CN109082411B - 一种通过多能干细胞分化获得具有吞噬功能的巨噬细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，提供了一种通过多能干细胞分化获得具有吞噬功能的巨噬细胞的方法。该细胞诱导培养基可以实现拟胚体细胞快速、大量地诱导分化成巨噬细胞。其中，前六种培养基包括无血清培养基，利用无血清培养基可以提供细胞各个阶段生长、增殖和分化所用的基础营养物质，又避免引入外源性物质，降低污染风险。第七培养基中含有血清，同时额外添加了FBS，可以很好的维持巨噬细胞的生长。每种培养基中又各自含有多种细胞因子能够促进细胞的定向分化。本发明提供的细胞诱导培养方法，简单高效、成本低、短周期内可大量扩增得到高质量高纯度的巨噬细胞，对于临床治疗和研究具有重要的意义。

Description

一种通过多能干细胞分化获得具有吞噬功能的巨噬细胞的 方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种通过多能干细胞分化获得具有吞噬功能的巨噬细胞的方法。
背景技术
巨噬细胞是机体重要的免疫细胞之一，在大部分组织和器官中都有分布，在非特异性免疫中清除细菌、病毒、真菌病原体和特异性免疫应答中起抗原提呈和产生相应细胞因子的作用。且巨噬细胞是一种多分化来源的细胞，单核细胞、CD34+造血干细胞、早期的T淋巴细胞等在一定条件下都可以分化为巨噬细胞。
目前，体外实验所用人类巨噬细胞主要有两种来源途径，一种是肿瘤来源的细胞系，如U937和THP-1等细胞系；另一种是原代细胞如外周血单核细胞来源的巨噬细胞。前者来源的巨噬细胞具有无限复制的潜能，在巨噬细胞相关生物学研究中发挥了重要的作用，但同原代巨噬细胞相比，这些永生化的细胞系容易发生非正常的遗传结构改变，导致功能的缺失，严重限制了其在相关研究中的应用。而来源于外周血的巨噬细胞能够代表组织巨噬细胞，但是因其不能自我更新，每次研究需要从供者体内采取大量血液，且因供者的生理状态和基因等的不同，导致试验结果不具代表性。
诱导性多能干细胞(iPS)在体外能够诱导分化为巨噬细胞。iPS分化而来的巨噬细胞对于建立基因特异的iPS驱动终末分化、正常核型以及同供体保持基因一致性方面提供了有力的替代系统。特别是研究人类疾病基因位点的巨噬细胞特异性功能以及体内平衡、疾病状态和治疗转化中人巨噬细胞生物学新机制提供了潜在的工具。iPS技术的出现不仅避免了干细胞研究在伦理道德上的限制，还由于来源丰富、获取相对容易及能获得个体特异性的iPS等优点，受到广泛的关注，并得到迅速的发展。但iPS向免疫细胞，尤其是巨噬细胞分化的机制尚不明确，且诱导的效率较低，因此，开发出一种iPS可以高效，稳定，大量的获得巨噬细胞的诱导方法具有重要意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一组细胞诱导培养基，本发明的第二目的在于提供一种细胞诱导培养方法，本发明的第三目的在于提供上述细胞诱导培养基或细胞诱导培养方法在诱导性多能干细胞或拟胚体诱导分化成巨噬细胞中的应用，本发明的第四目的在于提供一种包含上述细胞诱导培养基的用于诱导性多能干细胞或拟胚体诱导分化成巨噬细胞的试剂盒，以缓解现有技术中巨噬细胞来源少，细胞数量低或者品质无法保证，iPS诱导分化方法不成熟的技术问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供一组细胞诱导培养基，所述细胞诱导培养基包括：第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基和第七培养基；
所述第一培养基包括第一基础培养基和第一细胞因子；
所述第二培养基包括第一基础培养基和第二细胞因子；
所述第三培养基包括第一基础培养基和第三细胞因子；
所述第四培养基包括第二基础培养基和第三细胞因子；
所述第五培养基包括第二基础培养基和第四细胞因子；
所述第六培养基包括第二基础培养基和第五细胞因子；
所述第七培养基包括第三基础培养基、第六细胞因子和FBS；
其中，所述第一基础培养基和第二基础培养基为无血清培养基；
所述第三基础培养基为含血清培养基；
所述第一细胞因子包括BMP4和bFGF；
所述第二细胞因子包括BMP4，bFGF，VEGF和SCF；
所述第三细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF；
所述第四细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF；
所述第五细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，M-CSF和GM-CSF；
所述第六细胞因子包括M-CSF和GM-CSF。
进一步地，第一基础培养基为STEMdiffTMAPELTM2或mTeSR1；
和/或，第二基础培养基为StemProTM-34；
和/或，第三基础培养基为RPMI-1640。
进一步地，所述第一培养基中，所述BMP4和bFGF的终浓度依次为8-12ng/ml和3-7ng/ml；
和/或，所述第二培养基中，所述BMP4，bFGF，VEGF和SCF的终浓度依次为8-12ng/ml、3-7ng/ml、48-52ng/ml和95-105ng/ml；
和/或，所述第三培养基中，所述bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、23-27ng/ml、48-52ng/ml和48-52ng/ml；
和/或，所述第五培养基中，所述bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、23-27ng/ml、95-105ng/ml和95-105ng/ml；
和/或，所述第六培养基中，所述bFGF，VEGF，SCF，IGF1，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、95-105ng/ml和95-105ng/ml；
和/或，所述第七培养基中，所述FBS，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为质量分数8-12％、95-105ng/ml和95-105ng/ml；
优选地，所述第七培养基中，所述FBS经过灭活处理。
本发明提供一种细胞诱导培养方法，应用上述细胞诱导培养基，包括以下步骤：将细胞放置在第一培养基中进行第一阶段培养，然后在第二阶段、第三阶段、第四阶段、第五阶段、第六阶段和第七阶段依次用第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基和第七培养基进行培养；
所述第一阶段为接种后0-1天，所述第二阶段为接种后2-7天，所述第三阶段为接种后8-10天，第四阶段为接种后10-20天，第五阶段为接种后20-22天，第六阶段为接种后22-28天，第七阶段为接种后第29天。
进一步地，所述第二阶段培养时需要每隔一天更换新的第二培养基；
优选地，所述第三阶段培养时需要每隔一天更换新的第三培养基；
优选地，所述第五阶段进行培养的细胞为所述第四阶段培养后得到的悬浮细胞。
进一步地，所述第四阶段、第五阶段、第六阶段和第七阶段进行培养时均需要提供基质胶；
优选地，所述基质胶包括Matrigel或Laminin-521。
进一步地，所述细胞为拟胚体；
优选地，所述细胞经过细胞诱导培养方法培养得到巨噬细胞。
进一步地，所述拟胚体由诱导性多能干细胞得到；
优选地，诱导性多能干细胞中加入细胞消化液Accutase并在36-38℃条件下孵育10-14h得到拟胚体；
优选地，诱导性多能干细胞经Rock激酶抑制剂Y27632处理后再加入细胞消化液Accutase并在36-38℃条件下孵育10-14h得到拟胚体。
本发明又提供上述细胞诱导培养基或细胞诱导培养方法在诱导性多能干细胞或拟胚体诱导分化成巨噬细胞中的应用。
本发明最后提供一种包括上述细胞诱导培养基的用于诱导性多能干细胞或拟胚体诱导分化成巨噬细胞的试剂盒。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一组细胞诱导培养基，包括七种培养基。该细胞诱导培养基可以实现拟胚体细胞快速、大量地诱导分化成巨噬细胞。其中，前六种培养基包括无血清培养基，利用无血清培养基可以提供细胞各个阶段生长、增殖和分化所用的基础营养物质，又避免引入外源性物质，降低污染风险。第七培养基中含有血清，同时额外添加了FBS，可以很好的维持巨噬细胞的生长。每种培养基中又各自含有多种细胞因子能够促进细胞的定向分化，最终得到大量的性能稳定高质量的巨噬细胞。本发明提供的细胞诱导培养方法，简单高效、成本低、短周期内可大量扩增得到高质量高纯度的巨噬细胞，对于临床治疗和研究具有重要的意义。本发明提供的试剂盒，包括上述细胞诱导培养基，该试剂盒可以简便快速得到大量的巨噬细胞，为临床治疗和学术研究提供了条件。
附图说明
图1为本发明实施例2中拟胚体(EB)诱导分化成巨噬细胞的流程示意图；
图2A为本发明实施例3中第0天的iPS细胞的流式细胞技术检测结果图；
图2B为本发明实施例3中第2天的中胚层细胞的流式细胞技术检测结果图；
图2C为本发明实施例3中第7天的造血细胞的流式细胞技术检测结果图；
图2D为本发明实施例3中第17天的髓系细胞的流式细胞技术检测结果图；
图2E为本发明实施例3中第28天的成熟巨噬细胞的流式细胞技术检测结果图；
图3A为本发明实施例4中第14天的髓系细胞中标志物CD45流式细胞技术检测结果图；
图3B为本发明实施例4中第14天的髓系细胞中标志物CD34流式细胞技术检测结果图；
图3C为本发明实施例4中第14天的髓系细胞中标志物CD11b流式细胞技术检测结果图；
图3D为本发明实施例4中第14天的髓系细胞中标志物CD14流式细胞技术检测结果图；
图3E为本发明实施例4中第45天的成熟巨噬细胞中标志物CD11b流式细胞技术检测结果图；
图3F为本发明实施例4中第45天的成熟巨噬细胞中标志物CD14流式细胞技术检测结果图；
图3G为本发明实施例4中第45天的成熟巨噬细胞中标志物CD163流式细胞技术检测结果图；
图3H为本发明实施例4中第45天的成熟巨噬细胞中标志物CD86流式细胞技术检测结果图；
图4A为本发明实施例5中第28天的巨噬细胞吞噬经荧光标记的大肠杆菌过程示意图；
图4B为本发明实施例5中第28天的巨噬细胞吞噬大肠杆菌结果图；
图4C为本发明实施例5中第28天的巨噬细胞吞噬低密度脂蛋白结果图；
图4D为本发明实施例5中第28天的巨噬细胞吞噬A-β结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明提供一组细胞诱导培养基，包括：第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基和第七培养基；
第一培养基包括第一基础培养基和第一细胞因子；
第二培养基包括第一基础培养基和第二细胞因子；
第三培养基包括第一基础培养基和第三细胞因子；
第四培养基包括第二基础培养基和第三细胞因子；
第五培养基包括第二基础培养基和第四细胞因子；
第六培养基包括第二基础培养基和第五细胞因子；
第七培养基包括第三基础培养基、第六细胞因子和FBS；
其中，第一基础培养基和第二基础培养基为无血清培养基；
第三基础培养基为含血清培养基；
第一细胞因子包括BMP4和bFGF；
第二细胞因子包括BMP4，bFGF，VEGF和SCF；
第三细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF；
第四细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF；
所述第五细胞因子包括bFGF，VEGF，SCF，IGF1，M-CSF和GM-CSF；
第六细胞因子包括M-CSF和GM-CSF。
该细胞诱导培养基可以实现拟胚体细胞快速、大量地诱导分化成巨噬细胞。其中，前六种培养基包括无血清培养基，利用无血清培养基可以提供细胞各个阶段生长、增殖和分化所用的基础营养物质，又避免引入外源性物质，降低污染风险。第七培养基中含有血清，同时额外添加了FBS，可以很好的维持巨噬细胞的生长。每种培养基中又各自含有多种细胞因子能够促进细胞的定向分化，最终得到大量的性能稳定高质量的巨噬细胞。
BMP4(bone morphogenetic protein 4，骨形态发生蛋白4)属于TGF-β超家族，最初因其能诱导骨和软骨的形成而得名，对骨骼的胚胎发育和再生修复起重要作用，调节细胞的增殖、分化和凋亡的等生物学过程，在胚胎发育、出生后各组织器官内环境稳定及多种肿瘤的发生中都有重要作用。
bFGF为碱性成纤维细胞生在因子，是细胞形态发生和分化的诱导因子，可诱导多种细胞的增殖和分化。
VEGF(vascular endothelial growth factor，血管内皮生长因子)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。
SCF(Stem cell factor，干细胞因子)是由骨髓微环境中的基质细胞产生的一种酸性糖蛋白。
IGF1为类胰岛素生长因子(insulin-like growth factors)中的一种，促进细胞生长和分化，对于糖、脂、蛋白质代谢和无机盐代谢必不可少。
IL-3(Interleukin-3，白细胞介素-3)是趋化因子家族的一种细胞因子.调节造血与免疫。
在进行造血细胞的体外研究中。发现一些细胞因子可刺激不同的造血干细胞在半固体培养基中形成细胞集落。这类因子被命名为集落刺激因子(CSF)。集落刺激因子是一组功能很强的骨髓造血细胞增殖因子。巨噬细胞CSF(M-CSF)刺激巨噬细胞集落、刺激粒细胞功能，降低血胆固醇；粒细胞和巨噬细胞CSF(GM-CSF)刺激粒细胞，巨噬细胞集落形成，刺激粒细胞功能。
FBS为胎牛血清，是一种性状、外观浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。FBS中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，含有丰富的细胞生长必须的营养成份。
在本发明一个优选地实施方式中，第一基础培养基为STEMdiffTM APELTM2或mTeSR1。
在本发明一个优选地实施方式中，第二基础培养基为StemProTM-34。
在本发明一个优选地实施方式中，第三基础培养基为RPMI-1640。
在本发明一个优选地实施方式中，第一培养基中，BMP4和bFGF的终浓度依次为8-12ng/ml和3-7ng/ml。BMP4浓度典型但非限制性的为8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml或12ng/ml；bFGF浓度典型但非限制性的为3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml或7ng/ml。
在本发明一个优选地实施方式中，第二培养基中，BMP4，bFGF，VEGF和SCF的终浓度依次为8-12ng/ml、3-7ng/ml、48-52ng/ml和95-105ng/ml。BMP4浓度典型但非限制性的为8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml或12ng/ml；bFGF浓度典型但非限制性的为3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml或7ng/ml；VEGF浓度典型但非限制性的为48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、51ng/ml、52ng/ml；SCF浓度典型但非限制性的为95ng/ml、97ng/ml、99ng/ml、100ng/ml、102ng/ml、104ng/ml或105ng/ml。
在本发明一个优选地实施方式中，第三培养基中，bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、23-27ng/ml、48-52ng/ml和48-52ng/ml。bFGF浓度典型但非限制性的为8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml或12ng/ml；VEGF浓度典型但非限制性的为48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、51ng/ml、52ng/ml；SCF浓度典型但非限制性的为48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、51ng/ml、52ng/ml；IGF1浓度典型但非限制性的为8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml或12ng/ml；IL-3浓度典型但非限制性的为23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml或27ng/ml；M-CSF浓度典型但非限制性的为48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、51ng/ml、52ng/ml；GM-CSF浓度典型但非限制性的为48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、51ng/ml、52ng/ml。
在本发明一个优选地实施方式中，第五培养基中，bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、23-27ng/ml、95-105ng/ml和95-105ng/ml。bFGF浓度典型但非限制性的为8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml或12ng/ml；VEGF浓度典型但非限制性的为48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、51ng/ml、52ng/ml；SCF浓度典型但非限制性的为48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、51ng/ml、52ng/ml；IGF1浓度典型但非限制性的为8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml或12ng/ml；IL-3浓度典型但非限制性的为23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml或27ng/ml；M-CSF浓度典型但非限制性的为95ng/ml、97ng/ml、99ng/ml、100ng/ml、102ng/ml、104ng/ml或105ng/ml；GM-CSF浓度典型但非限制性的为95ng/ml、97ng/ml、99ng/ml、100ng/ml、102ng/ml、104ng/ml或105ng/ml。
在本发明一个优选地实施方式中，第六培养基中，bFGF，VEGF，SCF，IGF1，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、95-105ng/ml和95-105ng/ml。bFGF浓度典型但非限制性的为8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml或12ng/ml；VEGF浓度典型但非限制性的为48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、51ng/ml、52ng/ml；SCF浓度典型但非限制性的为48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、51ng/ml、52ng/ml；IGF1浓度典型但非限制性的为8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml或12ng/ml；M-CSF浓度典型但非限制性的为95ng/ml、97ng/ml、99ng/ml、100ng/ml、102ng/ml、104ng/ml或105ng/ml；GM-CSF浓度典型但非限制性的为95ng/ml、97ng/ml、99ng/ml、100ng/ml、102ng/ml、104ng/ml或105ng/ml。
在本发明一个优选地实施方式中，第七培养基中，FBS，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为质量分数8-12％、95-105ng/ml和95-105ng/ml。FBS的质量分数典型但非限制性的为8％、9％、10％、11％或12％；M-CSF浓度典型但非限制性的为95ng/ml、97ng/ml、99ng/ml、100ng/ml、102ng/ml、104ng/ml或105ng/ml；GM-CSF浓度典型但非限制性的为95ng/ml、97ng/ml、99ng/ml、100ng/ml、102ng/ml、104ng/ml或105ng/ml。
本发明提供一种细胞诱导培养方法，应用上述的细胞诱导培养基。该方法简单高效、成本低、短周期内可大量扩增得到高质量高纯度的巨噬细胞，对于临床治疗和研究具有重要的意义。
在本发明一个优选地实施方式中，包括以下步骤：将细胞放置在第一培养基中进行第一阶段培养，然后在第二阶段、第三阶段、第四阶段、第五阶段、第六阶段和第七阶段依次用第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基和第七培养基进行培养；其中，第一阶段为接种后0-1天，所述第二阶段为接种后2-7天，所述第三阶段为接种后8-10天，第四阶段为接种后10-20天，第五阶段为接种后20-22天，第六阶段为接种后22-28天，第七阶段为接种后第29天。
需要说明的是，第一阶段得到中胚层细胞，第二阶段得到造血细胞，第三阶段得到髓系细胞，第四阶段得到成熟巨噬细胞。
在本发明一个优选地实施方式中，细胞为拟胚体(Embryo body，EB)。
在本发明一个优选地实施方式中，拟胚体由诱导性多能干细胞得到。
在本发明一个优选地实施方式中，细胞经过细胞诱导培养方法培养得到巨噬细胞。
通过上述的细胞诱导培养方法，先将诱导性多能干细胞培养形成拟胚体，再经过细胞诱导培养基的培养，最后可以得到大量的巨噬细胞。
在本发明一个优选地实施方式中，诱导性多能干细胞形成拟胚体(EB)的过程如下：
预热(15-25℃)足够量的mTeSR1，DMEM/F12和Versene进行细胞传代。在培养基中添加Rock激酶抑制剂Y-27632，使其终浓度为3μM。
a)用1ml不含DPBS洗原孔；
b)吸去DPBS，加入1ml Versene+Y27632；
c)37℃孵育4min；
d)使用带有1000ul吸头的移液器吹打1-2次并移出细胞(通常细胞仍处于较大的团块中会形成更好的EB)；
e)立即将细胞转移到含有DMEM/F12的离心管中以1:5-9的比例稀释Versene；用1ml DMEM/F12洗一次原孔，收集剩余的细胞并转移到试管中，300×g离心5min；
f)mTeSR1+Y27632培养基重悬细胞并将细胞放入超低附板上，分离比为1-2:1(每孔有90％的诱导性多能干细胞)。
在本发明一个优选地实施方式中，第10天接种细胞时，细胞数量为20-25个/ml。
在本发明一个优选地实施方式中，按下列a)-c)中的任意一种方式更换培养基：
a)在管中放置细胞5分钟(管中用DPBS中的0.1％BSA包被)；
b)300rpm旋转3min；
c)用过滤器。
在本发明一个优选地实施方式中，细胞诱导培养过程中，不同类型平板的培养基体积如下表：
平板 6孔板 24孔板 96孔板
底面积(cm<sup>2</sup>) 9.6 1.9 0.32
培养基/孔 2.0mL 0.5mL 150μL
在本发明一个优选地实施方式中，第二阶段培养时需要每隔一天更换新的第二培养基。
在本发明一个优选地实施方式中，第三阶段培养时需要每隔一天更换新的第三培养基。
在本发明一个优选地实施方式中，第五阶段进行培养的细胞为第四阶段培养后得到的悬浮细胞。
在本发明一个优选地实施方式中，第四阶段、第五阶段、第六阶段和第七阶段进行培养时均需要提供基质胶。
在本发明一个优选地实施方式中，基质胶包括Matrigel或Laminin-521。
本发明又提供上述细胞诱导培养基或细胞诱导培养方法在诱导性多能干细胞或拟胚体诱导分化成巨噬细胞中的应用。
本发明最后提供一种包括上述细胞诱导培养基的用于诱导性多能干细胞或拟胚体诱导分化成巨噬细胞的试剂盒。
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1hiPSC诱导形成拟胚体(EB)
hiPSC由人的外周血单核细胞(PBMC)通过现有的诱导重编程的方法得到：一定量的PBMC，电转含重编程基因的episome，待出现克隆后，挑至matrigel的培养板上继续培养，得到重编程的iPS。
预热(15-25℃)足够量的mTeSR1，DMEM/F12和Versene进行细胞传代。在培养基中添加Rock激酶抑制剂Y-27632，使其终浓度为3μM。
a)用1ml DPBS洗原孔；
b)吸去DPBS，加入1ml Versene+Y27632；
c)37℃孵育4min；
d)使用带有1000ul吸头的移液器吹打1-2次并移出细胞(通常细胞仍处于较大的团块中会形成更好的EB)；
e)立即将细胞转移到含有DMEM/F12的离心管中以1:5-9的比例稀释Versene；用1ml DMEM/F12洗一次原孔，收集剩余的细胞并转移到试管中，300×g离心5min；
f)mTeSR1+Y27632培养基重悬细胞并将细胞放入超低附板上，分离比为1-2:1(每孔有90％的诱导性多能干细胞)。
实施例2拟胚体(EB)诱导分化成巨噬细胞
拟胚体(EB)诱导分化成巨噬细胞的流程示意图如图1所示。
步骤a)去除实施例1的f)中拟胚体的mTeSR1培养基，在第1天用第一培养基(STEMdiffTMAPELTM2，10ng/ml BMP4，5ng/mlbFGF)孵育培养24h，拟胚体分化成中胚层细胞；
步骤b)去除步骤a)中的第一培养基，第2-7天开始用第二培养基(STEMdiffTMAPELTM2，10ng/ml BMP4，5ng/ml bFGF，50ng/ml VEGF，100ng/ml SCF)孵育培养中胚层细胞，得到造血细胞，期间每隔一天更换一次新的第二培养基；
步骤c)去除步骤b)中的第二培养基，第8-10天开始用第三培养基(STEMdiffTMAPELTM2，10ng/ml bFGF，50ng/ml VEGF，50ng/ml SCF，10ng/ml IGF1，25ng/mlIL-3，50ng/ml M-CSF，50ng/ml GM-CSF)孵育培养造血细胞，期间每隔一天更换一次新的第三培养基；
步骤d)去除步骤c)中的第三培养基，第11-20天开始，将细胞按照20-25个/ml的浓度接种到预先涂有基质胶Matrigel(1mg/ml)的培养皿中，用第四培养基(StemProTM-34，10ng/ml bFGF，50ng/ml VEGF，50ng/ml SCF，10ng/ml IGF1，25ng/ml IL-3，50ng/ml M-CSF，50ng/ml GM-CSF)孵育培养步骤c)中的细胞，得到髓系细胞；
步骤e)第21-22天开始，收集步骤d)中悬浮的髓系细胞并重新铺板到预先涂有基质胶的培养皿中，用第五培养基(StemProTM-34，10ng/ml bFGF，50ng/ml VEGF，50ng/mlSCF，10ng/ml IGF1，25ng/ml IL-3，100ng/ml M-CSF，100ng/ml GM-CSF)孵育培养，分化得到巨噬细胞；
步骤f)去除步骤e)中的第五培养基，第23-28天用第六培养基(StemProTM-34，10ng/ml bFGF，50ng/ml VEGF，50ng/ml SCF，10ng/ml IGF1，100ng/ml M-CSF，100ng/mlGM-CSF)孵育巨噬细胞；
步骤g)去除步骤f)中的第六培养基，第29天用第七培养基(RPMI-1640，10％w/wFBS，100ng/ml M-CSF，100ng/ml GM-CSF)维持成熟的巨噬细胞或冻存。
通过方法得到大量高质量高纯度的成熟巨噬细胞。
实施例3细胞分化形态检测
显微镜下观察细胞形态并拍照，结果如图2A-图2E所示。
图2A为第0天的iPS细胞，图2B为第2天的中胚层细胞，图2C为第7天的造血细胞，图2D为第17天的髓系细胞，图2E为第28天的成熟巨噬细胞。
从图中可以看出iPS细胞很好的进行了定向分化，得到大量的成熟巨噬细胞。
实施例4流式细胞检测
取第14天和第45天的细胞做流式细胞技术检测相关细胞细胞的标记物。结果如图3A-3H所示，图3A-图3H中，1表示iPS细胞，2表示第14天的髓系细胞，3表示第45天的成熟巨噬细胞。
图3A为第14天的髓系细胞中血细胞的标志物CD45检测结果，图3B为第14天的髓系细胞中造血干细胞的标志物CD34检测结果，图3C为第14天的髓系细胞中巨噬细胞的标志物CD11b检测结果，图3D为第14天的髓系细胞中巨噬细胞的标志物CD14检测结果，图3E为第45天的成熟巨噬细胞中巨噬细胞的标志物CD11b检测结果，图3F为第45天的成熟巨噬细胞中巨噬细胞的标志物CD14检测结果，图3G为第45天的成熟巨噬细胞中巨噬细胞的标志物CD163检测结果，图3H第45天的成熟巨噬细胞中巨噬细胞的标志物CD86检测结果。
结果显示第14天出现巨噬细胞的标志物CD11b和CD14，第45天CD14的表达量上升，另外出现巨噬细胞新的标志物CD86和CD163。
实施例5巨噬细胞吞噬功能检测
在28天分化的巨噬细胞中分别加入荧光标记的大肠杆菌、低密度脂蛋白(LDL-C)或β-淀粉酶(A-β)。结果如图4B-4D所示。
图4A为第28天的巨噬细胞吞噬经荧光标记的大肠杆菌过程示意图，图4B为第28天的巨噬细胞吞噬大肠杆菌结果图，图4C为第28天的巨噬细胞吞噬低密度脂蛋白结果图，图4D为第28天的巨噬细胞吞噬A-β结果图。
从图中可以看出，本发明提供的细胞诱导培养基及细胞诱导培养方法分化得到的巨噬细胞能将大肠杆菌，低密度脂蛋白和A-β吞噬。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (7)

1.一种应用细胞诱导培养基的细胞诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将细胞放置在第一培养基中进行第一阶段培养，然后在第二阶段、第三阶段、第四阶段、第五阶段、第六阶段和第七阶段依次用第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基和第七培养基进行培养；
所述第一阶段为接种后0-1天，所述第二阶段为接种后2-7天，所述第三阶段为接种后8-10天，第四阶段为接种后10-20天，第五阶段为接种后20-22天，第六阶段为接种后22-28天，第七阶段为接种后第29天；
所述第一培养基中，BMP4和bFGF的终浓度依次为8-12ng/ml和3-7ng/ml；
所述第二培养基中，BMP4，bFGF，VEGF和SCF的终浓度依次为8-12ng/ml、3-7ng/ml、48-52ng/ml和95-105ng/ml；
所述第三培养基中，bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、23-27ng/ml、48-52ng/ml和48-52ng/ml；
所述第五培养基中，bFGF，VEGF，SCF，IGF1，IL-3，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、23-27ng/ml、95-105ng/ml和95-105ng/ml；
所述第六培养基中，bFGF，VEGF，SCF，IGF1，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为8-12ng/ml、48-52ng/ml、48-52ng/ml、8-12ng/ml、95-105ng/ml和95-105ng/ml；
所述第七培养基中，FBS，M-CSF和GM-CSF的终浓度依次为质量分数8-12%、95-105ng/ml和95-105ng/ml；
所述第四阶段、第五阶段、第六阶段和第七阶段进行培养时均需要提供基质胶；
所述方法由拟胚体经过细胞诱导培养得到巨噬细胞；
所述拟胚体由诱导性多能干细胞得到；
所述第五阶段进行培养的细胞为所述第四阶段培养后得到的悬浮细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞诱导培养方法，其特征在于，所述第一培养基、第二培养基和第三培养基采用STEMdiff™ APEL™ 2或mTeSR1作为基础培养基；
和/或，所述第四培养基、第五培养基和第六培养基采用StemPro™-34作为基础培养基；
和/或，所述第七培养基采用RPMI-1640作为基础培养基。
3.根据权利要求1所述的细胞诱导培养方法，其特征在于，所述第七培养基中，所述FBS经过灭活处理。
4.根据权利要求1所述的细胞诱导培养方法，其特征在于，所述第二阶段培养时需要每隔一天更换新的第二培养基。
5.根据权利要求1所述的细胞诱导培养方法，其特征在于，所述第三阶段培养时需要每隔一天更换新的第三培养基。
6.根据权利要求1所述的细胞诱导培养方法，其特征在于，所述基质胶包括Matrigel或Laminin-521。
7.权利要求1-6任一项所述的细胞诱导培养方法在诱导性多能干细胞或拟胚体诱导分化成巨噬细胞中的应用。
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