CN115354028B - 一种中脑多巴胺细胞群、其制造方法以及用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种中脑多巴胺细胞群、其制造方法以及用途。具体地,本申请提供了一种使用基于抗体的细胞分选法来生产中脑多巴胺细胞群的方法,其中,所生产的中脑多巴胺细胞群中表达TH的细胞的占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上,所生产的中脑多巴胺细胞群中表达EN1的细胞的占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上。
Description
技术领域
本申请涉及生物疗法领域,具体涉及一种中脑多巴胺细胞群、其制造方法以及用途。
背景技术
帕金森病是一种常见的中老年神经系统退行性疾病,主要以中脑多巴胺能神经元进行性死亡为主要病理改变。已有研究证明,向脑内移植胎儿来源或多能干细胞分化来源的多巴胺神经细胞可以改善患者疾病症状。然而,这2种来源的细胞中存在多种类型细胞,只有一部分是真正的中脑多巴胺能神经元,杂质细胞可能对患者造成多种副作用。如五羟色胺神经元会造成异动症、神经干细胞会过度增殖造成脑区被压迫等问题。
发明内容
基于上述现有技术中的问题,本申请要解决的问题是定义了一类中脑多巴胺能神经细胞群,有确定的体外分化中脑多巴胺能神经细胞的命运,该细胞群可以通过特定的表面标志物进行纯化,以解决现有细胞移植物不纯的问题。
本申请提供了:
在一个具体实施方式中,提供了一种使用基于抗体的细胞分选法来生产中脑多巴胺细胞群的方法,其中,所生产的中脑多巴胺细胞群中表达TH的细胞的占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上,和/或所生产的中脑多巴胺细胞群中表达EN1的细胞的占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上。在又一具体实施方式中,所生产的脑多巴胺细胞群中表达EN1的细胞也表达LMX1A。
在再一具体实施方式中,所述细胞分选法为流式细胞分选法(FACS)或磁珠分选法(MACS)。
在一个具体实施方式中,所述基于抗体的细胞分选法中使用的抗体是能够靶向下组中任一个膜蛋白的抗体中的一个或多个:CD99、VSTM2L、NRCAM、SLC16A3、CNTN6、MAP1B、LRP2、KIF21A、FLRT2、RGS2、CNRIP1、NOS1AP、SEMA3D、SLC40A1、FXYD1、CFC1、INHA、KNSTRN、KCNIP1、NAALAD2、CRYAB、RAB3C、UBE2B、B2M、LYPD3、CTTN、PLP2、ITGA6、RGS14、NOX1、STX8、TMED1、TDG、SERINC1、DLGAP2、PPM1A、ARL17A、RALGPS2、VAMP5、MAGI2、SLITRK3、MLC1、CDH18、CLIC5、KCNJ16、MAP7、UBL3、SNCA、CD1D、PLD1、SLC24A2、NPTN、WNK2、GDE1、PMP22、DAAM1、ARL4C、FNDC5、CORO1C、RTN3、NCS1、YWHAH、MAPT、ARL8A、NSG1、SYT5、PODXL2、STXBP1、PLPPR3、UBE2QL1。
在又一具体实施方式中,所述基于抗体的细胞分选法所使用的抗体是能够靶向下组中任一个膜蛋白的抗体的一个或多个:NRCAM、MAP1B、RGS2、CNRIP1、CFC1、CD99、VSTM2L、SLC16A3、INHA、NAALAD2、RAB3C、PMP22、DAAM1、CNTN6、LRP2、KCNF1、PLP2、MLC1、CDH18、CNRIP1、CLIC5、NOS1AP、SEMA3D、SLC40A1、CRYAB、LYPD3、CTTN、PLD1、ARL4C、CORO1C、PODXL2、PLPPR3。
在一个具体实施方式中提供了上述方法,其还包括:
在对人多能干细胞进行分化培养得到中脑多巴胺前体神经细胞后使用基于抗体的细胞分选法来生产中脑多巴胺细胞群。
在又一具体实施方式中提供了上述方法,其中,
使用基于抗体的细胞分选法来生产中脑多巴胺细胞群的步骤包括:
对分化培养得到中脑多巴胺能神经细胞进行消化;
向所述消化后的细胞中加入所述靶向膜蛋白的抗体;
向所述消化后的细胞中加入对所述靶向膜蛋白的抗体具有亲和力且连接有荧光标记的抗体;
对加入所述靶向膜蛋白的抗体和所述荧光标记的抗体的细胞进行清洗并通过流式细胞分选装置来进行分选得到所述中脑多巴胺细胞群。
在一个具体实施方式中提供了一种中脑多巴胺细胞群,其中,所生产的中脑多巴胺细胞群中表达TH的细胞的占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上,且所生产的中脑多巴胺细胞群中表达EN1的细胞的占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上。
在又一具体实施方式提供了一种中脑多巴胺细胞群,其中,所生产的脑多巴胺细胞群中表达EN1的细胞也表达LMX1A。
在再一具体实施方式中,所生产的中脑多巴胺细胞群中表达下述膜蛋白的任一项的细胞的占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上:CD99、VSTM2L、NRCAM、SLC16A3、CNTN6、MAP1B、LRP2、KIF21A、FLRT2、RGS2、CNRIP1、NOS1AP、SEMA3D、SLC40A1、FXYD1、CFC1、INHA、KNSTRN、KCNIP1、NAALAD2、CRYAB、RAB3C、UBE2B、B2M、LYPD3、CTTN、PLP2、ITGA6、RGS14、NOX1、STX8、TMED1、TDG、SERINC1、DLGAP2、PPM1A、ARL17A、RALGPS2、VAMP5、MAGI2、SLITRK3、MLC1、CDH18、CLIC5、KCNJ16、MAP7、UBL3、SNCA、CD1D、PLD1、SLC24A2、NPTN、WNK2、GDE1、PMP22、DAAM1、ARL4C、FNDC5、CORO1C、RTN3、NCS1、YWHAH、MAPT、ARL8A、NSG1、SYT5、PODXL2、STXBP1、PLPPR3、UBE2QL1。
在又一具体实施方式中,所生产的中脑多巴胺细胞群中表达下述膜蛋白的任一项的细胞的占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上:NRCAM、MAP1B、RGS2、CNRIP1、CFC1、CD99、VSTM2L、SLC16A3、INHA、NAALAD2、RAB3C、PMP22、DAAM1、CNTN6、LRP2、KCNF1、PLP2、MLC1、CDH18、CNRIP1、CLIC5、NOS1AP、SEMA3D、SLC40A1、CRYAB、LYPD3、CTTN、PLD1、ARL4C、CORO1C、PODXL2、PLPPR3。
在一个具体实施方式中提供了上述中脑多巴胺细胞群,其中,所述中脑多巴胺细胞群是利用上文所述的方法制备的。
在一个具体实施方式中提供了一种细胞制剂,其包含上文所述的中脑多巴胺细胞群或上文所述的方法生产的中脑多巴胺细胞群以及药学上可接受的助剂。
在又一具体实施方式中提供了根据上文所述的中脑多巴胺细胞群或根据上文所述的细胞制剂在制备用于治疗与多巴胺系统调节障碍相关疾病的药物中的用途。
在一个具体实施方式中,所述与多巴胺系统调节障碍相关疾病选自下组:与酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺脱羧酶(AADC)、多巴胺转运体(DAT)、囊泡单胺转运体2(VMAT2)、COMT、DRD1、DRD2和DRD3相关的基因突变疾病;帕金森病;精神分裂症;Tourette综合症;注意力缺陷多动综合症;抑郁症。在又一具体实施方式中,所述与多巴胺系统调节障碍相关疾病为帕金森病。
本申请取得的有益技术效果
有益技术效果包括:1 使用本申请的基于抗体的细胞纯化方法得到了TH和EN1阳性表达的高纯度细胞,该方法操作过程简便,成本较低,所获得的细胞产品中任何一种目标细胞标志物的阳性表达率都不低于50%;2.根据本申请的方法获得的高纯度细胞在脑部移植实验中取得了良好的医学效果和较小的治疗副作用。
附图说明
图1 为对多能干细胞分化的多巴胺神经前体细胞的流式鉴定,EN1比例约31%。
图2 为对多能干细胞分化的多巴胺神经前体细胞的免疫荧光鉴定,TH比例约15%。
图3 为多巴胺神经前体细胞经NRCAM抗体富集后的流式鉴定图。利用该抗体进行染色分选可以富集到EN1阳性细胞。
图4 为将抗体分选后的细胞贴壁培养进行免疫荧光染色鉴定,结果显示TH+细胞的比例能够达到71.5%,大大提高了细胞的纯度。
图5 为对多能干细胞分化的多巴胺神经前体细胞的MAP1B抗体染色流式鉴定,MAP1B+比例35.95%。
图6 为多巴胺神经前体细胞经MAP1B抗体富集后的免疫荧光染色鉴定图。利用该抗体进行染色分选可以富集到EN1+细胞90.5%,LMX1A+细胞95.8%。
图7 为将MAP1B抗体分选后的细胞贴壁培养进行免疫荧光鉴定,结果显示TH+细胞的比例能够达到80%,大大提高了细胞的纯度。
图8 为对多能干细胞分化的多巴胺神经前体细胞的流式鉴定,DAAM1+的比例约13.28%。
图9 为将DAAM1抗体分选后的细胞贴壁培养进行免疫荧光鉴定,结果显示TH+细胞的比例能够达到90%,大大提高了细胞的纯度。
图10 为对多能干细胞分化的多巴胺神经前体细胞的流式鉴定,CD99+的比例约27.3%。
图11 为将CD99抗体分选后的细胞贴壁培养进行免疫荧光鉴定,结果显示TH+细胞的比例能够达到90%,大大提高了细胞的纯度。
图12显示了经过CD99抗体分选后得到的细胞在治疗帕金森病中的作用;结果表明,与对照组相比,细胞注射可以明显降低小鼠的旋转次数,并与野生型小鼠接近,说明分选后的细胞可以改善帕金森病动物模型的行为能力。
图13为CD99抗体分选后的细胞进一步培养的结果,此结果显示了通过免疫荧光染色检测的成熟细胞标志物。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本申请的具体实施例。虽然附图中显示了本申请的具体实施例,然而应当理解,可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反,提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是,在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解,技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式,而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语,故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式,然所述描述乃以说明书的一般原则为目的,并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如本文所用,就特定组分而言“基本上不含”在本文中用于表示特定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此,由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量低于0.05%,优选低于0.01%。最优选的是其中特定组分的量用标准分析方法检测不到的组合物。
如在本说明书中所使用的,“一”或“一个”可以表示一个或多个。如权利要求中所使用的,当与单词“包含”一起使用时,单词“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。
在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”,除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的,尽管本公开内容支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。如本文所用,“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
贯穿本申请,术语“约”用于指示值包括装置的误差的固有变化,该方法用于测定该值或存在于研究对象之间的变化。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的,不应成为对本申请生物材料来源的限制。事实上,所用到的生物材料的来源是广泛的,任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本申请在第一方面提供了一种制造中脑细胞群的方法。
在一个具体实施方式中,提供了一种使用基于抗体的细胞分选法生产中脑多巴胺细胞群的方法,其中,所生产的中脑多巴胺细胞群中表达TH的细胞的占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上,和/或所生产的中脑多巴胺细胞群中表达EN1的细胞的占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上。
在本申请的上下文中,所生产的中脑多巴胺细胞群中表达TH的细胞占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上也可以标识为50%以上的细胞为TH阳性;所生产的中脑多巴胺细胞群中表达EN1的细胞占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上也可以标识为50%以上的细胞为EN1阳性。
例如,所生产的中脑多巴胺细胞群的表面标志物特征总体可以表现为:“50%以上的细胞为EN1阳性”、“60%以上的细胞为EN1阳性”、“70%以上的细胞为EN1阳性”、“80%以上的细胞为EN1阳性”、“90%以上的细胞为EN1阳性”、“50%以上的细胞为TH阳性”、“60%以上的细胞为TH阳性”、“70%以上的细胞为TH阳性”、“80%以上的细胞为TH阳性”、“90%以上的细胞为TH阳性”、“90%以上的细胞为EN1阳性且50%以上的细胞为TH阳性”、“80%以上的细胞为EN1阳性且50%以上的细胞为TH阳性”、“70%以上的细胞为EN1阳性且50%以上的细胞为TH阳性”、“60%以上的细胞为EN1阳性且50%以上的细胞为TH阳性”、“50%以上的细胞为EN1阳性且50%以上的细胞为TH阳性”、“50%以上的细胞为EN1阳性且90%以上的细胞为TH阳性”、“50%以上的细胞为EN1阳性且80%以上的细胞为TH阳性”、“50%以上的细胞为EN1阳性且70%以上的细胞为TH阳性”、“50%以上的细胞为EN1阳性且60%以上的细胞为TH阳性”、“60%以上的细胞为EN1阳性且60%以上的细胞为TH阳性”、“70%以上的细胞为EN1阳性且70%以上的细胞为TH阳性”、“80%以上的细胞为EN1阳性且80%以上的细胞为TH阳性”或“90%以上的细胞为EN1阳性且90%以上的细胞为TH阳性”。
在本说明书的上下文中,“基于抗体的细胞分选法”包括流式细胞分选法和磁珠分选法。其中,“流式细胞分选法”的英文简称是“FACS”,该方法是利用流式细胞分选装置对高速直线运动的荧光标记单个细胞进行准确分选的技术。FACS可以基于荧光色素标记细胞,通过光学系统检测并接收细胞标记荧光信号的强弱,再利用细胞分选系统将相应荧光素的目的细胞分离,从而达到从混合细胞群中分选特定细胞的目的。其中,“磁珠分选法”的英文简称为“MACS”,它是将针对细胞表面抗原分子的特异抗体与磁性微珠直接或间接偶联,再与细胞样本作用,形成含有免疫磁珠-抗体-表面抗原-细胞的复合体,在外加磁场中,与免疫磁珠相结合的细胞被吸附于磁场中,使这些细胞与其他不能结合磁珠微球的细胞分离,从而达到分选细胞的技术目的。相比两种具体使用的技术,FACS分选细胞虽然特异、高效,但是FACS仪器成本高,分选时需要大量细胞样本,而MACS是为小样本、低成本实验研究而开发的细胞分选技术。
在又一具体实施方式中,所生产的EN1阳性表达的中脑多巴胺细胞群同时为LMX1A阳性表达。
例如,所生产的中脑多巴胺细胞群的表面标志物特征总体可以表现为:
“90%以上的细胞为EN1阳性且50%以上的细胞为LMX1A阳性”、“80%以上的细胞为EN1阳性且50%以上的细胞为LMX1A阳性”、“70%以上的细胞为EN1阳性且50%以上的细胞为LMX1A阳性”、“60%以上的细胞为EN1阳性且50%以上的细胞为LMX1A阳性”、“50%以上的细胞为EN1阳性且50%以上的细胞为LMX1A阳性”、“50%以上的细胞为EN1阳性且90%以上的细胞为LMX1A阳性”、“50%以上的细胞为EN1阳性且80%以上的细胞为LMX1A阳性”、“50%以上的细胞为EN1阳性且70%以上的细胞为LMX1A阳性”、“50%以上的细胞为EN1阳性且60%以上的细胞为LMX1A阳性”、“60%以上的细胞为EN1阳性且60%以上的细胞为LMX1A阳性”、“70%以上的细胞为EN1阳性且70%以上的细胞为LMX1A阳性”、“80%以上的细胞为EN1阳性且80%以上的细胞为LMX1A阳性”、或“90%以上的细胞为EN1阳性且90%以上的细胞为LMX1A阳性”;且所生产的中脑多巴胺细胞群在具有上述细胞标志物表现特征的同时具有“至少50%以上的细胞为TH阳性”的特征。
在本说明书的上下文中,“TH”、“EN1”和“LMX1A”为细胞表面的标志物的名称,关于它们的背景信息也可见于文献“Transcriptome analysis reveals transmembranetargets on transplantable midbrain dopamine progenitors, C R.Bye, et al.,2015”。在本申请中鉴定了在细胞群中特定表面标志物是否为阳性;作为示例,EN1的阳性比例通过FACS的流式鉴定结果得出;作为示例,TH的阳性比例通过免疫荧光染色鉴定结果得出;作为示例,LMX1A的阳性及其比例是通过免疫荧光染色鉴定结果得出。
在一个具体实施方式中,所述基于抗体的细胞分选法所使用的抗体是选自下组基因表达的膜蛋白中一个或多个的抗体:CD99、VSTM2L、NRCAM、SLC16A3、CNTN6、MAP1B、LRP2、KIF21A、FLRT2、RGS2、CNRIP1、NOS1AP、SEMA3D、SLC40A1、FXYD1、CFC1、INHA、KNSTRN、KCNIP1、NAALAD2、CRYAB、RAB3C、UBE2B、B2M、LYPD3、CTTN、PLP2、ITGA6、RGS14、NOX1、STX8、TMED1、TDG、SERINC1、DLGAP2、PPM1A、ARL17A、RALGPS2、VAMP5、MAGI2、SLITRK3、MLC1、CDH18、CLIC5、KCNJ16、MAP7、UBL3、SNCA、CD1D、PLD1、SLC24A2、NPTN、WNK2、GDE1、PMP22、DAAM1、ARL4C、FNDC5、CORO1C、RTN3、NCS1、YWHAH、MAPT、ARL8A、NSG1、SYT5、PODXL2、STXBP1、PLPPR3、UBE2QL1。
在本申请中对于抗体的来源没有特别限定,只要是靶向上述膜蛋白中一个或多个的抗体即可,该抗体可以是购买的,也可以是基于生物工程生产或构建的,只要其靶向有上述膜蛋白即可。当这些抗体获取自商业渠道时,例如可以从R&D、Millipore、BD、abcam、BioLegend等公司购买。
在又一具体实施方式中,所述基于抗体的细胞分选法所使用的抗体是选自下组基因表达的膜蛋白中一个或多个的抗体:NRCAM、MAP1B、RGS2、CNRIP1、CFC1、CD99、VSTM2L、SLC16A3、INHA、NAALAD2、RAB3C、PMP22、DAAM1、CNTN6、LRP2、KCNF1、PLP2、MLC1、CDH18、CNRIP1、CLIC5、NOS1AP、SEMA3D、SLC40A1、CRYAB、LYPD3、CTTN、PLD1、ARL4C、CORO1C、PODXL2、PLPPR3。
在本说明书的上下文中,筛选“TH”、“EN1”和“LMX1A”阳性细胞群所使用的抗体所靶向的膜蛋白是使用生物信息学方法并辅助以实验验证最终确定的;具体地,所使用的筛选膜蛋白的方法的背景信息也可见于文献“Transcriptome analysis revealstransmembrane targets on transplantable midbrain dopamine progenitors, CR.Bye, et al., 2015”。在筛选膜蛋白后使用靶向它们的抗体进行了细胞分选的实验验证,出乎预料地发现,靶向本申请的表2以及表3的膜蛋白的抗体具有良好的用于细胞分选的技术效果。本申请所使用的靶向膜蛋白的抗体通过商业渠道购买自下述公司:R&D、Millipore、BD、abcam、BioLegend。
在一个具体实施方式中,在对人多能干细胞进行分化培养得到中脑多巴胺前体神经细胞后使用基于抗体的细胞分选法来生产中脑多巴胺细胞群。
在本说明书的上下文中,“中脑多巴胺前体神经细胞”是指使用本领域已知的方法对人多能干细胞进行诱导分化培养得到的经分化细胞,其尚未经历针对特定细胞标志物的富集/纯化。在本说明书的上下文中,“中脑多巴胺细胞群”是指使用本申请请求保护的基于抗体的细胞分选法使“中脑多巴胺前体神经细胞”经历针对特定细胞标志物的富集/纯化得到的具有特定制药用途的经分选的细胞群。人多能干细胞的建立方法可以见于文献Accreditation of Biosafe Clinical-Grade Human Embryonic Stem Cells Accordingto Chinese Regulations,2017,Stem Cell Reports。
在申请的技术方案中,首先对“人多能干细胞”进行分化培养得到“中脑多巴胺前体神经细胞”;该步骤可以分为细胞消化(优选使用TrypLE或accutase细消化液)、细胞计数(优选在台盼蓝溶液中混匀并计数)、接种至细胞分化培养基(优选以2×104/cm2的密度接种于含8-20μM Rock抑制剂(如Y-27632)的多巴胺神经前体细胞分化培养基1)、培养箱培养(优选使用37℃,5%CO2培养条件)。
然后,对由上面的方法所得到的“中脑多巴胺前体神经细胞”使用本申请请求保护的基于抗体的细胞分选法使之经历针对特定细胞标志物的富集/纯化过程得到“经分选的中脑多巴胺细胞群”,此处的“基于抗体的细胞分选法”可以参考常用的流式细胞分选流程,具体地包括细胞消化(有优选使用TrypLE进行消化)、对消化后的细胞加入本申请请求保护的靶向膜蛋白的抗体(优选使用含Y27632的PBS溶液稀释该抗体,37℃孵育30min,孵育期间每隔5 min 吹打混匀一次)、对经历了上一步骤的细胞悬液加入对靶向膜蛋白的抗体有亲和力且连接有荧光标记的抗体(优选将所得的细胞悬液室温1200rpm离心3min,吸弃多余的靶向上述膜蛋白的抗体;用PBS清洗2次后,加入含Y27632的PBS溶液稀释的对靶向膜蛋白的抗体有亲和力且连接有荧光标记的抗体,37℃避光孵育20-60min,孵育期间每隔5min 吹打混匀一次)、细胞清洗(优选将上述细胞悬液室温1200rpm离心3min,吸弃多余的对靶向膜蛋白的抗体有亲和力且连接有荧光标记的抗体;用PBS清洗2次后,加适量体积的含Y27632的PBS重悬,制成107/mL的细胞悬液,400目/70 μm细胞筛过滤)、流式上机。
最后,将“经分选的中脑多巴胺细胞群”进一步培养,获得“适合于特定制药用途的中脑多巴胺细胞群”;该方法包括细胞重悬(优选将经抗体分选后的细胞室温1200rpm离心3min,吸弃上清;加入含Y27632的细胞培养基重悬,取10μL细胞悬液检测细胞密度及活率)、继续培养(优选根据细胞密度检测结果,按照3×106/cm2的密度接种到培养板中继续培养)。
本申请的方法包括:对中脑多巴胺前体神经细胞进行基于抗体的细胞分选。可选地,本申请的方法包括:先将人多能干细胞分化培养得到中脑多巴胺前体神经细胞,再对中脑多巴胺前体神经细胞进行基于抗体的细胞分选。可选地,本申请的方法包括:先将人多能干细胞分化培养得到中脑多巴胺前体神经细胞,再对中脑多巴胺前体神经细胞进行基于抗体的细胞分选,继而将经分选的中脑多巴胺细胞群进一步培养,获得适合于特定制药用途的中脑多巴胺细胞群。
在一个具体实施方式中,所述基于抗体的细胞分选法是流式细胞分选法(FACS)或磁珠分选法(MACS),其中使用FACS生产中脑多巴胺细胞群的步骤包括:
对分化培养得到中脑多巴胺能神经细胞进行消化;
向所述消化后的细胞中加入所述靶向膜蛋白的抗体;
向所述消化后的细胞中加入对所述靶向膜蛋白的抗体具有亲和力且连接有荧光标记的抗体;
对加入所述靶向膜蛋白的抗体和所述荧光标记的抗体的细胞进行清洗并通过流式细胞分选装置来进行分选。
在又一具体实施方式中,对使用基于抗体的细胞分选法来生产中脑多巴胺细胞群进一步培养,而后可以使用免疫荧光染色法鉴定细胞标志物。
本申请在第二方面提供了一种中脑多巴胺细胞群。
在一个具体实施方式中提供了一种中脑多巴胺细胞群,其中,所述细胞群中TH和EN1阳性表达的细胞在50%以上。在又一具体实施方式中,所述中脑多巴胺细胞群同时也为LMX1A阳性表达。
在一个具体实施方式中,所生产的中脑多巴胺细胞群中表达下述膜蛋白的任一项的细胞的占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上:CD99、VSTM2L、NRCAM、SLC16A3、CNTN6、MAP1B、LRP2、KIF21A、FLRT2、RGS2、CNRIP1、NOS1AP、SEMA3D、SLC40A1、FXYD1、CFC1、INHA、KNSTRN、KCNIP1、NAALAD2、CRYAB、RAB3C、UBE2B、B2M、LYPD3、CTTN、PLP2、ITGA6、RGS14、NOX1、STX8、TMED1、TDG、SERINC1、DLGAP2、PPM1A、ARL17A、RALGPS2、VAMP5、MAGI2、SLITRK3、MLC1、CDH18、CLIC5、KCNJ16、MAP7、UBL3、SNCA、CD1D、PLD1、SLC24A2、NPTN、WNK2、GDE1、PMP22、DAAM1、ARL4C、FNDC5、CORO1C、RTN3、NCS1、YWHAH、MAPT、ARL8A、NSG1、SYT5、PODXL2、STXBP1、PLPPR3、UBE2QL1;优选所述表达比例在55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上或更高。
在又一具体实施方式中,所生产的中脑多巴胺细胞群中表达下述膜蛋白的任一项的细胞的占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上:NRCAM、MAP1B、RGS2、CNRIP1、CFC1、CD99、VSTM2L、SLC16A3、INHA、NAALAD2、RAB3C、PMP22、DAAM1、CNTN6、LRP2、KCNF1、PLP2、MLC1、CDH18、CNRIP1、CLIC5、NOS1AP、SEMA3D、SLC40A1、CRYAB、LYPD3、CTTN、PLD1、ARL4C、CORO1C、PODXL2、PLPPR3;优选所述表达比例在55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上或更高。
在一个具体实施方式中,所述中脑多巴胺细胞群是利用前述的方法制备而得。
本申请在第三方面提供了一种细胞制剂。
在一个具体实施方式中提供了一种细胞制剂,其包含前述的中脑多巴胺细胞群以及药学上可接受的助剂。
本申请在第四方面提供了上述细胞制剂的制药用途。
在一个具体实施方式中提供了细胞制剂在制备用于治疗与多巴胺系统调节障碍相关疾病的药物中的用途。
在又一具体实施方式中,所述与多巴胺系统调节障碍相关疾病选自下组:帕金森病;与酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺脱羧酶(AADC)、多巴胺转运体(DAT)、囊泡单胺转运体2(VMAT2)、COMT、DRD1、DRD2和DRD3相关的基因突变疾病;精神分裂症;Tourette综合症;注意力缺陷多动综合症;抑郁症;包括去甲肾上腺素缺乏、脑老化、心力衰竭的可以通过补充多巴胺而改善的疾病。
在本说明书的上下文中,“帕金森病”是中老年常见的一种以运动迟缓、肌强直、静止性震颤为主要表现的神经系统退行性疾病;其经常在中老年起病,研究认为该病的发病机制是中脑黑质中的细胞发生变性、死亡后,不能合成足够的多巴胺。在治疗方面,其原理通常是基于解决多巴胺不足的状况,尤以左旋多巴替代疗法为主要手段;本申请的发明人出乎预料地发现,“TH”、“EN1”和“LMX1A”阳性表达的中脑多巴胺细胞群对于帕金森症具有良好的植入后治疗效果。在又一具体实施方式中,所述与多巴胺系统调节障碍相关疾病为帕金森病。
实施例部分
实验步骤1 物料的准备
1培养基的配制
1. 多能干细胞向中脑多巴胺神经前体细胞的分化实验:
(1)各因子的制备及使用浓度:
1)LDN193189(Stemgent)溶液
工作浓度为50-500 nM。4℃可保存两周。
2)SB431542(R&D)溶液的制备
工作浓度为5-50 μM。4℃可保存两周。
3)SAG(R&D)溶液的制备
工作浓度为0.5-10μM。4℃可保存两周。
4)SHH(Sonic hedgehog)溶液制备
工作浓度为50-500ng/mL。4℃可保存两周。
5)CHIR99021(Stemgent)溶液制备
工作浓度为0.1-5 μM。一次性使用。
(2)基础培养基N2 medium配制:
49% CTS™KnockOut™ DMEM/F-12(Gibco) + 49% CTS™ Neurobasal (Gibco)+1% CTS™ N2 Supplement(Gibco) + 1% CTS- GlutaMAX™-I(Gibco)
(3)多巴胺神经前体细胞分化培养基1:
N2 medium+LDN193189 (100 nM) + SB431542 (10 μM) + SHH (100 ng/mL) +SAG (2 μM) + CHIR99021 (0.5-1.0 μM);
2. 中脑多巴胺神经前体细胞的分化成熟实验:
(1)各因子的配制及使用:
1)FGF8(R&D)溶液制备
工作浓度为80-120 ng/mL。4℃可保存两周。
2)TGFβ3(R&D)溶液制备
工作浓度为0.5-1.5ng/mL。4℃可保存两周。
3)Ascorbic acid(AA,Sigma)溶液制备
工作浓度为0.1-0.5mM。4℃可保存两周。
4)Dibutyryl cAMP(db-cAMP,Sigma)溶液的制备
工作浓度为0.13-0.7mM。4℃可保存两周。
5)BDNF(Peprotech)溶液制备
工作浓度为15-25ng/mL。4℃可保存两周。
6)GDNF(Peprotech)溶液制备
工作浓度为15-25ng/mL。4℃可保存两周。
(2)基础培养基B27medium配制:
97% CTS™ Neurobasal + 2% B27-CTS™(Gibco) + 1% CTS- GlutaMAX™-I
(3)多巴胺神经元成熟培养基2:
B27 medium+BDNF (20 ng/mL) + GDNF (20 ng/mL) + TGF-β3 (1 ng/mL) + AA(0.2 mM) + FGF8 (100 ng/mL),混匀后按比例加入,反复吹打;
(4)多巴胺神经元成熟培养基3:
B27 medium + BDNF (20 ng/mL) + GDNF (20 ng/mL) + TGF-β3 (1 ng/mL) +AA (0.2 mM) + db-cAMP (500 µM) + DAPT (10 µM),混匀后按比例加入,反复吹打混匀。
实验步骤2 人多能干细胞向中脑多巴胺能神经细胞的分化实验过程
1). 人多能干细胞向多巴胺神经前体细胞分化方法:
(1)Vitronectin(Gibco)基质的配制:室温下,吸取5-10mL DPBS加入至15 mL离心管中,然后吸取50-80μL Vitronectin加入至上述DPBS中,移液枪吹打10次混匀,得到Vitronectin基质,现用现配。六孔板每孔加入1mL配好的基质,室温孵育1-2h备用。
(2)将人多能干细胞(本实验室建立,具体方法和信息见本实验室文章:Accreditation of Biosafe Clinical-Grade Human Embryonic Stem Cells Accordingto Chinese Regulations,2017,Stem Cell Reports)用TrypLE(Gibco)或accutase(Gibco)消化成单细胞,取10 μL上述悬液加入到8-15μL台盼蓝溶液中混匀,细胞计数;然后吸弃Vitronectin基质,将用TrypLE或accutase消化的单细胞,以2×104/cm2的密度接种于含8-20μM Rock抑制剂(如Y-27632)的多巴胺神经前体细胞分化培养基1中,放入37℃,5%CO2培养箱培养。分化培养基中含有BMP抑制剂和TGF抑制剂,Wnt和SHH激活剂,若干天后可获得分化的多巴胺神经前体细胞。
2).多巴胺前体细胞分化为成熟多巴胺神经元的实验方法:
(1)Vitronectin基质的配制:室温下,吸取5-10mL DPBS加入至15 mL离心管中,然后吸取60 μL Vitronectin加入至上述DPBS中,移液枪吹打10次混匀,得到Vitronectin基质,现用现配。六孔板每孔加入1mL配好的基质,室温孵育1-2h备用。
(2)将前述分化的多巴胺神经前体细胞用TrypLE或accutase消化成单细胞,按照接种密度5×105/cm2接种于含Rock抑制剂(如Y-27632)的多巴胺神经元成熟培养基2中,混匀后放入37℃,5%CO2培养箱中培养。
(3)用多巴胺神经元成熟培养基2培养5-8天后,更换为多巴胺神经元成熟培养基3培养8天以上。
实验步骤3 筛选细胞分选术所使用的抗体
在进行实施例之前,基于单细胞转录组测序和生物信息学分析方法根据目标标志物EN1和TH筛选出了用于细胞分选的抗体所靶向的膜蛋白。关于所使用的方法的背景信息也可见于文献“Transcriptome analysis reveals transmembrane targets ontransplantable midbrain dopamine progenitors, C R.Bye, et al., 2015”。筛选出的膜蛋白的名称可见于表1;进一步地,针对表1中的膜蛋白,申请人的实验室分别从下述公司购买了能够靶向它们的抗体: R&D、Millipore、BD、abcam、BioLegend。
表1 通过生物信息学方法筛选出了下述可用于细胞分选的特定膜蛋白。
实验步骤4-1 基于抗体的流式细胞分选实验过程
a)细胞消化:将需要流式分选的细胞弃掉培养上清,PBS清洗一遍后,每孔加入1mLtryple消化5-8min,分散成单细胞后收集至离心管中,1200rpm室温离心3min。
b)对消化后的细胞加入靶向上述膜蛋白的抗体:吸弃培养上清,加入含Y27632的PBS溶液稀释该抗体,37℃孵育30min,孵育期间每隔5 min 吹打混匀一次;
c)对经历了b)步骤的细胞悬液加入对靶向膜蛋白的抗体有亲和力且连接有荧光标记的抗体:将上述细胞悬液室温1200rpm离心3min,吸弃多余的靶向上述膜蛋白的抗体;用PBS清洗2次后,加入含Y27632的PBS溶液稀释的对靶向膜蛋白的抗体有亲和力且连接有荧光标记的抗体,37℃避光孵育20-60min,孵育期间每隔5min 吹打混匀一次;
d)细胞清洗:将上述细胞悬液室温1200rpm离心3min,吸弃多余的对靶向膜蛋白的抗体有亲和力且连接有荧光标记的抗体;用PBS清洗2次后,加适量体积的含Y27632的PBS重悬,制成107/mL的细胞悬液,400目/70 μm细胞筛过滤,等待上机;
e)流式上机:以对照组为参照建立分选门对需分选的细胞进行分选。
实验步骤4-2 基于EN1抗体的流式细胞分析实验过程
a)细胞消化:将需要分析的细胞悬液用PBS清洗一遍后,用4%PFA室温下固定15-30min,然后用PBS洗3次。用含2%BSA和0.2-0.5%Triton的混合溶液重悬,室温处理2 h。
b)细胞离心后吸弃上清,PBS溶液重悬,加入靶向EN1蛋白的抗体,37℃孵育30min,孵育期间每隔5 min 吹打混匀一次;
c)对经历了b)步骤的细胞悬液加入对靶向EN1蛋白的抗体有亲和力且连接有荧光标记的抗体:将上述细胞悬液室温1200rpm离心3min,吸弃上清;用PBS清洗2次后,加入PBS溶液稀释的对EN1蛋白的抗体有亲和力且连接有荧光标记的抗体,37℃避光孵育20-60min,孵育期间每隔5min 吹打混匀一次;
d)细胞清洗:将上述细胞悬液室温1200rpm离心3min,吸弃上清;用PBS清洗2次后,加适量体积的PBS重悬,制成107/mL的细胞悬液,400目/70 μm细胞筛过滤,等待上机;
e)流式上机:以对照组为参照建立分选门对需分析的细胞进行分析。
实验步骤5 流式抗体分选后细胞的培养实验过程
a)细胞重悬:将实验步骤4经抗体分选后的细胞室温1200rpm离心3min,吸弃上清;加入含Y27632的细胞培养基重悬,取10μL细胞悬液检测细胞密度及活率;
b)根据细胞密度检测结果,按照3×106/cm2的密度接种到培养板中继续培养。
实施步骤6免疫荧光染色的实验过程
a)细胞接种:将洁净无菌的圆形盖玻片放在24孔细胞培养皿底部中央,vitronectin包被20-40min后接种细胞;
b)细胞固定:待细胞生长到合适密度,弃掉培养液,PBS清洗一遍后,用4%PFA室温下固定细胞15-30 min,然后用PBS洗3次。
c)封闭:每孔加入2%BSA和0.2-0.5%Triton的混合溶液320µL,室温封闭2 h。
d)对消化后的细胞加入靶向TH的抗体:用1-3%BSA和0.2-0.5%Triton的混合溶液稀释靶向TH的抗体,吹打混匀,弃去封闭液,加入靶向TH的 抗体的稀释液,每孔加入320µL靶向TH的 抗体稀释液,封口膜封口后,4℃过夜。
e)对经历了d)步骤的细胞悬液加入对靶向TH的抗体有亲和力且连接有荧光标记的抗体:吸弃多余的靶向TH的抗体后,用PBS洗2次;每孔加入320µL的2%BSA和0.3%Triton混合溶液稀释的靶向TH的抗体有亲和力且连接有荧光标记的抗体,避光室温放置2h。
f)染核:弃去多余的靶向TH的抗体有亲和力且连接有荧光标记的抗体,用PBS洗2次;每孔加入300-400µL的 Hoechst33342稀释液(1mL PBS中加1 uL Hoechst33342),孵育细胞15 min。
g)封片:吸弃Hoechst33342稀释液,用PBS洗1次;然后将每张载玻片加10 µL防淬灭剂,用注射器针头配合弯头镊子小心夹取长有细胞的玻璃片,将细胞面向下盖于加有防猝灭剂的载玻片上,避免产生气泡;最后用无色指甲油小心地在盖玻片边缘轻点固定玻片,晾5 min后放入玻片盒中。
实施例1 使用NRCAM抗体进行细胞分选的实验
多能干细胞分化的多巴胺神经前体细胞经流式(具体参见上述实验步骤4-1和4-2)和免疫荧光染色(具体参见上述实验步骤6)鉴定,其中EN1比例约31%(图1),TH比例约15%(图2)(图1和图2的结果显示了通过基于抗体的分选法对细胞进行富集前的细胞群的标志物百分比)。细胞经NRCAM抗体(实验步骤3得到的抗体之一)染色后进行流式分选(具体实验步骤参见实验步骤4),基于经流式方法富集的细胞群EN1阳性比例90%以上(图3),分选后经五天再培养(参见实验步骤5)即细胞贴壁培养后进行免疫荧光染色,TH比例70%以上(图4),图3和图4的结果显示了通过基于抗体的分选法对细胞进行富集后的细胞群的标志物百分比,该结果证明分选出来的细胞高比例表达EN1和TH;本申请的方法可以用于中脑多巴胺神经细胞纯化。
实施例2 使用MAP1B抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用MAP1B抗体进行流式鉴定发现,MAP1B+细胞比例能够达到35.95%。将抗体分选得到的MAP1B+细胞进行免疫荧光鉴定发现,与未分选组相比,MAP1B+细胞中EN1+的比例能够达到90%以上,而且EN1+细胞均表达LMX1A(在图6中可见)。将分选获得的MAP1B+细胞继续培养成熟,TH阳性细胞的比例能够达到80%以上。具体结果也见图5-图7。
实施例3 使用DAAM1抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用DAAM1抗体进行流式鉴定发现,DAAM1+细胞比例约13%。将抗体分选得到的DAAM1+细胞进行免疫荧光鉴定发现,DAAM1+细胞中TH+的比例能够达到90%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见图8和图9。
实施例4-1使用CD99抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用CD99抗体染色,经流式检测发现,CD99+细胞比例约27%。将抗体分选得到的CD99细胞进行免疫荧光鉴定发现,CD99细胞中TH+的比例能够达到90%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见图10和图11。
实施例4-2 使用CD99抗体分选得到的细胞可以体外分化成熟
将CD99抗体分选得到的CD99阴性细胞用“多巴胺神经元成熟培养基3”进行培养约30天后,通过免疫荧光染色检测成熟神经元标志物MAP2和多巴胺能神经元TH的表达。结果表明,90%以上TH阳性细胞也表达MAP2,说明分选后的细胞可以进一步分化成熟。本实施例的结果在图13中示出。
实施例5 使用RGS2 抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用RGS2抗体染色,经流式检测发现,RGS2+细胞比例约25%。将抗体分选得到的RGS2细胞进行免疫荧光鉴定发现,RGS2细胞中EN1+的比例能够达到80%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例6 使用CNRIP1抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用CNRIP1抗体染色,经流式检测发现,CNRIP1+细胞比例约26%。将抗体分选得到的CNRIP1细胞进行免疫荧光鉴定发现,CNRIP1细胞中EN1+的比例能够达到80%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例7 使用CFC1抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用CFC1抗体染色,经流式检测发现,CFC1+细胞比例约28%。将抗体分选得到的CFC1细胞进行免疫荧光鉴定发现,CFC1细胞中EN1+的比例能够达到80%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例8 使用VSTM2L抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用VSTM2L抗体染色,经流式检测发现,VSTM2L+细胞比例约26%。将抗体分选得到的VSTM2L细胞进行免疫荧光鉴定发现,VSTM2L细胞中EN1+的比例能够达到85%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例9 使用SLC16A3抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用SLC16A3抗体染色,经流式检测发现,SLC16A3+细胞比例约25%。将抗体分选得到的SLC16A3细胞进行免疫荧光鉴定发现,SLC16A3细胞中EN1+的比例能够达到82%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例10 使用INHA抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用INHA抗体染色,经流式检测发现,INHA+细胞比例约25%。将抗体分选得到的INHA细胞进行免疫荧光鉴定发现,INHA细胞中EN1+的比例能够达到70%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例11 使用NAALAD2抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用NAALAD2抗体染色,经流式检测发现,NAALAD2+细胞比例约23%。将抗体分选得到的NAALAD2细胞进行免疫荧光鉴定发现,NAALAD2细胞中EN1+的比例能够达到70%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例12 使用RAB3C抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用RAB3C抗体染色,经流式检测发现,RAB3C+细胞比例约23%。将抗体分选得到的RAB3C细胞进行免疫荧光鉴定发现,RAB3C细胞中EN1+的比例能够达到70%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例13 使用PMP22抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用PMP22抗体染色,经流式检测发现,PMP22+细胞比例约26%。将抗体分选得到的PMP22细胞进行免疫荧光鉴定发现,PMP22细胞中EN1+的比例能够达到70%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例14 使用CNTN6抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用CNTN6抗体染色,经流式检测发现,CNTN6+细胞比例约24%。将抗体分选得到的CNTN6细胞进行免疫荧光鉴定发现,CNTN6细胞中EN1+的比例能够达到76%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例15 使用LRP2抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用LRP2抗体染色,经流式检测发现,LRP2+细胞比例约24%。将抗体分选得到的LRP2细胞进行免疫荧光鉴定发现,CD99细胞中EN1+的比例能够达到73%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例16 使用KCNF1抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用KCNF1抗体染色,经流式检测发现,KCNF1+细胞比例约23%。将抗体分选得到的KCNF1细胞进行免疫荧光鉴定发现,KCNF1细胞中EN1+的比例能够达到65%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例17 使用PLP2抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用PLP2抗体染色,经流式检测发现,PLP2+细胞比例约24%。将抗体分选得到的PLP2细胞进行免疫荧光鉴定发现,PLP2细胞中EN1+的比例能够达到73%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例18 使用MLC1抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用MLC1抗体染色,经流式检测发现,MLC1+细胞比例约26%。将抗体分选得到的MLC1细胞进行免疫荧光鉴定发现,MLC1细胞中EN1+的比例能够达到62%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例19 使用CDH18抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用CDH18抗体染色,经流式检测发现,CDH18+细胞比例约23%。将抗体分选得到的CDH18细胞进行免疫荧光鉴定发现,CDH18细胞中EN1+的比例能够达到77%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例20 使用CNRIP1抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用CNRIP1抗体染色,经流式检测发现,CNRIP1+细胞比例约25%。将抗体分选得到的CNRIP1细胞进行免疫荧光鉴定发现,CNRIP1细胞中EN1+的比例能够达到68%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例21使用CLIC5抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用CLIC5抗体染色,经流式检测发现,CLIC5+细胞比例约28%。将抗体分选得到的CLIC5细胞进行免疫荧光鉴定发现,CLIC5细胞中EN1+的比例能够达到72%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例22 使用NOS1AP抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用NOS1AP抗体染色,经流式检测发现,NOS1AP+细胞比例约26%。将抗体分选得到的NOS1AP细胞进行免疫荧光鉴定发现,NOS1AP细胞中EN1+的比例能够达到65%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例23 使用SEMA3D抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用SEMA3D抗体染色,经流式检测发现,SEMA3D+细胞比例约25%。将抗体分选得到的SEMA3D细胞进行免疫荧光鉴定发现,SEMA3D细胞中EN1+的比例能够达到66%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例24 使用SLC40A1抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用SLC40A1抗体染色,经流式检测发现,SLC40A1+细胞比例约25%。将抗体分选得到的SLC40A1细胞进行免疫荧光鉴定发现,SLC40A1细胞中EN1+的比例能够达到61%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例25 使用CRYAB抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用CRYAB抗体染色,经流式检测发现,CRYAB+细胞比例约29%。将抗体分选得到的CRYAB细胞进行免疫荧光鉴定发现,CRYAB细胞中EN1+的比例能够达到76%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例26 使用LYPD3抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用LYPD3抗体染色,经流式检测发现,LYPD3+细胞比例约29%。将抗体分选得到的LYPD3细胞进行免疫荧光鉴定发现,LYPD3细胞中EN1+的比例能够达到68%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例27 使用CTTN抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用CTTN抗体染色,经流式检测发现,CTTN+细胞比例约26%。将抗体分选得到的CTTN细胞进行免疫荧光鉴定发现,CTTN细胞中EN1+的比例能够达到62%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例28 使用PLD1抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用PLD1抗体染色,经流式检测发现,PLD1+细胞比例约28%。将抗体分选得到的PLD1细胞进行免疫荧光鉴定发现,PLD1细胞中EN1+的比例能够达到70%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例29 使用ARL4C抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用ARL4C抗体染色,经流式检测发现,ARL4C+细胞比例约29%。将抗体分选得到的ARL4C细胞进行免疫荧光鉴定发现,ARL4C细胞中TH+的比例能够达到88%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例30 使用CORO1C抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用CORO1C抗体染色,经流式检测发现,CORO1C+细胞比例约28%。将抗体分选得到的CORO1C细胞进行免疫荧光鉴定发现,CORO1C细胞中TH+的比例能够达到90%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例31 使用PODXL2抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用PODXL2抗体染色,经流式检测发现,PODXL2+细胞比例约27%。将抗体分选得到的PODXL2细胞进行免疫荧光鉴定发现,PODXL2细胞中TH+的比例能够达到86%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
实施例32 使用PLPPR3抗体进行细胞分选的实验
对分化的多巴胺神经前体细胞使用PLPPR3抗体染色,经流式检测发现,PLPPR3+细胞比例约29%。将抗体分选得到的PLPPR3细胞进行免疫荧光鉴定发现,PLPPR3细胞中TH+的比例能够达到81%以上,证明该抗体可以富集多巴胺神经细胞。具体结果也见表2。
总共使用了32种抗体进行了流式细胞分选,分选后经五天再培养测定EN1和TH表达为阳性的细胞百分比(阳性率均高于50%):
表2 依照实施例1-3的实验过程,总共使用32种抗体进行细胞分选实验的结果(分选后经过5天再培养)。
表3 对表1中提及的蛋白都进行了分选-富集试验,并于本表总结了对EN1阳性细胞富集效果更佳的膜蛋白和对TH阳性细胞富集效果更佳的膜蛋白,此总结可与表2互相吻合。
实验例1 使用CD99抗体分选得到的细胞的帕金森症治疗效果
本实验例使用的细胞由实施例4得到,为了验证分选后的CD99细胞在治疗帕金森病中的作用,我们用6-OHDA(6-羟多巴胺)注射的方法制备了小鼠帕金森病模型,随后注射细胞,同时注射生理盐水作为对照。5个月后进行阿扑吗啡诱导的旋转试验检测行为能力,结果表明,与对照组相比,细胞注射可以明显降低小鼠的旋转次数,并与野生型小鼠接近,说明分选后的细胞可以改善帕金森病动物模型的行为能力。具体结果见图12。造模方法、细胞移植和行为学检测方法参照文献Xiong et al., Human Stem Cell-Derived NeuronsRepair Circuits and Restore Neural Function. 2021, Cell Stem Cell 28, 1–15。
尽管以上结合附图对本申请的实施方案进行了描述,但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域,上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的,而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下,还可以做出很多种的形式,这些均属于本申请保护之列。
Claims (6)
1.一种使用基于抗体的细胞分选法来生产中脑多巴胺细胞群的方法,其中,所生产的中脑多巴胺细胞群中表达TH的细胞占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上且所生产的中脑多巴胺细胞群中表达EN1的细胞占全部中脑多巴胺细胞群的比例在70%以上,或所生产的中脑多巴胺细胞群中表达TH的细胞占全部中脑多巴胺细胞群的比例在70%以上且所生产的中脑多巴胺细胞群中表达EN1的细胞占全部中脑多巴胺细胞群的比例在50%以上;所述中脑多巴胺细胞群为中脑多巴胺前体神经细胞;
其中,所述基于抗体的细胞分选法所使用的抗体是能够靶向下组中任一个膜蛋白的抗体的一个或多个:NRCAM、MAP1B、CD99,所述膜蛋白是根据目标标志物EN1和TH筛选出的用于细胞分选的抗体所靶向的膜蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,所生产的中脑多巴胺细胞群中表达TH的细胞占全部中脑多巴胺细胞群的比例在90%以上且所生产的中脑多巴胺细胞群中表达EN1的细胞占全部中脑多巴胺细胞群的比例在80%以上,且所述表达TH的细胞也表达MAP2;所述中脑多巴胺细胞群为中脑多巴胺前体神经细胞;其中,所述基于抗体的细胞分选法所使用的抗体是能够靶向CD99膜蛋白的抗体,所述膜蛋白是根据目标标志物EN1和TH筛选出的用于细胞分选的抗体所靶向的膜蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所生产的脑多巴胺细胞群中表达EN1的细胞也表达LMX1A。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述细胞分选法为流式细胞分选法(FACS)或磁珠分选法(MACS)。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其还包括:
在对人多能干细胞进行分化培养得到中脑多巴胺前体神经细胞后使用基于抗体的细胞分选法来生产中脑多巴胺细胞群。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,
使用基于抗体的细胞分选法来生产中脑多巴胺细胞群的步骤包括:
对分化培养得到中脑多巴胺能神经细胞进行消化;
向所述消化后的细胞中加入所述靶向膜蛋白的抗体;
向所述消化后的细胞中加入对所述靶向膜蛋白的抗体具有亲和力且连接有荧光标记的抗体;
对加入所述靶向膜蛋白的抗体和所述荧光标记的抗体的细胞进行清洗并通过流式细胞分选装置来进行分选得到所述中脑多巴胺细胞群。
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