CN106978395A

CN106978395A - 一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法

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Publication number: CN106978395A
Application number: CN201710229217.3A
Authority: CN
Inventors: 刘爽; 陈睿; 张青; 佘燕玲; 沈慧娟; 黎程
Original assignee: Guangdong No 2 Peoples Hospital
Current assignee: Guangdong No 2 Peoples Hospital
Priority date: 2017-04-10
Filing date: 2017-04-10
Publication date: 2017-07-25
Anticipated expiration: 2037-04-10
Also published as: CN106978395B

Abstract

本发明公开了一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法，属于生物技术领域，采用的技术手段是，在原代分离MSC时采用分次消化结合组织培养法的方法，并综合控制消化时间、二次消化液比例，通过利用消化液组分及细胞间的相互作用，大大提高了细胞的分离数量和贴壁成活率，对细胞损伤小，更大程度的保护间充质干细胞的活性和分化潜能。进一步改良了培养基组分，加入并控制三种添加成分的含量及比例，对脐带间充质干细胞的贴壁生长、活力保持、增殖能力具有协同促进功效，有利于高效获得大量成活率高、活力好、分化能力好的间充质干细胞。

Description

一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法。

背景技术

人脐带间充质干细胞(MSC)是一群具有高度自我更新能力和分化潜能的成体干细胞，在适当的诱导条件下能向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经细胞等多种组织细胞分化，加之其具有免疫调控、分泌细胞因子、取材方便等优点，MSC的分离、培养、分化、诱导植入等研究备受关注，在细胞治疗、组织工程等领域显示出日益广阔的应用前景。

自1995年首次报道MSC应用于临床试验，目前培养的MSC已被广泛地用于临床试验研究，如脊髓损伤、软骨和骨损伤、充血性心衰、急性心梗、Ⅱ型糖尿病等，而且在肾脏、肌肉和肺等组织损伤修复研究也有初步进展。研究表明MSC能够植入肌肉退化组织并向肌细胞分化，也能够促进造血干细胞的植入，MSC还可应用于软骨组织重建等生物工程；也可能成为未来抗癌治疗中携带自杀基因或抗癌腺病毒药物的载体细胞。

然而，要达到临床应用的细胞数量级及应用效果，就对原始干细胞的数量、活力及分化能力要求很高，目前分离和培养人脐带MSC的方法大致有胶原酶II消化法、组织块贴壁法、脐静脉内膜消化法，在培养应用或后期细胞性能检测中，上述各方法操作步骤、分离效果及弊端凸显。上述方法所初始分离的MSC数量有限，致使达到细胞融合80-90％多需6-15天，而要达到临床应用的细胞数量级则必须还要经体外培养多次传代，这些过程中，原代细胞生长时间过长、且传代次数过多，最终细胞极易发生老化，活力大减，难以保证临床应用时的效果。

另一方面，培养扩增中细胞密度、培养环境的优化关系MSC培养效率和安全。目前，一般采用含10-20％胎牛血清(FBS)的DMEM或α-MEM培养基，但在培养过程中，血清含量高，一方面使得细胞易于分化为脂肪细胞从而改变干细胞特效，另一方面，较多的血清蛋白因细胞内化而残留在胞浆中，有引发患者过敏的风险。近些研究有采用无血清条件下培养扩增，但这种培养方式需在培养基加大量的生长因子以维持细胞的生长繁殖，且这样造成细胞不易贴壁，造成传代培养中细胞损失严重，大量扩增困难较大。上述种种原因，给目前的新生儿脐带血存储用户带来了风险和应用缺失，还使其收到了较大的经济损失，更导致目前诸多用户对该技术存在技术疑虑，脐带血存储难以推广。

综上可见，获得大量的活力充足、分化潜能高的干细胞进行冻存，才能保证广大脐带血存储者应用时起到良好疗效，为人类生命健康保驾护航，因此，脐带干细胞分离培养及扩增技术是本领域一直亟需改进的技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法，用以解决现有脐带间充质干细胞原代分离细胞数量少、增殖慢、扩增易老化的技术问题。

为实现上述目的，本发明方法通过调整消化酶的组成及消化时间、进一步借助细胞与组织上未脱落细胞之间的相互作用，最大程度的保护细胞、提高细胞贴壁效率和增殖效率，从而保证了细胞的活力、增殖、分化潜能，高效获得大量间充质干细胞。具体地，本发明高效分离培养脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)将离体脐带以生理盐水冲洗至无血块，浸没至PBS或生理盐水中剪至0.25-0.35cm³碎块，2500-3000rpm离心1min得脐带组织块沉淀，弃上清；

(2)向脐带组织块沉淀加入等体积的Ⅱ型胶原酶，吹打均匀，密封置于37℃摇床20-40min，吹打均匀后静置，移液枪收集含MSC的Ⅱ型胶原酶液转移至MEM培养液中，2500-3000rpm离心3min，弃上清，以完全培养基重悬细胞，置于37℃、5％CO₂培养箱，剩余脐带组织块转入步骤(3)；

(3)向剩余脐带组织块加入等体积的混合酶溶液进行二次消化20-40min，至脐带组织块剩余30-40％体积，一并转移至步骤(2)中的完全培养基中，吹打均匀，以0.5～1×10⁶cells/cm²的密度种于T75培养瓶，37℃、5％CO₂培养箱36-48h，其中混合酶溶液由0.05-0.1％Ⅱ型胶原酶溶液和0.05-0.1％Ⅰ型胶原酶溶液以体积比6-8：2-4均匀混合组成；

(4)吸除旧培养基，更换为含有10％FBS、1％双抗、3万U单位庆大霉素的改良培养基继续培养48-72h；

(5)轻轻晃动培养瓶去除组织及漂浮细胞，PBS或生理盐水再次冲洗后，加入胰蛋白酶37℃消化至70～80％细胞脱落，加入改良培养基终止消化，吸管吹打培养瓶底部，转移至离心管，2500-3000rpm离心3-5min，弃上清，重悬计数，按照3000～5000cells/cm²的密度种于培养瓶传代；

(6)每3天换液一次，培养3-5天待细胞长至70～80％融合度，重复步骤(5)，传代扩增到第5或第6代，即可得足量间充质细胞用于实验或冻存。

优选的，所述步骤(3)中，二次消化20-40min后，首先以移液枪收集含MSC的混合酶溶液并以100目筛过滤后，再与所剩余的30-40％体积脐带组织块一并转移至步骤(2)中的完全培养基中。

更优选的，所述步骤(3)中培养36-48h过程中，在培养瓶周边施加100-150GS的静磁场作用10-15h。

更优选的，混合酶溶液由0.05-0.1％Ⅱ型胶原酶溶液和0.05-0.1％Ⅰ型胶原酶溶液以体积比6-8：2-4均匀混合组成；

更优选的，所述改良培养基由MEM基础培养基添加10％FBS、1％双抗、3万U单位庆大霉素和抗坏血酸、胆固醇、木糖醇组成。

优选的，所述抗坏血酸、胆固醇、木糖醇的浓度分别为10-20μg/mL、15-40μg/mL、60-100μg/mL。

更优选的，所述抗坏血酸、胆固醇、木糖醇的含量比例为1：1.5-2：4-5。

本发明方法具有如下优点：(1)本发明分离MSC时才有两步消化法并控制消化时间段，对细胞损伤小，更大程度的保护间充质干细胞的活性和分化潜能，有利于其高成活率，二步消化时采用特定比例的两种酶，无需离心，有效提高了细胞贴壁成活率；(2)进一步改进的技术方案中，二步消化细胞过筛破损少量细胞，在提高单细胞数量的同时，获得了有利于细胞信号传导的胞浆，大大提高了残余组织上细胞的爬出，提高了细胞的原代分离量和贴壁效率；加入静磁场，改善细胞周期，有利于细胞的生长和增殖能力，利于高效快速获得大量干细胞；(3)改良培养基中加入并控制三种添加成分的含量及比例，对提高脐带间充质干细胞的贴壁生长、活力保持、增殖能力具有协同促进功效，有利于高效获得大量成活率高、活力好、分化能力好的间充质干细胞。

附图说明

图1是实施例3成骨细胞分化测试中A1组的代表性示例照片；

图2是实施例3成骨细胞分化测试中B2组的代表性示例照片；

图3是实施例4成脂肪细胞分化测试中A2组的代表性示例照片；

图4是实施例4成脂肪细胞分化测试中B2组的代表性示例照片；

图5是实施例4成脂肪细胞分化测试中C2组的代表性示例照片；

图6是实施例4成脂肪细胞分化测试中D2组的代表性示例照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例具体说明本发明所提供的高效分离培养脐带间充质干细胞的方法，同时设置平行实验与目前常规分离比较所获得干细胞的数量，下述方法及试剂，如无特殊说明，均为常规操作和配制方法。

(一)实验前，对实验环境进行如下无菌处理：

1、用84消毒液按说明书配制水溶液擦拭细胞房(包括缓冲间、储存间)各暴露面及地面，用0.5％过氧乙酸重复擦拭一遍；用75％酒精浸透纱布，擦拭操作台、培养箱内外壁、及移液枪，水浴箱洗干净用75％酒精擦拭过后，换上已灭菌的去离子水；

2、紫外照射或臭氧熏30min。

(二)试剂的配制及器械预处理

1、剪刀、镊子、取脐带用的瓶子灭菌：高压蒸汽灭菌箱灭菌20～30min，烘箱中烘干；

2、Ⅱ型胶原酶溶液(浓度0.05-0.1％为质量体积浓度，0.05％即0.05g/100mL)、Ⅰ型胶原酶溶液、胰蛋白酶溶液用前先用0.45μm滤膜抽滤。

(三)分离培养脐带间充质干细胞

1、将新鲜采集的离体脐带以PBS或生理盐水冲洗至无血块，置于装有生理盐水的10cm培养皿中，剪刀剪碎至0.25-0.35cm³碎块，将碎块移至50ml离心管，加生理盐水悬匀，均匀分为4份，分别装入离心管，并标号为A、B、C和D，4个离心管同时装入离心机，以2600rpm离心1min，分别得A、B、C和D组脐带组织块沉淀，弃上清，；

2、脐带组织块沉淀的处理

2.1 A、B、C组脐带组织块沉淀的消化处理

向A、B和C组脐带组织块沉淀中分别加入与脐带组织等体积的Ⅱ型胶原酶溶液，混匀，以封口膜将盖子处密封好，置于37℃摇床，A组脐带组织块一直以Ⅱ型胶原酶溶液消化，等待B、C组二次消化后同一之间转入培养箱进行培养；B、C组摇30min后，分别以吸管吹打均匀，然后静置5min，或低速离心1min，再以移液枪收集含有MSC的Ⅱ型胶原酶液，并转移至MEM培养液中，2600rpm离心3min，去除上清后，以完全培养基分别重悬细胞，并装入T25细胞培养瓶中，培养瓶置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，此时，B、C组离心管中还有剩余脐带组织块；

2.2 D组脐带组织块沉淀以组织块贴壁法分离MSC

D组脐带组织块放置于培养瓶中，向培养瓶内加入完全培养基，放置在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中，先倒置4h，再正置培养44h，更换培养基时去除组织块；

3、B、C组剩余脐带组织块的二次消化

向B、C组离心管中分别加入与脐带组织块体积相当的混合酶溶液、Ⅱ型胶原酶溶液，其中混合酶溶液由Ⅱ型胶原酶溶液和Ⅰ型胶原酶溶液以体积比7:3均匀混合组成，进行二次消化，至脐带组织块最终量仅为剩余脐带组织块体积的30-40％时，停止二次消化，将含MSC的消化液加脐带组织块最终量一并转移至2.1中的对应组的完全培养基中，吸管吹打均匀，37℃、5％CO₂培养箱48h；

4、原代分离MSC初次换液

分离48h后，吸除旧培养基，更换为含有10％FBS、1％双抗、3万U单位庆大霉素的改良培养基，镜检发现B组中残留的脐带组织块周边有大量细胞爬出，并继续培养48h；

5、将上述A、B、C和D组培养瓶的MSC吸除旧培养基，以PBS轻轻晃动洗涤，去悬浮细胞，显微镜下观察各组的细胞密度，发现A、C和D组细胞总体数量较B组偏少，原因分析为A组胶原酶消化时间偏长，细胞损伤较大，导致贴壁少，换液损失等；D组组织块爬出细胞效率较低，在同样的时间上细胞爬出较少导致所得细胞少；B组细胞呈形态均一的长梭形、贴壁效果好，与二次消化时含有Ⅰ型胶原酶密切相关，适量量的Ⅰ型胶原酶有利于细胞黏附，同时不影响Ⅱ型胶原酶对细胞的消化能力，提高了分离细胞在短时间贴壁的细胞数量，保证了细胞密度和成活率，有利于细胞增殖，形状及细胞综合分析优于C组；进一步以等体积的0.1％胰蛋白酶-EDTA(质量体积比，0.1g/100mL)消化液37℃消化至70～80％细胞脱落，加入等体积改良培养基终止消化，并计数，结果显示A、B、C和D组细胞密度分别为7×10⁴个/mL、8×10⁵个/mL、2×10⁵个/mL和3×10⁴个/mL。

实施例2

本实施例具体说明本发明所分离培养的MSC的细胞增殖能力。

以实施例1中所得细胞，借助离心、重悬步骤调整细胞密度，并至5000cells/孔的密度种于48孔细胞培养板，A、B、C和D组，各组接种10孔，其中5孔以含10％FBS、1％双抗的完全培养基培养(标记为A_完全、B_完全、C_完全和D_完全)，另5孔以改良培养基培养(标记为A_改良、B_改良、C_改良和D_改良)，所述改良培养基由MEM基础培养基添加10％FBS、1％双抗、3万U单位庆大霉素和抗坏血酸、胆固醇、木糖醇组成，所述抗坏血酸、胆固醇、木糖醇的浓度分别为15μg/mL、30μg/mL、70μg/mL。以后每2天换液一次，在接种72h时后以MTT法测定细胞增殖比例，测定并计算平均吸光度，结果如下：A_改良/A_完全＝1.18，B_改良/B_完全＝1.27，C_改良/C_完全＝1.21，D_改良/D_完全＝1.20，B_改良/A_改良＝1.36，B_改良/C_改良＝1.13，B_改良/D_改良＝1.23，可见，本方法分离和培养的MSC配合本培养方法中所用的培养基，更利于细胞活力的保持和增强，细胞增殖能力更好。

上述培养方法中，改良培养基中添加有抗坏血酸、胆固醇、木糖醇，其中，抗坏血酸参与细胞的诸多氧化还原反应，促氧化反应，提高细胞磷酸酶活性，还有利于细胞生长增殖过程中骨架建立，对细胞的活力、增殖具有有利作用；胆固醇有利于增强MSC细胞在生长和增殖过程中细胞膜功能和结构；木糖醇可直接透过细胞膜，为细胞生长、增殖等生理过程提供能量，三者协同大大促进了细胞的生长和增殖，并保证了细胞的活力和结构，保持了干细胞功能，进一步通过多种浓度的探索，结论是需精确控制抗坏血酸、胆固醇、木糖醇的浓度及比例，本实施例中控制抗坏血酸、胆固醇、木糖醇的浓度分别为15μg/mL、30μg/mL和70μg/mL，其培养的细胞形状形态好，增殖能力强，活力旺盛。

实施例3

本实施例具体说明本发明所分离培养的MSC向成骨细胞分化的能力。以实施例1中各组所得细胞，分别以普通的完全培养基(后缀标1)和本申请中的改良培养基(后缀标2)培养传代，以P3代细胞考察各组MSC向成骨细胞分化的能力。

借助离心、重悬步骤调整细胞密度，以10000个/孔接种于48孔细胞培养板(美国康宁公司生产)，48孔板的分布如下：8列分别为A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2，6行分布为第1、2行为空白对照组(完全培养基或改良培养基500μL)，第3-6行为添加成骨诱导剂的培养基(添加50μL成骨诱导剂加450μL完全培养基或改良培养基，成骨诱导剂为含10^-8mol/L地塞米松，10.0mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50μg/mL抗坏血酸的对应培养基)诱导18天，期间每3天换液，在显微镜下观察，并以茜素红染色测定矿化结节，示例性镜检照片参见图1和图2，可见B2组相比于A1组中矿化结节更多、密集、大，定量计算矿化结节率，OD_诱导/OD_空白×100％，结果如下表所示：

表1各组MSC向成骨细胞分化的矿化结节率(平均值)

	A1	A2	B1	B2	C1	C2	D1	D2
									矿化结节率(％)	114	120	122	128	119	124	120	122

上述结果看见，总体比较以B2组细胞成骨分化性能最强，即以本发明的方法佩仪添加成骨诱导剂的改良培养基诱导成骨分化时，能最大程度的分化；比较各组中后缀标1的A1、B1、C1和D1，即以添加成骨诱导剂的普通完全培养基培养时，仍是本发明分离的MSC其成骨分化性能以微弱优势领域于其他方法分离的MSC；比较A2、B2、C2和D2可见在本发明分离方法有优势的基础上，配合本发明的改良培养基，更是保证了细胞的活力和分化能力，本发明的分离方法中通过分次消化、缩短消化时间、改良二次消化消化液组分并借助分离的单细胞于组织相互作用进一步增加分离细胞量，在大大保证了细胞分离及贴壁能力的同时，对细胞特性的保持程度最好。

实施例4

本实施例具体说明本发明所分离培养的MSC向脂肪细胞分化的能力。以实施例1中各组所得细胞，分别以普通的完全培养基(后缀标1)和本申请中的改良培养基(后缀标2)培养传代，以P3代细胞考察各组MSC向脂肪细胞分化的能力。

借助离心、重悬步骤调整细胞密度，以10000个/孔接种于48孔细胞培养板(美国康宁公司生产)，48孔板的分布如下：8列分别为A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2，6行分布为第1、2行为空白对照组(完全培养基或改良培养基500μL)，第3-6行为添加成脂诱导剂的培养基(添加50μL成脂诱导剂加450μL完全培养基或改良培养基，成脂诱导剂为含0.1μmol地塞米松和10μg/ml胰岛素的对应培养基)诱导14天，期间每3天换液一次，14天后，脂肪细胞有不同程度的分化出，在显微镜下观察，并以油红O染色测定并定量计算成脂肪分化率，OD_诱导/OD_空白×100％，结果如下表所示：

表1各组MSC向脂肪细胞分化的矿化结节率(平均值)

	A1	A2	B1	B2	C1	C2	D1	D2
									脂肪分化率(％)	118	123	130	136	124	128	122	128

综上可以看出，以本发明提供的方法相比于其他分离方法分离培养的MSC，首先，分离数量最多，贴壁效果最好，保证了原代初始细胞量；第二，所分离的细胞活力好、增殖能力强，不易老化，配合本发明所提供的培养基有效保持了干细胞的分化特性，更有望成为理想的人脐带间充质干细胞分离、扩增培养的方法。

实施例5

为进一步提高原代分离后贴壁效果，从而最大限度的保留原代细胞，本实施例在实施例1的基础上进一步改进如下：参照对B组的处理，所述步骤3中，二次消化至脐带组织块最终量仅为剩余脐带组织块体积的30-40％时，停止二次消化，首先以移液枪收集含MSC的混合酶溶液并以100目筛过滤后，再与所剩余的30-40％体积的脐带组织块一并转移至步骤2.1中的对应组的完全培养基中，吸管吹打均匀，37℃、5％CO₂培养箱48h，48h后镜检，本实施例的细胞培养瓶中与实施例1中B组培养瓶比较，贴壁MSC数量有10％-15％的提高，其原理是利用筛网过滤时对二次消化所得细胞中微少量细胞的破坏，在细胞培养基中包括了胞浆内各种因子等，促进了组织上残留细胞的爬出和贴壁，从而大大提高了最终原代细胞的获得数量。

实施例6

为进一步提高原代分离后贴壁效果及改善细胞周期，从而最大限度的保留原代细胞并改善细胞的，本实施例在实施例1的基础上进一步改进如下：参照对B组的处理，所述步骤3中培养48h的过程中，在培养瓶周边施加100GS的静磁场作用10-15h，增加该强度的静磁场利于培养基中离子及细胞的分布，还有利于培养基中营养物质及因子的相互作用和信号传导，48h后镜检发现，本实施例的细胞培养瓶中与实施例1中B组培养瓶比较，贴壁MSC数量有10％-15％的提高，进一步的，采用流式细胞仪检测细胞周期发现，本实施例中的MSC与实施例1中B组的比较，处于S期和G0期的细胞数量增加10％-15％，可以预期，这些处于S期和G0期的细胞会迅速生长，在经过传代后，其增殖速率更快，可见，采用静磁场处理后有效改善细胞的周期，对细胞的生长增殖及分户潜能的激发更有利，同时冻存储运复苏后其细胞成活率更高。

综上，本发明通过综合优化消化时间、消化液配比，尤其是进一步改进的技术方案中，采用部分过筛和/或加静磁场的措施，大大提高了原代MSC的分离数量，更提高了贴壁数量，保证了成活率，另一方面，配合本发明的改良培养基并选择出最优接种密度，保证了细胞的活力和密度依赖性的增殖，使细胞快速生长，高效达到临床应用级，对脐带干细胞的分离培养和储存具有重要意义。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将离体脐带以生理盐水冲洗至无血块，浸没至PBS或生理盐水中，剪至0.25-0.35cm³碎块，2500-3000rpm离心1min得脐带组织块沉淀，弃上清；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，二次消化20-40min后，首先以移液枪收集含MSC的混合酶溶液并以100目筛过滤后，再与所剩余的30-40％体积脐带组织块一并转移至步骤(2)中的完全培养基中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中培养36-48h过程中，在培养瓶周边施加100-150GS的静磁场作用10-15h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中混合酶溶液由0.05-0.1％Ⅱ型胶原酶溶液和0.05-0.1％Ⅰ型胶原酶溶液以体积比7：3均匀混合组成。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改良培养基由MEM基础培养基添加10％FBS、1％双抗、3万U单位庆大霉素和抗坏血酸、胆固醇、木糖醇组成。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗坏血酸、胆固醇、木糖醇的浓度分别为10-20μg/mL、15-40μg/mL、60-100μg/mL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗坏血酸、胆固醇、木糖醇的含量比例为1：1.5-2：4-5。