CN112608879B - 一种从胚胎干细胞分化获得肺上皮细胞的方法及其使用的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从胚胎干细胞分化获得肺上皮细胞的方法及其使用的培养基。实验证明，本发明提供的方法可以将胚胎干细胞分化为肺上皮细胞，质量稳定，安全性高，为组织工程、药物开发和细胞治疗提供大量的细胞来源；SARS‑CoV‑2假病毒和穿山甲冠状病毒GX_P2V可以高效感染该肺上皮细胞。由此可见，本发明提供的方法制备的肺上皮细胞可以作为细胞模型筛选抑制病毒药物。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从胚胎干细胞分化获得肺上皮细胞的方法及其使用的培养基。
背景技术
高致病性冠状病毒感染一直是重大的公共卫生问题。近年来爆发流行的严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)以及新冠肺炎(COVID-19)，对全人类的生命健康和经济发展带来了严重的影响。制备肺上皮细胞感染模型对新型冠状病毒的基础研究、疫苗研究及药物筛选等是非常必要的。
目前研究应用的细胞模型为来源于绿猴肾脏的Vero E6细胞，其模拟病毒感染肺上皮细胞过程与临床结果略有差别，例如氯喹在Vero E6细胞模型上可以明显抑制新型冠状病毒复制，但在肺上皮细胞中抑制作用缺失。由此可见，不同来源的细胞模型对于病毒研究影响较大。另外，肺癌细胞系(如A549)也由于其为癌细胞而限制了其应用。原代肺上皮细胞可以很好地用来研究新型冠状病毒感染，但是其来源受限且不同人来源的细胞差异较大，还不能很好应用于研究中。
干细胞分化技术的发展，为解决之前各种细胞系的缺陷提供了基础。首先，干细胞分化得到的细胞来源于人，具有种属特异性；其次，分化得到的细胞比较稳定，可以扩增，保证了大规模高通量筛选的细胞来源。因此，建立体外分化获得肺上皮细胞的方法，进而制备新型冠状病毒(即SARS-CoV-2)感染的细胞模型具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是建立体外分化获得肺上皮细胞的方法，从而制备病毒(如SARS-CoV-2、穿山甲冠状病毒GX_P2V)感染的细胞模型。
本发明首先保护一种从前肠内胚层细胞分化产生肺上皮细胞的方法，可包括如下步骤：
(a4)将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天(如8-10天、10-12天、8天、10天或12天)；
所述分化培养基I可为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；
(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；
所述分化培养基II可为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7后得到的培养基。
本发明还保护一种从内胚层细胞分化产生肺上皮细胞的方法，可包括如下步骤：
(a2)将内胚层细胞接种至分化培养基A，培养1-2天(如1天或2天)；
所述分化培养基A可为在基础培养基中加入Dorsomorphin和SB431542后得到的培养基；
(a3)完成步骤(a2)后，将所述细胞接种至分化培养基B，培养1-3天(如1天、2天或3天)，得到前肠内胚层细胞；
所述分化培养基B可为在基础培养基中加入IWP2和SB431542后得到的培养基；
(a4)完成步骤(a3)后，将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天(如8-10天、10-12天、8天、10天或12天)；
所述分化培养基I可为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；
(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；
所述分化培养基II可为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7后得到的培养基。
本发明还保护一种从胚胎干细胞分化产生肺上皮细胞的方法，包括如下步骤：
(a1)取胚胎干细胞，分化，获得内胚层细胞；
(a2)完成步骤(a1)后，将内胚层细胞接种至分化培养基A，培养1-2天(如1天或2天)；
所述分化培养基A可为在基础培养基中加入Dorsomorphin和SB431542后得到的培养基；
(a3)完成步骤(a2)后，将所述细胞接种至分化培养基B，培养1-3天(如1天、2天或3天)，得到前肠内胚层细胞；
所述分化培养基B可为在基础培养基中加入IWP2和SB431542后得到的培养基；
(a4)完成步骤(a3)后，将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天(如8-10天、10-12天、8天、10天或12天)；
所述分化培养基I可为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；
(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；
所述分化培养基II可为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7后得到的培养基。
所述步骤(a1)中，“胚胎干细胞，分化，获得内胚层细胞”可为取胚胎干细胞，采用STEMdiff Definitive Endoderm Kit培养，获得内胚层细胞。所述培养方法参照如下文献：Wu X，Dao Thi VL，Huang Y，et al.Intrinsic Immunity Shapes Viral Resistance ofStem Cells.Cell.2018；172(3)：423-438.e25.doi:10.1016/j.cell.2017.11.018。
上述任一所述的方法中，所述基础培养基可包括DMEM/F12、IMDM、N2 supplement(100×)、B27(100×)、维生素C、谷氨酰胺、硫代甘油和牛白蛋白。
上述任一所述基础培养基的溶质及其浓度为(1-2)×N2 supplement(如1×N2supplement或2×N2 supplement)、(1-2)×B27(如1×B27或2×B27)、40-100ng/ml(如40-50ng/ml、50-100ng/ml、40ng/ml、50ng/ml或100ng/ml)维生素C、1-5mM(如1-2mM、2-5mM、1mM、2mM或5mM)谷氨酰胺、0.1-1.0μM(如0.1-0.2μM、0.2-1.0μM、0.1μM、0.2μM或1.0μM)硫代甘油和0.01-0.1％(如0.01-0.05％、0.05-0.1％、0.01％、0.05％或0.1％)(m/v)牛白蛋白；溶剂为40-60％(如40-50％、50-60％、40％、50％或60％)(v/v)的DMEM/F12和40-60％(如40-50％、50-60％、40％、50％或60％)(v/v)的IMDM。
上述任一所述分化培养基I中，CHIR99021的浓度可为1-10μM(如1-3μM、3-10μM、1μM、3μM或10μM)。BMP4的浓度可为5-15ng/ml(如5-10ng/ml、10-15ng/ml、5ng/ml、10ng/ml或15ng/ml)。视黄醇的浓度可为1-10μM(如1-5μM、5-10μM、1μM、5μM或10μM)。FGF10的浓度可为10-25ng/ml(如10-20ng/ml、20-25ng/ml、10ng/ml、20ng/ml或25ng/ml)。FGF7的浓度可为5-20ng/ml(如5-10ng/ml、10-20ng/ml、5ng/ml、10ng/ml或20ng/ml)。
上述任一所述分化培养基II中，CHIR99021的浓度可为1-10μM(如1-3μM、3-10μM、1μM、3μM或10μM)。IBMX的浓度可为0.05-0.15mM(如0.05-0.1mM、0.1-0.15mM、0.05mM、0.1mM或0.15mM)。地塞米松的浓度可为30-60nM(如30-50nM、50-60nM、30nM、50nM或60nM)。FGF10的浓度可为10-25ng/ml(如10-20ng/ml、20-25ng/ml、10ng/ml、20ng/ml或25ng/ml)。FGF7的浓度可为5-20ng/ml(如5-10ng/ml、10-20ng/ml、5ng/ml、10ng/ml或20ng/ml)。
上述任一所述分化培养基A中，Dorsomorphin的浓度可为1-2uM(如1-1.5uM、1.5-2uM、1uM、1.5uM或2uM)。SB431542的浓度可为8-12uM(如8-10uM、10-12uM、8uM、10uM或12uM)。
上述任一所述分化培养基B中，IWP2的浓度可为0.5-1.5uM(如0.5-1.0uM、1.0-1.5uM、0.5uM、1.0uM或1.5uM)。SB431542的浓度可为8-12uM(如8-10uM、10-12uM、8uM、10uM或12uM)。
上述任一所述培养的条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、3-7％CO2(如3-5％CO2、5-7％CO2、3％CO2、5％CO2或7％CO2)培养。
上文中，获得肺上皮细胞的时间为自内胚层细胞接种于前肠内胚层细胞分化培养基I中开始计算的第21-38天。
本发明还保护培养基；所述培养基可为上述任一所述分化培养基I或上述任一所述分化培养基II。
本发明还保护成套培养基；所述成套培养基可包括上述任一所述分化培养基I和上述任一所述分化培养基II。
所述成套培养基具体可由上述任一所述分化培养基I和上述任一所述分化培养基II组成。
本发明还保护K1)、K2)、K3)、K4)、K5)、K6)、K7)、K8)和K9)中的至少一种。
K1)上述任一所述培养基在前肠内胚层细胞分化产生肺上皮细胞中的应用。
K2)上述任一所述成套培养基在前肠内胚层细胞分化产生肺上皮细胞中的应用。
K3)上述任一所述培养基在内胚层细胞分化产生肺上皮细胞中的应用。
K4)上述任一所述成套培养基在内胚层细胞分化产生肺上皮细胞中的应用。
K5)上述任一所述培养基在胚胎干细胞分化产生肺上皮细胞中的应用。
K6)上述任一所述成套培养基在胚胎干细胞分化产生肺上皮细胞中的应用。
K7)采用上述任一所述的方法制备的肺上皮细胞作为细胞模型的应用。
K8)采用上述任一所述的方法制备的肺上皮细胞作为细胞模型筛选药物中的应用。
K9)采用上述任一所述的方法制备的肺上皮细胞作为细胞模型筛选抑制病毒药物中的应用。
上述任一所述药物或抑制病毒药物可为瑞德西韦、千金藤素、乳清蛋白或干扰素。所述乳清蛋白可为人乳清蛋白、牛乳清蛋白或羊乳清蛋白。所述干扰素为干扰素α、干扰素β或干扰素γ。
上述任一所述病毒可为SARS-CoV-2假病毒或穿山甲冠状病毒GX_P2V。
实验证明，本发明提供的方法可以将胚胎干细胞分化为肺上皮细胞，质量稳定，安全性高，为组织工程、药物开发和细胞治疗提供大量的细胞来源。SARS-CoV-2假病毒和穿山甲冠状病毒GX_P2V可以高效感染该肺上皮细胞，瑞德西韦、千金藤素、乳清蛋白和干扰素可以抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染该肺上皮细胞。由此可见，本发明提供的方法制备的肺上皮细胞可以作为细胞模型筛选抑制病毒(SARS-CoV-2假病毒或穿山甲冠状病毒GX_P2V)药物。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR检测肺上皮细胞特异表达基因的相对表达量。
图2为流式细胞术检测ACE2。
图3为人乳清蛋白抑制SARS-CoV-2假病毒感染肺上皮细胞。
图4为穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞。
图5为瑞德西韦抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞。
图6为千金藤素抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞。
图7为乳清蛋白抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞。
图8为干扰素抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
DMEM/F12、IMDM、N2 supplement(100×)和B27(100×)均为Gibco公司的产品，货号依次为12400-024、12440053、17502048和17504044。维生素C和硫代甘油均为Sigma公司的产品，货号依次为137-66-6和96-27-5。谷氨酰胺为Life Technologies公司的产品，货号为10565018。牛白蛋白为上海生工公司的产品，货号为A500023-0100。Dorsomorphin为R&DSystem公司的产品，货号为3093。SB431542为StemCell公司的产品，货号为72234。IWP2为R&D System公司的产品，货号为3533。CHIR99021为StemCell公司的产品，货号为72054。BMP4为Peprotech公司的产品，货号为120-05-5。视黄醇为Peprotech公司的产品，货号为3027949。FGF10为R&D Systems公司的产品，货号为345-FG-025。FGF7为R&D Systems公司的产品，货号为251-KG-010。地塞米松为Sigma公司的产品，货号为D1756。A549细胞、HPAEpiC细胞和H460细胞均为ATCC公司的产品。ACE2抗体为R&D Systems公司的产品。IBMX为Sigma公司的产品，货号为I5879。
下述实施例中的基础培养基1、基础培养基2和基础培养基3的配方如表1所示。
表1
注：表中各浓度为在基础培养基中的终浓度。
实施例1、肺上皮细胞的获得和检测
一、胚胎干细胞分化获得肺上皮细胞
本发明的发明人经过大量实验，建立了胚胎干细胞分化获得肺上皮细胞的方法。具体步骤如下：
1、取胚胎干细胞(W09，Wicell，USA)，采用STEMdiff Definitive Endoderm Kit(StemCell，05110)培养(培养方法参照如下文献：Wu X，Dao Thi VL，Huang Y，etal.Intrinsic Immunity Shapes Viral Resistance of Stem Cells.Cell.2018；172(3)：423-438.e25.doi:10.1016/j.cell.2017.11.018)，获得内胚层细胞。此时记为分化第0天(D0)。
2、完成步骤1后，将内胚层细胞接种至前肠内胚层细胞分化培养基I，37℃、5％CO2培养1天。此时记为分化第1天(D1)。
前肠内胚层细胞分化培养基I为向基础培养基1中加入Dorsomorphin和SB431542获得的培养基；前肠内胚层细胞分化培养基I中，Dorsomorphin的浓度为1.5uM，SB431542的浓度为10uM。
3、完成步骤2后，将内胚层细胞接种至前肠内胚层细胞分化培养基II，37℃、5％CO2培养2天，得到前肠内胚层细胞。此时记为分化第3天(D3)。
前肠内胚层细胞分化培养基II为向基础培养基1中加入IWP2和SB431542获得的培养基；前肠内胚层细胞分化培养基II中，IWP2的浓度为1uM，SB431542的浓度为10uM。
4、完成步骤3后，将前肠内胚层细胞接种至肺上皮细胞分化培养基I，37℃、5％CO2培养10天；培养期间，每隔2天换1次培养基。
肺上皮细胞分化培养基I为向基础培养基1中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7获得的培养基；肺上皮细胞分化培养基I中，CHIR99021的浓度为3μM，BMP4的浓度为10ng/ml，视黄醇的浓度为1μM，FGF10的浓度为20ng/ml，FGF7的浓度为10ng/ml。
5、完成步骤4后，将前肠内胚层细胞接种至肺上皮细胞分化培养基II，37℃、5％CO2培养直至获得肺上皮细胞；培养期间，每隔2天换1次培养基。
肺上皮细胞分化培养基II为向基础培养基1中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7获得的培养基；肺上皮细胞分化培养基II中，CHIR99021的浓度为3μM，IBMX的浓度为0.1mM，地塞米松的浓度为50nM，FGF10的浓度为20ng/ml，FGF7的浓度为10ng/ml。
获得肺上皮细胞的时间为自内胚层细胞接种于前肠内胚层细胞分化培养基I中开始计算的第21-38天。
二、检测
1、实时荧光定量PCR检测
待测细胞为步骤一中得到的不同分化天数的细胞、A549细胞、HPAEpiC细胞或H460细胞。
A549细胞、HPAEpiC细胞和H460细胞均为肺上皮细胞，作为阳性对照。
提取待测细胞的基因组DNA并以其作为模板，实时荧光定量PCR检测肺上皮细胞特异表达基因(SFTPA、SFTPB、SFTPC、Nkx2.1、Foxj1、CC-10、ACE2、TMPRSS2、Mash1、Mucin5AC、Foxp2或p63)的相对表达量(以RPS11基因为内参基因)。
用于检测SFTPA基因的引物为5’-GTGCGAAGTGAAGGACGTTTGTGT-3’和5’-TTTGAGACCATCTCTCCCGTCCC-3’。
用于检测SFTPB基因的引物为5’-TCTGAGTGCCACCTCTGCATGT-3’和5’-TGGAGCATTGCCTGTGGTATGG-3’。
用于检测SFTPC基因的引物为5’-CCTTCTTATCGTGGTGGTGGTGGT-3’和5’-TCTCCGTGTGTTTCTGGCTCATGT-3’。
用于检测Nkx2.1基因的引物为5’-CGGCATGAACATGAGCGGCAT-3’和5’-GCCGACAGGTACTTCTGTTGCTTG-3’。
用于检测Foxj1基因的引物为5’-GGCATAAGCGCAAACAGCCG-3’和5’-TCGAAGATGGCCTCCCAGTCAAA-3’。
用于检测CC-10基因的引物为5’-TCATGGACACACCCTCCAGTTATGAG-3’和5’-TGAGCTTAATGATGCTTTCTCTGGGC-3’。
用于检测ACE2基因的引物为5’-AAACATACTGTGACCCCGCAT-3’和5’-CCAAGCCTCAGCATATTGAACA-3’。
用于检测TMPRSS2基因的引物为5’-AATCGGTGTGTTCGCCTCTAC-3’和5’-CGTAGTTCTCGTTCCAGTCGT-3’。
用于检测Mash1基因的引物为5’-CGCGGCCAACAAGAAGATGAGTAAG-3’和5’-CATGGAGTTCAAGTCGTTGGAGTAGT-3’。
用于检测Mucin5AC基因的引物为5’-GCACCAACGACAGGAAGGATGAG-3’和5’-CACGTTCCAGAGCCGGACAT-3’。
用于检测Foxp2基因的引物为5’-GCCTTGGCAGAGAGCAGTTTACCTTT-3’和5’-CCCGGACTACTGTTTCCATTGCTGT-3’。
用于检测p63基因的引物为5’-CCTATAACACAGACCACGCGCAGAA-3’和5’-GTGATGGAGAGAGAGCATCGAAG-3’。
用于检测RPS11基因的引物为5’-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3’和5’-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3’。
检测结果见图1。结果表明，步骤一中得到的分化天数为25天的细胞、A549细胞、HPAEpiC细胞和H460细胞均可以表达SFTPA、SFTPB、SFTPC、Nkx2.1、Foxj1、CC-10、ACE2、TMPRSS2、Mash1、Mucin5AC、Foxp2和p63。
2、流式细胞术检测
(1)取步骤一中得到的肺上皮细胞，加入PBS缓冲液重悬，得到细胞悬浮液。
(2)取细胞悬浮液，加入ACE2抗体，室温避光孵育20min(期间每隔5min混匀一次)；然后用PBS缓冲液洗涤2次(目的为除去未结合的抗体)。
(3)完成步骤(2)后，加入500μL PBS缓冲液重悬，然后采用流式细胞仪检测。
检测结果见图2。结果表明，90％以上的肺上皮细胞表面均表达ACE2抗体。
上述结果表明，步骤一的方法可以将胚胎干细胞高效分化为肺上皮细胞。
实施例2、乳清蛋白抑制SARS-CoV-2假病毒感染肺上皮细胞
SARS-CoV-2假病毒为中国食品药品检定研究院王佑春研究员惠赠，记载于如下文献中：Nie J,Li Q,Wu J,et al.Establishment and validation of a pseudovirusneutralization assay for SARS-CoV-2.Emerg Microbes Infect.2020；9(1):680-686.doi:10.1080/22221751.2020.1743767。
1、取细胞培养板，加入500μL实施例1中步骤一制备的肺上皮细胞培养液(约20000个肺上皮细胞)，37℃、5％CO2培养过夜。
2、完成步骤1后，接种SARS-CoV-2假病毒(接种剂量为650TCID50/well)，37℃、5％CO2培养24h。
3、完成步骤2后，加入人乳清蛋白并使人乳清蛋白在体系中的浓度为2mg/ml，37℃、5％CO2培养2h；之后弃上清，用PBS缓冲液清洗3次。
4、完成步骤3后，加入人乳清蛋白并使人乳清蛋白在体系中的浓度为2mg/ml，37℃、5％CO2培养72h。
5、完成步骤4后，裂解细胞并用Luciferase Assay System检测细胞裂解液中的荧光素酶活性。
6、完成步骤5后，获得相对荧光素酶活性(与对照组相比)或抑制率(抑制率＝(对照组-感染组)/对照组×100％)。
按照上述步骤，将人乳清蛋白替换为等体积的PBS缓冲液，作为空白对照。
按照上述步骤，将人乳清蛋白替换为人灭活乳清蛋白，其它步骤均不变，作为对照。
按照上述步骤，将人乳清蛋白替换为牛乳清蛋白，其他步骤不变，作为对照。
按照上述步骤，将人乳清蛋白替换为羊乳清蛋白，其他步骤不变，作为对照。
检测结果见图3。结果表明，SARS-CoV-2假病毒可以感染肺上皮细胞；人乳清蛋白、牛乳清蛋白和羊乳清蛋白分别处理后，SARS-CoV-2假病毒的感染效果受到抑制，即人乳清蛋白、牛乳清蛋白和羊乳清蛋白均可以抑制SARS-CoV-2假病毒感染肺上皮细胞，其中人乳清蛋白的抑制效果最好。
实施例3、穿山甲冠状病毒GX_P2V可以感染肺上皮细胞
穿山甲冠状病毒GX_P2V为中国食品药品检定研究院王佑春研究员惠赠，记载于如下文献中：Nie J，Li Q，Wu J，Zhao C，Hao H，Liu H，Zhang L，et al.Establishment andvalidation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2.EmergMicrobes Infect 2020；9:680-686.。
1、取细胞培养板，加入500μL实施例1中步骤一制备的肺上皮细胞培养液(约20000个肺上皮细胞)，37℃、5％CO2培养过夜。
2、完成步骤1后，接种穿山甲冠状病毒GX_P2V(接种病毒量为0.1MOI、0.01MOI或0.001MOI)，37℃、5％CO2培养24h或72h。同时不接种穿山甲冠状病毒GX_P2V，37℃、5％CO2培养24h或72h，作为对照。
3、完成步骤2后，使用Axygen TM多用途总RNA小提试剂盒(Axygene，货号AP-MN-MS-RNA-250G)提取RNA。
4、完成步骤3后，使用可消化gDNA的Hifair II 1st strand cDNA合成试剂盒(上海翊圣生物科技，货号：11121ES60)反转录，得到cDNA。
5、完成步骤4后，使用Quantstudio实时PCR检测试剂(Applied biosystems，Foster City，CA，USA)进行qRT-PCR，得到PCR产物。进行qRT-PCR的引物为CoV-F1：5’-GGTGATTGCCTTGGTGATATTG-3’、CoV-R1：5’-GCAAGTAGTGCAGAAGTGTATTG-3’、CoV-Probe：5’-FAM-TCTGTGAGCAAAGGCGGTAGAACC-TAMRA-3’、GAPDH-F：5’-AGCCTCAAGATCATCAGCAATG-3’、GAPDH-R：5’-ATGGACTGTGGTCATGAGTCCTT-3’和GAPDH-probe：5’-FAM-CCAACTGCTTAGCACCCCTGGCC-TRAMA-3’。
6、完成步骤5后，将PCR产物和T载体(北京睿博兴科生物技术)连接，得到连接产物。
7、完成步骤5后，将PCR产物和T载体连接，得到重组质粒。将重组质粒进行稀释，得到浓度为103拷贝/μL的稀释液1、104拷贝/μL的稀释液2、105拷贝/μL的稀释液3、106拷贝/μL的稀释液4、107拷贝/μL的稀释液5、108拷贝/μL的稀释液6和109拷贝/μL的稀释液7。
8、完成步骤7后，实时荧光定量分别检测稀释液1—稀释液7的荧光值，然后以重组质粒的拷贝数为横坐标，荧光值为纵坐标，绘制标准曲线。
9、实时荧光定量检测步骤6获得的连接产物的荧光值。然后将连接产物的荧光值代入标准曲线，获得拷贝数；根据拷贝数获得相对表达量(相对表达量＝log10拷贝数)。
10、完成步骤2后，采用Western blot检测细胞中病毒N蛋白表达量。采用N蛋白抗体作为一抗检测N蛋白，采用GAPDH抗体作为一抗检测GAPDH蛋白(作为对照)。
N蛋白抗体为Genscript公司的产品，货号为3F9C12。GAPDH抗体为Proteintech公司的产品，货号为A02049。
检测结果见图4(左图为相对表达量检测结果，Mock为未接种病毒；右图为Westernblot检测结果，ND为未接种病毒)。结果表明，穿山甲冠状病毒GX_P2V可在肺上皮细胞复制，RNA水平和蛋白水平均表明穿山甲冠状病毒GX_P2V的复制与感染剂量相关，随着MOI的提高而增高。
实施例4、抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞的药物筛选
一、瑞德西韦抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞
1、取细胞培养板，加入500μL实施例1中步骤一制备的肺上皮细胞培养液(约20000个肺上皮细胞)，37℃、5％CO2培养过夜。
2、完成步骤1后，接种穿山甲冠状病毒GX_P2V(接种病毒量为0.1MOI)，之后加入瑞德西韦并使瑞德西韦在体系中的浓度为4EC50、2EC50或EC50(EC50＝0.78μM)，37℃、5％CO2培养24h、48h或72h。同时只接种穿山甲冠状病毒GX_P2V(接种病毒量为0.1MOI)不加入瑞德西韦，37℃、5％CO2培养24h、48h或72h，作为对照。
3、完成步骤2后，使用Axygen TM多用途总RNA小提试剂盒提取RNA。
4、完成步骤3后，使用可消化gDNA的Hifair II 1st strand cDNA合成试剂盒反转录，得到cDNA。
5、完成步骤4后，使用Quantstudio实时PCR检测试剂实时定量检测P2V和GAPDHmRNA水平，获得P2V/GAPDH mRNA水平。检测P2V的引物为5’-GGTGATTGCCTTGGTGATATTG-3’、5’-GCAAGTAGTGCAGAAGTGTATTG-3’和5’-FAM-TCTGTGAGCAAAGGCGGTAGAACC-TAMRA-3’。检测GAPDH的引物为5’-AGCCTCAAGATCATCAGCAATG-3’、5’-ATGGACTGTGGTCATGAGTCCTT-3’和5’-FAM-CCAACTGCTTAGCACCCCTGGCC-TRAMA-3’。
检测结果见图5(Mock为未加入瑞德西韦)。结果表明，瑞德西韦可以抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V的复制能力，即瑞德西韦可以抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞。
二、千金藤素抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞
1、取细胞培养板，加入500μL实施例1中步骤一制备的肺上皮细胞培养液(约20000个肺上皮细胞)，37℃、5％CO2培养过夜。
2、完成步骤1后，接种穿山甲冠状病毒GX_P2V(接种病毒量为0.1MOI)，之后加入千金藤素并使千金藤素在体系中的浓度为8EC50、4EC50或2EC50(EC50＝0.21μM)，37℃、5％CO2培养24h、48h或72h。同时只接种穿山甲冠状病毒GX_P2V(接种病毒量为0.1MOI)不加入千金藤素，37℃、5％CO2培养24h、48h或72h，作为对照。
3、完成步骤2后，获得P2V/GAPDH mRNA水平。检测方法同步骤一中3-5。
检测结果见图6(Mock为未加入千金藤素)。结果表明，千金藤素可以抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V的复制能力，即千金藤素可以抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞。
三、人乳清蛋白抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞
1、取细胞培养板，加入500μL实施例1中步骤一制备的肺上皮细胞培养液(约20000个肺上皮细胞)，37℃、5％CO2培养过夜。
2、完成步骤1后，接种穿山甲冠状病毒GX_P2V(接种病毒量为0.1MOI)，之后加入人乳清蛋白并使人乳清蛋白在体系中的浓度为0.2mg/ml或0.8mg/ml，37℃、5％CO2培养24h或72h。同时只接种穿山甲冠状病毒GX_P2V(接种病毒量为0.1MOI)不加入人乳清蛋白，37℃、5％CO2培养24h或72h，作为对照。
3、完成步骤2后，获得P2V/GAPDH mRNA水平。检测方法同步骤一中3-5。
检测结果见图7(Mock为未加入人乳清蛋白)。结果表明，人乳清蛋白可以抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V的复制能力，即人乳清蛋白可以抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞。
四、干扰素抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞
干扰素为干扰素α、干扰素β或干扰素γ。
1、取细胞培养板，加入500μL实施例1中步骤一制备的肺上皮细胞培养液(约20000个肺上皮细胞)，37℃、5％CO2培养过夜。
2、完成步骤1后，接种穿山甲冠状病毒GX_P2V(接种病毒量为0.1MOI)，之后加入干扰素并使干扰素在体系中的浓度为1ng/ml、10ng/ml或100ng/ml，37℃、5％CO2培养24h、48h或72h。同时只接种穿山甲冠状病毒GX_P2V(接种病毒量为0.1MOI)不加入干扰素，37℃、5％CO2培养24h、48h或72h，作为对照。
3、完成步骤2后，获得P2V/GAPDH mRNA水平。检测方法同步骤一中3-5。
检测结果见图7(Mock为未加入干扰素)。结果表明，干扰素α、干扰素β和干扰素γ均可以抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V的复制能力，即干扰素α、干扰素β和干扰素γ均可以抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V感染肺上皮细胞。
上述结果表明，SARS-CoV-2假病毒和穿山甲冠状病毒GX_P2V可以感染实施例1中步骤一制备的肺上皮细胞，瑞德西韦、千金藤素、人乳清蛋白、干扰素α、干扰素β和干扰素γ均可以抑制穿山甲冠状病毒GX_P2V或SARS-CoV-2假病毒感染肺上皮细胞。由此可见，实施例1中步骤一制备的肺上皮细胞可以作为细胞模型筛选抑制SARS-CoV-2假病毒和穿山甲冠状病毒GX_P2V的药物。
按照上述方法，将基础培养基1替换为基础培养基2或基础培养基3，其它步骤均不变。结果表明，采用基础培养基1分化获得的肺上皮细胞、采用基础培养基2分化获得的肺上皮细胞和采用基础培养基3分化获得的肺上皮细胞的实验结果均无显著差异。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (7)
1.一种从前肠内胚层细胞分化产生肺上皮细胞的方法，包括如下步骤：
(a4)将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天；
所述分化培养基I为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；
所述分化培养基I中，CHIR99021的浓度为1-10μM；BMP4的浓度为5-15ng/ml；视黄醇的浓度为1-10μM；FGF10的浓度为10-25ng/ml；FGF7的浓度为5-20ng/ml；
(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；
所述分化培养基II为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7后得到的培养基；
所述分化培养基II中，CHIR99021的浓度为1-10μM；IBMX的浓度为0.05-0.15mM；地塞米松的浓度为30-60nM；FGF10的浓度为10-25ng/ml；FGF7的浓度为5-20ng/ml；
所述基础培养基的溶质及其浓度为(1-2)×N2 supplement、(1-2)×B27、40-100ng/ml维生素C、1-5mM谷氨酰胺、0.1-1.0μM硫代甘油和0.01-0.1％牛白蛋白；溶剂为40-60％的DMEM/F12和40-60％的IMDM。
2.一种从内胚层细胞分化产生肺上皮细胞的方法，包括如下步骤：
(a2)将内胚层细胞接种至分化培养基A，培养1-2天；
所述分化培养基A为在基础培养基中加入Dorsomorphin和SB431542后得到的培养基；
(a3)完成步骤(a2)后，将所述细胞接种至分化培养基B，培养1-3天，得到前肠内胚层细胞；
所述分化培养基B为在基础培养基中加入IWP2和SB431542后得到的培养基；
(a4)完成步骤(a3)后，将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天；
所述分化培养基I为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；
所述分化培养基I中，CHIR99021的浓度为1-10μM；BMP4的浓度为5-15ng/ml；视黄醇的浓度为1-10μM；FGF10的浓度为10-25ng/ml；FGF7的浓度为5-20ng/ml；
(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；
所述分化培养基II为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7后得到的培养基；
所述分化培养基II中，CHIR99021的浓度为1-10μM；IBMX的浓度为0.05-0.15mM；地塞米松的浓度为30-60nM；FGF10的浓度为10-25ng/ml；FGF7的浓度为5-20ng/ml；
所述基础培养基的溶质及其浓度为(1-2)×N2 supplement、(1-2)×B27、40-100ng/ml维生素C、1-5mM谷氨酰胺、0.1-1.0μM硫代甘油和0.01-0.1％牛白蛋白；溶剂为40-60％的DMEM/F12和40-60％的IMDM。
3.一种从胚胎干细胞分化产生肺上皮细胞的方法，包括如下步骤：
(a1)取胚胎干细胞，分化，获得内胚层细胞；
(a2)完成步骤(a1)后，将内胚层细胞接种至分化培养基A，培养1-2天；
所述分化培养基A为在基础培养基中加入Dorsomorphin和SB431542后得到的培养基；
(a3)完成步骤(a2)后，将所述细胞接种至分化培养基B，培养1-3天，得到前肠内胚层细胞；
所述分化培养基B为在基础培养基中加入IWP2和SB431542后得到的培养基；
(a4)完成步骤(a3)后，将前肠内胚层细胞接种至分化培养基I，培养8-12天；
所述分化培养基I为在基础培养基中加入CHIR99021、BMP4、视黄醇、FGF10和FGF7后得到的培养基；
所述分化培养基I中，CHIR99021的浓度为1-10μM；BMP4的浓度为5-15ng/ml；视黄醇的浓度为1-10μM；FGF10的浓度为10-25ng/ml；FGF7的浓度为5-20ng/ml；
(a5)完成步骤(a4)后，将所述细胞接种至分化培养基II，继续培养，直至获得肺上皮细胞；
所述分化培养基II为在基础培养基中加入CHIR99021、IBMX、地塞米松、FGF10和FGF7后得到的培养基；
所述分化培养基II中，CHIR99021的浓度为1-10μM；IBMX的浓度为0.05-0.15mM；地塞米松的浓度为30-60nM；FGF10的浓度为10-25ng/ml；FGF7的浓度为5-20ng/ml；
所述基础培养基的溶质及其浓度为(1-2)×N2 supplement、(1-2)×B27、40-100ng/ml维生素C、1-5mM谷氨酰胺、0.1-1.0μM硫代甘油和0.01-0.1％牛白蛋白；溶剂为40-60％的DMEM/F12和40-60％的IMDM。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
所述分化培养基A中，Dorsomorphin的浓度为1-2uM；SB431542的浓度为8-12uM；
所述分化培养基B中，IWP2的浓度为0.5-1.5uM；SB431542的浓度为8-12uM。
5.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述培养的条件为35-39℃、3-7％CO2培养。
6.由权利要求1中所述分化培养基I和所述分化培养基II组成的成套培养基。
7.K1)、K2)、K3)、K4)、K5)和K6)中的至少一种：
K1)权利要求6所述成套培养基在前肠内胚层细胞分化产生肺上皮细胞中的应用；
K2)权利要求6所述成套培养基在内胚层细胞分化产生肺上皮细胞中的应用；
K3)权利要求6所述成套培养基在胚胎干细胞分化产生肺上皮细胞中的应用；
K4)采用权利要求1至5任一所述的方法制备的肺上皮细胞作为细胞模型的应用；
K5)采用权利要求1至5任一所述的方法制备的肺上皮细胞作为细胞模型筛选药物中的应用；
K6)采用权利要求1至5任一所述的方法制备的肺上皮细胞作为细胞模型筛选抑制病毒药物中的应用。
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