CN106350483A - 诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法 - Google Patents
诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106350483A CN106350483A CN201610895792.2A CN201610895792A CN106350483A CN 106350483 A CN106350483 A CN 106350483A CN 201610895792 A CN201610895792 A CN 201610895792A CN 106350483 A CN106350483 A CN 106350483A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- culture
- fat
- mesenchymal stem
- differentiation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 45
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 title claims abstract description 28
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 title abstract 7
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title abstract 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 90
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 52
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 35
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims abstract description 34
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 65
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 38
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 33
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 32
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 30
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 26
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 22
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 claims description 16
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 13
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 11
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 claims description 11
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 10
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 10
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims description 10
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 10
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 10
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 10
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 10
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 10
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 claims description 10
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims description 10
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 claims description 7
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 238000009288 screen filtration Methods 0.000 claims description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 5
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 claims description 5
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 claims description 5
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 5
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 5
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 claims description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 5
- 229940099456 transforming growth factor beta 1 Drugs 0.000 claims description 5
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 62
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 4
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 3
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 3
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000002734 Collagen Type VI Human genes 0.000 description 1
- 108010043741 Collagen Type VI Proteins 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 101150067309 bmp4 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002670 chondrogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000003035 hyaline cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 210000005065 subchondral bone plate Anatomy 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- -1 that is Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
- C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法。为解决现有技术分化率低问题。步骤有：1)、脂肪间充质干细胞原代细胞的分离：2)、脂肪间充质干细胞扩增、传代：3)、P5代脂肪干细胞向软骨细胞分化培养：脂肪间充质干细胞在传P5代后加入条件培养基，即脂肪间充质干细胞向软骨分化培养基，进行向软骨细胞分化培养，每三天进行细胞换液，同时观察了细胞的形态学变化，诱导16天后进行阿利新蓝染色鉴定脂肪间充质干细胞成软骨分化情况。阿利新兰染色鉴定是显微镜下可见软骨细胞形成，且阿利新蓝染色呈阳性。具有简单易行，诱导培养基为无血清培养系统，诱导时间短，实验重复性好，成骨细胞分化率高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种干细胞诱导分化方法，特别是涉及一种诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法。
背景技术
关节软骨是一种特殊形式的结缔组织，属透明软骨，主要由软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)组成，其功能是减轻关节运动作用于软骨下骨的压力并减少关节面的摩擦。由于软骨组织没有血液供应，只能依靠关节液提供营养，因此，一旦软骨组织发生损伤则难以通过激活血液或骨髓里的祖细胞进入缺损处进行修复，损伤很难自愈。传统的关节软骨修复方法主要是通过调动软骨细胞内在的愈合潜能促进软骨愈合或者通过促进软骨细胞再生来修复软骨缺损。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)MSCs来源于中胚层，存在于成人多种组织中，包括滑膜、肌肉、脂肪、骨髓等，除了具有高度自我更新能力外，体外可以分化成脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、神经细胞等。脂肪间充质干细胞ADSCs具有多向分化潜能，无免疫原性，而且来源丰富、取材方便、创伤性小、干细胞含量高、能重复提取，所获得细胞数量多，可不经过体外扩增直接应用。另外，脂肪间充质干细胞ADSCs比骨髓间充质干细胞BMSCs高表达趋化因子受体，有利于干细胞的迁移和归巢，维持内环境的稳定和介导损伤修复。与高分化的软骨细胞相比，间充质干细胞具有自我更新和“可塑性”，自身来源的ADSCs几乎没有免疫原性，成为组织工程种子细胞的研究热点。ADSCs还能自分泌功能性细胞因子，包括诱导软骨形成的分子，如TGF-β、BMP4、FGF等促进分化。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种能将脂肪间充质干细胞高效分化为软骨细胞的诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法。
为实现上述目的，本发明诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法步骤有：
1)、脂肪间充质干细胞原代细胞的分离：吸脂来源的脂肪组织洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平a板检测，确保实验前脂肪无污染；离心后脂肪组织在下层，去掉上层血水后将离心管下层的脂肪分散，加入2倍体积I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物，37℃消化30-45分钟后停止酶解，离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液；
2)、脂肪间充质干细胞扩增、传代：获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4--1∶6接种到新培养瓶中培养，在培养瓶中加入间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞：细胞生长达到80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用自体血清终止消化，将细胞吸入离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，倒掉离心后的上清，以1∶3的比例传代，培养至P4代；
3)、P5代脂肪干细胞向软骨细胞分化培养：
(1)取P4代细胞生长达到70-80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入trypLETM进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用人血清终止消化，将细胞收集到离心管中，充分混匀后，离心，倒掉离心后的上清，加入DPBS洗液，混匀后再次离心，倒掉上清，再次加入DPBS洗液，混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，离心后去掉上清；备用做脂肪干细胞向软骨细胞分化培养；
(2)用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度；将细胞悬液加入多孔板中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中，约24小时后，换加入诱导分化培养基，每三天更换一次诱导分化培养基；16-18天后，进行阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况合格后，完成向软骨细胞分化的培养；
所述诱导分化培养基为由DMEM高糖培养液，5％血清替代物，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素，10ng/ml的转化生长因子-β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50ug/ml，地塞米松10-7mol/L，丙酮酸钠6.25ug/ml，维生素C浓度25ug/mL配制成的无血清诱导培养液。具有简单易行，诱导培养基为无血清培养系统，诱导时间短，实验重复性好，成骨细胞分化率高的特点。
作为优化，步骤1)中的吸脂来源的脂肪组织洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织是无菌条件下打开样本存储装置，将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织；加入2倍体积I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物是按照相应比例加入加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物；离心弃去上清液是1500rpm离心10分钟，弃去上清液；用筛网过滤是用200目筛网过滤。
作为优化，步骤2)中：获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中是获得的细胞按2-3×104/cm2的密度接种到培养瓶中；在培养瓶中加入间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞是在每个75cm2培养瓶中加入12ml间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞；用DPBS洗液洗多遍后，加入胰酶-EDTA进行消化是用DPBS洗液洗两遍后，加入3ml胰酶-EDTA进行消化；用自体血清终止消化是用2ml自体血清终止消化；将细胞吸入离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心是，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，取100微升计数，其余细胞悬液离心，1500rpm，维持10min。
作为优化，子步骤(1)中：用DPBS洗液洗多遍后，加入trypLETM进行消化是用DPBS洗液洗两遍后，加入3mltrypLETM进行消化；用人血清终止消化是用2ml人血清终止消化；将细胞收集到离心管中是将细胞收集到50毫升离心管中；离心是1500rpm，离心10min；加入DPBS洗液的量为40ml。
作为优化，子步骤(2)中：用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度是用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1.5×107细胞/ml；将细胞悬液加入多孔板中是将1ml含有1.5×107个细胞的细胞悬液取5ul加入96孔板中；阿利新兰染色鉴定是阿利新蓝染色检测蛋白多糖的分泌从而鉴定脂肪间充质干细胞成软骨分化情况。
作为优化，子步骤(2)中：阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况是定向诱导培养16-18天后，用低聚甲醛固定在多孔板中细胞后行以下检测：阿利新蓝染色是用阿利新蓝染色，蒸馏水冲洗，苏木精染核，无水乙醇脱水，在倒置相差显微镜下观察染色情况。
作为优化，用低聚甲醛固定在多孔板中细胞后行以下检测是用4％低聚甲醛固定24孔板中细胞20min后行以下检测；阿利新蓝染色是用阿利新蓝染色，蒸馏水冲洗，苏木精染核是用pH 2.5的阿利新蓝染色30min，蒸馏水冲洗15min，苏木精染核；无水乙醇脱水，室温下待干，在倒置相差显微镜下观察染色情况，镜下记录并拍照。
作为优化，子步骤(2)中：间充质干细胞生长培养基是每T75培养瓶加10ml专用培养基，专用培养基由D/F12，血清替代物，BFGF，1％的双抗配制而成。
作为优化，吸脂来源的脂肪组织是从人臀部吸脂来源的脂肪组织。
作为优化，阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况合格是显微镜下可见软骨细胞形成，且阿利新蓝染色呈阳性。
总之，本发明方法是：(1)采用2倍体积的0.1％I型胶原酶消化培养法，从人臀部脂肪组织中提取脂肪间充质干细胞进行体外扩增培养。(2)脂肪间充质干细胞在传P5代后加入条件培养基，即脂肪间充质干细胞向软骨分化培养基，进行向软骨细胞分化培养，每三天进行细胞换液，同时观察了细胞的形态学变化，诱导16天后进行阿利新蓝染色鉴定脂肪间充质干细胞成软骨分化情况。结果经成软骨诱导专用培养基培养16天后，显微镜下可见软骨细胞形成，且阿利新蓝染色呈阳性，证明我们用本发明建立的试验方法成功的将培养的脂肪间充质干细胞分化成为软骨细胞，本发明具有培养时间短，细胞分化率高的特点。
因此，采用上述技术方案后，本发明诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法具有简单易行，诱导培养基为无血清培养系统，诱导时间短，实验重复性好，成骨细胞分化率高的特点。
附图说明
图1是本发明诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法培养到第五代的100倍放大形态学照片；
图2-6是本发明诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法培养到第五代的流式表型分析峰形图。
具体实施方式
本发明诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法步骤有：
1)、脂肪间充质干细胞原代细胞的分离：吸脂来源的脂肪组织洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平a板检测，确保实验前脂肪无污染；离心后脂肪组织在下层，去掉上层血水后将离心管下层的脂肪分散，加入2倍体积I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物，37℃消化30-45分钟后停止酶解，离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液；
2)、脂肪间充质干细胞扩增、传代：获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4--1∶6接种到新培养瓶中培养，在培养瓶中加入间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞：细胞生长达到80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用自体血清终止消化，将细胞吸入离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，倒掉离心后的上清，以1∶3的比例传代，培养至P4代；
3)、P5代脂肪干细胞向软骨细胞分化培养：
(1)取P4代细胞生长达到70-80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入trypLETM进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用人血清终止消化，将细胞收集到离心管中，充分混匀后，离心，倒掉离心后的上清，加入DPBS洗液，混匀后再次离心，倒掉上清，再次加入DPBS洗液，混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，离心后去掉上清；备用做脂肪干细胞向软骨细胞分化培养；
(2)用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度；将细胞悬液加入多孔板中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中，约24小时后，换加入诱导分化培养基，每三天更换一次诱导分化培养基；16-18天后，进行阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况合格后，完成向软骨细胞分化的培养；
所述诱导分化培养基为由DMEM高糖培养液，5％血清替代物，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素，10ng/ml的转化生长因子-β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50ug/ml，地塞米松10-7mol/L，丙酮酸钠6.25ug/ml，维生素C浓度25ug/mL配制成的无血清诱导培养液。
具体是：步骤1)中的吸脂来源的脂肪组织洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织是无菌条件下打开样本存储装置，将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织；加入2倍体积I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物是按照相应比例加入加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物；离心弃去上清液是1500rpm离心10分钟，弃去上清液；用筛网过滤是用200目筛网过滤。
具体是：步骤2)中：获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中是获得的细胞按2-3×104/cm2的密度接种到培养瓶中；在培养瓶中加入间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞是在每个75cm2培养瓶中加入12ml间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞；用DPBS洗液洗多遍后，加入胰酶-EDTA进行消化是用DPBS洗液洗两遍后，加入3ml胰酶-EDTA进行消化；用自体血清终止消化是用2ml自体血清终止消化；将细胞吸入离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心是，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，取100微升计数，其余细胞悬液离心，1500rpm，维持10min。
具体是：子步骤(1)中：用DPBS洗液洗多遍后，加入trypLETM进行消化是用DPBS洗液洗两遍后，加入3mltrypLETM进行消化；用人血清终止消化是用2ml人血清终止消化；将细胞收集到离心管中是将细胞收集到50毫升离心管中；离心是1500rpm，离心10min；加入DPBS洗液的量为40ml。
具体是：子步骤(2)中：用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度是用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1.5×107细胞/ml；将细胞悬液加入多孔板中是将1ml含有1.5×107个细胞的细胞悬液取5ul加入96孔板中；阿利新兰染色鉴定是阿利新蓝染色检测蛋白多糖的分泌从而鉴定脂肪间充质干细胞成软骨分化情况。
具体是：子步骤(2)中：阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况是定向诱导培养16-18天后，用低聚甲醛固定在多孔板中细胞后行以下检测：阿利新蓝染色是用阿利新蓝染色，蒸馏水冲洗，苏木精染核，无水乙醇脱水，在倒置相差显微镜下观察染色情况。
更具体是：用低聚甲醛固定在多孔板中细胞后行以下检测是用4％低聚甲醛固定24孔板中细胞20min后行以下检测；阿利新蓝染色是用阿利新蓝染色，蒸馏水冲洗，苏木精染核是用pH 2.5的阿利新蓝染色30min，蒸馏水冲洗15min，苏木精染核；无水乙醇脱水，室温下待干，在倒置相差显微镜下观察染色情况，镜下记录并拍照。
具体是：子步骤(2)中：间充质干细胞生长培养基是每T75培养瓶加10ml专用培养基，专用培养基由D/F12，血清替代物，BFGF，1％的双抗配制而成。
具体是：吸脂来源的脂肪组织是从人臀部吸脂来源的脂肪组织。
具体是：阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况合格是显微镜下可见软骨细胞形成，且阿利新蓝染色呈阳性。
下面结合附图对本发明诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法作更进一步说明：
1.脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化培养方法：
1.1脂肪间充质干细胞原代细胞的分离：无菌条件下打开样本存储装置，将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平a板检测，确保实验前脂肪无污染。离心后脂肪组织在下层，去掉上层血水后将离心管下层的脂肪分散，按照相应比例加入加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物，37℃消化30-45分钟后停止酶解，1500rpm离心10分钟，弃去上清液；并用200目筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液。
1.2脂肪干细胞扩增、传代：获得的细胞按2-3×104/cm2的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4--1∶6接种到新培养瓶中培养，在每个75cm2培养瓶中加入12ml间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞，细胞生长达到80％融合，用DPBS洗液洗两遍后，加入3ml胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用2ml自体血清终止消化，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，取100微升计数，其余细胞悬液离心1500rpm，维持10min；倒掉离心后的上清，以1∶3的比例传代，培养至P4代。
P5代脂肪干细胞向软骨细胞分化培养：
1.3.1取P4代细胞生长达到70-80％融合，用DPBS洗液洗两遍后，加入3mltrypLETM进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用2ml人血清终止消化，将细胞收集到50毫升离心管中，充分混匀后，离心，1500rpm，10min；倒掉离心后的上清，加入40ml DPBS洗液，混匀后再次离心，倒掉上清，再次加入40ml DPBS洗液，混匀后，取出100UL计数，其余细胞悬液离心，1500rpm，10min；离心后去掉上清；备用做脂肪干细胞向软骨细胞分化培养。
1.3.2以上脂肪间充质干细胞专用培养基组成：每T75培养瓶加10ml专用培养基(D/F12，血清替代物，BFGF，1％的双抗)。
1.3.2脂肪干细胞向软骨细胞分化诱导液组成：我们用的脂肪干细胞向软骨分化的培养系统为无血清诱导液培养系统。DMEM高糖培养液，5％血清替代物，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素，10ng/ml的转化生长因子-β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50ug/ml，地塞米松10-7mol/L，丙酮酸钠6.25ug/ml，维生素C浓度25ug/mL。
1)用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1.5×107细胞/ml；
2)将1ml含有1.5×107个细胞的细胞悬液取5ul加入96孔板中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中，约24小时后，换加入诱导分化培养基，每三天更换一次诱导分化培养基；
3)16-18天后，进行阿利新兰染色鉴定，倒置显微镜下观察细胞生长状况，阿利新蓝染色检测蛋白多糖的分泌从而鉴定脂肪间充质干细胞成软骨分化情况。
1.4脂肪间充质干细胞成软骨细胞分化培养鉴定：
1)定向诱导培养16-18天后，用4％低聚甲醛固定24孔板中细胞20min后行以下检测。
2)阿利新蓝染色：用pH 2.5的阿利新蓝染色30min，蒸馏水冲洗15min，苏木精染核，无水乙醇脱水。
3)100％乙醇脱水，室温下待干，在倒置相差显微镜下观察染色情况，镜下记录并拍照。
2.脂肪干细胞培养结果及向软骨细胞分化结果：
2.1我们成功的从脂肪组织中提取了脂肪间充质干细胞并进行原代培养，镜下观察细胞形态，细胞呈梭形、多角形，原代细胞约10d接近80％融合，传代后细胞纯度提高，形态较原代均一，以平行排列生长为主，或呈漩涡状生长(图1)，将细胞进行流式检测分析，符合间充质干细胞特征，其中CD73、CD90、CD105为阳性。CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR为阴性(图2)。
2.2脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化结果：阿利新蓝能特异性结合细胞胞浆和胞外基质的蛋白聚糖硫酸基。分化第14天，镜下观察阿利新蓝染色可见胞内大量蓝紫色易染性基质，表现强阳性表达(2-A)。
3.本发明的优势：用本发明发明的脂肪干细胞向软骨细胞分化诱导液：即无血清诱导液培养系统(DMEM高糖培养液，5％血清替代物，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素，10ng/ml的转化生长因子-β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50ug/ml，地塞米松10-7mol/L，丙酮酸钠6.25ug/ml，维生素C浓度25ug/ml)。联合脂肪干细胞无血清专用培养基(D/F12，血清替代物，BFGF，1％的双抗)，成功的将培养的脂肪间充质干细胞分化成为软骨细胞，且经阿利新蓝染色可见胞内大量蓝紫色易染性基质，表现强阳性表达，证明我们诱导的细胞为软骨细胞。且本发明方法具有简单易行，诱导培养基为无血清培养系统，诱导时间短，实验重复性好，成骨细胞分化率高的特点，可以满足后续实验需求。
采用上述技术方案后，本发明诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法具有简单易行，诱导培养基为无血清培养系统，诱导时间短，实验重复性好，成骨细胞分化率高的特点。
Claims (10)
1.一种诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法，其特征在于步骤有：
1)、脂肪间充质干细胞原代细胞的分离：吸脂来源的脂肪组织洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平a板检测，确保实验前脂肪无污染；离心后脂肪组织在下层，去掉上层血水后将离心管下层的脂肪分散，加入2倍体积I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物，37℃消化3045分钟后停止酶解，离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪问充质干细胞悬液；
2)、脂肪间充质干细胞扩增、传代：获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4--1∶6接种到新培养瓶中培养，在培养瓶中加入间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞：细胞生长达到80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用自体血清终止消化，将细胞吸入离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，倒掉离心后的上清，以1∶3的比例传代，培养至P4代；
3)、P5代脂肪干细胞向软骨细胞分化培养：
(1)取P4代细胞生长达到70-80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入trypLETM进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用人血清终止消化，将细胞收集到离心管中，充分混匀后，离心，倒掉离心后的上清，加入DPBS洗液，混匀后再次离心，倒掉上清，再次加入DPBS洗液，混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，离心后去掉上清；备用做脂肪干细胞向软骨细胞分化培养；
(2)用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度；将细胞悬液加入多孔板中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中，约24小时后，换加入诱导分化培养基，每三天更换一次诱导分化培养基；16-18天后，进行阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况合格后，完成向软骨细胞分化的培养；
所述诱导分化培养基为由DMEM高糖培养液，5％血清替代物，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素，10ng/ml的转化生长因子-β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50ug/ml，地塞米松10- 7mol/L，丙酮酸钠6.25ug/ml，维生素C浓度25ug/mL配制成的无血清诱导培养液。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤1)中的吸脂来源的脂肪组织洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织是无菌条件下打开样本存储装置，将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织；加入2倍体积I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物是按照相应比例加入加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物；离心弃去上清液是1500rpm离心10分钟，弃去上清液；用筛网过滤是用200目筛网过滤。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤2)中：获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中是获得的细胞按2-3×104/cm2的密度接种到培养瓶中；在培养瓶中加入间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞是在每个75cm2培养瓶中加入12ml间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源问充质干细胞；用DPBS洗液洗多遍后，加入胰酶-EDTA进行消化是用DPBS洗液洗两遍后，加入3ml胰酶-EDTA进行消化；用自体血清终止消化是用2ml自体血清终止消化；将细胞吸入离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心是，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，取100微升计数，其余细胞悬液离心，1500rpm，维持10min。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于子步骤(1)中：用DPBS洗液洗多遍后，加入trypLETM进行消化是用DPBS洗液洗两遍后，加入3mltrypLETM进行消化；用人血清终止消化是用2ml人血清终止消化；将细胞收集到离心管中是将细胞收集到50毫升离心管中；离心是1500rpm，离心10min；加入DPBS洗液的量为40ml。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于子步骤(2)中：用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度是用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1.5×107细胞/ml；将细胞悬液加入多孔板中是将1ml含有1.5×107个细胞的细胞悬液取5ul加入96孔板中；阿利新兰染色鉴定是阿利新蓝染色检测蛋白多糖的分泌从而鉴定脂肪间充质干细胞成软骨分化情况。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于子步骤(2)中：阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况是定向诱导培养16-18天后，用低聚甲醛固定在多孔板中细胞后行以下检测：阿利新蓝染色是用阿利新蓝染色，蒸馏水冲洗，苏木精染核，无水乙醇脱水，在倒置相差显微镜下观察染色情况。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于用低聚甲醛固定在多孔板中细胞后行以下检测是用4％低聚甲醛固定24孔板中细胞20min后行以下检测；阿利新蓝染色是用阿利新蓝染色，蒸馏水冲洗，苏木精染核是用pH2.5的阿利新蓝染色30min，蒸馏水冲洗15min，苏木精染核；无水乙醇脱水，室温下待干，在倒置相差显微镜下观察染色情况，镜下记录并拍照。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于子步骤(2)中：间充质干细胞生长培养基是每T75培养瓶加10ml专用培养基，专用培养基由D/F12，血清替代物，BFGF，1％的双抗配制而成。
9.根据权利要求1-8任一所述方法，其特征在于吸脂来源的脂肪组织是从人臀部吸脂来源的脂肪组织。
10.根据权利要求1-8任一所述方法，其特征在于阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况合格是显微镜下可见软骨细胞形成，且阿利新蓝染色呈阳性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610895792.2A CN106350483A (zh) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | 诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610895792.2A CN106350483A (zh) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | 诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106350483A true CN106350483A (zh) | 2017-01-25 |
Family
ID=57865755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610895792.2A Pending CN106350483A (zh) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | 诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106350483A (zh) |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106978386A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-07-25 | 安徽安龙基因医学检验所有限公司 | 一种自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法 |
| CN107338218A (zh) * | 2017-07-28 | 2017-11-10 | 中国人民解放军总医院第附属医院 | 一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导剂和方法 |
| CN108384753A (zh) * | 2018-02-13 | 2018-08-10 | 中国人民解放军第四五五医院 | 成软骨培养基及其在ADSCs成软骨分化中的应用 |
| CN108384752A (zh) * | 2018-02-13 | 2018-08-10 | 中国人民解放军第四五五医院 | 成软骨培养基及其在微分裂技术中膝关节软骨分化中的应用 |
| CN109182256A (zh) * | 2018-08-31 | 2019-01-11 | 浙江省海洋水产研究所 | 一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法 |
| CN109402049A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-03-01 | 浙江大学 | 一种可用于软骨损伤修复的具有软骨分化潜能的组织工程脂肪干细胞片层的制备方法 |
| CN109837239A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-06-04 | 中山大学附属第五医院 | 一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法 |
| CN110373384A (zh) * | 2019-07-24 | 2019-10-25 | 安徽科门生物科技有限公司 | 一种无血清脂肪干细胞培养基及脂肪干细胞的培养方法 |
| CN110499286A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-11-26 | 广东万海细胞生物科技有限公司 | 一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法 |
| CN110846273A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-02-28 | 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 | 一种脂肪组织来源的间充质干细胞培养及三系分化诱导方法 |
| CN111518751A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-08-11 | 广东先康达生物科技有限公司 | 一种体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法 |
| CN111826343A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-10-27 | 北京中卫医正科技有限公司 | 一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用 |
| CN113583945A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-11-02 | 广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院） | 杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用及方法 |
| CN115418348A (zh) * | 2022-08-06 | 2022-12-02 | 北京永华燕芸生物科技有限公司 | 一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法 |
| CN115820546A (zh) * | 2022-04-12 | 2023-03-21 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种促进棕色脂肪干细胞成软骨分化的方法及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1778905A (zh) * | 2004-11-22 | 2006-05-31 | 赵春华 | 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用 |
| CN102925408A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-02-13 | 川北医学院第二临床医学院 | 诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞的方法 |
| CN104164403A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-11-26 | 大连大学 | 一种提取及培养脂肪干细胞的方法 |
| CN104611292A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-05-13 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法 |
-
2016
- 2016-10-14 CN CN201610895792.2A patent/CN106350483A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1778905A (zh) * | 2004-11-22 | 2006-05-31 | 赵春华 | 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用 |
| CN102925408A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-02-13 | 川北医学院第二临床医学院 | 诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞的方法 |
| CN104164403A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-11-26 | 大连大学 | 一种提取及培养脂肪干细胞的方法 |
| CN104611292A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-05-13 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 刘伟 等: "人脐带间充质干细胞治疗软骨损伤的研究进展及应用", 《兰州大学学报（医学版）》 * |
| 周全 等: "体外诱导的人脂肪间充质干细胞源性软骨细胞体内成骨活性", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
| 周全 等: "微球培养人脂肪间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
| 周全 等: "胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
| 毕晓娟 等: "三维培养诱导人脂肪间充质干细胞微球的成软骨分化能力", 《中国组织工程研究》 * |
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106978386A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-07-25 | 安徽安龙基因医学检验所有限公司 | 一种自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法 |
| CN107338218A (zh) * | 2017-07-28 | 2017-11-10 | 中国人民解放军总医院第附属医院 | 一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导剂和方法 |
| CN108384753A (zh) * | 2018-02-13 | 2018-08-10 | 中国人民解放军第四五五医院 | 成软骨培养基及其在ADSCs成软骨分化中的应用 |
| CN108384752A (zh) * | 2018-02-13 | 2018-08-10 | 中国人民解放军第四五五医院 | 成软骨培养基及其在微分裂技术中膝关节软骨分化中的应用 |
| CN109182256B (zh) * | 2018-08-31 | 2020-07-17 | 浙江省海洋水产研究所 | 一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法 |
| CN109182256A (zh) * | 2018-08-31 | 2019-01-11 | 浙江省海洋水产研究所 | 一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法 |
| CN109402049A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-03-01 | 浙江大学 | 一种可用于软骨损伤修复的具有软骨分化潜能的组织工程脂肪干细胞片层的制备方法 |
| CN109837239A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-06-04 | 中山大学附属第五医院 | 一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法 |
| CN109837239B (zh) * | 2018-12-28 | 2023-10-10 | 中山大学附属第五医院 | 一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法 |
| CN110373384A (zh) * | 2019-07-24 | 2019-10-25 | 安徽科门生物科技有限公司 | 一种无血清脂肪干细胞培养基及脂肪干细胞的培养方法 |
| CN110499286A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-11-26 | 广东万海细胞生物科技有限公司 | 一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法 |
| CN110846273A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-02-28 | 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 | 一种脂肪组织来源的间充质干细胞培养及三系分化诱导方法 |
| CN111518751A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-08-11 | 广东先康达生物科技有限公司 | 一种体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法 |
| CN111826343A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-10-27 | 北京中卫医正科技有限公司 | 一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用 |
| CN113583945A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-11-02 | 广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院） | 杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用及方法 |
| CN113583945B (zh) * | 2021-07-28 | 2023-02-03 | 广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院） | 杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用及方法 |
| CN115820546A (zh) * | 2022-04-12 | 2023-03-21 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种促进棕色脂肪干细胞成软骨分化的方法及其应用 |
| CN115418348A (zh) * | 2022-08-06 | 2022-12-02 | 北京永华燕芸生物科技有限公司 | 一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法 |
| CN115418348B (zh) * | 2022-08-06 | 2024-05-31 | 北京永华燕芸生物科技有限公司 | 一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106350483A (zh) | 诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法 | |
| Kolambkar et al. | Chondrogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells | |
| Gasparotto et al. | A new fibrin sealant as a three-dimensional scaffold candidate for mesenchymal stem cells | |
| Grayson et al. | Spatial regulation of human mesenchymal stem cell differentiation in engineered osteochondral constructs: effects of pre-differentiation, soluble factors and medium perfusion | |
| CN101914490B (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞无血清培养基及其培养方法 | |
| CN102292434B (zh) | 源自成人肾小球的分离的多潜能间充质干细胞(hGL-MSC)、其制备方法及其在肾脏再生医学中的用途 | |
| CN102002478B (zh) | 一种脂肪干细胞的分离培养方法 | |
| CN104164403A (zh) | 一种提取及培养脂肪干细胞的方法 | |
| CN106222134A (zh) | 高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法 | |
| CN104450611A (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法 | |
| CN109402051A (zh) | 一种人脐带间充质干细胞无血清培养基 | |
| CN102965335A (zh) | 用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用 | |
| CN110885786A (zh) | 细胞因子在促进牙髓干细胞分泌外泌体中的应用 | |
| CN102399745A (zh) | 一种软骨干细胞分离培养方法 | |
| CN101948804A (zh) | 脐带间充质干细胞的制备方法 | |
| CN109576216A (zh) | 尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法 | |
| CN112941017A (zh) | 一种诱导人间充质干细胞成脂分化培养基及其制备方法 | |
| CN103525761B (zh) | 分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法 | |
| CN111172104A (zh) | 一种脐血间充质干细胞的分离培养方法 | |
| CN103305465B (zh) | 一种颅神经嵴源性干细胞的培养方法和鉴定方法 | |
| CN113774020B (zh) | 一种脂肪间充质干细胞库的构建方法 | |
| CN105255821B (zh) | 一种牙周膜干细胞的培养方法 | |
| CN103184191A (zh) | 大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的提取方法和专用培养基 | |
| CN109652367B (zh) | 一种制备临床级脂肪干细胞的方法 | |
| CN106957814B (zh) | 一种羊膜间充质干细胞培养基和培养羊膜间充质干细胞的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170601 Address after: 101111 Beijing branch of Daxing District economic and Technological Development Zone Street No. 88 Yizhuang biomedical park E1-501 Applicant after: Defender Huayi (Beijing) Biotechnology Co. Ltd. Applicant after: Huayue will (Beijing) Medical Technology Co Ltd Address before: 101111 Beijing branch of Daxing District economic and Technological Development Zone Street No. 88 Yizhuang biomedical park E1-501 Applicant before: Defender Huayi (Beijing) Biotechnology Co. Ltd. |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170125 |