CN112795541A - 一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法 - Google Patents

一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，包括：⑴取第3代人脐带间充质干细胞培养；⑵用DF12、2％血清，双抗共培养24小时后流式检测；⑶用含2％血清、2％B27、DF12、20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、1mM IBMX、35ng/mL dbcAMP共培养诱导成神经干细胞，之后添加分化因子；⑷使用免疫荧光和荧光定量PCR检测Nestin、PAX6、SOX1、SOX2四种神经干细胞的标志物的表达；⑸使用免疫荧光技术和荧光定量PCR技术检测神经胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物MAP‑2的表达。本发明多因子联合使用并优化添加量，可以同时分化神经元和星角质细胞，标志物高表达，提高脐带间充质干细胞诱导神经干细胞的诱导率，从而有益于获得神经干细胞而用于治疗神经元损伤的疾病。

Description

一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶 质细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及脐带间充质干细胞诱导技术，尤其是一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法。
背景技术
随着我国人民生活日益富足人口老龄化问题凸显，越来越多的老年人患上神经损伤疾病，例如帕金森症、阿尔茨海默症还有脑血栓等局部神经损伤和凋亡的疾病。目前临床上仍无有效的治疗方法用于改善患者的神经功能缺陷，只能缓解症状或者延缓病情的加重。实验证明神经干细胞移植能够改善神经元损伤性疾病的恢复。
目前神经干细胞主要从胚胎干细胞诱导或是直接从发育中和成年哺乳动物的中枢神经系统中分离培养获得。但是伦理学、安全性问题以及细胞来源和数量均有限,在一定程度上都限制了神经干细胞的移植应用。因此,很有必要寻找其它能够获得神经干细胞的途径来克服这些限制。
有研究表明脐带被发现可以作为间充质干细胞的理想来源,将脐带诱导神经干细胞，但是脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞诱导率低，并且成功率也低，诱导的神经干细胞不具有分化功能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种诱导率高并且神经干细胞具有分化成神经元和胶质细胞的功能的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，具体方法步骤如下：
⑴取第3代人脐带间充质干细胞，以3000密度接种于培养瓶上；
⑵用DF12、2％血清，双抗共培养24小时，24小时后流式检测；
⑶用含2％血清、2％B27、DF12、20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、1mMIBMX、35ng/mL dbcAMP共培养3天，诱导成神经干细胞，之后添加分化因子；
⑷培养三天后使用免疫荧光和荧光定量PCR检测Nestin、PAX6、SOX1、SOX2四种神经干细胞的标志物的表达；
⑸五天后使用免疫荧光技术和荧光定量PCR技术检测神经胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物MAP-2的表达。
而且，所述的第3代人脐带间充质干细胞是原代培养到第三代使用或市售复苏使用。
而且，复苏方法为：将人脐带间充质干细胞从液氮罐拿出，37℃无菌水复苏，放入DF12培养基里，培养基与细胞悬液比例为9：1，300G，5min，重悬，细胞计数，接种于培养瓶内。
而且，所述的分化因子分别是20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、10ng/mL BDNF、50ng/mL IGF-1、5uM/LRA、200uM/LBHA，使神经干细胞分化成神经胶质细胞和神经元。
而且，免疫荧光方法步骤如下：
⑴3次用PBS浸洗细胞，每次3min；
⑵用4％的多聚甲醛固定细胞15min，PBS浸洗载玻片3次，每次3min；
⑶PBS配制0.5％Triton X-100室温通透处理20min；
⑷PBS浸洗载玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在载玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min；
⑸吸水纸吸掉封闭液，滴加稀释好的一抗，稀释倍数为100倍，并放入湿盒，4℃孵育过夜；
⑹24h后，加荧光二抗：PBS浸洗3次，每次3min，滴加稀释好的荧光二抗，稀释100倍，湿盒中20-37℃孵育1h，PBS浸洗切片3次，每次3min；
⑺复染核：滴加DAPI，避光孵育5min-10min，对标本进行染核，PBS 3-5minx4次洗去多余的DAPI；
⑻用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
而且，荧光定量PCR方法步骤如下：
一、提取RNA
⑴将细胞培养基吸出，用PBS洗2-3次，完全洗干净之后加Trizol,反复吹打后将Trizol移入EP管里，在装有裂解物的离心管中加入氯仿，震荡混匀30s，室温静置3min；
⑵4℃12000g离心15min，混合物分为3层，上层为RNA，中间白膜层为DNA，下层为蛋白；
⑶吸取上清液转移到新的离心管中，有机相和中间层含有DNA和蛋白，避免触及；
⑷上清液中加入等体积异丙醇，震荡混匀30s，室温静置10min；
⑸4℃12000g离心10min，RNA沉淀在离心管底部形成，小心吸取上清，避免触及RNA沉淀；
⑹在离心管中加入1mL预冷的75％酒精，涡旋混匀，4℃7500g离心5min，用20-50μl溶解RNA沉淀；
⑺酶标仪测定RNA浓度，计算反转录时RNA需加入量；
二、反转录
⑴首先配制下列混合溶液，10ul用量
试剂 用量
Oligo dT 1ul
Dntp Mixture 1ul
模板RNA 1ug
RNase free dH2O Up to 10ul
⑵65℃保温5min后，冰上迅速冷却；
⑶在上述管中配制下列反转录反应液，总量为20ul
试剂 用量
上述变性后反应液 10ul
5×PrimeScript ⅡBuffer 4ul
RNase Inhibitor 0.5ul
PrimeScript ⅡRTase 1ul
RTase free dH2O Up to 20ul
⑷缓慢混匀后42℃处理60min，70℃处理15min，4℃处理至反转录结束；
三、Q-PCR实验
⑴建立反应体系，25μl
名称 用量(μl)
TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10
10uM引物F 0.5
10uM引物R 0.5
模板 1
ddH2O 8
⑵扩增。
而且，扩增反应温度以时间如下：
Figure BDA0002785024470000031
本发明的优点和积极效果是：
本发明提供一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，优化各因子的添加量，且多因子联合使用，并且可以同时分化神经元和星角质细胞，并且标志物高表达，有益于诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞，提高脐带间充质干细胞诱导神经干细胞的诱导率，从而有益于获得神经干细胞而用于治疗神经元损伤的疾病。
附图说明
图1为本发明的流式检测结果图；
图2为本发明诱导3天后免疫荧光法检测神经干细胞四种标记物的表达结果对比图；
图3为本发明诱导3天后用荧光定量PCR方法检测神经干细胞四种标记物的表达结果对比图；
图4为本发明诱导5天后用免疫荧光方法检测神经元标记物的表达结果比对图；
图5为本发明诱导5天后用免疫荧光方法检测星胶质细胞标记物的表达结果对比图；
图6为本发明诱导5天后用荧光定量PCR方法，检测神经元标记物(MAP-2)和星胶质细胞标记物(GFAP)的表达结果对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，具体方法步骤如下：
⑴取第3代人脐带间充质干细胞，以3000密度接种于培养瓶上，该第3代人脐带间充质干细胞是原代培养到第三代使用或市售复苏使用；
复苏方法为：将人脐带间充质干细胞从液氮罐拿出，37℃无菌水复苏，放入新鲜DF12培养基里，培养基与细胞悬液比例为9：1，300G，5min，重悬，细胞计数，接种于培养瓶内。
⑵用DF12、2％血清，双抗共培养24小时，24小时后流式检测是否为脐带间充质干细胞，弃去原有培养基；
⑶用含2％血清、2％B27、DF12、20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、1mMol IBMX、35ng/mL dbcAMP共培养3天，诱导成神经干细胞，之后添加分化因子；
该分化因子分别是20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、10ng/mL BDNF、50ng/mL IGF-1、5uM/LRA、200uM/LBHA使神经干细胞分化成神经胶质细胞和神经元；
⑷培养三天后使用免疫荧光和荧光定量PCR检测Nestin、PAX6、SOX1、SOX2四种神经干细胞的标志物的表达；
⑸五天后使用免疫荧光技术和荧光定量PCR技术检测神经胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物MAP-2的表达。
免疫荧光方法步骤如下：
⑴3次用PBS浸洗细胞，每次3min；
⑵用4％的多聚甲醛固定细胞15min，PBS浸洗载玻片3次，每次3min；
⑶PBS配制0.5％Triton X-100室温通透处理20min；
⑷PBS浸洗载玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在载玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min；
⑸吸水纸吸掉封闭液，不洗，每瓶滴加足够量的稀释好的一抗，稀释倍数为100倍，并放入湿盒，4℃孵育过夜；
⑹24h后，加荧光二抗：PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上的多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，稀释100倍，湿盒中20-37℃孵育1h，PBS浸洗切片3次，每次3min；
⑺复染核：滴加DAPI，避光孵育5min-10min，对标本进行染核，PBS 3-5minx4次洗去多余的DAPI；
⑻用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
荧光定量PCR方法步骤如下：
一、提取RNA
⑴将细胞培养基吸出，用PBS洗2-3次，完全洗干净之后加Trizol,反复吹打后将Trizol移入EP管里，在装有裂解物的离心管中加入氯仿(Trizol总体积的1/5)，震荡混匀(手摇上下颠倒数次)30s，室温静置3min；
⑵4℃12000g离心15min，混合物分为3层，上层为RNA，中间白膜层为DNA，下层为蛋白；
⑶小心吸取上清液转移到新的离心管中，有机相和中间层含有DNA和蛋白，避免触及；
⑷上清液中加入等体积异丙醇，震荡混匀30s，室温静置10min；
⑸4℃12000g离心10min，RNA沉淀在离心管底部形成，小心吸取上清，避免触及RNA沉淀；
⑹在离心管中加入1mL预冷的75％酒精，涡旋混匀，4℃7500g离心5min，用20-50μl溶解RNA沉淀；
⑺酶标仪测定RNA浓度，计算反转录时RNA需加入量。
二、反转录
⑴首先配制下列混合溶液(10ul用量)
试剂 用量
Oligo dT 1ul
Dntp Mixture 1ul
模板RNA 1ug
RNase free dH2O Up to 10ul
⑵65℃保温5min后，冰上迅速冷却；
⑶在上述管中配制下列反转录反应液，总量为20ul
试剂 用量
上述变性后反应液 10ul
5×PrimeScript Ⅱ Buffer 4ul
RNase Inhibitor 0.5ul
PrimeScript Ⅱ RTase 1ul
RTase free dH2O Up to 20ul
⑷缓慢混匀后42℃处理60min，70℃处理15min，4℃处理至反转录结束。
三、Q-PCR实验
⑴建立反应体系(25μl)
名称 用量(μl)
TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10
10uM引物F 0.5
10uM引物R 0.5
模板 1
ddH2O 8
⑵扩增
Figure BDA0002785024470000061
以上述脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法为诱导组，增加对照组进行试验。
对照组：用DF12、10％血培养，双抗共培养24小时，24小时后流式检测是否为脐带间充质干细胞，定期换液继续培养5天，
1.1流式检测是否为脐带间充质干细胞
用DF12、2％血清、双抗共培养24小时，24小时后流式检测是否为脐带间充质干细胞；
一般阳性大于95％，阴性小于2％就是合格的。
如图1所示，流式检测CD14-,CD19-,CD45-,CD34-,HLA-DA-。CD73+，CD90+，CD105+，阴性的没有表达的。阳性都可以达到97％以上。通过流式结果，可以确定是脐带间充质干细胞。
1.2诱导3天后用免疫荧光方法检测神经干细胞四种标记物的表达
培养三天后使用免疫荧光和荧光定量PCR检测Nestin、PAX6、SOX1、SOX2四种神经干细胞的标志物的表达；
结果如图2所示，诱导3天免疫荧光结果检测了神经干细胞的四个标记物的表达，可以看出诱导组与对照组相比，Nestin的表达诱导组有明显的提高。PAX6标记物与对照组相比，荧光强度也是明显增强的，SOX1和SOX2两个标记物诱导组与对照组相比，诱导率和荧光强度是明显提高的，说明我们的诱导条件可以使脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞。
1.3诱导3天后用荧光定量PCR方法检测神经干细胞四种标记物的表达
如图3所示，从PCR结果看，诱导组与对照组相比，Nestin、PAX6、SOX1、SOX2的表达量都是明显提高的。Nestin诱导组是对照组的3倍左右，PAX6、SOX1、SOX2是对照组表达量的6-10倍。说明的诱导组神经干细胞标记物表达量非常高。
1.4诱导5天后用免疫荧光方法检测神经元标记物的表达
如图4所示，诱导5天后，MAP-2是神经元的标记物，对照组与诱导组相比，MAP-2的表达量是明显增强的。说明诱导的神经干细胞具有分化成神经元的可能。
1.5诱导5天后用免疫荧光方法检测星胶质细胞标记物的表达
如图5所示，GFAP是星胶质细胞的标记物，从结果分析，对照组和诱导组对比，我们的诱导组GFAP的表达量是增强的。说明诱导的神经干细胞具有分化成星胶质细胞的可能。
1.6诱导5天后用荧光定量PCR方法，检测神经元标记物(MAP-2)和星胶质细胞标记物(GFAP)的表达
如图6所示，从PCR结果分析，诱导组与对照组相比，诱导组的MAP-2和GFAP都是有明显的表达量增强的，说明本发明方法的分化条件促进了神经干细胞向神经元和星胶质细胞分化。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (7)

1.一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：具体方法步骤如下：
⑴取第3代人脐带间充质干细胞，以3000密度接种于培养瓶上；
⑵用DF12、2％血清，双抗共培养24小时，24小时后流式检测；
⑶用含2％血清、2％B27、DF12、20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、1mMIBMX、35ng/mL dbcAMP共培养3天，诱导成神经干细胞，之后添加分化因子；
⑷培养三天后使用免疫荧光和荧光定量PCR检测Nestin、PAX6、SOX1、SOX2四种神经干细胞的标志物的表达；
⑸五天后使用免疫荧光技术和荧光定量PCR技术检测神经胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物MAP-2的表达。
2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：所述的第3代人脐带间充质干细胞是原代培养到第三代使用或市售复苏使用。
3.根据权利要求2所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：复苏方法为：将人脐带间充质干细胞从液氮罐拿出，37℃无菌水复苏，放入DF12培养基里，培养基与细胞悬液比例为9：1，300G，5min，重悬，细胞计数，接种于培养瓶内。
4.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：所述的分化因子分别是20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uMForskolin、10ng/mL BDNF、50ng/mL IGF-1、5uM/LRA、200uM/LBHA，使神经干细胞分化成神经胶质细胞和神经元。
5.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：
免疫荧光方法步骤如下：
⑴3次用PBS浸洗细胞，每次3min；
⑵用4％的多聚甲醛固定细胞15min，PBS浸洗载玻片3次，每次3min；
⑶PBS配制0.5％Triton X-100室温通透处理20min；
⑷PBS浸洗载玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在载玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min；
⑸吸水纸吸掉封闭液，滴加稀释好的一抗，稀释倍数为100倍，并放入湿盒，4℃孵育过夜；
⑹24h后，加荧光二抗：PBS浸洗3次，每次3min，滴加稀释好的荧光二抗，稀释100倍，湿盒中20-37℃孵育1h，PBS浸洗切片3次，每次3min；
⑺复染核：滴加DAPI，避光孵育5min-10min，对标本进行染核，PBS 3-5minx4次洗去多余的DAPI；
⑻用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
6.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：
荧光定量PCR方法步骤如下：
一、提取RNA
⑴将细胞培养基吸出，用PBS洗2-3次，完全洗干净之后加Trizol,反复吹打后将Trizol移入EP管里，在装有裂解物的离心管中加入氯仿，震荡混匀30s，室温静置3min；
⑵4℃12000g离心15min，混合物分为3层，上层为RNA，中间白膜层为DNA，下层为蛋白；
⑶吸取上清液转移到新的离心管中，有机相和中间层含有DNA和蛋白，避免触及；
⑷上清液中加入等体积异丙醇，震荡混匀30s，室温静置10min；
⑸4℃12000g离心10min，RNA沉淀在离心管底部形成，小心吸取上清，避免触及RNA沉淀；
⑹在离心管中加入1mL预冷的75％酒精，涡旋混匀，4℃7500g离心5min，用20-50μl溶解RNA沉淀；
⑺酶标仪测定RNA浓度，计算反转录时RNA需加入量；
二、反转录
⑴首先配制下列混合溶液，10ul用量
试剂 用量 Oligo dT 1ul Dntp Mixture 1ul 模板RNA 1ug RNase free dH2O Up to 10ul
⑵65℃保温5min后，冰上迅速冷却；
⑶在上述管中配制下列反转录反应液，总量为20ul
Figure FDA0002785024460000021
Figure FDA0002785024460000031
⑷缓慢混匀后42℃处理60min，70℃处理15min，4℃处理至反转录结束；
三、Q-PCR实验
⑴建立反应体系，25μl
名称 用量(μl) TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 10uM引物F 0.5 10uM引物R 0.5 模板 1 ddH2O 8
⑵扩增。
7.根据权利要求6所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：
扩增反应温度以时间如下：
Figure FDA0002785024460000032
CN202011295084.8A 2020-11-18 2020-11-18 一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法 Active CN112795541B (zh)

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