CN102533643A

CN102533643A - 一种人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法

Info

Publication number: CN102533643A
Application number: CN2011104447487A
Authority: CN
Inventors: 李力; 肖扬
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法。它是取人脐带用胶原酶II消化，直至Wharton胶全部消化，然后收集消化下来的单细胞，将单细胞接入α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化；将胰蛋白酶消化的细胞悬液传代接种于α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化，再传代接种于α-MEM培养基中悬浮培养，如此重复进行传代培养，本步骤中的传代培养的α-MEM培养基中的胎牛血清的浓度是随传代次数的增加而递减直至无胎牛血清。该方法的取材-人脐带来源广泛、制备人脐带间充质干细胞快速、安全，不受伦理限制，后续培养不依赖胎牛血清的特征使得培养成本和临床使用风险大幅降低，具有很好的应用前景。

Description

一种人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法。

背景技术：

近几年来，干细胞的研究取得了重大突破。1999和2000年，世界最权威的美国《Science》杂志连续2年将干细胞和人类基因组计划列为当年的10大科学突破，尤其是在1999年甚至将干细胞研究列为第一位。干细胞很可能在医学领域引发革命性进步，因而具有不可估量的医学价值而引起全世界的广泛关注和研究，美国《时代》周刊认为干细胞和人类基因组计划将同时成为新世纪最具有发展和应用前景的领域。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，简称MSCs)是来源于成熟组织中的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是细胞移植和组织工程的新型种子细胞，具有广阔的应用前景。其中，研究最为广泛的MSCs是来源于骨髓的间充质干细胞，尽管其伦理问题与胚胎干细胞相比大为减少，但骨髓细胞必须通过浸入的途径获得，及其随着年龄的增长，干细胞数量显著减少。许多研究机构已经在其它组织中寻找到多能干细胞，包括动员的外周血、脐血、乳牙、脐带间充质细胞，然而，从这些组织中得到的细胞数量十分有限。

目前添加了胎牛血清的培养基被认为是体外扩增间充质干细胞最有效的培养基，然而，血清成分不明确，其中可能含有动物携带的已知的或未知的病原体，在临床应用中具有潜在的危险，并且胎牛血清价格昂贵。

发明内容：

本发明的目的是提供一种人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法，该方法的取材一人脐带来源广泛、制备人脐带间充质干细胞快速、安全，不受伦理限制等优越性，后续培养不依赖胎牛血清的特征使得培养成本和临床使用风险大幅降低，具有很好的应用前景。

本发明的人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)取人脐带用胶原酶II消化，直至Wharton胶全部消化，然后收集消化下来的单细胞，将单细胞接入α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化；

(b)将胰蛋白酶消化的细胞悬液传代接种于α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化，再传代接种于α-MEM培养基中悬浮培养，如此重复进行传代培养，本步骤中的传代培养的α-MEM培养基中的胎牛血清的浓度随传代次数的增加而递减直至无胎牛血清。

所述的步骤(b)优选为：将胰蛋白酶消化的细胞悬液传代接种于胎牛血清体积分数为8％的α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化，再传代接种于胎牛血清体积分数为5％的的α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化，再传代接种于胎牛血清体积分数为2％的α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化，再传代接种于无胎牛血清的α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化，然后一直用无胎牛血清的α-MEM培养基进行传代培养。

一般α-MEM培养基中，其胎牛血清的体积分数为10％。因此配制胎牛血清体积分数为8％的α-MEM培养基，其配制方法是将含胎牛血清的α-MEM培养基和无胎牛血清的α-MEM培养基按照4∶1的体积比混合。所述的胎牛血清体积分数为5％的α-MEM培养基，其配制方法是将含胎牛血清的α-MEM培养基和无胎牛血清的α-MEM培养基按照1∶1的体积比混合。所述的胎牛血清体积分数为2％的α-MEM培养基，其配制方法是将含胎牛血清的α-MEM培养基和无胎牛血清的α-MEM培养基按照1∶4的体积比混合。

所述的步骤(a)中的胶原酶II的浓度优选为lg/L。

所述的步骤(b)中的胰蛋白酶消化的细胞悬液，其密度优选为2×10⁵～1×10⁶个/ml。

所述的步骤(b)中传代接种的接种比例优选为1∶2～3，悬浮培养的条件优选都为：37℃、饱和湿度95％、体积分数为5％的CO₂的培养箱中培养，每3～4天全量换培养基一次。

利用本发明的人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法制备得到的人脐带间充质干细胞带型正常，具有向成骨细胞分化的潜能，具有广阔的应用前景。本发明的人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法，其取材为人脐带，来源广泛，应用其制备人脐带间充质干细胞快速，从15cm左右的脐带中分离培养出hUCMSCs，在体外培养三周左右，可获得(5～10)×10⁹个细胞，并且安全，不受伦理限制等优越性，后续培养不依赖胎牛血清使得培养成本和临床使用风险大幅降低，具有很好的应用前景。

附图说明：

图1是实施例1的P6代hUCMSCs的形态图；

图2是实施例1的P6代hUCMSCs表面标记流式细胞仪检测图谱；

图3是实施例1的P6代hUCMSCs染色体核型图谱；

图4是实施例1的P6代hUCMSCs经成骨诱导培养基诱导培养3周后的细胞染色图，其中图4A是碱性磷酸酶染色图，图4B是茜素红染色图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、人脐带间充质细胞的分离：

在无菌条件下取足月产健康男婴儿脐带组织，经医院伦理委员会批准。浸泡于α-MEM培养基中，超净台内取出脐带，D-Hank’s平衡液充分洗涤残留的血液，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，剥离Wharon胶，并将其剪碎至1mm×1mm×1mm大小组织块。将组织块移至1.0g/L胶原酶II中(按10ml的酶溶液消化3克的组织块计)，加入2ml α-MEM培养基，在37℃恒温振荡仪内消化，直至Wharon胶全部消化，然后用不锈钢滤网将消化下来的细胞制成单细胞悬液，将细胞悬液转入无菌离心管，以20倍细胞悬液的体积的α-MEM培养基反复吹打稀释，2500r/m离心30分钟，PBS洗2遍，用台盘兰染色，计数活细胞，以2×10⁵个/ml的密度将所得细胞接种于含有75ml α-MEM培养基的普通培养瓶中，在37℃、饱和湿度95％，体积分数为5％CO₂培养箱内培养。第3天全量换培养基，弃去未贴壁细胞，以后根据细胞生长情况每2～3天换培养基。倒置相差显微镜下观察，细胞达80％融合后，用质量分数为1.25g/L胰蛋白酶消化，调整细胞密度为2×10⁵～1×10⁶个/ml，而得到含人脐带间充质干细胞的细胞悬液。

2、人脐带间充质干细胞的无血清培养、纯化及扩增：

胎牛血清的体积分数为8％的α-MEM培养基，其配制方法是将含胎牛血清(体积分数为10％)的α-MEM培养基和无胎牛血清的α-MEM培养基按照4∶1的体积比混合。

胎牛血清的体积分数为5％的α-MEM培养基，其配制方法是将含胎牛血清(体积分数为10％)的α-MEM培养基和无胎牛血清的α-MEM培养基按照1∶1的体积比混合。

胎牛血清的体积分数为2％的α-MEM培养基，其配制方法是将含胎牛血清(体积分数为10％)的α-MEM培养基和无胎牛血清的α-MEM培养基按照1∶4的体积比混合。

无胎牛血清的α-MEM培养基是指α-MEM培养基中不含有胎牛血清。

将上一步骤所得的细胞密度为2×10⁵～1×10⁶个/ml的含人脐带间充质干细胞的细胞悬液按照1∶2的比例接种于含有75ml胎牛血清的体积分数为8％的α-MEM培养基的培养瓶中，于37℃、饱和湿度95％、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养，根据细胞生长情况，每3～4天全量换培养基一次，弃去未贴壁的细胞，待细胞达到80％～90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2的比例进行传代接种于胎牛血清的体积分数为5％的α-MEM培养基中，于37℃、饱和湿度95％、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养，根据细胞生长情况，每3～4天全量换培养基一次，弃去未贴壁的细胞，待细胞达到80％～90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2的比例进行传代接种于胎牛血清的体积分数为2％的α-MEM培养基中，于37℃、饱和湿度95％、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养，根据细胞生长情况，每3～4天全量换培养基一次，弃去未贴壁的细胞，待细胞达到80％～90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2的比例进行传代接种于无胎牛血清的α-MEM培养基中，于37℃、饱和湿度95％、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养，根据细胞生长情况，每3～4天全量换培养基一次，弃去未贴壁的细胞，待细胞达到80％～90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2的比例进行传代接种于无胎牛血清的α-MEM培养基中，按照上述培养条件，用无胎牛血清的α-MEM培养基进行传代培养，取第6代的人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)(即在无胎牛血清的α-MEM培养基中传代培养3次)。

3、P6代的人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的性质

3.1、细胞形态学及生长特点：

倒置相差显微镜下观察原代接种24h即可见有少量细胞贴壁，外观呈纺锤形和多角形，并可见细胞核。培养至7d可见细胞数量开始增多，细胞形态为长而扁平的梭形，为典型的成纤维细胞形态，见图1。培养至10d左右细胞汇合达到90％左右，细胞极性列，集落呈漩涡状。此时按1∶2传代，细胞传代后，贴壁速度增快，生长迅速；48h后，贴壁的细胞间可见有细胞集落形成，细胞大多呈长梭形，细胞核较大，数量也逐渐增多，3d后首次换液，5-7d细胞便铺满瓶底，融合成片，细胞排列较整齐，分布较均匀，生长较一致，杂细胞相对已较少可再次传代。

对P6代的人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)用常规的方法制备染色体涂片，进行核型检查，其结果如图3所示，由图3可以看出，核型为正常男性46条染色体，带型正常。

3.2、细胞免疫表型分析

经流式细胞仪检测，结果如图2所示，从图2可以看出P6代的hUCMSCs均一地高表达MSCs标志CD29、CD44、CD105、CD13、CD73、CD90，不表达造血系标志CD34、CD45、CD14、CD106和人白细胞抗原HLA-DR。

3.3、取P6代的人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)，采用成骨诱导培养基培养3周左右，细胞形态逐渐由长梭形变为方形、鳞片形、三角形或多角形等。高倍镜下可见细胞浆内含颗粒样物质。碱性磷酸酶染色可见浅棕色至棕黑色细小颗粒(图4A)，茜素红染色可见细胞间红色矿化基质沉积(图4B)。由此说明hUCMSCs在体外具有向成骨细胞分化的潜能。

综上所述，本发明所制备的hUCMSCs表达间充质干细胞特异性标志，核型正常，经成骨诱导后相关染色结果显示具备明显的骨细胞特征，并且利用本发明的方法制备hUCMSCs，其取材为人脐带，来源广泛，应用其制备人脐带间充质干细胞快速，从15cm左右的脐带中分离培养出hUCMSCs，在体外培养三周左右，可获得(5～10)×10⁹个细胞，并且安全，不受伦理限制等优越性，后续培养不依赖胎牛血清使得培养成本和临床使用风险大幅降低，具有很好的应用前景。

Claims

1.一种人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(b)将胰蛋白酶消化的细胞悬液传代接种于α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化，再传代接种于α-MEM培养基中悬浮培养，如此重复进行传代培养，本步骤中的传代培养的α-MEM培养基中的胎牛血清的浓度是随传代次数的增加而递减直至无胎牛血清。

2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法，其特征在于，所述的步骤(b)为：将胰蛋白酶消化的细胞悬液传代接种于胎牛血清体积分数为8％的α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化，再传代接种于胎牛血清体积分数为5％的的α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化，再传代接种于胎牛血清体积分数为2％的α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化，再传代接种于无胎牛血清的α-MEM培养基中悬浮培养，直至细胞达到80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化，然后一直用无胎牛血清的α-MEM培养基进行传代培养。

3.根据权利要求1或2所述的人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法，其特征在于，步骤(a)中的胶原酶II的浓度为1g/L。

4.根据权利要求1或2所述的人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法，其特征在于，所述的步骤(b)中的胰蛋白酶消化的细胞悬液，其密度为2×10⁵～1×10⁶个/ml。

5.根据权利要求1或2所述的人脐带间充质干细胞的分离及血清梯度切换培养方法，其特征在于，所述的步骤(b)中传代接种的接种比例为1∶2～3，悬浮培养的条件都为：37℃、饱和湿度95％、体积分数为5％的CO₂的培养箱中培养，每3～4天全量换培养基一次。