CN107034170B - 脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的培养基及方法 - Google Patents
脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的培养基及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的培养基及方法。本发明提供的培养基能够将脂肪间充质干细胞诱导同时分化成为星状细胞和肝内皮细胞，实验操作简单，干细胞来源广泛。以本发明提供培养基对脂肪干细胞诱导分化的效果要显著优于对照试验，且分化而来的两种细胞都具备其典型功能和表达关键基因。结果表明，本发明提供的培养基诱导分化23天后，有9.6％的细胞分化为肝星状细胞类似的细胞，有14.3％的细胞成为人类肝内皮细胞类似的细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的培养基及方法。
背景技术
在我国每年近28万人死于肝硬化、肝癌等肝脏相关疾病。目前对晚期肝病的临床治疗尚无特效疗法和技术手段，原位肝移植是公认的治疗晚期肝病的有效治疗方法。但是，由于肝源短缺，手术费用昂贵，操作要求高，术后免疫反应等原因，肝移植治疗遇到了瓶颈问题。
干细胞移植治疗就是试图缓解肝源短缺的问题。目前，利用干细胞移植在肝病的治疗中取得了一定的成果，潘兴南、何金秋和Mehdi Mohamadnejad等人利用自体骨髓间充质干细胞临床治疗肝硬化等终末期肝病取得一定的疗效；此外还有干细胞成功治疗骨头坏死、眼疾、耳聋，心脏、血管、肌肉损伤上治疗的报道。但是，干细胞治疗的应用还存在一些难题，比如，临床研究种子细胞主要来源于骨髓或脐血，其来源相对局限，获取的细胞数量较低，且诱导干细胞的生长和分化过程十分复杂，效率较低；其次，骨髓间充质干细胞的质量在较高程度上影响着治疗的效果；且有研究显示，骨髓干细胞移植之后，会明显增加受损肝脏内星状细胞和肌纤维母细胞的数量，这说明骨髓干细胞移植很大程度上会加速，而不是改善肝纤维化的进展。
另外，本领域当前研究的方向主要集中在将干细胞分化成肝细胞，或者不进行分化，直接用干细胞移植后令其在肝内自发分化而起作用；也有研究者将干细胞分化成胆管上皮样细胞。不过该方法有几大缺点，包括分化后仅为肝细胞一种细胞类型、注射细胞仅为2D细胞悬液、治疗效率低和移植后成瘤性等问题。现在有研究创造性地将肝细胞、静脉内皮细胞和间充质干细胞共培养，提示多种相关细胞的混合培养更有利于3D器官芽的形成。但是，虽然肝星状细胞和肝内皮细胞是肝脏细胞的最重要的细胞类型，在肝脏的生理、病理进程中发挥着不可或缺的作用，但目前还没有很成熟、简单且高效的将干细胞在体外诱导分化成这两种细胞的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的培养基及方法，本发明提供的培养基和培养方法能够将脂肪间充质干细胞在体外直接同时诱导分化成为肝星状细胞和肝内皮细胞，操作更加简单。
本发明提供了一种培养基，包括：基础培养基和Wnt3a蛋白20ng/mL～80ng/mL、Activin A蛋白50ng/mL～100ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL～200μL/mL。
本发明中，将该培养基标记为培养基A。
一些实施例中，培养基A包括：基础培养基和Wnt3a蛋白20ng/mL、Activin A蛋白100ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
一些实施例中，培养基A包括：基础培养基和Wnt3a蛋白20ng/mL、Activin A蛋白100ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 200μL/mL。
一些实施例中，培养基A包括：基础培养基和Wnt3a蛋白80ng/mL、Activin A蛋白50ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
一些实施例中，培养基A包括：基础培养基和Wnt3a蛋白80ng/mL、Activin A蛋白50ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 200μL/mL。
一些实施例中，培养基A包括：基础培养基和Wnt3a蛋白40ng/mL、Activin A蛋白75ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
一些实施例中，培养基A包括：基础培养基和Wnt3a蛋白40ng/mL、Activin A蛋白75ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 200μL/mL。
培养基A中，基础培养基为DMEM/F12培养基。
培养基A在诱导脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化中的应用。所述的脂肪间充质为人间充质干细胞。
Wnt3a蛋白是包含328个氨基酸残基的单链蛋白质，是Wnt1家族成员，参与经典的Wnt信号通路。Wnt3a蛋白作为一种干细胞生长分化因子，其在信号表达、胚胎成长、干细胞生长分化和成体组织维护方面起关键作用。本发明采用的Wnt3a蛋白是重组人类Wnt3a蛋白。
Activin A蛋白是一种激活素(activins)，Activin A是转化生长因子(TGF)β家族的一种分泌蛋白，可控制胚胎轴发育为有功能的前肠源性组织，调解多种细胞的生长和分化。本发明采用的Activin A蛋白为重组人类Activin A蛋白。
本发明还提供了一种培养基，包括：基础培养基和bFGF蛋白2.5ng/mL～10ng/mL、BMP4蛋白10ng/mL～50ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
本发明中，将该培养基标记为培养基B。
一些实施例中，培养基B包括：基础培养基和bFGF蛋白2.5ng/mL、BMP4蛋白50ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
一些实施例中，培养基B包括：基础培养基和bFGF蛋白10ng/mL、BMP4蛋白10ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
一些实施例中，培养基B包括：基础培养基和bFGF蛋白5ng/mL、BMP4蛋白25ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
培养基B中，基础培养基为DMEM/F12培养基。
培养基B在诱导脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化中的应用。
bFGF蛋白，碱性成纤维细胞生长因子，是重要的促有丝分裂因子，也是形态发生和分化的诱导因子。本发明采用的bFGF蛋白为重组人类bFGF蛋白。
BMP4蛋白，骨形态发生蛋白4，又名骨成型蛋白4，具有促进动物软骨形成、调节细胞增殖、分化及迁移的多种功能。本发明采用的BMP4蛋白为重组人类BMP4蛋白。
一种培养基，包括：基础培养基和aFGF蛋白10ng/mL～50ng/mL、FGF4蛋白2.5ng/mL～10ng/mL、FGF8b蛋白10ng/mL～40ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
本发明中，将该培养基标记为培养基C。
一些实施例中，培养基C包括：基础培养基和aFGF蛋白50ng/mL、FGF4蛋白2.5ng/mL、FGF8b蛋白40ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
一些实施例中，培养基C包括：基础培养基和aFGF蛋白10ng/mL、FGF4蛋白10ng/mL、FGF8b蛋白10ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
一些实施例中，培养基C包括：基础培养基和aFGF蛋白25ng/mL、FGF4蛋白5ng/mL、FGF8b蛋白20ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
培养基C中，基础培养基为DMEM/F12培养基。
培养基C在诱导脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化中的应用。
aFGF蛋白，酸性成纤维细胞生长因子，由147个氨基酸组成，分子量为15.3KD的活性多肽，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥着重要功能。本发明采用的aFGF蛋白为重组人类aFGF蛋白。
FGF4蛋白，成纤维细胞生长因子4，能够显著促进干细胞增殖，促进干细胞向韧带或肌腱方向分化。本发明采用的FGF4蛋白为重组人类FGF4蛋白。
FGF8b蛋白，成纤维细胞生长因子8b，能够接到胚胎上皮-间充质细胞转变。本发明采用的FGF8b蛋白为重组人类FGF8b蛋白。
一种培养基，包括：基础培养基和HGF蛋白5ng/mL～20ng/mL、Follistatin蛋白25ng/mL～75ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
本发明中，将该培养基标记为培养基D。
一些实施例中，培养基D包括：基础培养基和HGF蛋白5ng/mL、Follistatin蛋白75ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
一些实施例中，培养基D包括：基础培养基和HGF蛋白20ng/mL、Follistatin蛋白25ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
一些实施例中，培养基D包括：基础培养基和HGF蛋白10ng/mL、Follistatin蛋白50ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
培养基D中，基础培养基为DMEM/F12培养基。
培养基D在诱导脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化中的应用。
HGF蛋白，肝细胞生长因子，是重要的抗纤维化因子，能修复受损肺组织，是重要的保护性因子。本发明采用的HGF蛋白为重组人类HGF蛋白。
Follistatin蛋白，卵泡抑素，又名FSH抑制蛋白，是一种单链糖蛋白，可以通过Activin/FSP系统来调节动物的生殖活动。本发明采用的Follistatin蛋白为重组人类Follistatin蛋白。
本发明的培养基A～D中，含有地塞米松、ITS、FBS。地塞米松又叫德沙美松、氟甲强的松龙，是抗炎、抗过敏药物。FBS是胎牛血清(fetal bovine serum)，ITS是指Insulin-transferrin-selenium，是胰岛素-转铁蛋白-硒的混合物，本发明采用的是ITS的市售商品，其规格是100×，含有胰岛素1g/L，转铁蛋白0.55g/L，硒0.00067g/L。本发明提供的培养基中ITS被稀释至0.25×。基础培养基时常见的细胞培养基，适用于多种哺乳动物细胞的培养。
本发明提供的培养基可用于脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞的分化。以本发明提供的培养基诱导脂肪间充质干细胞，分化的过程更加简单，操作容易，且同时得到两种细胞类型，相比起每一种都去耗时耗力分化，更加经济省力。此外，同时分化之后的分离措施简单，用流式细胞仪即可轻松完成，能兼容下游多种临床和基础研究的需要。
本发明提供了诱导脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的方法，其特征在于，包括：
第0天～第6天，脂肪间充质干细胞培养基A培养；
第7天～第10天，以培养基B培养；
第11天～第14天，以培养基C培养；
第15天～第28天，以培养基D培养。
脂肪间充质干细胞的获得方式可采用本领域的常规方法自行分离获得，也可通过商业途径购买获得。本发明对此不作限定。在进行诱导前，脂肪间充质干细胞经过复苏、传代培养的步骤。
所述复苏是指，将液氮中冻存的人脂肪间充质干细胞解冻，并转移至培养基中培养，使其恢复活性的操作，具体步骤包括：
从液氮中取出人脂肪间充质干细胞，37℃水浴溶解；
将溶解的细胞以DMEM/F12完全培养液(包含10％FBS，不包括双抗)重选后，1000rpm离心5min；弃掉上清；
细胞沉淀再次以DMEM/F12完全培养液(包含10％FBS，不包括双抗)重悬后进行培养；
培养1天后，弃除培养上清液，加入新鲜的DMEM/F12完全培养液(包含10％FBS，不包括双抗)继续培养至细胞长到80％～90％密度(confluence)时，传代。
所述传代的具体步骤包括：
复苏后，细胞长到80％～90％密度(confluence)时，吸掉培养上清液，加入2mL无菌PBS洗涤一遍，然后加入1mL已经预热的胰酶(浓度0.25％)消化，待到细胞80％变圆时加入2mL DMEM/F12完全培养液终止消化，收集细胞并转移至干净的15mL离心管，1000rpm离心5min；弃掉上清，加入1mL DMEM/F12完全培养液重悬，用移液器吹散成单个细胞悬液，培养、传代。
本发明实施例中，脂肪间充质干细胞优选为第4代细胞。
一些实施例中，
第0天～第2天，培养基A中FBS的浓度为200μL/mL；
第3天～第6天，培养基A中FBS的浓度为50μL/mL。
第0天培养细胞的接种浓度为105个/mL。培养采用12孔板，每孔500μL。
一些实施例中，第7天、第11天、第15天更换培养基前，细胞经无菌PBS清洗。清洗的次数为1～2次。
一些实施例中，培养的条件为：37℃，5％CO2，每天更换60v％的新鲜培养基。
一些实施例中，培养的容器不以matrigel包被。
matrigel是一种基底胶，现有技术中认为脂肪干细胞的诱导分化应对培养容器进行matrigel包被或铺板。但本发明实验证明，不以matrigel包被或铺板，同样能够获得良好的分化效果，甚至不包被matrigel的实验组中，分化的效果还优于包被的实验组。所述培养的容器为12孔板。
整个诱导的时间为28天。脂肪间充质干细胞历经28天的分化诱导，成功转化为肝星状细胞和肝内皮细胞。实验流程如图1。
肝内皮细胞是肝脏非实质细胞的主要细胞群，在调节肝窦血流与周围组织的物质交换中起有效的中枢性的作用，同时参与多种肝脏的生理病理过程。肝星状细胞是肝脏分泌细胞外基质的主要细胞，具有储脂和储存维生素A的功能，实验过程中，观察实验结果发现：在第1天时，用于分化的脂肪间充质干细胞呈短梭形，和对照组(进行常规传代培养的脂肪间充质干细胞)细胞形态并无二致。分化至第3天时，分化组与对照组在形态上仍然还没有区别。直到分化至第9天时，分化组的细胞形态开始向中央靠拢，出现体积相对较大的多边形或星形形态贴壁，细胞质内出现许多大小不一的脂滴。该现象到了第23天，也就是诱导分化基本完成的阶段，在诱导分化组表现得更为明显，而对照组没有出现这种情况，一直保持间充质干细胞较为明显的形态特征。诱导分化后，对细胞的性质和功能进行检测，表明所得细胞的功能良好，表现出显著的星状细胞和肝内皮细胞特性。
本发明提供的培养基能够将脂肪间充质干细胞诱导同时分化成为星状细胞和肝内皮细胞，实验操作简单，干细胞来源广泛。以本发明提供培养基对脂肪干细胞诱导分化的效果要显著优于对照试验，且分化而来的两种细胞都具备其典型功能和表达关键基因。结果表明，本发明提供的培养基诱导分化23天后，有9.6％的细胞分化为肝星状细胞类似的细胞，有14.3％的细胞成为人类肝内皮细胞类似的细胞。
附图说明
图1示实施例3的实验流程；
图2示诱导的人类脂肪间充质干细胞在关键时间点细胞形态的变化；
图3示脂肪干细胞分化星状细胞储存维生素A之后的自发荧光；
图4示脂肪干细胞分化肝内皮细胞孵育VE-Cadherin后的免疫荧光。
具体实施方式
本发明提供了提供脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的培养基及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明中英文缩写与中文对照如下：
Wnt3a Wnt信号蛋白3a
Activin A 激活素A
ITS 胰岛素-转铁蛋白-硒
FBS 胎牛血清
bFGF 碱性成纤维细胞生长因子
BMP4 骨形态发生蛋白4
aFGF 酸性成纤维细胞生长因子
FGF4 成纤维细胞生长因子4
FGF8b 成纤维细胞生长因子8b
HGF 肝细胞生长因子
Follistatin 卵泡抑素
matrigel 基底胶
VE-cadherin 血管内皮粘钙素
PPARg 过氧化物酶体增殖物激活受体gamma
ALCAM 激活性白细胞黏附分子，又称CD166
CRBP1 细胞视黄醇结合蛋白1
TIMP1 基质金属蛋白酶抑制因子-1
LOX 赖氨酰氧化酶
VCAM-1 血管内皮细胞粘附分子1
MRC-1 甘露糖受体C1
CD31b 血小板内皮细胞黏附分子-1
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
复苏：从液氮中取出一支冻存的人脂肪间充质干细胞(细胞来源，深圳市第三人民医院外科抽脂手术获得的成年妇女腹部脂肪组织)，在37℃水浴中快速摇晃溶解，迅速将细胞转移至一个干净的15mL离心管，加入1mLDMEM/F12完全培养液(包含10％FBS，不包括双抗)，1000rpm离心5min；弃掉上清，加入1mL前述DMEM/F12完全培养液重悬，用移液器吹散成单个细胞悬液，将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养。第二天吸掉DMEM/F12完全培养液，加入3mL新鲜前述DMEM/F12完全培养液培养。
传代培养：细胞长到80％～90％密度(confluence)时，吸掉DMEM/F12完全培养液，加入2mL无菌PBS洗涤一遍，然后加入1mL已经预热的胰酶消化，待到细胞80％变圆时加入2mL DMEM/F12完全培养液终止消化，收集细胞并转移至干净的15mL离心管，1000rpm离心5min；弃掉上清，加入1mL DMEM/F12完全培养液重悬，用移液器吹散成单个细胞悬液，根据实验需要将细胞悬液平均转移至两个或三个6cm培养皿中培养。
诱导分化：培养基如表1：
表1培养基配方
1)Day 0～6：常规培养人脂肪间充质干细胞，待第4细胞长到80％-90％密度时，按照常规传代培养操作。用培养基A重悬细胞后，使用细胞计数板技术，调整细胞浓度为105个/mL加入12孔板(不以matrigel包被)，500ul/孔。同时设置对照组，用DMEM/F12完全培养液(FBS)重悬。置37℃，5％CO2培养箱中培养。
2)Day 7～10：在Day 7用无菌PBS洗细胞1～2次，整体换新的培养基B，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 7～10每天换60％该分化培养基。
3)Day 11～14：在Day 11用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基C，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 11～14每天换60％该分化培养基。
4)Day 15～28：在Day 15用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基D，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 15～28每天换60％分化培养基。
实施例2
以实施例1传代获得的第4代脂肪干细胞作为分化起点，诱导分化：培养基如表2
表2培养基配方
1)Day 0～6：常规培养人脂肪间充质干细胞，待第4细胞长到80％-90％密度时，按照常规传代培养操作。用培养基A重悬细胞后，使用细胞计数板技术，调整细胞浓度为105个/mL加入12孔板(不以matrigel包被)，500ul/孔。同时设置对照组，用DMEM/F12完全培养液(FBS)重悬。置37℃，5％CO2培养箱中培养。
2)Day 7～10：在Day 7用无菌PBS洗细胞1～2次，整体换新的培养基B，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 7～10每天换60％该分化培养基。
3)Day 11～14：在Day 11用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基C，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 11～14每天换60％该分化培养基。
4)Day 15～28：在Day 15用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基D，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 15～28每天换60％分化培养基。
实施例3
以实施例1传代获得的第4代脂肪干细胞作为分化起点，诱导分化：培养基如表3
表3培养基配方
1)Day 0～6：常规培养人脂肪间充质干细胞，待第4细胞长到80％-90％密度时，按照常规传代培养操作。用培养基A重悬细胞后，使用细胞计数板技术，调整细胞浓度为105个/mL加入12孔板(不以matrigel包被)，500ul/孔。同时设置对照组，用DMEM/F12完全培养液(FBS)重悬。置37℃，5％CO2培养箱中培养。
2)Day 7～10：在Day 7用无菌PBS洗细胞1～2次，整体换新的培养基B，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 7～10每天换60％该分化培养基。
3)Day 11～14：在Day 11用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基C，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 11～14每天换60％该分化培养基。
4)Day 15～28：在Day 15用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基D，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 15～28每天换60％分化培养基。
对比例1
以实施例1传代获得的第4代脂肪干细胞作为分化起点，诱导分化：培养基如表4：
表4培养基配方
1)Day 0～6：常规培养人脂肪间充质干细胞，待第4细胞长到80％-90％密度时，按照常规传代培养操作。用培养基A重悬细胞后，使用细胞计数板技术，调整细胞浓度为105个/mL加入12孔板(不以matrigel包被)，500ul/孔。同时设置对照组，用DMEM/F12完全培养液(FBS)重悬。置37℃，5％CO2培养箱中培养。
2)Day 7～10：在Day 7用无菌PBS洗细胞1～2次，整体换新的培养基B，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 7～10每天换60％该分化培养基。
3)Day 11～14：在Day 11用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基C，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 11～14每天换60％该分化培养基。
4)Day 15～28：在Day 15用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基D，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 15～28每天换60％分化培养基。
对比例2
以实施例1传代获得的第4代脂肪干细胞作为分化起点，诱导分化：培养基如表5：
表5培养基配方
1)Day 0～6：常规培养人脂肪间充质干细胞，待第4细胞长到80％-90％密度时，按照常规传代培养操作。用培养基A重悬细胞后，使用细胞计数板技术，调整细胞浓度为105个/mL加入12孔板(以matrigel包被)，500ul/孔。同时设置对照组，用DMEM/F12完全培养液(FBS)重悬。置37℃，5％CO2培养箱中培养。
2)Day 7～10：在Day 7用无菌PBS洗细胞1～2次，整体换新的培养基B，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 7～10每天换60％该分化培养基。
3)Day 11～14：在Day 11用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基C，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 11～14每天换60％该分化培养基。
4)Day 15～28：在Day 15用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基D，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 15～28每天换60％分化培养基。
对比例3
以实施例1传代获得的第4代脂肪干细胞作为分化起点，诱导分化：培养基如表6
表6培养基配方
1)Day 0～6：常规培养人脂肪间充质干细胞，待第4细胞长到80％-90％密度时，按照常规传代培养操作。用培养基A重悬细胞后，使用细胞计数板技术，调整细胞浓度为105个/mL加入12孔板(以matrigel包被)，500ul/孔。同时设置对照组，用DMEM/F12完全培养液(FBS)重悬。置37℃，5％CO2培养箱中培养。
2)Day 7～10：在Day 7用无菌PBS洗细胞1～2次，整体换新的培养基B，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 7～10每天换60％该分化培养基。
3)Day 11～14：在Day 11用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基C，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 11～14每天换60％该分化培养基。
4)Day 15～28：在Day 15用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基D，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 15～28每天换60％分化培养基。
对比例4
以实施例1传代获得的第4代脂肪干细胞作为分化起点，诱导分化：培养基如表7：
表7培养基配方
1)Day 0～6：常规培养人脂肪间充质干细胞，待第4细胞长到80％-90％密度时，按照常规传代培养操作。用培养基A重悬细胞后，使用细胞计数板技术，调整细胞浓度为105个/mL加入12孔板(不以matrigel包被)，500ul/孔。同时设置对照组，用DMEM/F12完全培养液(FBS)重悬。置37℃，5％CO2培养箱中培养。
2)Day 7～10：在Day 7用无菌PBS洗细胞1～2次，整体换新的培养基B，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 7～10每天换60％该分化培养基。
3)Day 11～14：在Day 11用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基C，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 11～14每天换60％该分化培养基。
4)Day 15～28：在Day 15用无菌PBS洗1～2次，整体换新的培养基D，然后在37℃，5％CO2培养箱培养；Day 15～28每天换60％分化培养基。
实施例4
对实施例1～3和对比例1～4诱导分化的细胞进行检测。
1、形态学分析
根据不同程度分化的细胞与未分化的细胞形态学上的改变和特征，如大小，细胞器分布复杂性等，在关键天时在倒置显微镜/荧光显微镜下观察、拍照、记录。
实施例和对比例诱导细胞的形态与未诱导分化的细胞的形态如图2：在实施例3的细胞中，我们发现在Day 1时，用于分化的脂肪间充质干细胞呈短梭形，和对照组细胞形态并无二致。分化至Day 3时，分化组与对照组在形态上仍然还没有区别。直到分化至Day 9时，分化组的细胞形态开始向中央靠拢，出现体积相对较大的多边形或星形形态贴壁，细胞质内出现许多大小不一的脂滴。该现象到了Day 23，也就是诱导分化基本完成的阶段，在诱导分化组表现得更为明显，而不诱导分化的对照组没有出现这种情况，一直保持间充质干细胞较为明显的形态特征。实施例1和实施例2的细胞在形态上与实施例3的细胞相似。但对比例1～4的细胞形态则与实施例3有所不同。
2、荧光分析
实施例和对比例细胞分化至约20～23天时，进行细胞免疫荧光分析。使用PBS洗涤三次，4％多聚甲醛固定30min；PBS洗涤三次，每次10min；含0.2％Triton 100的1％BSA的PBS冰上通透5min；PBS洗涤三次，每次10min；含1％BSA的PBS封闭1h；PBS洗涤三次，每次10min；加入合适的一抗(1：200)，室温避光孵育2-3h/4℃摇晃过夜；PBS洗涤三次，每次10min；加入合适的荧光二抗(1：1000)，室温避光孵育1-1.5h；PBS洗涤三次，每次10min；加入DAPI(1：1000)进行细胞核染色，最后37℃避光孵育15min后在荧光显微镜下观察、拍照。
由于星状细胞具有储脂和储存维生素A的功能，对其自发荧光进行检测。
肝内皮细胞是肝脏非实质细胞的主要细胞群，在调节肝窦血流与周围组织的物质交换中起有效的中枢性的作用，同时参与多种肝脏的生理病理过程。为了证明通过分化，人类脂肪间充质干细胞中有一部分细胞已经成功分化成了肝内皮细胞，我们首先对分化后的细胞进行了VE-cadherin(vascular endothelial-cadherin)的免疫荧光染色。VE-cadherin，即血管内皮粘钙素，一般认为是内皮细胞的特异标志物，也是干细胞向内皮细胞分化的检测金标准。
分化23天的细胞的荧光检测结果如表8：
表8流式细胞仪分选百分比
结果表明，当干细胞分化23天后，实施例1～3的一部分细胞在形态上出现包含较多脂滴的形态。此外，在第23天时如果在实施例1～3与对照组(未分化)的培养体系中均加入5μM浓度的维生素A，24小时后，对照组细胞漂浮死亡，而实施例1～3分化细胞不死且发出蓝色的自发荧光，提示实施例1～3分化细胞具有将维生素A转化为视黄醇储存的功能(图3示实施例3分化细胞的分化星状细胞储存维生素A之后的自发荧光，实施例1～2的细胞发光情况与此相似)。但对比例1～4在分化23天后，细胞存活情况不及实施例，且荧光也显著低于实施例1～3，经统计学分析，对比例1～4的细胞维生素A自然发光情况皆显著低于对比例1～4，p<0.01。
并且，结果表明，当干细胞分化23天后，实施例1～3分化的细胞能够在细胞质表达大量的VE-cadherin阳性信号，说明该部分细胞已经成功被分化为内皮细胞。(图4示实施例3分化细胞孵育VE-Cadherin后的免疫荧光，实施例1～2的荧光情况与此相似)。但对比例1～4在分化23天后，荧光情况显著低于实施例1～3，经统计学分析，对比例1～4的细胞免疫荧光情况皆显著低于对比例1～4，p<0.01。
3、流式细胞分选
为了将测定脂肪间充质干细胞同时分化成星状细胞和肝内皮细胞的效率，以及将两种细胞类型分离，我们分别利用星状细胞自发紫色荧光或者VE-cadherin标记后的绿色荧光(采用绿色荧光二抗)，使用流式细胞仪进行分选。结果表明，没有分化时，干细胞能够表达自发紫色荧光的比例为0.2％，经过23天分化后，有大约9.6％的细胞能表达自发荧光，说明这部分细胞应为人类肝星状细胞类似的细胞。而对于VE-cadherin阳性细胞而言，未分化时仅有0.5％的细胞有阳性信号，23天分化后，有大约14.3％的细胞成为人类肝内皮细胞类似的细胞。
4、关键基因定量PCR的测试
在经过流式细胞仪筛选富集的星状细胞群落中进行了定量PCR的测试，确定星状细胞关键基因(PPARg、ALCAM、CRBP1、TIMP1、LOX)的表达水平，其中，PPARg(peroxisomeproliferator-activated receptor gamma)，即过氧化物酶体增殖物激活受体gamma，是核激素受体家族中的配体激活受体家族的一种。文献报道，PPARg的激活会抑制星状细胞的激活，所以在干细胞向星状细胞分化时，PPARg的表达应该被抑制；ALCAM(activatedleukocyte cell adhesion molecule)，即激活性白细胞黏附分子，又称CD166，是免疫球蛋白超家族成员之一。已有文献报道胚胎发育时，ALCAM阳性的细胞拥有向星状细胞分化的潜力(19085956)；CRBP1(cellular retinol-binding protein-1)，即细胞视黄醇结合蛋白1，是血液中维生素的转运蛋白，由肝脏合成、广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。已有文献报道，CRBP1和vinculin(黏着斑蛋白)是人类星状细胞激活时较好的标记物；TIMP1(tissue inhibitor of metallopeptidase-1)，即基质金属蛋白酶抑制因子-1，是表达于组织中常见的一种糖蛋白。TIMP家族蛋白的主要功能是抑制和调节基质金属蛋白酶，共同维护细胞外基质稳态。一般认为，肝内TIMP-1的主要来源是星状细胞和Kupffer细胞，所以TIMP-1可以作为星状细胞分化和激活的分子标志物之一；LOX(lysyl oxidase)，即赖氨酰氧化酶，是一种铜依赖性单胺氧化酶。文献发现其早期激活阶段会发生LOX的大量表达，使得LOX成为鉴定星状细胞的重要标志性分子之一。检测结果如表9：
表9相对定量PCR结果(以未分化组为100％)
注，同行不同肩标字母示存在显著性差异，p<0.05。
结果表明，相对于未分化细胞，实施例1～3分化获得的星状细胞中，这5种关键基因都发生了极其显著的变化。而与实施例1～3相比，对比例1～4分化获得的细胞中，这5中关键基因的变化程度显著低于实施例1～3，p<0.05。
在富集的内皮细胞中也检测了三种关键基因(VCAM-1、MRC-1和CD31b)的表达变化情况。VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)，即血管内皮细胞粘附分子1，是细胞黏附因子的一种，介导淋巴细胞、单核粒细胞、中性粒细胞等免疫细胞向血管内皮移动和黏附的过程。一直以来，VCAM-1均被认为是内皮细胞最为特异和重要的指示基因之一；MRC-1(mannose receptor C1)，即甘露糖受体C1，属于C型凝集素超家族成员，可通过胞外区识别和结合特定的糖类分子，在识别病原体、递呈抗原和保持内环境稳定中发挥作用。已有报道指出，MRC-1在肝内皮细胞激活过程中会发生显著表达上调，可以作为其指示基因；CD-31b(cluster of differentiation 31b)，又叫PECAM(platelet endothelial cell adhesionmolecule-1，血小板内皮细胞黏附分子-1)，是身体内移除衰老中性粒细胞的关键分子。其一直以来都被认为是内皮细胞的重要指标之一。检测结果如表10：
表10相对定量PCR结果(以未分化组为100％)
注，同行不同肩标字母示存在显著性差异，p<0.05。
我们发现，相对于未分化细胞，实施例1～3分化获得的内皮细胞中，这3种关键基因均有显著高表达，。而与实施例1～3相比，对比例1～4分化获得的内皮细胞中，这3中关键基因的表达水平显著低于实施例1～3，p<0.05。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.诱导脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的方法，其特征在于，包括：
第0天～第6天，脂肪间充质干细胞以培养基A培养；
第7天～第10天，以培养基B培养；
第11天～第14天，以培养基C培养；
第15天～第28天，以培养基D培养；
所述培养基A包括：基础培养基和Wnt3a蛋白20ng/mL～80ng/mL、Activin A蛋白50ng/mL～100ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL～200μL/mL；
所述培养基B包括：基础培养基和bFGF蛋白2.5ng/mL～10ng/mL、BMP4蛋白10ng/mL～50ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL；
所述培养基C包括：基础培养基和aFGF蛋白10ng/mL～50ng/mL、FGF4蛋白2.5ng/mL～10ng/mL、FGF8b蛋白10ng/mL～40ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL；
所述培养基D包括：基础培养基和HGF蛋白5ng/mL～20ng/mL、Follistatin蛋白25ng/mL～75ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
第0天～第2天，所述的培养基A中FBS的浓度为200μL/mL；
第3天～第6天，所述的培养基A中FBS的浓度为50μL/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的条件为：37℃，5％CO2，每天更换60v％的新鲜培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的容器不以matrigel包被。
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