CN114181892B - 心肺祖细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种心肺祖细胞的制备方法以及通过该方法得到的心肺祖细胞及其应用，包括以下步骤：将C57BL/6小鼠胚胎头部和尾部去掉，再将CPPs区域分离出来；用消化液进行消化，离心，收集细胞；悬滴培养；悬浮培养；用ABC培养基继续培养，每两天更换一次培养基，直至细胞汇合度大于90％时，传代，即得。本发明还公开了用于诱导分化的ABC培养基。本发明体外培养和扩增所得的心肺祖细胞是一个异质的祖细胞池，作为一种新的干细胞来源，为体外研究心脏和肺脏共发育提供了一种细胞模型，同时，预示其可作为一种新的细胞治疗方式，用于心脏疾病以及肺部疾病的治疗。

Description

心肺祖细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，更具体地，本发明涉及心肺祖细胞及其制备方法和应用。
背景技术
祖细胞分别存在于生物的各种成体组织中，负责组织损伤后的修复再生过程。在损伤发生后，祖细胞可以被动员激活，大量增殖并迁移到受损部位，分化成成熟的细胞，替换受损的组织。在人体的多种组织器官中都已鉴定到相应的祖细胞，例如：血液祖细胞、皮肤祖细胞、小肠祖细胞、肺脏祖细胞等等。由于祖细胞具有帮助组织器官修复再生的“神奇”功能，因此科学家们正尝试培养祖细胞并将其移植到患者体内，用来治疗多种退行性疾病。
目前并没有合适的能体外培养获得心肺祖细胞的方法，也没有针对其增殖和干性维持而开发的合适的培养基。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一种心肺祖细胞的体外制备方法。
一种心肺祖细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)将第9.5天的C57BL/6小鼠胚胎头部和尾部去掉，再将心肺祖细胞所在区域分离出来；
(2)用消化液对所述心肺祖细胞所在区域进行消化，离心，收集细胞；
(3)诱导培养胚状体的方法，进行悬滴培养46-52小时；
(4)悬浮培养：在基础培养基中加入CHIR99021(GSK3抑制剂)培养24小时后，换成基础培养基培养24±2小时，然后将细胞消化成单个细胞悬液，种于铺有明胶的培养皿上；
(5)用ABC培养基继续培养，每两天更换一次培养基，直至细胞汇合度大于90％时，按1：3-4的比例进行传代，即得；所述ABC培养基包括1.5-2.5％的B-27，1.5-2.5mM的L-谷氨酰胺，0.8-1.2％的非必需氨基酸，0.08-0.12mM的β-巯基乙醇，0.8-1.2μM的A83-01，45-55ng/ml的bFGF，10-14μM的CHIR-99021，2.0-5.0％的人血小板裂解物。
在其中一些实施例中，加入的CHIR99021浓度为12±0.1μM。
在其中一些实施例中，所述ABC培养基包括2±0.1％的B-27，2±0.1mM的L-谷氨酰胺，1±0.1％的非必需氨基酸，0.1±0.01mM的β-巯基乙醇，1±0.1μM的A83-01，50±0.5ng/ml的bFGF，12±1μM的CHIR-99021，2.5±0.1％的人血小板裂解物。
在其中一些实施例中，所述基础培养基包括有：RPMI 1640中加入2±0.1％B-27(无胰岛素)、2±0.1mM L-谷氨酰胺、1±0.1％非必需氨基酸(NEAA)、1±0.1％双抗青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin),0.1±0.01mMβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)。
在其中一些实施例中，所述消化液为0.03-0.05％胰蛋白酶(Trypsin)and 0.04-0.06％胶原酶IV(Collagenase IV)。
在其中一些实施例中，步骤(2)中，在37℃消化10分钟，中途轻轻颠倒数次。用含FBS的培养基终止消化后，200×g离心5分钟，收集的细胞计数后，用诱导培养胚状体的方法，进行悬滴培养，每滴悬液体积为15μl，细胞数为2000个。
在其中一些实施例中，步骤(4)中，悬浮培养：在基础培养基中加入CHIR99021培养24小时后，换成基础培养基培养24小时，然后将细胞消化成单个细胞悬液，种于铺有0.2％明胶的培养皿上。
本发明的另一目的是提供一种可用于制备心肺祖细胞的ABC培养基。
一种ABC培养基，包括1.5-2.5％的B-27，1.5-2.5mM的L-谷氨酰胺，0.8-1.2％的非必需氨基酸，0.08-0.12mM的β-巯基乙醇，0.8-1.2μM的A83-01，45-55ng/ml的bFGF，10-14μM的CHIR-99021，2.0-3.0％的人血小板裂解物。
本发明的另一目的是提供上述体外培养扩增得到的心肺祖细胞在制备治疗心脏疾病或肺部疾病的药物中的作用。
本发明的发明人，通过配制合适的ABC培养基，以及合适的培养方法，首次获得体外培养的CPPs(心肺祖细胞)，实验表明，从所述体外培养得到的CPPs继续体外诱导分化能得到各种心肺祖细胞(心肌细胞、II型肺泡上皮细胞、内皮细胞)，其具有很好的分化能力。本发明体外培养扩增所得的心肺祖细胞是一个异质的祖细胞池，作为一种新的干细胞来源，为体外研究心脏和肺脏共发育提供了一种细胞模型，同时，预示其可作为一种新的细胞治疗方式，用于心脏疾病以及肺部疾病的治疗，如肺源性心脏病(肺心病)。
本发明所述ABC培养基，是为了获得心肺祖细胞以及对心肺祖细胞增殖和干性维持而开发的培养基。
附图说明
图1第9.5天的小鼠胚胎中CPPs的区域。A、9.5天的胚胎；B、胚胎去除首位，取中间段；C、CPPs区域如箭头所示。
图2胚状体(EB)悬滴培养法A、滴加细胞液至培养皿上；B、培养皿倒置培养；C、形成的胚状体肉眼可见；D、显微镜下的胚状体。
图3 CPPs的培养及扩增方案示意图。明场的细胞图片为分别培养2、4和6天的EB。
图4 ABC培养基成分的浓度筛选结果。A、不同浓度组合的三个因子CCK-8结果的热图；B、在最佳的A83-01、bFGF和CHIR99021的浓度下，加入不同浓度HPL后的CCK-8实验结果；C、免疫荧光检测增殖细胞。
图5 CPPs的鉴定：A、免疫荧光鉴定CPPs的三个标志物Isl1、Wnt2和Gli1；B、流式细胞术检测CPPs的三个标志物Isl1、Wnt2和Gli1。
图6 CPPs中检测中胚层标志蛋白Mesp1的表达。A、免疫荧光检测Mesp1阳性的细胞；B、流式细胞术检测Mesp1阳性的细胞。
图7 CPPs向心脏和肺谱系的细胞分化的方案。
图8免疫荧光鉴定CPPs体外诱导分化后的心肌细胞。分别用免疫荧光(A)、流式细胞术(B)和RT-qPCR(C)检测心肌细胞的标志物。
图9免疫荧光鉴定CPPs体外诱导分化后的II型肺泡上皮细胞。分别用免疫荧光(A)、流式细胞术(B)和RT-qPCR(C)检测II型肺泡上皮细胞的标志物。
图10免疫荧光鉴定CPPs体外诱导分化后的内皮细胞。分别用免疫荧光(A)、流式细胞术(B)和RT-qPCR(C)检测内皮细胞的标志物。
图11免疫荧光鉴定CPPs体外诱导分化后的成纤维细胞。分别用免疫荧光(A)、流式细胞术(B)和RT-qPCR(C)检测成纤维细胞的标志物。
图12免疫荧光鉴定CPPs体外诱导分化后的平滑肌细胞。分别用免疫荧光(A)、流式细胞术(B)和RT-qPCR(C)检测平滑肌细胞的标志物。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
在解剖镜下，将第9.5天的C57BL/6(江苏集萃药康生物科技股份有限公司)小鼠胚胎头部和尾部去掉，再将具有CPPs(Cardiopulmonary progenitors，心肺祖细胞)区域分离(图1)，用消化液(0.04％Trypsin和0.05％Collagenase IV)在37℃消化10分钟，中途轻轻颠倒数次。用含FBS的培养基(RPMI 1640培养基)终止消化后，200×g离心5分钟，收集的细胞计数后，用诱导培养胚状体(EB)的方法，进行悬滴培养(图2)，每滴悬液体积为15μl，细胞数为2000个。悬滴培养两天后，改为悬浮培养，用基础培养基中加入12μM的CHIR99021培养一天后，换成基础培养基(RPMI 1640中加入2％B-27without insulin、2mM L-glutamine、1％NEAA、1％penicillin/streptomycin、0.1mMβ-mercaptoethanol)再培养1天，然后将细胞消化成单个细胞悬液，种于铺有0.2％Gelatin胶的培养皿上，用ABC培养基(表1)继续培养，每两天更换一次培养基，直至细胞汇合度大于90％时，按1：3传代。具体培养过程见图3。ABC培养基的组成(体积比)如下：
表1 DMEM/F12基础培养基中配置ABC培养基所添加的试剂及浓度
上述传达代即可得到CPPs细胞，可以传到第八代，第八代后基本没有增殖能力。
实施例2
ABC培养基中，A83-01、bFGF、CHIR99021以及HPL(人血小板裂解物)的浓度筛选结果，见图4。
具体实验如下：
一、ABC培养基中A、B和C(分别是A83-01、bFGF、CHIR99021)三个因子的最适浓度筛选过程及结果解析：
1.筛选过程：
第一天：用基础培养基，将CPPs种在96孔板中，使细胞贴壁后的密度为80％左右；
第二天：将基础培养基换成无因子的ABC培养基(不含A、B、C，以及HPL这些因子)进行饥饿培养24小时；
第三天：将饥饿培养基换成含有因子的ABC培养基，A因子设置3个浓度，B因子设置4个浓度，C因子设置3个浓度，如图4A所示，加入用不同浓度的A、B和C三因子组合(共36种组合)，检测其促进细胞增殖的效果，每种浓度的组合设置6个复孔，继续培养24小时；
第四天：每孔加入20μl的CCK-8，放回培养箱继续培养4小时后，用紫外分光光度计检测450nm处的吸光值，吸光值越高，表示细胞增殖能力越强。
2.结果分析：
将同一组内重复性差的复孔数据去除后，其他复孔取平均值，与其他浓度组合进行比较。由于浓度组合多达36种，所以将每种组合在450nm吸光值的平均值绘制成热图，数值低的呈现为蓝色，数值高的为红色，中间数值是绿色。这样，可将36个数值的大小可视化，如图4A所示，箭头所指的最红的那个方块代表最高的数值，也就是说，它对应的因子浓度组合，能最大程度地使CPPs增殖。这个浓度是：A：1μM，B：50ng/ml，C：12μM。所以，这是A、B和C三个因子的最适浓度。
二、ABC培养基中HPL的最适浓度筛选过程及结果解析：
1.筛选过程：
第一天：用筛选到的A、B和C三个因子的最适浓度配置ABC培养基，将CPPs种在96孔板中，使细胞贴壁后的密度为80％左右；
第二天：将基础培养基换成无因子的ABC培养基(不含A、B、C，以及HPL这些因子)进行饥饿培养24小时；
第三天：将饥饿培养基换成ABC培养基与不同浓度的HPL(0％、1.25％、2.5％和5％)的组合，同时用E8培养基这种商品化的培养基作为对照，每种组合设置6个复孔，继续培养24小时；
第四天：每孔加入20μl的CCK-8，放回培养箱继续培养4小时后，用紫外分光光度计检测450nm处的吸光值，吸光值越高，表示细胞增殖能力越强。
2.结果分析：
将同一组内重复性差的复孔数据去除后，其他复孔取平均值，与其他组合进行比较。以分组为横坐标，平均值为纵坐标，作柱状图，如图4B所示，平均值越高的，代表这个组的细胞增殖能力越强。2.5％和5％的HPL组，平均值都明显高于其他组，并具有统计学差异。所以，说明这两个浓度都能很大程度地刺激细胞增殖，然而，这两个组之间没有统计学差异。所以，最终，选择2.5％的HPL作为加入ABC培养基的第四种因子。
三、用免疫荧光的方法验证ABC培养基中HPL对细胞的增殖效应及结果解析：
1.实验过程：
第一天：将CPPs种于铺有Gelatin胶的共聚焦小皿中；
第二天：将培养基换成无因子的ABC培养基，饥饿培养24小时；
第三天：培养基中加入A、B、C
三个因子，同时，三个皿加入2.5％HPL，另外三个皿不加HPL，继续培养24小时；
第四天：去掉细胞上清，用PBS润洗一次，加入4％多聚甲醛，室温固定10分钟后，用PBS润洗一次，再用0.1％Triton X-100室温孵育10分钟，然后加入5％BSA的封闭液，室温孵育30分钟，最后加入Ki67抗体(1:250稀释)，在4℃孵育过夜；
第五天：去除上清液，加入PBS润洗三次，每次5分钟，然后加入偶联了荧光基团的二抗，室温孵育1小时后，PBS润洗三次，每次5分钟，用DAPI染核后，PBS润洗一次，再加入PBS后，用共聚焦显微镜拍照。
2.结果分析：
图4C所示，绿色显示的是Ki67抗体标记上的细胞，蓝色显示的是被DAPI染色的细胞核。蓝色和绿色同时表达的细胞是正在增殖的细胞，只有蓝色，没有绿色的细胞是没有增殖的细胞。由图4C可以看出，加入2.5％HPL后，免疫荧光染色结果显示，具有增殖能力的细胞明显多于不加HPL组，所以，本实验验证了2.5％的HPL可以促进细胞的增殖。
其中，A、不同浓度组合的三个因子CCK-8结果的热图；B、在最佳的A83-01、bFGF和CHIR99021的浓度下，加入不同浓度HPL后的CCK-8实验结果；C、免疫荧光检测增殖细胞。
此外，发明人还对其他参数和步骤进行了优化，在优化过程中，如果不按照本申请实施例1中所述方法的步骤进行时，例，如不悬滴培养，或者悬滴培养不在46-52小时之内，或者不按照本申请的方式进行悬浮培养，都没有办法得到本申请所述的心肺祖细胞，因得不到，后续实验无法进行。
实施例3
通过实施例1所述制备方法，获得了高纯度的，同时表达Isl1、Wnt2和Gli1的心肺祖细胞(图5)，CPPs的占比是88.9％。
具体实验如下：
一、免疫荧光法鉴定CPPs
1.实验过程：
第一天：将CPPs种于铺有1％Gelatin的共聚焦小皿中；
第二天：去掉细胞上清，用PBS润洗一次，加入4％多聚甲醛，室温固定10分钟后，用PBS润洗一次，再用0.1％Triton X-100室温孵育10分钟，然后加入5％BSA的封闭液，室温孵育30分钟，最后加入Isl1、Wnt2和Gli1抗体(都是1:200稀释)，在4℃孵育过夜；
第三天：去除上清液，加入PBS润洗三次，每次5分钟，然后加入偶联了荧光基团的二抗(1：500稀释)，室温孵育1小时后，PBS润洗三次，每次5分钟，用DAPI染核后，PBS润洗一次，再加入PBS后，用共聚焦显微镜拍照。
2.结果分析：
如图5A所示，绿色、红色和蓝色分别代表Isl1、Wnt2和Gli1抗体检测阳性的细胞，白色代表DAPI染上的细胞核。Merge的图代表不同荧光通道的信号叠加在一起的情况，可以看出，几乎每个细胞都同时呈现绿色、红色、蓝色和白色，表明每个细胞都同时表达了Isl1、Wnt2和Gli1这三个蛋白，所以说，我们获得了高纯度的心肺祖细胞。
二、流式细胞法鉴定CPPs
1.实验过程：
第一天：200×g，离心5分钟，收集细胞，用PBS重悬后，再离心，去掉上清，保留100μl左右的液体，然后加入固定/破膜液，室温孵育1小时后，加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，加入含5％FBS的封闭液，室温孵育15分钟，加入Isl1、Wnt2和Gli1的抗体(1：200稀释)，4℃孵育过夜。
第二天：加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，加入偶联了荧光基团的二抗(1：200稀释)，室温避光孵育1小时后，加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，用PBS重悬，上机检测。
2.结果分析：
如图5B所示，FITC、Alexa Fluor 405和Alexa Fluor 700三个通道分别检测Isl1、Gli1和Wnt2三个蛋白的表达情况，图中横、纵坐标分别表示Gli1和Isl1的表达,色彩轴表示Wnt2的表达：Wnt2有表达，则呈现绿色或红色，Wnt2无表达则是蓝色。由图5B可以看出，同时表达Isl1、Gli1和Wnt2三个蛋白的细胞比例是88.9％，也就是说CPPs的阳性率高达88.9％，验证了我们获得了高纯度的CPPs。
实施例4
在实施例1所制备的ABC培养基的培养下，CPPs传代到第六代还维持了中胚层标志物Mesp1(MESP1 Cardiovascular development mesodermal-associated protein1antibody)的高表达，如图6所示，第一代和第六代的CPPs中，Mesp1的比例分别是94.6％和91.3％。
具体实施操作如下。
一、免疫荧光法鉴定中胚层标志物Mesp1
1.实验过程：
第一天：将CPPs种于铺有1％Gelatin的共聚焦小皿中；
第二天：去掉细胞上清，用PBS润洗一次，加入4％多聚甲醛，室温固定10分钟后，用PBS润洗一次，再用0.1％Triton X-100室温孵育10分钟，然后加入5％BSA的封闭液，室温孵育30分钟，最后加入Mesp1抗体(1:200稀释)，在4℃孵育过夜；
第三天：去除上清液，加入PBS润洗三次，每次5分钟，然后加入偶联了荧光基团的二抗(1：500稀释)，室温孵育1小时后，PBS润洗三次，每次5分钟，用DAPI染核后，PBS润洗一次，再加入PBS后，用共聚焦显微镜拍照。
2.结果分析：
如图6A所示，红色和蓝色分别代表Mesp1抗体检测阳性的细胞，以及被DAPI染上的细胞核。Merge的图代表不同荧光通道的信号叠加在一起的情况，可以看出，几乎每个细胞都同时呈现红色和蓝色，表明几乎每个细胞都表达了Mesp1这个蛋白，所以说，本发明获得的心肺祖细胞保持了中胚层的干性。
二、流式细胞法鉴定Mesp1阳性细胞比例
1.实验过程：
第一天：200×g，离心5分钟，收集细胞，用PBS重悬后，再离心，去掉上清，保留100μl左右的液体，然后加入固定/破膜液，室温孵育1小时后，加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，加入含5％FBS的封闭液，室温孵育15分钟，加入Mesp1的抗体(1：200稀释)，4℃孵育过夜。
第二天：加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，加入偶联了荧光基团的二抗(1：200稀释)，室温避光孵育1小时后，加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，用PBS重悬，上机检测。
2.结果分析：
如图6B所示，CPPs第一代的细胞Mesp1阳性细胞的比例是94.6％，传至第六代后，Mesp1阳性细胞的比例是91.3％，所以说，用ABC培养基传代后，能维持CPPs的干性基因表达。
实施例5
同时，体外培养的CPPs具有同时往心脏和肺谱系的细胞分化的能力(分化方案见图7，分化结果见图8-12)。CPPs在体外能高效地分化成为心肌细胞(图8B，占比75.4％)、II型肺泡上皮细胞(图9B，占比47.9％)、内皮细胞(图10B，占比92.7％)、成纤维细胞(图11B，占比74.7％)和平滑肌细胞(图12B，占比88.5％)。
5.1 CPPs向心脏和肺谱系的细胞分化。
图7显示的是CPPs分化成不同细胞的分化方案。从上到下依次是成纤维细胞(FC)、平滑肌细胞(SMC)、内皮细胞(EC)、心肌细胞(CM)和2型肺泡上皮细胞(AE II)的分化方案。除了AE II细胞的分化是用P0代的CPPs(尚未消化传代的CPPs)，其余细胞的分化用的是P1-P6代的CPPs。除了CM的分化培养基用的是基础培养基，其他细胞的分化用的是未加入因子的ABC培养基，在此基础上，根据图7所示，在不同的时间点加入不同的因子，诱导相应细胞的分化。不同的细胞分化诱导的时间不一样。SMC和EC的诱导时间是6天，而FC、CM和AE II的诱导时间是12天。
如图7所示，诱导分化成纤维细胞的方案是：在ABC培养基(未加入A、B、C三个因子)中，加入10ng/ml的bFGF，每隔两天换液，一直到第12天，收细胞进行检测；2)诱导分化平滑肌细胞(SMC)的方案是：在ABC培养基(未加入A、B、C三个因子)中加入5ng/ml TGFβ后，培养2天，换成含10ng/ml bFGF的ABC培养基(未加入A、B、C三个因子)后，再培养4天(每两天换液)，收细胞检测；3)诱导分化内皮细胞(EC)的方案是：用内皮细胞分化培养基(购于Lonza公司，其中含有hFGF-B、VEGF、Hegf、R3-IGF-1)培养6天(每两天换液)后，收细胞检测；4)诱导心肌细胞(CM)的方案是：在基础培养基中，加入5μM IWP2，5μM purmorphamine，5μMSB431542，培养2天后，换成基础培养基继续培养10天(每两天换液)，收细胞检测；5)诱导2型肺泡上皮细胞(AE II)的方案是：取出来的CPPs用悬滴培养的方法培养两天后，在ABC培养基(未加入A、B、C三个因子)中加入20ng/ml Wnt3a、5ng/ml FGF-10和5ng/ml KGF，继续培养10天(每两天换液)后，收细胞检测。
5.2免疫荧光鉴定CPPs体外诱导分化后的心肌细胞。
具体实施如下。
一、免疫荧光法鉴定CM标志物
1.实验过程：
第一天：将诱导分化后的CPPs种于铺有1％Gelatin的共聚焦小皿中；
第二天：去掉细胞上清，用PBS润洗一次，加入4％多聚甲醛，室温固定10分钟后，用PBS润洗一次，再用0.1％Triton X-100室温孵育10分钟，然后加入5％BSA的封闭液，室温孵育30分钟，最后加入cTnT抗体(1:200稀释)，在4℃孵育过夜；
第三天：去除上清液，加入PBS润洗三次，每次5分钟，然后加入偶联了荧光基团的二抗(1：500稀释)，室温孵育1小时后，PBS润洗三次，每次5分钟，用DAPI染核后，PBS润洗一次，再加入PBS后，用共聚焦显微镜拍照。
2.结果分析：
如图8A所示，红色和蓝色分别代表cTnT抗体检测阳性的细胞，以及被DAPI染上的细胞核。Merge的图代表不同荧光通道的信号叠加在一起的情况，可以看出，呈现红色的细胞代表表达了cTnT这个蛋白的细胞。
二、流式细胞法鉴定CM阳性细胞比例
1.实验过程：
第一天：200×g，离心5分钟，收集细胞，用PBS重悬后，再离心，去掉上清，保留100μl左右的液体，然后加入固定/破膜液，室温孵育1小时后，加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，加入含5％FBS的封闭液，室温孵育15分钟，加入cTnT的抗体(1：200稀释)，4℃孵育过夜。
第二天：加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，加入偶联了荧光基团的二抗(1：200稀释)，室温避光孵育1小时后，加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，用PBS重悬，上机检测。
2.结果分析：
如图8B所示，用CM诱导分化方案分化后的CPPs中cTnT阳性细胞的比例是75.4％。
三、RT-qPCR法鉴定CM的标志物
1.实验过程：
1)将细胞裂解液加入Mini Column中，室温12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
2)向Mini Column中加入500μl的Buffer WA，室温12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
3)向Mini Column中加入750μl的Buffer WB，室温12,000rpm离心1分钟，弃滤液。注)请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100％乙醇。
4)重复步骤3)一次。
5)将Mini Column安置于新的2.0ml Collection Tube上，室温12,000rpm离心2分钟。
6)将Mini Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Mini Column膜的中央处加入50μl Elution Buffer。
或灭菌水，室温静置5分钟，然后室温12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。
7)去除基因组DNA。按照下表配制好反应液，进行基因组DNA去除反应。
组分名称 加入量
gDNA Clean Reagent 1μl
5X gDNA Clean Buffer 2μl
Total RNA 根据RNA浓度确定体积
RNase free water up to 10μl
反应条件：42℃2分钟后4℃保存。
8)反转录反应。配制反转录反应液，置于PCR仪进行变性、退火反应。(注：配制反转录反应液时，为了保证反应液配制的准确性，可将各组分先配制为Master Mix，再分装到反应管中，最后加入RNA样品。反转录反应体系可以根据需要相应调整体积。
组分名称 加入量
步骤7反应液 10μl
Evo M-MLV RTase Enzyme Mix 1μl
Oligo dT(18T)Primer(50μM) 1μl
Random 6mers Primer(100μM) 1μl
5X RTase Reaction Buffer Mix I 4μl
RNase free water 3μl
Total 20μl
反应条件：37℃15分钟后，85℃5秒，4℃保存。
9)定量PCR
经上述反转录过程得到的cDNA可以直接进行定量PCR分析，具体操作如下：
PCR引物序列：
ms-Tnnt2-forward GCAGCAGAAATACGAAATCAACG(SED ID NO.1)
ms-Tnnt2-reversed GGCACAGCTTTGACGAGAAC(SED ID NO.2)
ms-Tnni3-forward ttggatgggctgggctttgaa(SED ID NO.3)
ms-Tnni3-reversed gcagagatcctcactcttcgg(SED ID NO.4)
ms-GATA4-forward aagacaccccaatctcgatatg(SED ID NO.5)
ms-GATA4-reversed gatgccgttcatcttgtgatag(SED ID NO.6)
ms-gapdh-forward CGGGTTCCTATAAATACGGACTG(SED ID NO.7)
ms-gapdh-reversed GAAGGGGTCGTTGATGGCAA(SED ID NO.8)
qPCR扩增程序：
2.结果分析：
如图8C所示，CM的标志基因TNNT2、TnnI3和GATA-4的表达水平相对于诱导前，分别增加到6.18、3.03和9.76倍。
5.3免疫荧光鉴定CPPs体外诱导分化后的II型肺泡上皮细胞。
一、免疫荧光法鉴定AE II标志物
1.实验过程：
1)——8)参考上述RT-qPCR法鉴定CM的标志物中的实验过程；
9)定量PCR
经上述反转录过程得到的cDNA可以直接进行定量PCR分析，具体操作如下：
PCR引物序列：
ms-Scgb1a1-forward AACATCATGAAGCTCACGGAGA(SED ID NO.9)
ms-Scgb1a1-reversed AGACACAGGGCAGTGACAAG(SED ID NO.10)
ms-Cftr-forward TTGCCAACTACAGCAGGACA(SED ID NO.11)
ms-Cftr-reversed GAAATCCTTGCACGCTGACC(SED ID NO.12)
ms-gapdh-forward CGGGTTCCTATAAATACGGACTG(SED ID NO.7)
ms-gapdh-reversed GAAGGGGTCGTTGATGGCAA(SED ID NO.8)
qPCR扩增程序：
2.结果分析：
如图9C所示，AE II的标志基因Scgb1a1和Cftr的表达水平相对于诱导前，分别增加到9.65和21.83倍。
5.4免疫荧光鉴定CPPs体外诱导分化后的内皮细胞。
一、免疫荧光法鉴定EC标志物
1.实验过程：
第一天：将诱导分化后的CPPs(参考实施例4和图7的中SMC的分化方法)种于铺有1％Gelatin的共聚焦小皿中；
第二天：去掉细胞上清，用PBS润洗一次，加入4％多聚甲醛，室温固定10分钟后，用PBS润洗一次，再用0.1％Triton X-100室温孵育10分钟，然后加入5％BSA的封闭液，室温孵育30分钟，最后加入CD31抗体(1:200稀释)，在4℃孵育过夜；
第三天：去除上清液，加入PBS润洗三次，每次5分钟，然后加入偶联了荧光基团的二抗(1：500稀释)，室温孵育1小时后，PBS润洗三次，每次5分钟，用DAPI染核后，PBS润洗一次，再加入PBS后，用共聚焦显微镜拍照。
2.结果分析：
如图10A所示，红色和蓝色分别代表CD31抗体检测阳性的细胞，以及被DAPI染上的细胞核。Merge的图代表不同荧光通道的信号叠加在一起的情况，可以看出，呈现红色的细胞代表表达了CD31这个蛋白的细胞。
二、流式细胞法鉴定EC性细胞比例
1.实验过程：
第一天：200×g，离心5分钟，收集细胞，用PBS重悬后，再离心，去掉上清，保留100μl左右的液体，然后加入固定/破膜液，室温孵育1小时后，加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，加入含5％FBS的封闭液，室温孵育15分钟，加入CD31的抗体(1：200稀释)，4℃孵育过夜。
第二天：加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，加入偶联了荧光基团的二抗(1：200稀释)，室温避光孵育1小时后，加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，用PBS重悬，上机检测。
2.结果分析：
如图10B所示，用EC诱导分化方案分化后的CPPs中CD31阳性细胞的比例是92.7％。
三、RT-qPCR法鉴定EC标志物
1.实验过程：
1)——8)参考上述RT-qPCR法鉴定CM的标志物中的实验过程；
9)定量PCR
经上述反转录过程得到的cDNA可以直接进行定量PCR分析，具体操作如下：
PCR引物序列：
ms-KDR-forward CTACAGACCCGGCCAAACAA(SED ID NO.13)
ms-KDR-reversed CAGCTTGGATGACCAGCGTA(SED ID NO.14)
ms-Pecam1-forward TGAGGAAAGCCAAGGCCAAA(SED ID NO.15)
ms-Pecam1-reversed GGCTTCCACACTAGGCTCAG(SED ID NO.16)
ms-gapdh-forward CGGGTTCCTATAAATACGGACTG(SEQ ID NO.7)
ms-gapdh-reversed GAAGGGGTCGTTGATGGCAA(SEQ ID NO.8)
qPCR扩增程序：
2.结果分析：
如图10C所示，EC的标志基因KDR和PECAM的表达水平相对于诱导前，分别增加到49.81、和1.74倍。
5.5免疫荧光鉴定CPPs体外诱导分化后的成纤维细胞
一、免疫荧光法鉴定FC标志物
1.实验过程：
第一天：将诱导分化后的CPPs(参考实施例4和图7的中描述的SMC的分化方法)种于铺有1％Gelatin的共聚焦小皿中；
第二天：去掉细胞上清，用PBS润洗一次，加入4％多聚甲醛，室温固定10分钟后，用PBS润洗一次，再用0.1％Triton X-100室温孵育10分钟，然后加入5％BSA的封闭液，室温孵育30分钟，最后加入Vimentin抗体(1:200稀释)，在4℃孵育过夜；
第三天：去除上清液，加入PBS润洗三次，每次5分钟，然后加入偶联了荧光基团的二抗(1：500稀释)，室温孵育1小时后，PBS润洗三次，每次5分钟，用DAPI染核后，PBS润洗一次，再加入PBS后，用共聚焦显微镜拍照。
2.结果分析：
如图11A所示，绿色和蓝色分别代表Vimentin抗体检测阳性的细胞，以及被DAPI染上的细胞核。Merge的图代表不同荧光通道的信号叠加在一起的情况，可以看出，呈现绿色的细胞代表表达了Vimentin这个蛋白的细胞。
二、流式细胞法鉴定FC性细胞比例
1.实验过程：
第一天：200×g，离心5分钟，收集细胞，用PBS重悬后，再离心，去掉上清，保留100μl左右的液体，然后加入固定/破膜液，室温孵育1小时后，加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，加入含5％FBS的封闭液，室温孵育15分钟，加入Vimentin的抗体(1：200稀释)，4℃孵育过夜。
第二天：加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，加入偶联了荧光基团的二抗(1：200稀释)，室温避光孵育1小时后，加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，用PBS重悬，上机检测。
2.结果分析：
如图11B所示，用FC诱导分化方案分化后的CPPs中Vimentin阳性细胞的比例是74.7％。
三、RT-qPCR法鉴定FC标志物
1.实验过程：
1)——8)参考上述RT-qPCR法鉴定CM的标志物中的实验过程；
9)定量PCR
经上述反转录过程得到的cDNA可以直接进行定量PCR分析，具体操作如下：
PCR引物序列：
ms-α-SMA-forward CTTCCAGCCATCTTTCATTGG(SEQ ID NO.17)
ms-α-SMA-reversed GTTCTGGAGGGGCAATGAT(SEQ ID NO.18)
ms-gapdh-forward CGGGTTCCTATAAATACGGACTG(SEQ ID NO.7)
ms-gapdh-reversed GAAGGGGTCGTTGATGGCAA(SEQ ID NO.8)
qPCR扩增程序：
2.结果分析：
如图11C所示，FC的标志基因α-SMA的表达水平相对于诱导前，增加到224.93倍。
5.6免疫荧光鉴定CPPs体外诱导分化后的平滑肌细胞。
一、免疫荧光法鉴定SMC标志物
1.实验过程：
第一天：将诱导分化后的CPPs(参考实施例4和图7中分化方法)种于铺有1％Gelatin的共聚焦小皿中；
第二天：去掉细胞上清，用PBS润洗一次，加入4％多聚甲醛，室温固定10分钟后，用PBS润洗一次，再用0.1％Triton X-100室温孵育10分钟，然后加入5％BSA的封闭液，室温孵育30分钟，最后加入α-SMA抗体(1:200稀释)，在4℃孵育过夜；
第三天：去除上清液，加入PBS润洗三次，每次5分钟，然后加入偶联了荧光基团的二抗(1：500稀释)，室温孵育1小时后，PBS润洗三次，每次5分钟，用DAPI染核后，PBS润洗一次，再加入PBS后，用共聚焦显微镜拍照。
2.结果分析：
如图12A所示，红色和蓝色分别代表α-SMA抗体检测阳性的细胞，以及被DAPI染上的细胞核。Merge的图代表不同荧光通道的信号叠加在一起的情况，可以看出，呈现红色的细胞代表表达了α-SMA这个蛋白的细胞。
二、流式细胞法鉴定SMC性细胞比例
1.实验过程：
第一天：200×g，离心5分钟，收集细胞，用PBS重悬后，再离心，去掉上清，保留100μl左右的液体，然后加入固定/破膜液，室温孵育1小时后，加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，加入含5％FBS的封闭液，室温孵育15分钟，加入α-SMA的抗体(1：200稀释)，4℃孵育过夜。
第二天：加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，加入偶联了荧光基团的二抗(1：200稀释)，室温避光孵育1小时后，加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，保留100μl左右的液体，再加入破膜工作液，涡旋几秒后，离心，去上清，用PBS重悬，上机检测。
2.结果分析：
如图12B所示，用SMC诱导分化方案分化后的CPPs中α-SMA阳性细胞的比例是88.5％。
三、RT-qPCR法鉴定SMC标志物
1)——8)参考上述RT-qPCR法鉴定CM的标志物中的实验过程；
9)定量PCR
经上述反转录过程得到的cDNA可以直接进行定量PCR分析，具体操作如下：
PCR引物序列：
ms-PDGFRα-forwardGTCGGATTTTGGGATCCGGT(SEQ ID NO.19)
ms-PDGFRα-reversed GACCTGGCTGTGGGTTTGAG(SEQ ID NO.20)
ms-MYH11-forward CCTCAAGAGCAAACTCAGGAGA(SEQ ID NO.21)
ms-MYH11-reversed TCCCTGACATGGTGTCCAATC(SEQ ID NO.22)
ms-α-SMA-forward CTTCCAGCCATCTTTCATTGG(SEQ ID NO.17)
ms-α-SMA-reversed GTTCTGGAGGGGCAATGAT(SEQ ID NO.18)
ms-gapdh-forward CGGGTTCCTATAAATACGGACTG(SEQ ID NO.7)
ms-gapdh-reversed GAAGGGGTCGTTGATGGCAA(SEQ ID NO.8)
qPCR扩增程序：
2.结果分析：
如图12C所示，SMC的标志基因MYH11、α-SMA和PDGFRα的表达水平相对于诱导前，分别增加到1433.18、283.07和7.50倍。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州医科大学
<120> 心肺祖细胞及其制备方法和应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagcagaaa tacgaaatca acg 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcacagctt tgacgagaac 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttggatgggc tgggctttga a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcagagatcc tcactcttcg g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagacacccc aatctcgata tg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatgccgttc atcttgtgat ag 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgggttccta taaatacgga ctg 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggggtcg ttgatggcaa 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aacatcatga agctcacgga ga 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agacacaggg cagtgacaag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgccaacta cagcaggaca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaaatccttg cacgctgacc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctacagaccc ggccaaacaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagcttggat gaccagcgta 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgaggaaagc caaggccaaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggcttccaca ctaggctcag 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
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<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttctggagg ggcaatgat 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctcaagagc aaactcagga ga 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tccctgacat ggtgtccaat c 21

Claims (8)

1.一种心肺祖细胞的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
（1） 将第9.5天的C57BL/6小鼠胚胎头部和尾部去掉，再将心肺祖细胞所在区域分离出来；
（2）用消化液对心肺祖细胞所在区域进行消化，离心，收集细胞；
（3）用诱导培养胚状体的方法，进行悬滴培养46-52小时；
（4）悬浮培养，在基础培养基中加入12μM CHIR99021培养24±2小时后，换成基础培养基培养24±2小时，然后将细胞消化成单个细胞悬液，种于铺有明胶的培养皿上；所述基础培养基由RPMI 1640中加入2±0.1% B-27 、2±0.1 mM L-谷氨酰胺、1±0.1% NEAA、1±0.1%青霉素/链霉素、0.1±0.01 mMβ-巯基乙醇组成；
（5）用ABC培养基继续培养，每两天更换一次培养基，直至细胞汇合度大于90%时，按1：3-4的比例进行传代，即得；所述ABC培养基由不含维生素 A 的1.5-2.5%的B-27，1.5-2.5mM的L-谷氨酰胺，0.8-1.2%的非必需氨基酸，0.08-0.12mM的β-巯基乙醇，0.8-1.2 µM的A83-01，45-55 ng/ml的bFGF，10-14 µM的CHIR-99021，2.0-5.0%的人血小板裂解物组成。
2.根据权利要求1所述的心肺祖细胞的制备方法，其特征是，所述ABC培养基由不含维生素 A 的2±0.1% 的B-27，2±0.1 mM的L-谷氨酰胺，1±0.1%的非必需氨基酸，0.1±0.01mM的β-巯基乙醇，1±0.1µM的A83-01，50±0.5ng/ml的bFGF，12±1 µM的CHIR-99021，2.5±0.1%的人血小板裂解物组成。
3.根据权利要求1所述的心肺祖细胞的制备方法，其特征是，所述消化液为0.03-0.05%胰蛋白酶和0.04-0.06%胶原酶IV。
4.根据权利要求1所述的心肺祖细胞的制备方法，其特征是，步骤（2）中，在37±1℃消化10±1分钟，中途轻轻颠倒数次；用含FBS的培养基终止消化后，离心，收集的细胞计数后，用诱导培养胚状体的方法，进行悬滴培养，每滴悬液的细胞数为2000个。
5.根据权利要求1所述的心肺祖细胞的制备方法，其特征是，步骤（4）中，悬浮培养：在基础培养基中加入12μM CHIR99021培养24小时后，换成基础培养基培养24小时，然后将细胞消化成单个细胞悬液，种于铺有0.2%明胶的培养皿上。
6.根据权利要求1-5任一项所述制备方法得到的心肺祖细胞。
7.一种ABC培养基，其特征是，其由不含维生素 A 的1.5-2.5%的B-27，1.5-2.5 mM的L-谷氨酰胺，0.8-1.2%的非必需氨基酸，0.08-0.12mM的β-巯基乙醇，0.8-1.2 µM的A83-01，45-55ng/ml的bFGF，10-14 µM的CHIR-99021，2.0-3.0%的人血小板裂解物组成。
8.根据权利要求7所述ABC培养基，其特征是，所述ABC培养基由不含维生素 A 的2±0.1% 的B-27，2±0.1 mM的L-谷氨酰胺，1±0.1%的非必需氨基酸，0.1±0.01mM的β-巯基乙醇，1±0.1µM的A83-01，50±0.5ng/ml的bFGF，12±1µM的CHIR-99021，2.5±0.1%的人血小板裂解物组成。
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