CN106754671A - 一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒 - Google Patents

一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，其内设有若干试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别盛装有培养液I、培养液II、生长因子I、生长因子II、生长因子III、生长因子IV、消化液、清洗液、冻存液和细胞种子。本发明提供的试剂盒可以培养扩增心肌祖细胞并进行冷冻保存，解决了心肌祖细胞培养存活率低、培养效率不高、培养批次间差别大、冻存复活率不理想等问题，使心肌祖细胞在理想营养平衡状态下进行扩增而不发生分化，为利用心肌祖细胞进行进一步实验研究和医学治疗提供了丰富的来源，非常适用于培养心肌祖细胞。

Description

一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒
技术领域
本发明属于细胞技术领域，尤其涉及一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒。
背景技术
近年来，心肌梗死的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，是当今威胁人类健康的重要疾病之一。研究发现，心肌梗死后会有少量心肌细胞发生分裂增生，但数量有限，仅限于存活部分的心肌，不能有效修复心肌组织；大量的心肌细胞死亡后由疤痕组织代替，导致局部的心肌收缩减弱、紊乱，心肌功能下降，目前尚无理想的治疗手段，如何增加有舒缩功能的心肌细胞数量成为治疗心肌受损后心力衰竭的关键。
将外源性干细胞移植入受损心肌组织的心肌细胞成形术让我们看到了希望。通过将外源性干细胞移植到心肌受损部位，使之存活并转化为心肌细胞或有心肌细胞功能的细胞，代替衰竭或死亡的心肌细胞，以恢复和改善心功能，最后达到治疗心血管疾病的目的。但移植外源性干细胞治疗功能性心肌细胞死亡或凋亡,易导致移植并发症,因此心脏本身存在的心肌祖细胞成为更理想的种子细胞。
为满足医学研究和治疗的需求，大量培养心肌祖细胞成为重要的研究课题，心肌祖细胞培养的过程很繁琐，而且所需的培养试剂因子种类较多，培养时间较长，如果试验人员选择的用于培养和保存心肌祖细胞的试剂和方法不够妥当，往往会造成培养的心肌祖细胞的数量和质量无法达到要求，浪费了人力和其他资源，因此研究一种专门用于稳定的大量扩增培养心肌祖细胞的试剂盒具有重要意义。目前专门用于培养心肌祖细胞的试剂盒较少，现有技术中公开了一些用于培养其他干细胞的试剂盒，例如CN104928238A公布了一种用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，包括脂肪保存液、脂肪洗涤液、脂肪分解液、细胞洗涤液、细胞培养液、细胞消化液、细胞冻存液，但此试剂盒培养扩增干细胞的效果不够理想，存在试剂安全性、稳定性不高，细胞存活率和增殖率低等问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，其内设有若干试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别盛装有培养液I、培养液II、生长因子I、生长因子II、生长因子III、生长因子IV、消化液、清洗液、冻存液和细胞种子，所述冻存液主要是将DMEM/F12干粉培养基、人血白蛋白、果聚糖、大车前苷、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培养基30-50g、所述人血白蛋白10-20g、所述果聚糖1-3g、所述大车前苷0.2-0.5g、所述苦杏仁甙0.05-0.08g。
大车前苷：分子式为C29H36O16，CAS号为104777-68-6；
苦杏仁甙：分子式为C20H27NO11，CAS号为29883-15-6；
本发明提供的试剂盒内的冻存液的冻存性能较好，心肌祖细胞复苏后存活率较高，而且更利于心肌祖细胞冻存前后细胞形态的维持和稳定。
优选的，所述培养液I为DMEM/F12培养基溶液，所述DMEM/F12培养基溶液由DMEM/F12干粉培养基用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培养基20-40g。
优选的，所述培养液II为H-DMEM培养基溶液，所述H-DMEM培养基溶液由H-DMEM干粉培养基用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述H-DMEM干粉培养基20-40g。
优选的，所述生长因子I为bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)溶液，所述bFGF溶液由bFGF冻干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述bFGF冻干粉0.1-0.2mg。
优选的，所述生长因子II为EGF(表皮细胞生长因子)溶液，所述EGF溶液由EGF冻干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述EGF冻干粉0.1-0.2mg。
优选的，所述生长因子III为LIF(白细胞抑制因子)溶液，所述LIF溶液由LIF冻干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述LIF冻干粉0.1-0.2mg。
优选的，所述生长因子IV为VEGF(血管内皮生长因子)溶液，所述VEGF溶液由VEGF冻干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述VEGF冻干粉0.1-0.2mg。
优选的，所述消化液为含1％胰酶的PBS缓冲液。
优选的，所述清洗液为PBS缓冲液。
上述PBS缓冲液均为含0.05％吐温-20，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
优选的，所述细胞种子为心肌祖细胞原代细胞。
优选的，所述心肌祖细胞原代细胞分离自流产胚胎心脏组织。
进一步的，所述冻存液中还含有海藻酸丙二醇酯、甘氨酸钠和葡萄糖酸内酯，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯0.6-1.3g、所述甘氨酸钠0.4-0.8g、所述葡萄糖酸内酯0.1-0.3g。
在冻存液中加入海藻酸丙二醇酯、甘氨酸钠和葡萄糖酸内酯可以显著提高冻存液的稳定性，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，冻存液的稳定性下降。
进一步的，所述冻存液中还含有二硫代甘醇酸和甲酸钠，每L所述注射用水溶解所述二硫代甘醇酸0.3-0.5g、所述甲酸钠0.08-0.2g。
在冻存液中加入二硫代甘醇酸和甲酸钠可以提高冻存液的抗菌能力，有效抑制冻存液中细菌的滋生和繁殖，保障冻存液的使用安全。
进一步的，所述试剂瓶内还盛装有培养基添加剂，所述培养基添加剂包括如下重量份数的各成分：
本发明提供的培养基添加剂可以提高采用其配置的完全培养基的增殖能力，提高心肌祖细胞的培养增殖速度。
进一步的，所述培养基添加剂中还包括如下重量份数的各成分：
葛根素 0.5-1
维生素E 0.2-0.6。
葛根素：分子式为C21H20O9，CAS号为3681-99-0；
在培养基添加剂中加入葛根素和维生素E有利于进一步提高采用其配置的完全培养基的增殖能力。
进一步的，所述培养基添加剂中还包括如下重量份数的各成分：
酒石酸钾钠 0.8-1
聚乙烯醇 0.1-0.3。
在培养基添加剂中加入酒石酸钾钠和聚乙烯醇可以显著提高采用其配置的完全培养基的稳定性，避免完全培养基出现沉淀、分层和变色等问题，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，完全培养基的稳定性下降。
进一步的，所述培养基添加剂中还包括如下重量份数的各成分：
谷胱甘肽 0.3-0.7
对羟基苯甲酸甲酯 0.1-0.2。
在培养基添加剂中加入谷胱甘肽和对羟基苯甲酸甲酯可以有效提高采用其配制的完全培养基防止细菌感染的能力，有效抑制完全培养基中细菌的滋生和繁殖，保障完全培养基的使用安全，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，都会导致全培养基抗菌能力减弱。
本发明还提供一种培养心肌祖细胞的方法，包括如下步骤：
S1.将培养液I、培养液II、生长因子I、生长因子II、生长因子III、生长因子IV按照重量份数比为3：3：1：1：1：1的比例混合均匀，配置成为完全培养基放置在4℃的冰箱中保存；
S2.将细胞种子加入清洗液中，在4℃、1000rpm的条件下离心5min，然后收集细胞加入完全培养基重悬，再按照1-2×106个/ml的密度接种在培养瓶中，在37℃、5％C02的环境中，用标准的孵化器孵化细胞；
S3.当细胞生长面积达到85-95％时，先用清洗液清洗2次，然后加入5％的消化液，适当震荡摇晃培养瓶，使消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化1-2min，最后加入预热至37℃的完全培养基终止消化，然后将获得的细胞按照1:3的比例传代；
S4.重复S3步骤1次，然后在4℃、1000rpm的条件下离心5min，重复离心2遍，然后收集细胞放入冻存液中进行冻存，冻存密度为1-2×107个/ml冻存液。
进一步的，用标准的孵化器孵化细胞的过程中，如果经过24h的培养，细胞生长面积未达到50％，则更换1次完全培养基。
进一步的，所述细胞种子的制备包括：从流产胚胎上采取心脏组织，倒入清洗液清洗后用眼科剪剪成1-2mm3大小的组织碎块；将组织碎块加入含1％胶原酶I型的PBS缓冲液中，水浴震荡，每3min震荡一次，震荡5次后加入完全培养基终止分解；然后进行反复吹打，混匀细胞浆，用300目的细胞筛过滤后收集悬液；将悬液离心后弃去上清液，即可获得细胞种子。
本发明提供的试剂盒可以培养扩增心肌祖细胞并进行冷冻保存，解决了心肌祖细胞培养存活率低、培养效率不高、培养批次间差别大、冻存复活率不理想等问题，使心肌祖细胞在理想营养平衡状态下进行扩增而不发生分化，为利用心肌祖细胞进行进一步实验研究和医学治疗提供了丰富的来源，非常适用于培养心肌祖细胞。
具体实施方式
实施例1
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，其内设有若干试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别盛装有培养液I、培养液II、生长因子I、生长因子II、生长因子III、生长因子IV、消化液、清洗液、冻存液和细胞种子，所述冻存液主要是将DMEM/F12干粉培养基、人血白蛋白、果聚糖、大车前苷、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培养基30g、所述人血白蛋白10g、所述果聚糖1g、所述大车前苷0.2g、所述苦杏仁甙0.05g。
实施例2
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，其内设有若干试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别盛装有培养液I、培养液II、生长因子I、生长因子II、生长因子III、生长因子IV、消化液、清洗液、冻存液和细胞种子，所述冻存液主要是将DMEM/F12干粉培养基、人血白蛋白、果聚糖、大车前苷、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培养基50g、所述人血白蛋白20g、所述果聚糖3g、所述大车前苷0.5g、所述苦杏仁甙0.08g。
实施例3
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，其内设有若干试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别盛装有培养液I、培养液II、生长因子I、生长因子II、生长因子III、生长因子IV、消化液、清洗液、冻存液和细胞种子，所述冻存液主要是将DMEM/F12干粉培养基、人血白蛋白、果聚糖、大车前苷、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培养基40g、所述人血白蛋白12g、所述果聚糖2g、所述大车前苷0.4g、所述苦杏仁甙0.06g。
实施例4
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述冻存液中还含有海藻酸丙二醇酯、甘氨酸钠和葡萄糖酸内酯，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯0.6g、所述甘氨酸钠0.4g、所述葡萄糖酸内酯0.1g。
实施例5
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例2不同的是：所述冻存液中还含有海藻酸丙二醇酯、甘氨酸钠和葡萄糖酸内酯，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯1.3g、所述甘氨酸钠0.8g、所述葡萄糖酸内酯0.3g。
实施例6
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例3不同的是：所述冻存液中还含有海藻酸丙二醇酯、甘氨酸钠和葡萄糖酸内酯，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯1g、所述甘氨酸钠0.5g、所述葡萄糖酸内酯0.2g。
实施例7
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述冻存液中还含有二硫代甘醇酸和甲酸钠，每L所述注射用水溶解所述二硫代甘醇酸0.3g、所述甲酸钠0.08g。
实施例8
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例5不同的是：所述冻存液中还含有二硫代甘醇酸和甲酸钠，每L所述注射用水溶解所述二硫代甘醇酸0.5g、所述甲酸钠0.2g。
实施例9
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例3不同的是：所述冻存液中还含有二硫代甘醇酸和甲酸钠，每L所述注射用水溶解所述二硫代甘醇酸0.4g、所述甲酸钠0.1g。
实施例10
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述试剂瓶内还盛装有培养基添加剂，所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
实施例11
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例8不同的是：所述试剂瓶内还盛装有培养基添加剂，所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
实施例12
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例3不同的是：所述试剂瓶内还盛装有培养基添加剂，所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
实施例13
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例10不同的是：所述培养基添加剂中还包括如下重量的各成分：
葛根素 0.5g
维生素E 0.2g。
实施例14
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例11不同的是：所述培养基添加剂中还包括如下重量的各成分：
葛根素 1g
维生素E 0.6g。
实施例15
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例12不同的是：所述培养基添加剂中还包括如下重量的各成分：
葛根素 0.8g
维生素E 0.5g。
实施例16
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例10不同的是：所述培养基添加剂中还包括如下重量的各成分：
酒石酸钾钠 0.8g
聚乙烯醇 0.1g。
实施例17
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例14不同的是：所述培养基添加剂中还包括如下重量的各成分：
酒石酸钾钠 1g
聚乙烯醇 0.3g。
实施例18
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例12不同的是：所述培养基添加剂中还包括如下重量的各成分：
酒石酸钾钠 0.9g
聚乙烯醇 0.2g。
实施例19
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例10不同的是：所述培养基添加剂中还包括如下重量的各成分：
谷胱甘肽 0.3g
对羟基苯甲酸甲酯 0.1g。
实施例20
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例17不同的是：所述培养基添加剂中还包括如下重量的各成分：
谷胱甘肽 0.7g
对羟基苯甲酸甲酯 0.2g。
实施例21
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例12不同的是：所述培养基添加剂中还包括如下重量的各成分：
谷胱甘肽 0.5g
对羟基苯甲酸甲酯 0.15g。
实施例22
一种培养心肌祖细胞的方法，包括如下步骤：
S1.将培养液I、培养液II、生长因子I、生长因子II、生长因子III、生长因子IV按照重量份数比为3：3：1：1：1：1的比例混合均匀，配置成为完全培养基放置在4℃的冰箱中保存；
S2.将细胞种子加入清洗液中，在4℃、1000rpm的条件下离心5min，然后收集细胞加入完全培养基重悬，再按照1×106个/ml的密度接种在培养瓶中，在37℃、5％C02的环境中，用标准的孵化器孵化细胞；
S3.当细胞生长面积达到85％时，先用清洗液清洗2次，然后加入5％的消化液，适当震荡摇晃培养瓶，使消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化1min，最后加入预热至37℃的完全培养基终止消化，然后将获得的细胞按照1:3的比例传代；
S4.重复S3步骤1次，然后在4℃、1000rpm的条件下离心5min，重复离心2遍，然后收集细胞放入冻存液中进行冻存，冻存密度为1×107个/ml冻存液。
实施例23
一种培养心肌祖细胞的方法，包括如下步骤：
S1.将培养液I、培养液II、生长因子I、生长因子II、生长因子III、生长因子IV按照重量份数比为3：3：1：1：1：1的比例混合均匀，配置成为完全培养基放置在4℃的冰箱中保存；
S2.从流产胚胎上采取心脏组织，倒入清洗液清洗后用眼科剪剪成1-2mm3大小的组织碎块；将组织碎块加入含1％胶原酶I型的PBS缓冲液中，水浴震荡，每3min震荡一次，震荡5次后加入完全培养基终止分解；然后进行反复吹打，混匀细胞浆，用300目的细胞筛过滤后收集悬液；将悬液离心后弃去上清液，即可获得细胞种子；
S3.将细胞种子加入清洗液中，在4℃、1000rpm的条件下离心5min，然后收集细胞加入完全培养基重悬，再按照1.5×106个/ml的密度接种在培养瓶中，在37℃、5％C02的环境中，用标准的孵化器孵化细胞，如果经过24h的培养，细胞生长面积未达到50％，则更换1次完全培养基；
S4.当细胞生长面积达到90％时，先用清洗液清洗2次，然后加入5％的消化液，适当震荡摇晃培养瓶，使消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化1.5min，最后加入预热至37℃的完全培养基终止消化，然后将获得的细胞按照1:3的比例传代；
S5.重复S3步骤1次，然后在4℃、1000rpm的条件下离心5min，重复离心2遍，然后收集细胞放入冻存液中进行冻存，冻存密度为1.5×107个/ml冻存液。
对照例1
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，其内设有若干试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别盛装有培养液I、培养液II、生长因子I、生长因子II、生长因子III、生长因子IV、消化液、清洗液、冻存液和细胞种子，所述冻存液主要是将DMEM/F12干粉培养基、人血白蛋白、大车前苷、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培养基40g、所述人血白蛋白12g、所述大车前苷0.4g、所述苦杏仁甙0.06g。
对照例2
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，其内设有若干试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别盛装有培养液I、培养液II、生长因子I、生长因子II、生长因子III、生长因子IV、消化液、清洗液、冻存液和细胞种子，所述冻存液主要是将DMEM/F12干粉培养基、人血白蛋白、果聚糖、蒲公英提取物、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培养基40g、所述人血白蛋白12g、所述果聚糖2g、所述蒲公英提取物0.4g、所述苦杏仁甙0.06g。
对照例3
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例3不同的是：所述冻存液中还含有海藻酸丙二醇酯和葡萄糖酸内酯，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯1g、所述葡萄糖酸内酯0.2g。
对照例4
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例3不同的是：所述冻存液中还含有海藻酸丙二醇酯、甘氨酸钠和次磷酸钠，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯1g、所述甘氨酸钠0.5g、所述次磷酸钠0.2g。
对照例5
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例3不同的是：所述冻存液中还含有甲酸钠，每L所述注射用水溶解所述甲酸钠0.1g。
对照例6
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例3不同的是：所述冻存液中还含有二硫代甘醇酸和苯甲酸钠，每L所述注射用水溶解所述二硫代甘醇酸0.4g、所述苯甲酸钠0.1g。
对照例7
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例3不同的是：所述试剂瓶内还盛装有培养基添加剂，所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
羟丙基纤维素 9g
亮氨酸 4g
乙基香草醛。 0.8g。
对照例8
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例3不同的是：所述试剂瓶内还盛装有培养基添加剂，所述培养基添加剂包括如下重量的各成分：
对照例9
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例12不同的是：所述培养基添加剂中还包括0.8g的葛根素。
对照例10
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例12不同的是：所述培养基添加剂中还包括如下重量的各成分：
甘草提取物 0.8g
维生素E 0.5g。
对照例11
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例12不同的是：所述培养基添加剂中还包括0.9g的酒石酸钾钠。
对照例12
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例12不同的是：所述培养基添加剂中还包括如下重量的各成分：
酒石酸钾钠 0.9g
甲壳素 0.2g。
对照例13
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例12不同的是：所述培养基添加剂中还包括0.5g的谷胱甘肽。
对照例14
一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，与实施例12不同的是：所述培养基添加剂中还包括如下重量的各成分：
木糖醇 0.5g
对羟基苯甲酸甲酯 0.15g。
冻存液对心肌祖细胞冻存性能的影响评价
将心肌祖细胞分别加入1.5mL实施例3、对照例1和对照例2提供的的冻存液和CN104928238A提供的的细胞冻存液重悬后加入2mL细胞冻存管中，并控制细胞数量为1×106个/mL；迅速将细胞冻存管转移至已加好异丙醇的细胞程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱2～3天后，将细胞冻存管转移至液氮保存；一个月后进行细胞复苏，将保存于液氮中的细胞冻存管取出，转移至37℃水浴锅中迅速解冻，用移液管将细胞转入之前预温好的10mL按照实施例22的方法配置的完全培养基中，轻轻吹打混匀后，取0.5mL细胞悬液检测细胞存活率和细胞形态变化情况，实验结果见表1。
表1冻存液对心肌祖细胞冻存性能的影响
组别 细胞存活率(％) 细胞形态变化
实施例3 97.6 几乎不变
对照例1 79.7 轻微形态变化
对照例2 83.1 轻微形态变化
CN104928238A 69.8 轻微形态变化
将实施例3提供的冻存液的冻存性能与对照例1、对照例2提供的的冻存液和CN104928238A提供的细胞冻存液的冻存性能相比，可以得出本发明提供的冻存液的冻存性能相对更好，心肌祖细胞复苏后存活率较高，而且更利于心肌祖细胞冻存前后细胞形态的维持和稳定。
冻存液稳定性评价
1.加速试验
取实施例3、实施例6、对照例3和对照例4提供的冻存液，均在温度40℃±2℃下，相对湿度为75％±5％的条件下放置6个月，在试验期间1个月、2个月、3个月、6个月末分别取样一次，检测冻存液的性状、色泽和气味，结果发现，实施例6提供的冻存液的各项指标均无明显变化；而实施例3、对照例3和对照例4提供的冻存液出现少量沉淀，并且颜色变深。
2.长期试验
取实施例3、实施例6、对照例3和对照例4提供的冻存液，均在温度25℃±2℃下，相对湿度为60％±10％的条件下放置12个月，在试验期间0个月、3个月、6个月、9个月、12个月末分别取样一次，检测冻存液的性状、色泽和气味，结果发现，实施例6提供的冻存液的各项指标均无明显变化；而实施例3、对照例3和对照例4提供的冻存液出现沉淀和颜色变深的现象。
从上述加速试验和长期试验的结果可知，在冻存液中加入海藻酸丙二醇酯、甘氨酸钠和葡萄糖酸内酯可以显著提高冻存液的稳定性，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，冻存液的稳定性下降。
冻存液安全性评价
分别取实施例3、实施例9、对照例5和对照例6提供的冻存液，均在温度为25℃±2℃，相对湿度为60％±10％的条件下密闭保存12个月，检测冻存液中的细菌总数。
表2冻存液中细菌总数统计
实施例3 实施例9 对照例5 对照例6
细菌总数(cfu/mL) 801 101 789 764
由上述结果可知，在冻存液中加入二硫代甘醇酸和甲酸钠可以提高冻存液的抗菌能力，有效抑制冻存液中细菌的滋生和繁殖，保障冻存液的使用安全。
培养基添加剂对完全培养基增殖能力的影响分析
将实施例12、实施例15、对照例7-10提供的培养基添加剂分别按照实施例22的方法配置全培养基，再将上述全培养基分别按照实施例22的方法培养扩增心肌祖细胞，采用台盼蓝经典染色法对细胞进行计数，分别统计原代和第3代活心肌祖细胞的数量，结果见表3。
表3心肌祖细胞体外培养扩增效果评价
由上述结果可以得出，采用实施例12提供的培养基添加剂配置的完全培养基培养心肌祖细胞的增殖速度明显高于CN104928238A的细胞培养液，也优于采用对照例7和对照例8的培养基添加剂配置的完全培养基，说明本发明提供的培养基添加剂可以提高采用其配置的完全培养基的增殖能力。
采用实施例15提供的培养基添加剂配置的完全培养基培养心肌祖细胞的增殖速度比采用实施例12、对照例9、对照例10提供的培养基添加剂配置的完全培养基培养心肌祖细胞的增殖速度更佳，说明在培养基添加剂中加入葛根素和维生素E有利于提高采用其配置的完全培养基的增殖能力。
培养基添加剂对完全培养基稳定性的影响分析
取实施例12、实施例18、对照例11、对照例12的培养基添加剂分别按照实施例22的方法在无菌条件下配置完全培养基，对上述完全培养基进行稳定性的加速试验和常温试验：
1.加速试验
将上述完全培养基均在温度40℃±2℃下，相对湿度为75％±5％的条件下放置6个月，在试验期间1个月、2个月、3个月、6个月末分别取样一次，检测完全培养基的性状、色泽和气味，结果发现，采取实施例12提供的培养基添加剂配置的完全培养基的各项指标均无明显变化；而采取实施例18、对照例11和对照例12提供的培养基添加剂配置的完全培养基颜色变深，并且出现少量沉淀。
2.长期试验
将上述完全培养基均在温度25℃±2℃下，相对湿度为60％±10％的条件下放置12个月，在试验期间0个月、3个月、6个月、9个月、12个月末分别取样一次，检测完全培养基的性状、色泽和气味，结果发现，采取实施例12提供的培养基添加剂配置的完全培养基的各项指标均无明显变化；而采取实施例18、对照例11和对照例12提供的培养基添加剂配置的完全培养基出现沉淀和颜色变深的现象。
从上述加速试验和长期试验的结果可知，在培养基添加剂中加入酒石酸钾钠和聚乙烯醇可以显著提高完全培养基的稳定性，避免完全培养基出现沉淀、分层和变色等问题，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，完全培养基的稳定性下降。
培养基添加剂对完全培养基安全性的影响分析
取实施例12、实施例21、对照例13、对照例14的培养基添加剂分别按照实施例22的方法在无菌条件下配置完全培养基，将上述完全培养基均在温度为25℃±2℃，相对湿度为60％±10％的条件下密闭保存12个月，然后检测完全培养基中的细菌总数，结果如表4所示。
表4完全培养基中细菌总数统计
实施例12 实施例21 对照例13 对照例14
细菌总数(cfu/mL) 597 25 571 546
由上述结果可知，在培养基添加剂中加入谷胱甘肽和对羟基苯甲酸甲酯可以有效提高完全培养基防止细菌感染的能力，有效抑制完全培养基中细菌的滋生和繁殖，保障完全培养基的使用安全，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，都会导致全培养基抗菌能力减弱。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内设有若干试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别盛装有培养液I、培养液II、生长因子I、生长因子II、生长因子III、生长因子IV、消化液、清洗液、冻存液和细胞种子，所述冻存液主要是将DMEM/F12干粉培养基、人血白蛋白、果聚糖、大车前苷、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培养基30-50g、所述人血白蛋白10-20g、所述果聚糖1-3g、所述大车前苷0.2-0.5g、所述苦杏仁甙0.05-0.08g。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述冻存液中还含有海藻酸丙二醇酯、甘氨酸钠和葡萄糖酸内酯，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯0.6-1.3g、所述甘氨酸钠0.4-0.8g、所述葡萄糖酸内酯0.1-0.3g。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述冻存液中还含有二硫代甘醇酸和甲酸钠，每L所述注射用水溶解所述二硫代甘醇酸0.3-0.5g、所述甲酸钠0.08-0.2g。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶内还盛装有培养基添加剂，所述培养基添加剂包括如下重量份数的各成分：
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述培养基添加剂中还包括如下重量份数的各成分：
葛根素 0.5-1
维生素E 0.2-0.6。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述培养基添加剂中还包括如下重量份数的各成分：
酒石酸钾钠 0.8-1
聚乙烯醇 0.1-0.3。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述培养基添加剂中还包括如下重量份数的各成分：
谷胱甘肽 0.3-0.7
对羟基苯甲酸甲酯 0.1-0.2。
8.一种培养心肌祖细胞的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
S1.将培养液I、培养液II、生长因子I、生长因子II、生长因子III、生长因子IV按照重量份数比为3：3：1：1：1：1的比例混合均匀，配置成为完全培养基放置在4℃的冰箱中保存；
S2.将细胞种子加入清洗液中，在4℃、1000rpm的条件下离心5min，然后收集细胞加入完全培养基重悬，再按照1-2×106个/ml的密度接种在培养瓶中，在37℃、5％C02的环境中，用标准的孵化器孵化细胞；
S3.当细胞生长面积达到85-95％时，先用清洗液清洗2次，然后加入5％的消化液，适当震荡摇晃培养瓶，使消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化1-2min，最后加入预热至37℃的完全培养基终止消化，然后将获得的细胞按照1:3的比例传代；
S4.重复S3步骤1次，然后在4℃、1000rpm的条件下离心5min，重复离心2遍，然后收集细胞放入冻存液中进行冻存，冻存密度为1-2×107个/ml冻存液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用标准的孵化器孵化细胞的过程中，如果经过24h的培养，细胞生长面积未达到50％，则更换1次完全培养基。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞种子的制备包括：从流产胚胎上采取心脏组织，倒入清洗液清洗后用眼科剪剪成1-2mm3大小的组织碎块；将组织碎块加入含1％胶原酶I型的PBS缓冲液中，水浴震荡，每3min震荡一次，震荡5次后加入完全培养基终止分解；然后进行反复吹打，混匀细胞浆，用300目的细胞筛过滤后收集悬液；将悬液离心后弃去上清液，即可获得细胞种子。
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