CN112725260B - 一种从胚胎干细胞分化获得肝星状细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从胚胎干细胞分化获得肝星状细胞的方法。采用该方法制备的肝星状细胞,质量稳定,安全性高,为组织工程、药物开发和细胞治疗提供大量的细胞来源。本发明制备的肝星状细胞具有肝星状细胞静息态和活化态的特性;可以被TAA活化,能够模拟药物(如TAA)导致肝纤维化的过程;可以被APAP活化,能够模拟药物(如APAP)引起的肝毒性肝星状细胞激活。由此可见,本发明提供的方法制备的肝星状细胞可以作为细胞模型筛选治疗肝纤维化药物。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种从胚胎干细胞分化获得肝星状细胞的方法。
背景技术
肝纤维化是由于肝脏对各种病因引起慢性肝损伤后的一种损伤修复反应,在肝脏内大量细胞外基质(胶原)过度沉积的过程,可进一步发展为肝硬化、肝衰竭甚至肝癌。慢性肝损伤主要由慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝病及非酒精性脂肪性肝病等病因引起。在我国,乙型肝炎病毒感染仍然是导致肝纤维化的主要病因之一。肝纤维化是大多肝病终末期阶段病症发展的基础,如肝门脉高压、肝腹水、代谢功能紊乱等。因此,深入研究肝纤维化的发病机制,以及研发出可以诊断及阻断其发展的方法和药物具有重要的临床意义。
现有细胞模型具有一定的局限性,且永生化的HSC细胞是已经活化的细胞,不利于研究HSC最初活化的特征及机制。利用干细胞分化技术获得HSC细胞具有很多优点,1、干细胞可以自我增殖,细胞的量可以得到保证且来源比较单一,同质化好;2、没有经过激活还是处于静息状态,有助于研究HSC早期激活的特征变化及机制;3、研究干细胞来源的HSC细胞,将有助于去理解HSC分化起源,具有重要的生物学意义。利用干细胞分化技术获得的HSC细胞有助于研究肝纤维化的发生、发展机制及作为一个新的平台用于治疗肝纤维化的药物筛选,具有重要的临床意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是建立体外分化获得肝星状细胞的方法,从而研究肝纤维化的发生发展机制和筛选用于治疗肝纤维化的药物。
本发明首先保护一种从内胚层细胞和/或中胚层细胞分化产生肝星状细胞的方法,可包括如下步骤:
(a2)将内胚层细胞和/或中胚层细胞接种至iHSCs分化培养基I,培养3-5天(如3-4天、4-5天、3天、4天或5天);
所述iHSCs分化培养基I可为在基础培养基I中加入BMP4、FGF2、VEGF和HGF后得到的培养基;
(a3)完成步骤(a2)后,将所述细胞接种至iHSCs分化培养基II,继续培养,直至获得肝星状细胞;
所述iHSCs分化培养基II可为向基础培养基II中加入视黄醇、罗格列酮和地塞米松后得到的培养基。
本发明还保护一种从胚胎干细胞分化产生肝星状细胞的方法,可包括如下步骤:
(a1)取胚胎干细胞,分化,获得内胚层细胞和/或中胚层细胞;
(a2)完成步骤(a1)后,将内胚层细胞和/或中胚层细胞接种至iHSCs分化培养基I,培养3-5天(如3-4天、4-5天、3天、4天或5天);
所述iHSCs分化培养基I可为在基础培养基I中加入BMP4、FGF2、VEGF和HGF后得到的培养基;
(a3)完成步骤(a2)后,将所述细胞接种至iHSCs分化培养基II,继续培养,直至获得肝星状细胞;
所述iHSCs分化培养基II可为向基础培养基II中加入视黄醇、罗格列酮和地塞米松后得到的培养基。
所述步骤(a1)中,“胚胎干细胞,分化,获得内胚层细胞和/或中胚层细胞”可为取胚胎干细胞,分别采用STEMdiff Mesoderm Induction Medium(Stemcell,05221)和STEMdiff Definitive Endoderm Kit(StemCell,05110)培养(培养方法参照如下文献:WuX,Dao Thi VL,Huang Y,et al.Intrinsic Immunity Shapes Viral Resistance of StemCells.Cell.2018;172(3):423-438.e25.doi:10.1016/j.cell.2017.11.018),依次获得中胚层细胞和内胚层细胞。
上述任一所述基础培养基I可包括DMEM/F12、KOSR和谷氨酰胺。
上述任一所述基础培养基I的溶质及其浓度可为1-5mM(如1-2mM、2-5mM、1mM、2mM或5mM)谷氨酰胺;溶剂可为80-90%(如80-85%、85-90%、80%、85%或90%)(v/v)的DMEM/F12和10-20%(如10-15%、15-20%、10%、15%或20%)(v/v)的KOSR。
上述任一所述基础培养基II可包括DMEM/F12、KOSR、B27、ITS-X和谷氨酰胺。
上述任一所述基础培养基II的溶质及其浓度可为1-5mM(如1-2mM、2-5mM、1mM、2mM或5mM)谷氨酰胺、(1-2)×B27(100×)(如1×B27或2×B27)和(1-2)×ITS-X(100×)(如1×ITS-X或2×ITS-X);溶剂可为80-90%(如80-85%、85-90%、80%、85%或90%)(v/v)的DMEM/F12和10-20%(如10-15%、15-20%、10%、15%或20%)(v/v)的KOSR。
上述任一所述iHSCs分化培养基I中,BMP4的浓度可为1-10ng/ml(如1-5ng/ml、5-10ng/ml、1ng/ml、5ng/ml或10ng/ml)。FGF2的浓度可为1-10ng/ml(如1-5ng/ml、5-10ng/ml、1ng/ml、5ng/ml或10ng/ml)。VEGF的浓度可为5-15ng/ml(如5-10ng/ml、10-15ng/ml、5ng/ml、10ng/ml或15ng/ml)。HGF的浓度可为1-10ng/ml(如1-5ng/ml、5-10ng/ml、1ng/ml、5ng/ml或10ng/ml)。
上述任一所述iHSCs分化培养基II中,视黄醇的浓度可为0.5-10μM(如0.5-1μM、1-10μM、0.5μM、1μM或10μM)。罗格列酮的浓度可为10-30μM(如10-20μM、20-30μM、10μM、20μM或30μM)。地塞米松的浓度可为30-60nM(如30-50nM、50-60nM、30nM、50nM或60nM)。
上述任一所述培养的条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、3-7%CO2(如3-5%CO2、5-7%CO2、3%CO2、5%CO2或7%CO2)培养。
上文中,获得肝星状细胞的时间可为自内胚层细胞和/或中胚层细胞接种至iHSCs分化培养基I中开始计算的第10-20天。
本发明还保护培养基;所述培养基可为上述任一所述iHSCs分化培养基I或上述任一所述iHSCs分化培养基II。
本发明还保护成套培养基;所述成套培养基可包括上述任一所述iHSCs分化培养基I和上述任一所述iHSCs分化培养基II。
所述成套培养基具体可由上述任一所述iHSCs分化培养基I和上述任一所述iHSCs分化培养基II组成。
本发明还保护K1)、K2)、K3)、K4)、K5)、K6)、K7)和K8)中的至少一种。
K1)上述任一所述培养基在内胚层细胞和/或中胚层细胞分化产生肝星状细胞中的应用。
K2)上述任一所述成套培养基在内胚层细胞和/或中胚层细胞分化产生肝星状细胞中的应用。
K3)上述任一所述培养基在胚胎干细胞分化产生肝星状细胞中的应用。
K4)上述任一所述成套培养基在胚胎干细胞分化产生肝星状细胞中的应用。
K5)采用上述任一所述的方法制备的肝星状细胞作为细胞模型的应用。
K6)采用上述任一所述的方法制备的肝星状细胞作为细胞模型研究静息状态机制。
K7)采用上述任一所述的方法制备的肝星状细胞作为细胞模型在研究肝纤维化中的应用。
K8)采用上述任一所述的方法制备的肝星状细胞作为细胞模型在筛选治疗肝纤维化药物中的应用。
上述任一所述胚胎干细胞可为Wicell的W09。
实验证明,本发明提供的方法可以将胚胎干细胞分化为肝星状细胞,质量稳定,安全性高,为组织工程、药物开发和细胞治疗提供大量的细胞来源。本发明制备的肝星状细胞具有肝星状细胞静息态和活化态的特性,有助于用于肝星状细胞活化模型的建立及机制研究;可以被TAA活化,能够模拟药物(如TAA)导致肝纤维化的过程;可以被APAP活化,能够模拟药物(如APAP)引起的肝毒性肝星状细胞激活。由此可见,本发明提供的方法制备的肝星状细胞可以作为细胞模型筛选治疗肝纤维化药物。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR检测肝星状细胞特异表达基因的相对表达量。
图2为免疫荧光染色检测肝星状细胞的标志物。
图3为流式细胞术检测PDGFRβ抗体。
图4为肝星状细胞在FBS和TGFβ刺激后活化情况。
图5为肝星状细胞在硫代乙酰胺作用下的活化情况。
图6为肝星状细胞在对乙酰氨基酚作用下的活化情况。
图7为HBV病毒感染活化肝星状细胞。
图8为HCV病毒感染活化肝星状细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
DMEM/F12、KOSR和B27(100×)均为Gibco公司的产品,货号依次为12400-024、A3181502和17504044。ITS-X(100×)和谷氨酰胺均为Life Technologies公司的产品,货号分别为51500056和10565018。
下述实施例中的基础培养基I和基础培养基II的配方如表1所示。
表1
组分 | 基础培养基I | 基础培养基II |
DMEM/F12 | 90%(v/v) | 80%(v/v) |
KOSR | 10%(v/v) | 20%(v/v) |
B27(100×) | - | 1× |
ITS-X(100×) | - | 1× |
谷氨酰胺(0.2M) | 2mM | 2mM |
注:表中各浓度为在基础培养基中的终浓度,“-”表示不存在。
实施例1、肝星状细胞的获得和检测
一、胚胎干细胞分化获得肝星状细胞
本发明的发明人经过大量实验,建立了胚胎干细胞分化获得肝星状细胞的方法。具体步骤如下:
1、取胚胎干细胞(W09,Wicell,USA),分别采用STEMdiff Mesoderm InductionMedium(Stemcell,05221)和STEMdiff Definitive Endoderm Kit(StemCell,05110)培养(培养方法参照如下文献:Wu X,Dao Thi VL,Huang Y,et al.Intrinsic Immunity ShapesViral Resistance of Stem Cells.Cell.2018;172(3):423-438.e25.doi:10.1016/j.cell.2017.11.018),依次获得中胚层细胞和内胚层细胞。此时记为分化第0天(D0)。
2、完成步骤1后,将内胚层细胞和/或中胚层细胞接种至iHSCs分化培养基I,37℃、5%CO2培养4天。
iHSCs分化培养基I为向基础培养基I中加入BMP4、FGF2、VEGF和HGF获得的培养基;iHSCs分化培养基I中,BMP4的浓度为5ng/ml,FGF2的浓度为10ng/ml,VEGF的浓度为10ng/ml,HGF的浓度为10ng/ml。
3、完成步骤2后,将所述细胞接种至iHSCs分化培养基II,37℃、5%CO2培养直至获得iHSCs(即肝星状细胞);培养期间,每隔2天换1次培养基。
iHSCs分化培养基II为向基础培养基II中加入视黄醇、罗格列酮和地塞米松获得的培养基;iHSCs分化培养基II中,视黄醇的浓度为1μM,罗格列酮的浓度为20μM,地塞米松的浓度为50nM。
获得肝星状细胞的时间为自内胚层细胞和/或中胚层细胞接种至iHSCs分化培养基I中开始计算的第10-20天。
二、检测
1、实时荧光定量PCR检测
待测细胞为步骤一中得到的不同分化天数的细胞或LX-2细胞。
LX-2细胞为北京大学医学部病原生物学系沈弢副教授惠赠。LX-2细胞为人肝星状细胞,作为阳性对照。
提取待测细胞的基因组DNA并以其作为模板,实时荧光定量PCR检测肝星状细胞特异表达基因(AFP、PDGFRα、Desmin、hSTAP、COL1α1、ALCAM、α-SMA、PCDH7、COL3α1或PDGFRβ)和肝星状细胞未表达基因(OCT-4、SOX17、THY-1或FOXA2)的相对表达量(以RPS11基因为内参基因)。其中ThY-1抗原,又叫θ抗原,系T淋巴细胞表面的一种抗原。此种抗原主要存在于小鼠胸腺细胞的表面,周围淋巴组织T细胞也含有相当数量,少量存在于脑组织、上皮细胞和成纤维细胞。THY-1是成纤维细胞的标志物。
用于检测AFP基因的引物为5’-AGACTGAAAACCCTCTTGAATGC-3’和5’-GTCCTCACTGAGTTGGCAACA-3’。
用于检测PDGFRα基因的引物为5’-AACCCTGCTGATGAAAGCAC-3’和5’-TCCTTTCTAGCATGGGGACA-3’。
用于检测Desmin基因的引物为5’-AGGAACAGCAGGTCCAGGTA-3’和5’-AGAGCATCAATCTCGCAGGT-3’。
用于检测hSTAP基因的引物为5’-TGCCAGTGACTTCCCACCT-3’和5’-TAGATGAGGCCACGCAGC-3’。
用于检测COL1α1基因的引物为5’-TCTGCGACAACGGCAAGGTG-3’和5’-GACGCCGGTGGTTTCTTGGT-3’。
用于检测ALCAM基因的引物为5’-ACCTCAGAATCTCATGTTTGG-3’和5’-GTTTAGATGGTTGCTTGAACAC-3’。
用于检测α-SMA基因的引物为5’-CCAGAGCCATTGTCACACAC-3’和5’-CAGCCAAGCACTGTCAGG-3’。
用于检测PCDH7基因的引物为5’-GGATCGGGTGAGGTGACTTTC-3’和5’-GTTCTCGTCGAAGATCATCTGAC-3’。
用于检测COL3α1基因的引物为5’-GGAGCTGGCTACTTCTCGC-3’和5’-GGGAACATCCTCCTTCAACAG-3’。
用于检测PDGFRβ基因的引物为5’-CCCTTATCATCCTCATCATGC-3’和5’-CCTTCCATCGGATCTCGTAA-3’。
用于检测RPS11基因的引物为5’-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3’和5’-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3’。
用于检测OCT-4基因的引物为5’-GATGGCGTACTGTGGGCCC-3’和5’-TGGGACTCCTCCGGGTTTTG-3’。
用于检测SOX17基因的引物为5’-TTCTGTACACTTTAATGAGGCTGTTC-3’和5’-TTGTGGGAAGTGGGATCAAG-3’。
用于检测FOXA2基因的引物为5’-ATTGCTGGTCGTTTGTTGTG-3’和5’-TACGTGTTCATGCCGTTCAT-3’。
用于检测THY-1基因的引物为5’-AAGGACGAGGGCACCTACAC-3’和5’-GAGGTGTTCTGAGCCAGCAG-3’。
检测结果见图1。结果表明,步骤一中得到的分化天数为14天的细胞和LX-2细胞均可以表达AFP、PDGFRα、Desmin、hSTAP、COL1α1、ALCAM、α-SMA、PCDH7、COL3α1和PDGFRβ,不能表达OCT-4、SOX17、THY-1和FOXA2(分化获得的肝星状细胞不表达THY-1,说明还未被激活为成纤维细胞)。
2、免疫荧光染色检测
待测细胞为成纤维细胞(美国Lonza公司的产品)、原代星状细胞-p0(美国Lonza公司的产品)、原代星状细胞-p5(原代星状细胞-p0的传代培养细胞)或iHSCs(即步骤一获得的肝星状细胞)。
将待测细胞进行免疫荧光染色检测。具体步骤如下:
(1)用4%PFA固定待测细胞,常温固定20min;
(2)完成步骤(1)后,用PBS缓冲液清洗待测细胞3次;每次清洗时置于摇床上振摇10min;
(3)完成步骤(2)后,用PBS缓冲液稀释的0.1%Triton-100使待测细胞通透,常温下在摇床上振摇10min;
(4)完成步骤(3)后,用PBS缓冲液清洗3次;每次清洗时置于摇床上振摇10min;
(5)完成步骤(4)后,用10%山羊血清和1%BSA的混合液封闭待测细胞,常温下在摇床上振摇60min;
(6)完成步骤(5)后,用漂洗液(含0.1%Tween-20的PBS缓冲液)清洗3次,每次10min;
(7)完成步骤(6)后,将一抗(GFAP抗体、PCDH7抗体、NCAM抗体、Desmin抗体、Collagen I抗体、Nestin抗体或α-SMA抗体)以1:500稀释度加入含有1%BSA的PBS缓冲液,然后4℃摇床上过夜;
(8)完成步骤(7)后,用漂洗液清洗3次,每次10min;
(9)完成步骤(8)后,向含1%BSA的PBS缓冲液中加入1:2000稀释度的二抗和1:20000稀释度DAPI(抗体包含:Alexa594 goat anti-mouse antibody和Alexa488 goat anti-mouse antibody),37℃培养箱孵育30min,之后用漂洗液清洗3次,每次10min,然后加上适量PBS缓冲液;
(10)完成步骤(9)后,利用荧光显微镜观察,拍照记录。
GFAP、PCDH7、NCAM和Desmin均为肝星状细胞标志物。Collagen I和α-SMA均为活化的肝星状细胞标志物。Nestin为外胚层细胞的标志物,星状细胞活化后也能高表达。
检测结果见图2。结果表明,步骤1获得的肝星状细胞中,GFAP、PCDH7、NCAM和Desmin明显表达,Collagen I、Nestin、Nestin和α-SMA基本不表达。
3、流式细胞术检测
(1)取步骤一中得到的不同分化天数的细胞,加入PBS缓冲液重悬,得到细胞悬浮液。
(2)取细胞悬浮液,加入PDGFRβ抗体,室温避光孵育20min(期间每隔5min混匀一次);然后用PBS缓冲液洗涤2次(目的为除去未结合的抗体)。
(3)完成步骤(2)后,加入500μL PBS缓冲液重悬,然后采用流式细胞仪检测。
检测结果见图3。结果表明,分化时间越长,表达PDGFRβ抗体的细胞的数量越多。90%以上的肝星状细胞表面均表达PDGFRβ抗体。
上述结果表明,步骤一的方法可以将胚胎干细胞高效分化为肝星状细胞。
实施例2、肝星状细胞在FBS和TGFβ刺激后活化情况
1、实施例1中步骤一分化获得的肝星状细胞的活化
(1)取实施例1中步骤一分化获得的肝星状细胞,加入FBS,得到体系1;FBS在体系1中的浓度为10%。取实施例1中步骤一分化获得的肝星状细胞,加入TGFβ,得到体系2;TGFβ在体系2中的浓度为50ng/ml。
(2)分别取体系1、体系2和实施例1中步骤一分化获得的肝星状细胞(作为对照),37℃、5%CO2培养2天、4天或6天。
2、取完成步骤1的肝星状细胞,免疫荧光染色检测collagen I、Desmin、α-SMA和Nestin。检测步骤同实施例1步骤二中2。
3、取完成步骤1的肝星状细胞,流式细胞术检测。检测步骤同实施例1步骤二中3。检测方法参考实施例1步骤二中3。
4、取完成步骤1的肝星状细胞,实时荧光定量PCR检测COL1α1基因和α-SMA基因的相对表达水平(以RPS11基因为内参基因)。检测步骤同实施例1步骤二中1。
检测COL1a1基因的引物为5’-GACACAGAGGTTTCAGTGG-3’和5’-CACCCTTAGCACCAACAG-3’。
检测α-SMA基因的引物为5’-CCAGAGCCATTGTCACACAC-3’和5’-CAGCCAAGCACTGTCAGG-3’。
检测RPS11基因的引物为5’-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3’和5’-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3’。
检测结果见图4。结果表明,实施例1中步骤一分化获得的肝星状细胞经过FBS及TGFβ刺激后发生活化,导致collagen I、nestin及α-SMA蛋白明显表达,而静息态的分子如desmin表达明显降低。
上述结果表明,实施例1中步骤一分化获得的肝星状细胞具有肝星状细胞静息态和活化态的特性,有助于用于肝星状细胞活化模型的建立及机制研究。
实施例3、肝星状细胞在硫代乙酰胺作用下的活化情况
1、取实施例1中步骤一分化获得的肝星状细胞,加入培养基,得到处理体系1。取实施例1中步骤一分化获得的肝星状细胞,加入含TAA溶液(溶剂为DMSO)的培养基,得到处理体系2;处理体系2中,TAA的浓度为25mM或75mM。取实施例1中步骤一分化获得的肝星状细胞,加入含DMSO的培养基,得到处理体系3。处理体系3中DMSO的加入量与处理体系2中DMSO的加入量完全相同。
TAA为Sigma公司的产品,货号为Cat#163678。
2、完成步骤1后,将处理体系(处理体系1、处理体系2或处理体系3)处理5天。
3、完成步骤2后,收集所述处理体系中的细胞,提取细胞的基因组DNA并以其作为模板,实时荧光定量PCR检测Col3α1、Colα1和α-SMA的相对表达量(以RPS11基因为内参基因)。
检测引物见实施例1中步骤二。
检测结果见图5(Mock为处理体系1,0为处理体系3)。结果表明,步骤一分化获得的肝星状细胞TAA处理后,Col3α1、Colα1和α-SMA的相对表达量显著增高。由此可见,步骤一分化获得的肝星状细胞可以被TAA活化。
由此可见,步骤一分化获得的肝星状细胞(即肝星状细胞模型)可以模拟药物导致肝细胞毒性作用,从而导致肝星状细胞活化的过程。步骤一分化获得的肝星状细胞能够模拟药物导致肝纤维化的过程。
实施例4、肝星状细胞在对乙酰氨基酚作用下的活化情况
与HepaRG共培养:
1、将20000个HepaRG细胞铺在Transwell上层,100000个星状细胞(iHSC或pHSC;iHSC即实施例1中步骤一分化获得的肝星状细胞;pHSC即原代星状细胞-p0)铺在transwell下层,上层与下层的培养基接触,两种细胞可以进行细胞因子交流,但细胞是被隔离的。
2、完成步骤1后,取星状细胞,加入培养基,得到处理体系1。取星状细胞,加入含APAP溶液(溶剂为DMSO)的培养基,得到处理体系2;处理体系2中,APAP的浓度为25mM或75mM。取星状细胞,加入含DMSO的培养基,得到处理体系3。处理体系3中DMSO的加入量与处理体系2中DMSO的加入量完全相同。
APAP为Sigma公司的产品,货号为Cat#A7085。
3、完成步骤2后,将处理体系(处理体系1、处理体系2或处理体系3)处理5天。
4、完成步骤3后,收集所述处理体系中的细胞,提取细胞的基因组DNA并以其作为模板,实时荧光定量PCR检测Col3α1、Colα1和α-SMA的相对表达量(以RPS11基因为内参基因)。
检测引物见实施例1中步骤二。
未与HepaRG共培养:
将上述方法中步骤1替换为步骤1A,其它步骤均不变,作为对照。步骤1A为:将100000个星状细胞(具体为iHSC,即实施例1中步骤一分化获得的肝星状细胞)铺在transwell下层,Transwell上层为空白,培养。
检测结果见图6(Mock为处理体系1,0为处理体系3)。结果表明,未与HepaRG共培养条件下,步骤一分化获得的肝星状细胞APAP处理后活化不明显;步骤一分化获得的肝星状细胞与HepaRG共培养,APAP处理后,Col3α1、Colα1和α-SMA的相对表达量显著增高。由此可见,步骤一分化获得的肝星状细胞可以被APAP活化。
由此可见,步骤一分化获得的肝星状细胞(即肝星状细胞模型)与HepaRG共培养,HepaRG细胞将APAP代谢为有肝毒性的中间产物N-乙酰苯醌亚胺(NAPQI),从而激活肝星状细胞。步骤一分化获得的肝星状细胞能够模拟药物引起的肝毒性肝星状细胞激活。
实施例5、HBV病毒感染活化肝星状细胞
HepG2-NTCP稳转细胞系;其制备方法具体参考如下文献:Michailidis E,PabonJ,Xiang K,et al.A robust cell culture system supporting the complete lifecycle of hepatitis B virus.Sci Rep.2017;7(1):16616.唯一不同在于产毒株细胞系在参考文献中为HepDE19,在本发明为HepAD38。
HBV病毒;其制备方法具体参考如下文献:Michailidis E,Pabon J,Xiang K,etal.A robust cell culture system supporting the complete life cycle ofhepatitis B virus.Sci Rep.2017;7(1):16616.
1、取细胞培养板,随机分为HBV感染组、HBV+ETV组、ETV组和Mock组,各组进行如下处理:
HBV感染组:加入约100000个HepG2-NTCP细胞和500个单位(利用qPCR进行定量。500单位指的是每个细胞感染病毒的量是500个拷贝)HBV病毒,37℃、5%CO2培养过夜;
HBV+ETV组:加入约100000个HepG2-NTCP细胞、500个单位HBV病毒,之后加入恩替卡韦(ETV)并使恩替卡韦在体系中的浓度为500nM,37℃、5%CO2培养过夜;
ETV组:加入约100000个HepG2-NTCP细胞,之后加入恩替卡韦(ETV)并使恩替卡韦在体系中的浓度为500nM,37℃、5%CO2培养过夜;
Mock组:加入约100000个HepG2-NTCP细胞,37℃、5%CO2培养过夜。
2、完成步骤1后,加入实施例1中步骤一制备的肝星状细胞培养液(约100000个肝星状细胞),37℃、5%CO2培养过夜。
3、完成步骤2后,使用Axygen TM多用途总RNA小提试剂盒提取RNA。
4、完成步骤3后,使用可消化gDNA的Hifair II 1st strand cDNA合成试剂盒反转录,得到cDNA。
5、完成步骤4后,使用Quantstudio实时PCR检测试剂实时定量检测COL3α1基因、COL1α1基因和α-SMA基因的相对表达水平(以RPS11基因为内参基因)。
检测COL3α1基因的引物为5’-GGAGCTGGCTACTTCTCGC-3’和5’-GGGAACATCCTCCTTCAACAG-3’。
检测COL1α1基因的引物为5’-GACACAGAGGTTTCAGTGG-3’和5’-CACCCTTAGCACCAACAG-3’。
检测α-SMA基因的引物为5’-CCAGAGCCATTGTCACACAC-3’和5’-CAGCCAAGCACTGTCAGG-3’。
检测RPS11基因的引物为5’-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3’和5’-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3’。
检测结果见图7。结果表明,与其它组相比,HBV感染组中COL3α1基因、COL1α1基因和α-SMA基因的表达量显著增加。
实施例6、HCV病毒感染活化肝星状细胞
HCV病毒,选用HCV2a型JFH-1病毒株制备;其制备方法具体参考如下文献:WakitaT,Pietschmann T,Kato T,et al.Production of infectious hepatitis C virus intissue culture from a cloned viral genome[published correction appears in NatMed.2005Aug;11(8):905].Nat Med.2005;11(7):791-796.
1、取细胞培养板,随机分为HCV感染组、HCV+SOF组、SOF组和Mock组,各组进行如下处理:
HCV感染组:加入约100000个HepG2-NTCP细胞和HCV病毒(接种量为10MOI),37℃、5%CO2培养过夜;
HCV+SOF组:加入约100000个HepG2-NTCP细胞、HCV病毒(接种量为10MOI),之后加入索非布韦(SOF)并使索非布韦在体系中的浓度为700nM,37℃、5%CO2培养过夜;
SOF组:加入约100000个HepG2-NTCP细胞,之后加入索非布韦(SOF)并使索非布韦在体系中的浓度为700nM,37℃、5%CO2培养过夜;
Mock组:加入约100000个HepG2-NTCP细胞,37℃、5%CO2培养过夜。
2、完成步骤1后,加入实施例1中步骤一制备的肝星状细胞培养液(约20000个肝星状细胞),37℃、5%CO2培养过夜。
3、完成步骤2后,使用Axygen TM多用途总RNA小提试剂盒提取RNA。
4、完成步骤3后,使用可消化gDNA的Hifair II 1st strand cDNA合成试剂盒反转录,得到cDNA。
5、完成步骤4后,使用Quantstudio实时PCR检测试剂实时定量检测COL3α1基因、COL1α1基因和α-SMA基因的相对表达水平(以RPS11基因为内参基因)。
检测COL3α1基因的引物为5’-GGAGCTGGCTACTTCTCGC-3’和5’-GGGAACATCCTCCTTCAACAG-3’。
检测COL1α1基因的引物为5’-GACACAGAGGTTTCAGTGG-3’和5’-CACCCTTAGCACCAACAG-3’。
检测α-SMA基因的引物为5’-CCAGAGCCATTGTCACACAC-3’和5’-CAGCCAAGCACTGTCAGG-3’。
检测RPS11基因的引物为5’-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3’和5’-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3’。
检测结果见图8。结果表明,与其它组相比,HCV感染组中COL1α1基因和α-SMA基因的表达量显著增加。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
Claims (3)
1.一种从内胚层细胞和/或中胚层细胞分化产生肝星状细胞的方法,包括如下步骤:
(a2)将内胚层细胞和/或中胚层细胞接种至iHSCs分化培养基I,培养3-5天;
所述iHSCs分化培养基I为在基础培养基I中加入BMP4、FGF2、VEGF和HGF后得到的培养基;其中,所述基础培养基I的溶质及其浓度为2mM谷氨酰胺,溶剂为90% DMEM/F12和10%KOSR;BMP4的浓度为1~10ng/ml;FGF2的浓度为1~10ng/ml;VEGF的浓度为5~15ng/ml;HGF的浓度为1~10ng/ml;(a3)完成步骤(a2)后,将所述细胞接种至iHSCs分化培养基II,继续培养,直至获得肝星状细胞;
所述iHSCs分化培养基II为向基础培养基II中加入视黄醇、罗格列酮和地塞米松后得到的培养基;其中,所述基础培养基II的溶质及其浓度为2mM谷氨酰胺、1×B27、1×ITS-X,溶剂为80% DMEM/F12和20% KOSR;视黄醇的浓度为0.5~10μM;罗格列酮的浓度为10~30μM;地塞米松的浓度为30~60nM。
2.一种从胚胎干细胞分化产生肝星状细胞的方法,包括如下步骤:
(a1)取胚胎干细胞,分化,获得内胚层细胞和/或中胚层细胞;
(a2)完成步骤(a1)后,将内胚层细胞和/或中胚层细胞接种至iHSCs分化培养基I,培养3~5天;
所述iHSCs分化培养基I为在基础培养基I中加入BMP4、FGF2、VEGF和HGF后得到的培养基;其中,所述基础培养基I的溶质及其浓度为2mM谷氨酰胺,溶剂为90% DMEM/F12和10%KOSR;BMP4的浓度为1~10ng/ml;FGF2的浓度为1~10ng/ml;VEGF的浓度为5~15ng/ml;HGF的浓度为1~10ng/ml;
(a3)完成步骤(a2)后,将所述细胞接种至iHSCs分化培养基II,继续培养,直至获得肝星状细胞;
所述iHSCs分化培养基II为向基础培养基II中加入视黄醇、罗格列酮和地塞米松后得到的培养基;其中,所述基础培养基II的溶质及其浓度为2mM谷氨酰胺、1×B27、1×ITS-X,溶剂为80% DMEM/F12和20% KOSR;视黄醇的浓度为0.5~10μM;罗格列酮的浓度为10~30μM;地塞米松的浓度为30~60nM;
所述胚胎干细胞不为从人胚胎制备获得的人胚胎干细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述培养的条件为35~39℃、3~7%CO2培养。
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