细胞分离液组，B组：密度为1.083g/ml骨髓间充质干细胞分离液组，C组：密度为1.089g/ml骨髓间充质干细胞分离液组，D组：淋巴细胞分离液组。依据分组情况事先对骨髓间充质干细胞分离液或淋巴细胞分离液进行分装，每个离心管放入3ml备用；在纳入对象中，于实施髓内钉内固定或髋关节置换手术中抽取股骨髓腔内的红骨髓5-10ml，加入含肝素钠的抗凝管中4℃保存，收集的红骨髓在2小时内转移至实验室完成骨髓间充质干细胞的分离提取工作，在无菌工作台上，红骨髓与磷酸盐缓冲液2：1稀释后经灭菌的200目细胞筛过滤，去除脂肪组织、骨组织等，制成细胞悬浮液，将约3ml细胞悬浮液加入缓慢加入装有不同密度的骨髓间充质干细胞分离液或淋巴细胞分离液的离心管中，经500g，20℃离心20min后，用吸管小心吸取第二层环装乳白色细胞层至新的无菌15ml离心管中，向所得离心管中加入约10ml PBS混匀，经过250g，20℃离心10min后弃上清，加入5ml含10％FBS的DMEM细胞培养液轻轻吹打混匀，取20μL细胞悬液加入细胞计数板内，于Countstar自动细胞计数仪上对各组细胞进行计数，获得不同组别细胞获得率，统计结果见表4；

而将剩余细胞悬液种植于T25细胞培养瓶，置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养，种植后的24h进行细胞换液，除去死亡的或未贴壁的细胞及漂浮的细胞团块等，以后每2-3天换液一次，以获得生长呈旋涡状、形态扁平梭状等多型性的骨髓间充质干细胞，并进行传代培养，在不同密度的分离液获得的贴壁细胞中，本研究观察了骨质疏松组在种植后的各时期细胞生长情况，分别在种植后24h、72h和144h于显倒置显微镜下随机选择三个视野进行拍摄，其中，种植后24h属于第一次换液后，计数四个组别的细胞数量和增殖情况，不同组别在种植后各时间点的细胞计数的统计结果见表5。

上述实施例的招募实验对象步骤中，进一步的，纳入标准为：a.既往身体健康，近3个月无长期药物服用史，年龄在18-75岁成年人，b.绝经女性患者需满足绝经时间在一年以上，c.入院诊断为单侧股骨颈骨折、股骨粗隆间骨折或股骨干骨折需行髓内钉内固定或髋关节置换的手术患者；排除标准为：a.既往患有重大疾病，包括癌症、心脑血管疾病、风湿免疫性疾病、精神疾病等，b.绝经前妇女经常出现月经不规律包括经期时间缩短或延长等，仍处于围绝经期妇女，或既往患有妇科相关重大疾病，c.确诊为继发性骨质疏松症患者，包括有长期服用激素史、内分泌紊乱、结缔组织病、胃肠道及营养性疾病等导致的继发性骨质疏松，d.长期服用抗骨质疏松及影响骨骼细胞活性等药物，e.患者自身不能耐受手术或拒绝手术者；BMD主要测定腰椎L1-L4及单侧髋部BMD，明确骨质疏松情况；当T值≤－2.5SD可诊断为骨质疏松，划分为骨质疏松组，当－1SD<T值≤1SD可诊断为BMD正常，划为正常对照组。

上述实施例的预先准备步骤中，实验所需仪器具体如下表1所示：

表1

主要仪器设备	厂商
		低温离心机	Sigma，USA
液氮容器	成都金凤液氮容器有限公司
		高压灭菌锅	致微仪器有限公司
净化工作台	上海汇龙仪表电子有限责任公司
		细胞培养箱	Thermo，USA
倒置显微镜	德国leica
		-20℃生物储存冰箱	海尔
多种量程移液器	Thermo，USA
		激光共聚焦显微镜	Olympus，Melville，NY，USA
冰点渗透压仪	德国Loser，OM815
		液体密度测定仪	仪特诺，ET-03L
自动细胞计数仪	Countstar，IC1000
		水平脱色摇床	其林贝尔，TS-100型
迷你离心机	其林贝尔，LX-200型
		涡旋混合器	Servicebio
光学显微镜	日本OLYMPUS公司
		多功能光酶标仪	BD
精密电子分析天平	德国赛多利斯
		-80℃冰箱	海尔

。

上述实施例的预先准备步骤中，实验所需的试剂具体如下表2所示：

表2

进一步的，骨髓间充质干细胞分离液配制中的具体配制步骤为：

骨髓间充质干细胞分离液配制：将右旋糖酐40氯化钠注射液275ml、碘海醇注射液150ml进行混合，之后缓慢加入稀释缓冲液约100ml，搅拌均匀，在液体密度测定仪上测定混合后溶液密度，并用适量稀释液调整至1.077-1.089g/ml，滤过除菌后放入2-4℃冰箱保存备用。

进一步的，上述稀释缓冲液的配置步骤为：稀释缓冲液配制：依次称量氯化钙、九水合硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸，加入适量蒸馏水，用轻微搅拌溶解，用1mol/L的氢氧化钠溶液或盐酸溶液调定pH至7.35-7.45，并定容至500ml，滤过除菌后放入2-4℃冰箱保存备用，稀释缓冲液配制的称量具体如下表3所示：

表3

一种人骨髓间充质干细胞株的诱导分化应用，包括基于上述针对骨质疏松患者的配置的骨髓间充质干细胞分离液的应用，具体地，包括骨髓间充质干细胞的鉴定和成骨的分化应用和骨髓间充质干细胞转录分析的应用；

骨髓间充质干细胞的鉴定和成骨的分化应用中，获取的原代骨髓间充质干细胞每3-5天传代一次，常规培养液为含10％FBS、100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的DMEM，细胞融合度达到80％以上时，弃除旧培养液并进行细胞传代，PBS冲洗两次，滴加2ml 0.25％胰酶并轻轻晃动拍打培养瓶，消化2min后加入10-12ml含10％FBS的DMEM培养液，轻轻吹打直到细胞全部悬浮为止；根据细胞数量，采用一传二或一传三的方式进行传代培养，在采集自同一研究对象的不同分离方法获得的骨髓间充质干细胞中，选取1.083g/ml骨髓间充质干细胞分离液所得到的传代稳定的P1代骨髓间充质干细胞，进行细胞纯度鉴定和成骨分化验证，得出一定的结果，进而分析其应用规律；

骨髓间充质干细胞转录分析的应用中，获得的骨髓间充质干细胞中，筛选年龄相近、无基础疾病患者的骨髓间充质干细胞，其中5株为骨密度正常组，6株为骨质疏松组，收集各株细胞采用总RNA提取试剂盒，按照使用说明进行总RNA的提取，提取出的总RNA采用NanoDrop核酸定量仪进行定量，找出符合OD260/280范围在1.8-2.0之间的总RNA，取20μl进行RNA-seq测序分析，剩余冻存-80℃备用，根据测序分析，进而得出其应用规律。

进一步的，骨髓间充质干细胞的鉴定中，具体地，包括如下分化应用实验：

骨髓间充质干细胞鉴定：a.细胞的准备和固定，取传代的P1代细胞用0.25％胰酶消化2min，至所有细胞脱落，随后加入含10％FBS的DMEM培养液吹打混匀，取少量细胞悬液进行细胞计数，调整细胞密度至1×10³至1×10⁴/ml后种植于4孔腔室载玻片里，培养1-2天至细胞融合度达到80％以上后，弃培养液并用PBS洗涤2次，在室温下用4％多聚甲醛将处理好的骨髓间充质干细胞固定30min，再用0.4％Triton X-100对细胞进行透化处理10min；b.免疫荧光染色和封片：1)封闭：经透化处理的细胞，用PBS进行洗涤，5min/次，清洗3次后，5％BSA室温封闭30min；2)孵育CD105一抗：弃去封闭液，直接滴加用2％BSA稀释的CD105一抗，4℃过夜；3)孵育抗兔荧光二抗：第二天，回收一抗，用PBS清洗，5min/次，清洗3次，将用2％BSA稀释好的对应的抗兔荧光二抗滴加到玻片上面，室温孵育1h(此步骤开始避光，以后每一步都注意避光)；4)孵育CD45一抗：用PBS进行清洗，5min/次，清洗3次，滴加用2％BSA稀释好了的CD45一抗，4℃过夜；5)孵育抗鼠荧光二抗：第三天，回收一抗。用PBS清洗，5min/次，清洗3次，将用2％BSA稀释好的抗鼠荧光二抗滴加到玻片上面，室温孵育1h；6)染细胞核：弃去二抗，用PBS清洗3次，每次5min，滴加DAPI进行染核，室温孵育10min；7)封片：弃去DAPI，用PBS清洗3次，每次5min，用抗淬灭剂封片剂进行封片；8)观察结果：用激光共聚焦显微镜对染色结果进行观测并收集数据；c.得出免疫荧光染色结果：对1.083g/ml骨髓间充质干细胞分离液所得骨髓间充质干细胞和常规淋巴细胞分离液所得骨髓间充质干细胞，采用细胞特异性表面抗原CD105和CD45进行免疫荧光染色，骨髓间充质干细胞免疫荧光染色结果统计见表6；

骨髓间充质干细胞的成骨诱导：a.成骨诱导：取P1代对数期生长的骨髓间充质干细胞，滴入2ml 0.25％胰酶并轻轻晃动拍打，消化2min后加入10-12ml含10％FBS的DMEM培养液轻轻吹打直到细胞全部悬浮为止，取适量细胞悬液进行细胞计数，调整至1×10³×至1×10⁴/ml接种于12孔板，放置培养箱24小时细胞贴壁后弃旧培养液，加入含有10nM地塞米松、0.2mg/ml L-抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠、10％FBS、100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的DMEM成骨诱导培养液，每两天换成骨诱导液一次，连续培养18-21天。b.碱性磷酸酶活性检测：1)细胞准备：在对1.083g/ml骨髓间充质干细胞分离液所得正常对照组和骨质疏松组中的骨髓间充质干细胞进行成骨诱导，分别取在成骨诱导后的第6、10、14、18天细胞，去除培养液并用PBS洗2次后，加入0.25％胰酶消化2min，加入适量10％FBS的DMEM培养液并进行细胞计数，调整细胞数至1×10⁴/ml，取1ml细胞悬液经室温，1000转离心2min后加入细胞裂解液并充分震荡裂解，经12000转离心5min后吸取上清待用；2)碱性磷酸酶的测定：参照碱性磷酸酶检测试剂盒说明书，分别设置空白对照、标准品、样品组，按照对应试剂及步骤依次进行操作，最后于酶标仪中检测405nm的吸光值，根据酶活性定义计算样品中的碱性磷酸酶活性；3)计算各组不同时间的碱性磷酸酶活性，得出结论，其中各组成骨诱导不同时间点的碱性磷酸酶活性检测结果见表7。c.茜素红染色：1)细胞固定：在对1.083g/ml骨髓间充质干细胞分离液所得正常对照组和骨质疏松组中的骨髓间充质干细胞进行成骨诱导，分别取在成骨诱导后的第10、14、18、21天细胞，去除培养液，PBS清洗2次，加入4％对聚甲醛固定15min，蒸馏水洗去固定液；2)茜素红染色：按照茜素红染色液说明书，加入适量茜素红S染液染色30min，蒸馏水冲洗2-3次，随机选择不同三个视野于普通光学显微镜下进行拍摄：3)通过Imaging J软件对两组的不同时间点茜素红染色拍摄图片进行钙结晶程度的图像分析，各组成骨诱导不同时间点的茜素红钙结节染色统计结果见表8。

进一步的，骨髓间充质干细胞转录分析中，所得测序原始结果使用Hisat2软件比对至参考基因组上，采用HTseq软件计算转录本表达水平，并用R软件包DEseq2进行差异表达分析，对于有生物学重复的数据，差异显著性的标准为padj<0.0，与正常对照组相比，骨质疏松症患者的骨髓间充质干细胞共有187个差异表达基因，其中上调的有119个,下调的有68个，其中排位前10的上调和下调的表达基因见表9。

实验结果统计与分析：

不同组别细胞获得率的统计结果如下表4：

表4

组别	A组(10<sup>5</sup>/ml)	B组(10<sup>5</sup>/ml)	C组(10<sup>5</sup>/ml)	D组(10<sup>5</sup>/ml)
					骨质疏松组	3.323±0.208	3.665±0.230	2.920±0.111	2.110±0.229
骨密度正常组	4.208±0.107	4.888±0.105	3.975±0.125	3.972±0.108

；

上表分析及结果表明：本技术从骨质疏松组和骨密度正常组的红骨髓中均能有效提取分离细胞，其中密度为1.083g/ml骨髓间充质干细胞分离液相较于其他组获得的细胞数较多，即有效获取分离骨质疏松患者和正常人的骨髓间充质干细胞，增加红骨髓中目标细胞获得率并减少细胞损失。

计数四个组别的细胞数量和增殖情况如下表5：

表5

上表分析及结果表明：在开始种植的1-2天，大部分贴壁细胞呈圆形或类圆形的明亮细胞，少数伴有突起；4-7天时圆形细胞减少，大多数变为梭形、多角形细胞，并呈旋涡状分布开始快速增殖分裂，随着培养时间的增加，各组细胞逐渐成对数增长，其中在相同时间内B组细胞增殖速度较快，D组细胞生长较慢，表明密度为1.083g/ml骨髓间充质干细胞分离液在分离培养过程中对细胞损伤较小，能够较大限度提取骨髓间充质干细胞，并在原代贴壁培养中表现出较快的增殖速度，由此可见，密度为1.083g/ml骨髓间充质干细胞分离液能够减少分离培养过程中的细胞损伤，使得获得细胞活性高并加快增殖速度，更快达到实验所需细胞数量。

骨髓间充质干细胞免疫荧光染色结果统计如下表6：

表6

组别	DAPI(个/视野)	CD105/DAPI	CD45/DAPI
				统计结果	51.34±6.82	0.97±0.08	0.02±0.01

；

上表分析及结果表明：结果显示两组细胞的CD105表达阳性、CD45表达阴性，表面骨髓间充质干细胞分离液能够从红骨髓中获取大量骨髓间充质干细胞，且其纯度高、特异性好，能够满足各种对骨髓间充质干细胞相关实验的要求。

各组成骨诱导不同时间点的碱性磷酸酶活性检测结果如下表7：

表7

组别	6天(EDA)	10天(EDA)	14天(EDA)	18天(EDA)
					骨质疏松组	0.053±0.025	0.138±0.022	0.263±0.041	0.358±0.055
骨密度正常组	0.060±0.029	0.128±0.021	0.275±0.047	0.370±0.039

；

上表分析及结果表明：随着时间的延长，其碱性磷酸酶活性逐渐升高，成骨诱导效果显著，骨质疏松组和正常组在相同时间点的碱性磷酸酶活性无显著差异。

各组成骨诱导不同时间点的茜素红钙结节染色统计结果如下表8：

表8

上表分析及结果表明：细胞分化培养至14天时钙结晶开始增加，并随着分化培养时间的延长逐渐增多，骨质疏松组和正常组在相同时间点的钙结晶量并无显著差异，故而1.083g/ml骨髓间充质干细胞分离液所得细胞能够成功进行诱导分化，随着诱导分化时间的增加其细胞内碱性磷酸酶活性和生成的钙结晶逐渐增多，因此本技术所得骨髓间充质干细胞能够完全能够满足干细胞成骨诱导分化的实验要求。

排位前10的上调和下调的表达基因如下表9：

表9

上表分析及结果表明：本技术所得正常骨密度和骨质疏松患者来源的骨髓间充质干细胞，在基因转录表达上存在一定差异，为从基因分子水平寻找骨质疏松成骨分化障碍的发病机制提供理论依据，也为进一步寻找有效靶向药物提供新的思路。

根据上述分析结果得出总结论：本发明提取的股骨干髓腔来源的骨髓间充质干细胞纯度高、活性好，完全能够满足干细胞成骨诱导分化等一系列实验，提取的骨质疏松患者骨髓间充质干细胞与正常人的相比转录组学上存在表达差异，为进一步揭示骨髓间充质干细胞在骨质疏松症的发病机制和寻找新的治疗靶点，提供了新的思路和方法，具体地，通过对股骨颈/股骨粗隆间/股骨干骨折的患者在手术中抽取少量红骨髓提取骨髓间充质干细胞，满足对骨质疏松症等特殊类型疾病的人类来源的细胞系构建，较常规提取方法能够有效保持骨髓间充质干细胞离体后的活性，避免因提取时间过长或提取步骤过多造成细胞活性下降、纯度降低等问题，进一步造成分离提取失败。同时，针对骨质疏松症等骨髓间充质干细胞含量较少的样本，本技术亦能有效增加提取后的细胞获得量，增加贴壁细胞数量，促进细胞更快进入对数生长期，减少培养时间，降低培养成本，更易于保持骨髓间充质干细胞的细胞干性，从而满足成骨分化、干细胞治疗等一系列实验需求，具有较大的应用前景和社会效益。

值得注意的是，上述实施例中涉及的方法学背景如下：在成年人中，红骨髓存在于肱骨、股骨等长骨的骨髓腔或胸骨、髂骨等扁平骨的稀松骨质间的网眼中，红骨髓中包含了大量造血干细胞、骨髓间充质干细胞、骨髓基质细胞等，在人体造血、成骨、组织修复等方面起到了重要的作用。因此骨髓间充质干细胞主要从红骨髓中提取分离培养而来，而创伤导致的长骨骨折能够在手术治疗时从髓腔获得大量红骨髓，为除髂骨以外的部位分离提取人的骨髓间充质干细胞提供了可能。股骨颈、股骨粗隆间骨折或股骨干骨折是骨质疏松症患者较为常见的骨折部位，而低能量或非暴力损伤如平面跌倒等，是髋部骨折最常见的原因，由于致残致死率高、并发症多，常常需要手术治疗。在手术中从骨质疏松患者股骨骨折部位一部分红骨髓并分离提取骨髓间充质干细胞，将是研究骨质疏松症的良好的对象。一些骨密度正常人由于高能量暴力损伤如高处坠落、车祸等导致的相同部位骨折，从红骨髓中提取而来的骨髓间充质干细胞是最佳的正常对照研究对象。

骨髓间充质干细胞来源有限，在骨髓中的含量大约占到了0.01-0.1％，但由于其增殖能力较强，能够在体外培养并自我繁殖为传代稳定的细胞系。在成骨细胞谱系中，典型的骨髓间充质干细胞特异性表达CD29、CD44、CD105等细胞表面抗原，不表达CD14、CD34、CD45等细胞表面抗原，通过流式细胞技术或免疫荧光染色等方法特异性标记表面标志物可以进一步对骨髓间充质干细胞鉴定并计算细胞纯度，同时区别于造血细胞。

骨髓间充质干细胞是一种多潜能干细胞，在体外通过诱导培养基可以进一步分化为成骨细胞、心肌细胞、神经细胞等。骨髓间充质干细胞成骨诱导培养技术日趋完善，多项研究均报道了骨髓间充质干细胞在含有10nM地塞米松、0.2mg/ml L-抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠的培养基中诱导分化14-21天，刺激细胞内核心结合因子α1、碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙素等表达增加，并可作为成骨分化的重要标志。因此本技术利用分离提取的骨髓间充质干细胞，进一步验证了成骨分化的情况，探究通过本技术分离培养的骨髓间充质干细胞在骨质疏松症等疾病模型中的应用。

在上述实施例中，还值得注意的是：稀释缓冲液成分可根据细胞的特性进行适当调整，加入细胞生长因子或细胞必要营养物质，以保持细胞分离提取过程中的活性；稀释缓冲液的量不同，可调配出不同密度的骨髓间充质干细胞分离液，不同密度的分离液提取出细胞量将不同，同时提取结果也与温度、离心条件、分离液与细胞悬液比例等相关，本技术针对适当稀释后的红骨髓悬液，经实验摸索提取的最佳条件为：红骨髓悬液：1.083g/ml骨髓间充质干细胞分离液＝3ml：3ml，经500g，20℃离心20min后，用吸管小心吸取第二层环装乳白色细胞层，所获细胞获得量及贴壁细胞数量最多。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种人骨髓间充质干细胞株的建立方法，其特征在于：包括预先准备、骨髓间充质干细胞分离液配制以及骨髓间充质干细胞的分离培养，具体地，包括如下方法步骤：

预先准备：预先准备包括招募针对骨质疏松患者的实验对象、确定实验仪器以及准备所需试剂；

骨髓间充质干细胞分离液配制：配制包括右旋糖酐40氯化钠注射液275ml，碘海醇注射液150ml，稀释缓冲液约100ml的骨髓间充质干细胞分离液，在配制溶液中加入适量细胞营养物质；

骨髓间充质干细胞的分离培养：事先制备三种不同浓度的骨髓间充质干细胞分离液，与市面上购买的常规淋巴细胞分离液一起验证细胞获得率，将其分为四组，依据分组情况事先对骨髓间充质干细胞分离液或淋巴细胞分离液进行分装，每个离心管放入3ml备用；在纳入对象中，于实施髓内钉内固定或髋关节置换手术中抽取股骨髓腔内的红骨髓5-10ml，加入含肝素钠的抗凝管中4℃保存，收集的红骨髓在2小时内转移至实验室完成骨髓间充质干细胞的分离提取工作，在无菌工作台上，将红骨髓与磷酸盐缓冲液按照2：1比例稀释后经灭菌的200目细胞筛过滤，去除脂肪组织、骨组织，制成细胞悬浮液，将约3ml细胞悬浮液加入缓慢加入装有不同密度的骨髓间充质干细胞分离液或淋巴细胞分离液的离心管中，经500g，20℃离心20min后，用吸管小心吸取第二层环装乳白色细胞层至新的无菌15ml离心管中，向所得离心管中加入约10mlPBS混匀，经过250g，20℃离心10min后弃上清，加入5ml含10％FBS的DMEM细胞培养液轻轻吹打混匀，取20μL细胞悬液加入细胞计数板内，于Countstar自动细胞计数仪上对各组细胞进行计数；将剩余细胞悬液种植于T25细胞培养瓶，置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养，种植后的24h进行细胞换液，除去死亡的或未贴壁的细胞及漂浮的细胞团块等，以后每2-3天换液一次，以获得生长呈旋涡状、形态扁平梭状等多型性的骨髓间充质干细胞，并进行传代培养，在不同密度的分离液获得的贴壁细胞中，分别在种植后24h、72h和144h于显倒置显微镜下随机选择三个视野进行拍摄，计数四个组别的细胞数量和增殖情况。

2.根据权利要求1所述的一种人骨髓间充质干细胞株的建立方法，其特征在于：骨髓间充质干细胞分离液配制中的具体配制步骤为：将右旋糖酐40氯化钠注射液275ml、碘海醇注射液150ml进行混合，之后缓慢加入稀释缓冲液约100ml，搅拌均匀，在液体密度测定仪上测定混合后溶液密度，并用适量稀释液调整至1.077-1.089g/ml，滤过除菌后放入2-4℃冰箱保存备用。

3.根据权利要求1-2任一所述的一种人骨髓间充质干细胞株的诱导分化应用，其特征在于：包括基于上述针对骨质疏松患者的配置的骨髓间充质干细胞分离液的应用。