CN106047702A - 一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，包括试剂盒本体、若干试剂瓶和若干冰袋，若干所述试剂瓶内分别盛装有组织保存液、基础培养基、培养基添加剂、生长因子Ⅰ、生长因子Ⅱ、组织分解液、细胞消化液、洗涤液和冻存液。本发明提供的试剂盒可以从脂肪组织中分离脂肪干细胞，并培养和保存脂肪干细胞，解决了脂肪干细胞分离数量少且纯度低、培养存活率低、培养效率不高、冻存复活率不理想等问题，使脂肪干细胞在理想营养平衡状态下进行多代扩增而不发生分化，为利用脂肪干细胞进行进一步实验研究提供了丰富的来源，非常适用于培养脂肪干细胞。

Description

一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒及培养方法
技术领域
本发明属于细胞技术领域，尤其涉及一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒及培养方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，可以不断进行自我更新，并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。近年来，干细胞技术被广泛用于多种疾病的临床试验及治疗中，并且表现出良好的应用前景，逐渐成为近年来新的医学研究热点之一。
脂肪组织中存在一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪干细胞，其具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化，可以分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织或器官的细胞，医学价值很高。脂肪干细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，具有取材容易、不限年龄及时间、少量组织即可获取大量细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，而且脂肪来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，具有广阔的临床应用前景。
为满足医学研究的需求，大量培养脂肪干细胞成为重要的研究课题，而试验人员选择的用于分离、培养、保存脂肪干细胞的试剂和方法不够妥当，往往造成了培养的脂肪干细胞的数量和质量无法达到试验的要求，浪费了人力和其他资源，因此研究一种专门用于稳定的大量扩增培养脂肪干细胞的试剂盒具有重要意义。现有技术中也公开了一些用于培养脂肪干细胞的试剂盒，例如CN 104928238A公布了一种用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，包括脂肪保存液、脂肪洗涤液、脂肪分解液、细胞洗涤液、细胞培养液、细胞消化液、细胞冻存液，但此试剂盒培养脂肪干细胞的效果不够理想，存在试剂安全性、稳定性不高，细胞存活率和增殖率低等问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，包括试剂盒本体、若干试剂瓶和若干冰袋，所述试剂盒本体包括顶端开口的盒体、与所述盒体铰接的盒盖和设置在盒体内的插托，所述插托与所述盒体的底板平行，其上设有若干个用于放置所述试剂瓶的插孔，所述插托下方设有与所述盒体的底板平行的镂空隔板，所述镂空隔板与其下方的所述盒体形成第一空腔，所述第一空腔的侧壁上设有第一开口和与所述第一开口匹配的第一盖板，所述盒盖由盒盖上板、与所述盒盖上板平行的盒盖下板、连接所述盒盖上板和所述盒盖下板的盒盖侧壁组成，所述盒盖下板为镂空结构，所述盒盖上板、所述盒盖下板和所述盒盖侧壁形成第二空腔，所述盒盖侧壁上设有第二开口和与所述第二开口匹配的第二盖板，若干所述冰袋分别放置在第一空腔和第二空腔内,若干所述试剂瓶内分别盛装有组织保存液、基础培养基、培养基添加剂、生长因子Ⅰ、生长因子Ⅱ、组织分解液、细胞消化液、洗涤液和冻存液。
进一步的，所述盒体内设有试剂瓶固定装置，所述试剂瓶固定装置包括固定帽、对称设于固定帽两侧的第一固定带和所述第二固定带，所述第一固定带的两端分别与所述固定帽的边沿和所述插托固定连接，所述第二固定带的一端与所述固定帽的边沿固定连接，另一端通过连接结构与所述插托连接。
进一步的，所述试剂盒上还设有温度监控装置，所述温度监控装置包括设于试剂盒内的测温仪、与所述测温仪连接的温度控制器以及与所述温度控制器连接的报警装置。
进一步的，所述试剂盒外表面设有防撞层。
进一步的，所述试剂盒外表面与防撞层之间设有保温层。
进一步的，所述盒体与盒盖的连接处设有固定装置，防止运输移动过程中盒盖打开导致试剂瓶滑落摔碎。
进一步的，所述基础培养基为α-MEM培养基溶液，所述α-MEM培养基溶液由α-MEM干粉培养基用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述α-MEM干粉培养基30-50g。
进一步的，所述生长因子Ⅰ为bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)溶液，所述bFGF溶液由bFGF冻干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述bFGF冻干粉8-12μg。
进一步的，所述生长因子Ⅱ为EGF(表皮细胞生长因子)溶液，所述EGF溶液由EGF冻干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述EGF冻干粉8-12μg。
进一步的，所述组织分解液为含1％胶原酶I型的PBS缓冲液或基础培养基。
进一步的，所述细胞消化液为含0.25％胰酶和0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)的PBS缓冲液。
进一步的，所述洗涤液为PBS缓冲液。
上述PBS缓冲液均为含0.05％吐温-20，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
进一步的，所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基30-50g、所述青霉素1×105-2×105U、所属链霉素0.1-0.2g、所述羟甲基纤维素钠8-12g、所述次磷酸钠2-5g。上述组织保存液可以有效保持脂肪干细胞活性、提高脂肪干细胞存活率。
进一步的，所述组织保存液中还含有琥珀酸钠和乳糖醇，每L所述注射用水分别溶解所述琥珀酸钠3-8g、所述乳糖醇0.5-1.5g。在组织保存液中添加琥珀酸钠和乳糖醇可以有效提高组织保存液的稳定性，避免组织保存液产生沉淀、分层和变色等问题，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，组织保存液的稳定性会减弱。
进一步的，所述组织保存液中还含有水杨酸钠和淀粉甘醇酸钠，每L所述注射用水分别溶解所述水杨酸钠2-5g、所述淀粉甘醇酸钠1-3g。在组织保存液中添加水杨酸钠和淀粉甘醇酸钠可以有效提高组织保存液防止细菌、真菌和病毒感染的能力，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，都会导致组织保存液抗细菌、真菌和病毒感染的能力减弱。
进一步的，所述培养基添加剂包括如下重量份的各成分：
胎牛血清蛋白15-20 乙基甲基纤维素8-12
木糖醇5-8 甲酸钠1-3。
采用上述培养基添加剂与基础培养基和生长因子混合均匀配置的全培养基培养脂肪干细胞的增殖效率高、增殖效果好。
进一步的，所述培养基添加剂还包括如下重量份的各成分：
肉桂醇3-8 磷酸酯1-3 抗坏血酸钠1-3。
在培养基添加剂中增加肉桂醇、磷酸酯和抗坏血酸钠可以有效提高配置的全培养基防止细菌、真菌和病毒感染的能力。
进一步的，所述培养基添加剂还包括如下重量份的各成分：
甘氨酸钠3-8 D-木糖2-5。
在培养基添加剂中增加甘氨酸钠和D-木糖可以有效提高配置的全培养基的稳定性，避免全培养基出现沉淀、分层和变色等问题。
进一步的，所述冻存液主要是将α-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基30-50g、所述人血白蛋白40-60g、所述二甲基亚砜3-8g、所述甘露聚糖2-5g、所述麦芽糊精1-3g、所述生物素0.5-1.5g。
上述冻存液的冻存性能较好，脂肪干细胞复苏后存活率较高，而且更利于脂肪干细胞冻存前后细胞形态的维持和稳定。
进一步的，所述冻存液中还含有山梨酸钾和烟酰胺，每L所述注射用水分别溶解所述山梨酸钾1-3g、所述烟酰胺0.5-1.5g。
在冻存液中加入山梨酸钾和烟酰胺可以降低冻存过程中对细胞造成的伤害，进一步提高冻存液的冻存性能。
本发明还提供一种培养脂肪干细胞的方法，包括如下步骤：
(1)无菌收集脂肪组织，放入盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶中并密封，将所述试剂盒运输至实验室；
(2)将所述基础培养基、所述培养基添加剂、所述生长因子Ⅰ和所述生长因子Ⅱ按照重量份数比为1：0.05：1：1的比例混合均匀，配置成全培养基，配好的所述全培养基放置在4℃的冰箱中保存；
(3)从盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶中取出20ml含有脂肪组织的组织保存液，倒入所述洗涤液，洗去血污，获得脂肪组织，将所述脂肪组织用眼科剪剪成1-2mm3大小的脂肪碎块；
(4)将步骤(3)获得的所述脂肪碎块加入所述组织分解液中，水浴震荡，每3min震荡一次，持续15-18min，或者放入培养箱中分解10-15min，再加入步骤(2)配置的所述全培养基终止分解；
(5)将步骤(4)所得反复吹打，混匀细胞浆，先用100目的细胞筛过滤掉未分解的脂肪组织，再用300目的细胞筛过滤掉成熟脂肪组织，收集悬液；
(6)将步骤(5)所得悬液离心，弃掉上层清液，得脂肪干细胞单细胞悬液，记为P0代脂肪干细胞，用步骤(2)配置的所述全培养基将P0代脂肪干细胞重悬，再按照1-2×106个/ml的密度接种在培养瓶中，将培养瓶放入37℃、5％CO2的CO2培养箱中；
(7)将步骤(6)所得每三天更换全培养基一次，通过显微镜观察到脂肪干细胞生长面积达到80％左右时，先用所述洗涤液清洗2次，然后加入所述细胞消化液，适当震荡摇晃培养瓶，使所述细胞消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化30-60s，最后加入步骤(2)配置的所述全培养基终止消化，所得脂肪干细胞记为P1代脂肪干细胞，取出一部分P1代脂肪干细胞放入所述冻存液中进行冻存，冻存密度为3-5×106个/ml冻存液，剩余P1代脂肪干细胞按照1：3比例进行传代；
(8)重复步骤(7)，将脂肪干细胞进行多次的培养和传代。
本发明提供的试剂盒可以从脂肪组织中分离脂肪干细胞，并培养和保存脂肪干细胞，解决了脂肪干细胞分离数量少且纯度低、培养存活率低、培养效率不高、冻存复活率不理想等问题，使脂肪干细胞在理想营养平衡状态下进行多代扩增而不发生分化，为利用脂肪干细胞进行进一步实验研究提供了丰富的来源，非常适用于培养脂肪干细胞。
附图说明
图1为本发明实施例1的用于培养脂肪干细胞的试剂盒的结构示意图；
图2为本发明实施例2的用于培养脂肪干细胞的试剂盒的结构示意图；
图3为图2中A的放大示意图；
其中：1试剂瓶；2盒体；3盒盖；4插托；5第一开口；6第一盖板；7盒盖下板；8盒盖侧壁；9第二开口；10第二盖板；11固定帽；12第一固定带；13第二固定带；14连接结构。
具体实施方式
实施例1
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，如图1所示，包括试剂盒本体、若干试剂瓶1和若干冰袋，所述试剂盒本体包括顶端开口的盒体2、与所述盒体2铰接的盒盖3和设置在盒体2内的插托4，所述插托4与所述盒体2的底板平行，其上设有若干个用于放置所述试剂瓶1的插孔，所述插托4下方设有与所述盒体2的底板平行的镂空隔板，所述镂空隔板与其下方的所述盒体2形成第一空腔，所述第一空腔的侧壁上设有第一开口5和与所述第一开口5匹配的第一盖板6，所述盒盖3由盒盖上板、与所述盒盖上板平行的盒盖下板7、连接所述盒盖上板和所述盒盖下板7的盒盖侧壁8组成，所述盒盖下板7为镂空结构，所述盒盖上板、所述盒盖下板7和所述盒盖侧壁8形成第二空腔，所述盒盖侧壁8上设有第二开口9和与所述第二开口9匹配的第二盖板10，若干所述冰袋分别放置在第一空腔和第二空腔内,若干所述试剂瓶1内分别盛装有组织保存液、基础培养基、培养基添加剂、生长因子Ⅰ、生长因子Ⅱ、组织分解液、细胞消化液、洗涤液和冻存液。
实施例2
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，如图2所示，与实施例1不同的是：所述盒体2内设有试剂瓶固定装置，所述试剂瓶固定装置包括固定帽11、对称设于固定帽两侧的第一固定带12和所述第二固定带13，所述第一固定带12的两端分别与所述固定帽11的边沿和所述插托4固定连接，所述第二固定带13的一端与所述固定帽11的边沿固定连接，另一端通过连接结构14与所述插托4连接，所述连接结构包括设在所述第二固定带13上的母扣和设在所述插托4上的与所述母扣匹配的公扣。
实施例3
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基30g、所述青霉素1×105U、所属链霉素0.1g、所述羟甲基纤维素钠8g、所述次磷酸钠2g。
实施例4
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基50g、所述青霉素2×105U、所属链霉素0.2g、所述羟甲基纤维素钠12g、所述次磷酸钠5g。
实施例5
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5×105U、所属链霉素0.15g、所述羟甲基纤维素钠10g、所述次磷酸钠3g。
实施例6
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠、琥珀酸钠、乳糖醇用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基30g、所述青霉素1×105U、所属链霉素0.1g、所述羟甲基纤维素钠8g、所述次磷酸钠2g、所述琥珀酸钠3g、所述乳糖醇0.5g。
实施例7
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠、琥珀酸钠、乳糖醇用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基50g、所述青霉素2×105U、所属链霉素0.2g、所述羟甲基纤维素钠12g、所述次磷酸钠5g、所述琥珀酸钠8g、所述乳糖醇1.5g。
实施例8
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠、琥珀酸钠、乳糖醇用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5×105U、所属链霉素0.15g、所述羟甲基纤维素钠10g、所述次磷酸钠3g、所述琥珀酸钠5g、所述乳糖醇1g。
实施例9
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠、琥珀酸钠、乳糖醇、水杨酸钠、淀粉甘醇酸钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基30g、所述青霉素1×105U、所属链霉素0.1g、所述羟甲基纤维素钠8g、所述次磷酸钠2g、所述琥珀酸钠3g、所述乳糖醇0.5g、所述水杨酸钠2g、所述淀粉甘醇酸钠1g。
实施例10
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠、水杨酸钠、淀粉甘醇酸钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基50g、所述青霉素2×105U、所属链霉素0.2g、所述羟甲基纤维素钠12g、所述次磷酸钠5g、所述水杨酸钠5g、所述淀粉甘醇酸钠3g。
实施例11
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠、水杨酸钠、淀粉甘醇酸钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5×105U、所属链霉素0.15g、所述羟甲基纤维素钠10g、所述次磷酸钠3g、所述水杨酸钠3g、所述淀粉甘醇酸钠2g。
实施例12
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
胎牛血清蛋白15g 乙基甲基纤维素8g
木糖醇5g 甲酸钠1g。
实施例13
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
胎牛血清蛋白20g 乙基甲基纤维素12g
木糖醇8g 甲酸钠3g。
实施例14
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素10g
木糖醇6g 甲酸钠2g。
实施例15
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
实施例16
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
实施例17
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
实施例18
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
实施例19
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
胎牛血清蛋白20g 乙基甲基纤维素12g
木糖醇8g 甲酸钠3g
甘氨酸钠8g D-木糖5g。
实施例20
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素10g
木糖醇6g 甲酸钠2g
甘氨酸钠5g D-木糖3g。
实施例21
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述冻存液主要是将α-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基30g、所述人血白蛋白40g、所述二甲基亚砜3g、所述甘露聚糖2g、所述麦芽糊精1g、所述生物素0.5g。
实施例22
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述冻存液主要是将α-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基50g、所述人血白蛋白60g、所述二甲基亚砜8g、所述甘露聚糖5g、所述麦芽糊精3g、所述生物素1.5g。
实施例23
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述冻存液主要是将α-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述人血白蛋白50g、所述二甲基亚砜5g、所述甘露聚糖3g、所述麦芽糊精2g、所述生物素1g。
实施例24
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述冻存液主要是将α-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素、山梨酸钾、烟酰胺用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基30g、所述人血白蛋白40g、所述二甲基亚砜3g、所述甘露聚糖2g、所述麦芽糊精1g、所述生物素0.5g、所述山梨酸钾1g、所述烟酰胺0.5g。
实施例25
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述冻存液主要是将α-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素、山梨酸钾、烟酰胺用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基50g、所述人血白蛋白60g、所述二甲基亚砜8g、所述甘露聚糖5g、所述麦芽糊精3g、所述生物素1.5g、所述山梨酸钾3g、所述烟酰胺1.5g。
实施例26
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述冻存液主要是将α-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素、山梨酸钾、烟酰胺用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述人血白蛋白50g、所述二甲基亚砜5g、所述甘露聚糖3g、所述麦芽糊精2g、所述生物素1g、所述山梨酸钾2g、所述烟酰胺1g。
实施例27
一种培养脂肪干细胞的方法，包括如下步骤：
(1)无菌收集脂肪组织，放入盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶1中并密封，将所述试剂盒运输至实验室；
(2)将所述基础培养基、所述培养基添加剂、所述生长因子Ⅰ和所述生长因子Ⅱ按照重量份数比为1：0.05：1：1的比例混合均匀，配置成全培养基，所述基础培养基为α-MEM培养基溶液，所述生长因子Ⅰ为bFGF溶液，所述生长因子Ⅱ为EGF溶液，配好的所述全培养基放置在4℃的冰箱中保存；
(3)从盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶1中取出20ml含有脂肪组织的组织保存液，倒入所述洗涤液，洗去血污，获得脂肪组织，将所述脂肪组织用眼科剪剪成1mm3大小的脂肪碎块；
(4)将步骤(3)获得的所述脂肪碎块加入所述组织分解液中，水浴震荡，每3min震荡一次，持续15min，或者放入培养箱中分解10min，再加入步骤(2)配置的所述全培养基终止分解；
(5)将步骤(4)所得反复吹打，混匀细胞浆，先用100目的细胞筛过滤掉未分解的脂肪组织，再用300目的细胞筛过滤掉成熟脂肪组织，收集悬液；
(6)将步骤(5)所得悬液离心，弃掉上层清液，得脂肪干细胞单细胞悬液，记为P0代脂肪干细胞，用步骤(2)配置的所述全培养基将P0代脂肪干细胞重悬，再按照1×106个/ml的密度接种在培养瓶中，将培养瓶放入37℃、5％CO2的CO2培养箱中；
(7)将步骤(6)所得每三天更换全培养基一次，通过显微镜观察到脂肪干细胞生长面积达到80％左右时，先用所述洗涤液清洗2次，然后加入所述细胞消化液，适当震荡摇晃培养瓶，使所述细胞消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化30s，最后加入步骤(2)配置的所述全培养基终止消化，所得脂肪干细胞记为P1代脂肪干细胞，取出一部分P1代脂肪干细胞放入所述冻存液中进行冻存，冻存密度为3×106个/ml冻存液，剩余P1代脂肪干细胞按照1：3比例进行传代；
(8)重复步骤(7)，将脂肪干细胞进行多次的培养和传代。
实施例28
一种培养脂肪干细胞的方法，包括如下步骤：
(1)无菌收集脂肪组织，放入盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶1中并密封，将所述试剂盒运输至实验室；
(2)将所述基础培养基、所述培养基添加剂、所述生长因子Ⅰ和所述生长因子Ⅱ按照重量份数比为1：0.05：1：1的比例混合均匀，配置成全培养基，所述基础培养基为α-MEM培养基溶液，所述生长因子Ⅰ为bFGF溶液，所述生长因子Ⅱ为EGF溶液，配好的所述全培养基放置在4℃的冰箱中保存；
(3)从盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶1中取出20ml含有脂肪组织的组织保存液，倒入所述洗涤液，洗去血污，获得脂肪组织，将所述脂肪组织用眼科剪剪成2mm3大小的脂肪碎块；
(4)将步骤(3)获得的所述脂肪碎块加入所述组织分解液中，水浴震荡，每3min震荡一次，持续18min，或者放入培养箱中分解15min，再加入步骤(2)配置的所述全培养基终止分解；
(5)将步骤(4)所得反复吹打，混匀细胞浆，先用100目的细胞筛过滤掉未分解的脂肪组织，再用300目的细胞筛过滤掉成熟脂肪组织，收集悬液；
(6)将步骤(5)所得悬液离心，弃掉上层清液，得脂肪干细胞单细胞悬液，记为P0代脂肪干细胞，用步骤(2)配置的所述全培养基将P0代脂肪干细胞重悬，再按照2×106个/ml的密度接种在培养瓶中，将培养瓶放入37℃、5％CO2的CO2培养箱中；
(7)将步骤(6)所得每三天更换全培养基一次，通过显微镜观察到脂肪干细胞生长面积达到80％左右时，先用所述洗涤液清洗2次，然后加入所述细胞消化液，适当震荡摇晃培养瓶，使所述细胞消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化60s，最后加入步骤(2)配置的所述全培养基终止消化，所得脂肪干细胞记为P1代脂肪干细胞，取出一部分P1代脂肪干细胞放入所述冻存液中进行冻存，冻存密度为5×106个/ml冻存液，剩余P1代脂肪干细胞按照1：3比例进行传代；
(8)重复步骤(7)，将脂肪干细胞进行多次的培养和传代。
实施例29
一种培养脂肪干细胞的方法，包括如下步骤：
(1)无菌收集脂肪组织，放入盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶1中并密封，将所述试剂盒运输至实验室；
(2)将所述基础培养基、所述培养基添加剂、所述生长因子Ⅰ和所述生长因子Ⅱ按照重量份数比为1：0.05：1：1的比例混合均匀，配置成全培养基，所述基础培养基为α-MEM培养基溶液，所述生长因子Ⅰ为bFGF溶液，所述生长因子Ⅱ为EGF溶液，配好的所述全培养基放置在4℃的冰箱中保存；
(3)从盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶1中取出20ml含有脂肪组织的组织保存液，倒入所述洗涤液，洗去血污，获得脂肪组织，将所述脂肪组织用眼科剪剪成1.5mm3大小的脂肪碎块；
(4)将步骤(3)获得的所述脂肪碎块加入所述组织分解液中，水浴震荡，每3min震荡一次，持续16min，或者放入培养箱中分解12min，再加入步骤(2)配置的所述全培养基终止分解；
(5)将步骤(4)所得反复吹打，混匀细胞浆，先用100目的细胞筛过滤掉未分解的脂肪组织，再用300目的细胞筛过滤掉成熟脂肪组织，收集悬液；
(6)将步骤(5)所得悬液离心，弃掉上层清液，得脂肪干细胞单细胞悬液，记为P0代脂肪干细胞，用步骤(2)配置的所述全培养基将P0代脂肪干细胞重悬，再按照1.5×106个/ml的密度接种在培养瓶中，将培养瓶放入37℃、5％CO2的CO2培养箱中；
(7)将步骤(6)所得每三天更换全培养基一次，通过显微镜观察到脂肪干细胞生长面积达到80％左右时，先用所述洗涤液清洗2次，然后加入所述细胞消化液，适当震荡摇晃培养瓶，使所述细胞消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化40s，最后加入步骤(2)配置的所述全培养基终止消化，所得脂肪干细胞记为P1代脂肪干细胞，取出一部分P1代脂肪干细胞放入所述冻存液中进行冻存，冻存密度为4×106个/ml冻存液，剩余P1代脂肪干细胞按照1：3比例进行传代；
(8)重复步骤(7)，将脂肪干细胞进行多次的培养和传代。
对照例1
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、次磷酸钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5×105U、所属链霉素0.15g、所述次磷酸钠3g。
对照例2
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、肝素钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5×105U、所属链霉素0.15g、所述羟甲基纤维素钠10g、所述肝素钠3g。
对照例3
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠、琥珀酸钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5×105U、所属链霉素0.15g、所述羟甲基纤维素钠10g、所述次磷酸钠3g、所述琥珀酸钠5g。
对照例4
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠、海藻酸铵、乳糖醇用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5×105U、所属链霉素0.15g、所述羟甲基纤维素钠10g、所述次磷酸钠3g、所述海藻酸铵5g、所述乳糖醇1g。
对照例5
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠、淀粉甘醇酸钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5×105U、所属链霉素0.15g、所述羟甲基纤维素钠10g、所述次磷酸钠3g、所述淀粉甘醇酸钠2g。
对照例6
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠、水杨酸钠、抗坏血酸钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5×105U、所属链霉素0.15g、所述羟甲基纤维素钠10g、所述次磷酸钠3g、所述水杨酸钠3g、所述抗坏血酸钠2g。
对照例7
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素10g
甲酸钠2g。
对照例8
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素10g
海藻糖6g 甲酸钠2g。
对照例9
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素10g
木糖醇6g 甲酸钠2g
肉桂醇5g 磷酸酯2g。
对照例10
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
对照例11
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素10g
木糖醇6g 甲酸钠2g
甘氨酸钠5g。
对照例12
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素10g
木糖醇6g 甲酸钠2g
乙酰胺5g D-木糖3g。
对照例13
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述冻存液主要是将α-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、甘露聚糖、生物素用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述人血白蛋白50g、所述二甲基亚砜5g、所述甘露聚糖3g、所述生物素1g。
对照例14
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述冻存液主要是将α-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、葡聚糖、麦芽糊精、生物素用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述人血白蛋白50g、所述二甲基亚砜5g、所述葡聚糖3g、所述麦芽糊精2g、所述生物素1g。
对照例15
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述冻存液主要是将α-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素、山梨酸钾用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述人血白蛋白50g、所述二甲基亚砜5g、所述甘露聚糖3g、所述麦芽糊精2g、所述生物素1g、所述山梨酸钾2g。
对照例16
一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述冻存液主要是将α-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素、对羟基苯甲酸丙酯钠、烟酰胺用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基40g、所述人血白蛋白50g、所述二甲基亚砜5g、所述甘露聚糖3g、所述麦芽糊精2g、所述生物素1g、所述对羟基苯甲酸丙酯钠2g、所述烟酰胺1g。
组织保存液对脂肪干细胞存活率的影响分析：
将相同数量的脂肪干细胞分别放入实施例5、对照例1、对照例2的组织保存液和CN104928238A的脂肪保存液中，置于灭菌的西林瓶中，在4℃下保存240小时，期间分别于第12h、24h、48h、96h、240h时观察脂肪干细胞形态，并用台盼兰染色计数脂肪干细胞存活率，试验结果见表1。
表1组织保存液对脂肪干细胞存活率的影响
其中：A表示细胞分散度好、大小均匀、形态不变、轮廓清晰；
B表示细胞体积变大、大小不等、轮廓模糊、出现椭圆或不规则等异常形态。
上述试验结果表明，采用本发明提供的组织保存液保存脂肪干细胞的效果与对比试验1-2的组织保存液和CN104928238A的脂肪保存液相比，其保存的脂肪干细胞存活率明显较高，且脂肪干细胞的形态也保持得更好，由此可知本发明提供的的组织保存液可以有效保持脂肪干细胞活性、提高脂肪干细胞存活率。
组织保存液稳定性评价：
取实施例5、实施例8、对照例3-4的组织保存液，均在温度40℃±2℃下，相对湿度为75％±5％的条件下放置12个月，在试验期间1个月、3个月、6个月、9个月、12个月末分别取样一次，检测组织保存液的性状和色泽，试验结果见表2。
表2组织保存液稳定性评价
其中：“-”表示没有，“√”表示有。
比较实施例8与实施例5和对照例3-4的组织保存液的稳定性状况可知，在组织保存液中添加琥珀酸钠和乳糖醇可以有效提高组织保存液的稳定性，避免组织保存液产生沉淀、分层和变色等问题，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，组织保存液的稳定性会减弱。
组织保存液安全性评价：
取实施例5、实施例11、对照例5-6的组织保存液，均在温度40℃±2℃下，相对湿度为75％±5％的条件下放置12个月，在试验期间1个月、3个月、6个月、9个月、12个月末分别取样一次，检测组织保存液中细菌、真菌和病毒的感染情况，检验结果见表3。
表3组织保存液安全性评价
其中：“-”表示“没有”，“√”表示“有”。
比较实施例11与实施例5、对照例5-6的组织保存液的细菌、真菌和病毒的感染状况可知，在组织保存液中添加水杨酸钠和淀粉甘醇酸钠可以有效提高组织保存液防止细菌、真菌和病毒感染的能力，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，都会导致组织保存液抗细菌、真菌和病毒感染的能力减弱。
培养基添加剂对全培养基增殖能力的影响分析
将实施例14、对照例7、对照例8的培养基添加剂分别按照实施例27的培养脂肪干细胞的方法配置全培养基，再将上述全培养基和CN104928238A的细胞培养液分别按照实施例27的培养脂肪干细胞的方法培养扩增脂肪干细胞，采用台盼蓝经典染色法对细胞进行计数，分别统计原代、第3代、第6代和第9代活脂肪干细胞的数量，结果见表4。
表4脂肪干细胞体外培养扩增效果评价
由上述结果可以得出，采用本发明提供的培养基添加剂配置的全培养基培养脂肪干细胞的增殖速度明显高于CN104928238A的细胞培养液，也优于采用对照例7和对照例8的培养基添加剂配置的全培养基。
培养基添加剂对全培养基安全性的影响分析
取实施例14、实施例17、对照例9、对照例10的培养基添加剂分别按照实施例27的培养脂肪干细胞的方法在无菌条件下配置全培养基，将上述全培养基均在温度-4℃±2℃下，相对湿度为60％±5％的条件下放置1个月后，检测全培养基中细菌、真菌和病毒的感染情况，实施例17的培养基添加剂配置的全培养基中未发现细菌、真菌和病毒，而实施例14、对照例9、对照例10的培养基添加剂配置的全培养基中均发现了细菌、真菌和病毒中的一种或几种。
由上述试验结果可知，在培养基添加剂中增加肉桂醇、磷酸酯和抗坏血酸钠可以有效提高全培养基防止细菌、真菌和病毒感染的能力，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，都会导致配置的全培养基抗细菌、真菌和病毒感染的能力减弱。
培养基添加剂对全培养基稳定性的影响分析
取实施例14、实施例20、对照例11、对照例12的培养基添加剂分别与α-MEM培养基溶液、bFGF、EGF混合配置成全培养基，将上述全培养基均在温度-4℃±2℃下，相对湿度为60％±5％的条件下放置6个月后，检测全培养基的性状和色泽，实施例20的培养基添加剂配置的全培养基的形状和色泽未发生明显变化，而实施例14、对照例11、对照例12的培养基添加剂配置的全培养基均出现了少量沉淀或分层现象。
由上述试验结果可知，在培养基添加剂中增加甘氨酸钠和D-木糖可以有效提高全培养基的稳定性，避免全培养基出现沉淀、分层和变色等问题，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，配置的全培养基的稳定性会减弱。
冻存液对脂肪干细胞冻存性能的影响分析
收集实施例27制得的P2代脂肪干细胞，将细胞重悬混匀后，进行细胞计数，将所需的细胞悬液分装至离心管中离心去除上清液，收集细胞沉淀，分别加入1.5mL实施例23、实施例26、对照例13-16的冻存液和CN104928238A的细胞冻存液重悬后加入2mL细胞冻存管中，并控制细胞数量为1×106个/mL；迅速将细胞冻存管转移至已加好异丙醇的细胞程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱2～3天后，将细胞冻存管转移至液氮保存；一个月后进行细胞复苏，将保存于液氮中的细胞冻存管取出，转移至37℃水浴锅中迅速解冻，用移液管将细胞转入之前预温好的10mL按照实施例27的方法配置的全培养基中，轻轻吹打混匀后，取0.5mL细胞悬液检测细胞存活率和细胞形态变化情况，实验结果见表5。
表5冻存液对脂肪干细胞冻存性能的影响
组别 细胞存活率(％) 细胞形态变化
实施例23 92.3 几乎不变
实施例26 98.1 几乎不变
对照例13 77.9 轻微形态变化
对照例14 79.1 轻微形态变化
对照例15 93.0 几乎不变
对照例16 93.7 几乎不变
CN104928238A 73.8 轻微形态变化
将实施例23、实施例26的冻存液的冻存性能与对照例13、对照例14的冻存液和CN104928238A的细胞冻存液的冻存性能相比，可以得出本发明提供的冻存液的冻存性能相对更好，脂肪干细胞复苏后存活率较高，而且更利于脂肪干细胞冻存前后细胞形态的维持和稳定。
实施例26的冻存液的冻存性能比实施例23、对照例15、对照例16的冻存液的冻存性能更佳，说明在冻存液中加入山梨酸钾和烟酰胺可以降低冻存过程中对细胞造成的伤害，进一步提高冻存液的冻存性能。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括试剂盒本体、若干试剂瓶(1)和若干冰袋，所述试剂盒本体包括顶端开口的盒体(2)、与所述盒体(2)铰接的盒盖(3)和设置在盒体(2)内的插托(4)，所述插托(4)与所述盒体(2)的底板平行，其上设有若干个用于放置所述试剂瓶(1)的插孔，所述插托(4)下方设有与所述盒体(2)的底板平行的镂空隔板，所述镂空隔板与其下方的所述盒体(2)形成第一空腔，所述第一空腔的侧壁上设有第一开口(5)和与所述第一开口(5)匹配的第一盖板(6)，所述盒盖(3)由盒盖上板、与所述盒盖上板平行的盒盖下板(7)、连接所述盒盖上板和所述盒盖下板(7)的盒盖侧壁(8)组成，所述盒盖下板(7)为镂空结构，所述盒盖上板、所述盒盖下板(7)和所述盒盖侧壁(8)形成第二空腔，所述盒盖侧壁(8)上设有第二开口(9)和与所述第二开口(9)匹配的第二盖板(10)，若干所述冰袋分别放置在第一空腔和第二空腔内,若干所述试剂瓶(1)内分别盛装有组织保存液、基础培养基、培养基添加剂、生长因子Ⅰ、生长因子Ⅱ、组织分解液、细胞消化液、洗涤液和冻存液。
2.根据权利要求1所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于：所述组织保存液主要是将α-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基30-50g、所述青霉素1×105-2×105U、所属链霉素0.1-0.2g、所述羟甲基纤维素钠8-12g、所述次磷酸钠2-5g。
3.根据权利要求2所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于：所述组织保存液中还含有琥珀酸钠和乳糖醇，每L所述注射用水分别溶解所述琥珀酸钠3-8g、所述乳糖醇0.5-1.5g。
4.根据权利要求2所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于：所述组织保存液中还含有水杨酸钠和淀粉甘醇酸钠，每L所述注射用水分别溶解所述水杨酸钠2-5g、所述淀粉甘醇酸钠1-3g。
5.根据权利要求1所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于：所述培养基添加剂包括如下重量份的各成分：
胎牛血清蛋白15-20 乙基甲基纤维素8-12
木糖醇5-8 甲酸钠1-3。
6.根据权利要求5所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于：所述培养基添加剂还包括如下重量份的各成分：
肉桂醇3-8 磷酸酯1-3 抗坏血酸钠1-3。
7.根据权利要求5所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于：所述培养基添加剂还包括如下重量份的各成分：
甘氨酸钠3-8 D-木糖2-5。
8.根据权利要求1所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于：所述冻存液主要是将α-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-MEM干粉培养基30-50g、所述人血白蛋白40-60g、所述二甲基亚砜3-8g、所述甘露聚糖2-5g、所述麦芽糊精1-3g、所述生物素0.5-1.5g。
9.根据权利要求8所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于：所述冻存液中还含有山梨酸钾和烟酰胺，每L所述注射用水分别溶解所述山梨酸钾1-3g、所述烟酰胺0.5-1.5g。
10.一种应用权利要求1-9任一所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒培养脂肪干细胞的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)无菌收集脂肪组织，放入盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶(1)中并密封，将所述试剂盒运输至实验室；
(2)将所述基础培养基、所述培养基添加剂、所述生长因子Ⅰ和所述生长因子Ⅱ按照重量份数比为1：0.05：1：1的比例混合均匀，配置成全培养基，配好的所述全培养基放置在4℃的冰箱中保存；
(3)从盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶(1)中取出20ml含有脂肪组织的组织保存液，倒入所述洗涤液，洗去血污，获得脂肪组织，将所述脂肪组织用眼科剪剪成1-2mm3大小的脂肪碎块；
(4)将步骤(3)获得的所述脂肪碎块加入所述组织分解液中，水浴震荡，每3min震荡一次，持续15-18min，或者放入培养箱中分解10-15min，再加入步骤(2)配置的所述全培养基终止分解；
(5)将步骤(4)所得反复吹打，混匀细胞浆，先用100目的细胞筛过滤掉未分解的脂肪组织，再用300目的细胞筛过滤掉成熟脂肪组织，收集悬液；
(6)将步骤(5)所得悬液离心，弃掉上层清液，得脂肪干细胞单细胞悬液，记为P0代脂肪干细胞，用步骤(2)配置的所述全培养基将P0代脂肪干细胞重悬，再按照1-2×106个/ml的密度接种在培养瓶中，将培养瓶放入37℃、5％CO2的CO2培养箱中；
(7)将步骤(6)所得每三天更换全培养基一次，通过显微镜观察到脂肪干细胞生长面积达到80％左右时，先用所述洗涤液清洗2次，然后加入所述细胞消化液，适当震荡摇晃培养瓶，使所述细胞消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化30-60s，最后加入步骤(2)配置的所述全培养基终止消化，所得脂肪干细胞记为P1代脂肪干细胞，取出一部分P1代脂肪干细胞放入所述冻存液中进行冻存，冻存密度为3-5×106个/ml冻存液，剩余P1代脂肪干细胞按照1：3比例进行传代；
(8)重复步骤(7)，将脂肪干细胞进行多次的培养和传代。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520679A (zh) * 2016-11-30 2017-03-22 张晓南 一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒
CN106719600A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脂肪组织冻存液
CN106754671A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 张晓南 一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒
CN106978395A (zh) * 2017-04-10 2017-07-25 广东省第二人民医院 一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法
CN107416327A (zh) * 2017-08-12 2017-12-01 北京碳云科技有限公司 一种防止试剂运输过程倾倒的试剂运输箱
CN108094410A (zh) * 2018-01-26 2018-06-01 山东大学齐鲁医院 一种皮肤深低温保护剂及皮肤保存方法
CN112625904A (zh) * 2020-12-27 2021-04-09 弘康信达(江苏)医学研究有限公司 一种外胚间充质干细胞的分离培养设备及方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103087982A (zh) * 2011-10-27 2013-05-08 北京清美联创干细胞科技有限公司 一种快速分离脂肪间充质干细胞的试剂盒及方法
CN103891709A (zh) * 2012-12-24 2014-07-02 深圳先进技术研究院 细胞冻存液及细胞冻存方法
CN104164403A (zh) * 2014-07-25 2014-11-26 大连大学 一种提取及培养脂肪干细胞的方法
CN104928238A (zh) * 2014-03-21 2015-09-23 青岛中天干细胞工程有限公司 用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒
CN205120720U (zh) * 2015-06-05 2016-03-30 军科正源（北京）药物研究有限责任公司 一种快速检测egfr抗体药物的抗药抗体的试剂盒
CN205203794U (zh) * 2015-12-18 2016-05-04 四川鼎尖动物药业有限责任公司 一种试剂盒
CN105685015A (zh) * 2016-03-10 2016-06-22 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种细胞冻存液

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103087982A (zh) * 2011-10-27 2013-05-08 北京清美联创干细胞科技有限公司 一种快速分离脂肪间充质干细胞的试剂盒及方法
CN103891709A (zh) * 2012-12-24 2014-07-02 深圳先进技术研究院 细胞冻存液及细胞冻存方法
CN104928238A (zh) * 2014-03-21 2015-09-23 青岛中天干细胞工程有限公司 用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒
CN104164403A (zh) * 2014-07-25 2014-11-26 大连大学 一种提取及培养脂肪干细胞的方法
CN205120720U (zh) * 2015-06-05 2016-03-30 军科正源（北京）药物研究有限责任公司 一种快速检测egfr抗体药物的抗药抗体的试剂盒
CN205203794U (zh) * 2015-12-18 2016-05-04 四川鼎尖动物药业有限责任公司 一种试剂盒
CN105685015A (zh) * 2016-03-10 2016-06-22 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种细胞冻存液

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520679A (zh) * 2016-11-30 2017-03-22 张晓南 一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒
CN106719600A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脂肪组织冻存液
CN106754671A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 张晓南 一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒
CN106520679B (zh) * 2016-11-30 2019-05-31 张晓南 一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒
CN106754671B (zh) * 2016-11-30 2020-02-07 张晓南 一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒
CN106978395A (zh) * 2017-04-10 2017-07-25 广东省第二人民医院 一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法
CN107416327A (zh) * 2017-08-12 2017-12-01 北京碳云科技有限公司 一种防止试剂运输过程倾倒的试剂运输箱
CN107416327B (zh) * 2017-08-12 2020-05-22 北京碳云科技有限公司 一种防止试剂运输过程倾倒的试剂运输箱
CN108094410A (zh) * 2018-01-26 2018-06-01 山东大学齐鲁医院 一种皮肤深低温保护剂及皮肤保存方法
CN108094410B (zh) * 2018-01-26 2021-08-31 山东大学齐鲁医院 一种皮肤深低温保护剂及皮肤保存方法
CN112625904A (zh) * 2020-12-27 2021-04-09 弘康信达(江苏)医学研究有限公司 一种外胚间充质干细胞的分离培养设备及方法

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