CN113249328B - EpCAM在调控人肝前体细胞肝向分化中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体是EpCAM在调控人肝前体细胞肝向分化中的应用，以及一种提高人肝前体细胞体外肝向分化效率的方法。本发明优点在于：本发明在研究中发现肝前体细胞表面标志物EpCAM能够通过激活Notch1信号通路负向调控肝向分化。因此，EpCAM不仅是肝前体细胞标志物，同时也是功能分子，通过降低EpCAM的表达，可以实现更高效的肝向分化，获取更优质的功能肝细胞。在临床细胞移植治疗、组织器官修复与再生和生物人工肝领域具有很好的应用前景。

Description

EpCAM在调控人肝前体细胞肝向分化中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体的说，是一种调控人肝前体细胞肝向分化的方法，以及EpCAM在调控人肝前体细胞肝向分化中的应用。
背景技术
我国是肝病大国，大多数终末期肝病患者无法获得肝移植治疗机会，而肝细胞移植是肝移植的有效替代手段之一，但需要大量功能肝细胞。肝前体细胞处于未分化的干细胞状态，具有发生肝向和胆向分化的潜能，虽然目前我们可在体外诱导肝前体细胞发生肝向分化，但其分化程度尚未达到原代肝细胞水平，这与我们还不了解调控肝前体细胞分化的分子机制有关。因此，阐明分化机制并在此基础上提高肝向分化效率是肝脏研究领域亟待解决的问题。
但是关于EpCAM调控人肝前体细胞肝向分化效率的应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule,上皮细胞粘附分子)在调控人肝前体细胞肝向分化中的应用，以及一种提高人肝前体细胞体外肝向分化效率的方法。
本发明筛选影响肝前体细胞分化的表面标志分子EpCAM，通过慢病毒转染结合免疫荧光检测成熟肝细胞极性维持情况，采用流式细胞术检测成熟肝细胞功能分子表达情况，明确了EpCAM对肝向分化的抑制作用。
本发明的技术方案主要包括：人肝前体细胞的体外增殖和分化，免疫荧光结合共聚焦显微镜检测能呈现成熟肝细胞极性的多药耐药相关蛋白2(MRP2)的表达情况，免疫荧光结合流式细胞术检测成熟肝细胞功能分子(如白蛋白Alb和细胞色素P450 3A4酶(CYP3A4))的表达情况。
本发明的第一方面，提供EpCAM在调控人肝前体细胞肝向分化中的应用。
进一步的，所述的EpCAM抑制人肝前体细胞的肝向分化。
本发明的第二方面，提供EpCAM在制备调控人肝前体细胞肝向分化的试剂中的应用。
本发明的第三方面，提供抑制或下调EpCAM表达量的试剂在促进人肝前体细胞肝向分化中的应用。
本发明的第四方面，提供抑制或下调EpCAM表达量的试剂在制备功能肝细胞中的应用。
进一步的，所述的抑制或下调EpCAM的表达量的试剂包括但不限于：
特异性结合EpCAM的蛋白；
特异性干扰EpCAM基因表达、加工的小干扰分子，如siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸等；
EpCAM抑制剂、拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。
本发明的第五方面，提供一种提高人肝前体细胞体外肝向分化效率的方法，所述的方法是将抑制或下调EpCAM表达量的干扰分子转染进人肝前体细胞中。
本发明优点在于：
肝前体细胞的分化受到机体复杂而有序的调控，多重因素对其有重要影响，本发明在研究中发现肝前体细胞表面标志物EpCAM能够通过激活Notch1信号通路负向调控肝向分化。因此，EpCAM不仅是肝前体细胞标志物，同时也是功能分子，通过降低EpCAM的表达，可以实现更高效的肝向分化，获取更优质的功能肝细胞。在临床细胞移植治疗、组织器官修复与再生和生物人工肝领域具有很好的应用前景。
附图说明
图1是EpCAM对肝向分化的抑制作用。A，表示分化后的HepaRG细胞明显保留肝细胞极性，而HepaRGepcam+细胞几乎失去极性；B，表示成熟肝细胞功能分子Alb和CYP3A4在HepaRGepcam+细胞中的表达明显降低；C，表示Alb和CYP3A4在HepLPCepcam-细胞中的表达明显升高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例：
1、人肝前体细胞的培养
本发明所用的体外人肝前体细胞模型HepaRG购于Biopredic International公司，HepLPC为本实验室建系所得(建系方法参照中国专利文献CN110438157A)。HepaRG细胞增殖所需培养基为William's E完全培养基，即在William's E基础培养基中加入10％胎牛血清，50U/ml单位青霉素链霉素联合双抗，2mM L-谷氨酰胺，5μg/ml胰岛素，0.5μM氢化可的松。细胞置于37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中进行培养，每隔2天更换新鲜培养基。HepLPC增殖培养基为TEM，即在Advanced DMEM/F12培养基中按比例添加N-2营养补充剂(100X)、B-27营养补充剂(50X)、丙酮酸钠溶液(100X)和终浓度为10μg/mL维生素C，混匀。小分子添加物包括终浓度为20ng/mL肝细胞生长因子HGF，20ng/mL上皮细胞生长因子EGF，10μM ROCK激酶抑制剂Y27632，3μM Wnt信号通路激动剂CHIR99021，1μM TGF-β信号抑制剂A8301，1μM 1-磷酸鞘氨醇S1P和5μM溶血磷脂酸LPA。
2、人肝前体细胞的肝向分化
待细胞生长至对数期，换用分化培养基进行培养，诱导其从前体细胞状态转换为成熟肝细胞状态。连续分化10天，每天更换新鲜的分化培养基。
3、建立EpCAM过表达和敲减的人肝前体细胞系
将EpCAM弱阳性的HepaRG细胞以1×105/孔铺在24孔板中，第二天在细胞数量为2×105/孔左右时，加入适量过表达EpCAM的慢病毒悬液(病毒滴度MOI＝5)，37℃继续培养24小时，用新鲜的William's E完全培养基替换含有病毒的培养基。转染48小时后EpCAM开始表达，72小时后用流式细胞术检测转染效率，建立EpCAM稳定过表达的HepaRGepcam+细胞株。
将EpCAM高表达的HepLPC细胞以1×105/孔铺在24孔板中，第二天在细胞数量为2×105/孔左右时，加入适量敲减EpCAM的慢病毒悬液(病毒滴度MOI＝5)，37℃继续培养24小时，用新鲜的TEM培养基替换含有病毒的培养基。转染48小时后EpCAM开始表达，72小时后用流式细胞术检测转染效率，建立EpCAM稳定敲减的HepLPCepcam-细胞株。
4、EpCAM对肝向分化的抑制作用
(1)将HepaRG和HepaRGepcam+前体细胞按1×105的密度种植于培养皿中，待细胞汇合度达到90％后进行分化，10天后在培养皿上直接进行固定和染色处理，步骤如下：吸干培养基，用1×PBS清洗，随后在细胞上覆盖一层2–3mm用温热PBS稀释的4％甲醛，室温下固定细胞15分钟；吸干固定液，用1×PBS漂洗三次，每次5分钟；在封闭缓冲液中封闭标本60分钟；吸去封闭缓冲液，加入MRP2一抗(1：100稀释)，4℃孵育过夜；第二天用1×PBS漂洗三次，每次5分钟；加入Cy3标记的二抗(1：500稀释)，室温下避光孵育标本1小时；用1X PBS漂洗三次，每次5分钟，最后用奥林巴斯FV3000共聚焦显微镜进行图像采集。
(2)按照1和2的方法分别对HepaRG和HepaRGepcam+前体细胞，以及HepLPC和HepLPCepcam-前体细胞进行培养和分化，随后检测分化后的成熟肝细胞表达CYP3A4和Alb的能力。分化10天后，用胰酶消化离心收集细胞，PBS洗3遍，按照BD Cytofix/Cytoperm破膜/固定试剂盒操作步骤对细胞进行固定破膜，然后进行免疫荧光染色，每50μl染色体系中加入荧光标记的Alb和CY3A4直标抗体各5μl，冰上孵育1-1.5h。染色完毕，用PBS清洗3遍，最后加入1ml PBS重悬细胞，1小时之内进行流式上机检测。
结果如附图1A-B所示，与HepaRG相比，HepaRGepcam+成熟肝细胞中的MRP2表达极低，表明肝细胞极性丢失；同样，由HepaRGepcam+分化而来的肝细胞，其表达Alb和CYP3A4的能力明显低于成熟HepaRG细胞，表明肝功能的降低。如图1C所示，由HepLPCepcam-分化而来的肝细胞，其表达Alb和CYP3A4的能力明显高于成熟HepLPC细胞，表明肝功能的升高。
综上所述，EpCAM不仅是肝前体细胞标志物，而且是功能分子，能够抑制肝前体细胞向肝细胞分化。基于EpCAM对肝向分化的抑制作用，在体外分化过程中，我们可以通过降低EpCAM在肝前体细胞的表达，促进肝前体细胞发生肝向分化，从而获得功能更优化的肝细胞。在此基础上，建立可体现个体异质性的肝细胞库，为药物筛选和生物人工肝等应用提供全新的肝细胞源。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (3)

1.下调EpCAM表达量的试剂在体外促进人肝前体细胞肝向分化中的应用；所述的肝前体细胞为HepLPC细胞；所述的下调EpCAM的表达量的试剂为特异性干扰EpCAM基因表达、加工的小干扰分子siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸或慢病毒。
2.下调EpCAM表达量的试剂在体外制备功能肝细胞中的应用；所述的下调EpCAM表达量的试剂通过降低EpCAM在肝前体细胞的表达，促进肝前体细胞发生肝向分化，获得功能肝细胞；所述的肝前体细胞为HepLPC细胞；所述的下调EpCAM的表达量的试剂为特异性干扰EpCAM基因表达、加工的小干扰分子siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸或慢病毒。
3.一种提高人肝前体细胞体外肝向分化效率的方法，其特征在于，所述的方法是将下调EpCAM表达量的干扰分子转染进人肝前体细胞中；所述的肝前体细胞为HepLPC细胞。
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