CN105685015A - 一种细胞冻存液 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细胞冻存液，包括以下体积分数的组分：9～13％的二甲基亚砜、2～7％的人血清白蛋白和82～87％的培养基；所述培养基包括Lonza基础培养基和/或DMEN高糖培养基。本发明中的培养基和人血清白蛋共同构成了成分丰富多元的营养体系，为细胞提供了稳定的、直接的营养供给，保证了细胞存活率。此外，在温度下降的过程中，蛋白质等大分子物质形成了水化膜，降低冰晶形成，避免了细胞因温度下降时，冰晶的形成造成的细胞机械损伤、死亡，从而提高了经长时间冻存复苏后的细胞活率。实验结果表明，使用本发明中的冻存液在冻存1个月、6个月和12个月后的细胞复苏率分别为94～98％、94～97％和92～94％。

Description

一种细胞冻存液
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种细胞冻存液。
背景技术
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。
目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要是采用添加适量保护剂的缓慢冷冻法来冻存细胞，如采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)为保护剂，因为如果细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应，如：细胞脱水使局部电解质浓度增高、导致pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，从而引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易被破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
现有的冻存方案常采用10％DMSO+90％FBS的冻存方案去保存细胞，该方案能够很好的为动物细胞提供营养物质，细胞经短时间冻存再复苏后仍能维持较高的活率。但是该细胞冻存方案经长时间冻存后细胞复苏率较低，只有85％左右，直接制约冻存细胞的临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞冻存液，使用本发明提供的细胞冻存液长时间冻存后的细胞复苏率较高。
本发明提供一种细胞冻存液，包括以下体积分数的组分：
9～13％的二甲基亚砜、2～7％的人血清白蛋白和82～87％的培养基；
所述培养基包括Lonza基础培养基和/或DMEN高糖培养基。
优选的，所述二甲基亚砜的体积分数为10～12％。
优选的，所述人血清白蛋白的体积分数为3～6％。
优选的，所述人血清白蛋白的体积分数为4～5％。
优选的，所述培养基的体积分数为83～86％。
优选的，所述培养基的体积分数为84～85％。
本发明提供了一种细胞冻存液，包括以下体积分数的组分：9～13％的二甲基亚砜、2～7％的人血清白蛋白和82～87％的培养基；所述培养基包括Lonza基础培养基和/或DMEN高糖培养基。本发明中的培养基和人血清白蛋共同构成了成分丰富多元的营养体系，为细胞提供了稳定的、直接的营养供给，保证了细胞存活率。此外，在温度下降的过程中，蛋白质等大分子物质形成了水化膜，降低冰晶形成，避免了细胞因温度下降时，冰晶的形成造成的细胞机械损伤、死亡，从而提高了经长时间冻存复苏后的细胞活率。实验结果表明，使用本发明中的冻存液在冻存1个月、6个月和12个月后的细胞复苏率分别为94～98％、94～97％和92～94％。
具体实施方式
本发明提供了一种细胞冻存液，包括以下体积分数的组分：
9～13％的二甲基亚砜、2～7％的人血清白蛋白和82～87％的培养基；
所述培养基包括Lonza基础培养基和/或DMEN高糖培养基。
使用本发明提供的细胞冻存液长时间冻存后的细胞复苏率较高。
在本发明中，所述二甲基亚砜(DMSO)的体积分数为9～13％，优选为10～12％，更优选为10％。本发明对所述二甲基亚砜的来源没有特殊的限制，采用常规的市售商品即可。
在本发明中，所述人血清白蛋白(HSA)的体积分数为2～7％，优选为3～6％，更优选为4～5％；本发明对所述人血清白蛋白的来源没有特殊的限制，具体的，在本发明的实施例中，可采用广州医药公司提供的体积分数为20％的人血清白蛋白。
在本发明中，所述培养基的体积分数为82～87％，优选为83～86％，更优选为84～85％；所述培养基包括Lonza基础培养基和/或DMEN高糖培养基，本发明对所述Lonza基础培养基的来源没有特殊的限制，具体的，在本发明的实施例中，可采用广州昂赛生物技术有限公司提供的Lonza基础培养基。本发明对所述DMEN高糖培养基的来源没有特殊的限制，具体的，可采用Gibco公司提供的规格为500mL/瓶的DMEN高糖培养基。
在培养基中加入二甲基亚砜和质量浓度为20％的人血清白蛋白，得到最终含有体积分数9～13％的二甲基亚砜、2～7％的人血清白蛋白和82～87％的培养基的细胞冻存液。
在本发明中，所述培养基、二甲基亚砜和右旋糖酐的来源和用量与上述技术方案中培养基、二甲基亚砜和右旋糖酐的来源和用量一致，在此不再赘述。
本发明提供的细胞冻存液可用于冻存多种类型的人体细胞，如人体肝细胞、人体免疫细胞、人体肿瘤细胞或人体成体细胞，具体的，在本发明的实施例中，可采用以下类型和来源的人体细胞：
按照文献：田霖，孙筱放，刘海波.人脂肪干细胞的分离培养与生物学特征.《中国组织工程研究》，2012,16(32)：5946-5952中的方法获取ADSCs原代细胞，经过传代培养、获取的P3～P5的细胞；
按照文献：李艳琪，王洪一.人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进.《中国组织工程研究》，2014,18(10):1609-1614中的方法中的方法获取UC-MSC原代细胞，经过传代培养，获取的P3～P5的细胞。
按照文献：陈丹，王小东.三种分离人外周血单核细胞方法的分离.《天津医科大学学报》，2014.6:483-485中的方法获取人外周血单个核细胞(PBMC)；
从暨南大学生命科学院获取肿瘤细胞K562、HL60细胞；
按照文献：王玲玲，马峰，张玉成.人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定.《中国老年学杂志》，2012,32:1215-1216.中的方法获取成纤维细胞，经过传代培养后，获取P3～P5的细胞。
本发明分别将上述细胞冻存后，于1个月、6个月和12个月将细胞复苏，结果表明，冻存12个月后复苏的细胞活率均在93％以上。在本发明中，所述细胞冻存和复苏的方法为本领域技术人员常用的方法。
本发明提供了一种细胞冻存液，包括以下体积分数的组分：9～13％的二甲基亚砜、2～7％的人血清白蛋白和82～87％的培养基；所述培养基包括Lonza基础培养基和/或DMEN高糖培养基。本发明提供的细胞冻存液具有以下优点：
本发明通过优化细胞冻存方案，尽可能避免细胞在冻存过程中因冰晶形成而导致细胞大量死亡；
优化了冻存体系，细胞在复苏后可直接回输至人体；
不添加动物来源的血清，避免了动物来源的病毒污染；
本发明中的冻存液可用于多种细胞类型，如干细胞、免疫细胞、肿瘤细胞，成体细胞等。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种细胞冻存液进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
在以下实施例中，Lonza基础培养基由广州昂赛生物技术有限公司提供，Lonza基础培养基为500mL/瓶，人血清白蛋白由广州医药公司提供，质量浓度为20％。
在以下实施例中，所涉及到的百分数均为体积百分数。
实施例1人体干细胞ADSCs的冻存
往Lonza基础培养基中分别加入DMSO和质量浓度20％的人血清白蛋白，形成含有10％DMSO和5％人血清白蛋白的细胞冻存液。
按照文献：田霖，孙筱放，刘海波.人脂肪干细胞的分离培养与生物学特征.《中国组织工程研究》，2012,16(32)：5946-5952中的方法获取ADSCS原代细胞，经过传代培养，获取的P3～P5的细胞。
用PBS重悬后1500r/min离心5min，弃上清。用4℃的细胞冻存液重悬细胞，取50μL的细胞悬液，按细胞悬崖(v):0.4％台盼蓝(v)＝1:1混匀后进行细胞活率及数量计算；调整细胞密度至冻存密度为1×106cells/mL，把细胞悬液分装至冻存管中，1.5mL/管；进行标记，冻存6管。
把装有细胞悬液的冻存管放入至冻存盒中，放入至-80℃冰箱中，48h后，转入液氮。
分别于1个月、6个月、12个月复苏ADSCs的细胞，每次复苏两管；具体步骤如下：从液氮中取出细胞，于37℃的水中迅速溶解，把细胞悬液分别转移至含有10mLLonza基础培养基的50mL离心管中，200g离心5min，弃上清后用lonza基础培养基重悬，并调整密度至1×106cells/mL。
本发明分别计算1、6和12个月ADSCs细胞活率(重复3次计数)，结果如表1所示，表1为本发明实施例1～6冻存的细胞复苏后的细胞活率。
本发明分别取于1个月、6个月、12个月复的苏ADSCs细胞，用10％FBS+PBS重悬，并调整成1×106cells/mL的细胞悬液，分别取抗人CD73、CD105、CD45及HLA-DR的单克隆抗体各5μL，加入细胞悬液200μL，室温下避光孵育20min，同时设立同型对照组，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL1640基础培养基重悬后上机检测复苏后细胞表面抗原。结果表明，细胞表面抗原表达符合标准。
实施例2人体干细胞UC-MSC的冻存
按照文献：李艳琪，王洪一.人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进.《中国组织工程研究》，2014,18(10):1609-1614中的方法中的方法获取UC-MSC原代细胞，经过传代培养，获取的P3～P5的细胞。
用PBS重悬后1500r/min离心5min，弃上清。用4℃的实施例1中制得的细胞冻存液重悬细胞，取50uL的细胞悬液，按细胞悬崖(v):0.4％台盼蓝(v)＝1:1混匀后进行细胞活率及数量计算；调整细胞密度至冻存密度为1×106cells/mL，把细胞悬液分装至冻存管中，1.5mL/管；进行标记，冻存6管。
把装有细胞悬液的冻存管放入至冻存盒中，放入至-80℃冰箱中，48h后，转入液氮。
分别于1个月、6个月、12个月复苏UC-MSC的细胞，每次复苏两管；具体步骤如下：从液氮中取出细胞，于37℃的水中迅速溶解，把细胞悬液分别转移至含有10mLLonza基础培养基的50mL离心管中，200g离心5min，弃上清后用lonza基础培养基重悬，并调整密度至1×106cells/mL。
本发明分别计算1、6和12个月UC-MSC细胞活率(重复3次计数)，结果如表1所示，表1为本发明实施例1～6冻存的细胞复苏后的细胞活率。
本发明分别取于1个月、6个月、12个月复苏的UC-MSC细胞，用10％FBS+PBS重悬，并调整成1×106cells/mL的细胞悬液，分别取抗人CD73、CD105、CD45及HLA-DR的单克隆抗体各5μL，加入细胞悬液200μL，室温下避光孵育20min，同时设立同型对照组，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL1640基础培养基重悬后上机检测复苏后细胞表面抗原。结果表明，细胞表面抗原表达符合标准。
实施例3人外周血单个核细胞(PBMC)的冻存
按照文献：陈丹，王小东.三种分离人外周血单核细胞方法的分离.《天津医科大学学报》，2014.6:483-485中的方法获取人外周血单个核细胞(PBMC)；
用PBS重悬后1500r/min离心5min，弃上清。用4℃的实施例1中制得的细胞冻存液重悬细胞，取50uL的细胞悬液，按细胞悬崖(v):0.4％台盼蓝(v)＝1:1混匀后进行细胞活率及数量计算；调整细胞密度至冻存密度为3×106cells/mL，把细胞悬液分装至冻存管中，1.5mL/管；进行标记，冻存6管。
把装有细胞悬液的冻存管放入至冻存盒中，放入至-80℃冰箱中，48h后，转入液氮。
分别于1个月、6个月、12个月复苏PBMC的细胞，每次复苏两管；具体步骤如下：从液氮中取出细胞，于37℃的水中迅速溶解，把细胞悬液分别转移至含有10mLLonza基础培养基的50mL离心管中，200g离心5min，弃上清后用lonza基础培养基重悬，并调整密度至1×106cells/mL。
本发明分别计算1、6和12个月PBMC细胞活率(重复3次计数)，结果如表1所示，表1为本发明实施例1～6冻存的细胞复苏后的细胞活率。
本发明用10％FBS+PBS重悬于1个月、6个月、12个月复苏的PBMC，并调整成1×106cells/mL的细胞悬液，分别取抗人CD3、CD56、CD4、CD8、CD19的单克隆抗体各5μL，加入细胞悬液200μL，室温下避光孵育20min，同时设立同型对照组，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL1640基础培养基重悬后上机检测复苏后细胞表面抗原。结果表明，细胞表面抗原表达符合标准。
实施例4人体肿瘤细胞K562细胞的冻存
从暨南大学生命科学院获取肿瘤细胞K562细胞；
用PBS重悬后1500r/min离心5min，弃上清。用4℃的实施例1中制得的细胞冻存液重悬细胞，取50μL的细胞悬液，按细胞悬崖(v):0.4％台盼蓝(v)＝1:1混匀后进行细胞活率及数量计算；调整细胞密度至冻存密度为5×106cells/mL，把细胞悬液分装至冻存管中，1.5mL/管；进行标记，冻存6管。
把装有细胞悬液的冻存管放入至冻存盒中，放入至-80℃冰箱中，48h后，转入液氮。
分别于1个月、6个月、12个月复苏K562的细胞，每次复苏两管；具体步骤如下：从液氮中取出细胞，于37℃的水中迅速溶解，把细胞悬液分别转移至含有10mLLonza基础培养基的50mL离心管中，200g离心5min，弃上清后用lonza基础培养基重悬，并调整密度至1×106cells/mL。
本发明分别计算1、6和12个月K562细胞活率(重复3次计数)，结果如表1所示，表1为本发明实施例1～6冻存的细胞复苏后的细胞活率。
本发明用10％FBS+PBS重悬于1个月、6个月、12个月复苏的K562细胞，并调整成1×106cells/mL的细胞悬液，分别取抗人CD13、CD117、CD34及HLA-DR的单克隆抗体各5μL，加入细胞悬液200μL，室温下避光孵育20min，同时设立同型对照组，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL1640基础培养基重悬后上机检测复苏后细胞表面抗原。结果表明，细胞表面抗原表达符合标准。
实施例5人体肿瘤细胞HL60细胞的冻存
从暨南大学生命科学院获取肿瘤细胞HL60细胞；
用PBS重悬后1500r/min离心5min，弃上清。用4℃的实施例1中制得的细胞冻存液重悬细胞，取50uL的细胞悬液，按细胞悬崖(v):0.4％台盼蓝(v)＝1:1混匀后进行细胞活率及数量计算；调整细胞密度至冻存密度为5×106cells/mL，把细胞悬液分装至冻存管中，1.5mL/管；进行标记，冻存6管。
把装有细胞悬液的冻存管放入至冻存盒中，放入至-80℃冰箱中，48h后，转入液氮。
分别于1个月、6个月、12个月复苏HL60的细胞，每次复苏两管；具体步骤如下：从液氮中取出细胞，于37℃的水中迅速溶解，把细胞悬液分别转移至含有10mLLonza基础培养基的50mL离心管中，200g离心5min，弃上清后用lonza基础培养基重悬，并调整密度至1×106cells/mL。
本发明分别计算1、6和12个月HL60细胞活率(重复3次计数)，结果如表1所示，表1为本发明实施例1～6冻存的细胞复苏后的细胞活率。
本发明用10％FBS+PBS重悬于1个月、6个月、12个月复苏的HL60细胞，并调整成1×106cells/mL的细胞悬液，分别取抗人CD13、CD11b的单克隆抗体各5μL,加入细胞悬液200μL，室温下避光孵育20min，同时设立同型对照组，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL1640基础培养基重悬后上机检测复苏后细胞表面抗原。结果表明，细胞表面抗原表达符合标准。
实施例6人成纤维细胞的冻存
按照文献王玲玲，马峰，张玉成.人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定.《中国老年学杂志》，2012,32:1215-1216.中的方法获取成纤维细胞，经过传代培养后，获取P3～P5的细胞；
用PBS重悬后1500r/min离心5min，弃上清。用4℃的实施例1中制得的细胞冻存液重悬细胞，取50uL的细胞悬液，按细胞悬崖(v):0.4％台盼蓝(v)＝1:1混匀后进行细胞活率及数量计算；调整细胞密度至冻存密度为3×106cells/mL，把细胞悬液分装至冻存管中，1.5mL/管；进行标记，冻存6管。
把装有细胞悬液的冻存管放入至冻存盒中，放入至-80℃冰箱中，48h后，转入液氮。
分别于1个月、6个月、12个月复苏成纤维细胞，每次复苏两管；具体步骤如下：从液氮中取出细胞，于37℃的水中迅速溶解，把细胞悬液分别转移至含有10mLLonza基础培养基的50mL离心管中，200g离心5min，弃上清后用lonza基础培养基重悬，并调整密度至1×106cells/mL。
本发明分别计算1、6和12个月成纤维细胞活率(重复3次计数)，结果如表1所示，表1为本发明实施例1～6冻存的细胞复苏后的细胞活率。
本发明用10％FBS+PBS重悬1个月、6个月、12个月复苏的成纤维细胞并调整成1×106cells/mL的细胞悬液，分别取抗人波形蛋白抗体(Vimentin)和角蛋白抗体(CK15抗体)的单克隆抗体各5μL,加入细胞悬液200μL，室温下避光孵育20min，同时设立同型对照组，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL1640基础培养基重悬后上机检测复苏后细胞表面抗原。结果表明，细胞表面抗原表达符合标准。
表1本发明实施例1～6冻存的细胞复苏后的细胞活率
由表1可以看出，使用本发明中的细胞冻存液冻存不同类型的人体细胞，即使经过长时间冻存，复苏后仍具有较高的细胞活率。均在93％以上，最高能够达到94％左右。
实施例7～12
往Lonza基础培养基中分别加入DMSO和质量浓度20％的人血清白蛋白，形成含有10％DMSO和3％人血清白蛋白的细胞冻存液。
采用上述细胞冻存液，按照实施例1～6中的冻存方法分别冻存人体干细胞ADSCs(实施例7)、人体干细胞UC-MSC(实施例8)、人外周血单个核细胞(PBMC)(实施例9)、人体肿瘤细胞K562细胞(实施例10)、人体肿瘤细胞HL60细胞(实施例11)和人成纤维细胞(实施例12)，并分别计算了实施例7～12中各细胞的细胞活率(重复3次计数)，结果如表2所示，表2为本发明实施例7～12冻存的细胞复苏后的细胞活率。
表2本发明实施例7～12冻存的细胞复苏后的细胞活率
实施例 细胞类型 冻存前细胞活率 1个月细胞活率 6个月细胞活率 12个月细胞活率
7 ADSCs 98.32±2.54 96.37±6.35 93.46±7.25 88.28±8.09
8 UC-MSC 99.46±1.87 96.73±7.02 93.51±7.36 87.67±6.48
9 PBMC 96.55±3.60 95.91±8.64 92.48±8.53 86.51±8.25
10 K562 99.23±1.93 97.14±6.47 94.29±8.28 88.83±8.08
11 HL60 97.97±2.69 96.22±7.58 93.26±9.47 87.64±8.72
12 成纤维细胞 96.42±3.06 96.43±8.19 93.38±9.15 85.49±9.38
实施例13～18
往Lonza基础培养基中分别加入DMSO和质量浓度20％的人血清白蛋白，形成含有12％DMSO和6％人血清白蛋白的细胞冻存液。
采用上述细胞冻存液，按照实施例1～6中的冻存方法分别冻存人体干细胞ADSCs(实施例13)、人体干细胞UC-MSC(实施例14)、人外周血单个核细胞(PBMC)(实施例15)、人体肿瘤细胞K562细胞(实施例16)、人体肿瘤细胞HL60细胞(实施例17)和人成纤维细胞(实施例18)，并分别计算了实施例13～18中各细胞的细胞活率(重复3次计数)，结果如表3所示，表3为本发明实施例13～18冻存的细胞复苏后的细胞活率。
表3本发明实施例13～18冻存的细胞复苏后的细胞活率
实施例 细胞类型 冻存前细胞活率 1个月细胞活率 6个月细胞活率 12个月细胞活率
13 ADSCs 98.32±2.54 92.65±6.42 89.49±8.15 83.82±8.31
14 UC-MSC 99.46±1.87 92.73±6.79 87.66±7.84 81.71±7.76
15 PBMC 96.55±3.60 90.94±6.49 86.68±6.97 83.29±8.25
16 K562 99.23±1.93 93.88±7.40 88.47±7.83 82.59±8.46
17 HL60 97.97±2.69 91.19±7.65 85.24±7.48 79.07±7.89
18 成纤维细胞 96.42±3.06 90.08±7.98 86.58±8.41 81.35±8.63
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种细胞冻存液，包括以下体积分数的组分：
9～13％的二甲基亚砜、2～7％的人血清白蛋白和82～87％的培养基；
所述培养基包括Lonza基础培养基和/或DMEN高糖培养基。
2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述二甲基亚砜的体积分数为10～12％。
3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述人血清白蛋白的体积分数为3～6％。
4.根据权利要求3所述的细胞冻存液，其特征在于，所述人血清白蛋白的体积分数为4～5％。
5.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述培养基的体积分数为83～86％。
6.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述培养基的体积分数为84～85％。
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