CN116376822A - 利用人多潜能干细胞体外制备t淋巴细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种造血祖细胞和/或T淋巴细胞，及其制备方法与应用。本发明提供了制备T淋巴细胞的方法，包括以下步骤：(1)将多潜能干细胞在中胚层诱导培养基中培养，获得中胚层细胞；(2)将步骤(1)获得的中胚层细胞在生血内皮诱导培养基中培养，获得生血内皮细胞；(3)将步骤(2)获得的生血内皮细胞在造血祖细胞诱导培养基中培养，获得CD34+造血祖细胞；(4)将步骤(3)获得的CD34+造血祖细胞与表达DLL4的基质细胞及凝胶共聚集滴到培养板中形成3D结构，或直接与表达DLL4的基质细胞共聚集滴到Transwell板中，在T淋巴诱导培养基中培养，获得T淋巴细胞。本发明的制备方法中所使用的培养基成分明确，可高效制备出大量功能性T淋巴细胞。
Description
技术领域
本发明属于干细胞分化技术领域，更具体地，本发明涉及诱导多潜能干细胞制备造血祖细胞和T淋巴细胞的方法。
背景技术
近年来，癌症免疫治疗取得重大进展，为攻克癌症的治疗带来了新希望(Couzin- Frankel,J，2013)。其中，利用表达嵌合抗原受体的T细胞(Chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T细胞)进行的T细胞过继性治疗白血病更是取得了革命性的突破(Grupp SA et al.,2013)。这种方法是通过构建嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，将识别肿瘤相关抗原的单链抗体和T细胞的活化基序结合为一体，转染自体T细胞(CAR-T细胞)形成基因编辑后的CAR-T细胞，使得病人自体T细胞具有特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力。将这种经过基因修饰的CAR-T细胞自体移植回输患者，就可以特异性地杀伤肿瘤细胞。
然而，CAR-T疗法目前存在T细胞来源有限，制备繁琐，成本过高等问题。人多能干细胞具有自我更新并定向分化成功能细胞的潜力，并且人多能干细胞相对易于进行基因编辑和筛选。因此，人多能干细胞成为建立通用型的，并提供无限的，安全的，功能性的T细胞提供了最佳的种子细胞。在多潜能干细胞制备功能性T细胞方面，Michele Sadelain团队诱导多潜能干细胞获得嵌合CAR-CD19的T细胞，并具有一定的肿瘤杀伤功能(Themeli,M.， 2013)。美国Crooks团队利用MS5DLL4基质细胞建立3D体外分化体系，获得了CD8b阳性的T淋巴细胞，但体内杀伤能力较弱(Montel-Hagen A，2018)。日本Shin Kaneko团队在利用多潜能干细胞分化方面取得了进展，建立了基于OP9基质细胞产生多能干细胞来源的T细胞，在体外具有较强的增殖能力和杀伤能力。但是该体系含有血清，不利于临床的转化应用(Minagawa A，2018；Kawai Y,2021)。
在本研究中，主要采用人化学诱导重编程多潜能干细胞(Guanet al.,2022),基于我们以往的研究基础(Wang et al.,2012)，建立了高效诱导的、化学成分明确的分化方法产生造血祖细胞，再将分化来源的造血祖细胞与表达D LL4的基质细胞共聚集形成类3D结构，或将多潜能干细胞来源的造血祖细胞直接与表达DLL4的基质混合滴到Transwell培养板中进行分化，产生大量的功能性T淋巴细胞。人多潜能干细胞来源的T淋巴细胞表达杀伤特性的标志蛋白，并能在体内体外表现直接杀伤细胞的能力。因此，人多潜能干细胞来源的T淋巴细胞为建立新的免疫疗法辅助肿瘤治疗带来希望。
发明内容
在本发明中，我们建立了一个逐级诱导多潜能干细胞向T淋巴细胞分化的策略。该分化过程包括多潜能干细胞向中胚层细胞分化、中胚层细胞向生血内皮细胞分化、生血内皮细胞向造血祖细胞的分化以及造血祖细胞向T淋巴细胞的分化。基于我们之前的研究基础(Wang et al.,2012)，我们进一步优化了中胚层细胞向生血内皮细胞分化以及生血内皮细胞向造血祖细胞分化的方法，能够诱导多潜能干细胞更高效地产生功能更强的造血祖细胞。这些造血祖细胞能与表达DLL4的基质细胞共聚集，自发形成聚集体，通过与凝胶混合形成类3D结构，在T细胞诱导条件下产生大量功能性的T淋巴细胞。T淋巴细胞分化过程模拟体内T细胞发育进程，通过产生CD34+CD7+(double negative)的淋巴T细胞祖细胞，再分化产生CD7+CD4+ISP(intermediate single positive)阶段淋巴细胞，进一步分化产生CD4+CD8+DP(double positive)细胞和CD4+/CD8+SP(single positive)细胞。在关键转录因子的表达方面，分化得到的T细胞与胚胎期胸腺T细胞(Thymus-T)接近，多能干细胞分化来源的T细胞经过CD3/CD28的刺激，可以在体外扩增近100倍，使用在体外扩增后的T细胞进行肿瘤细胞杀伤实验，扩增的T呈现出较强的肿瘤杀伤能力，并且具有特异性肿瘤杀伤能力。该研究为今后开发基于T细胞的免疫疗法提供了无限的细胞来源。
在本发明中，表述“多潜能干细胞”表示诱导多潜能干细胞iPS，或胚胎干细胞。
具体地，本发明提供了以下技术方案：
1.制备T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
将诱导多能干细胞iPS或胚胎干细胞在中胚层诱导培养基中培养，获得中胚层细胞；
将获得的中胚层细胞在生血内皮诱导培养基中培养，获得生血内皮细胞；
将获得的生血内皮细胞在造血祖细胞诱导培养基中培养，获得造血祖细胞，从中分选CD34+造血祖细胞；和
将获得的CD34+造血祖细胞与表达DLL4的基质细胞及凝胶混合共聚集，在T淋巴细胞诱导培养基中培养，获得T淋巴细胞(优选杀伤性T淋巴细胞，iNKT淋巴细胞，辅助性T淋巴细胞)；
在所述获得T淋巴细胞的步骤中，优选将获得的CD34+造血祖细胞与表达DLL4的基质细胞(例如人基质细胞或鼠基质细胞)及凝胶混合共聚集滴到培养板中形成3D结构，或直接与表达DLL4的基质细胞共聚集滴到Transwell板中，在T淋巴细胞诱导培养基中培养，从而获得T淋巴细胞。
2.项目1所述的方法，其中，所述中胚层诱导培养基包含BMP4,Wnt信号激活剂(例如WNT 3a,CHIR-99021),bFGF；优选地，所述中胚层诱导培养基包含5-100ng/mL BMP4,3-20μM/mlCHIR-99021、5-100ng/mL bFGF，更优选地包含20ng/mLBMP4、10μM/ml CHIR-99021、20ng/mLbFGF，优选地，所述中胚层诱导培养基使用RPMI1640培养基，更优选地，在RPMI1640培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸和0.1mM硫代甘油。
3.项目1或2所述的方法，其中，所述生血内皮诱导培养基包含BMP4、VEGF、bFGF，TGFβ受体/ALK5抑制剂(例如SB431542、LY-364947、SB-505或A-83-01)；优选地，所述生血内皮诱导培养基包含5-50ng/ml BMP4、10-100ng/ml VEGF、10-100ng/ml bFGF、5-20μMSB431542，更优选地包含5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542，优选地，所述生血内皮诱导培养基使用RPMI1640培养基，更优选地，在RPMI1640培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸，0.1mM硫代甘油。
4.项目1-3任一项所述的方法，其中，所述造血祖细胞诱导培养基包含VEGF和促造血祖细胞生成因子(例如SCF、Flt3 Ligand,TPO、IL7)和TGFβ受体/ALK5抑制剂；优选地，所述造血祖细胞诱导培养基包含5-100ng/ml VEGF和20-200ng/ml SCF,20-200ng/ml Flt3Ligand,20-200ng/ml TPO，TGFβ受体/ALK5抑制剂(例如SB431542、LY-364947、SB-505或A-83-01,IL7，更优选地包含5-20ng/ml VEGF和20-50ng/ml SCF、20-50ng/ml Flt3 Ligand、20-50ng/ml TPO、5-20ng/ml IL7，5-20ng/mL 5-20μMSB43154,最优选地包含5ng/ml VEGF、50ng/ml SCF、50ng/ml Flt3 Ligand、50ng/mL TPO，5ng/mL IL7、10μM SB43154，
优选地，所述造血祖细胞诱导培养基使用IMDM培养基，更优选地，在IMDM培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸，0.1mM硫代甘油，2uM minocyclinehydrochloride，30uM NAC。
5.项目1-4任一项所述的方法，其中，所述基质细胞包括但不限于人骨髓基质细胞，人成纤维细胞和人内皮细胞，优选地，所述凝胶包括但不限于Matrigel、VITROGEL、iMatrix 511、PEG，优选包含Matrigel，优选地，所述T淋巴细胞诱导培养基包含促T细胞生成细胞因子(如SCF，Flt3Ligand和IL-7)，更优选地，所述T淋巴细胞诱导培养基包含5-100ng/ml SCF，5-100ng/ml Flt3 Ligand和5-100ng/ml IL7；最优选包含10ng/ml SCF和10ng/ml Flt3 Ligand,5ng/mL IL7，优选地，所述T淋巴细胞诱导培养基使用IMDM培养基，更优选地，在IMDM培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸，0.1mM硫代甘油，2uM minocycline hydrochloride，30uM NAC。
6.项目1-5任一项所述的方法，其中所述多潜能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多潜能干细胞，优选来自哺乳动物，更优选来自小鼠或人，最优选来自人；其中，所述胚胎干细胞为从商业途径获得的胚胎干细胞，优选为下述任一种NIH编号的细胞系的细胞：BG01、BG02、BG03、BG04、SA01、SA02、SA03、ES01、ES02、ES03、ES04、ES05、ES06、TE03、TE32、TE33、TE04、TE06、TE62、TE07、TE72、UC01、UC06、WA01、WA07、WA09、WA13和WA14。
7.项目1所述的方法，其中所述基质细胞为小鼠骨髓基质细胞及人骨髓基质细胞(例如HS-5、HS-27A)；人成纤维细胞(例如WI-38、IMR-90、BJ、HFF-1、Hs 67、F.thy 62891)；人内皮细胞(例如HUVEC、HAEC、HPAEC)。
8.制备T淋巴细胞的方法，其特征在于，包含以下步骤：
将诱导多能干细胞iPS或胚胎干细胞在中胚层诱导培养基中培养，获得中胚层细胞；
将获得的中胚层细胞在生血内皮诱导培养基中培养，获得生血内皮细胞；
将获得的生血内皮细胞在造血祖细胞诱导培养基中培养，获得造血祖细胞，从中分选CD34+造血祖细胞；
将获得的CD34+造血祖细胞与表达DLL4的鼠基质细胞(例如鼠MS-5)及凝胶混合共聚集，在T淋巴细胞诱导培养基中培养，获得T淋巴细胞(优选杀伤性T细胞)。
9.项目1-2或4-8任一项所述的方法，其中，所述生血内皮诱导培养基包含BMP4、VEGF、bFGF、TGFβ受体/ALK5抑制剂(例如SB431542、LY-364947、SB-505或A-83-01)、Wnt信号激活剂(例如WNT 3a,CHIR-99021)；优选地，所述生血内皮诱导培养基包含5-50ng/mlBMP4、10-100ng/ml VEGF、10-100ng/ml bFGF,5-20μM SB431542、3-10μMCHIR-99021，更优选地包含5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542、3μM/ml CHIR-99021。
10.项目9所述的方法，其中所述生血内皮诱导培养基还包含RA信号激活剂(例如Alltrans-retinoic acid、AM580)，优选地，2-10μMRA，更优选2μM/ml RA。
11.项目10所述的方法，其中所述生血内皮诱导培养基包含5ng/ml BMP4、50ng/mlVEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542、3μM/ml CHIR-99021和2μM/ml RA。
12.制备造血祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
将诱导多能干细胞iPS或胚胎干细胞在中胚层诱导培养基中培养，获得中胚层细胞；
将获得的中胚层细胞在生血内皮诱导培养基中培养，获得生血内皮细胞；
将获得的生血内皮细胞在造血祖细胞诱导培养基中培养，获得造血祖细胞。
13.项目12所述的方法，其中所述方法还包含从获得的造血祖细胞中分选CD34+造血祖细胞的步骤。
14.项目12或13所述的方法，其中所述生血内皮诱导培养基包含BMP4、VEGF、bFGF、TGFβ受体/ALK5抑制剂(例如SB431542、LY-364947、SB-505或A-83-01)、Wnt信号激活剂(例如WNT 3a,CHIR-99021)；优选地，所述生血内皮诱导培养基包含5-50ng/ml BMP4、10-100ng/ml VEGF、10-100ng/ml bFGF、5-20μM SB431542、3-10μM CHIR-99021，更优选地包含5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542、3μM/ml CHIR-99021。
15.项目12-14任一项所述的方法，其中所述生血内皮诱导培养基还包含RA信号激活剂(例如Alltrans-retinoic acid、AM580)，优选地，2-10μMRA，更优选2μM/ml RA。
16.项目12-15任一项所述的方法，其中所述生血内皮诱导培养基包含5ng/mlBMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542、3μM/ml CHIR-99021和2μM/ml RA。
17.项目1-11任一项所述的方法制备的T淋巴细胞.
18.项目12-16任一项所述的方法制备的造血祖细胞。
19.项目17所述的T淋巴细胞在制备抑制肿瘤的药物(例如CAR-T和TCR-T)中的用途，或项目17所述的T淋巴细胞在抑制肿瘤中的用途。
20.项目18所述的造血祖细胞在分化为淋巴细胞或髓系细胞中的用途，优选地，所述淋巴细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞；优选地，所述髓系细胞包括巨噬细胞、DC细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞或红细胞。
21.用于将诱导多潜能干细胞iPS或胚胎干细胞分化为T淋巴细胞或造血祖细胞的试剂盒，包括中胚层诱导培养基、生血内皮诱导培养基、造血祖细胞诱导培养基和T淋巴细胞诱导培养基，其中所述生血内皮诱导培养基包含BMP4、VEGF、bFGF、TGFβ受体/ALK5抑制剂(例如SB431542、LY-364947、SB-505或A-83-01)、Wnt信号激活剂(例如WNT 3a,CHIR-99021)；优选地，所述生血内皮诱导培养基包含5-50ng/ml BMP4、10-100ng/ml VEGF、10-100ng/ml bFGF,5-20μM SB431542、3-10μMCHIR-99021，更优选地包含5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542、3μM/ml CHIR-99021。
22.项目20所述的试剂盒，其中所述生血内皮诱导培养基还包含RA信号激活剂(例如Alltrans-retinoic acid、AM580)，优选地，2-10μMRA，更优选2μM/ml RA。
23.项目20或21所述的试剂盒，其中所述生血内皮诱导培养基包含5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542、3μM/ml CHIR-99021和2μM/ml RA。
本发明中，所述基质细胞为人骨髓基质细胞(例如HS-5、HS-27A)或鼠骨髓基质细胞(如MS-5)；人成纤维细胞(例如WI-38、IMR-90、BJ、HFF-1、Hs 67、F.thy 62891)；人内皮细胞(例如HUVEC、HAEC、HPAEC)。基质细胞不表达DLL4，通过将编码DLL4的基因(GenBank:NM_019074.4)转入基质细胞中，使得所述基质细胞表达DLL4(即Delta样配体4)。在本发明中，以基质细胞-DLL4表示转入了DLL4编码基因的基质细胞。例如，以MS-5-DLL4或HS-5-DLL4表示已经转入了DLL4编码基因的MS-5或HS-5细胞。
在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基为在早期基础培养基中添加BMP4,Wnt信号激活(例如WNT 3a,CHIR-99021),bFGF；优选地，所述中胚层诱导培养基包含5-100ng/mL BMP4,3-20μM/mlCHIR-99021、5-100ng/mL bFGF，更优选地包含20ng/mLBMP4、10μM/mlCHIR-99021、20ng/mLbFGF，优选地，所述早期基础培养基以RPMI1640为基础培养基，并在其中添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸和0.1mM硫代甘油。
在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基为在早期基础培养基中添加20ng/mLBMP4,10μM/mlCHIR-99021,20ng/mL bFGF而获得。
在具体实施方案中，通过CD34+磁珠分选获得CD34+造血祖细胞，按照数量比1:4(造血祖细胞：基质细胞)的比例混合，用T淋巴细胞诱导培养基将混合细胞在低贴附板中聚集24小时，然后收集细胞后用含有T淋巴细胞诱导培养基的凝胶重悬，按照10ul/滴的体积将细胞悬液滴到24孔培养板，放37°静置15分钟，再添加1mLT淋巴细胞诱导培养基。所述T淋巴细胞诱导培养基为在后期基础培养基中添加10ng/ml SCF,10ng/mL Flt3 Ligand和5ng/ml IL7所获得的培养基。
在本发明中，成功开发了一种高效的方法，能够诱导人多潜能干细胞产生大量的功能性T淋巴细胞，这些细胞表达T淋巴细胞特异蛋白和相关基因。重要的是，这些人多潜能干细胞来源的T淋巴细胞具有体外增殖能力，释放细胞因子的能力，并表现出很强的体内体外杀伤多种肿瘤细胞的能力。
在本发明中，我们建立了优化的获得造血祖细胞分化的方法，能够诱导多潜能干细胞更高效地产生功能更强的造血祖细胞，并进一步分化获得T淋巴细胞的方法。其中基于本分化体系诱导产生的生血内皮细胞效率增加，极大增加了生血内皮阶段的产率(图2)；同时该诱导体系获得的造血祖细胞具有更强的增殖能力，能够在T细胞分化早期阶段(EarlyTprogenitor)产生具有强增殖能力的T祖细胞(图4)，这些T祖细胞能够进一步分化成CD4+CD8+DP细胞和CD4-CD8+SPT细胞(图5)。成熟的T细胞不表达CD56，CD4，CD45RO，表达CD7，CD5，CD8，CD3，TCRab，CD28，CD45RA，CD62L(图5)；经过anti-CD3/CD28激活刺激后，成熟的T细胞能够在体外增殖近100倍，并能分泌细胞因子包括IL2，TNFa和IFNg(图6)。激活的表达IG4的T细胞具有体外特异性杀伤能力，并在体内具有抑制肿瘤细胞生长的能力(图7)。该方法中所使用的培养基化学成分明确，这使得易于将所述诱导分化方法进行标准化，为今后临床治疗转化提供大量的、均一的功能性T细胞。经过在人多潜能干细胞上进行基因编辑，有望为提供大量的、通用型和即用型T细胞。总的来讲，我们开发的化学成分明确的分化策略将为今后的应用提供大量的T淋巴细胞应用于癌症的治疗。
本发明的技术效果
本发明公开了T淋巴细胞的制备方法，该方法中所使用的培养基化学成分明确，诱导过程简单，分步骤逐级诱导，可高效制备出大量功能性T淋巴细胞，易于进行标准化和规模化。
上述方法极大提高的生血内皮细胞的分化效率以及造血祖细胞在产生T淋巴祖细胞极强的增殖能力，所获得的T淋巴细胞具有增殖能力和释放细胞因子的能力，具有体内外杀伤肿瘤细胞能力。该方法为临床提供了产生数量巨大的功能性T淋巴细胞的新方案。
附图说明：
图1.由人化学诱导多潜能干细胞(hCiPS)分化产生生血内皮细胞。(A)表示3株hCiPS和1株hiPS分化产生生血内皮细胞的代表性流式图；(B)表示3株hCiPS和1株hiPS分化产生造血祖细胞的代表性流式图。
图2.利用hCiPS-3优化生血内皮细胞分化方案来源的造血祖细胞产生具有强增殖能力的T淋巴祖细胞。(A)表示优化分化方案示意图；(B)表示优化分化方案促进生血内皮分化效率的提高；(C)表示优化分化方案显著提高生血内皮的得率。
图3.利用hCiPS-3优化的培养条件促进造血祖细胞的产生。(A)表示造血细胞因子促进生血内皮细胞产生造血祖细胞CD34+CD45+；(B)表示造血因子协同VEGF、SB431542促进生血内皮产生造血祖细胞CD34+CD45+；(C)表示造血因子在生血内皮向造血祖细胞转化过程中是必须的；(D)表示aMEM基础培养基不利于生血内皮向造血祖细胞的分化。
图4.利用hCiPS-3细胞优化生血内皮来源的造血祖细胞产生具有强增殖能力的T早期祖细胞。(A)表示优化生血内皮来源的造血祖细胞能产生具有强增殖能力的T淋巴祖细胞；(B)表示优化生血内皮来源的造血祖细胞产生CD7+CD5+的T祖细胞，CD4+ISP、CD4+CD8+DPT淋巴细胞；(C)表示优化方案来源的造血祖细胞显著提高了T细胞产率；所有数据显示为平均值±标准差。
图5.显示人化学诱导性多潜能干细胞(hCiPS-2和hCiPS-4)产生功能成熟的T细胞。(A)表示模拟体内T细胞发育，人化学诱导性多潜能干细胞逐级分化产生DN，ISP，DP以及SPT淋巴细胞；(B)表示成熟的T细胞表型分析，代表性流式分析结果，CD7+、CD5+、CD56-、CD4+CD8+、CD4-CD8+、CD8a+CD8b+、CD3+、TCRab+、CD45RA+、CD45RO-、CD62L+；(C)表示分化来源的T细胞(CiPS4-SP、CiPS-SPA、CiPS2-CD8+、CiPS-CD8+CD4-、CiPS4-CD4+CD8+)、造血祖细胞(CiPS2-HPC1、CiPS2-HPC2)、发育来源的胸腺T细胞(ThyCD8+、Thy1 CD4+CD8-、Thy1CD4-CD8+)进行RNA-seq分析，数据聚类结果；(D)表示上述(C)中的细胞进行RNA-seq分析，其中淋巴分化相关特异性基因的表达情况；(E)表示功能性T淋巴细胞关键基因的表达。
图6.hCiPS-3显示了人化学诱导多潜能干细胞分化产生的T细胞在体外激活刺激扩增、分泌细胞因子。(A)表示人化学诱导多潜能干细胞分化产生的T细胞经过anti-CD3/CD28/CD2刺激激活后，呈现增殖状态；(B)表示人化学诱导多潜能干细胞分化产生的T细胞经过anti-CD3/CD28刺激激活后扩增约140倍；(C)表示人化学诱导多潜能干细胞分化产生的T细胞经过anti-CD3/CD28刺激激活后，分泌IFNg、IL2和TNFa细胞因子，代表性流式结果。
图7.hCiPS-3显示了人化学多潜能干细胞(hCiPS)来源的T淋巴细胞具有体外、体内细胞杀伤能力。(A)表示人化学诱导多潜能干细胞分化产生的IG4表达的T淋巴细胞特异性杀伤K562-NY-ES-O1瘤细胞；(B)表示人化学诱导多潜能干细胞分化产生的IG4表达的T淋巴细胞在体内抑制K562-NY-ES-O1瘤细胞的生长；(C)表明分化来源的T细胞在体内具有一直肿瘤生长的能力。
图8.显示了人胚胎干细胞和人诱导多潜能干细胞与表达DLL4的人源基质细胞共培养产生T淋巴细胞。(A)表示人胚胎干细胞来源的造血祖细胞与表达DLL4的基质细胞共聚集产生T淋巴细胞；(B)表示人化学诱导性多潜能干细胞来源的造血祖细胞与表达DLL4基质细胞共聚集诱导产生T淋巴细胞。
图9.Wnt信号通路激活产生的生血内皮细胞具有更强的产生T淋巴祖细胞的能力。(A)表示通过激活WNT信号产生的生血细胞显著促进了早期T祖细胞CD34+CD7+细胞的分化；(B)通过激活WNT信号产生的生血细胞显著促进了早期T祖细胞CD7+CD5+细胞的分化。
图10.显示了慢病毒载体EF1a-GFP-2A-Luc2-NY-ES-O1和EF1a-GFP-2A-Luc2-MART1的图谱。
图11.包含IG4和RFP的Phage-IG4载体图谱。
图12.显示了人诱导多潜能干细胞包括hCiPS2，hCiPS-3和hiPS-7定向分化产生CD4+CD8b+T淋巴细胞，同时表达CD45RA+CD62L+，CD45RA+CD45RO- 
T淋巴细胞的表型。
图13.显示人脐血CD34+造血祖细胞直接与表达DLL4的人基质细胞共聚集在Transwell板中培养，产生了功能成熟的T淋巴细胞。
图14.显示人化学重编程细胞hCiPS3来源的造血祖细胞直接与表达DLL4的人基质细胞共聚集在Transwell板中共培养，产生了功能成熟的T淋巴细胞。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐述本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本发明的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本发明的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本发明的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
实施例1.体外定向分化人多潜能干细胞(hiPSC)逐级定向诱导分化为T淋巴细胞
在本发明中，所使用的人胚胎干细胞系H1(NIH的编号为WA01)可商购，例如获自WiCell研究所。所使用的人诱导多潜能干细胞hiPS-7商购于北京Cauliscell生物技术有限公司。所使用化学重编程细胞系包括hCiPS2、hCiPS-3、hCiPS4、hCiPS5、hCiPS7，其制备方法可参见(Guan etal.,2022)。
1.将人多潜能干细胞诱导分化为淋巴细胞的方法包括以下步骤：
(1)诱导多潜能干细胞，获得中胚层细胞；
具体地，将3.6×105(每6孔板)人胚胎干细胞使用含5uM Y27632的人多潜能干细胞培养基(mTeSR1 plus)接种于Matrigel预处理的细胞培养板，并培养一天后开始分化：
分化第一阶段：换成中胚层诱导培养基(早期基础培养基添加20ng/mL BMP4,10μM/mlCHIR-99021,20ng/mLbFGF得到)培养2天诱导中胚层产生；
其中，早期基础培养基使用RPMI1640为基础培养基，并在其中添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素细胞培养添加物(Gibco，Cat#15140-148)，1％非必须氨基酸(Gibco，Cat#11140050)，0.1mM硫代甘油。
分化第二阶段：诱导中胚层细胞分化产生生血内皮细胞；
在早期基础培养基中添加5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF,10uMSB431542和3uMCHIR-99021而获得的培养基(早期基础培养基的成分如上所述)分化48h，换液为5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF,10uM SB431542，2uMRA培养3天，诱导生血内皮细胞产生(图1A)；
为了提供生血内皮的分化效率以及获得具有更高质量的生血内皮细胞，我们进一步对多潜能干细胞来源的早期中胚层细胞诱导产生生血内皮细胞的过程进行了优化。
我们发现在中胚层向生血内皮分化阶段，在抑制TGFb信号通路的基础上(Wangetal.,2012)，激活WNT信号通路(添加3uM/mLCHIR-99021)处理，并继续在抑制TGFb信号通路的基础上激活RA信号通路(添加2uM All-ransRetinoicAcid)(图2A)，能够显著提高生血内皮的分化效率，其CD34+CDH5+的比例从仅仅使用BMP4、VEGF、bFGF的培养条件提高到(图2B)。重要的是，经过优化的生血内皮细胞分化条件，能够大大促进CD34+生血内皮的产量(图2C)。
第三步：诱导生血内皮细胞，获得造血祖细胞；
然后，将细胞培养基换成造血祖细胞诱导培养基(后期基础培养基添加5ng/mlVEGF和50ng/ml SCF，50ng/ml Flt3 Ligand，50ng/ml TPO，10μMSB43154，IL7 5-20ng/mL而获得)，培养3-5天，诱导造血祖细胞产生(见图3B)；
其中，所述后期基础培养基使用IMDM为基础培养基，并在其中添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素细胞培养添加物(Gibco，Cat#15140-148)，1％非必须氨基酸(Gibco，Cat#11140050)，0.1mM硫代甘油，2uMminocycline hydrochloride，30uM NAC。
在生血内皮细胞向造血祖细胞分化的过程中，我们发现该过程中造血因子是必须的包括SCF、FL、TPO，促进造血祖细胞CD45+CD43+的形成(图3A、3C)。其中VEGF，SB431542对于造血祖细胞的形成，主要维持了细胞的存活并显著提升了造血祖细胞产生的数量(图3B)。同时，我们发现IMDM对于促进生血内皮向造血祖细胞的分化显著优于aMEM(图3D)。
第四步：诱导造血祖细胞分化产生T淋巴细胞；
在第10-12天，用CD34磁珠分选CD34+造血祖细胞，与表达DLL4的鼠骨髓基质细胞(表示为MS-5-DLL4)共聚集，悬浮培养24小时，收集后与凝胶按1：1(T细胞培养基：Matrigel)混合，按照10ul/滴，将细胞悬液滴到24孔板培养板，37°放置15分钟后，添加1mLT淋巴细胞培养基(后期基础培养基添加10ng/ml SCF,10ng/mL Flt3 Ligand和5ng/ml IL7获得)培养至产生CD4+CD8+及CD4-CD8+成熟细胞(图4B、图5A和5B)。以上诱导过程每三天换液一次。根据需要取培养过程中的细胞进行T淋巴细胞染色，流式细胞分析或者功能分析。
为了证明优化方案获得的生血内皮细胞能够产生质量更好的造血祖细胞，我们将优化方案产生的造血祖细胞与表达DLL4的基质细胞进行共聚集，在类3D的培养体系中诱导造血祖细胞向T淋巴细胞分化。
在T细胞培养条件中，造血祖细胞能够较早出现增殖性的细胞，这种增殖能力在T细胞分化14天表现非常显著(图4A)。流式分析显示，该阶段细胞表达早期T细胞祖细胞的表面蛋白，包括CD34+、CD45+、CD7+、和CD5+(图4B)。通过细胞计数分析，1X106CD34+造血祖细胞能够在分化T24天能产生约4-8X107CD7+CD5+CD4+/CD4+CD8+T淋巴祖细胞/T DP T淋巴细胞(图4C)。
该优化方案产生的生血内皮效率提高，同时向T细胞分化的潜力大大提升。为后续建立优化的功能成熟的T淋巴体系奠定了基础。
为了进一步优化诱导造血祖细胞分化产生T淋巴细胞的体系，推进临床应用研究，我们做了进一步的优化改进。我们将分化来源的CD34+造血祖细胞与表达DLL4的人基质细胞共聚集，以T细胞培养基6ul/滴混合液滴到Transwell培养板(12孔板)，在培养板中加入1ml培养基进行培养。每6天换液一次。我们首先用人脐血来源的CD34+造血祖细胞与表达DLL4的人基质细胞进行Transwell的培养，发现经过8周到12周，逐渐形成较高比例的CD7+CD1a+CD4+CD8b+DP以及CD7+CD1a-CD4-CD8b+CD3+TCRab+的T淋巴细胞(图13)。该优化体系不需要凝胶，成分相对减少，同时表达DLL4的人基质细胞更有利于进行临床应用的推进。
基于该Tranwell体系，我们将人化学重编程细胞系hCiPS3分化来源的造血祖细胞CD34+与表达DLL4的人基质细胞共聚集滴到Transwell板，进行T细胞的诱导分化。经过6-8周，hCiPS3来源的造血祖细胞也能进一步分化产生成熟的CD7+CD5+CD4-CD8b+CD3+TCRab+的T淋巴细胞(图14)。
2.流式细胞分析
收集不同培养阶段的细胞1800转/分钟，离心3分钟，去上清，使用含0.5％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞成单细胞悬液。加入相应的抗体(每个抗体每个样品加0.2微升)，室温避光孵育15分钟。PBS三遍后使用300微升PBS重悬细胞，使用40微米筛网过滤细胞，上机分析。使用的抗体如下：
7-AAD(BD Pharmingen,559925)，PE-KDR BioLegend Cat:359904，PE-CD43BioLegend Cat:343204，BV421-CD45 BioLegend Cat:304032，BV421-CD8 BioLegend Cat:344748，FITC-CD7 BioLegend Cat:343104，PE-CD5 BioLegend Cat:364014，PECy7-CD8βInvitrogen REF:25-5273-42，APC-CD4 BioLegend Cat:357408，APCCy7-TCRαβBioLegendCat:306728，Bv421-CD3 BioLegend Cat:317344，APC-CD28 BioLegend Cat:302912，PECy7-CD45RA BioLegend Cat:304126，APC-CD62L BioLegend Cat:304810，APCCy7-IL2BioLegend Cat:500341，APC-IFNγBioLegend Cat:502511，PE-TNFαBioLegend Cat:502908。
3.T淋巴细胞刺激扩增实验：
将分化成熟的T细胞收集离心，通过CD8磁珠(美天旎,Cat:130-045-201)分选获得CD8阳性的细胞，在T细胞扩增培养基(STEMCell，Cat:10981)中刺激扩增，添加Anti-CD3/CD28/CD2(Stem Cell Technology，Cat：10970)。扩增后的细胞收样计数扩增倍数。
4.经过上面3刺激扩增的T淋巴细胞，检测细胞因子表达情况，通过胞内流式染色：取单细胞悬液染色活细胞染料575V，之后使用BD Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeabilization试剂盒固定细胞和破膜，染色组加入APCCy7-IL2，APC-IFNγ，PE-TNFαEPX进行染色，对照组加入抗体的同型对照抗体小鼠IgG1，在37℃染色15分钟，使用40微米筛网过滤细胞，上机分析。流式细胞仪使用CytoFlex(Beckman Coulter)，数据分析使用FlowJo-V10(BD)软件。
5.转录组测序和生物信息学分析
收集后期成熟的T淋巴细胞包括DP阶段和成熟SP阶段，提取RNA。使用NEB Next,Ultra RNA Library Prep kit for Illumina试剂盒建库，建立的真核普通转录组文库使用Illumina HiSeq-PE150上机测序。所有转录组测序均在诺和致远进行。
生物信息学分析首先使用TopHat读取原始Fastq测序文件并与人类参照基因组(hg19)进行比对，读数和FPKM采用cuffquant和cuffnorm进行计算。图5D和5E的聚类分析和基因表达热图分析是基于FPKM进行计算的结果，不同样品间基因表达差异使用DESeq2进行评判，我们使用log2(倍数变化)>1或者<-1并且FDR<0.01作为阈值进行分析。
6.制备荧光素酶表达细胞系
慢病毒载体NY-ES-O1和MART-1(载体图谱参见图10)编码独立的GFP蛋白和荧光素酶，按照之前我们报道的方法进行病毒包装和滴度测试(Xiao et al.,2019)。将制备好的病毒感染K562细胞(人髓系白血病细胞细胞，ATCC)，获得K562-NY-ES-O1-GFP-Luc细胞和K562-MART1-GFP-Luc两种细胞系，使用流式细胞分选仪分选GFP阳性细胞进行培养，每种细胞的荧光素酶活性检测合格之后再进行功能试验。
7.T淋巴细胞体外杀伤实验
1)取培养的K562-NY-ES-O1-GFP-Luc细胞和K562-MART1-GFP-Luc肿瘤细胞，离心后用1640+10％FBS培养基重悬，进行细胞计数。
2)调整肿瘤细胞密度为1*106细胞/ml，取新的96孔白板，按每孔100ul加入细胞悬液，使每孔肿瘤细胞接种量为1*105细胞/孔。
3)取人多潜能干细胞分化的T淋巴细胞用于杀伤实验，按照E/T
(Effector为T淋巴细胞，Target为K562靶细胞)0:1、1:1、2:1、5:1、10:1的比例，分别将分化的T淋巴细胞接种到K562-NY-ES-O1和K562-MART1肿瘤细胞中。每种浓度设三个平行孔。
4)将96孔白板放回37℃的CO2细胞培养箱，共培养20小时。
5)往96孔白板添加luciferase发光底物：用PBS将储存底物(浓度为20mg/ml)按1:50稀释，使用排枪将稀释后的底物以每孔50ul快速添加到96孔白板待测孔中，注意避光操作。
6)加过底物的白板放振荡器上避光摇匀5分钟，使用multimode plate reader(PerkinElmer)发光检测仪，进行发光检测。
7)按下公式计算每孔杀伤效率：
杀伤效率％＝(对照孔发光强度–待测孔发光强度)x100/对照孔发光强度。
8.T淋巴细胞体内杀伤能力检测
取2*105个荧光素酶表达的癌细胞K562-NY-ES-O1皮下接种于NPG小鼠中，癌细胞接种3天、6天时分别通过尾静脉注射2*106刺激扩增的T-IG4淋巴细胞(重悬在培养基中)。使用Xenogen IVIS(Caliper Life Sciences)系统检测小鼠肿瘤负担，检测前尾静脉向小鼠注射300微升150mg/kg D-荧光素，10分钟后进行分析。
9.统计学方法
数据统计使用GraphPad Prism软件，数据呈现为平均值和标准偏差(SD)或指和均值的标准误差(SEM)。不同组数据之间比较是unpaired t test或者two-tailed ANOVA分析方法。显著性分析一般在文中或者图中描述，P<0.05被认为是显著差异。所有的流式数据使用FlowJo v10软件进行分析，所有的图使用Adobe Photoshop and Adobe Illustrator处理。
实施例2.由人诱导多潜能干细胞(hPSCs)分化产生生血内皮细胞和造血祖细胞
之前，我们已经建立了从人多潜能干细胞(hPSCs)逐级产生造血祖细胞的分化方案(Wang et al.,2012)。在本发明中，为了从hCiPS细胞中产生造血祖细胞，我们首先筛选了多株hCiPS细胞系，筛选到其中hCiPS-2，hCiPS-3，hCiPS-5具有稳定的向生血内皮分化的能力。各株细胞均能产生早期中胚层KDR+细胞，并从KDR+细胞中产生CD34+CDH5+的生血内皮细胞。多株hCiPS分化能力与商购的hiPS-7具有可比性(图1A)。
为了进一步验证这些hCiPS细胞系来源的生血细胞是否具有进一步产生造血祖细胞的能力，我们在造血细胞诱导体系(添加SCF，Flt3 Ligand，TPO和IL3，参见Wang,C.,etal.,TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitorsfrom human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwisestrategy.Cell Res,2012.22(1):p.194-207)继续诱导分化。在分化第18天后，3株hCiPS细胞系hCiPS-2，hCiPS-3，hCiPS-5与hiPS-7，都能高效产生造血祖细胞，高表达CD34+CD43+CD45+表面标志(图1B)。
因此，hCiPS细胞具有与hiPS细胞同样生血能力，为基于hCiPS产生血液细胞以及进一步产生成熟的免疫细胞或者髓系细胞提供了新的种子细胞。
实施例3.人化学诱导多潜能干细胞产生成熟的T淋巴细胞
通过进一步在T淋巴细胞诱导培养基中进行培养，人化学诱导多潜能干细胞hCiPS-2和hCiPS-4分化的造血祖细胞按照实施例1的方案能够模拟体内T细胞发育过程，逐步产生CD4-CD8-、CD4+ISP、CD4+CD8+DP、CD4-CD8+SP的T淋巴细胞(图5A)。
经过最终成熟阶段，约分化6-8周的时间，成熟的T细胞CD4-CD8b+SP的细胞产生。成熟的T细胞表达CD7+、CD5+、CD3+、TCRab+、CD45RA+、CD62L+,不表达NK细胞表面蛋白CD56，不表达CD45RO(图5B-C)。
进一步，对分化来源的T细胞进行基因表达分析。我们比较了人化学诱导多潜能干细胞hCiPS-2和hCiPS-4来源的T细胞、人化学诱导多潜能干细胞hCiPS-2来源的造血祖细胞和人胸腺直接分离的T细胞转录组表达情况。聚类分析结果显示，分化来源的T细胞与胸腺发育T细胞相近，而与分化来源早期阶段的造血祖细胞相差较远(图5D)。我们发现分化T细胞在关键转录因子的表达方面，hCiPS2和hCiPS4分化得到的T细胞与胚胎期胸腺T细胞(Thymus-T)非常接近，包括TCF7，BCL11b,RUNX3等转录因子；功能性T淋巴细胞关键基因的表达如CD8a，CD8b,CD3以及LCK等表达类似(图5E)。相对于分化早期阶段的造血祖细胞，T细胞特异性基因均无表达。
实施例6人化学诱导多潜能干细胞产生T淋巴细胞响应刺激扩增并分泌细胞因子
我们对hCiPS-3分化来源的T细胞进行刺激扩增，在经过Anti-CD3/CD28的刺激之后，分化来源的T细胞能够响应刺激，并连续扩增。细胞形态变大，拉长，能够连续培养(图6A)。通过对刺激扩增的细胞计数，从计数结果来看，分化的T细胞在体外连续培养14天，能够增殖超过100倍(图6B)。
进一步，我们对刺激扩增的细胞进行分泌细胞因子的实验。通过添加PMA和Inomycin处理，采用细胞内流式分方法，能够检测到刺激扩增的T细胞分泌细胞因子包括IFNg、IL2以及TNFa(图6C)。这些结果表明，体外分化来源的T细胞具有成熟T细胞的增殖能力以及分泌细胞因子的能力。
实施例7人化学诱导多潜能干细胞产生T淋巴细胞具有体内外杀伤能力
通过在人化学诱导多潜能干细胞中表达IG4基因(IG4基因表达的蛋白是对应于NY-ES-O1特异性抗原)和红色荧光蛋白RFP基因(表达IG4基因和RFP基因的载体图谱见图11)，建立了稳定表达IG4的人化学诱导多潜能干细胞。采用上述分化体系，利用hCiPS-3细胞，获得表达IG4-RFP，同时表达CD3，TCRab的T淋巴细胞。经过分选CD8b+RFP+的T淋巴细胞，体外激活刺激扩增后开展特异性杀伤实验。在K562中表达NY-ES-O1-GFP-Luc和MART1-GFP-Luc。通过杀伤实验，可以看出，诱导分化来源的IG4-RFP+T细胞具有较强的肿瘤杀伤能力，能对K562-MART1仅有微弱的杀伤能力。表现出特异性T细胞杀伤能力(图7A)。同时，在提高肿瘤效靶比之后，能够观察到诱导来源T细胞具有很强的肿瘤杀伤能力(图7B)。
我们进一步将K562-NY-ES-O1-GFP-Luc的细胞移植到NPG小鼠体内，癌细胞接种3天、6天时分别通过尾静脉注射分化来源的T淋巴细胞2X106/只小鼠(重悬在培养基中)，对照组小鼠注射等体积的培养基。使用Xenogen IVIS(Caliper Life Sciences)系统检测小鼠肿瘤负担，检测前尾静脉向小鼠注射300微升150mg/kg D-荧光素，10分钟后进行分析。结果表明分化来源的T细胞在体内具有一直肿瘤生长的能力(图7C)。
实施例8.人多潜能干细胞分化来源的造血祖细胞与表达DLL4的人基质细胞共聚集诱导T淋巴细胞产生
我们将人胚胎干细胞(H1)按照本发明的方法定向分化产生造血祖细胞用于诱导T淋巴细胞。分化方案除了不添加CHIR-99021和RA以外，与实施例1的步骤3相同，获得的造血祖细胞分析后与表达DLL4的人基质细胞HS-5-DLL4和凝胶混合(实施与实施例1的步骤4相同)，通过T淋巴细胞诱导培养基的培养，能够获得人T淋巴细胞，主要表达CD4+、CD8a+、CD8b+(图8A)。
同样地，我们将人化学诱导多潜能干细胞hCiPS-4来源的造血祖细胞与表达DLL4的人基质细胞HS-5-DLL4共聚集，通过T淋巴细胞诱导培养基的培养，能够获得人T淋巴细胞，主要表达CD4+、CD8a+、CD8b+(图8B)。
实施例9：Wnt信号激活产生的生血内皮促进造血祖细胞和T淋巴祖细胞的产生
使用hCiPS-3细胞作为示例性细胞，在生血内皮细胞的优化体系中，我们发现中胚层向生血内皮分化的早期阶段添加CHIR-99021促进了生血内皮细胞的产生。基于含5ng/mlBMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF,10uM/ml SB431542的培养基，添加Wnt信号通路激活剂3uM/ml CHIR-99021诱导2天，再用5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF,10uM/mlSB431542培养2天，获得的生血内皮细胞具有更强的产生造血祖细胞的能力。产生的造血祖细胞在分化第10-12天，经过分选获得CD34+造血祖细胞，与表达DLL4的基质细胞MS-5-DLL4共聚集与Matrigel混合形成3D结构进行T培养，我们发现，该条件下诱导获得的造血祖细胞，能够更加高效地产生CD34+CD7+，以及CD7+CD5+的造血T淋巴祖细胞(图9)。
本发明发现生血内皮产生过程中，Wnt信号的激活对于产生功能更完善的生血内皮细胞起到促进的作用，为产生高质量的造血祖细胞提供基础。
实施例10.从多株人诱导性多潜能干细胞(包括hCiPS2、hCiPS3和iPS7细胞)都能分化获得T淋巴细胞以人诱导性多潜能干细胞包括hCiPS2、hCiPS3和hiPS-7细胞为起始细胞，重复实施例1的第一步-第四步的方法，诱导分化获得T淋巴细胞，结果见图12。经过T淋巴细胞培养后6周，均能高效产生CD7+CD5+CD4+CD8b+的T淋巴细胞，同时表达CD45RA+CD62L+，CD45RA+CD45RO-的
T淋巴细胞，不表达CD56。
实施例11.建立进一步优化的T淋巴细胞诱导分化方案。
为了进一步优化T淋巴细胞诱导分化方案，更实用于临床应用，我们建立了基于Transwell并联合表达DLL4的人基质细胞诱导T淋巴细胞诱导方案。
为了首先验证该方案的可行性，我们将人脐带血来源的造血祖细胞CD34+分离后直接与表达DLL4的人基质细胞共聚集，以6ul/滴将混合液滴到Transwell板(12孔板)，添加1mLT淋巴细胞培养液。经过8-12周的培养，我们发现该体系能高效诱导人脐带血CD34+造血细胞分化产生成熟的T淋巴细胞，表达CD7+CD1a-CD4-CD8b+CD3+TCRab+的表型(图13)。
基于该体系，我们将人化学重编程细胞hCiPS3来源的造血祖细胞直接与表达DLL4的人基质细胞共聚集在Transwell板中共培养，同样也产生了功能成熟的T淋巴细胞，表达CD7+CD5+CD4+CD8b+CD3+TCRab+的表型(图14)。
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Claims (23)
1.制备T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
将诱导多能干细胞iPS或胚胎干细胞在中胚层诱导培养基中培养，获得中胚层细胞；
将获得的中胚层细胞在生血内皮诱导培养基中培养，获得生血内皮细胞；
将获得的生血内皮细胞在造血祖细胞诱导培养基中培养，获得造血祖细胞，从中分选CD34+造血祖细胞；和
将获得的CD34+造血祖细胞与表达DLL4的基质细胞及凝胶混合共聚集，在T淋巴细胞诱导培养基中培养，获得T淋巴细胞(优选杀伤性T淋巴细胞，iNKT淋巴细胞，辅助性T淋巴细胞)；
在所述获得T淋巴细胞的步骤中，任选地，将获得的CD34+造血祖细胞与表达DLL4的基质细胞(例如人基质细胞或鼠基质细胞)及凝胶混合共聚集滴到培养板中形成3D结构，或直接与表达DLL4的基质细胞共聚集滴到Transwell板中，在T淋巴细胞诱导培养基中培养，从而获得T淋巴细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述中胚层诱导培养基包含BMP4,Wnt信号激活剂(例如WNT 3a,CHIR-99021),bFGF；优选地，所述中胚层诱导培养基包含5-100ng/mL BMP4,3-20μM/mlCHIR-99021、5-100ng/mL bFGF，更优选地包含20ng/mLBMP4、10μM/ml CHIR-99021、20ng/mLbFGF，优选地，所述中胚层诱导培养基使用RPMI1640培养基，更优选地，在RPMI1640培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸和0.1mM硫代甘油。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述生血内皮诱导培养基包含BMP4、VEGF、bFGF，TGFβ受体/ALK5抑制剂(例如SB431542、LY-364947、SB-505或A-83-01)；优选地，所述生血内皮诱导培养基包含5-50ng/ml BMP4、10-100ng/ml VEGF、10-100ng/ml bFGF、5-20μMSB431542，更优选地包含5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542，优选地，所述生血内皮诱导培养基使用RPMI1640培养基，更优选地，在RPMI1640培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸，0.1mM硫代甘油。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述造血祖细胞诱导培养基包含VEGF和促造血祖细胞生成因子(例如SCF、Flt3 Ligand,TPO、IL7)和TGFβ受体/ALK5抑制剂；优选地，所述造血祖细胞诱导培养基包含5-100ng/ml VEGF和20-200ng/ml SCF,20-200ng/ml Flt3Ligand,20-200ng/ml TPO，TGFβ受体/ALK5抑制剂(例如SB431542、LY-364947、SB-505或A-83-01,IL7，更优选地包含5-20ng/ml VEGF和20-50ng/ml SCF、20-50ng/ml Flt3 Ligand、20-50ng/ml TPO、5-20ng/ml IL7，5-20ng/mL5-20μMSB43154,最优选地包含5ng/ml VEGF、50ng/ml SCF、50ng/ml Flt3 Ligand、50ng/mL TPO，5ng/mL IL7、10μM SB43154，
优选地，所述造血祖细胞诱导培养基使用IMDM培养基，更优选地，在IMDM培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸，0.1mM硫代甘油，2uM minocyclinehydrochloride，30uM NAC。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述基质细胞包括但不限于人骨髓基质细胞，人成纤维细胞和人内皮细胞，优选地，所述凝胶包括但不限于Matrigel、VITROGEL、iMatrix 511、PEG，优选包含Matrigel，优选地，所述T淋巴细胞诱导培养基包含促T细胞生成细胞因子(如SCF，Flt3 Ligand和IL-7)，更优选地，所述T淋巴细胞诱导培养基包含5-100ng/ml SCF，5-100ng/ml Flt3 Ligand和5-100ng/ml IL7；最优选包含10ng/ml SCF和10ng/ml Flt3 Ligand,5ng/mL IL7，优选地，所述T淋巴细胞诱导培养基使用IMDM培养基，更优选地，在IMDM培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸，0.1mM硫代甘油，2uM minocycline hydrochloride，30uM NAC。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述多潜能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多潜能干细胞，优选来自哺乳动物，更优选来自小鼠或人，最优选来自人；其中，所述胚胎干细胞为从商业途径获得的胚胎干细胞，优选为下述任一种NIH编号的细胞系的细胞：BG01、BG02、BG03、BG04、SA01、SA02、SA03、ES01、ES02、ES03、ES04、ES05、ES06、TE03、TE32、TE33、TE04、TE06、TE62、TE07、TE72、UC01、UC06、WA01、WA07、WA09、WA13和WA14。
7.权利要求1所述的方法，其中所述基质细胞为小鼠骨髓基质细胞及人骨髓基质细胞(例如HS-5、HS-27A)；人成纤维细胞(例如WI-38、IMR-90、BJ、HFF-1、Hs 67、F.thy 62891)；人内皮细胞(例如HUVEC、HAEC、HPAEC)。
8.制备T淋巴细胞的方法，其特征在于，包含以下步骤：
将诱导多能干细胞iPS或胚胎干细胞在中胚层诱导培养基中培养，获得中胚层细胞；
将获得的中胚层细胞在生血内皮诱导培养基中培养，获得生血内皮细胞；
将获得的生血内皮细胞在造血祖细胞诱导培养基中培养，获得造血祖细胞，从中分选CD34+造血祖细胞；
将获得的CD34+造血祖细胞与表达DLL4的鼠基质细胞(例如鼠MS-5)及凝胶混合共聚集，在T淋巴细胞诱导培养基中培养，获得T淋巴细胞(优选杀伤性T细胞)。
9.权利要求1-2或4-8任一项所述的方法，其中，所述生血内皮诱导培养基包含BMP4、VEGF、bFGF、TGFβ受体/ALK5抑制剂(例如SB431542、LY-364947、SB-505或A-83-01)、Wnt信号激活剂(例如WNT 3a,CHIR-99021)；优选地，所述生血内皮诱导培养基包含5-50ng/mlBMP4、10-100ng/ml VEGF、10-100ng/ml bFGF,5-20μM SB431542、3-10μMCHIR-99021，更优选地包含5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542、3μM/ml CHIR-99021。
10.权利要求9所述的方法，其中所述生血内皮诱导培养基还包含RA信号激活剂(例如Alltrans-retinoic acid、AM580)，优选地，2-10μMRA，更优选2μM/ml RA。
11.权利要求10所述的方法，其中所述生血内皮诱导培养基包含5ng/ml BMP4、50ng/mlVEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542、3μM/ml CHIR-99021和2μM/ml RA。
12.制备造血祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
将诱导多能干细胞iPS或胚胎干细胞在中胚层诱导培养基中培养，获得中胚层细胞；
将获得的中胚层细胞在生血内皮诱导培养基中培养，获得生血内皮细胞；
将获得的生血内皮细胞在造血祖细胞诱导培养基中培养，获得造血祖细胞。
13.权利要求12所述的方法，其中所述方法还包含从获得的造血祖细胞中分选CD34+造血祖细胞的步骤。
14.权利要求12或13所述的方法，其中所述生血内皮诱导培养基包含BMP4、VEGF、bFGF、TGFβ受体/ALK5抑制剂(例如SB431542、LY-364947、SB-505或A-83-01)、Wnt信号激活剂(例如WNT 3a,CHIR-99021)；优选地，所述生血内皮诱导培养基包含5-50ng/ml BMP4、10-100ng/ml VEGF、10-100ng/ml bFGF、5-20μM SB431542、3-10μMCHIR-99021，更优选地包含5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542、3μM/ml CHIR-99021。
15.权利要求12-14任一项所述的方法，其中所述生血内皮诱导培养基还包含RA信号激活剂(例如Alltrans-retinoic acid、AM580)，优选地，2-10μMRA，更优选2μM/ml RA。
16.权利要求12-15任一项所述的方法，其中所述生血内皮诱导培养基包含5ng/mlBMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542、3μM/ml CHIR-99021和2μM/ml RA。
17.权利要求1-11任一项所述的方法制备的T淋巴细胞。
18.权利要求12-16任一项所述的方法制备的造血祖细胞。
19.权利要求17所述的T淋巴细胞在制备抑制肿瘤的药物(例如CAR-T和TCR-T)中的用途，或权利要求17所述的T淋巴细胞在抑制肿瘤中的用途。
20.权利要求18所述的造血祖细胞在分化为淋巴细胞或髓系细胞中的用途，优选地，所述淋巴细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞；优选地，所述髓系细胞包括巨噬细胞、DC细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞或红细胞。
21.用于将诱导多潜能干细胞iPS或胚胎干细胞分化为T淋巴细胞或造血祖细胞的试剂盒，包括中胚层诱导培养基、生血内皮诱导培养基、造血祖细胞诱导培养基和T淋巴细胞诱导培养基，其中所述生血内皮诱导培养基包含BMP4、VEGF、bFGF、TGFβ受体/ALK5抑制剂(例如SB431542、LY-364947、SB-505或A-83-01)、Wnt信号激活剂(例如WNT 3a,CHIR-99021)；优选地，所述生血内皮诱导培养基包含5-50ng/ml BMP4、10-100ng/ml VEGF、10-100ng/mlbFGF,5-20μM SB431542、3-10μMCHIR-99021，更优选地包含5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542、3μM/ml CHIR-99021。
22.权利要求20所述的试剂盒，其中所述生血内皮诱导培养基还包含RA信号激活剂(例如Alltrans-retinoic acid、AM580)，优选地，2-10μMRA，更优选2μM/ml RA。
23.权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述生血内皮诱导培养基包含5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542、3μM/ml CHIR-99021和2μM/ml RA。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116536251B (zh) * | 2023-07-06 | 2023-09-19 | 北京北启生物医药有限公司 | 一种无饲养层的化学诱导多能干细胞单克隆建株方法 |
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Application publication date: 20230704 Assignee: Beijing Beiqi Biomedical Co.,Ltd. Assignor: Peking University Contract record no.: X2023990000885 Denomination of invention: Preparation of T lymphocytes using human pluripotent stem cells in vitro License type: Exclusive License Record date: 20231023 |