CN113832104B - 一种从hiPS分化巨噬细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从hiPS分化巨噬细胞的方法，该方法包括如下步骤：1)、人诱导多能干细胞(hiPSCs)培养成类胚体EB；2)、类胚体EB诱导分化的途径分化成巨噬细胞；其中初始种植细胞是8000细胞每个EB每孔培养的方式。本发明解决了iPS分化巨噬细胞耗时长，产量低的问题。缩短了巨噬细胞分化时间，提高了分化巨噬细胞的数量；并且不用借助滋养层细胞和分选单核细胞的步骤，简化了分化步骤，也避免了不必要的污染机会，建立临床级的巨噬细胞分化。

Description

一种从hiPS分化巨噬细胞的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种从hiPS(人诱导多能干细胞)分化巨噬细胞的方法。
背景技术
巨噬细胞是造血系统中最具可塑性的细胞类型，在生长发育、内环境稳定、组织修复和免疫等方面发挥着重要作用。此外，巨噬细胞与肿瘤密切相关。巨噬细胞作为免疫细胞，在肿瘤微环境中具有双重作用。肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)促进肿瘤的生长，包括支持肿瘤相关的血管生成，促进肿瘤细胞的侵袭、迁移和血管内浸润。在食管癌、乳腺癌和胰腺癌中，研究人员观察到较晚期的肿瘤通常伴有高密度的TAMs。因此，巨噬细胞是免疫治疗的重要靶点。
近年来，一些研究人员将注意力转向巨噬细胞工程。总的来说，是改善巨噬细胞的吞噬功能和减弱促肿瘤表型。目前，人巨噬细胞的实验模型主要有三种细胞来源:(1)外周血单个核细胞来源的巨噬细胞；(2)人髓样细胞系，如thp-1；(3)人多能干细胞来源的巨噬细胞。但是血液单核细胞的产生需要大量的血液，而肿瘤细胞系的核型异常和表型不成熟。由于巨噬细胞具有终末分化的特征，成体细胞不具有很大的复制潜力，也不易于进行遗传操作。近年来，一些研究小组已经成功地利用多能干细胞制造巨噬细胞。诱导多能干细胞易于操作产生基因编辑的巨噬细胞，或直接分化为正常的巨噬细胞。但目前分化流程需要与基质细胞共培养、分离单核细胞或复杂的反应设备，并且产量受到限制。所以分化巨噬细胞和ips的方法需要进一步优化。
发明内容
发明人在研究中，意外地发现，不同初始种植量影响巨噬细胞的成熟时间和分化数量，但不影响巨噬细胞的吞噬功能，并且可以和外周血巨噬细胞一样诱导极化，进而在此基础上，本发明提供了一种在短期内产生高产量巨噬细胞的分化方案。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种人诱导多能干细胞分化巨噬细胞的方法，包括如下步骤：
1)、人诱导多能干细胞(hiPSCs)培养成类胚体EB；
2)、类胚体EB诱导分化的途径分化成巨噬细胞；其中初始种植细胞是8000细胞每个EB每孔培养的方式。
优选地，所述的步骤1)中采用无饲养层、无血清人多潜能干细胞培养基进行培养，当细胞达到70％-80％密度时传代，传代比例1:6。
优选地，步骤1)中无饲养层、无血清人多潜能干细胞培养基为无饲养层、无血清培养基(cellapy，人多潜能干细胞培养基)。
具体地，步骤1)为：采用无饲养层、无血清培养基(cellapy，人多潜能干细胞培养基)培养hiPSCs，当细胞达到70％-80％密度时传代；弃掉培养基，加入覆盖细胞的0.5mM EDTA，在37℃下消化培养4-5分钟；吸掉EDTA液体，加入培养基，按1:6的比例传代后将平板放入温度为37℃、含有5％二氧化碳的培养箱中。
具体地，所述的步骤2)中包含如下步骤：先用培养液1重悬细胞，将浓度调到100μl含8000细胞的浓度；在未处理的圆底96孔板中部的60个孔中接种细胞100μl，室温离心5min；第3天、第5天更换培养液2，培养至第8天，然后再在培养液3中培养至第 21天，移除EBs，再在培养液4继续培养；
其中培养基1为APEL+10mM Y27632+20ng/mlBMP4和10ng/ml重组人bFGF+ 20ng/mlVEGF+40ng/ml SCF；
其中培养基2为APEL+20ng/mlBMP4和10ng/ml重组人bFGF+20ng/ml VEGF+ 40ng/ml SCF；
其中培养基3为RPMI1640+20％FBS+1％PS+100ng/ml M-CSF+25ng/ml IL-3。
其中培养基4为RPMI1640+20％FBS+1％PS+100ng/ml M-CSF。
本发明还提供了一种免疫细胞制剂，其包括上述方法生产的巨噬细胞或其衍生物。
本发明所具有的有益效果：
本发明解决了iPS分化巨噬细胞耗时长，产量低的问题。缩短了巨噬细胞分化时间，提高了分化巨噬细胞的数量；并且不用借助滋养层细胞和分选单核细胞的步骤，简化了分化步骤，也避免了不必要的污染机会，建立临床级的巨噬细胞分化。
本发明初始种植细胞是8000细胞每个EB每孔培养的方式，可以将CD34+造血干细胞提前在EB的第4天出现，并且8天达到20％左右，进而在第8天进行iL-3刺激分化造血干细胞向单核巨噬细胞定向分化，到第14天可以拿到60％的单核细胞和40％巨噬细胞率，到22天达到90％以上的巨噬细胞率。到第30天每60个EB可以获得2X107的巨噬细胞量。整个过程不需要滋养层，不需要磁珠分选单核细胞。
本发明hiPS分化的巨噬细胞对荧光珠和肿瘤细胞的吞噬能力和外周血巨噬细胞相当；并且极化为M1和M2细胞的比例以及吞噬能力也是和外周血来源的巨噬细胞相当。
附图说明：
图1为两种不同方案对于hiPSCs的巨噬细胞分化效果的影响图；其中图1(a)为iPS细胞分化巨噬细胞的程序示意图，P8000组是初始种植细胞是8000细胞每个EB每孔培养的方式；P3500组是初始种植细胞是3500细胞每个EB每孔培养的方式。图1(b)为在两种巨噬细胞分化方案下，培养阶段EB和细胞在不同时间点的典型明场图像。图1 (c)两种巨噬细胞分化方案在不同培养阶段产生不同类型CD34+、CD45+、CD45+/CD14 +和CD45+/CD11b+细胞的百分比。图1(d)第14天CD34+/CD45+细胞百分率，第 14天CD45+/CD14+、CD45+/CD11b+细胞百分率。*p<0.05，***p<0.001。图1(e) 在两种巨噬细胞分化方案中，第14天、第22天和第30天的总细胞数。*p<0.05，*** p<0.001。图1(f)外周血单核细胞和巨噬细胞的典型wright染色图像，培养第14天，第22天，第30天。
图2为2个不同方案分化来的巨噬细胞在极化、吞噬能力以及细胞因子释放的影响图。图2(a)为来自hiPSCs的M0、M1和M2细胞的代表性明场图像；图2(b)为iPS和外周血分化巨噬细胞极化的M1和M2细胞的表面抗原CD45、CD14、CD11b、CD80(M1)、 cd86(M1)、cd163(M2)、cd206(M2)的流式细胞分析；图2(c)和图2(d)为iPS和外周血分化巨噬细胞以及极化的不同亚型吸收荧光珠的流式细胞术分析；*p<0.05。图2 (e)为流式细胞分析iPS和外周血分化巨噬细胞以及极化的不同亚型在Nalm6(用H33342 标记)和Reh(用H33342标记)上的吞噬作用(巨噬细胞:肿瘤细胞＝1:4)；图2(f)为48h 极化后，在M0、M1和M2细胞上清液中检测il-6、il-10、TNF-a的浓度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的方案做进一步说明，但不限定本发明的保护范围。实施例1(p8000的方案)
一种人诱导多能干细胞分化巨噬细胞的方法，包括如下步骤：
1)、人诱导多能干细胞(hiPSCs)培养：采用无饲养层、无血清培养基(cellapy，人多潜能干细胞培养基)培养hiPSCs，当细胞达到70％-80％密度时传代。弃掉培养基，加入可以覆盖细胞的0.5mM EDTA，在37℃下消化培养4-5分钟。吸掉EDTA液体，加入iPS培养液，按1:6的比例传代后将平板放入温度为37℃、含有 5％二氧化碳的培养箱中。
2)、我们采用EB-离心方案进行造血分化：当hiPSCs长到70％左右密度，弃掉培养液，加入可以覆盖hiPSCs的TrypLE Express((Gbico)消化液，在室温下消化2分钟。然后弃掉消化液，用APEL(STEMCELL Technologies)附加10mM Y27632(STEMCELL Technologies)、20ng/mlBMP4(R&D)和10ng/ml重组人bFGF(R&D)，20ng/ml VEGF (Peprotech),40ng/ml SCF(Peprotech)培养液重悬细胞，上下吸将细胞消化为单细胞悬液，计数，将浓度调到100μl含8000细胞的浓度。在未处理的圆底96孔板(costar 3788)中部的60个孔中接种细胞100μl(8000/well)，室温离心5min。细胞于第3天，第5天换 APEL+20ng/mlBMP4+10ng/ml重组人bFGF+20ng/ml VEGF+40ng/ml SCF培养液。
3)、第8天，去除APEL培养基，换为RPMI1640培养液中加入20％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素(PS)、100ng/ml m-CSF(peprotech)和25ng/ml IL-3(peprotech)的巨噬细胞分化培养基培养。
4)、在第21天，用100-μm的细胞过滤器，移除EBs，用RPMI1640+20％FBS+1％ PS+100ng/ml M-CSF培养液培养。每3天换液一次。
实施例2(p3500的方案)
1)、人诱导多能干细胞(hiPSCs)培养：采用无饲养层、无血清培养基(cellapy，人多潜能干细胞培养基)培养hiPSCs，当细胞达到70％-80％密度时传代。弃掉培养基，加入可以覆盖细胞的0.5mM EDTA，在37℃下消化培养4-5分钟。吸掉EDTA液体，加入iPS培养液，按1:6的比例传代后将平板放入温度为37℃、含有5％二氧化碳的培养箱中。
2)、我们采用EB-离心方案进行造血分化：但hiPSCs长到70％左右密度，弃掉培养液，加入可以覆盖hiPSCs的TrypLE Express((Gbico)消化液，在室温下消化2分钟。然后弃掉消化液，用APEL(STEMCELL Technologies)附加10mMY27632(STEMCELL Technologies)、10ng/ml BMP4(R&D)和10ng/ml重组人bFGF(R&D)培养液重悬细胞，上下吸将细胞消化为单细胞悬液，计数，将浓度调到100ul含3500细胞的浓度。在未处理的圆底96孔板(costar3788)中部的60个孔中接种细胞100ul(8000/well)，室温离心5min。细胞于第2天换成含有BMP4(10ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、血管内皮生长因子VEGF(10ng/ml)和SCF(50ng/ml)的APEL中培养。每3天换液一次，直到培养到14天。
3)、第14天，去除APEL培养基，换为RPMI1640培养液中加入20％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素(PS)、100ng/ml m-CSF(peprotech)和25ng/ml IL-3(peprotech)的巨噬细胞分化培养基培养。每3天换液一次。
4)、在第21天，用100-μm的细胞过滤器，移除EBs。用RPMI1640+20％FBS+1％ PS+100ng/ml M-CSF培养液培养。每3天换液一次。
分化为M1，M2亚型：
第25天至第30天，细胞分化为M0细胞。M0细胞在100ng/ml LPS(sigma)和20ng/mlIFN-γ(peprotech)的巨噬细胞分化培养液中分化48h至M1细胞。
M0细胞在20ng/ml IL-4(peprotech)的巨噬细胞分化培养液中分化至M2细胞。细胞分离采用Accutase(Gibco)溶液(gibco)或EDTA消化液浸泡10分钟消化。
形态学鉴定
细胞形态用倒置显微镜检测，分化的血细胞利用离心玻璃片的离心机500rpm离心5 分钟，将血细胞离心到玻璃片上，利用瑞士吉姆萨染料染色染色10分钟，蒸馏水冲洗后，用40X油镜观察拍照。
流式细胞术
用流式抗体CD45-APC-Cy7(2D1,IgG1κ-APC,BioLegend)，CD34-PE(4H11,IgG1κ-PE, Invitrogen)，CD14-PE(61D3,IgG1κ-PE,Invitrogen),CD11b-APC(M1/70,IgG2bκ-APC,eBioscience)，CD80-PE(2D10.4,IgG1κ-PE,eBioscience)，CD86-PE-Cy7(IT2.2,IgG2bκ-PE-Cy7, eBioscience)，CD163-PE(GHI/61,IgG1κ-PE,eBioscience)，CD206-PE-Cy7(19.2,IgG1κ-PE-Cy7,eBioscience)。抗体CD34/CD45，CD45/CD14，CD45/CD11b等组合，以及其单抗体管，不加抗体对照，每管取细胞1X105，每管1个抗体加1μl，混合在4℃条件下染色30分钟。加1ml 的PBS，重悬细胞，室温离心5min，每管100μl的PBS重悬细胞，放在冰上。样本在流式细胞仪(BD canto plus)上进行分析，数据采用flowjo v10(flowjo，llc)进行分析。
吞噬功能
吞噬荧光珠实验
在巨噬细胞培养基中加入1.0μm红色荧光乳胶珠(polyscience inc.，18660)。24小时后，洗涤巨噬细胞，用confocoal显微镜拍照或流式细胞仪进行分析。
肿瘤细胞吞噬实验
Reh,Nalm6等白血病细胞系，用10ng/ml的H33342(life technologies)在37℃条件下培养染色20分钟。细胞用PBS洗3遍，1×105的巨噬细胞分别与肿瘤细胞按1:1、1:2和1:4 的比例共培养，在37℃培养2h。取细胞，在4℃条件下用CD11b-APC抗体染色30min，用流式测定吞噬率(H33342和CD11b双阳细胞占CD11b单阳细胞的比例)。巨噬细胞在培养到M0,M1和M2的时候，与肿瘤细胞以1:4的比例共培养检测吞噬作用。
细胞因子鉴定
巨噬细胞在分化培养液中培养至CD11b阳性率到90％以上。然后M0细胞向M1 细胞和M2细胞极化培养48小时后，收集细胞培养上清液，采用流式细胞仪(quantobio) 检测细胞因子il-6、il-10、TNF-a的浓度。
实验结果
巨噬细胞的分化需要三个步骤:造血分化、髓系祖细胞的扩增和巨噬细胞的成熟。本发明比较了两个方案，根据单孔种植细胞量分为p3500和p8000，来比较来自hiPSCs 的巨噬细胞分化效果(图1a)。具体的培养方式见上述方法。在p8000方案中，第14天，发现p8000方案细胞分化成熟的较p3500方案早。P3500方案第14天CD34+/CD45+细胞百分比达80％以上(图1b-1d)，而p8000方案第14天CD34+/CD45+细胞百分比不超过20％，CD45+/CD14+和CD45+/CD11b+细胞百分比达40％-60％(图1c-1d)。从第14 天到第22天，CD34+/CD45+造血祖细胞分化为髓系祖细胞。在第22天，p3500方案的 CD45+/CD14+和CD45+/CD11b+细胞百分比可达70％左右，而p8000方案的阳性率可以到达90％左右(图1c，图1d)。从第22天到第30天，细胞分化主要经历巨噬细胞成熟和纯化阶段。在第30天，两组间CD45+/CD14+和CD45+/CD11b+细胞百分比无差异(图 1c，图1d)。总的来说，p8000方案的巨噬细胞分化过程比p3500方案快。更重要的是， p8000方案在第22天和第30天获得的总细胞数量显著高于p3500方案(图1e)。在p8000 方案中，第30天每一个96孔板(60孔)收集约2X107个巨噬细胞。在巨噬细胞分化过程中，第14天、第22天和第30天的细胞用wright-giemsa染色法进行染色可以观察到巨噬细胞从干祖细胞走向成熟的巨噬细胞的过程(图1f)：第14天主要是未成熟的造血干祖细胞。第22天，单核细胞表现出典型的形态学特征，细胞质中液泡较多。第30天，细胞更加成熟，就像“煎蛋”一样。这些结果表明，种子细胞的数量和添加细胞因子的时间决定了分化效率和进程。
巨噬细胞通常分为两种不同的激活状态，即M1型(或经典激活型)和M2型(或交替激活型)。M1表型是促炎症因子，具有强大的抗微生物和抗肿瘤活性，而M2被认为促进组织重塑和肿瘤生长。在持续的巨噬细胞集落刺激因子M-CSF诱导下，髓系祖细胞粘附在六孔板上，分化为巨噬细胞。LPS和IFN-γ均能使M0细胞向M1细胞极化。使用IL-4， M0细胞可以向M2细胞极化。本发明2个不同方案分化来的巨噬细胞再极化处理时，没有差异。从形态上看，M0形状被拉长，M1有更多的突起，M2更圆(图2a)。CD80和CD86 在M1细胞中表达上调，CD163和CD206在M0和M2细胞中表达上调(图2b)。本发明2 个方案得到的巨噬细胞进一步极化效果和外周血来源的巨噬是没有差异的。
然后分析不同极化状态的巨噬细胞的吞噬能力。结果表明，M0细胞和M2细胞的吞噬能力无差异，M1细胞的吞噬能力略有下降，但无统计学意义(图2c-2d)。iPS来源的2种方案分化的巨噬细胞的吞噬活性均与外周血来源的巨噬细胞相当(图2d-2e)。细胞因子分泌显示，外周血来源和iPS来源的M1细胞分泌的促炎性细胞因子(IL-6和TNF-α)水平明显升高(图2f)。实验结果证实，诱导多能干细胞来源的巨噬细胞和外周血来源的巨噬细胞在极化、吞噬能力以及细胞因子释放方面功能是没有差异的。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (1)

1.一种人诱导多能干细胞分化巨噬细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)、人诱导多能干细胞培养成类胚体EB；
2)、类胚体EB诱导分化的途径分化成巨噬细胞；其中初始种植细胞是8000细胞每个EB每孔培养的方式；
其中，
步骤1)为：采用无饲养层、无血清
Figure FDA0004109624060000011
Ⅱ培养基培养hiPSCs，当细胞达到70％-80％密度时传代；弃掉培养基，加入覆盖细胞的0.5mM EDTA，在37℃下消化培养4-5分钟；吸掉EDTA液体，加入
Figure FDA0004109624060000012
Ⅱ培养基，按1:6的比例传代后将平板放入温度为37℃、含有5％二氧化碳的培养箱中；
步骤2)中包含如下步骤：先用培养液1重悬细胞，将浓度调到100μl含8000细胞的浓度；在未处理的圆底96孔板中部的60个孔中接种细胞100μl，室温离心5min；第3天、第5天更换培养液2，培养至第8天，然后再在培养液3中培养至第21天，移除EBs，再在培养液4继续培养；
其中培养液1为APEL+10mM Y27632+20ng/mlBMP4和10ng/ml重组人bFGF+20ng/ml VEGF+40ng/ml SCF；
其中培养液2为APEL+20ng/mlBMP4和10ng/ml重组人bFGF+20ng/ml VEGF+40ng/mlSCF；
其中培养液3为RPMI1640+20％FBS+1％PS+100ng/ml M-CSF+25ng/ml IL-3；
其中培养液4为RPMI1640+20％FBS+1％PS+100ng/ml M-CSF。
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