CN105969733B - 诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法，包括以下步骤：1)将hPSCs贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养；2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂；3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构；4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，第17天将形成球状神经前体细胞；5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁，得到大脑皮质神经元；6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁，加入神经营养因子培养，在分化90天后，获得谷氨酰胺能神经元。

Description

诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法
技术领域
本发明涉及一种诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法，属生物医学和发育生物领域。
背景技术
大脑皮质是哺乳动物中枢神经系统最重要的组成部分，占大脑体积的3/4。大脑皮质包含上百种细胞类型组成的神经环路来执行感官知觉、运动、学习、语言等中枢神经系统的指令。大脑皮质损伤是造成神经退行性疾病如阿尔兹海默综合症、帕金森综合症的重要原因。hPSCs技术的出现，为体外模拟大脑皮质发育，构建退行性疾病模型以研究发病机制、分子机理、细胞筛药提供细胞模型。
大脑皮质包含神经元主要分为两大种类，一类是兴奋性谷氨酰胺能经元，约占80％，另一类是抑制性γ-氨基丁酸能中间神经元(GABA interneurons)，约占20％。谷氨酰胺能神经元主要起源于胚胎前脑外套层室管膜前体细胞，随后放射性迁移到软脑膜。而GABA interneurons起源于内侧神经节隆起，然后沿切线方向迁移到大脑皮质。谷氨酰胺能神经元分泌谷氨酸递质，表达标记物glutamate、vGlut1。谷氨酰胺能神经元分布于大脑皮质I-VI层，位于不同皮质层的谷氨酰胺能神经元表达特定的转录因子。如第VI层表达Pax6、Tbr1；第V层表达Ctip2,Tbr2；第II-IV层表达Sabt2,Cux1,Brn2。谷氨酰胺能神经元还可投射到丘脑、基底核、中脑、后脑、脊髓等区域。
大脑皮质谷氨酰胺能神经元在神经发育中扮演非常重要的角色。据文献报道，谷氨酰胺能神经元的异常与神经退行性疾病，如阿尔兹海默综合症，精神分裂症等密切相关。在神经病理学的研究中发现谷氨酰胺能神经元在精神分裂症患者的脑内表现出神经突数量减少，突触后蛋白PSD-95水平下降以及谷氨酸受体表达下降等缺陷。在阿尔兹海默患者的脑内，tau蛋白过磷酸化以及淀粉样蛋白质Aβ聚集主要发生在谷氨酰胺能神经元中，造成谷氨酰胺能神经元大量丢失，影响谷氨酰胺能神经系统的正常运行，导致阿尔兹海默患者认知功能出现障碍。在帕金森患者的皮层中，谷氨酸囊泡转运体vGlut1表达严重下调，谷氨酰胺能神经元丢失，谷氨酰胺能神经元活动减退。对于这些神经退行性疾病，目前多用药物治疗，但是此类疾病的根源在于神经元的异常或丢失，所以单纯用药物治疗的效果不佳，用细胞替代治疗或许能从根本上治愈或者缓解神经退行性疾病。但是体外获得谷氨酰胺能神经元的数量特别有限，hPSCs体外诱导分化为特种神经元技术的兴起，为细胞移植治疗提供了巨大的潜力。
hPSCs包括人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)。第一株hESCs是从早期胚胎的内细胞团中分离出来的，而hiPSCs则是Shinya Yamanaka用逆转录病毒将包含人Oct3/4,Sox2,Klf4,c-Myc的四个因子转入人皮肤成纤维细胞后重编程后得到的。hiPSCs在形态、增殖、表面抗原、基因表达、端粒酶活性展现出了与hESCs非常相似的特性。hPSCs具有独特的性质，它们不但能进行自我更新，而且具有分化为三个胚层的能力。研究证明，在特定条件下hPSCs可以分化为任何一种细胞类型，如神经前体细胞，心肌细胞，肝细胞等。它们可作为一种再生资源治疗神经类疾病，如I型糖尿病，帕金森疾病，心血管疾病，肝脏疾病。hPSCs的出现，将为再生医学中应用细胞治疗提供不可估量的前景。
越来越多的研究数据表明，hPSCs在特定的诱导坏境下可分化为大脑皮质谷氨酰胺能神经元。随着诱导技术的不断发展，尽管由hPSCs向谷氨酰胺能神经元的诱导分化已经取得一些突破，但仍然存在分化得到的神经元不纯等局限。据文献报道，hPSCs经过诱导分化，无法获得高纯度的大脑皮质谷氨酰胺能神经元，分化得到的细胞中还包含起源于侧神经节隆起的GABA投射神经元。可能是因为多能干细胞在分化的过程中自发分泌少量腹侧化因子SHH，诱导多能干细胞部分腹侧化。然而，在Pols One第6卷第9期e25788页发表的Anti-AβDrug Screening Platform Using Human iPS Cell-Derived Neurons for theTreatment of Alzheimer’s Disease一文中报道的实验显示，在培养中单纯加入SHH的抑制剂Cyclopamine，并不能够显著增加vesicular glutamate transporter的表达量，显示了谷氨酰胺能神经元数量并没有因为SHH抑制剂的加入而增加。在Neuron期刊2013年2月6日发表的Pyramidal Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells IntegrateEfficiently into Mouse Brain Circuits In Vivo一文中同样显示加入Cyclopamine对于人神经前体细胞的命运-没有影响。由此可见，之前的实验均显示加入Cyclopamine并不能够得到高纯度的大脑皮质谷氨酰胺能神经元。
因此，建立一种高效诱导hPSCs定向分化为谷氨酰胺能神经元的方法尤为重要。理想状态下，通过分化获得的细胞不包含GABA能投射神经元，只包含谷氨酰胺能神经元。在本专利中，我们克服偏见，找到了一种高效分化hPSCs至大脑皮质谷氨酰胺能神经元的方法，为体外模拟大脑皮质发育，构建退行性疾病模型，研究发病机制、分子机理、细胞筛药提供细胞模型。
发明内容
发明目的：本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种诱导干细胞分化为谷氨酰胺能神经元的方法，具体涉及诱导hPSCs分化为大脑皮质谷氨酰胺能神经元的方法，更具体的涉及一种用神经诱导培养液NIM、腹侧化因子SHH抑制剂Cyclopamine将hPSCs诱导分化为大脑皮质谷氨酰胺能神经元的方法。该方法能有效解决大脑皮质谷氨酰胺能神经元纯度不高等缺陷造成的难题。
本发明的进一步目的是提供所述方法制得的细胞在体外构建大脑皮质退行性疾病模型，为研究发病机制，分子机理，细胞筛药提供细胞模型。
本发明的方法，将hPSCs经过贴壁，消化，悬浮，再贴壁，再悬浮等一系列诱导分化过程获得纯度较高的大脑皮质谷氨酰胺能神经元。具体是将hPSCs在神经诱导培养液中诱导后，加入腹侧化因子SHH抑制剂Cyclopamine，诱导hPSCs定向分化为谷氨酰胺能神经元。
本发明方法中，首先将hPSCs在神经诱导培养液中进行分化，1天后加入腹侧化因子抑制剂Cyclopamine。该方法利用Cyclopamine抑制细胞分化过程中腹侧化因子SHH的分泌，能有效减少GABA投射神经元的产生，提高谷氨酰胺能神经元分化的纯度。
具体而言，本发明的诱导hPSCs分化为大脑皮质谷氨酰胺能神经元的方法，诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将hPSCs细胞贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养；
2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂；
3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构；
4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，第17天将形成球状神经前体细胞；
5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁，得到大脑皮质神经元；
6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁，加入神经营养因子培养，在分化90天后，获得谷氨酰胺能神经元。
进一步地，所述步骤1)将hPSCs细胞贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养具体为：
将hPSCs贴壁培养于在室温下用基质胶Vitronectin提前2小时包被过的培养皿中；hPSCs所用培养液为Essential 8,由Essential 8TM Basal Medium DMEM/F12(Ham)(1:1)与Essential 8TM Supplement(50X)配制而成，体积比为50:1；
hPSCs在培养皿中增殖为边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后，加入1mlDispase(1Uml-1)于37℃，5％CO2的孵箱中孵育2min，移至显微镜下观察，克隆边缘发亮，并微微卷起时，将Dispase吸除；用DMEM/F12轻洗细胞，10-20s后吸走，再加入DMEM/F12轻轻将克隆吹下，一边吹一边将已吹下的克隆从液体中吸出转移至15ml离心管中；将装有细胞和DMEM/F12的离心管离心，800rpm,1min；吸除上清，将管底的细胞转移至细胞培养瓶，换上神经诱导培养液NIM，将细胞制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养，其中，神经诱导培养液NIM为DMEM/F12培养基，NEAA，N2以体积比98:1:1配制而成。
进一步地，所述步骤2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂，具体为：
分化第1天在神经诱导培养液中加入腹侧化因子SHH的抑制剂Cyclopamine，浓度为2-20μM，并持续至分化第25天，并且在分化第1-3天时加入体积为培液体积5％的血清替代物KOSR，分化第1天至分化第4天，每天半换液，4天之后，隔天半换液，更换的培养液均为加入Cyclopamine的神经诱导培养液。
进一步地，所述步骤3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构具体为：
分化第7天时把拟胚体从培养瓶吸出置于离心管中，用枪头轻吹打2-3次；待细胞自然沉降到管底后，吸走上清，留少量培养基，用枪将拟胚体吸出，置于细胞培养皿中，每个培养皿中大约含50个拟胚体，细胞培养液为1.5ml NIM+10％FBS(0.15ml)；10小时后更换为加入Cyclopamine的神经诱导培养液。
进一步地，所述步骤4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，第17天将形成球状神经前体细胞，具体为：分化第16天，用1ml的枪将形成神经管样细胞结构吹下，转移至15ml离心管中自然沉降，弃上清，将管底细胞转移至细胞培养瓶中，培养液为加入Cyclopamine的神经诱导培养液，并在其中加入B27和Rock inhibitor；体积比为98:2:0.01；
分化第17天，细胞将形成球状神经前体细胞。
进一步地，所述步骤5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁，得到大脑皮质神经元具体为：
分化第20天将神经前体细胞贴壁分化；在贴壁提前两小时在室温下用Matrigel包被用Poly-l-ornithine hydrobromide提前处理过的玻片，80ul/片；用1ml的枪吸出少量神经前体细胞于1.5ml的离心管中，使其自然沉淀，弃上清，加入1ml的TrypLE酶，置于37℃的孵箱中孵育6min；吸出TrypLE,加入1ml DMEM/F12重悬，待神经前体细胞自然沉降到管底后吸去上清；再加入500ul DMEM/F12，用200ul的枪头逐级吹打细胞；吸取10ul进行细胞计数，以4x10^4个/ml的密度种于玻片上，每个玻片100ul，2hour后补液至500ul，培养液为NIM和B27，体积比为NIM:B27＝98:2；每隔一周半换液；剩余的神经前体细胞继续在培养瓶中培养，所用培养液仍然为含有Cyclopamine的神经诱导培养液；在分化第26天时，将Cyclopamine从神经诱导培养液中撤出，使用NIM神经诱导培养液。
进一步地，所述步骤6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁，加入神经营养因子培养，在分化90天后，获得谷氨酰胺能神经元具体为：
在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁分化，在贴壁前两小时在室温下用Matrigel包被用Poly-l-ornithine hydrobromide提前处理过的玻片，80ul/片；用1ml的枪头吸出少量神经前体细胞于1.5ml的离心管中，使其自然沉淀，弃上清，用10ul的枪头将神经前体细胞吸出，按10个/玻片的密度种于玻片上，每个玻片100ul，2hour后补液至500ul，培养液为NIM，包含2％B27和神经营养因子10ng ml-1 BDNF、1μM CAMP，每隔一周半换液,培养至第90天。其包括步骤：
本发明方法的有益效果为：
在诱导分化的第17天的神经前体细胞中，Cyclopamine处理组中腹侧化因子SHH的含量比对照组下降了47％。分化第21天，Cyclopamine处理组可获得大量的大脑皮质前体细胞，表达标记物Pax6的阳性细胞率达到83.44％±1.39％，显著高于对照组。Cyclopamine处理组表达侧神经节隆起标记物Meis2的阳性细胞比对照组相比明显下降。Cyclopamine处理组中表达大脑皮质室管膜下层(subventricular zone,SVZ)的标记物Tbr2,表达大脑皮质第六层的标记物Tbr1的阳性细胞数与对照组相比均有显著增加。分化第35天时Cyclopamine处理组中GABA投射神经元的比例显著低于对照组。分化第93天时，Cyclopamine处理组中谷氨酰胺能转运体BNPI(vGlut1)的表达显著高于对照组。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施方式对本发明的诱导hPSCs分化为大脑皮质谷氨酰胺能神经元的方法进行详细描述。
附图说明
图1为诱导hPSCs分化至谷氨酰胺能神经元的示意图；
图2为诱导hPSCs分化至谷氨酰胺能神经元的实验结果示意图；
图3为诱导hPSCs分化至谷氨酰胺能神经元的实验结果示意图。
具体实施方式
下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1：
本实施例步骤如下：
步骤1)将hPSCs细胞贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养：将hPSCs贴壁培养于在室温下用基质胶Vitronectin提前2小时包被过的培养皿中。hPSCs所用培养液为Essential 8,用体积比为50:1的Essential 8TM Basal Medium DMEM/F12(Ham)(1:1)与Essential 8TM Supplement(50X)配制而成，即在490ml的E8培养基中加入10ml E8因子。hPSCs在培养皿中增殖为边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后，加入1ml Dispase(1Uml-1)于37℃，5％CO2的孵箱中孵育2min，移至显微镜下观察，克隆边缘发亮，并微微卷起时，将Dispase吸除。用DMEM/F12轻洗细胞，10-20s后吸走，再加入DMEM/F12轻轻将克隆吹下，一边吹一边将已吹下的克隆从液体中吸出转移至15ml离心管中，减少对细胞的机械损伤。将装有细胞和DMEM/F12的离心管离心，800rpm,1min。吸除上清，将管底的细胞转移至细胞培养瓶，换上神经诱导培养液NIM，细胞将形成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养，其中，神经诱导培养液NIM为DMEM/F12培养基，NEAA，N2以体积比98:1:1配制而成。
步骤2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂：分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂Cyclopamine,浓度为2-20μM，至分化第25天撤销，并且在分化第1-3天时加入体积为培液体积5％的血清替代物KOSR，降低加药初期对细胞的毒性影响。分化第1天至分化第4天，每天半换液，4天之后，隔天半换液，更换的培养液均为加入Cyclopamine的神经诱导培养液。
步骤3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构：分化第7天时把拟胚体从培养瓶吸出置于15ml离心管中，用1ml的枪头轻吹打2-3次，将拟胚体表面的死细胞吹下。待细胞自然沉降到管底后，吸走上清，留少量培养基，用10ul的枪将拟胚体吸出，置于直径为60mm的细胞培养皿中，每个培养皿中大约含50个拟胚体，细胞培养液为1.5ml NIM+10％FBS。FBS可促进细胞贴壁，但加入10小时后应更换培养基为加入Cyclopamine的神经诱导培养液。
步骤4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，第17天将形成球状神经前体细胞：分化第10天时细胞出现神经管样细胞结构，分化第16天，用1ml的枪头将形成神经管样细胞结构吹下，转移至15ml离心管中自然沉降，弃上清，将管底细胞转移至细胞培养瓶中，培养液为加入Cyclopamine的神经诱导培养液，并在其中加入B27和Rock inhibitor；体积比为98:2:0.01；，可减少机械吹打对细胞的损伤。分化第17天，细胞将形成球状神经前体细胞，如果直径过大，可用1ml的枪吸出置于1.5ml离心管中吹打几次，使其变小。可收集部分神经前体细胞用Real-time Quantitative PCR检测因子的表达。
步骤5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁，得到大脑皮质神经元：分化第20天可将神经前体细胞贴壁分化。提前两小时在室温下用Matrigel包被用Poly-l-ornithinehydrobromide提前处理过的玻片，80ul/片。用1ml的枪吸出少量神经前体细胞于1.5ml的离心管中，使其自然沉淀，弃上清，加入1ml的TrypLE酶消化神经前体细胞，置于37℃的孵箱中孵育6min，使球状神经前体细胞变得松散。吸出TrypLE,加入1ml DMEM/F12重悬，待神经前体细胞自然沉降到管底后吸去上清。再加入500ul DMEM/F12，用200ul的枪头逐级吹打细胞。吸取10ul进行细胞计数，以4x10^4个/ml的密度种于玻片上，每个玻片100ul，2hour后补液至500ul，培养液为NIM+2％B27，每隔一周半换液。其中，使用的TrypLE酶为lifetechnology公司的产品，货号：1677119。在分化第25天时将Cyclopamine从NIM中撤出。
步骤6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁，加入神经营养因子培养，在分化90天后，获得谷氨酰胺能神经元：在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁分化，提前两小时在室温下用Matrigel包被用Poly-l-ornithine hydrobromide提前处理过的玻片，80ul/片。用1ml的枪吸出少量神经前体细胞于1.5ml的离心管中，使其自然沉淀，弃上清，用10ul的枪头将神经前体细胞吸出，按10个/玻片的密度种于玻片上，每个玻片100ul，2hour后补液至500ul，培养液为NIM，包含2％B27和神经营养因子10ng ml-1BDNF、1μM CAMP，每隔一周半换液。
在细胞分化的第21天后根据大脑皮质谷氨酰胺能神经元表达因子的时间固定细胞，进行细胞免疫荧光染色鉴定。其具体步骤为：用镊子把玻片挑出置于做组化所用的培养皿中，加入100ul/玻片的polyformaldehyde(PFA)固定半小时后吸走；加入PhosphateBuffered Saline(PBS)洗3次，每次5min；加入0.2％Triton，10min；加10％Donkey-Serum封闭1hour；加入0.1％Triton与5％Donkey-Serum配制的一抗，4℃过夜。用PBS洗3次，每次10min,加入二抗，用5％Donkey-Serum配制，室温孵育30min，再用PBS洗3次，每次10min。用封片剂封片，观察荧光结果。
图1显示了诱导hPSCs分化至谷氨酰胺能神经元的示意图。其中，A.分化谷氨酰胺能神经元时，在第1-25天持续加入Cyclopamine。B.hPSCs于基质胶上贴壁生长，形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆。C.在分化第1天，hPSCs形成拟胚体Embryonic body(EB),悬浮培养，标尺＝100μm。D.在分化的第7天，EB在FBS的作用下贴壁，诱导分化为神经上皮细胞Neuroepithelium(NE)，在分化第10天形成玫瑰花样Rosettes的管状结构，标尺＝100μM。E.在分化第16天，重悬Rosettes,形成球状神经前体细胞Neurospheres(NS)，标尺＝100μm。E.在分化的21与28天，可将NS贴于玻片上，分化至神经元，标尺＝100μm。
图2A显示在分化第17天收集NS，用Real-time Quantitative PCR检测腹侧化因子SHH的表达，与对照组相比，Cyclopamine处理组SHH的水平显著降低(P＝0.0008)，标尺＝100μm。图2B显示了在分化第23天，两组均获得80％以上的前脑神经元，表达前脑标记物Foxg1与神经元标记物Tuj-1。对照组和Cyclopamine处理组的神经元的分化率并未表现出明显差异(P＝0.45)，标尺＝100μm。图2C.在分化第21天，获得大量大脑皮质前体细胞，表达标记物Pax6(红色),与对照组的阳性细胞74.83±1.6％相比，Cyclopamine处理组的阳性细胞数高达83.44±1.39％(P＝0.0003)，标尺＝100μm。图2D.在分化21天，获得的神经元中仍有少量表达侧神经节隆起的标记物Meis2(红色),与对照组的阳性细胞14.84±0.79％相比，Cyclopamine处理组阳性细胞3.82±1.73％显著下降(P<0.0001)，标尺＝100μm。图2E.在分化第27天，获得的神经元表达大脑皮质SVZ区的标记物Tbr2(红色)，与对照组的阳性细胞4.61±0.64％相比，Cyclopamine处理组阳性细胞15.68％±1.23％显著增加(P<0.0001)，标尺＝100μm。
图3A显示在分化第35天，获得的神经元中仍有少量表达Y-氨基丁酸能神经元的标记物GABA(绿色)，与对照组阳性细胞数22.85±2.67％相比，Cyclopamine处理组的阳性细胞数仅为12.11％±1.45％(P＝0.0036)，标尺＝100μm。图3B.在分化的第40天，获得的神经元表达大脑皮质第6层的标记物Tbr1(红色),与对照组的阳性细胞数1.95±0.28％相比,Cyclopamine处理组的阳性细胞数高达44.81±2.29％，标尺＝100μm。图3C.在分化的第93天，对照组与Cyclopamine处理组部分神经元发育成熟，表达标记物Map2(红色)，分泌突触前蛋白Synaptophysin(Syn)(绿色),标尺＝10μm。图3D.在分化第93天，谷氨酰胺能神经元能被谷氨酰胺能转运体BNPI(绿色)，即vGlut1标记。对照组中BNPI的阳性数与Synaptophysin(Syn)(红色)阳性数比值为13.60±1.31％，Cyclopamine处理组中BNPI的阳性数与Synaptophysin(Syn)阳性数比值为29.04±2.12％，有显著性增加(P＝0.0042)，标尺＝10μm。图3E.在分化第93天，获得的谷氨酰胺能成熟神经元表达标记物Map2(红色)与BNPI(绿色)，标尺＝10μm
实验结果证实，本发明所述的诱导分化方法(即NIM+Cyclopamine)可明显降低GABA能投射神经元的比例，提高大脑皮质谷氨酰胺能神经元的纯度。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (1)

1.一种诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将hPSCs贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养；
2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂；
3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构；
4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，第17天将形成球状神经前体细胞；
5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁，得到大脑皮质神经元；
6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁，加入神经营养因子培养，在分化90天后，获得谷氨酰胺能神经元；
所述步骤1)将hPSCs贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养具体为：
将hPSCs贴壁培养于在室温下用基质胶Vitronectin提前2小时包被过的培养皿中；hPSCs所用培养液为Essential 8，由体积比为50∶1的Essential8TM Basal Medium与Essential 8TM Supplement 50X配制而成；
hPSCs在培养皿中增殖为边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后，加入1ml 1Uml- 1Dispase于37℃，5％CO2的孵箱中孵育2分钟，移至显微镜下观察，克隆边缘发亮，并微微卷起时，将Dispase吸除；用DMEM/F12轻洗细胞，10-20s后吸走，再加入DMEM/F12轻轻将克隆吹下，一边吹一边将已吹下的克隆从液体中吸出转移至15ml离心管中；将装有细胞和DMEM/F12的离心管离心，800rpm，1min；吸除上清，将管底的细胞转移至细胞培养瓶，换上神经诱导培养液Neural induction medium，将细胞制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养，其中，神经诱导培养液NIM为DMEM/F12培养基，NEAA，N2以体积比98∶1∶1配制而成；
所述步骤2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂，具体为：
分化第1天在神经诱导培养液中加入腹侧化因子SHH的抑制剂Cyclopamine，浓度为2-20μM，并且在分化第1-3天时加入体积为培养 液体积5％的血清替代物KOSR，分化第1天至分化第4天，每天半换液，4天之后，隔天半换液，更换的培养液均为加入Cyclopamine的神经诱导培养液，持续至分化第25天；
所述步骤3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构具体为：
分化第7天时把拟胚体从培养瓶吸出置于离心管中，用头轻吹打2-3次；待细胞自然沉降到管底后，吸走上清，留少量培养基，用枪将拟胚体吸出，置于细胞培养皿中，每个培养皿中大约含50个拟胚体，细胞培养液为1.5ml，由90％NIM+10％FBS配制而成；10小时后更换为加入Cyclopamine的神经诱导培养液；
所述步骤4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，第17天将形成球状神经前体细胞，具体为：分化第16天，用1ml的枪将形成神经管样细胞结构吹下，转移至15ml离心管中自然沉降，弃上清，将管底细胞转移至细胞培养瓶中，培养液为加入Cyclopamine的神经诱导培养液，并在其中加入B27和Rock inhibitor；体积比为98∶2∶0.01；
分化第17天，细胞将形成球状神经前体细胞；
所述步骤5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁，得到大脑皮质神经元具体为：
分化第20天将神经前体细胞贴壁分化；在贴壁提前两小时在室温下用Matrigel包被用Poly-l-ornithine hydrobromide提前处理过的玻片，80ul/片；用1ml的枪吸出少量神经前体细胞于1.5ml的离心管中，使其自然沉淀，弃上清，加入1ml的TrypLE酶，置于37℃的孵箱中孵育6min；吸出TrypLE，加入1mlDMEM/F12重悬，待神经前体细胞自然沉降到管底后吸去上清；再加入500ulDMEM/F12，用200ul的枪头逐级吹打细胞；吸取10ul进行细胞计数，以4x104个/ml的密度种于玻片上，每个玻片100ul，2hours后补液至500ul，培养液为NIM与B27，体积比为NIM∶B27＝98∶2；每隔一周半换液；剩余的神经前体细胞继续在培养瓶中培养，所用培养液仍然为含有Cyclopamine的神经诱导培养液；在分化第26天时，将Cyclopamine从神经诱导培养液中撤出，使用NIM神经诱导培养液；
所述步骤6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁，加入神经营养因子培养，在分化90天后，获得谷氨酰胺能神经元具体为：
在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁分化，在贴壁前两小时在室温下用Matrigel包被用Poly-1-omithine hydrobromide提前处理过的玻片，80ul/片；用1ml的枪吸出少量神经前体细胞于1.5ml的离心管中，使其自然沉淀，弃上清，用10ul的枪头将神经前体细胞吸出，按10个/玻片的密度种于玻片上，每个玻片100ul，2hours后补液至500ul，培养液为NIM，包含2％B27和神经营养因子10ng ml-1BDNF、1μM CAMP，每隔一周半换液，培养至第90天。
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