CN109251884A - 一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法 - Google Patents
一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109251884A CN109251884A CN201811173238.9A CN201811173238A CN109251884A CN 109251884 A CN109251884 A CN 109251884A CN 201811173238 A CN201811173238 A CN 201811173238A CN 109251884 A CN109251884 A CN 109251884A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cell
- cell
- fetal liver
- liver stem
- mature hepatocytes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 title claims abstract description 117
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 113
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 title claims abstract description 83
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 52
- 230000006698 induction Effects 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000013459 approach Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 59
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 35
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 28
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims abstract description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 8
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 claims description 22
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 claims description 22
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 10
- DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N DAPT Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)OC(C)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N 0.000 claims description 8
- 238000011977 dual antiplatelet therapy Methods 0.000 claims description 8
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 7
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 5
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims description 4
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 4
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 claims description 4
- PKXWXXPNHIWQHW-RCBQFDQVSA-N (2S)-2-hydroxy-3-methyl-N-[(2S)-1-[[(5S)-3-methyl-4-oxo-2,5-dihydro-1H-3-benzazepin-5-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]butanamide Chemical compound C1CN(C)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](O)C(C)C)C2=CC=CC=C21 PKXWXXPNHIWQHW-RCBQFDQVSA-N 0.000 claims description 3
- XCGJIFAKUZNNOR-UHFFFAOYSA-N 3-[4-(4-chlorophenyl)sulfonyl-4-(2,5-difluorophenyl)cyclohexyl]propanoic acid Chemical compound C1CC(CCC(=O)O)CCC1(S(=O)(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC(F)=CC=C1F XCGJIFAKUZNNOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 claims description 3
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 claims description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 3
- 101150102995 dlk-1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- PUOAETJYKQITMO-LANLRWRYSA-N (3e)-1-[(1s)-1-(4-fluorophenyl)ethyl]-3-[[3-methoxy-4-(4-methylimidazol-1-yl)phenyl]methylidene]piperidin-2-one Chemical compound C1([C@H](C)N2CCC\C(C2=O)=C/C=2C=C(C(=CC=2)N2C=C(C)N=C2)OC)=CC=C(F)C=C1 PUOAETJYKQITMO-LANLRWRYSA-N 0.000 claims description 2
- XEAOPVUAMONVLA-QGZVFWFLSA-N Avagacestat Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1S(=O)(=O)N([C@H](CCC(F)(F)F)C(=O)N)CC(C(=C1)F)=CC=C1C=1N=CON=1 XEAOPVUAMONVLA-QGZVFWFLSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 claims description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 abstract 2
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 30
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 30
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 18
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 6
- 102000001760 Notch3 Receptor Human genes 0.000 description 5
- 108010029756 Notch3 Receptor Proteins 0.000 description 5
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 5
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 5
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 5
- 206010057573 Chronic hepatic failure Diseases 0.000 description 4
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 3
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 3
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 2
- -1 3,5- difluoro phenylacetyl Chemical group 0.000 description 1
- 206010000804 Acute hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 101000994439 Danio rerio Protein jagged-1a Proteins 0.000 description 1
- 101000584743 Homo sapiens Recombining binding protein suppressor of hairless Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100032702 Protein jagged-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030000 Recombining binding protein suppressor of hairless Human genes 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000003999 epithelial cell of bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 239000003540 gamma secretase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
- C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
- C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，属于生物技术领域，包括以下步骤：(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：a)胎肝干细胞的分离和扩增；b)胎肝干细胞的鉴定；(2)胎肝干细胞的诱导分化：a)在干冰上低温收集正常肝脏组织研磨匀浆后制成的组织悬液，离心后收集上清液加入Williams’E细胞培养基，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养以获得肝祖细胞；b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，继续培养以获得肝样细胞；c)将步骤b)所获得的细胞用加入含HGF的细胞快速扩增培养基培养，以获得有功能的肝细胞，能快速、准确、高效地将我们前期获得的胎肝干细胞诱导分化为具有功能的肝细胞。
Description
技术领域
本发明属于生物技术的技术领域，具体涉及一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法。
背景技术
原位肝移植是治疗终末期肝病的金标准。但是，肝源的短缺成为了肝细胞移植在临床应用上最大的瓶颈，限制的其有效开展。所以，找到合适的、丰富的肝细胞来源是现在生物学领域研究的热点。同时，大量研究证实，细胞疗法是治疗终末期肝病(End-stageliver diseases,ESLDs)有效的方法之一，应用前景十分光明。胎肝干/祖细胞(FLSPCs)具有成活率高，增殖量小，安全性高等优点，是用于肝脏疾病的干细胞治疗理想的细胞之一。在我们研究的早期阶段，我们申请了一种三步分离方法来富集FLSPCs，并获得与流式细胞分选方法相似的分离效率。并且，使用暴发性肝衰竭大鼠模型，我们证明FLSPCs可以促进肝形态发生和功能的恢复。
业已证实，胎肝干细胞是一种双向分化潜能的多能干细胞。在适当的信号通路的调节下，肝干细胞可以分化为成熟的肝细胞和胆管细胞。从而完成肝脏的损伤修复。胎肝干细胞能表达干细胞表面标志物，如CD133、EpCAM、CD49f、Dlk1、CD13等。肝干细胞体外能长期培养而保持染色体组型的稳定性不变，且其增殖分化潜能明显高于其他来源的干细胞。早期研究已证实：Wnt信号通路调控肝干细胞向肝细胞分化，而Notch信号通路则促进肝干细胞向胆管系分化，Notch信号是相邻细胞之间通讯进而调控细胞发育的重要通路。Notch基因的配体Jagged1由Thy1+的肌纤维母细胞产生，并与肝干细胞上的受体作用从而活化下游信号通路，促进肝干细胞向胆管细胞分化。于此相反，Wnt信号分子作用于肝干细胞诱。
导β-链蛋白信号并同时表达Notch信号途径的抑制物，最终导致肝干细胞向胆管细胞分化的Notch信号通路受抑制，向肝细胞分化受促进。Notch信号途径是人体最重要的信号转导通路之一，其分子广泛表达于胚胎和成年个体组织中，主要由表达于相邻细胞上的Notch配体和Notch受体、以及表达于细胞内的转录因子、下游分子和其他调节分子组成。RBP-J是激活Notch信号通路所必需的一个核心转录因子，它的缺失意味着Notch信号的完全阻断。Notch信号途径对细胞的分化、增殖、凋亡有重要的调控作用，它广泛参与组织器官的发育、生长以及再生进程，其功能的异常与很多疾病及肿瘤发生有关。我们前期研究发现，肝再生的进程伴有Notch信号通路分子的广泛变化。Notch信号途径对于维持肝脏的稳态具有重要作用。然而，仍有一个问题需要解决，以探索FLSPCs的治疗潜力。
首先，如何准时诱导干细胞分化为肝细胞仍然是一个挑战。研究显示：Notch信号在调节许多类型的干细胞的分化和自我更新中起着关键作用。我们早期研究发现，Notch信号在FLSPC向肝细胞分化中发挥重要作用。然而，在从胎儿肝干/祖细胞分化为(FLSPCs)成熟的肝细胞的过程中Notch的作用，尤其是主要的Notch受体的作用是未知的。因此，需确定主要的促进FLSPCs分化的特异性Notch受体。同时，在组织水平和细胞水平上，我们发现与成人成熟肝脏和BRL细胞相比，Notch3是在胚胎14日的胎肝和FLSPCs中唯一表达较多的。
其次，我们从形态学表型和功能方面分析评价，在利用GSIs(c-分泌酶抑制剂，Notch抑制剂)抑制Notch信号通路后，FLSPCs向肝细胞分化的结果。结果表明作为GSI的类似物N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)能够促进FLSPC分化为成熟肝细胞，并且从FLSPC分化而来的细胞显示出与正常成熟肝细胞相似的表型和形态，表达成熟肝细胞的标记物，具有与成熟肝细胞类似的功能。因而得出，GSIs的分化效率、效能与肝细胞生长因子(HGF)诱导的相似。更具体地说，随着FLSPCs向成熟肝细胞的分化，Notch3的表达逐渐下调，与其他干细胞标记物下调一致。这些发现意味着Notch3可能不仅是FLSPCs分化成肝细胞的调节剂，而且也是FLSPCs的潜在标志。故一定程度的信号通路的失衡，可以调控肝干细胞向成熟肝细胞的分化，从而为成熟肝细胞治疗肝病带来希望。
细胞移植是在肝源短缺情况下治疗终末期肝病的最有效的潜在治疗方法。但是，细胞移植在临床应用上的最大瓶颈是如何大量获得大量的肝干细胞和如何快速有效的将肝干细胞诱导分化为具有功能的肝细胞。所以，如何解决这两个问题是目前生物学领域研究的热点。
在我们研究的早期阶段，我们获得授权了一种三步分离方法来富集FLSPCs的方法，并证明此方法获得的细胞与流式细胞分选方法相似的分离效率。并且，使用暴发性肝衰竭大鼠模型，我们证明FLSPCs可以促进肝形态发生和功能的恢复，从而解决了上述的第一个问题。
接下来，如何快速、高效的诱导胎肝干细胞分化为肝细胞仍然是一个挑战。胎肝干细胞是一种双向分化潜能的多能干细胞，在适当的信号通路的调节下，肝干细胞可以分化为成熟的肝细胞和胆管细胞。目前各种诱导分化的模型存在效率低、准确性差等缺点。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法以达到能够采用分离培养的胎肝干细胞，利用体外干细胞诱导技术，研究肝干细胞的多能性和肝细胞定向分化，并通过体内移植用于小鼠肝脏部分切除的急性肝损伤模型进行研究，为肝脏疾病的干细胞治疗提供一种新的途径的目的。
本发明所采用的技术方案为：一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：
1)胎肝干细胞的分离培养和扩增；
2)胎肝干细胞的鉴定；
(2)胎肝干细胞的诱导分化：
a)在干冰上低温收集正常肝脏组织进行研磨匀浆，制作成组织悬液，离心后收集上清液，将上清液加入Williams’E细胞培养基，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养6-8天；
b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，继续培养6-8天；
c)将步骤b)所获得的细胞用加入含HGF的细胞快速扩增培养基，继续快速扩增6-8天，以获得有功能的肝细胞，主要用于细胞的快速增殖。
进一步地，所述步骤1)中进行胎肝干细胞的分离培养和扩增所采用的具体步骤如下：
a、利用Percoll非连续密度梯度离心富集大鼠胎肝细胞；
b、利用时差贴壁和时差消化对培养的胎肝细胞进行纯化；
c、利用Percoll连续密度梯度离心富集大鼠胎肝干细胞。
进一步地，所述步骤b)中的Notch信号通路抑制剂为γ-分泌酶抑制剂，且γ-分泌酶抑制剂的浓度为0.5μmol/L-1.5μmol/L。
进一步地，所述γ-分泌酶抑制为DAPT、LY-450139、MK-0752、E2012、BMS-708163、PF-3084014以及2GSI-953中的任意一种。
进一步地，所述步骤c)中的细胞快速扩增培养基为加入HGF的Williams’E培养基，且HGF的稀释终浓度为15ng/mL-25ng/mL。
进一步地，还包括培养成熟肝细胞，其具体步骤如下：
A、对步骤(c)所培养的细胞每隔1-3天进行换液处理，待细胞长满细胞培养瓶后进行细胞传代处理；
B、对步骤A所获得的细胞培养25-35天，即为成熟肝细胞。
进一步地，所述步骤2)中胎肝干细胞的鉴定方法：通过免疫组化和免疫荧光多重抗体染色对干细胞进行鉴定。
进一步地，所述免疫组化和免疫荧光多重抗体染色所采用的干细胞标记物为CD133、EpCAM、CD49f、Dlk1或CD13。
本发明的有益效果为：
1.本发明的成熟肝细胞分化的方法中细胞来源丰富，分离培养技术已掌握，提供了一种全新的肝干细胞来源；通过体外定向诱导分化为肝脏样功能细胞，提供了一种大量获得肝脏细胞的方法。
2.通过体内移植，发现该细胞不仅能融入受损伤肝脏，而且可以一定程度恢复肝脏白蛋白水平和抑制转氨酶的活性，为临床终末期肝病的治疗提供了一种新的选择。
3.本发明采用分离培养的胎肝干细胞，利用体外干细胞诱导技术，研究肝干细胞的多能性和肝细胞定向分化，并通过体内移植用于小鼠肝脏部分切除的急性肝损伤模型进行研究，证实其用于急性肝损伤治疗的可行性，为肝脏疾病的干细胞治疗提供一种新的途径。
附图说明
图1是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中肝干细胞向成熟肝细胞分化过程流程图；
图2是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中各种细胞表达Notch分子的相对表达量(A)；
图3是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中肝干细胞和正常成熟肝细胞表达各型Notch分子的相对表达量(B)；
图4是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中各种诱导剂诱导分化后成熟肝细胞标记物检测结果；
图5是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中各种诱导剂诱导分化后胆管细胞标记物检测结果；
图6是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中胎肝干细胞在DMSO、DAPT、HGF诱导分化后的细胞ICG排泄时间和正常成熟肝细胞排泄时间对比试验观察图；
图7是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中胎肝干细胞在DMSO、DAPT、HGF诱导分化后的细胞ICG排泄时间和正常成熟肝细胞排泄时间对比试验表格；
图8是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中DMSO、DAPT、HGF诱导分化的肝干细胞合成糖原能力检测观察图；
图9是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中DMSO、DAPT、HGF诱导分化的肝干细胞合成糖原能力检测对比表格。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1：
如图1所示，本发明中提供了一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：
1)胎肝干细胞的分离培养和扩增，主要为以下步骤：a、利用Percoll非连续密度梯度离心富集大鼠胎肝细胞；b、利用时差贴壁和时差消化对培养的胎肝细胞进行纯化；c、利用Percoll连续密度梯度离心富集大鼠胎肝干细胞。
2)胎肝干细胞的鉴定：通过免疫组化和免疫荧光多重抗体染色对干细胞进行鉴定，其中，所采用的干细胞标记物为CD133。
(2)胎肝干细胞的诱导分化：
a)在干冰上低温收集正常肝脏组织进行研磨匀浆，制作成组织悬液，将匀浆液在3℃、19000G转速的离心条件下离心，离心后收集上清液，将上清液加入Williams’E细胞培养基，配制为终浓度8％(体积分数)的溶液甲，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养6天；
b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，选用γ-分泌酶抑制剂为Notch信号通路抑制剂，并配制γ-分泌酶抑制剂Williams’E培养基，标记为溶液乙，继续培养6天；γ-分泌酶抑制剂Williams’E培养基的配制方法如下：将γ-分泌酶抑制剂溶解于二甲基亚砜(DMSO),再用Williams’E培养基稀释为终浓度0.5μmol/L。其中，γ-分泌酶抑制优选为DAPT。
c)将步骤b)所获得的细胞用加入HGF的Williams’E培养基，继续快速扩增6天，以获得有功能的肝细胞，主要用于细胞的快速增殖。所述加入HGF的Williams’E培养基的稀释终浓度为15ng/mL。
(3)对步骤(c)所培养的细胞每隔1天进行换液处理，待细胞长满细胞培养瓶后进行细胞传代处理。
(4)对步骤(3)中所获得的细胞培养25天，即为成熟肝细胞。
实施例2：
如图1所示，本发明中提供了一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：
1)进行胎肝干细胞的分离培养和扩增，主要为以下步骤：a、利用Percoll非连续密度梯度离心富集大鼠胎肝细胞；b、利用时差贴壁和时差消化对培养的胎肝细胞进行纯化；c、利用Percoll连续密度梯度离心富集大鼠胎肝干细胞。
2)胎肝干细胞的鉴定：通过免疫组化和免疫荧光多重抗体染色对干细胞进行鉴定，其中，所采用的干细胞标记物为EpCAM。
(2)胎肝干细胞的诱导分化：
a)在干冰上低温收集正常肝脏组织进行研磨匀浆，制作成组织悬液，将组织悬液在4℃、20000G转速的离心条件下离心处理，离心后收集上清液，将上清液加入Williams’E细胞培养基，配制为终浓度10％(体积分数)的溶液甲，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养7天；
b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，选用γ-分泌酶抑制剂作为Notch信号通路抑制剂，并配制γ-分泌酶抑制剂Williams’E培养基，标记为溶液乙，继续培养7天；γ-分泌酶抑制剂Williams’E培养基的配制方法如下：将γ-分泌酶抑制剂溶解于二甲基亚砜(DMSO)，再用Williams’E培养基稀释为终浓度1μmol/L。其中，γ-分泌酶抑制优选为LY-450139。
c)将步骤b)所获得的细胞用加入HGF的Williams’E培养基，继续快速扩增7天，以获得有功能的肝细胞，主要用于细胞的快速增殖。所述加入HGF的Williams’E培养基的稀释终浓度为20ng/mL。
(3)对步骤(c)所培养的细胞每隔2天进行换液处理，待细胞长满细胞培养瓶后进行细胞传代处理。
(4)对步骤(3)中所获得的细胞培养28天，即为成熟肝细胞。
实施例3：
如图1所示，本发明中提供了一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：
1)进行胎肝干细胞的分离培养和扩增，主要为以下步骤：a、利用Percoll非连续密度梯度离心富集大鼠胎肝细胞；b、利用时差贴壁和时差消化对培养的胎肝细胞进行纯化；c、利用Percoll连续密度梯度离心富集大鼠胎肝干细胞。
2)胎肝干细胞的鉴定：通过免疫组化和免疫荧光多重抗体染色对干细胞进行鉴定，其中，所采用的干细胞标记物为CD49f。
(2)胎肝干细胞的诱导分化：
a)在干冰上低温收集正常肝脏组织进行研磨匀浆，制作成组织悬液，将组织悬液在5℃、21000G转速的离心条件下离心处理，离心后收集上清液，将上清液加入Williams’E细胞培养基，配制为终浓度12％(体积分数)的溶液甲，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养8天；
b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，选用γ-分泌酶抑制剂作为Notch信号通路抑制剂，并配制γ-分泌酶抑制剂Williams’E培养基，标记为溶液乙，继续培养8天；γ-分泌酶抑制剂Williams’E培养基的配制方法如下：将γ-分泌酶抑制剂溶解于二甲基亚砜(DMSO)，再用Williams’E培养基稀释为终浓度1.5μmol/L。其中，γ-分泌酶抑制优选为MK-0752。
c)将步骤b)所获得的细胞用加入HGF的Williams’E培养基，继续快速扩增8天，以获得有功能的肝细胞，主要用于细胞的快速增殖。所述加入HGF的Williams’E培养基的稀释终浓度为25ng/mL。
(3)对步骤(c)所培养的细胞每隔3天进行换液处理，待细胞长满细胞培养瓶后进行细胞传代处理。
(4)对步骤(3)中所获得的细胞培养35天，即为成熟肝细胞。
在上述实施例1-实施例3中，可采用c-jun替代HGF作为使细胞扩增的细胞因子，两者均可发挥同等作用的使细胞扩增。
由图2中可知，成熟肝细胞在Notch3的信号通道受到抑制；
图3可知，成熟肝细胞相对肝干细胞在Notch3的信号通道受到抑制；
图4可知，各种诱导剂诱导分化后成熟肝细胞标记物的表达量值分布情况；
图5可知，各种诱导剂诱导分化后胆管细胞标记物的表达量值分布情况；
图7可知，HGF诱导分化后的细胞ICG排泄时间较正常成熟肝细胞排泄时间更长；
图9可知，HGF诱导分化的肝干细胞合成糖原能力较其他诱导剂的能力更强。
本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：
1)胎肝干细胞的分离培养和扩增；
2)胎肝干细胞的鉴定；
(2)胎肝干细胞的诱导分化：
a)在干冰上低温收集正常肝脏组织进行研磨匀浆，制作成组织悬液，离心后收集上清液，将上清液加入Williams’E细胞培养基，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养6-8天；
b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，继续培养6-8天；
c)将步骤b)所获得的细胞用加入含有HGF因子的细胞快速扩增培养基，继续快速扩增6-8天，以获得有功能的肝细胞。
2.根据权利要求1所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤(2)中进行胎肝干细胞的诱导分化过程所采用的具体步骤如下：
a、利用含肝脏组织上清液的培养基启动胎肝干细胞向肝细胞分化；
b、利用含有Notch信号通路抑制剂为γ-分泌酶抑制剂的培养基加速胎肝干细胞向肝细胞分化；
c、利用含有肝脏成熟因子HGF的培养基完成胎肝干细胞向肝细胞分化。
3.根据权利要求1所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤b)中的Notch信号通路抑制剂为γ-分泌酶抑制剂，且γ-分泌酶抑制剂的浓度为0.5μmol/L-1.5μmol/L。
4.根据权利要求3所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述γ-分泌酶抑制为DAPT、LY-450139、MK-0752、E2012、BMS-708163、PF-3084014以及2GSI-953中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述加入HGF的Williams’E培养基的稀释终浓度为15ng/mL-25ng/mL。
6.根据权利要求1所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，还包括培养成熟肝细胞，其具体步骤如下：
A、对步骤(c)所培养的细胞每隔1-3天进行换液处理，待细胞长满细胞培养瓶后进行细胞传代处理；
B、对步骤A所获得的细胞培养25-35天，即为成熟肝细胞。
7.根据权利要求1所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤2)中胎肝干细胞的鉴定方法：通过免疫组化和免疫荧光多重抗体染色对干细胞进行鉴定。
8.根据权利要求7所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述免疫组化和免疫荧光多重抗体染色所采用的干细胞标记物为CD133、EpCAM、CD49f、Dlk1或CD13。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811173238.9A CN109251884A (zh) | 2018-10-09 | 2018-10-09 | 一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811173238.9A CN109251884A (zh) | 2018-10-09 | 2018-10-09 | 一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109251884A true CN109251884A (zh) | 2019-01-22 |
Family
ID=65045568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811173238.9A Pending CN109251884A (zh) | 2018-10-09 | 2018-10-09 | 一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109251884A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113249328A (zh) * | 2020-02-11 | 2021-08-13 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | EpCAM在调控人肝前体细胞肝向分化中的应用 |
| CN114045254A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-02-15 | 华中农业大学 | Hepa1-6细胞上清条件培养基促进WBF344细胞向肝细胞分化的方法及应用 |
| CN115011550A (zh) * | 2022-07-14 | 2022-09-06 | 广东乾晖生物科技有限公司 | 一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基以及方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101495621A (zh) * | 2006-06-04 | 2009-07-29 | 塞拉提斯股份公司 | 衍生自hbs细胞的新型肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞 |
| WO2011064309A1 (en) * | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method for hepatic differentiation of definitive endoderm cells |
| US20120189702A1 (en) * | 2009-08-06 | 2012-07-26 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Cell therapy for treatment of liver failure |
| CN103266084A (zh) * | 2013-05-27 | 2013-08-28 | 刘卫辉 | 富集干细胞的三步分离法 |
| WO2014165663A1 (en) * | 2013-04-03 | 2014-10-09 | Cellular Dynamics International, Inc. | Methods and compositions for culturing endoderm progenitor cells in suspension |
| CN104388383A (zh) * | 2014-08-29 | 2015-03-04 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种肝干细胞的长期体外培养和定向分化体系和方法 |
| CN104531611A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-04-22 | 中国人民解放军第二军医大学 | 肝干细胞的特异性表面分子标志物cd63及其应用 |
| CN108431209A (zh) * | 2015-06-12 | 2018-08-21 | 新加坡科技研究局 | 肝脏干细胞的衍生和成熟肝细胞类型及其用途 |
-
2018
- 2018-10-09 CN CN201811173238.9A patent/CN109251884A/zh active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101495621A (zh) * | 2006-06-04 | 2009-07-29 | 塞拉提斯股份公司 | 衍生自hbs细胞的新型肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞 |
| US20120189702A1 (en) * | 2009-08-06 | 2012-07-26 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Cell therapy for treatment of liver failure |
| WO2011064309A1 (en) * | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method for hepatic differentiation of definitive endoderm cells |
| WO2014165663A1 (en) * | 2013-04-03 | 2014-10-09 | Cellular Dynamics International, Inc. | Methods and compositions for culturing endoderm progenitor cells in suspension |
| CN103266084A (zh) * | 2013-05-27 | 2013-08-28 | 刘卫辉 | 富集干细胞的三步分离法 |
| CN104388383A (zh) * | 2014-08-29 | 2015-03-04 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种肝干细胞的长期体外培养和定向分化体系和方法 |
| CN106566799A (zh) * | 2014-08-29 | 2017-04-19 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种肝干细胞的定向分化体系和方法 |
| CN104531611A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-04-22 | 中国人民解放军第二军医大学 | 肝干细胞的特异性表面分子标志物cd63及其应用 |
| CN108431209A (zh) * | 2015-06-12 | 2018-08-21 | 新加坡科技研究局 | 肝脏干细胞的衍生和成熟肝细胞类型及其用途 |
| US20190161734A1 (en) * | 2015-06-12 | 2019-05-30 | Agency For Science, Technology And Research | Derivation of hepatic stem cells and mature liver cell types and uses thereof |
Non-Patent Citations (12)
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113249328A (zh) * | 2020-02-11 | 2021-08-13 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | EpCAM在调控人肝前体细胞肝向分化中的应用 |
| CN114045254A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-02-15 | 华中农业大学 | Hepa1-6细胞上清条件培养基促进WBF344细胞向肝细胞分化的方法及应用 |
| CN114045254B (zh) * | 2021-11-01 | 2023-12-22 | 华中农业大学 | Hepa1-6细胞上清条件培养基促进WBF344细胞向肝细胞分化的方法及应用 |
| CN115011550A (zh) * | 2022-07-14 | 2022-09-06 | 广东乾晖生物科技有限公司 | 一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基以及方法 |
| CN115011550B (zh) * | 2022-07-14 | 2024-04-26 | 广东乾晖生物科技有限公司 | 一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基以及方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Raynaud et al. | Comprehensive characterization of mesenchymal stem cells from human placenta and fetal membrane and their response to osteoactivin stimulation | |
| Lawson et al. | Stem cells in prostate cancer initiation and progression | |
| CN109251884A (zh) | 一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法 | |
| Castrechini et al. | Mesenchymal stem cells in human placental chorionic villi reside in a vascular Niche | |
| CN110317775A (zh) | 用于肝细胞培养及肝脏类器官制备的培养基 | |
| Bailey et al. | Converging roads: evidence for an adult hemangioblast | |
| Passeri et al. | Isolation and expansion of equine umbilical cord-derived matrix cells (EUCMCs) | |
| JP2004535820A5 (zh) | ||
| Dziedzic et al. | Kidney stem cells in development, regeneration and cancer | |
| Leir et al. | Characterization of primary cultures of adult human epididymis epithelial cells | |
| Shi et al. | Anchorage-independent culture maintains prostate stem cells | |
| US20180282690A1 (en) | Method and culture medium for ex vivo culturing of epidermis-derived stem cells | |
| Sandhaanam et al. | Mesenchymal stem cells (MSC): identification, proliferation and differentiation | |
| Crowley et al. | Heterogeneity and complexity of the prostate epithelium: New findings from single-cell RNA sequencing studies | |
| Howden et al. | Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions | |
| JP2009535024A (ja) | 腎臓由来の幹細胞集団、同定及び治療的使用 | |
| US20140322696A1 (en) | Functional recovery of human lungs for transplantation | |
| Haus et al. | CD133-enriched Xeno-Free human embryonic-derived neural stem cells expand rapidly in culture and do not form teratomas in immunodeficient mice | |
| JP6147419B2 (ja) | 心臓内膜由来の成体幹細胞及びこれの製造方法 | |
| CN101469322B (zh) | 一种用于肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂及其制备方法 | |
| CN104745529B (zh) | 瘦素在诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途及其应用 | |
| Arutyunyan et al. | Effect of endothelial cells on angiogenic properties of multipotent stromal cells from the umbilical cord during angiogenesis modeling in the basement membrane matrix | |
| Zhang et al. | Maintenance of tendon stem/progenitor cells in culture | |
| WO2021221179A1 (ja) | ヒト膵癌オルガノイドを用いたマウスモデルの樹立 | |
| CN108753681A (zh) | 一种鼻上皮干细胞培养方法及鼻上皮干细胞增殖培养基 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190122 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |