CN114990065A - 神经干细胞的定向诱导剂、诱导方法及应用 - Google Patents

神经干细胞的定向诱导剂、诱导方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种神经干细胞的定向诱导剂、诱导方法及应用，涉及细胞培养技术领域，本发明的发明人通过强化既有分化方法的优点，并尽量规避其不足，经过大量测试发现，采用二甲双胍和特定细胞因子作为双组份的神经干细胞的定向诱导剂，比市面上常见的化学诱导剂安全性高，且能够在降低成本的基础上，有效提高安全性和定向诱导分化效率。本发明提供的定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化的方法方便快捷，通过两步分段诱导，可建立一种新的高效、稳定的神经干细胞定向诱导方法。

Description

神经干细胞的定向诱导剂、诱导方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种神经干细胞的定向诱导剂、诱导方法及应用。
背景技术
神经干细胞是指存在于神经系统中的一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，具有分化为神经元和星形胶质细胞潜能，可促进脑组织新生；此外，神经干细胞还可通过旁分泌作用对受损的脑组织进行修复。科学证据表明，有多种神经退行性疾病的主要特征均为在大脑特点区域发生神经元丢失，且具有进行性特征，因此如能植入合格的外源性神经干细胞，则补充的外源神经干细胞就有可能弥补因疾病损失的神经元，从而达到治疗目的。但目前已建立的神经干细胞系多来源于非人物种，不但具有较大的种属差异，还在人体内易成瘤，人源神经干细胞来源显著不足，临床急需一种来源广、不易成瘤、干性强的神经干细胞。
通常，间充质干细胞的定向分化主要是基于特定基因的选择性诱导表达或差异性增加，从而控制细胞表型和蛋白质的特异型分布。因此分化细胞类型的主要决定性因素是细胞本身的分化潜能，以及外部微环境中各种因子的组成和浓度。同样，人源间充质干细胞具有分化为神经干细胞的潜能。在诱导方法上，目前报道的主要有：1)化学诱导法，如β-巯基乙醇，二甲基亚砜，丁基羟基茴香醚等；2)生长因子诱导法，如表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF；神经生长因子NGF，视黄酸RA等；3)条件培养基法；4)基因转染法等。
上述方法虽然都能在一定程度上诱导间充质干细胞向神经干细胞定向分化，但也都存在可进一步改进的潜能，如传统的化学诱导法虽然可以高效快速的完成诱导，但其细胞存活率较低，且化学诱导剂具有一定的毒性，用于体内移植具有一定的风险。生长因子诱导法虽细胞存活率高但诱导效率较低；如使用类体内条件培养基，则具有较高的成本；而基因编辑法不但成本高且涉及基因的改变，具有一定脱靶性，具有较大非预期效应和成瘤风险。如何在降低成本的基础上，提高安全性和定向诱导分化效率成为亟待解决的难题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种神经干细胞的定向诱导剂，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的目的之二在于提供上述神经干细胞的定向诱导剂在定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化中的应用。
本发明的目的之三在于提供一种定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，包括组分A和组分B；
所述组分A包括细胞因子EGF、bFGF、FGF4、BDNF、NTF3、VEGF、NGF、KGF和GDNF中的一种或多种；
所述组分B包括二甲双胍。
进一步的，所述组分A中各细胞因子的浓度均独立地为5-100ng/mL，优选为10ng/mL。
进一步的，所述二甲双胍的浓度为20-150mM，优选为100mM。
进一步的，所述组分A包括如下(a)～(i)中的任一种：
(a)EGF+bFGF；
(b)EGF+bFGF+NFT3；
(c)EGF+bFGF+BDNF；
(d)EGF+bFGF+BDNF+NGF；
(e)EGF+bFGF+BDNF+NFT3；
(f)EGF+bFGF+BDNF+NFT3+KGF；
(g)EGF+bFGF+BDNF+NFT3+GDNF；
(h)EGF+bFGF+BDNF+VEGF；
(i)EGF+bFGF+BDNF+FGF4。
本发明还提供了上述的神经干细胞的定向诱导剂在定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化中的应用。
此外，本发明还提供了一种定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化的方法，利用上述的神经干细胞的定向诱导剂分阶段诱导多能干细胞分化得到神经干细胞；
所述分阶段诱导包括在第一诱导阶段使用组分A进行诱导，在第二诱导阶段使用组分B进行诱导。
进一步的，所述第一诱导阶段和第二诱导阶段均独立地为5～7天。
进一步的，在进行第一诱导阶段培养时，每2～4天换液一次；
在进行第二诱导阶段培养时，每2～4天换液一次。
进一步的，在第一诱导阶段向基础培养基中加入组分A进行培养；
在第二诱导阶段向基础培养基中加入组分B进行培养；
所述基础培养基包括DMEM培养基、DMEM/F12培养基、MEM培养基或者1640培养基；
优选地，所述第二诱导阶段的基础培养基中还包括血清和/或抗生素。
进一步的，所述多能干细胞包括间充质干细胞，优选为P5代间充质干细胞。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
本发明的发明人通过强化既有分化方法的优点，并尽量规避其不足，经过大量测试，最终发现，采用二甲双胍(Metformin)和特定细胞因子作为双组份的神经干细胞的定向诱导剂，比市面上常见的化学诱导剂安全性高，且能够在降低成本的基础上，有效提高安全性和定向诱导分化效率。
本发明提供的定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化的方法方便快捷，通过两步分段诱导，可建立一种新的高效、稳定的神经干细胞定向诱导方法，仅花费10-14天即可成功诱导间充质干细胞成神经干细胞分化，诱导分化效率高，对于诱导神经元分化和后续的应用具有较高的参考价值，且成本较低，可用于较大规模的生产培养基，适用于推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例提供的使用流式细胞仪检测间充质干细胞标志物的结果图；
图2为本发明实验例提供的使用酶标仪在492nm波长时测各细胞因子组合的吸光度值；
图3为本发明实验例提供的分段诱导的流程示意图；
图4为本发明实验例提供的EGF+bFGF+BDNF组+100mM二甲双胍免疫荧光染色的结果图；
图5为本发明实验例提供的RT-qPCR的结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，包括组分A和组分B；
所述组分A包括细胞因子EGF、bFGF、FGF4、BDNF、NTF3、VEGF、NGF、KGF和GDNF中的一种或多种；
所述组分B包括二甲双胍。
细胞因子是一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，能够调节细胞生长、分化和效应。本发明的发明人经过大量实验，最终选定EGF、bFGF、FGF4、BDNF、NTF3、VEGF、NGF、KGF和GDNF中的一种或多种作为诱导剂，诱导人源间充质干细胞向神经干细胞定向分化。
二甲双胍是一种治疗糖尿病的临床药物，是一种安全的天然化合物，本发明的发明人创造性地发现，将二甲双胍和特定的细胞因子作为双组份配合使用，能够高效、稳定地定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化。
本发明的发明人通过强化既有分化方法的优点，并尽量规避其不足，经过大量测试，最终发现，采用二甲双胍(Metformin)和特定细胞因子作为双组份的神经干细胞的定向诱导剂，比市面上常见的化学诱导剂安全性高，且能够在降低成本的基础上，有效提高安全性和定向诱导分化效率。
在一些优选的实施方式中，所述组分A中各细胞因子的使用浓度均独立地为5-100ng/mL。例如可以为，但不限于5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，优选浓度为10ng/ml。
在另一些优选的实施方式中，所述二甲双胍的使用浓度为20-150mM。例如可以为，但不限于20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM或150mM，优选浓度为100mM。
为了取得更好的定向分化效果，发明人将A组分中的细胞因子进行特定的组合，得到如下(a)～(i)：
(a)EGF+bFGF；
(b)EGF+bFGF+NFT3；
(c)EGF+bFGF+BDNF；
(d)EGF+bFGF+BDNF+NGF；
(e)EGF+bFGF+BDNF+NFT3；
(f)EGF+bFGF+BDNF+NFT3+KGF；
(g)EGF+bFGF+BDNF+NFT3+GDNF；
(h)EGF+bFGF+BDNF+VEGF；
(i)EGF+bFGF+BDNF+FGF4。
应用上述(a)～(i)任意组合的细胞因子作为本发明神经干细胞的定向诱导剂的A组分，与B组分配合使用，均能增强多能干细胞定向诱导神经分化能力，具有耗时短，毒性低，分化效率高的优点，适于临床应用。
基于上述神经干细胞的定向诱导剂的有益效果，本发明还提供了该神经干细胞的定向诱导剂在定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化中的应用。
此外，本发明还提供了一种定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化的方法，利用上述的神经干细胞的定向诱导剂分阶段诱导多能干细胞分化得到神经干细胞；
所述分阶段诱导包括在第一诱导阶段使用组分A进行诱导，在第二诱导阶段使用组分B进行诱导。
本发明提供的定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化的方法方便快捷，通过两步分段诱导，可建立一种新的高效、稳定的神经干细胞定向诱导方法，仅花费10-14天即可成功诱导间充质干细胞成神经干细胞分化，诱导分化效率高，对于诱导神经元分化和后续的应用具有较高的参考价值，且成本较低，可用于较大规模的生产培养基，适用于推广。
在一些优选的实施方式中，所述第一诱导阶段和第二诱导阶段均独立地为5～7天。例如，第一诱导阶段的培养时间可以为5天、6天或7天，第二诱导阶段的培养时间可以为5天、6天或7天，第一诱导阶段的培养时间可以和第二诱导阶段的培养时间可以相同，也可以不同，本实施方式不作具体限定。
其中，在进行第一诱导阶段培养时，每2～4天换液一次，例如可以为，但不限于2天、3天或4天；在进行第二诱导阶段培养时，每2～4天换液一次，例如可以为，但不限于2天、3天或4天。第一诱导阶段的培养时间和第二诱导阶段的换液频次可以相同，也可以不同，本实施方式不作具体限定。
在一些优选的实施方式中，在第一诱导阶段向基础培养基中加入组分A进行培养；
在第二诱导阶段向基础培养基中加入组分B进行培养；
需要说明的是，在进行第二诱导阶段培养时，先将第一诱导阶段培养所用的包含组分A的培养基舍弃，然后再加入包含组分B的培养基进行培养。
其中，所述基础培养基包括DMEM培养基、DMEM/F12培养基、MEM培养基或者1640培养基；
作为优选，所述第二诱导阶段的基础培养基中还包括血清和/或抗生素。
通过添加血清能够为细胞生长提供营养物质，进一步促进细胞的生长；抗生素能够大大降低细胞污染的风险。其中，血清和抗生素可以同时添加，也可以单独添加血清或单独添加抗生素。
在一些优选的实施方式中，所述多能干细胞包括间充质干细胞，优选为P5代间充质干细胞。本发明发现，在前3代细胞中，干细胞存在异常核型的比例偏高，干细胞基因组有着不稳定的因素，就如间充质干细胞而言，用于诱导的最佳稳定代数应该在4～6代，更高代次的间充质干细胞具有老化的可能，因此作为优选，选用干性强且稳定的5代细胞。
在一些具体的实施方式中，定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化的方法包括如下步骤：
(1)使用干细胞培养液培养间充质干细胞至60％-80％密度时进行传代，此时仍用常规DMEM干细胞培养基培养。
(2)培养细胞密度至90％时，进行消化接种到96孔板，待细胞贴壁后添加组分A，用96孔板培养24h。
(3)分段培养细胞，提高其增殖能力以及神经分化能力：
S1、24孔板培养P5代间充质干细胞，在DMEM基础培养基中添加组分A，每种因子的浓度为5-100ng/mL；第一诱导阶段培养7天，每3天换一次液；
S2、吸去原有的培养基，换为DMEM/F12培养基，并在培养基中添加组分B，作为第二步主要诱导剂，优选最终浓度为20-100mM。第二诱导阶段培养7天，每3天换一次液。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，包括组分A和组分B；
组分A包括EGF+bFGF，EGF和bFGF的使用浓度为10ng/ml；
组分B包括使用浓度为100mM的二甲双胍。
实施例2
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，包括组分A和组分B；
组分A包括EGF+bFGF+NFT3，EGF、bFGF和NFT3的使用浓度为10ng/ml；
组分B包括使用浓度为100mM的二甲双胍。
实施例3
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，包括组分A和组分B；
组分A包括EGF+bFGF+BDNF，EGF、bFGF和BDNF的使用浓度为10ng/ml；
组分B包括使用浓度为100mM的二甲双胍。
实施例4
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，包括组分A和组分B；
组分A包括EGF+bFGF+BDNF+NGF，EGF、bFGF、BDNF和NGF的使用浓度为10ng/ml；
组分B包括使用浓度为100mM的二甲双胍。
实施例5
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，包括组分A和组分B；
组分A包括EGF+bFGF+BDNF+NFT3，EGF、bFGF、BDNF和NFT3的使用浓度为10ng/ml；
组分B包括使用浓度为100mM的二甲双胍。
实施例6
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，包括组分A和组分B；
组分A包括EGF+bFGF+BDNF+NFT3+KGF，EGF、bFGF、BDNF、NFT3和KGF的使用浓度为10ng/ml；
组分B包括使用浓度为100mM的二甲双胍。
实施例7
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，包括组分A和组分B；
组分A包括EGF+bFGF+BDNF+NFT3+GDNF，EGF、bFGF、BDNF、NFT3和GDNF的使用浓度为10ng/ml；
组分B包括使用浓度为100mM的二甲双胍。
实施例8
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，包括组分A和组分B；
组分A包括EGF+bFGF+BDNF+VEGF，EGF、bFGF、BDNF和VEGF的使用浓度为10ng/ml；
组分B包括使用浓度为100mM的二甲双胍。
实施例9
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，包括组分A和组分B；
组分A包括EGF+bFGF+BDNF+FGF4，EGF、bFGF、BDNF和FGF4的使用浓度为10ng/ml；
组分B包括使用浓度为100mM的二甲双胍。
实施例10
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，与实施例3的不同之处在于，二甲双胍的使用浓度为20mM。
实施例11
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，与实施例3的不同之处在于，二甲双胍的使用浓度为150mM。
实施例12
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，与实施例3的不同之处在于，EGF的使用浓度为120ng/mL，bFGF的使用浓度为80ng/mL，BDNF的使用浓度为的使用浓度为55ng/mL。
实施例13
本实施例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，与实施例3的不同之处在于，二甲双胍的使用浓度为160mM。
对比例1
本对比例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，与实施例3的不同之处在于，不使用二甲双胍。
对比例2
本对比例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，包括使用浓度为100mM的二甲双胍。
对比例3
本对比例提供了一种神经干细胞的定向诱导剂，与实施例3的不同之处在于，使用苯乙双胍替换二甲双胍。
实验例
1、间充质干细胞的复苏和扩增：
(1)使用4mL常规干细胞培养基在培养瓶中复苏P3代的间充质干细胞。
(2)将培养箱中的培养瓶取出观察细胞生长状况，当间充质干细胞在培养瓶的融合率达到95％时，使用0.2％的胰酶进行消化传代，一般来说每代细胞培养3天后即可传代。
(3)当细胞密度至95％左右时，弃去培养基，用PBS冲洗两次，加胰酶消化，将培养瓶横置，来回晃动使胰酶覆盖整个瓶底，放入37℃恒温细胞培养箱中，1分30秒后取出培养瓶，在显微镜下观察，细胞成片脱离瓶底时终止消化，将细胞悬液移入15mL离心管，1000g离心5min，弃去上清，加入培养基重悬细胞，移入培养瓶，完成传代过程，标记为P4代细胞。
(4)流式细胞仪检测干细胞标记物
当P4代细胞融合率达70％，按下表1添加因子，24h后使用流式细胞仪检测间充质干细胞标志物。
表1
Figure BDA0003644399050000121
结果详见图1以及表2，添加诱导物后，P4代间充质干细胞中间充质干细胞阳性标志物CD73阳性细胞数为99.91％，CD90阳性细胞数为99.85％，CD105阳性细胞数为100.00％，间充质干细胞阴性标志物CD34阳性细胞数为0.03％，CD11b阳性细胞数为0.03％，CD19阳性细胞数为0.05％，CD45阳性细胞数为0.10％，HLA-DR阳性细胞数为0.15％，由此说明，在二甲双胍和细胞因子的诱导下，干细胞主要标志物并无改变，因此仍可定义为间充质干细胞。
表2
阳性标记物 百分比
CD73 99.91％
CD90 99.85％
CD105 100.00％
阴性标记物 百分比
CD34 0.05％
CD11b 0.03％
CD19 0.03％
CD45 0.10％
HLA-DR 0.15％
2、细胞因子组合的筛选：
将P5代的间充质干细胞接种于96孔板中，接种密度为1×105个每孔，每孔100微升，当细胞贴壁后，加入本发明实施例1-9及12中的组分A，对照组加入DMEM完全培养基，当细胞融合率达80％左右时，每孔加入20微升MTT溶液，4h后，吸取孔内液体，加入150微升DMSO溶液，使用酶标仪在492nm波长时测吸光度值。结果如图2所示，说明添加因子组合的组别均具有高于不添加任何因子的对照组的细胞增殖，其中(1)实施例5提供的EGF+bFGF+BDNF+NFT3，(2)实施例3提供的EGF+bFGF+BDNF，(3)实施例8提供的EGF+bFGF+BDNF+VEGF，(4)实施例4提供的EGF+bFGF+BDNF+NGF，(5)实施例9提供的EGF+bFGF+BDNF+FGF4，为细胞增殖最高的5个组合，为了节约实验成本，将上述5组用于进一步的神经诱导方案。
3、间充质干细胞的神经分化诱导(如图3所示)：
第一步：取一瓶长满的P5代间充质干细胞，1mL胰酶进行消化，2mL完全培养基终止消化，1000g离心5min后24mL培养基重悬，接种到24孔板里，每孔加入1mL培养基，当细胞贴壁后加入因子组合诱导，组别设置空白组为含有10％FBS，1％双抗的DMEM完全培养基，实验组和对照组分别添加5种因子组合，分别为：
1)EGF+bFGF+BDNF+NFT3、
2)EGF+bFGF+BDNF、
3)EGF+bFGF+BDNF+VEGF、
4)EGF+bFGF+BDNF+NGF、
5)EGF+bFGF+BDNF+FGF4；
空白实验组不添加细胞因子。第二步：实验组吸去原有培养基，分别换成含有20mM、100mM、150mM和160mM二甲双胍的DMEM完全培养基，DMEM完全培养基含有10％FBS，1％双抗，每孔的最终浓度分别为20mM、100mM、150mM和160mM，空白实验组吸去原有培养基换成含有100mM二甲双胍的DMEM完全培养基，对照组1将培养基更换为DMEM完全培养基，对照组2吸去原有培养基换成100mM苯乙双胍，空白组使用DMEM完全培养基。第二步诱导时间为7天，3天换一次液。
4、免疫荧光染色
弃去上述诱导14d后的24孔板中的培养基，用PBS轻轻洗涤2次，每孔加入100微升胰酶，加入400微升培养基终止消化，加入1.5mL ep管后1000g离心5min，离心后弃去上清，1mL培养基重悬，每管取100微升接入新的24孔板用于GFAP染色，另取100微升用于NESTIN染色。24h后进行免疫荧光染色。用4％多聚甲醛室温下固定20min，用PBS在室温下洗涤2次，加入按比例GFAP、NESTIN稀释一抗，4℃过夜孵育，PBS洗涤两次，加入二抗常温孵育，1h后吸去，PBS洗涤两次，DAPI染料常温孵育15min后PBS洗，于荧光导致显微镜下拍照观察，为便于观察选择EGF+bFGF+BDNF组展示结果图，结果如图4所示，其中荧光亮度代表表达蛋白的强度。
5、RT-qPCR
弃去上述诱导14d后的24孔板中的培养基，用PBS轻轻洗涤2次，每孔加入100微升胰酶，加入400微升培养基终止消化，加入1.5mL ep管后1000g离心5min，离心后弃去上清，1mL培养基重悬，取800微升离心后用PBS重悬，反复洗涤两次，加入200微升Trizol裂解液用于提取RNA。将150微升的异丙醇加入Trizol中，上下颠倒，溶液变为均匀的粉色乳浊液后静置2-3min，分层后4℃，12000rpm离心10min，取上清液到新的1.5mL ep管中，加入三氯甲烷150微升，静置10min后4℃，12000rpm离心10min,弃去上清，加入100微升无水乙醇洗涤两次，待酒精挥发后用DEPC水溶解RNA，Nanodrop系统测浓度，根据浓度加入反转录体系，反转录后根据说明书加入引物，Mix，目的基因进行荧光定量qPCR系统检测。根据目的基因的Ct值进行数据分析，结果如图5，NESTIN和GFAP免疫荧光染色的表现均为绿色，显色阳性。
结果：加入含有100mM二甲双胍以及生长因子组合的DMEM培养基进行分段诱导，qPCR结果显示在第二组中Met分段诱导的组别比对照组神经标志蛋白NESTIN和GFAP的表达具有同步的增加，免疫荧光染色图进一步验证了Met分段诱导的NESTIN和GFAP蛋白表达比单独诱导的高，表现在绿色荧光的增强，NESTIN成丝状散布在整个细胞里，GFAP则呈胶状纤维丝散布在细胞里，证明Met分段诱导的优势性，提供一种新的神经诱导培养基的制备方法。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种神经干细胞的定向诱导剂，其特征在于，包括组分A和组分B；
所述组分A包括细胞因子EGF、bFGF、FGF4、BDNF、NTF3、VEGF、NGF、KGF和GDNF中的一种或多种；
所述组分B包括二甲双胍。
2.据权利要求1所述的神经干细胞的定向诱导剂，其特征在于，所述组分A中各细胞因子的使用浓度均独立地为5-100ng/mL，优选为10ng/mL。
3.根据权利要求1所述的神经干细胞的定向诱导剂，其特征在于，所述二甲双胍的使用浓度为20-150mM，优选为100mM。
4.根据权利要求1-3任一项所述的神经干细胞的定向诱导剂，其特征在于，所述组分A包括如下(a)～(i)中的任一种：
(a)EGF+bFGF；
(b)EGF+bFGF+NFT3；
(c)EGF+bFGF+BDNF；
(d)EGF+bFGF+BDNF+NGF；
(e)EGF+bFGF+BDNF+NFT3；
(f)EGF+bFGF+BDNF+NFT3+KGF；
(g)EGF+bFGF+BDNF+NFT3+GDNF；
(h)EGF+bFGF+BDNF+VEGF；
(i)EGF+bFGF+BDNF+FGF4。
5.权利要求1-4任一项所述的神经干细胞的定向诱导剂在定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化中的应用。
6.一种定向诱导多能干细胞向神经干细胞分化的方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一项所述的神经干细胞的定向诱导剂分阶段诱导多能干细胞分化得到神经干细胞；
所述分阶段诱导包括在第一诱导阶段使用组分A进行诱导，在第二诱导阶段使用组分B进行诱导。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一诱导阶段和第二诱导阶段均独立地为5～7天。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在进行第一诱导阶段培养时，每2～4天换液一次；
在进行第二诱导阶段培养时，每2～4天换液一次。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在第一诱导阶段向基础培养基中加入组分A进行培养；
在第二诱导阶段向基础培养基中加入组分B进行培养；
所述基础培养基包括DMEM培养基、DMEM/F12培养基、MEM培养基或者1640培养基；
优选地，所述第二诱导阶段的基础培养基中还包括血清和/或抗生素。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞包括间充质干细胞，优选为P5代间充质干细胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115595307A (zh) * 2022-12-15 2023-01-13 内蒙古创润生物科技有限公司（Cn） 一种将间充质干细胞诱导为神经干细胞的方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103031275A (zh) * 2012-11-30 2013-04-10 陆华 脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法
US20150111225A1 (en) * 2013-10-17 2015-04-23 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Method for in vitro differentiation of blood circulating cells into neuronal-like cells and applications thereof
CN104974978A (zh) * 2015-08-05 2015-10-14 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种内皮细胞培养基及内皮细胞的培养方法
US20160272939A1 (en) * 2013-11-01 2016-09-22 Bbhc Co., Ltd. Method for Differentiating Pluripotent Stem Cell Induced from Mesenchymal Stem Cell Into Neuron
CN109266609A (zh) * 2018-09-30 2019-01-25 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种培养基及其在诱导羊膜间充质干细胞向神经样细胞分化中的应用
US20190321399A1 (en) * 2018-04-24 2019-10-24 Xuanwu Hospital Capital Medical University Uses of induced neural stem cells derived from peripheral blood mononuclear cells
CN112190596A (zh) * 2020-09-14 2021-01-08 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 一种用于治疗关节炎的间充质干细胞制剂及其制备方法
CN112662624A (zh) * 2021-02-06 2021-04-16 成都吱吖科技有限公司 一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基
CN112795541A (zh) * 2020-11-18 2021-05-14 天津市康婷生物工程集团有限公司 一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法
CN113481152A (zh) * 2021-07-12 2021-10-08 中科博赛干细胞再生医学科技(广州)有限公司 间充质干细胞旁分泌因子的制备方法及旁分泌因子应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103031275A (zh) * 2012-11-30 2013-04-10 陆华 脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法
US20150111225A1 (en) * 2013-10-17 2015-04-23 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Method for in vitro differentiation of blood circulating cells into neuronal-like cells and applications thereof
US20160272939A1 (en) * 2013-11-01 2016-09-22 Bbhc Co., Ltd. Method for Differentiating Pluripotent Stem Cell Induced from Mesenchymal Stem Cell Into Neuron
CN104974978A (zh) * 2015-08-05 2015-10-14 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种内皮细胞培养基及内皮细胞的培养方法
US20190321399A1 (en) * 2018-04-24 2019-10-24 Xuanwu Hospital Capital Medical University Uses of induced neural stem cells derived from peripheral blood mononuclear cells
CN109266609A (zh) * 2018-09-30 2019-01-25 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种培养基及其在诱导羊膜间充质干细胞向神经样细胞分化中的应用
CN112190596A (zh) * 2020-09-14 2021-01-08 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 一种用于治疗关节炎的间充质干细胞制剂及其制备方法
CN112795541A (zh) * 2020-11-18 2021-05-14 天津市康婷生物工程集团有限公司 一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法
CN112662624A (zh) * 2021-02-06 2021-04-16 成都吱吖科技有限公司 一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基
CN113481152A (zh) * 2021-07-12 2021-10-08 中科博赛干细胞再生医学科技(广州)有限公司 间充质干细胞旁分泌因子的制备方法及旁分泌因子应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHANGLIN CAI等: "Chitosan Hydrogel Supplemented with Metformin Promotes Neuron–like Cell Differentiation of Gingival Mesenchymal Stem Cells", 《INT J MOL SCI.》, vol. 23, no. 6 *
TONG LEI等: "Metformin enhances the osteogenesis and angiogenesis of human umbilical cord mesenchymal stem cells for tissue regeneration engineering", 《INT J BIOCHEM CELL BIOL . 》, pages 106086 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115595307A (zh) * 2022-12-15 2023-01-13 内蒙古创润生物科技有限公司（Cn） 一种将间充质干细胞诱导为神经干细胞的方法

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