CN110093314B

CN110093314B - 红细胞脱核培养基及试剂盒

Info

Publication number: CN110093314B
Application number: CN201910151121.9A
Authority: CN
Inventors: 裴雪涛; 谢小燕; 房芳; 陈琳; 曲洺逸
Original assignee: South China Institute Of Biomedicine; Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: South China Institute Of Biomedicine; Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2039-02-28
Also published as: CN110093314A

Abstract

本发明涉及红细胞脱核领域，具体涉及一种红细胞脱核培养基及试剂盒。该红细胞脱核培养基包括：基础培养基、转铁蛋白、重组人胰岛素、肝素和Bcl‑2小分子抑制剂；可选地，还含有血浆、血清、谷氨酰胺或者促红细胞生成素中的至少一种。该试剂盒，用于红细胞的脱核培养，包括Bcl‑2小分子抑制剂。利用本发明提供的红细胞脱核培养基或者试剂盒制备成熟红细胞，能够显著提高红细胞的脱核率。

Description

红细胞脱核培养基及试剂盒

技术领域

本发明涉及红细胞脱核领域，具体涉及一种红细胞脱核培养基及试剂盒。

背景技术

在造血功能障碍、常规的贫血及休克治疗中，输血是一个关键的环节。虽然在发达国家有相对充足的血液供应，但是存在血源性病毒无法完全清除的问题。在发展中国家血液供应长期处于供不应求的状况，近年来，我国多个城市甚至出现“血荒”的说法。要解决血液来源匮乏的问题，开发新的血源已经成为当前医疗中的迫切需要。其中的一个途径就是通过自体或者是通过干细胞研究的相关手段产生红细胞，这包括脐带、成人骨髓、外周血来源的造血干/祖细胞及胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESC)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)。这些细胞都可以作为种子细胞，通过大量诱导扩增生成可用于移植的红细胞。这样不仅可以避免血源性病毒无法完全清除的问题，而且是一种新型的缓解供血不足的手段。

红细胞的成熟脱核对于输注医学应用意义重大，红细胞的脱核是红细胞成熟终末阶段发生的关键事件。生理条件下，细胞核的脱落是在成红细胞岛中进行的，并且该过程的发生与巨噬细胞密切相关。有研究报道，通过透射电子显微镜和扫描电镜的观察，发现巨噬细胞处于红细胞岛中央位置，周边环绕有即将脱核红细胞。进一步的研究表明，巨噬细胞表面有众多黏附分子，包括红细胞巨噬细胞蛋白、血管细胞黏附分子1、αv整合蛋白，红细胞表面也有α4β1整合蛋白和细胞间黏附分子4等蛋白质，这些蛋白质为二者的相互接触提供了条件。巨噬细胞不仅有锚定红细胞的功能，并且还可以吞噬红细胞成熟过程中脱出的细胞核。除此之外，巨噬细胞还可以通过胞吐作用分泌由自身合成的铁蛋白，从而促进红细胞的成熟、分化。虽然已经认识到一部分生理条件下红细胞是如何进行脱核的，但是目前对脱核机制研究并不明确，并且体外成熟红细胞的制备技术也仍待改进，特别是多种类型的干细胞诱导生成的成红细胞中脱核效率的提高。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种制备成熟红细胞的方法以及红细胞脱核培养基。

本发明的发明人在研究过程中发现：在体外环境下得到成熟红细胞，脱核是非常关键的一步，因为有核红细胞的携氧能力低于脱核红细胞，而且有核红细胞在跨越狭窄的毛细血管时容易发生溶血；此外，由于脱核细胞丢失了染色体和分裂能力，移入体内后导致接受者恶性转化的风险也明显降低。正是基于此，红细胞的成熟脱核对于输注医学应用意义重大，但是迄今为止在诱导干细胞红系分化的体系中，只有在基质细胞的辅助下诱导造血干/祖细胞才能实现较为高效的成熟和脱核效率，而无基质细胞体系、或是以胚胎干细胞、诱导多能干细胞为起始细胞的诱导体系中，红细胞成熟和脱核效率仍然有待提高。Ma等(Ma F,Ebihara Y,Umeda K,et al.Generation of functional erythrocytes fromhuman embryonic stem cell-derived definitive hematopoiesis.Proc Natl Acad SciUSA,2008,105(35):13087-13092)的研究表明，对于体外输血而言，所需的红细胞在1×10¹²～2.5×10¹²(500ml全血，红细胞的数量维持在5×10⁹/ml)，但是体外诱导分化所得的脱核红细胞的数量仅维持在由10⁴的hESC可以获得10⁶的成熟脱核红细胞，由此看来所得到的脱核红细胞的数量远低于临床的需求。此外，由皮肤成纤维细胞、胚胎期的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)及胎儿MSC来源的iPSC在体外诱导条件下也可以获得类似hESC来源的早期红细胞(Chang C J,Mitra K,Koya M,et al.Production of embryonicand fetal-like red blood cells from human induced pluripotent stem cells.PLoSOne,2011,6(10):e25761)，并且iPSC也可经诱导分化获得晚幼红细胞，但是其脱核效率较低，仅有4％～10％(Lapillonne H,Kobari L,Mazurier C,et al.Red blood cellgeneration from human induced pluripotent stem cells:perspectivesfortransfusion medicine.Haematologica,2010,95(10):1651-1659)。

为此，本申请提供了一种红细胞脱核培养基，利用该红细胞脱核培养基可以促进红细胞脱核。我们可以在常规红系脱核培养基中添加一种Bcl-2小分子抑制剂，该抑制剂的添加可以明显促进红细胞的脱核。

为此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种红细胞脱核培养基，包括：基础培养基、转铁蛋白、重组人胰岛素、肝素和Bcl-2小分子抑制剂；可选地，还含有血浆、血清、谷氨酰胺或者促红细胞生成素中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，以上所述红细胞脱核培养基可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述Bcl-2小分子抑制剂包括选自ABT-199、ABT-263、ABT-737、AZD4320、GX15-070、BAM7、Sabutoclax、、Gambogic Acid、Gossypol acetic acid、AT-101acetic acid、HA14-1、TW-37、BH3I-1、(S)-Gossypol acetic acid、A-385358、AT-101、(+)-Apogossypol Inhibitor、S55746、Sabutoclax、BM 957、EM20-25中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述Bcl-2小分子抑制剂为ABT-199或EM20-25。

在本发明的一些实施例中，所述转铁蛋白的浓度为50～500μg/ml；所述重组人胰岛素的浓度为1～100μg/ml；所述肝素的浓度为0.5～10U/ml；所述谷氨酰胺的浓度为0～20mM，任选为2～10mM；所述血浆的体积浓度为0～10％，任选为1～8％；所述血清的体积浓度为0～10％，任选为1～8％；所述促红细胞生成素的浓度为0～20U/ml，任选为2～10U/ml；所述Bcl-2小分子抑制剂的浓度为0.1μM～100mM。

在本发明的一些实施例中，所述转铁蛋白的浓度为300μg/ml；所述重组人胰岛素的浓度为10μg/ml；所述肝素的浓度为3U/ml；所述谷氨酰胺的浓度为3mM；所述血浆的体积浓度为2％；所述血清的体积浓度为3％；所述Bcl-2小分子抑制剂的浓度为1μM～100μM。

在本发明的一些实施例中，所述基础培养基包括选自IMDM、F12、IPMI1640、stemspan、stem span II、stemline II中的至少一种。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于红细胞的脱核培养，所述试剂盒包括Bcl-2小分子抑制剂。

根据本发明的实施例，以上所述的试剂盒进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述试剂盒中所述Bcl-2小分子抑制剂包括选自下列中的至少一种：

ABT-199、ABT-263、ABT-737、AZD4320、GX15-070、BAM7、Sabutoclax、、GambogicAcid、Gossypol acetic acid、AT-101acetic acid、HA14-1、TW-37、BH3I-1、(S)-Gossypolacetic acid、A-385358、AT-101、(+)-Apogossypol Inhibitor、S55746、Sabutoclax、BM957、EM20-25。

在本发明的一些实施例中，以上所述的试剂盒进一步包括下列中的至少一种：基础培养基、转铁蛋白、重组人胰岛素、谷氨酰胺、肝素、血浆、血清和促红细胞生成素。

在本发明的一些实施例中，所述Bcl-2小分子抑制剂与所述基础培养基、转铁蛋白、重组人胰岛素、肝素、谷氨酰胺、血浆、血清和促红细胞生成素设置在不同的容器中。当然，也可以预先将这些成分混合在一起。将这些成分分别放置在不同的容器中，使用时，现配制，效果更佳。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种制备成熟红细胞的方法，包括：利用Bcl-2小分子抑制剂对表面标志CD235a呈阳性的有核红系细胞进行脱核培养处理，以便获得成熟红细胞。根据需要，Bcl-2小分子抑制剂可以作为外源物质添加到含有表面标志CD235a呈阳性的有核红系细胞的培养基中，也可以将Bcl-2小分子抑制剂预先加入到培养基中，然后利用含有Bcl-2小分子抑制剂的培养基对所述表面标志物CD235a呈阳性的细胞进行脱核培养处理。其中表面标志CD235呈阳性的有核红系细胞是指表面标志物CD235表达呈现阳性的具有细胞核的红系细胞。

在本发明的一些实施例中，以上制备成熟红细胞的方法可以进一步附加如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述Bcl-2小分子抑制剂包括选自Venetoclax(维奈妥拉，ABT-199,GDC-0199)、Navitoclax(ABT-263)、ABT-737、AZD4320、Obatoclax Mesylate(GX15-070)、BAM7、Sabutoclax、Gambogic Acid、Gossypol acetic acid、AT-101aceticacid、HA14-1、TW-37、BH3I-1、(S)-Gossypol acetic acid、A-385358、AT-101、(+)-Apogossypol Inhibitor、S55746、Sabutoclax、BM 957、EM20-25中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：利用含有Bcl-2小分子抑制剂的红细胞脱核培养基对所述表面标志CD235a呈阳性的有核红系细胞进行脱核培养处理，以便获得成熟红细胞。

在本发明的一些实施例中，利用含有Bcl-2小分子抑制剂的红细胞脱核培养基对所述所述表面标志CD235a呈阳性的有核红系细胞进行脱核培养，相比较于未添加有Bcl-2小分子抑制剂的红细胞脱核培养基对所述表面标志CD235a呈阳性的有核红系细胞进行脱核培养，脱核率提高了至少2倍。

在本发明的一些实施例中，所述红细胞脱核培养基包括：基础培养基；转铁蛋白，所述转铁蛋白的浓度为50～500μg/ml，优选为300μg/ml；重组人胰岛素，所述重组人胰岛素的浓度为1～100μg/ml，优选为10μg/ml；肝素，所述肝素的浓度为0.5～10U/ml，优选为3U/ml；谷氨酰胺，所述谷氨酰胺的浓度为0～20mM，优选为2～10mM；血浆，所述血浆的体积浓度为0～10％，任选为1～8％，优选为2％；血清，所述血清的体积浓度为0～10％，任选为1～8％，优选为3％；促红细胞生成素，所述促红细胞生成素的浓度为0～20U/ml，任选为2～10U/ml，优选为3U/ml；和Bcl-2小分子抑制剂，所述Bcl-2小分子抑制剂的浓度为0.1μM～100mM，优选为1μM～100μM。通过这些含有Bcl-2小分子抑制剂的红细胞脱核培养基，能够明显提高红细胞的脱核效率。本文中“体积浓度”作本领域的通常理解，即两种液体的体积比。以红细胞脱核培养基中含有的血浆为例，当表示所述血浆的体积浓度为0～10％时，即意味着每100ml红细胞脱核培养基，含有血浆0～10ml。

在本发明的一些实施例中，所述基础培养基包括选自IMDM、F12、IPMI1640、stemspan、stem spanII、stemline II中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：对造血干/祖细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、单个核细胞中的至少一种进行诱导分化培养，获得所述表面标志CD235a呈阳性的有核红系细胞。

在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：(1)从血液中分离获得所述单个核细胞；(2)利用红细胞分化培养基对所述单个核细胞进行诱导分化培养，获得所述表面标志CD235a呈阳性的有核红系细胞。

在本发明的一些实施例中，所述血液取自于脐带血、骨髓或者外周血中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述脱核培养处理的时间为3～12天。在该培养时间内，利用Bcl-2小分子抑制剂进行脱核培养处理，相较于未添加有Bcl-2小分子抑制剂脱核处理，脱核率至少提高了1倍。

在本发明的一些实施例中，所述脱核培养处理的时间为4～6天。

在本发明的一些实施例中，所述诱导分化培养的时间为12～21天。例如诱导分化培养14天，大部分单个核细胞发生红系分化，此时可以利用Bcl-2小分子抑制剂进行脱核培养处理，获得成熟的红细胞。由此获得的红细胞的脱核率较高。

在本发明的一些实施例中，当表面标志CD71和CD235a呈现双阳性的细胞占所述经诱导分化的细胞的比例达到60～90％时，任选至少达到80％时，利用Bcl-2小分子抑制剂对所述经诱导分化的细胞进行脱核培养处理。

在本发明的一些实施例中，步骤(2)中利用红细胞分化培养基对所述单个核细胞进行诱导分化培养，所述红细胞分化培养基中添加有促红细胞生成素、干细胞生长因子、转铁蛋白、IGF-1(胰岛素样生长因子-1)、类脂、地塞米松和谷氨酰胺。

本发明所取得的有益效果为：本发明利用Bcl-2小分子抑制剂能够明显提高红细胞的脱核效率。由此所制备的红细胞脱核培养基不仅能够明显提高红细胞的脱核效率，还可以避免了基质细胞的污染。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的红系分化14天检测红系表面标志情况的结果图。

图2是根据本发明的实施例提供的代表性Bcl-2小分子抑制剂EM20-25处理红系祖细胞6天后检测脱核情况的结果图。

图3是根据本发明的实施例提供的代表性Bcl-2小分子抑制剂ABT-199处理红系祖细胞6天后检测脱核情况的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

为了方便本发明的理解，下面对本发明的某些术语做进一步描述。这些描述并非是对本发明的限制。

本文中“Bcl-2小分子抑制剂”指任何能够与Bcl-2蛋白或者相关核酸结合，并且拮抗Bcl-2相关核酸或蛋白质活性的小分子物质。

Bcl-2蛋白(B淋巴细胞瘤-2)是一类细胞凋亡蛋白，在肿瘤的发生及转移中起着重要的作用。正常情况下，Bcl-2蛋白与Bax形成二聚体以及自身二聚调控细胞的凋亡。Bcl-2蛋白是Bcl-2家族蛋白中的一种抑制凋亡蛋白，在某些癌细胞中高度表达，选择性的抑制Bcl-2已经成为抗肿瘤药物的热门靶点。

以Venetoclax为例，Venetoclax是一种选择性的Bcl-2抑制剂，旨在恢复细胞的凋亡功能，发挥抗肿瘤的作用，它也是全球上市的蛋白-蛋白相互作用抑制剂。

(Venetoclax)是由艾伯维公司研发，于2016年4月11日获美国食品药品管理局(FDA)批准上市，在不到1年内连续获得3次突破疗法认定。该药用于治疗带有17p基因缺失突变并且曾接受过至少一种治疗的慢性淋巴细胞白血病(CLL)。

本文中的Bcl-2小分子抑制剂包括但不限于：Venetoclax(维奈妥拉、维奈托克、凡托克斯，ABT-199,GDC-0199)、Navitoclax(ABT-263)、ABT-737、AZD4320、ObatoclaxMesylate(甲磺酸酯，GX15-070)、BAM7、Sabutoclax、Gambogic Acid、Gossypol aceticacid(一种多酚类化合物)、AT-101acetic acid、HA14-1、TW-37、BH3I-1、(S)-Gossypolacetic acid(棉酚)、A-385358、AT-101、(+)-Apogossypol Inhibitor、S55746、Sabutoclax、BM 957、EM20-25等，这些小分子抑制剂可以和Bcl-2结合并抑制其活性。

其中“祖细胞”是指在一定的微环境和某些因素的调节下，增殖分化为各类血细胞的族细胞，也称为造血祖细胞，是一种相当原始的具有增殖能力的细胞，但已失去多向分化能力，只能向一个或几个血细胞系定向增殖分化。红系祖细胞是指可以在一定微环境和某些因素的调节下增殖分化为成熟红细胞。

“成熟红细胞”是指血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液运送氧气、二氧化碳、营养物质的最主要的媒介，同时还具有免疫功能。哺乳动物成熟红细胞是无核的，这就意味着它们失去了DNA。而且也没有线粒体，是通过葡萄糖合成能量。

“红细胞分化培养基”是指通过特定的培养基和因子的组合可以诱导细胞分化，进一步获得红系细胞，包括BFU-E(爆式红系集落形成单位)、CFU-E(红系集落形成单位)、原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞等不同阶段的红系细胞。可以利用本领域常用的红细胞分化培养基。通常是由无血清基础培养基、胎牛血清和各种小分子物质组成的用于培养红细胞的培养基。其中无血清培养基可以为StemSpan/SCGM为基础培养基，小分子物质可以是重组人胰岛素、肝素钠、谷氨酰胺、转铁蛋白、二巯基乙醇等等。在本发明的至少一些实施方式中，红细胞分化培养基中含有促红细胞生成素、干细胞生长因子、转铁蛋白、地塞米松和谷氨酰胺。

“红细胞脱核培养基”是指有利于幼红细胞向成熟红细胞分化并完成脱核过程的培养基。红细胞脱核是指红细胞分化成熟的终末阶段(晚幼红细胞阶段)，细胞核发生皱缩、边缘化并与细胞质分离的过程。本发明的发明人发现将Bcl-2小分子抑制剂加入到培养基中，对红细胞进行脱核处理，Bcl-2小分子抑制剂能够显著提高红细胞脱核的效率。由此可以获得红细胞脱核培养基，当然可以按照本领域的常规的方法制备获得红细胞脱核培养基。在本发明的一些具体实施方式中，所述红细胞脱核培养基包括基础培养基、转铁蛋白、重组人胰岛素、肝素、Bcl-2小分子抑制剂，在此基础上还可以进一步包括血浆和血清、谷氨酰胺或者促红细胞生成素。其中当基础培养基中含有谷氨酰胺时，可以不再另加入谷氨酰胺。谷氨酰胺可以以商品GlutaMAX^TM的形式加入，例如使用浓度可以为2mM。也可以以L-谷氨酰胺的形式加入。在本发明的另一些具体实施方式中，所述红细胞脱核培养基中转铁蛋白的浓度为50-500μg/ml，可以为100-500μg/ml,100-400μg/ml，150-350μg/ml,例如可以为200μg/ml、300μg/ml等等。所述重组人胰岛素的浓度为1-100μg/ml,可以为1-80μg/ml、10-50μg/ml、10-30μg/ml，例如可以为10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml等等。所述肝素的浓度为0.5-10U/ml,可以为3U/ml、5U/ml。所述Bcl-2小分子抑制剂的浓度为0.1μM-100mM，可以为1μM～100μM。当然使用不同的Bcl-2小分子抑制剂时，其浓度也会有所不同。以Bcl-2小分子抑制剂EM20-25为例，其浓度可以为40μM，60μM；以ABT-199为例，其浓度可以为20μM，30μM。另外，以100ml所述红细胞脱核培养基计，可以含有0-10ml血浆，例如可以含有1-8ml血浆。以100ml所述红细胞脱核培养基计，可以含有0-10ml血清，例如可以含有1-8ml血清。红细胞脱核培养基中的血浆和/或血清成分，可全部替代为胎牛血清。这样一方面避免了分离取材血清、血浆成分的复杂操作，一方面也使得制备的培养基更为通用。当培养基中含有促红细胞生成素时，促红细胞生成素的浓度可以为1～20U/ml，可以为2～10U/ml，例如可以为3U/ml。

在至少一些实施方式中，本发明所提供的制备成熟红细胞的方法，借助于Bcl-2小分子抑制剂，能够提高红细胞的脱核效率。该方法包括：(1)从血液中分离获得单个核细胞；(2)对所述单个核细胞进行诱导分化培养，获得经诱导分化的细胞；(3)利用Bcl-2小分子抑制剂对所述经诱导分化的细胞进行脱核培养处理，获得成熟红细胞。从血液中获得单个核细胞，经过诱导分化培养，大部分细胞被诱导分化为红系祖细胞，红系祖细胞经过脱核处理可以形成为成熟的红细胞；而发明人通过研究发现Bcl-2小分子抑制剂可以显著提高红细胞脱核的效率，应用于成熟红细胞的制备过程中，可以极大节省红细胞制备的成本。

本文中，术语“单个核细胞”是指血液中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞，也包括造血干细胞和祖细胞。可以用本领域常用的方法制备单个核细胞。在本发明中，单个核细胞是根据血液中细胞的密度不同分离得到的。其可以利用脐血或外周血的全血直接分离得到，也可以从脐血或外周血中分离出白膜层后再从白膜层制备得到。在本发明的一个实施方案中，所述单个核细胞来自脐血全血。当然我们还可以从骨髓、外周血中分离获得单个核细胞。本文中，对于血液的血型没有特别的限制，可以是来自A型血、B型血或者O型血、RH型血等等。较佳地，可以是来自O型血的脐带血，可以普遍适用于临床需要输血人群，可以覆盖大多数人群输血，尤其是急救时，可以减少检测血型的过程。

在本发明的至少一些实施方式中，本发明提供了一种制备成熟红细胞的方法，包括：(1)获得造血干/祖细胞、胚胎干细胞或者诱导多能干细胞；(2)对所述造血干/祖细胞、胚胎干细胞或者所述诱导多能干细胞进行诱导分化培养，获得表面标志C235a呈阳性的有核红系细胞；(3)利用Bcl-2小分子抑制剂对所述表面标志CD235a呈阳性的有核红系细胞进行脱核培养处理，以便获得成熟红细胞。造血干/祖细胞、胚胎干细胞或者诱导多能干细胞经过一定程度的诱导分化培养，其表面标志CD235a呈现阳性，利用这些细胞可以作为种子细胞，利用Bcl-2小分子抑制剂进行脱核培养，可以获得成熟的红细胞。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次表明的内容相同。

实施例1

一、脐带血单个核细胞的分离

1、沉降红细胞

(1)、将第一次离心剩余的脐血转入250ml玻璃瓶中，补加生理盐水至脐血原体积。

(2)、按脐血总体积的1/3加入6％羟乙基淀粉，充分混匀，室温沉降20～30min。

(3)、小心吸取上清，收集到2-3个50ml离心管中，离心1800rpm，5min，室温20～25℃。

2、脐带血单个核细胞(mononuclear cell,MNC)的分离

(1)、取上述去红细胞的脐带血离心细胞团，弃上清，每管加入10mL PBS重悬细胞，于室温下以1800rpm/min离心5min，洗涤后用10mL PBS合并、重悬所有细胞；

(2)、在2个10mL离心管中加入预先平衡至室温的人淋巴细胞分离液[Ficoll-Hypaque液，(1.077±0.0002)g/L]，每管5mL，将5mL细胞悬液在距分离液界面上约1cm处沿着试管壁缓慢加至分离液液面之上，应注意保持两者分界面清晰，切勿破坏分界线而使血液混入下层分离液内；

(3)、将离心管置于水平式离心机内，注意使离心机转速的升降速度控制在最低档，于室温下以2000rpm/min离心20min；离心后，可见管内悬液分为以下四层：最上层为绝大部分血小板、血浆与血液稀释液的混合液；最下层为红细胞及粒细胞；中下层为淋巴细胞分离液；而在分离液与血浆相交界面可见混浊的灰白色云雾状细胞层即为单个核细胞层；

(4)、将滴管轻轻插入灰白色云雾状细胞层，旋转滴管及离心管小心吸出灰白色的单个核细胞层，转移入另一支新的50ml离心管中(共2管)，此过程中既要尽量多地吸取不遗漏单个核细胞，又要避免吸取过多的分离液或血浆而混杂其他细胞成分，加入生理盐水调整细胞悬液至终体积50ml，充分混匀后于室温下以1800rpm/min离心5min，弃上清；

(5)、合并各管细胞于1个50ml离心管中，加入PBS或生理盐水至40ml，1800rpm，5min，洗涤一次，弃上清。将细胞悬于PBS或生理盐水中至终体积至40ml，吸管吹打混匀，取100ul细胞悬液，移入1.5mL Ep管中备细胞计数。

(6)、根据细胞多少选择稀释倍数计数。加样器轻轻吹打细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加10μL细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要太少或带气泡。在显微镜下用10×物镜观察计数四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。健康细胞胞体完整且透明，而死细胞或状态较差的细胞折光性差，细胞膜不完整。将计数结果代入下式得出细胞密度。

细胞数/毫升原液＝(4大格细胞数之和/4)×10000×稀释倍数

二、脐带血单个核细胞体外无血清培养体系下向红系祖细胞诱导分化

将分离得到的单个核细胞接种到体外无血清的红系祖细胞定向诱导分化培养体系中，进行细胞诱导和扩增。

所用到的诱导分化培养基的配方为：StemSpan无血清培养基，添加人促红细胞生成素(EPO)5U/mL、干细胞生长因子(SCF)100ng/mL、胰岛素样生长因子(IGF-1)40ng/mL、转铁蛋白(holo-Transferrin)100μg/mL、地塞米松(Dex)1μM、L-谷氨酰氨2mM。其中StemSpan无血清培养基、细胞因子、地塞米松和转铁蛋白分装后-20℃保存。StemSpan培养基使用时提前放入4℃冰箱融化，细胞培养基现用现配。

细胞的初始接种密度设定为3-5×10⁶个细胞/mL，随着细胞的扩增，视实际的生长情况约每3天细胞传代，使细胞密度最好保持不超过4×10⁶细胞/mL。

三、红系祖细胞的脱核

在红系诱导分化体系下，单个核细胞会倾向于红系的分化，即倾向分化为红系祖细胞，在红系诱导分化14天时，通过流式检测，相关红系细胞表面标志CD71和CD235a为双阳性细胞占被诱导分化的总细胞的比例到达80％左右(如图1)，收集并洗涤细胞后，将其置于红细胞脱核培养基中诱导脱核。在本次实验中，我们按照以下表1配置红细胞脱核培养基。其中EM20-25购自于sigma，产品货号为SML0183，分子式为C₁₅H₉ClN₄O₆，结构式如下：

表1红细胞脱核培养基的配方

基本成分	比例与终浓度(配置100ml培养基)
		基础培养基(IPMI1640)	95ml
转铁蛋白	300μg/ml
		重组人胰岛素	10μg/ml
肝素	3U/ml
		血浆	2ml
血清	3ml
		Bcl-2小分子抑制剂(EM20-25)	40μM

以未添加有Bcl-2小分子抑制剂的红细胞脱核培养基作为对照组(即按照表1中所示的红细胞脱核培养基配方，不添加Bcl-2小分子抑制剂组，使用溶剂DMSO代替)。

在脱核处理3-12天时，我们分别检测红细胞的脱核比例，并使用麦格氏染色对该阶段的细胞进行染色。结果显示，在脱核6天时，可以观察到对照组的脱核比例(脱核率)为14.7％，添加有Bcl-2小分子抑制剂EM20-25的实验组的脱核率为45.7％，明显优于对照组(图2，以CD235a⁺SYTO16^-代表脱核细胞，脱核率即为脱核细胞占总细胞的比例)。同时，实验进行了多次，统计结果表明实验组的脱核率为50％左右，对照组的脱核率不到25％(N＝5，p＝0.003939)。另外，麦格氏染色结果也能明显反映出大量红细胞已完成脱核。

另外，针对Bcl-2小分子抑制剂EM20-25，我们变换了该小分子抑制剂的浓度，分别为20μM和60μM，分别作为实验组，按照上述方法进行了实验，结果表明，其脱核率相较于对照组也有明显提高。

实施例2

实施例2与实施例1的不同之处在于，实施例2所用到的为Bcl-2小分子抑制剂为ABT-199(又称Venetoclax、维奈妥拉、维奈托克、凡托克斯、GDC-0199)：

按照表1中的配方，将红细胞脱核培养基中的EM20-25更换为ABT-199(分子式如下所示，使用浓度为20μM)，脱核检测结果如图3所示。

图3的结果表明，对照组的脱核率为14％，而采用Bcl-2小分子抑制剂ABT-199处理，脱核率为37％。结果表明使用Bcl-2小分子抑制剂ABT-199相比较于未添加有ABT-199的对照组，脱核率至少提高了一倍。Bcl-2小分子抑制剂ABT-199与EM20-25有同样的促进脱核的效果。

另外，针对Bcl-2小分子抑制剂ABT-199，我们更换了该小分子抑制剂的浓度，分别为1μM、2μM、5μM和10μM，分别作为实验组，按照上述方法进行了实验，结果表明，其脱核率相较于对照组也有了明显的提高。

同时，我们对其他Bcl-2小分子抑制剂，例如BAM7，S55746、BM957等的脱核效果分别按照如上方法进行了验证，结果表明，利用这些Bcl-2小分子抑制剂相较于未添加这些Bcl-2小分子抑制剂的对照组进行脱核处理，脱核率有了显著的提高。

从以上实验可以看出，利用Bcl-2小分子抑制剂可以促进红细胞脱核，从而可以用于制备成熟的红细胞。且所制备得到的红细胞的脱核率，在不依赖于基质细胞的情况下，就可以达到50％左右。

我们之前的研究表明miR-125b对脱核起到调控作用，该内容记载在申请号为ZL201210479480.5的中国专利申请中，并可以根据需要部分或者全部引入本文。miR-125b可以促进红细胞的脱核。而通过进一步研究表明miR-125b可以通过下调Bcl-2，从而发挥对红细胞脱核的促进作用，并且Bcl-2siRNA的添加可以促进脱核比例的增高。鉴于Bcl-2的下调表达可以促进红细胞的脱核，在实验的研究过程中我们发现，采用Bcl-2小分子抑制剂处理也有同样的作用效果，例如包括EM20-2、ABT-199等。而且Bcl-2小分子抑制剂使用起来操作简单，极大的简化了操作成本，并且提高了脱核率。以ABT-199为例，其是目前唯一一个正在开展临床研究的Bcl-2小分子抑制剂，这对于进一步体外大规模制备红细胞应用于临床也提供了一个优化培养方案。Bcl-2小分子抑制剂的发展，也将促进体外制备成熟红细胞的远期临床应用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种红细胞脱核培养基，其特征在于，包括：

基础培养基、转铁蛋白、重组人胰岛素、肝素和Bcl-2小分子抑制剂，

其中，所述Bcl-2小分子抑制剂为ABT-199或EM20-25。

2.根据权利要求1所述的红细胞脱核培养基，其特征在于，所述红细胞脱核培养基还含有血浆、血清、谷氨酰胺或者促红细胞生成素中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的红细胞脱核培养基，其特征在于，

所述转铁蛋白的浓度为50～500μg/ml；

所述重组人胰岛素的浓度为1～100μg/ml；

所述肝素的浓度为0.5～10U/ml；

所述谷氨酰胺的浓度为0～20mM；

所述血浆的体积浓度为0～10％；

所述血清的体积浓度为0～10％；

所述促红细胞生成素的浓度为0～20U/ml；

所述Bcl-2小分子抑制剂的浓度为0.1μM～100mM。

4.根据权利要求3所述的红细胞脱核培养基，其特征在于，所述谷氨酰胺的浓度为2～10mM。

5.根据权利要求3所述的红细胞脱核培养基，其特征在于，所述血浆的体积浓度为1～8％。

6.根据权利要求3所述的红细胞脱核培养基，其特征在于，所述血清的体积浓度为1～8％。

7.根据权利要求3所述的红细胞脱核培养基，其特征在于，所述促红细胞生成素的浓度为2～10U/ml。

8.根据权利要求2所述的红细胞脱核培养基，其特征在于，

所述转铁蛋白的浓度为300μg/ml；

所述重组人胰岛素的浓度为10μg/ml；

所述肝素的浓度为3U/ml；

所述谷氨酰胺的浓度为3mM；

所述血浆的体积浓度为2％；

所述血清的体积浓度为3％；

所述Bcl-2小分子抑制剂的浓度为1μM～100μM。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的红细胞脱核培养基，其特征在于，所述基础培养基包括选自IMDM、F12、IPMI1640、stem span、stem span II、stemline II中的至少一种。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于红细胞的脱核培养，所述试剂盒包括Bcl-2小分子抑制剂，其中，所述Bcl-2小分子抑制剂为ABT-199或EM20-25。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括下列中的至少一种：

基础培养基、转铁蛋白、重组人胰岛素、肝素、谷氨酰胺、血浆、血清和促红细胞生成素。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述Bcl-2小分子抑制剂与所述基础培养基、转铁蛋白、重组人胰岛素、肝素、谷氨酰胺、血浆、血清和促红细胞生成素设置在不同的容器中。

13.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述基础培养基包括选自IMDM、F12、IPMI1640、stem span、stem span II、stemline II中的至少一种。