CN116478919A - 一种诱导多能干细胞向红细胞高效分化的体系建立及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多能干细胞向红细胞高效分化的体系建立及其应用，利用STEMdiffTM造血祖细胞分化试剂盒诱导多能干细胞向造血干组细胞分化，和分三个阶段将造血干祖细胞诱导分化成红细胞。本发明提供了一种无需血清和基质细胞、周期短、重复性好、高产率生成CD34+造血干祖细胞(一个多能干能生成100个造血干祖细胞)的优化体系。该体系生成CD34+造血干祖细胞的效率高达90％左右，无需分选，可直接用于下游红细胞的分化。本发明通过在无基质细胞参与的分化体系中添加BRD4抑制剂(+)‑JQ1或MS436促进红细胞的终末分化，进而将脱核效率提高到20％左右。本发明为人工血液的制备提供新方法。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程领域，涉及一种诱导多能干细胞向红细胞高效分化的体系建立及其应用。
背景技术
近年来，随着医疗技术的迅猛发展和人民群众健康需求不断提升，医疗机构对血液的需求量呈现快速增长的趋势。随着我国人口老龄化加剧，预计2036年血液供应将在2016年基数上减少16.0％，而输血需求增加33.1％。因此，解决血液供应不足问题迫在眉睫。此外，捐献的血液还面临HIV病毒、肝炎病毒等各种病原体传染的风险。流行病的爆发严重影响血液供应链，更使本来紧缺的临床血液库存受到极大的挑战。人工红细胞不仅可以为血液供应提供新的来源，保证临床血液供应；而且有利于保证血液安全，免受传染病等因素的影响；还有利于及时满足稀有血型患者的输血需求。
目前利用多能干细胞诱导分化有临床应用价值的CAR-T细胞、CAR-NK细胞和CAR-Mac取得了重大突破，已经在临床上被用于治疗白血病、淋巴瘤等恶性血液疾病并取得很好的疗效，这更为利用干细胞生产人工红细胞带来了希望。然而，目前诱导干细胞向红细胞仍存在分化效率低、脱核效率低、规模化生产难等问题。
红细胞的生成包含一系列复杂的细胞命运改变事件。造血干祖细胞(Hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs)经历早期和晚期红系祖细胞集落形成单位生成原始红细胞，原始红细胞经过连续数次有丝分裂依次形成早、中和晚幼红细胞，晚幼红细胞脱核生成网织红细胞并最终形成成熟红细胞。原始红细胞生成晚幼红细胞的过程是红细胞成熟脱核的关键，被称为红系终末分化。
溴结构域蛋白4(Bromodomain-containing protein 4,BRD4)是BET家族的重要成员，是重要的表观遗传调节蛋白和转录调控蛋白，对于细胞正常生长、细胞周期的进行具有重要意义。BRD4在早期胚胎发育、干细胞干性维持、癌症发生、免疫治疗中发挥重要作用。针对BRD4已开发出多种抑制剂，且其单药或联合其它肿瘤抑制剂应用均显现出良好的抗肿瘤作用。其中，(+)-JQ1(分子式：C23H25ClN4O2S；CAS:1268524-70-4)和MS436(分子式：C18H17N5O3S；CAS：1395084-25-9)是两个BET bromodomain抑制剂，能有效抑制BRD4。
发明内容
本发明的目的是针对目前体外多能干细胞诱导红细胞分化效率低和脱核效率低的难题，提供一种诱导多能干细胞向红细胞高效分化的体系构建方法，所述体系是一种促进红细胞终末分化和脱核效率的分化体系。
本发明提供一种多能干细胞向红细胞高效分化的体系，包括利用STEMdiffTM造血祖细胞分化试剂盒诱导多能干细胞向造血干组细胞分化，和分三个阶段将造血干祖细胞诱导分化成红细胞。
具体通过以下步骤实现：
(1)分化前1天用ReLeSRTM细胞解离液将多能干细胞解离成小的细胞聚集体，将30-40个100-200uM大小的细胞细胞聚集体种到提前铺被基质胶的12孔板培养孔中，用造血分化培养基A(培养基A)培养3天诱导多能干细胞向中胚层分化，然后换成造血分化培养基B(培养基B)。分化的前6天隔天进行半换液，第7天开始每天换新鲜的培养基B，至分化的第12天，且换培养基前，将悬浮的血样细胞收集到15ml离心管中离心，用PBS洗一遍，然后用新鲜培养基重悬，合并到原来的培养孔里继续培养。
(2)分化的第12天，将悬浮的血样细胞收集到15ml离心管中，用PBS洗一遍，并将PBS合并到收集悬浮细胞的离心管中；
(3)对于贴壁细胞，用Accutase细胞消化液在培养箱消化8-10min，加入3倍Accutase细胞消化液体积的DMEM/F12基础培养基终止消化，用40uM孔径的细胞过滤器过滤，将消化后的单细胞悬液收集到步骤(2)中的离心管中，300g,A9,D9，离心5min，弃上清，此阶段的细胞即为造血干祖细胞；
(4)红细胞的高效分化：
(a)分化的第一阶段(阶段Ⅰ)，以1*105cell/ml的密度将造血干祖细胞种到第一阶段的红系分化培养基中，分化6天；第一阶段红系分化培养基成分：100ng/ml干细胞因子(Stem cell factor，SCF)，3U/ml促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)、10ng/ml白介素-3(Interleukin-3，IL-3)，50ug/ml的全转铁蛋白，40ng/ml的胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor，IGF-1)，50uM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(1-Methyl-3-Isobutylxanthine，IBMX)，1uM的地塞米松(Dexamethasone，DEX)，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素；
(b)分化的第二阶段(阶段Ⅱ)，将步骤(a)中红系前体细胞以1*105cell/ml的密度种到第二阶段的红系分化培养基中，分化4天，；第二阶段红系分化培养基成分：50ng/mlSCF，3U/ml EPO，50ug/ml的转铁蛋白，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素，该过程添加BRD4抑制剂(+)-JQ1或MS436；
(c)分化的第三阶段(阶段Ⅲ)，将步骤(b)中红系前体细胞以0.5-1*106cell/ml的密度种到第三阶段的红系分化培养基中，分化8天；第三阶段红系分化培养基成分：1U/mlEPO，1mg/ml的转铁蛋白，3％AB血清，2％human plasma，5ug/ml的Insulin,3U/ml的Heparin，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素。
其中(b)中优化的(+)-JQ1浓度为100nM；优化的MS436浓度为10uM。
本发明的另一个目的是提供所述体系在诱导人工红细胞中的应用，所述应用是诱导多能干细胞向红细胞高效分化，为人工血液的制备提供新方法。
本发明提供的多能干细胞向红细胞分化的过程包括多能干细胞生成造血干祖细胞，和造血干祖细胞生成红细胞。目前一般利用过表达多个转录因子，或结合拟胚体形成，或基质细胞共培养的方法诱导多能干细胞生成造血干祖细胞，存在分化周期长、分化效率低、重复性差、基质细胞增加临床应用安全性等问题。本发明提供了一种无需血清和基质细胞、周期短(12天)、重复性好、高产率生成CD34+造血干祖细胞(一个多能干能生成100个造血干祖细胞)的优化体系。该体系生成CD34+造血干祖细胞的效率高达90％左右，无需分选，可直接用于下游红细胞的分化。
目前利用多能干细胞来源的造血干祖细胞诱导红细胞的技术难题是脱核效率极低(2-5％)。借助基质细胞能促进脱核，但是增加了临床应用的安全隐患。本发明通过在无基质细胞参与的分化体系中添加BRD4抑制剂(+)-JQ1或MS436促进红细胞的终末分化，进而将脱核效率提高到20％左右。本发明为人工血液的制备提供新方法。
附图说明
图1为本发明提供的诱导多能干细胞生成红细胞的体系示意图。
图2为利用STEMdiffTM造血祖细胞分化试剂盒诱导多能干细胞生成造血干组细胞的效率。体系优化后活细胞比例更高，CD34+CD43+造血干祖细胞比例更高。
图3为优化多能干细胞向造血干祖细胞生成的体系后，造血干祖细胞高效生成红细胞的结果图。
图4为多能干细胞来源的造血干祖细胞向红细胞终末分化的流式结果图，结果显示BRD4抑制剂MS436显著促进多能干细胞来源的造血干祖细胞向红细胞的终末分化。
图5为多能干细胞来源的造血干祖细胞生成脱核红细胞的流式结果图，结果显示BRD4抑制剂MS436促进多能干细胞来源的造血干祖细胞生成脱核红细胞。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，此处描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1优化多能干细胞向造血干祖细胞分化的体系
首先尝试了不同方法诱导多能干细胞向CD34+造血干祖细胞分化。其中STEMdiffTMHematopoietic Kit(Stemcell technologies,catalog#05310)诱导体系包含培养基A和培养基B，仅需分化的前3天用培养基A诱导多能干细胞向中胚层分化，然后换成培养基B培养至第12天。该方法操作简单，无需血清和基质细胞，且周期短，但是产生造血干祖细胞的效率不高。通过观察分化过程中细胞的变化，发现按照STEMdiffTMHematopoieticKit说明书中的方法诱导分化时，分化后期(D7之后)悬浮的死细胞较多，且培养基颜色偏黄。我们将说明书中的隔天吸走一半旧培养液补加一半新鲜培养液的半换液方法改成D7之后每天完全换成新鲜的培养基B。同时，为防止换液时丢失血样悬浮细胞，换液前将原来培养液转移到15ml管，并用PBS洗一遍后吸走与转移的培养液合并离心，将离心后的细胞沉淀用新鲜培养基B重悬后加到原孔。优化后的具体实验方案如下(见附图1)。
分化前一天(D-1)，用ReLeSRTM细胞解离液(Stemcell technologies，05872)处理4分钟，将多能干细胞解离成小的细胞聚集体，用mTeSR培养基(Stemcell technologies，85851)重悬细胞聚集体并计数。取30-40个100-200uM大小的细胞聚集体种到提前铺被基质胶的12孔板培养孔中，用mTeSR培养基培养24小时。
用STEMdiffTMHematopoietic Kit中的培养基A培养3天(D0-D3)诱导多能干细胞向中胚层分化，然后换成STEMdiffTMHematopoietic Kit中的培养基B。分化的前6天隔天进行半换液，第7天开始每天换新鲜的培养基B，至分化的第12天，且换培养基前，将悬浮的血样细胞收集到15ml离心管中离心，用PBS洗一遍，然后用新鲜培养基重悬，合并到原来的培养孔里继续培养。
分化的第12天，将悬浮的血样细胞收集到15ml离心管中，用PBS洗一遍，并将PBS合并到收集悬浮细胞的离心管中；对于贴壁细胞，用Accutase细胞消化液(Stemcelltechnologies，07920)在培养箱消化8-10min，加入3倍Accutase细胞消化液体积的DMEM/F12基础培养基(Hyclone，SH30023.01B)终止消化，用40uM孔径的细胞过滤器过滤，将消化后的单细胞悬液收集到上述悬浮细胞的离心管中，300g,A9,D9，离心5min，弃上清，此阶段的细胞即为造血干祖细胞。
优化后的方法提高了悬浮细胞的数量和活率，且CD34+造血干祖细胞比例达到90％左右(附图2)，不用分选可直接用于下游红细胞的分化。此外，我们用Accutase将贴壁细胞消化下来进行流式检测，发现CD34+细胞比例也达到80％以上。将悬浮细胞和贴壁细胞不经分选直接用于下游红系分化，发现能获得90％以上的CD71+GPA+红细胞(附图3A)。我们优化后的体系显著提高了红细胞的诱导效率，且节约实验成本的同时简化了实验过程。
实施例2优化造血干祖细胞向红细胞分化的体系
2.1分化第一阶段(阶段Ⅰ)
取步骤1中分化至第12天的造血干祖细胞，用第一阶段培养基重悬计数，以1*105cell/ml的密度种到12孔细胞培养板中，每个孔加1ml第一阶段培养基。分化的第3天补加1ml培养基，之后隔天补1ml第一阶段培养基至6天。
第一阶段培养基成分：100ng/ml SCF(PeproTech,300-07)，3U/ml EPO(Stemcelltechnologies，78007)、10ng/ml IL3(PeproTech,200-03)，50ug/ml的转铁蛋白(Sigma,T0665)，40ng/ml的IGF1(Stemcell technologies,78022.1)，50uM的IBMX(陶素，T1713)，1uM的DEX(陶素，T1076)，100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素(青霉素-链霉素混合液，Solarbio，P1400)。
2.2分化第二阶段(阶段Ⅱ)
将2.1中分化第6天的细胞收集到15ml离心管中，300g,A9,D9，离心5min，用第二阶段培养基重悬细胞，计数，以1*105cell/ml的密度种到12孔细胞培养板中，每个孔加1ml第二阶段培养基。分化的第9天(第二阶段的第3天)补加1ml培养基，培养至第10天。第二阶段培养基全程添加100nM的(+)-JQ1或10uM的MS436。
第二阶段培养基成分：50ng/ml SCF，3U/ml EPO，50ug/ml的转铁蛋白，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素。
2.3分化第三阶段(阶段Ⅲ)
将分化第10天的细胞收集到15ml离心管中，300g,A9,D6，离心5min，用第三阶段培养基重悬细胞，计数，以0.5-1*106cell/ml的密度种到12孔细胞培养板中，每个孔加1ml第三阶段培养基。第13天(第三阶段第3天)之后隔天补加0.5ml培养基，直至分化的第18天(第三阶段第8天)。
第三阶段培养基成分：1U/ml EPO，1mg/ml的转铁蛋白，3％ AB血清(Gemini,100-512)，2％人血浆，5ug/ml的Insulin(陶素，T8221),3U/ml的Heparin(BioFroxx,1170GR005)，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素。
实施例3细胞流式术检测多能干细胞来源红细胞分化情况
3.1造血干祖细胞及红细胞表面抗原检测
(1)细胞悬液制备：对于要检测的造血干祖细胞或分化不同阶段的红细胞，取1×105个细胞加入流式管中，用1ml PBS重悬清洗，300g转速离心5min，弃上清；
(2)抗体标记：用100μL PBS重悬细胞成单细胞悬液，加入1ul要检测表面抗原的抗体，4℃避光孵育30min；
(3)洗涤：每管加入1mLPBS缓冲液，混匀后常温下300g离心5min，弃上清；
(4)流式管中添加300-400μL PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测；
(5)FlowJo X 10.0.7r2软件分析数据。结果见附图2，附图3A，和附图4。附图2结果显示优化多能干细胞生成造血干祖细胞的培养体系后，造血细胞活率提高了一倍左右，且CD34+造血干祖细胞比例高达90％左右。附图3A显示我们的体系中造血干祖细胞生成GPA+CD71+红细胞的效率高达90％以上。附图4显示添加BRD4抑制剂后显著促进红细胞的终末分化。
3.2红细胞脱核效率检测
(1)细胞悬液制备：对于要检测的分化后期的红细胞，取1×105个细胞加入流式管中，用1ml PBS重悬清洗，300g，A4，D4，离心5min，弃上清。
(2)DRAQ5标记：用100μL PBS重悬细胞成单细胞悬液，加入2ul DRAQ5，4℃避光孵育30min。
(3)上机检测：每管补加300uL PBS缓冲液，流式细胞仪上机检测。
(4)FlowJo X 10.0.7r2软件分析数据。结果见附图5。附图4结果显示添加BRD4抑制剂后红细胞脱核率提高2倍左右。
实施例4qPCR检测多能干细胞来源红细胞表达血红蛋白情况
(1)设计不同血红蛋白链的qPCR引物，将正反引物以2.5pmol浓度稀释到一个管子。(2)收集2-5*105个多能干细胞来源的红细胞，用500ul Trizol裂解1min。(3)提取RNA，并取1ug RNA进行逆转录得到cDNA模版。(4)将(2)中cDNA模版20倍稀释，检测不同血红蛋白基因的表达情况。结果见附图3B。附图3B显示我们的体系生成的红细胞在转录水平同时表达胎儿期和成体期血红蛋白。
实施例5HPLC检测多能干细胞来源红细胞表达血红蛋白情况
(1)样本处理：取1*108个多能干细胞来源的红细胞溶于1ml HPLC级别双蒸水中，-80℃冰箱放置10min，37℃水浴锅5min。反复冻融3次。另取等量的脐带血红细胞和成人外周血红细胞反复冻融3次做对照。(2)12000rpm，四度离心10min，将含血红素的上清液转移到提前预冷的EP管中。(3)仪器准备：将配置好的有机相A相(acetonitrile–methanol,at 90:10(v/v))和无机相B相(0.5％ TFA in deionized water at pH 2.6)进行过滤。过滤好后进入仪器进行更换有机相与无机相，同时更换柱子。(4)打开软件，调节LC 20AT进行排气，排气以100％的A相2.0min/ml的流速运行3min，再以100％的B相2.0min/ml的流速运行3min。接着平衡柱压。(5)上样检测：将相应样本按顺序排放于进样区，软件上编号，且进行设置检测程序，点击“Start”按钮进行检测。(6)检测完成后，根据相应程序清洗柱子并分析数据。结果见附图3C。附图3C显示我们的体系生成的红细胞在蛋白水平同时表达胎儿期和成体琪血红蛋白。
Claims (4)
1.一种诱导多能干细胞向红细胞高效分化的体系建立，其特征在于，包括利用STEMdiffTM造血祖细胞分化试剂盒诱导多能干细胞向造血干组细胞分化，并分三个阶段将造血干祖细胞诱导分化成红细胞。
2.根据权利要求1所述的体系建立，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)分化前1天用ReLeSRTM细胞解离液将多能干细胞解离成小的细胞聚集体，将30-40个100-200uM大小的细胞聚集体种到提前铺被基质胶的12孔板培养孔中，用造血分化培养基A(培养基A)培养3天诱导多能干细胞向中胚层分化，然后换成造血分化培养基B(培养基B)，分化的前6天隔天进行半换液，第7天开始每天换新鲜的造血分化培养基B，至分化的第12天，且换培养基前，将悬浮的血样细胞收集到15ml离心管中离心，用PBS洗一遍，然后用新鲜培养基重悬，合并到原来的培养孔里继续培养；
(2)分化的第12天，将悬浮的血样细胞收集到15ml离心管中，用PBS洗一遍，并将PBS合并到收集悬浮细胞的离心管中；
(3)对于贴壁细胞，用Accutase细胞消化液在培养箱消化8-10min，加入3倍Accutase细胞消化液体积的DMEM/F12基础培养基终止消化，用40uM孔径的细胞过滤器过滤，将消化后的单细胞悬液收集到步骤(2)中的离心管中，300g,A9,D9，离心5min，弃上清，此阶段的细胞即为造血干祖细胞；
(4)红细胞的高效分化：
(a)分化的第一阶段，以1*105cell/ml的密度将造血干祖细胞种到第一阶段的红系分化培养基中，分化6天；第一阶段红系分化培养基成分：100ng/ml干细胞因子(Stem cellfactor，SCF)，3U/ml促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)、10ng/ml白介素-3(Interleukin-3，IL-3)，50ug/ml的全转铁蛋白，40ng/ml的胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor，IGF-1)，50uM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(1-Methyl-3-Isobutylxanthine，IBMX)，1uM的地塞米松(Dexamethasone，DEX)，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素；
(b)分化的第二阶段，将步骤(a)中红系前体细胞以1*105cell/ml的密度种到第二阶段的红系分化培养基中，分化4天，；第二阶段红系分化培养基成分：50ng/ml SCF，3U/ml EPO，50ug/ml的转铁蛋白，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素，该过程添加BRD4抑制剂(+)-JQ1或MS436；
(c)分化的第三阶段，将步骤(b)中红系前体细胞以0.5-1*106cell/ml的密度种到第三阶段的红系分化培养基中，分化8天；第三阶段红系分化培养基成分：1U/ml EPO，1mg/ml的转铁蛋白，3％AB血清，2％human plasma，5ug/ml的Insulin,3U/ml的Heparin，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素。
3.根据权利要求2所述的体系建立，其特征在于，其中(b)中优化的(+)-JQ1浓度为100nM；优化的MS436浓度为10uM。
4.权利要求1所述的所述体系建立方法在诱导人工红细胞中的应用。
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| CN202310298906.5A CN116478919A (zh) | 2023-03-24 | 2023-03-24 | 一种诱导多能干细胞向红细胞高效分化的体系建立及其应用 |
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| CN (1) | CN116478919A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113207297A (zh) * | 2018-12-20 | 2021-08-03 | 住友化学株式会社 | 包含胚胎型成红细胞的细胞群体及其制备方法、细胞培养组合物以及化合物试验方法 |
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2023
- 2023-03-24 CN CN202310298906.5A patent/CN116478919A/zh active Pending
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