CN101948804A - 脐带间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的制备方法，本发明的步骤包括：(1)取人脐带用酒精消毒，生理盐水洗涤后剔除血管；(2)加入胶原酶、透明质酸酶、蛋白中性酶消化；(3)收集细胞悬液，离心，弃去上清液，培养，即可获得间充质干细胞。本发明为新生儿储存脐带间充质干细胞以及今后大规模临床应用间充质干细胞提供了一种较为简单、高效的分离方法。

Description

脐带间充质干细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及脐带间充质干细胞的获取方法，更具体地涉及一种酶消化法来制备脐带间充质干细胞的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)最早是从骨髓分离出的成体干细胞。MSC具有较强的粘附性，低密度培养时能够迅速贴壁，且具有快速增殖的能力。MSC体外培养能保持核型的稳定及端粒酶的活性。目前主要是根据其形态、抗原表型及分化潜能来鉴定MSC。传代后骨髓MSC的形态呈单一类成纤维细胞的长梭形。迄今尚未发现MSC的特异性表面标志，MSC均匀稳定的抗原标记包括：SH2(+)、SH3(+)、CD29(+)、CD44(+)、CD71(+)、CD90(+)、CD106(+)、CD120a(+)、CD124(+)，不表达造血细胞表面标志CD34、CD45、CD14、CD117和与移植免疫排斥发生密切相关的表面标志HLA-DR、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40等。MSC在体外不同的微环境诱导下可向不同的组织分化，用地塞米松，β-磷酸甘油和抗坏血酸等联合诱导，MSC可以分化为成骨细胞；在3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，吲哚美辛作用下，MSC可分化为成脂细胞；用β-巯基乙醇，全反式视黄酸为诱导剂，MSC可分化为神经细胞等。

1991年，McElreavey等首次报道，从人脐带的Wharton’s jelly组织中分离并培养到了一种成纤维样细胞，具有较强的分化潜能，可向多个方向进行分化。随后，数位研究者也分别报道脐带中含有丰富的MSC。脐带MSC具有骨髓MSC相类似的特点：形态似长梭形，表达以上骨髓MSC的一组抗原标记以及多向分化潜能。但其还具有自身独特的优势：脐带MSCs不表达主要组织相容性复合物(MHC)II类抗原，表达MHC-I类抗原，但不表达或低表达移植免疫排斥相关的共刺激因子CD80、CD86、CD40和CD40 L等，因此是一类免疫缺陷细胞，可用来与造血干细胞共移植，预防和治疗急性移植物抗宿主反应(GVHD)。脐带是分娩后的废物，取材方便，易于收集、保存、冷冻，不受伦理道德及法律方面的限制，且细胞较为原始，分化能力强，生物性能稳定，可以为实验和临床提供充足的细胞来源，因此在细胞治疗方面具有广阔的临床前景。

目前国内外各家实验室存在多种分离脐带MSCs的方法，归纳起来主要是利用流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法，以及酶消化法进行分离纯化脐带MSCs。流式细胞仪分选与免疫磁珠分选间充质干细胞的方法成本高，操作繁琐，大量细胞的分离纯化受到限制，且目前仍未找到MSCs特有的特异性抗原标记，因此大多数实验室使用酶消化法。然而，不同实验室的酶消化方法也各不相同，首先是消化的脐带组织不同，大多数实验室消化的是从脐带中刮出的Wharton胶状物或是将脐带组织整个剪碎为1-2mm³大小的组织块进行消化，操作较为复杂，且容易污染；另外，所用的酶的种类不同，如Sachiko使用胶原酶与透明质酸酶消化，而Wangs则单独使用胶原酶消化，这些均能得到脐带MSCs，但是细胞得率各不相同，且细胞能传代的次数各不相同。

发明内容

本发明旨在建立一种简单有效且得率高的脐带MSCs分离方法，为新生儿储存脐带间充质干细胞以及今后大规模临床应用脐带间充质干细胞奠定基础。

本发明提供一种简单高效的脐带间充质干细胞分离方法，包括：

(1)脐带剔除血管的处理；

(2)酶消化步骤，

(3)收集消化后的细胞；

(4)对收集获得的细胞进行培养；

其特点是所用的酶为2U/ml中性蛋白酶+2mg/ml胶原酶I+2U/ml透明质酸酶。

根据本发明的实施例，优选的消化时间为16小时。

消化后，将未消化的组织用镊子夹出，收集消化的细胞悬液，加入生理盐水后离心，2000r，20min，小心弃除上清液，用生理盐水洗涤，离心，弃上清。细胞冰醋酸稀释后计数，细胞培养在含10％FBS+10ng/mlbFGF的DMEM/F12培养基中，37℃、5％CO2培养箱内培养。细胞贴壁后，每隔2～3d更换培养基，约过7-10天，细胞即可80％汇合后，以胰酶/EDTA消化即可得到原代的脐带间充质干细胞。

根据本发明的实施例，证实：

1用本发明的方法制备得到的细胞为脐带MSC。

原代培养时大多数细胞呈成纤维样的长梭形，折光性强，胞核为圆形或椭圆形，位于胞体的中央，胞质较丰富，少部分细胞呈上皮样结构，为扁平的多角形，紧密相连(图1A)。细胞生长达80％汇合时，用胰酶消化并按1∶3的比例传代，传至第二代时，细胞形态为均一的成纤维样的长梭形(图1B)。应用流式细胞技术我们分析了传代培养后类成纤维样细胞的表面标志，类成纤维样细胞高表达间质细胞表面标志CD29，CD90和多能干细胞标志OCT-4，SSEA4；不表达造血和内皮细胞标志CD34，CD45，CD31，KDR(图2)。应用细胞免疫化学方法，细胞质中可检测到高表达的细胞骨架蛋白Vimentin，SMA，Desmin(图3)。上述结果表明传代培养后类成纤维样细胞表达间质细胞的表面标志，不表达造血和内皮细胞标志。类成纤维样细胞在含有地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油钠的成骨诱导培养体系中培养，细胞胞体逐渐变大，由单一的类成纤维样细胞的梭形变成三角形或多边形。局部细胞可呈多层生长，细胞聚集区可见细胞外基质分泌增多，形成大小不一的颗粒状沉淀。成骨诱导30d后，碱性磷酸酶染色呈红色(图4A)，Von Kossa染色有黑色的矿物沉淀(图4B)。传代培养后类成纤维样细胞在含有吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和胰岛素的成脂诱导分化体系中培养，随着诱导时间延长，细胞内呈空泡样的脂滴逐渐增多并相互融合，细胞由长梭形变为圆形或多边形，诱导14天后油红0染色呈红色(图5)，表明有大量脂质沉积。根据以上的细胞成纤维样形态、表达间质细胞的表面标志及向成骨成脂分化潜能证实了我们所得的细胞为脐带MSC.

2.同时，根据本发明的实施例，还证实新的方法比其余方法简单高效。

实验中我们比较了不同的酶混合液消化5cm去除血管后的脐带组织的结果。结果显示，单独使用胰酶消化或先用中性蛋白酶再用胰酶消化，细胞得率均非常低，分离得到的单个核细胞很难贴壁，即使将脐带组织剪碎后再消化，得到的结果也类似。因此我们主要比较了应用中性蛋白酶与胶原酶I两种酶混合液和中性蛋白酶、胶原酶I与透明质酸酶三种酶混合液进行消化后的结果。如表1所示，应用两种酶的混合液消化单位长度去血管脐带组织，消化后的细胞得率及培养一定时间后细胞得率与用三种酶的混合液消化结果类似，但是前者消化后得到的细胞悬液非常粘稠，需要大量的生理盐水反复稀释洗涤后，细胞才能接种，而后者消化后按常规方法洗涤细胞即可，可能由于脐带组织富含透明质酸，消化液中加入了透明质酸酶后，将透明质酸消化，从而去除了消化后细胞悬液的粘稠性，使后续的处理更容易。

文献报道脐带Wharton胶和间质组织均含有间充质干细胞，本研究中我们应用不同的方法分别分离了Wharton胶状物和包含Wharton胶的去除血管后脐带组织的间质干细胞。我们使用三种酶混合消化Wharton胶状物和去除血管后脐带组织，细胞得率如表2所示，含Wharton胶的脐带组织消化后，细胞得率、培养10天后得到的细胞数均明显高于Wharton胶组织。

因此，我们认为应用三种酶混合液消化去除血管后的脐带间质组织不需要刮胶，也不需将脐带组织剪碎，操作简便，减少了污染的机会，细胞得率更高，不失为脐带间质干细胞分离较好的方法。

表1：不同酶混合液消化5cm去血管脐带组织结果

表2：；去血管脐带组织和Wharton胶消化后细胞得率的比较

*表示与wharton胶组比较，P＜0.05，**表示与wharton胶组比较，P＜0.01。

附图说明

图1为原代培养中的细胞形态。A为原代培养得到的上皮样细胞形态。B为第二代时培养时得到的成纤维样细胞形态。

图2为流式分析细胞表面分子CD29，CD90，CD34，CD31，CD45，KDR，SSEA4，OCT-4。结果显示：成纤维样细胞高表达间质细胞表面标志CD29，CD90和多能干细胞标志OCT-4，SSEA4；不表达造血和内皮细胞标志CD34，CD45，CD31，KDR。

图3为免疫荧光细胞染色分析细胞表面分子Vimentin，SMA，Desmin，显示细胞质中可检测到高表达的细胞骨架蛋白Vimentin，SMA，Desmin，

图4为细胞向成骨细胞定向诱导分化。A为碱性磷酸酶染色后呈现红色；B为VonKossa染色显示矿物质的沉积。说明成纤维样细胞具有向成骨细胞分化的潜能。

图5为细胞成脂诱导，油红O染色显示细胞内有大量脂质沉积。说明成纤维样细胞具有向成脂细胞分化的潜能。

具体实施方式

1脐带MSCs的分离和培养

无菌条件下取脐带组织，浸泡于生理盐水中。超净台内取出脐带，酒精冲洗消毒，生理盐水充分洗涤后，剔除血管，刮出Wharton胶状物；或将去除血管后的脐带组织剪成2.5cm片段，然后将Wharton胶状物和去血管的脐带组织按照如下方法操作：1)0.05％胰酶/EDTA消化10min，2)2U/ml中性蛋白酶消化30min后，0.05％胰酶/EDTA胰酶消化10min，3)2U/ml中性蛋白酶+2mg/ml胶原酶I消化16h，4)2U/ml中性蛋白酶+2mg/ml胶原酶I+2U/ml透明质酸酶消化16h。每种方法分离5cm(单位长度)脐带。消化后细胞用15倍体积DPBS清洗2遍，冰醋酸稀释后计数单个核细胞数，细胞培养在含10％FBS+10ng/mlbFGF的DMEM/F12培养基中，37℃、5％CO2培养箱内培养。细胞贴壁后，每隔2d-3d更换培养基，细胞80％汇合后，以胰酶/EDTA消化传代，计算培养10天后细胞产量，结果见：表1和表2，细胞形态见图1。取传代培养第4代的脐带MSCs进行生物学特性分析和鉴定。

2细胞表面分子标志检测

21流式分析

收集培养的第4代脐带MSCs，分别加入PE-hCD29、PE-CD90、PE-CD34、FITC-CD45、FITC-IgG1和PE-IgG1抗体，室温孵育30min或加入小鼠抗人CD31抗体、小鼠抗人KDR、小鼠抗人SSEA4、小鼠抗人OCT4，室温孵育60min，PBST洗2次，再加入大鼠抗小鼠FITC二抗室温孵育45min，PBS洗涤后，流式细胞仪检测，结果见图2。

22免疫细胞荧光染色

消化生长状态良好的第4代脐带MSCs，调整细胞浓度，接种在纤粘连素包被的coverslip上，培养24h后，细胞用4％的多聚甲醛固定，0.1％的Triton-X-100破膜10min(用于细胞内抗原Vimentin、SMA、Desmin的检测)，4％的山羊血清封闭30min，按1∶200的稀释度加入Vimentin、SMA、Desmin抗体，室温孵育2h后，加FITC交联的大鼠抗小鼠二抗或FITC交联的兔抗大鼠二抗，避光室温孵育40min，0.1％DAPI复染核3min，激光共聚焦显微镜下观察细胞染色情况并照相记录，结果见图3。

3分化潜能的鉴定

31成骨诱导分化及鉴定

取第4代细胞，每孔5×10⁴细胞接种在24孔培养板中培养，待细胞增长至80％-90％融合时替换成成骨诱导培养基，隔日换液，培养30天后，行碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色。成骨诱导培养基为DMEM/F12辅以10％FBS、0.1μmol/L的地塞米松、0.2mM的维生素C、10mmol/L的β-磷酸甘油钠。

311碱性磷酸酶染色

参照Gomori α-萘基磷酸法，具体方法如下：4℃预冷的4％多聚甲醛固定30分钟，蒸馏水洗2遍，加入新鲜配制的染液染色，同时在显微镜下观察细胞染色情况，待细胞着色明显时，倾去染料，蒸馏水冲洗2遍，显微镜下观察细胞染色情况并照相记录，结果见图4A。。染液的组分为：25mg Fast Red TR、5mg α-萘酚、44.6ml蒸馏水、0.3ml 10％MgCl2、5ml 4.5％硼酸钠。

312Von Kossa染色

成骨诱导后细胞用4％多聚甲醛固定15min，然后用5％硫代硫酸钠孵育30min，蒸馏水冲洗，再加入1％硝酸银，紫外线下照射30min后，加入5％硫代硫酸钠作用2min，蒸馏水冲去表面的黑色颗粒，显微镜下观察细胞染色情况并照相记录，结果见图4B。

32成脂诱导分化及鉴定

取第4代细胞，按每孔5×10⁴个细胞接种在24孔培养板内，培养24h后替换成成脂诱导培养基。诱导培养基组分为：10％FBS的L-DMEM辅以1umol/L地塞米松、100uM吲哚美辛、0.5mM IBMX、10mg/L胰岛素，每3d换液一次，诱导培养2周后，油红染色检测脂肪沉积。

321油红O染色

油红O染液的配制：油红O干粉0.4g加入10mL异丙醇充分溶解，为油红O染液的储存液。将储存液按3∶2的比例加入双蒸水混匀，过滤即为油红O染液的工作液。成脂诱导后细胞用10％中性甲醛固定10min，油红O染液浸染20min，显微镜下观察细胞染色情况并照相记录，结果见图5。

Claims (2)

1.脐带间充质干细胞分离方法，包括：

(1)脐带剔除血管的处理；

(2)酶消化步骤，

(3)收集消化后的细胞；

(4)对收集获得的细胞进行培养；

其特点是所用的酶为2U/ml中性蛋白酶+2mg/ml胶原酶I+2U/ml透明质酸酶。

2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞分离方法，其特征在于消化时间为16小时。

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