CN109837239B - 一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物组织工程技术领域，公开了一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法，采用胶原酶分离法获得皮下和网膜组织来源的人脂肪间充质干细胞，原代培养至80％融合，再进行传代培养，并进行脂肪间充质干细胞的鉴定。选用生长良好的第三代细胞，加入无血清诱导培养基进行成脂、成骨诱导分化，最后进行油红O染色及茜素红染色鉴定分化效果及Real‑time RCR检测成脂、成骨基因表达情况。人脂肪组织易于获得，经原代培养所得的脂肪间充质干细胞足够存活量和存活期，且可诱导分化为成熟的成脂细胞和成骨细胞，为糖尿病、肥胖、骨质疏松症等代谢性疾病细胞治疗提供理想的种子细胞，为组织工程生物化骨、生物化脂肪提供新途径，有广阔的临床应用前景。

Description

一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法

技术领域

本发明属于生物组织工程技术领域，尤其涉及一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

人脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)诱导方式主要有体外诱导、基因修饰、蛋白转导与组织微环境诱导，其中体外诱导是采用不同刺激因子组合，将干细胞诱导分化为目的细胞。文献报道的运用间充质干细胞体外诱导分化为成脂、成骨细胞的研究报道非常多，主要有：1)均是由10％FBS的DMEM作为基础培养基配制的成脂、成骨分化诱导液。2)分化时间较长，大多在28天左右时间。其主要缺陷是：1)干细胞在含血清的培养基中分化为成脂细胞，受干扰因素非常多、分化周期长；2)传统的化学试剂大多有毒性，令人望而却步，影响后续临床应用；3)诱导后的成脂分化细胞低、状态不佳；4)各实验室诱导分化条件各异，诱导分化机制尚不明确，且诱导分化效率低；5)血清对于培养的原代细胞容易有支原体污染等，并且会影响干细胞的分化进程。

无血清诱导分化液是在基础分化液的基础上，加入成分明确的血清替代物，既能满足干细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因此，发展无血清分化技术是干细胞走向临床应用的重要条件。中国专利申请201210197360.6公开了一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基，改培养基以高糖型DMEM为基础培养基，添加了牛磺酸、还原性谷胱甘肽和铜蓝蛋白等组分，但还原性谷胱甘肽是对高糖环境下的成骨细胞起到保护作用，对脂肪间充质干细胞的成骨分化可起到促进作用，但对其成脂分化作用不大，存在细胞贴壁性差，增殖缓慢，且该组分较复杂的缺陷。中国专利申请201310134502.9公开了一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基，该培养基以低糖型DMEM为基础培养基，虽然添加了碱性成纤维生长因子、肝素和谷氨酰胺等组分，但脂肪间充质细胞由于取材等方面的影响，其生长增殖效果不够理想。中国专利申请CN104762260A公开了一种脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途，该方法获得的脂肪间充质干细胞纯度高达90％以上，其重点在于发现了能更好发挥干细胞的功能，达到抗衰老目的，并未研究诱导分化的作用。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)细胞增殖速率不够理想，细胞组分复杂，原代细胞来源于脂肪组织，除了我们所需的，间充质干细胞外，还含有成纤维细胞、前脂肪细胞及成熟的脂肪细胞，成分复杂，而且增殖缓慢，达不到实验所需的细胞量。

(2)诱导分化时间长，细胞老化状态不好，分化液对细胞有毒性等。传统分化需要28天，随着细胞老化及分化液对细胞的毒性，细胞状态不好，影响实验结果。

(3)传统分化液含血清，血清中生长因子和细胞因子影响了代谢性疾病细胞因子的检测，影响干细胞分化进程，导致研究误差大。

解决上述技术问题的意义：

本发明无血清的脂肪间充质干细胞成骨、成脂分化培养方法，不含血清，可避免批次间的差异和血清组分对细胞培养的影响，成本低；避免血清的外源性污染和对细胞毒性作用；避免了血清中生长因子和细胞因子影响代谢性指标的检测；成分明确，分化效率高，有利于研究细胞的生理调节机制。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法。

本发明是这样实现的，一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向分化方法，选取人皮下及网膜脂肪组织10g左右，胶原酶分离法获取原代脂肪干细胞，原代培养至80％融合，再进行传代培养，并采用流式细胞仪进行脂肪间充质干细胞的鉴定，选用生长良好的第三代细胞，加入无血清成脂、成骨诱导培养基培养，最后进行实验组和对照组的油红O染色及茜素红染色鉴定成脂、成骨分化效果及Real-time RCR检测成脂、成骨基因表达情况。

进一步，所述人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法包括以下步骤：

步骤一，采用胶原酶分离法获取人原代脂肪干细胞，分离培养至80％融合，再进行传代培养；

步骤二，选用生长良好的P3细胞，诱导脂肪间充质干细胞分化为成脂细胞:先用A液诱导3天，然后B液诱导2天，交替循环3次后，用B液继续维持7天；

步骤三，选用生长良好的P3细胞，诱导脂肪间充质干细胞分化为成骨细胞:加入无血清成骨分化液诱导细胞，每3天换液一次；

步骤四，诱导后成脂、成骨细胞鉴定:形态学观察法、油红O染色法、茜素红染色法；

步骤五，通过Real-time RNA进行实验组和对照组的成脂、成骨相关基因的表达情况。

诱导成脂分化的培养基由以下组分组成：包括A液和B液；A液：包括无血清DMEM/F12培养液、100μmol/L抗坏血酸、1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、10mg/L胰岛素、0.5mmol/L IBMX；B液：无血清DMEM/F12+10mg/L胰岛素；

A液：无血清DMEM/F12培养液中按浓度添加抗坏血酸、地塞米松、吲哚美辛、IBMX和胰岛素5ml，定容至500ml，经0.22μm针头滤器过滤除菌、分装，储存于4℃冰箱；B液：无血清DMEM/F12培养液中按所述浓度添加胰岛素5ml，定容至500ml，经0.22μm针头滤器过滤除菌、分装，储存于4℃冰箱。

成骨诱导分化液包含：无血清DMEM/F12培养液、地塞米松10-8mol/L0.1μmol/L、50mg/L抗坏血酸或维生素C 50mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L。配制如下：无血清DMEM/F12培养液按浓度添加抗坏血酸，β-甘油磷酸钠和地塞米松，定容至500ml，经0.22μm针头滤器过滤除菌、分装，储存于4℃冰箱。

配制对照组的含血清诱导培养基，即成脂诱导分化液包括A液和B液；A液：包括含10％血清的DMEM/F12培养液、100μmol/L抗坏血酸、1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、10mg/L胰岛素、0.5mmol/L IBMX；B液：10％血清的DMEM/F12+10mg/L胰岛素。成骨诱导分化液包含，10％血清DMEM/F12培养液、地塞米松10-8mol/L、50mg/L抗坏血酸或维生素C 50mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L。

胶原酶消化液提前配制保存包括如下步骤：称取100mg I型胶原酶，1g牛血清白蛋白，充分溶解于50ml PBS缓冲液中，即配成2％I型胶原酶+2％BSA的消化液，消化液经0.22μm针头滤器过滤除菌，以5ml为单位，分装成小管，-20℃避光储存备用。

地塞米松在培养基中的终浓度为1μM包括如下步骤：将称取好的7.8mg地塞米松溶于2ml无水乙醇之中，得到地塞米松储存液浓度为10mM，分装至EP管中，-20℃下储存备用，使用时1:1000进行稀释，使得培养基中的终浓度为1μM。

胰岛素在培养基中的终浓度为1μg/ml，包括如下步骤：1)酸化水的配制：0.1ml的冰醋酸加入4.9ml去离子双蒸水中，混合均匀后备用；2)工作液的配制：0.5ml酸化水中溶入胰岛素5mg，得到浓度为10mg/ml的工作液，将其分装至4个洁净EP管中，-20℃储存备用，使用时1:1000稀释，得到终浓度为1μg/ml的胰岛素。

1-甲基-3-异丁醇黄嘌呤(IBMX)在培养基中的终浓度为0.2nM，包括如下步骤：1mlDMSO中溶入称取好的IBMX 110mg，得到浓度为0.5mol/L的溶液，若溶解情况不佳，可适当加入1N的氢氧化钠帮助溶解，之后分装于不同的EP管中，-20℃储存备用，使用时取出1:1000进行稀释，得到终浓度为0.2nM的IBMX；

油红O染色剂的配制如下：称取0.35g油红O，加入100ml异丙醇溶液里，摇晃使充分混匀，静置8～10h后滤纸过滤，锡纸包裹避光常温密封保存。使用时以滤液：去离子水＝3：2的比例稀释，后用滤纸过滤2次。

本发明的另一目的在于提供一种所述原代培养的人脂肪干细胞及无血清分化方法在生物组织工程中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明成功建立了符合经典ADSCs鉴定标准的人ADSCs模型；用I型胶原酶消化法从符合条件的成人腹部皮下、网膜分离得到的脂肪组织，离心处理后得到基质血管成分(SVF)，将其接种后成功得到人ADSCs再通过不断换液、消化传代的方法去除杂细胞，获得较为纯净的ADSCs，细胞增殖非常活跃，P3、P6、P9、P15的细胞生长曲线均呈“S”形；成功建立符合经典ADSCs鉴定标准的状态良好的人ADSCs模型。在特定的诱导条件下可以分化为成熟的脂肪细胞、骨细胞，ADSCs向脂肪细胞定向分化用到了胰岛素、糖皮质激素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)等促脂肪形成因子，其中胰岛素和糖皮质激素是最常用到的成脂分化诱导物，当分化至第14天时90％的ADSCs都分化为脂肪细胞，分化率较高，加入胰岛素和地塞米松可以有效地诱导ADSCs的成脂分化，效果肯定，且显示本发明实施的无血清诱导分化方式比普通方法提高1.2倍。

本发明诱导人脂肪间充质干细胞分化为成脂细胞、成骨细胞的方法，采用无血清这一因素，14天就可获得成脂细胞，与现有技术21天的诱导时间相比，大大缩短了诱导分化时间；人离体脂肪细胞易于获得，分化后诱导所得的成脂细胞具有足够存货量和存活期，为糖尿病、肥胖等代谢性疾病细胞治疗提供理想的种子细胞，为糖尿病细胞移植治疗将提供新途径，具有广阔的临床应用前景，如下表1。

表1本发明与以往发明区别

附图说明

图1是本发明实施例提供的人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法流程图；

图2是本发明实施例提供的人脂肪间充质干细胞(hADSCs)形态学观察示意图；

图中：A为第3代细胞培养24h后，可见少量细胞贴壁生长，呈椭圆形及长梭形，并可见贴壁不牢的圆形细胞；B为培养48h后，细胞以长梭形为主，可见多角形和椭圆形细胞；C为第6代细胞，细胞形态较均一，呈长梭形；D为第9代细胞，细胞形态均一，排列呈旋涡状贴壁生长。E为ADSCs生长曲线；ADSCs传代培养的第1-2d为潜伏期，2-4d为指数增殖期细胞逐渐融合，第4d后进入平台期并达到峰值。P3、P6、P9、P15的细胞生长曲线均呈“S”形。

图3是本发明实施例提供的细胞免疫荧光鉴定CD44特异性染色示意图；

图4是本发明实施例提供的不同诱导条件下ADSCs成骨、成脂分化图；

图中：A-B，ADCSs成脂分化油红O染色图(×100)；A为含10％FBS诱导成脂分化液图；B为无血清诱导成脂分化液图，统计学显示两种成脂分化条件下，本发明实施的无血清诱导分化方式比普通方法提高1.6倍；C-D为ADCSs成骨分化茜素红矿化结节染色图(×100)；C为含10％FBS诱导成骨分化液图，统计学显示两种成骨分化条件下，本发明实施的无血清诱导分化方式比普通方法提高1.2倍；D为无血清诱导成骨分化液图E为油红O染色吸光度定量图(590nM)；F为茜素红染色吸光度定量图(590nM)。

图5是本发明实施例提供的不同诱导条件下ADSCs成脂、成骨相关基因表达示意图；

图中：无血清诱导分化液与含10％诱导分化液分别培养ADSCs检测成脂、成骨相关基因表达。由图可知与空白组相比，无血清诱导培养基其成骨、成脂相关基因表达均高于有血清诱导的分化，**P<0.01，差异具有极显著意义。表明本发明实施的无血清分化液可以更好的使ADSCs分化。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明将分离得到的脂肪间充质干细胞进行原代培养、传代培养后，用无血清诱导分化培养基进行诱导分化。经过无血清诱导培养基诱导后，所得到的具有更好更快的脂肪间充质干细胞，具备更强的能力，有效减少分化时间，建立人脂肪干细胞的原代培养模型，为生物组织工程提供“种子细胞”的同时，还为代谢性疾病细胞治疗将提供新途径，具有广阔的临床应用前景。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法包括以下步骤：

S101：采用胶原酶分离法获得皮下、网膜组织来源的人脂肪间充质干细胞，原代分离培养，至80％融合，再进行传代培养s；

S102：选用生长良好的P3细胞，诱导脂肪间充质干细胞分化为成脂细胞:先用A液诱导3天，然后B液诱导2天，交替循环3-5次后，用B液继续维持7天；

S103：选用生长良好的P3细胞，诱导脂肪间充质干细胞分化为成骨细胞:加入无血清成骨分化液诱导细胞，每3天换液一次；

S104：诱导后成脂、成骨细胞鉴定:形态学观察法、油红O染色法、茜素红染色法；

S105：通过Real-time RNA进行实验组和对照组的成脂、成骨相关基因的表达情况。

下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。

1、人脂肪间充质干细胞的分离及原代培养

①选择我院普外科择期行开腹手术的病人，要求年龄小于50岁，无急慢性感染和恶性肿瘤转移史，无内分泌及全身代谢性疾病史，无服用干预糖及脂肪代谢的药物史，知情同意下切取腹部皮下及大网膜脂肪组织各约10g。

②将无菌条件下新鲜切除的脂肪组织10g放置于在培养皿中，用含有双抗(青霉素+链霉素)的PBS缓冲液漂洗3次，充分洗掉血迹，剔除肉眼可见的血污及结缔组织。

③利用已消毒的手术剪充分剪碎脂肪组织(大约为1mm×1mm大小的小块)，将其转移到含有5ml胶原酶的50ml离心管中，避光下于37℃水浴箱中振荡消化60min。

④消化结束后将其加入到10ml基础培养基中终止消化，并且使用吸管来回吹打以完全分散组织块，悬液通过孔径为25μm(200目)的筛网过滤，收集滤液，将其转移至离心管中以1500rpm的转速离心7min。

⑤弃上清液，沉淀用原代培养的基础培养基制成细胞悬液，接种于5ml培养瓶中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

⑥培养48h后换液，吸除原培养液，用PBS液洗涤3次，加入预热至37℃的新鲜培养液进行培养。显微镜下每日观察细胞的生长情况并拍照。

2、脂肪间充质干细胞的传代培养

①轻轻摇晃细胞培养瓶，倒弃旧的培养基后加入3ml PBS缓冲液左右轻微摇晃洗去存留的培养基，后弃去，再加入1ml胰蛋白酶，放置37℃细胞培养箱中进行消化1-2min。

②取出培养瓶，轻轻摇晃，使得胰酶与细胞充分接触，置于显微镜下观察可见到培养瓶中细胞回缩变圆，细胞间隙增宽、变大，加入5mL基础培养基终止消化，用吸管轻柔吹打混匀，尽量将仍然贴壁的细胞吹打下，在这一过程中注意尽量避免气泡的产生，制成细胞悬液。

③将细胞悬液转移至无菌离心管内，1000rpm离心7min，弃去上清，向离心管内加入新的基础培养基6ml，用1次性吸管吹打均匀后接种到2个培养瓶中，继续放入37℃，5％的CO₂培养箱中培养。

④每隔2-3天更换一次新鲜培养基，待生长至80％融合后，重复以上步骤，进行下一代传代培养。显微镜下每日观察细胞的生长情况并拍照。如图2A-图2E所示。

3、脂肪间充质干细胞的鉴定

取P₃代脂肪间充质干细胞，使用免疫荧光法鉴定CD44标记物，人脂肪干细胞鉴定试验分为实验组和阴性对照组；其中实验组使用一抗(兔抗人的CD44)、二抗(Alexa Fluor594Goat anti-rabbit)孵育，阴性对照组使用5％BSA代替一抗孵育，二抗正常孵育。荧光图片的曝光时间均为300ms，结果如图3所示。图中蓝色的部分是DAPI非特异性染色的细胞核，红色的部分为CD44特异性染色的显色。经免疫荧光鉴定，该细胞纯度达到90％以上。流式检测细胞表面标记，如表3所示，其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD44表达率大于98％，阴性标记物CD31、CD34、CD45、HLA-DR表达率低于2％，证明该细胞为脂肪间充质干细胞。

4、诱导分化及染色鉴定

(1)成脂诱导分化及油红O染色鉴定

①成脂诱导分化液配制：有A液、B液组成，采用如下方法配制而成：A液：无血清DMEM/F12培养液中添加100μmol/L抗坏血酸、1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、0.5mmol/LIBMX和10mg/L胰岛素5ml，定容至500ml，经0.22μm针头滤器过滤除菌、分装，储存于4℃冰箱；B液：无血清DMEM/F12培养液中添加10mg/L胰岛素5ml，定容至500ml，经0.22μm针头滤器过滤除菌、分装，储存于4℃冰箱。

②传至第3代的细胞生长至培养皿面积的90％～100％时，用吸管轻轻吹打，使贴壁细胞脱离培养皿，后接种于6孔板(每孔约1ml)进行培养。长满80％左右，加入成脂诱导分化A液，培养3天，弃上清后再加入成脂诱导培养基B，培养2天，交替循环3-5次后，用成脂诱导完全培养基B继续维持7天。诱导直至21天，每日显微镜下观察细胞形态的变化并照相。

③油红O染色鉴定成脂分化效果：用吸管吸弃培养孔中的培养基，PBS缓冲液冲洗细胞3次，用含10％甲醛的PBS缓冲液在室温下固定1h，弃去固定液，再用双蒸水冲洗3次，之后每孔加入油红O溶液500μl，室温下避光染色1h，吸弃染色剂，无菌双蒸水冲洗3次，洗去未着色的染料，放置于显微镜下观察并照相，分化程度与油滴大小及吸光度成正相关。每日显微镜下观察细胞形态的变化并照相。ADSCs更换成脂诱导培养液后增殖缓慢，逐渐由长梭形变为多边形、圆形和椭圆形，细胞体积减小。诱导1w后胞浆内出现脂滴并逐渐聚集；2w时可见大量脂滴形成，随着诱导时间的延长，脂滴逐渐增多增大，油红O染色阳性，细胞内出现大量红染颗粒；4w时多数细胞被诱导成脂肪样细胞；证明细胞内的颗粒为脂滴，如图3所示。

(2)成骨诱导分化及鉴定

①成骨诱导分化液配制，采用如下方法配制而成：含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的无血清DMEM/F12培养液中添加50mg/L抗坏血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和10^-8mol/L(0.1μmol/L)地塞米松，定容至500ml，经0.22μm针头滤器过滤除菌、分装，储存于4℃冰箱。

②传至第3代的细胞生长至培养皿面积的80％～90％时，接种于6孔板中，加入无血清成骨分化培养基诱导分化，每3天换液一次，在显微镜下观察细胞形态变化并照相。

③诱导至28天时行茜素红染色。即培养皿用PBS冲洗2次，用95％乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。每孔加入一定量的0.1％茜素红-Tris-HCl(PH8.3)，37℃，静置30min，随后PBS冲洗，干燥，镜下观察矿化结节。每日显微镜下观察细胞形态的变化并照相。ADSCs更换成骨诱导培养液3d后，细胞由长梭形逐渐变为多边形、不规则形；1w后细胞开始呈簇状生长，聚集成团；2w时细胞团逐渐增大，4w时可见明显的钙结节形成，行茜素红染色，镜下见钙结节被染成红色，如图3所示。

5、Real-time RCR检测成脂、成骨基因的表达

(1)脂肪间充质干细胞RNA的提取

①吸除ADSCs原培养液，用PBS缓冲液洗涤3次。

②加入1ml的Trizol试剂，室温下静置5min，裂解细胞。

③加入1/5体积的氯仿，用力震荡混匀，静置5min后12000rpm离心15min。

④吸取上层水相至新的离心管，加入0.5ml异丙醇，充分混匀，静置5min后12000rpm离心10min。

⑤弃上清，加入75％乙醇(DEPC水配置)，洗涤沉淀，离心弃上清，重复2次。

⑥自然干燥后加入DEPC水溶解沉淀。进行总RNA质量鉴定及浓度测定。

(2)RT-PCR反应(cDNA合成)

使用的是TaRaKa公司的逆转录试剂盒(PrimescriptTM RT reagent kit withgDNAEraser，货号：RR048)，按照说明书进行相关操作。首先将提取的RNA用0.1％的DEPC水调整浓度为0.2μg/μl，反应体系为20μl。

①去除基因组DNA反应(总RNA量≦1μg)

按照以下成分在冰上进行反应混合液的配制，为保证反应液配制量的准确性，进行配制时按照总反应数+2的量配制Master Mix，再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。42℃，2min(或者室温放置5min)。

试剂	用量
		gDNAEraser	1μl
5×gDNAEraserBuffer	2μl
		TotalRNA	依据浓度1-2μl
RNaseFreedH2O	Upto10μl

②逆转录反应

按以下成分加入分涡流混合器混匀，于PCR仪中设置37℃，15min，85℃，5s，反应结束后立即放置于冰上，储存于-20℃冰箱。

试剂	用量
		步骤1反应液	10.0μl
PrimescriptTMRTEnzymeMixI	1.0μl
		RTPrimerMix	1.0μl
5×PrimeScriptBuffer2	4.0μl
		RNaseFreedH2O	4.0μl
Total	20.0μl

(3)Real-time PCR反应

引物设计

使用Primer 5.0软件设计引物，设计脂肪细胞分化标志基因C/EBP-α，PPAR-γ，成骨细胞分化相关基因Runx2、Atf4、Osterix、OC。以上引物经过Blast检验。内参直接从上海生工购买，其余由上海生工生物合成。序列见下表1：

表1 Real-time PCR引物

②定时定量PCR反应：使用TaKaRa试剂盒( Ex TaqTMⅡ，货号：RR802B)，按照如下成分配制Real-time PCR反应液，总的反应体系25μl。反应体系如表2所示。

表2反应体系

反应体系于涡流混合器中混匀。选择GAPDH作为内参基因，于Eppendorf荧光定量PCR仪上进行PCR反应，按照说明进行操作。所有样本均重复三次取均值。PCR反应条件如下：

③实验结果的判断：反应结束后观察溶解曲线(引物的特异性)和扩增曲线(扩增效率)，结果采用最大二级导数法分析，用2^-△△Ct计算出目的基因的相对转录水平(mRNA的表达水平)。如图5所示。可知无血清诱导培养基其成骨、成脂相关基因表达均高于有血清诱导的分化，表明本发明实施的无血清分化液可以更好的使ADSCs分化。

表3流式细胞仪检测P₃代脂肪间充质干细胞表面标记物

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法，其特征在于：所述人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法，采用胶原酶分离法获得皮下、网膜组织来源的人脂肪间充质干细胞，原代培养至80％融合，再进行传代培养，并进行脂肪间充质干细胞的鉴定，选用生长良好的第三代细胞，加入无血清诱导培养基进行诱导分化，最后进行油红O染色及茜素红染色鉴定成脂、成骨分化效果及Real-time RCR检测成脂、成骨基因表达情况；

所述人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法包括以下步骤：

步骤一，采用胶原酶分离法获得皮下、网膜组织来源的人脂肪间充质干细胞，原代分离培养至80％融合，再进行传代培养；MTT法检测细胞细胞增殖情况，流式细胞仪鉴定细胞表面抗原；

步骤二，选用生长良好的P3细胞，诱导脂肪间充质干细胞分化为成脂细胞:先用A液诱导3天，然后B液诱导2天，交替循环3-5次后，用B液继续维持7天；

步骤三，选用生长良好的P3细胞，诱导脂肪间充质干细胞分化为成骨细胞:加入无血清成骨分化液诱导细胞，每3天换液一次；

步骤四，诱导后成脂、成骨细胞鉴定:形态学观察法、油红O染色法、茜素红染色法；

步骤五，通过Real-time RNA进行成脂、成骨相关基因的表达情况；

诱导成脂分化的培养基由以下组分组成：成脂诱导分化液包括A液和B液；A液：包括无血清DMEM/F12培养液、100μmol/L抗坏血酸、1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、10mg/L胰岛素、0.5mmol/L IBMX；B液：无血清DMEM/F12+10mg/L胰岛素；

A液：无血清DMEM/F12培养液中按浓度添加抗坏血酸、地塞米松、吲哚美辛、IBMX和胰岛素5ml，定容至500ml，经0.22μm针头滤器过滤除菌、分装，储存于4℃冰箱；B液：无血清DMEM/F12培养液中按所述浓度添加胰岛素5ml，定容至500ml，经0.22μm针头滤器过滤除菌、分装，储存于4℃冰箱；

成骨诱导分化液包含：无血清DMEM/F12培养液、地塞米松0.1μmol/L、抗坏血酸或维生素C 50mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L；配制如下：无血清DMEM/F12培养液按浓度添加抗坏血酸，β-甘油磷酸钠和地塞米松，定容至500ml，经0.22μm针头滤器过滤除菌、分装，储存于4℃冰箱。

2.如权利要求1所述的人脂肪干细胞原代培养方法，其特征在于，胶原酶消化液提前配制保存包括如下步骤：称取100mg I型胶原酶，1g牛血清白蛋白，充分溶解于50ml PBS缓冲液中，即配成2％I型胶原酶+2％BSA的消化液，消化液经0.22μm针头滤器过滤除菌，以5ml为单位，分装成小管，-20℃避光储存备用。

3.如权利要求1所述的人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法，其特征在于，地塞米松在培养基中的终浓度为1μM，包括如下步骤：将称取好的7.8mg地塞米松溶于2ml无水乙醇之中，得到地塞米松储存液浓度为10mM，分装至EP管中，-20℃下储存备用，使用时1:1000进行稀释，使得培养基中的终浓度为1μM。

4.如权利要求1所述的人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法，其特征在于，胰岛素在培养基中的终浓度为1μg/ml，包括如下步骤：1)酸化水的配制：0.1ml的冰醋酸加入4.9ml去离子双蒸水中，混合均匀后备用；2)工作液的配制：0.5ml酸化水中溶入胰岛素5mg，得到浓度为10mg/ml的工作液，将其分装至4个洁净EP管中，-20℃储存备用，使用时1:1000稀释，得到终浓度为1μg/ml的胰岛素。

5.如权利要求1所述的人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法，其特征在于，1-甲基-3-异丁醇黄嘌呤(IBMX)在培养基中的终浓度为0.2nM，包括如下步骤：1ml DMSO中溶入称取好的IBMX 110mg，得到浓度为0.5mol/L的溶液，若溶解情况不佳，可适当加入1N的氢氧化钠帮助溶解，之后分装于不同的EP管中，-20℃储存备用，使用时取出1:1000进行稀释，得到终浓度为0.2nM的IBMX；

油红O染色剂的配制如下：称取0.35g油红O，加入100ml异丙醇溶液里，摇晃使充分混匀，静置8～10h后滤纸过滤，锡纸包裹避光常温密封保存；使用时以滤液：去离子水＝3：2的比例稀释，后用滤纸过滤2次。

6.一种如权利要求1～5任意一项所述人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法在人脂肪间充质干细胞培养中的应用。