ES2612469T3

ES2612469T3 - Composición celular mejorada y métodos de elaboración de la misma

Info

Publication number: ES2612469T3
Application number: ES09789172.5T
Authority: ES
Inventors: Andy Zeitlin; Gregory Russotti; Shuyang He; Ajai Pal; Hong J. Chen; Thomas Brieva; Ryan Shorr; Brian Murphy
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Current assignee: Clarity Acquisition II LLC
Priority date: 2008-08-20
Filing date: 2009-08-20
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2029-08-20
Also published as: US10104880B2; RU2018121514A3; EP3172963A1; NZ591292A; CN105766891A; KR20110050521A; JP2012500021A; IL267138B2; JP2015232000A; EP3172963B1; IL211272A0; IL267138A; WO2010021714A2; MX339624B; IL267138B1; KR20240052847A; CA2734236C; KR20180049231A; US20100047213A1; RU2563518C2

Abstract

Un método de elaboración de una composición que comprende células de mamífero, que comprende: (a) poner en contacto dichas células con una solución que comprende (1) dextrano, maltodextrano, trehalosa o hetalmidón; y (2) albúmina de suero humano (HSA) para formar una solución que contiene células; (b) filtrar la solución que contiene células a través de un filtro de 70 micrómetros a 100 micrómetros; y (c) si dicha solución que contiene células comprende más de 10 ± 3 x 106 células por mililitro, diluir dichas células a no más de 10 ± 3 x 106 células por mililitro con una primera solución de dilución que comprende dextrano.

Description

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DESCRIPCION

Composicion celular mejorada y metodos de elaboracion de la misma

1. Campo

Se proporcionan en la presente memoria procedimientos para la elaboracion de composiciones mejoradas, p. ej., composiciones farmaceuticas, que comprenden celulas de mamuferos, p. ej., celulas madre y celulas de la placenta, tales como celulas pluripotentes placentarias adherentes humanas aisladas, p. ej., celulas pluripotentes de la placenta descritas en la seccion 5.3, o celulas aisladas de lfquido perfundido de la placenta, p. ej., celulas nucleadas totales aisladas de lfquido perfundido de la placenta.

2. Antecedentes

Las composiciones de celulas, p. ej., las composiciones de celulas madre, se han convertido en una terapia atractiva para una serie de deficiencias fisiologicas, p. ej., la sustitucion de la medula osea. Existe una necesidad de formulaciones de celulas mejoradas, p. ej., celulas madre, que se van a administrar a individuos que necesitan tales composiciones.

3. Compendio

La presente memoria proporciona metodos mejorados de preparacion de composiciones que comprenden celulas de mamffero, p. ej., celulas de la placenta aisladas, tales como las celulas madre de la placenta, celulas pluripotentes de la placenta, celulas de la placenta que pueden ser expandidas y tienen el potencial de diferenciarse en al menos dos tipos de celulas diferentes, p. ej., celulas de tipo osteogenico y condrogenico o celulas aisladas de lfquido perfundido de la placenta, p. ej., celulas nucleadas totales aisladas de lfquido perfundido de la placenta, y composiciones que comprenden tales celulas, p. ej., que son adecuadas para la administracion a un individuo. Los metodos mejorados utilizan etapas espedficas y composiciones espedficas para el tratamiento de pre- crioconservacion, crioconservacion y descongelacion de las celulas. En ciertas realizaciones, los metodos mejorados reducen o eliminan la formacion de cumulos despues de la descongelacion de las celulas crioconservadas. En realizaciones preferidas, las composiciones mejoradas comprenden celulas pluripotentes de la placenta.

Por lo tanto, espedficamente, la presente invencion proporciona un metodo de elaboracion de una composicion que comprende celulas de mamffero, que comprende:

(a) poner en contacto dichas celulas con una solucion que comprende (1) dextrano, maltodextrano, trehalosa o hetalmidon; y (2) albumina de suero humano (HSA) para formar una solucion que contiene celulas;

(b) filtrar la solucion que contiene las celulas a traves de un filtro de 70 micrometros a 100 micrometros;

(c) si dicha solucion que contiene celulas comprende mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, diluir dichas celulas a no mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro con una primera solucion de dilucion que comprende dextrano.

En una realizacion del metodo de la presente invencion, dichas celulas son crioconservadas tras la etapa (c). En otra realizacion, dicha solucion en la etapa (a) comprende HSA al 10% (p/v). En otra realizacion de la invencion, dicha primera dilucion comprende dextrano 40 al 5,5% (p/v). En una realizacion adicional mas, dicha primera solucion de dilucion comprende HSA al 10% (p/v). En otra realizacion, dicha solucion en la etapa (a) o dicha primera solucion de dilucion comprenden adicionalmente un crioprotector, preferiblemente en donde dicho crioprotector en dicha primera solucion de dilucion es DMSO. En una realizacion adicional, el metodo de la presente invencion comprende despues de la etapa (c), la etapa (d) de dilucion de la solucion que contiene celulas con una segunda solucion de dilucion que comprende dextrano, maltodextrano, trehalosa o hetalmidon pero no comprende HSA, elaborando de ese modo una composicion que comprende celulas de mamfferos. En otra realizacion, dicha segunda solucion de dilucion comprende dextrano 40 al 5,5% o al 10% (p/v). En una realizacion, dicho filtro es un filtro de 70 micrometros o un filtro de 100 micrometros. En una realizacion espedfica, dichas celulas de mamffero son celulas de la placenta adherentes humanas aisladas.

En una realizacion, el metodo de la presente invencion comprende:

(a) suspender una pluralidad de celulas de la placenta adherentes humanas aisladas en una solucion de dextrano 40 al 5,5% (p/v), albumina de suero humano al 10% (p/v) (HSA) para formar una solucion que contiene celulas;

(b) filtrar la solucion que contiene celulas a traves de un filtro de 70 micrometros o un filtro de 100 micrometros;

(c) diluir la solucion que contiene celulas en dextrano 40 al 5,5% (p/v), HSA al 10% (p/v), y DMSO al 5% a no mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro;

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(d) crioconservar las celulas;

(e) descongelar las celulas; y

(f) diluir opcionalmente la solucion que contiene las celulas 1:1 a 1:11 con dextrano 40 al 10% (p/v) para producir dicha composicion.

En una realizacion adicional, el metodo de la presente invencion comprende:

(a) centrifugar una pluralidad de celulas de la placenta adherentes humanas aisladas para recoger las celulas;

(b) resuspender las celulas en dextrano 40 al 5,5% (p/v);

(c) centrifugar las celulas para recoger las celulas;

(d) resuspender las celulas en una solucion de dextrano 40 al 5,5% (p/v) que comprende albumina de suero humano al 10% (HSA) (p/v) para formar una solucion que contiene celulas;

(e) filtrar la solucion que contiene celulas a traves de un filtro de 70 micrometros o un filtro de 100 micrometros;

(f) diluir la solucion que contiene las celulas en dextrano 40 al 5,5% (p/v), HSA al 10% (p/v), y DMSO al 5% a no mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro;

(g) crioconservar las celulas;

(h) descongelar las celulas; y

(i) opcionalmente, diluir la solucion que contiene las celulas 1:1 a 1:11 con dextrano 40 al 10% (p/v) para producir dicha composicion.

En una realizacion adicional mas, el metodo de la presente invencion comprende:

(a) proporcionar una pluralidad de celulas de la placenta adherentes humanas aisladas en una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5% (p/v) y albumina de suero humano al 10% (HSA) (p/v) para formar una solucion que comprende celulas de la placenta adherentes humanas aisladas;

(b) filtrar dicha solucion que comprende celulas de la placenta adherentes humanas aisladas a traves de un filtro de 70 micrometros o un filtro de 100 micrometros para producir celulas de la placenta adherentes humanas aisladas filtradas;

(c) diluir dicha celulas de la placenta adherentes humanas aisladas filtradas con una cantidad de una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5% (p/v), HSA al 10% (p/v) y dimetilsulfoxido al 5% (DMSO) suficiente para llevar dichas celulas de la placenta adherentes humanas aisladas filtradas a 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro; y

(d) diluir dichas celulas de la placenta adherentes humanas aisladas con dextrano 40 al 10% (p/v) a una razon de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:11 celulas de la placenta adherentes humanas aisladas:dextrano 40 para producir dicha composicion.

En otra realizacion, el metodo de la presente invencion comprende:

(a) poner en contacto celulas de la placenta adherentes humanas aisladas con una solucion que comprende dextrano al 5,5% (p/v) y albumina de suero humano al 10% (HSA) (p/v);

(b) filtrar las celulas de la placenta adherentes humanas aisladas a traves de un filtro de 70 micrometros o un filtro de 100 micrometros; y

(c) diluir dichas celulas de la placenta adherentes humanas aisladas a 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro con una solucion que comprende dextrano 40 al 10% (p/v),

en donde dicha composicion no comprende macro-cumulos de celulas, en donde el macro-cumulo de celulas comprende una agregacion de celulas mayor de aproximadamente 150 micrometros.

En una realizacion del metodo de la presente invencion, dichas celulas de la placenta adherentes humanas aisladas son celulas CD10+, CD34- y CD105+ ; preferiblemente dichas celulas CD10+, CD34- y CD105+ son adicionalmente CD200+. En una realizacion adicional, dichas celulas CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+ son CD45- o CD90+. En una realizacion adicional mas, dichas celulas CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+ son CD45'y CD90+.

La presente invencion tambien se refiere a una composicion obtenible mediante los metodos de la presente invencion. En una realizacion, la composicion de la presente invencion comprende una pluralidad de celulas de la

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placenta adherentes humanas aisladas en una solucion que comprende dextrano 40 al 4-10% (p/v), en donde dicha composicion comprende entre 1,0 ± 0,3 x 106 celulas por mililitro y 5,0 ± 1,5 x 106 celulas por mililitro, y en donde dicha composicion no comprende macro-cumulos de celulas, en donde un macro-cumulo de celulas comprende una agregacion de celulas mayor de aproximadamente 150 micrometros. En otra realizacion, la composicion de la presente invencion comprende menos de aproximadamente 100 micro-cumulos de celulas por 106 celulas. En una realizacion adicional de la composicion de la presente invencion, las celulas de la placenta adherentes humanas aisladas son celulas CD10+, CD34- y CD105+; preferiblemente dichas celulas CD10+, CD34- y CD105+ son adicionalmente CD200+ . En una realizacion adicional de la composicion de la presente invencion, dichas celulas CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+ son CD45- o CD90+. En una realizacion adicional mas de la composicion de la presente invencion, dichas celulas CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+ son CD45- y CD90+.

En una realizacion, se proporciona en la presente memoria un metodo para elaborar una composicion que comprende: (a) poner en contacto las celulas con una solucion que comprende dextrano y albumina de suero humano (HSA) para formar una solucion que contiene celulas; (b) filtrar la solucion que contiene celulas a traves de un filtro de 70 pM a 100 pM para formar una solucion que contiene celulas filtradas; (c) opcionalmente, diluir la solucion que contiene las celulas filtradas a aproximadamente 1, a 10 x 106 celulas por mililitro con una primera solucion de dilucion que comprende dextrano; y (d) opcionalmente, diluir la solucion que contiene las celulas filtradas con una segunda solucion de dilucion que comprende dextrano. En algunas realizaciones, la etapa (c) se realiza cuando la solucion que contiene las celulas filtradas en (b) comprende mas de aproximadamente 15 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (c) es de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En realizaciones particulares, la etapa (c) se realiza cuando la solucion que contiene las celulas filtradas en (b) comprende mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (c) tiene aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En algunas realizaciones, la etapa (c) se realiza cuando la solucion que contiene las celulas filtradas en (b) comprende mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (c) es hasta aproximadamente 7,5 x 106 celulas por mililitro. La solucion que comprende dextrano de la etapa (d) no comprende albumina de suero humano. En una realizacion espedfica, las celulas de la composicion que contiene las celulas filtradas se crioconservan antes de la etapa (d).

En algunas realizaciones, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion o dicha segunda solucion es dextrano al 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25 %, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%. En algunas realizaciones, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion o dicha segunda solucion es dextrano a aproximadamente 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%. El dextrano en la primera solucion de dilucion o segunda solucion de dilucion puede ser dextrano de cualquier peso molecular, p. ej., dextrano que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 150 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 125 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 75 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 25 kDa. En algunas realizaciones, el dextrano en la primera solucion de dilucion o segunda solucion de dilucion tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 10 kDa, de aproximadamente 30 kDa a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 60 kDa a aproximadamente 80 kDa. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion o dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 1. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion y dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 1. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion o dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 70. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion y dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 70. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion o dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 40. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion y dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 40. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion o dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 40 de 2,5% a 10%. En algunas realizaciones, dicho dextrano 40 en dicha primera solucion de dilucion o dicha segunda solucion es dextrano 40 a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%. En algunas realizaciones, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion o dicha segunda solucion es dextrano 40 a aproximadamente 11%,

12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha

primera solucion de dilucion es dextrano 40 al 5,0%. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha

primera solucion de dilucion es dextrano 40 al 5,5%. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha

segunda solucion de dilucion es dextrano 40 al 10%.

En otras realizaciones, dichas primera y/o segunda soluciones de dilucion pueden comprender un polisacarido ademas de o distinto, es dedr, en lugar de, dextrano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, dichas primera y/o segunda soluciones de dilucion comprenden maltodextrano (p. ej., maltodextrina a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75 %, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%), trehalosa (p. ej., trehalosa a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25 %, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%), o hetalmidon (p. ej., hetalmidon a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%,

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En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA de aproximadamente 1 a 17%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16% o 17%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA de aproximadamente 4 a 10%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA a aproximadamente 3,125%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA a aproximadamente 5%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA a aproximadamente 10%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA a aproximadamente 16,875%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA de aproximadamente 1 a 17%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16% o 17%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA de 4 a 10%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA a aproximadamente 3,125%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA a aproximadamente 5%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA a aproximadamente 10%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera dilucion es HSA a aproximadamente 16,875%.

En otras realizaciones, se puede utilizar albumina de suero bovino (BSA) (p. ej., BSA a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%) o de suero bovino fetal (FBS) (p. ej., FBS a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%) adicionalmente de HSA en dicha solucion.

En algunas realizaciones, la razon de HSA con respecto a dextrano, p. ej., dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la primera solucion esta entre HSA:dextrano aproximadamente 6:1 y HSA:dextrano aproximadamente 1:2,6. En algunas realizaciones, la razon de HSA con respecto a dextrano es de HSA:dextrano de aproximadamente 6:1, 5,5:1, 5:1, 4,5:1, 4:1, 3,5:1, 3:1, 2,5:1, 2,0:1, 1,5:1, 1:1, 1:1,5, 1:2 o 1:2,6. En algunas realizaciones, la razon de HSA con respecto a dextrano, p. ej., dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la primera solucion es de aproximadamente HSA al 3,13%/dextrano al 8,25%. En algunas realizaciones, la razon de HSA con respecto a dextrano, p. ej., dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la primera solucion es de aproximadamente HSA al 16,88%/dextrano al 2,75%. En realizaciones concretas, la razon de HSA con respecto a dextrano, p. ej., dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la primera solucion es de aproximadamente hSa al 10%/dextrano al 5,5%, p. ej., dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70.

En otra realizacion espedfica, dicha solucion en la etapa (a) o una solucion que contiene celulas comprende un crioprotector. En una realizacion mas espedfica, dicho crioprotector es dimetilsulfoxido (DMSO). En una realizacion particular, la solucion expuesta en la etapa (a) comprende DMSO de aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 2,5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 2,5% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 10% o de aproximadamente 10% a aproximadamente 15%. En una realizacion particular, la solucion expuesta en la etapa (a) comprende DMSO a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%. En una realizacion particular, la solucion expuesta en la etapa (a) comprende DMSO a aproximadamente 5%. En otra realizacion espedfica, dicha primera solucion de dilucion comprende adicionalmente un crioprotector. En una realizacion mas espedfica, dicho crioprotector es dimetilsulfoxido (DMSO). En una realizacion particular, dicha primera solucion de dilucion comprende adicionalmente DMSO de aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 2,5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 2,5% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 10% o de aproximadamente 10% a aproximadamente 15%. En una realizacion particular, dicha primera solucion de dilucion comprende adicionalmente DMSO a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%. En una realizacion particular, dicha primera solucion de dilucion comprende adicionalmente DMSO a aproximadamente 5%.

En una realizacion espedfica, dicha primera solucion de dilucion comprende dextrano 40 a aproximadamente 5,5%, HSA a aproximadamente 10%, y DMSo a aproximadamente 5%.

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En una realizacion particular, el metodo de la invencion produce una composicion que comprende de 1,0 ± 0,3 x 106 a 50 ± 1,5 x 106 celulas por mililitro y dextrano a aproximadamente 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, o 9,0%, p. ej., dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70. En general, dicho procedimiento produce una composicion que comprende celulas y dextrano de aproximadamente 7,5% a aproximadamente 9%, por ejemplo, dextrano 40. En otra realizacion espedfica, dicho metodo produce una composicion que comprende de aproximadamente 1,5 x 106 celulas por mililitro a aproximadamente 3,75 x 106 celulas por mililitro. Por lo tanto, de acuerdo con la invencion, el metodo produce una composicion que comprende de aproximadamente 1,0 ± 0,3 x 106 celulas por mililitro a aproximadamente 5,0 ± 1,5 x 106 celulas por mililitro. En otras realizaciones espedficas, el metodo produce una composicion que comprende entre aproximadamente 1,0 x 106 celulas por mililitro y 6,5 x 10 6 celulas por mililitro, p. ej., entre aproximadamente 1,3 x 106 celulas por mililitro y aproximadamente 6,5 x 106 celulas por mililitro. En otra realizacion espedfica, dicho metodo produce una composicion que comprende HSA de aproximadamente 1% a aproximadamente 15%. En otra realizacion espedfica, dicho metodo produce una composicion que comprende HSA a aproximadamente 1% a HSA a aproximadamente 10%.

Ademas se proporciona en la presente memoria un metodo de elaboracion de una composicion, que comprende: (a) filtrar una pluralidad de celulas en una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5% y HSA al 10% a traves de un filtro de 70 pM - 100 pM para formar una solucion que contiene celulas filtradas; (b) si dicha solucion que contiene celulas comprende mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro diluir la solucion que contiene celulas filtradas con dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10%, y DMSO al 5% a aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro; (c) crioconservar las celulas; (d) descongelar las celulas; y (e) diluir la solucion que contiene celulas filtradas con dextrano 40 al 10% para producir dicha composicion. En algunas realizaciones, la etapa (b) se realiza cuando la solucion que contiene celulas filtradas en (a) comprende mas de aproximadamente 15 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (b) es a aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En algunas realizaciones, la etapa (b) se realiza cuando la solucion que contiene celulas filtradas en (a) comprende mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (b) es de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En algunas realizaciones, la etapa (b) se realiza cuando la solucion que contiene celulas filtradas en (a) comprende mas de aproximadamente 7,5 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (b) es de aproximadamente 7,5 x 106 celulas por mililitro. En algunas realizaciones, la etapa (e) comprende diluir la solucion que contiene celulas filtradas de 1:1 a 1:5 (v/v) con dextrano 40 al 10%. En algunas realizaciones, la etapa (e) comprende diluir la solucion que contiene celulas filtradas de 1:1 a 1:11 (v/v) con dextrano 40 al 10%. En una realizacion mas espedfica, la solucion que contiene celulas de la etapa (a) comprende, adicionalmente, un crioprotector, p. ej., DMSO, p. ej., DMSO de aproximadamente 2% a aproximadamente 15%. En una realizacion particular, la solucion expuesta en la etapa (a) comprende, adicionalmente, DMSO a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12 %, 13%, 14% o 15%. En una realizacion particular, la solucion expuesta en la etapa (a) comprende, adicionalmente, DMSO a aproximadamente 5%. En el metodo de la invencion, el filtro en la etapa (a) es un filtro 70 pM a 100 pM.

En otra realizacion, se proporciona en la presente memoria un metodo de elaboracion de una composicion, que comprende: (a) centrifugar una pluralidad de celulas para recoger las celulas; (b) resuspender las celulas en dextrano 40 al 5,5%; (c) centrifugar las celulas para recoger las celulas; (d) resuspender las celulas en una solucion de dextrano 40 al 5,5% que comprende HSA al 10% para producir una solucion que contiene celulas; (e) filtrar la solucion que contiene celulas a traves de un filtro de 70 pM a 100 pM para producir una solucion que contiene celulas filtradas; (f) si dicha solucion que contiene celulas comprende mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, diluir la solucion que contiene celulas filtradas en dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10%, y un crioprotector, p. ej., DMSO, p. ej., DMSO al 5% a aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro; (g) crioconservar las celulas; (h) descongelar las celulas; e (i) diluir la solucion que contiene las celulas de 1:1 a 1:11 (v/v) con dextrano 40 al 10% para producir dicha composicion. En algunas realizaciones, la etapa (f) se realiza cuando la solucion que contiene celulas filtradas en (e) comprende mas de aproximadamente 15 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (f) es de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En realizaciones particulares, la etapa (f) se realiza cuando la solucion que contiene celulas filtradas en (e) comprende mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, en donde dilucion en la etapa (f) es de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En algunas realizaciones, la etapa (e) se lleva a cabo cuando la solucion que contiene celulas filtradas en (e) comprende mas de aproximadamente 7,5 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (f) es de aproximadamente 7,5 x 106 celulas por mililitro. Asimismo, en una realizacion particular, si la resuspension expuesta en la etapa (d) diera como resultado una solucion que contuviera celulas que comprendiera menos de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, la solucion expuesta en la etapa (d) comprendena un crioprotector, p. ej., DMSO, p. ej., DMSO de aproximadamente 2% a aproximadamente 15%. En el metodo de la invencion, el filtro en la etapa (e) es un filtro de 70 pM a 100 pM.

Tambien se proporciona en la presente memoria un metodo de elaboracion de una composicion, que comprende: (a) filtrar una solucion que comprende celulas de la placenta aisladas, dextrano 40 al 5,5% y albumina de suero humano al 10% (HSA) con un filtro de 70 pM a 100 pM que elimina cumulos de celulas visibles para producir una solucion que contiene celulas de la placenta aisladas filtradas; (b) diluir dicha dilucion que contiene celulas de placenta aisladas filtradas con una cantidad de una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10% y dimetilsulfoxido al 5% (DMSO) suficiente para llevar dicha solucion que contiene celulas de la placenta aisladas filtradas a aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro; y (c) diluir dicha solucion que contiene celulas de la

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placenta aisladas filtradas con dextrano 40 al 10% para producir dicha composicion. En algunas realizaciones, la etapa (b) se realiza cuando la solucion que contiene celulas filtradas en (a) comprende mas de aproximadamente 15 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (b) es de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En realizaciones particulares, la etapa (b) se realiza cuando la solucion que contiene celulas filtradas en (a) comprende mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (b) es de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En algunas realizaciones, la etapa (b) se realiza cuando la solucion que contiene celulas filtradas en (a) comprende mas de aproximadamente 7,5 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (b) es de aproximadamente 7,5 x 106 celulas por mililitro. En algunas realizaciones, la etapa (c) comprende diluir dicha solucion que contiene celulas de la placenta aisladas filtradas con dextrano 40 al 10% a una razon de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:11 de solucion que contiene celulas de la placenta aisladas: dextrano 40 (v/v). En algunas realizaciones, la etapa (c) comprende diluir dicha solucion que contiene celulas de la placenta aisladas filtradas con dextrano 40 al 10% a una razon de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:5 de solucion que contiene celulas de la placenta aisladas:dextrano 40 (v/v). En una realizacion espedfica, dicho filtro es un filtro de 70 pM. En otra realizacion espedfica, dicho filtro es un filtro de 100 pM. En el metodo de la invencion, el filtro en la etapa (a) es un filtro de 70 pM a 100 pM.

En una realizacion espedfica de cualquiera de los metodos anteriores, la composicion es una composicion farmaceutica.

En otra realizacion espedfica de cualquiera de los metodos anteriores, el metodo comprende adicionalmente la concentracion de la composicion de celulas resultante a aproximadamente 5 x 106 celulas por mililitro a 1 x 108 celulas por mililitro. Tal composicion es util, por ejemplo, para la administracion subcutanea de la composicion a un individuo que lo necesite.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente memoria composiciones, p. ej., composiciones farmaceuticas que comprenden celulas, p. ej., celulas madre, celulas de la placenta aisladas, p. ej., celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta, obtenidas por medio de cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria. En una realizacion, se proporciona en la presente memoria una composicion, p. ej., una solucion, que comprende una pluralidad de celulas, p. ej., celulas madre, celulas de la placenta aisladas, por ejemplo, celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta, en donde dicha composicion comprende entre aproximadamente 1,0 ± 0,3 x 106 celulas por mililitro a aproximadamente 5,0 ± 1,5 x 106 celulas por mililitro, y en donde dicha composicion no comprende cumulos visibles de celulas (es dedr, no hay macro-cumulos de celulas), o sustancialmente ninguno de tales cumulos visibles. En otras ciertas realizaciones, la composicion comprende entre aproximadamente 1,0 x 106 celulas por mililitro y 6,5 x 106 celulas por mililitro, p. ej., entre aproximadamente 1,3 x 106 celulas por mililitro y aproximadamente 6,5 x 106 celulas por mililitro.

En algunas realizaciones, las composiciones anteriores comprenden dextrano a aproximadamente 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%, p. ej., dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70. En una realizacion espedfica, dicha composicion comprende dextrano 40 de aproximadamente 7,5% a aproximadamente 9%. En una realizacion espedfica, dicha composicion comprende dextrano 40 a aproximadamente 5,5%.

En otras realizaciones, dicha composicion comprende un polisacarido ademas de o distinto de, es decir, en lugar de, dextrano. En ciertas realizaciones, el polisacarido es un polfmero de glucosa que no comprende subunidades de sacarido distintas de glucosa. En otras realizaciones, dicha composicion comprende maltodextrina (p. ej., maltodextrina a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%,

9,25%, 9,5 %, 9,75%, o 10%), trehalosa (p. ej., trehalosa a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%,

3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25 %, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%,

7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%), o hetalmidon (p. ej., hetalmidon a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25 %, 9,5%, 9,75%, o 10%). En otras realizaciones, dicha composicion comprende sacarosa (p. ej., sacarosa a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75 %, o 10%), heparina (p. ej., heparina de 55 USP/ml), o glucogeno (p. ej., glucogeno a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%,

3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%,

7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75 %, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%). En una realizacion particular, dicha composicion comprende maltodextrano ademas de o distinto de, es decir, en lugar de, dextrano. En otra realizacion particular, dicha composicion comprende trehalosa ademas de o en lugar de dextrano. En otra realizacion particular, dicha composicion comprende hetalmidon ademas de o en lugar de dextrano.

En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende HSA de aproximadamente 1% a aproximadamente 17%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende HSA a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, o aproximadamente 17%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende HSA a aproximadamente 3,125%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende HSA a aproximadamente 5%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende HSA a aproximadamente

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10%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende HSA a aproximadamente 16,875%.

En otras realizaciones, dicha composicion comprende albumina de suero bovino (BSA) (p. ej., BSA a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%) o suero bovino fetal (FBS) (p. ej., FBS a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%), adicionalmente de HSA.

En algunas realizaciones, dicha composicion comprende un crioprotector, p. ej., DMSO, p. ej., DMSO de aproximadamente 1% a aproximadamente 15%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende DMSO de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende DMSO de aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 2,5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 2,5% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 10% o de aproximadamente 10% a aproximadamente 15%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende DMSO a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%. En una realizacion particular, la composicion comprende DMSO a aproximadamente 5%.

En una realizacion espedfica, dichas celulas han sido crioconservadas y descongeladas. De acuerdo con la invencion, dichas celulas se han filtrado a traves de un filtro de 70 pM a 100 pM. En otra realizacion espedfica, dicha composicion no comprende macro-cumulos de celulas, en donde los macro-cumulos de celulas comprenden una agregacion de celulas mayor de aproximadamente 150 pm. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende menos de aproximadamente 200 cumulos de celulas por cada 106 celulas, en donde dichos cumulos de celulas solo son visibles bajo un microscopio, p. ej., un microscopio optico. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende menos de aproximadamente 150 cumulos de celulas por cada 106 celulas, en donde dichos cumulos de celulas solo son visibles bajo un microscopio, p. ej., un microscopio optico. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende menos de aproximadamente 100 cumulos de celulas por cada 106 celulas, en donde dichos cumulos de celulas solo son visibles bajo un microscopio, p. ej., un microscopio optico.

En una realizacion espedfica de cualquiera de los metodos o composiciones descritos en la presente memoria, las celulas son celulas madre, por ejemplo, celulas madre aisladas de una placenta despues del parto humano cuya sangre ha sido drenada. En ciertas realizaciones, se han ampliado tales celulas. En otra realizacion espedfica de cualquiera de las realizaciones anteriores, las celulas son celulas adherentes, es decir, las celulas que se adhieren a la superficie del cultivo de tejidos, p. ej., el plastico del cultivo de tejido (ya sea sin recubrir o recubierto, p. ej., con fibronectina, laminina, o similar). Los ejemplos de celulas adherentes incluyen, p. ej., las celulas madre adherentes de la placenta, como se describe en la presente memoria; celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, fibroblastos, o similares. En otra realizacion, las celulas son celulas humanas.

En otra realizacion, dichas celulas son celulas obtenidas a partir de (p. ej., aisladas de) lfquido perfundido de placenta. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas son celulas nucleadas, p. ej., celulas nucleadas totales, obtenidas a partir de lfquido perfundido de placenta. En ciertas realizaciones, se drena la sangre de la placenta de la que se obtienen por perfusion celulas de la placenta nucleadas totales y se perfunden para eliminar la sangre residual antes de la perfusion para recoger las celulas de la placenta nucleadas totales. En ciertas realizaciones, se drena la sangre de la placenta de la que se obtienen por perfusion celulas de la placenta nucleadas totales pero no se perfunde para eliminar la sangre residual antes de la perfusion para recoger celulas de la placenta nucleadas totales. En otras ciertas realizaciones, ni se drena la sangre de la placenta de la que se obtienen las celulas de la placenta nucleadas totales, ni se perfunde para eliminar la sangre residual antes de la perfusion para recoger las celulas de la placenta nucleadas totales. En otras ciertas realizaciones, ni se drena la sangre de la placenta de la que se obtienen las celulas de la placenta nucleadas totales por perfusion ni se perfunde para eliminar la sangre residual antes de la perfusion para recoger las celulas de la placenta nucleadas totales.

En otra realizacion espedfica del metodo, dichas celulas son celulas madre. En realizaciones mas espedficas, las celulas madre son celulas madre adultas, celulas madre somaticas, celulas madre embrionarias, celulas germinales embrionarias, celulas madre de cordon umbilical, celulas madre de lfquido amniotico, celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, celulas madre mesenquimales derivadas de la sangre de cordon, celulas madre mesenquimales derivadas de sangre periferica, celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo o celulas madre mesenquimales derivadas de periostio. En otra realizacion, dichas celulas son celulas asesinas naturales.

En otra realizacion espedfica, dichas celulas son celulas de la placenta aisladas. En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son celulas madre de la placenta aisladas. En otras ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son celulas pluripotentes de la placenta aisladas.

En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son celulas madre de la placenta aisladas. En otras ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son celulas pluripotentes placentarias aisladas. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD34-, CD10+ y CD105+ segun se detecta por citometna de flujo. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta aisladas CD34-, CD10+, CD105+ son celulas madre de la placenta. En otra realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son celulas de la placenta pluripotentes. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD34-,

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CD10+, CD105+ aisladas tienen el potencial de diferenciarse en celulas de un fenotipo neural, celulas de un fenotipo osteogenico, o celulas de un fenotipo condrogenico. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son adicionalmente CD200+. En otra realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son adicionalmente CD90+ o CD45-, segun se detecta por citometna de flujo. En otra realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son adicionalmente CD90+ o CD45-, segun se detecta por citometna de flujo. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ o CD45-, segun se detecta por citometna de flujo. En otra realizacion mas espedfica, las celulas CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ son, adicionalmente, CD90+ y CD45-, segun se detecta por citometna de flujo. En otra realizacion mas espedfica, las celulas CD34-, CD10+, CD105+, CD200+, CD90+, CD45- son, adicionalmente, CD80- y CD86-, segun se detecta por citometna de flujo.

En una realizacion mas espedfica, las celulas CD34-, CD10+, CD105+ son, adicionalmente, uno o mas de CD29+, CD38-, CD44+, CD54+, CD80-, CD86-, SH3+ o SH4+. En otra realizacion mas espedfica, las celulas son adicionalmente CD44+. En otra realizacion espedfica de cualquiera de las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas anteriores, las celulas son, adicionalmente, una o mas de CD117-, CD133-, KDR- (VEGFR2-), HLA- A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR-, y/o ligando de muerte programada-1 (PDL1)+.

En otras realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+ y CD200+; CD200+ y OCT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta que comprende dichas celulas de la placenta aisladas cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; u OCT-4+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta, que comprende las celulas de la placenta aisladas cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide; o cualquier combinacion de las mismas. En una realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD200+, HLA-G+ son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ y CD200+ son CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ y HLA-G+ son CD34-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+ y CD105+ son OCT-4+, CD34-, CD38- y CD45". En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta son Cd73+, CD105+, CD200+, CD34", CD38- y CD45-.

En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son uno o mas de CD10+, CD29+, CD34", CD38 ", CD44+, CD45", CD54+, CD80-, CD86-, CD90+, CD117-, CD133-, CD200+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+,

MHC-I+, KDR-(VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR-, PDL1+o ABC-p+, donde ABC-p es una protema transportadora ABC espedfica de la placenta (tambien conocida como protema de resistencia al cancer de mama (BCRP) y como protema de resistencia a mitoxantrona (MXR)). En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4- y OCT-4+. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD45-, CD54+, Sh2+, SH3+, y SH4+. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD45-, CD54+, SH2+, SH3+, SH4+y OCT-4+. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, HLA-1+, SH2+, SH3+, SH4+. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+ y ABC-p+. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas son SH2+, SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+, CD34-, SSEA3-, y SSEA4-. En una realizacion espedfica, dichas celulas OCT-4+, CD34^ SSEA3-, y SSEA4- son, adicionalmente, CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, y SH4+. En otra realizacion, las celulas de la

placenta aisladas son OCT-4+ y CD34-, y SH3+ o SH4+. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas son CD34- y, CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+, u OCT-4+. En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son CD10+, CD34-, CD105+y CD200+.

En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas utiles en los metodos de tratamiento descritos en la presente memoria son uno o mas de CD10+, CD29-, CD44+, CD45-, CD54/ICAM-, CD62-E-, CD62-L- CD62-P-, CD80-, CD86-, CD103-, CD104-, CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-cadherinabaja, CD184/CXCR4-, p2-microglobulinabaja, MHC- Ibaja, MHC-II-, HLA-Gbaja, y/o PDL1baja. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son al menos CD29- y CD54-. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son, al menos, CD44+ y CD106+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son al menos CD29+.

En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas expresan uno o mas genes a un nivel detectable mayor que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dichos uno o mas genes son uno o mas de ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A, y en donde dichas celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea han sido sometidas a numerosos pases en cultivo equivalentes al numero de pases al que se han sometido dichas celulas de la placenta aisladas. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas expresan dichos uno o mas genes cuando se

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cultivan durante aproximadamente 3 a aproximadamente 35 duplicaciones de la poblacion en un medio que comprende Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)-LG al 60% (preferiblemente de Gibco) y MCDB-201 al 40% (preferiblemente de Sigma); suero de ternera fetal al 2% (preferiblemente de Hyclone Labs.); 1x insulina- transferrina-selenio (ITS); 1X acido linoleico-albumina de suero bovino (LA-BSA); dexametasona 10"9 M (preferiblemente de Sigma); acido ascorbico - 2-fosfato 10-4 M(preferiblemente de Sigma); factor de crecimiento epidermico de 10 ng/ml (preferiblemente de R & D Systems); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF- BB) 10 ng/ml (preferiblemente de R & D Systems). En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas expresan dichos uno o mas genes cuando se cultivan durante aproximadamente 3 a aproximadamente 35 duplicaciones de la poblacion en un medio que comprende DMEM-LG al 60% (preferiblemente de Gibco) y MCDB- 201 al 40% (preferiblemente de Sigma); suero de ternera fetal al 2% (preferiblemente de Hyclone Labs.); 1x insulina- transferrina-selenio (ITS); 1x acido linoleico - albumina de suero bovino (LA-BSA); dexametasona 10-9 M (preferiblemente de Sigma); acido ascorbico - 2-fosfato 10-4 M (preferiblemente de Sigma); factor de crecimiento epidermico de 10 ng/ml (preferentemente de R & D Systems); y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) de 10 ng/ml (preferiblemente de R & D Systems).

En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre de la placenta expresan factores de crecimiento neurotroficos (GDNF) derivados de celulas gliales, factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento placentario (PGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas estan contenidas dentro de una poblacion de celulas, de las cuales al menos 50% son dichas celulas de la placenta aisladas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas estan contenidas dentro de una poblacion de celulas, de las cuales al menos 70% son dichas celulas de la placenta aisladas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas estan contenidas dentro de una poblacion de celulas, de las cuales al menos 80% son dichas celulas de la placenta aisladas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas estan contenidas dentro de una poblacion de celulas, de las cuales al menos 90% son dichas celulas de la placenta aisladas. En otras ciertas realizaciones, las celulas de la placenta en dicha poblacion de celulas estan sustancialmente libres de celulas que tienen un genotipo materno; p. ej., al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las celulas de la placenta en dicha poblacion tienen un genotipo fetal, es decir, son de origen fetal. En otras ciertas realizaciones, la poblacion de celulas que comprende dichas celulas de la placenta estan sustancialmente libres de celulas que tienen un genotipo materno; p. ej., al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las celulas en dicha poblacion tiene un genotipo fetal, es decir, son de origen fetal.

En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son celulas de la placenta CD34+, p. ej., celulas hematopoyeticas de la placenta. Tales celulas se pueden obtener a partir de tejido de la placenta, p. ej., a partir de una placenta cuya sangre del cordon se ha drenado y se ha perfundido para eliminar la sangre residual. En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta CD34+ son CD38+. En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta CD34+ son CD38-. En otras ciertas realizaciones, las celulas de la placenta CD34+ son CD45+. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta son CD34+, CD38'y CD45+.

En cualquiera de las realizaciones anteriores de celulas de la placenta aisladas, las celulas de la placenta aisladas generalmente no se diferencian durante el cultivo en medio de crecimiento, es decir, el medio formulado para promover la proliferacion, p. ej., durante la proliferacion en medio de crecimiento. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas no requieren una capa de alimentacion para proliferar. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas no se diferencian en el cultivo como el resultado del cultivo en ausencia de una capa de celulas de alimentacion.

En otra realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas se obtienen por perfusion de una placenta despues del parto cuya sangre se ha y se ha perfundido para eliminar la sangre residual; cuya sangre se ha drenado, pero no perfundido para eliminar sangre residual; o cuya sangre ni se ha drenado, ni se ha perfundido para eliminar sangre residual. En otra realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas se obtienen por rotura ffsica y/o enzimatica de tejido de la placenta.

En ciertas realizaciones del metodo anterior, las celulas de la placenta aisladas se filtran y se crioconservan como parte de la construccion de un banco de celulas de la placenta. Por ejemplo, las celulas de la placenta aisladas se afslan a partir de una placenta, o tejido de la placenta, y, despues del cultivo, se resuspenden en una solucion que comprende, p. ej., dextrano, p. ej., dextrano 40, p. ej., dextrano 40 al 5,5%. En realizaciones mas espedficas, la solucion comprende adicionalmente HSA y/o DMSO, en preparacion para la crioconservacion. Las celulas de la placenta aisladas crioconservadas en el banco, segun sea necesario, se descongelan y se diluyen, p. ej., con una solucion que comprende dextrano 40 al 10%, como se describe en la presente memoria. En ciertas realizaciones del metodo, el metodo de filtracion y dilucion descrito en la presente memoria no es una parte del aislamiento inicial de las celulas de la placenta aisladas.

En ciertas realizaciones, dichas celulas de la placenta aisladas se obtienen por perfusion de la placenta despues del parto cuya sangre se ha drenado y perfundido para eliminar la sangre residual. En otra realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas se obtienen por rotura ffsica y/o enzimatica de tejido de la placenta.

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4. Breve descripcion de las figuras

La FIG. 1 presenta un diagrama ternario que muestra un espacio de la solucion de HSA, dextrano 40 y DMSO y el diseno experimental para evaluar el efecto de la variacion de la concentracion de los componentes en la viabilidad y proliferacion celular.

La FIG. 2 presenta los datos del Analisis de Retencion en Filtro (FRA) para formulaciones que comprenden diferentes porcentajes de DMSO. Los datos se expresan en pfxeles por millon de celulas cargadas (px/MM) ^dos en un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell. Control del analisis = solucion de dextrano 40 al 100%, con colorante

celular, sin celulas.

La FIG. 3 presenta los datos de FRA para formulaciones celulares que comprenden diferentes fracciones en volumen de HSA. Los datos se expresan en pfxeles por millon de celulas cargadas (px/MM) lefdos en un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell. Control del analisis = solucion de dextrano 40 al l00%, con colorante celular, sin

celulas.

La FIG. 4 presenta la viabilidad en azul de tripan despues de la descongelacion para formulaciones celulares que comprenden diferentes porcentajes de DMSO (0-20%).

La FIG. 5 presenta la recuperacion celular total despues de la descongelacion como una funcion de las concentraciones variables de DMSO (0-20%).

FIG. 6: Restablecimiento del cultivo como una funcion de las formulaciones variables que comprenden diferentes porcentajes de DMSO, segun se evaluo por medio del analisis MTS (vease la Seccion 6.3.1, a continuacion).

La FIG. 7 presenta la viabilidad celular despues de la descongelacion de formulaciones celulares que comprenden diferentes fracciones en volumen de HSA al 25%.

La FIG. 8 presenta la recuperacion celular total despues de la descongelacion como una funcion de la fraccion en volumen de HSA.

La FIG. 9 presenta datos que evaluan el restablecimiento del cultivo como una funcion de las diferentes fracciones de HSA, generadas a traves del uso de Cell Titer 96® Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, Wisconsin).

FIG. 10: Niveles de inmunosupresion, evaluados por medio de Analisis de Reaccion con Esferas (Bead Reaction Assay) para formulaciones que comprenden diferentes concentraciones de componentes de formulacion.

FIG. 11: Agregacion celular como una funcion de la variacion de las densidades variables de celulas en congelacion (1-40 x 10° celulas/ml), segun se determina por medio del analisis FRA. Los datos se expresan en pfxeles por millon de celulas cargadas (px/MM) lefdos en un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell.

FIG. 12 Agregacion celular como una funcion de densidades de celulas en congelacion (1-40 millones de celulas/ml). Los datos se expresan en pfxeles por millon de celulas cargadas (px/MM) lefdos en un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell.

FIG. 13: Agregacion celular como una funcion de los pesos moleculares variables de dextrano, segun se determina por medio del analisis FRA. Equivalente de la senal FRA en dextrano 1.000, 40.000 y 70.000 (es decir, dextrano 1, dextrano 40 y dextrano 70, respectivamente). Los datos se expresan en pfxeles por millon de celulas cargadas (px/MM). Control de analisis = solucion de dextrano 40 al 100%, con colorante celular, sin celulas.

La FIG. 14 presenta la viabilidad despues de la descongelacion a traves de formulaciones que comprenden diferentes pesos moleculares de dextrano.

La FIG. 15 presenta la recuperacion de celulas a traves de formulaciones que comprenden diferentes pesos moleculares de dextrano.

La FIG. 16 presenta CD105+/CD200+ a traves de formulaciones que comprenden diferentes pesos moleculares de dextrano.

La FIG. 17 presenta datos de cuentas de reaccion de celulas T en esferas (BTR) a traves de formulaciones que comprenden diferentes pesos moleculares de dextrano.

La FIG. 18 presenta la agregacion celular medida por FRA a traves de formulaciones que comprenden diferentes polisacaridos. Control de analisis = solucion de dextrano 40 al 100%, con colorante celular, sin celulas.

La FIG. 19 presenta la viabilidad despues de la descongelacion de las celulas formuladas con polisacaridos distintos de dextrano 40. Los datos se expresan en pfxeles por millon de celulas cargadas (px/MM).

FIG. 20: Recuperacion de celulas viables como una funcion de las formulaciones que comprenden diferentes

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polisacaridos.

La FIG. 21 presenta la expresion de CD105+/CD200+ en formulaciones celulares que comprenden dextrano 40, o maltodextrano, sacarosa, trehalosa, heparina, hetalmidon o glucogeno en lugar de dextrano 40.

La FIG. 22 presenta los datos de BTR para dextrano 40 y seis azucares/polisacaridos distintos de dextrano 40 diferentes.

La FIG. 23 presenta la agregacion celular medida por FRA a traves de formulaciones que comprenden albumina de suero humano (HSA) al 10%, albumina de suero bovino (BSA) al 10% o suero bovino fetal al l0% (FBS). Control de analisis = solucion de dextrano 40 al 100%, con colorante celular, sin celulas.

FIG. 24: Viabilidad celular despues de la descongelacion a traves de formulaciones que comprenden HSA al 10%, BSA al 10% o FBS al 10%.

La FIG. 25 presenta la recuperacion despues de la descongelacion a traves de formulaciones que comprenden HSA al 10%, HSA al 4%, BSA al 10% o FBS al 10%.

La FIG. 26 presenta la identidad celular medida por medio de la expresion de CD105+/CD200+ a traves de formulaciones que comprenden HSA al 10%, HSA al 4%, BSA al 10% o fBs al 10%.

La FIG. 27 presenta la expresion de CD34-/CD10+ a traves de formulaciones que comprenden HSA al 10%, BSA al 10% o FBS al 10%.

La FIG. 28 presenta la funcionalidad celular medida por medio del analisis BTR a traves de formulaciones que comprenden HSA al 10%, HSA al 4%, BSA al 10% o FBS al 10%.

La FIG. 29 presenta los resultados de la agregacion celular FRA de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea (BMMSC) y celulas asesinas naturales (NK). Los datos se expresan en pfxeles por millon de celulas cargadas (px/MM).

5. Descripcion detallada

5.1 Definiciones

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "aproximadamente" significa, p. ej., dentro del 10% de una cifra o valor indicados.

Segun se utiliza en la presente memoria, "macro-cumulo de celulas" significa una agregacion de celulas visible sin aumento, p. ej., visible a simple vista, y en general se refiere a una agregacion de celulas mayor de aproximadamente 150 micras.

Segun se utiliza en la presente memoria, "micro-cumulo de celulas" significa una agregacion de celulas visible solo con aumento, y en general se refiere a una agregacion de celulas menor de aproximadamente 150 micras.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "SH2" se refiere a un anticuerpo que se une a un epttopo en el marcador CD105. Por lo tanto, las celulas que se refieren como SH2+ son CD105+.

Segun se utilizan en la presente memoria, los terminos "SH3" y SH4 "se refieren a anticuerpos que se unen a epftopos presentes en el marcador CD73. Por lo tanto, las celulas que se refieren como SH3+ y/o SH4+ son CD73+.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "celula aislada", p. ej., "celula madre aislada", significa una celula que esta separada sustancialmente de otras celulas del tejido, p. ej., la placenta, del que deriva la celula. Una celula esta "aislada" si al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o al menos 99% de las celulas con las que la celula se asocia de forma natural, se elimina de la celula, p. ej., durante la recogida y/o cultivo de la celula.

Segun se utiliza en la presente memoria, "pluripotente", cuando se refiere a una celula, significa que la celula tiene la capacidad de diferenciarse en algunos, pero no necesariamente todos, los tipos de celulas del organismo, o en celulas que tienen caractensticas de algunos, pero no todos, los tipos de celulas del organismo. En ciertas realizaciones, por ejemplo, una celula pluripotente aislada que tiene la capacidad de diferenciarse en cualquiera de las celulas que tienen las caractensticas de las celulas condrogenicas u osteogenicas es una celula pluripotente.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "poblacion de celulas aisladas" significa una poblacion de celulas que se separa sustancialmente de otras celulas de un tejido, p. ej., la placenta, del cual deriva la poblacion de celulas.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "celula madre de la placenta" se refiere a una celula madre o celulas progenitora que deriva de una placenta de mairnfero, independientemente de la morfologfa, los marcadores de superficie celular, o el numero de pases despues de un cultivo primario. Una celula madre de la placenta no se obtiene, y no se puede obtener, de sangre, p. ej., sangre del cordon umbilical o sangre de placenta. Los terminos

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"celulas madre de la placenta" y "celulas pluripotentes de la placenta", segun se utilizan en la presente memoria, sin embargo, no se refieren a, y las celulas madre de la placenta y las celulas pluripotentes de la placenta no son, trofoblastos, angioblastos, hemangioblastos, celulas germinales embrionarias, celulas madre embrionarias, o celulas obtenidas de la masa celular interna de un blastocisto, una celula obtenida de una cresta gonadal embrionaria, p. ej., una celula germinal embrionaria. Una celula se considera una "celula madre" si la celula muestra atributos de una celula madre, p. ej., un marcador o perfil de expresion de genes asociados con uno o mas tipos de celulas madre; la capacidad para replicar por lo menos 10-40 veces en cultivo, la capacidad para diferenciarse en celulas de una o mas de las tres capas germinales; la falta de caractensticas de las celulas adultas (es decir, diferenciadas), o similares. Los terminos "celulas madre de la placenta" y "celulas madre derivadas de la placenta" se pueden utilizar indistintamente. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, el termino "de la placenta" incluye el cordon umbilical. Las celulas madre de la placenta descritas en la presente memoria, en ciertas realizaciones, se diferencian in vitro (en condiciones de diferenciacion), se diferencian in vivo, o ambas.

Segun se utiliza en la presente memoria, una celula, p. ej., una celula madre, es "positiva" para un marcador particular, cuando ese marcador es detectable por encima del fondo. Por ejemplo, una celula madre de la placenta es positiva, p. ej., para CD73 porque CD73 es detectable en las celulas madre de la placenta en una cantidad detectablemente mayor que el fondo (en comparacion, p. ej., con un control de isotipo). Una celula tambien es positiva para un marcador cuando ese marcador se puede utilizar para distinguir la celula de al menos otro tipo de celulas, o se puede utilizar para seleccionar o aislar la celula cuando esta presente o es expresado por la celula. En el contexto, p. ej., de la deteccion mediada por anticuerpos, "positivo", como una indicacion de que un marcador de la superficie celular particular esta presente, significa que el marcador es detectable utilizando un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo marcado fluorescentemente, espedfico para ese marcador; "positivo" tambien se refiere a una celula que presenta ese marcador en una cantidad que produce una senal, p. ej., en un citometro, que esta detectablemente por encima del fondo. Por ejemplo, una celula es "CD200+" cuando la celula esta marcada de manera detectable con un anticuerpo espedfico para CD200, y la senal del anticuerpo es detectablemente mas alta que la de un control (p. ej., el fondo o un control de isotipo). A la inversa, "negativo" en el mismo contexto significa que el marcador de la superficie celular no es detectable utilizando un anticuerpo espedfico para ese marcador en comparacion con el fondo. Por ejemplo, una celula es "CD34-", cuando la celula no esta marcada de forma detectable reproduciblemente con un anticuerpo espedfico para CD34 en un grado mayor que un control (p. ej., el fondo o un control de isotipo). Se determina que los marcadores no detectados, o no detectables, utilizando anticuerpos son positivos o negativos de una manera similar, utilizando un control apropiado. Por ejemplo, se puede determinar que una celula o poblacion de celulas son OCT-4+ si la cantidad de ARN de OCT-4 detectada en el ARN de la celula o poblacion de celulas es detectablemente mayor que el fondo segun se determina, p. ej., mediante un metodo de deteccion de ARN, tal como RT-PCR, transferencias de ranura, etc. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, los cumulos de diferenciacion ("CD") marcadores se detectan utilizando anticuerpos. Se puede determinar si OCT-4 esta presente, y una celula es "OCT-4+", si el ARN de OCT-4 es detectable mediante RT-PCR.

5.2 Composiciones mejoradas que comprenden celulas y metodos de elaboracion de las composiciones

Se proporcionan en la presente memoria metodos mejorados de elaboracion de composiciones que comprenden celulas de mamffero, p. ej., celulas madre, p. ej., celulas madre de la placenta, y composiciones mejoradas, p. ej., composiciones farmaceuticas, producidas de este modo. Las composiciones, p. ej., composiciones administrables en forma lfquida, que comprenden las celulas son generalmente mejor toleradas por un destinatario, p. ej., cuando los cumulos de celulas, en particular los cumulos de celulas visibles a simple vista (es decir, macro-cumulos), se eliminan antes de la administracion de la composicion farmaceutica a un individuo. Los metodos de preparacion de las composiciones que comprenden las celulas, p. ej., celulas madre, tales como las celulas madre de una placenta despues del parto humano cuya sangre se ha drenado, las celulas de la placenta, como se describe en la presente memoria, dan como resultado composiciones que son sustancialmente mejor toleradas cuando se administran a un individuo.

Espedficamente, la presente invencion proporciona un metodo de elaboracion de una composicion que comprende celulas de marnffero, que comprende:

(a) poner en contacto dichas celulas con una solucion que comprende (1) de dextrano, maltodextrano,

trehalosa o hetalmidon; y (2) albumina de suero humano (HSA) para formar una solucion que contiene

celulas;

(b) filtrar la solucion que contiene celulas a traves de un filtro de 70 micrometros a 100 micrometros;

(c) si dicha solucion que contiene celulas comprende mas de 10 ± 3 x 10 6 celulas por mililitro, diluir dichas

celulas a no mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro con una primera solucion de dilucion que comprende

dextrano.

En una realizacion del metodo de la presente invencion, dichas celulas son crioconservadas tras la etapa (c). En otra realizacion, dicha solucion en la etapa (a) comprende HSA al 10% (p/v). En otra realizacion de la invencion, dicha primera dilucion comprende dextrano 40 al 5,5% (p/v). En una realizacion adicional mas, dicha primera solucion de

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dilucion comprende HSA al 10% (p/v). En otra realizacion, dicha solucion en la etapa (a) o dicha primera solucion de dilucion comprenden adicionalmente un crioprotector, preferiblemente en donde dicho crioprotector en dicha primera solucion de dilucion es DMSO. En una realizacion adicional, el metodo de la presente invencion comprende despues de la etapa (c), la etapa (d) de dilucion de la solucion que contiene celulas con una segunda solucion de dilucion que comprende dextrano, maltodextrano, trehalosa o hetalmidon pero no comprende HSA, con lo que se elabora una composicion que comprende celulas de mairnferos. En otra realizacion, dicha segunda solucion de dilucion comprende dextrano 40 al 5,5% o 10% (p/v). En una realizacion, dicho filtro es un filtro de 70 micrometros o un filtro de 100 micrometros. En una realizacion espedfica, dichas celulas de mamffero son celulas de la placenta adherentes humanas aisladas.

En una realizacion, el metodo de la presente invencion comprende:

(a) suspender una pluralidad de celulas de la placenta adherentes humanas aisladas en una solucion de dextrano 40 al 5,5% (p/v), albumina de suero humano (HSA) al 10% (p/v) para formar una solucion que contiene celulas;

(c) diluir la solucion que contiene celulas en dextrano 40 al 5,5% (p/v), HSA al 10% (p/v), y DMSO al 5% a no mas de 10 ± 3 x 10 6 celulas por mililitro;

(d) crioconservar las celulas;

(e) descongelar las celulas; y

(f) diluir opcionalmente la solucion que contiene las celulas de 1:1 a 1:11 con dextrano 40 al 10% (p/v) para producir dicha composicion.

En una realizacion adicional, el metodo de la presente invencion comprende:

(b) resuspender las celulas en dextrano 40 al 5,5% (p/v);

(c) centrifugar las celulas para recoger las celulas;

(d) resuspender las celulas en una solucion de dextrano 40 al 5,5% (p/v) que comprende albumina de suero humano (HSA) al 10% (p/v) para formar una solucion que contiene celulas;

(f) diluir la solucion que contiene celulas en dextrano 40 al 5,5% (p/v), HSA al 10% (p/v), y DMSO al 5% a no mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro;

(g) crioconservar las celulas;

(h) descongelar las celulas; y

(i) opcionalmente, diluir la solucion que contiene las celulas de 1:1 a 1:11 con dextrano 40 al 10% (p/v) para producir dicha composicion.

En una realizacion adicional mas, el metodo de la presente invencion comprende:

(c) diluir dichas celulas de la placenta adherentes humanas aisladas filtradas con una cantidad de una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5% (p/v), HSA al 10% (p/v) y dimetilsulfoxido (DMSO) al 5% suficiente para llevar dichas celulas de la placenta adherentes humanas aisladas filtradas a 10 ± 3 x 10 6 celulas por mililitro; y

(d) diluir dicha celulas de la placenta adherentes humanas aisladas con dextrano 40 al 10% (p/v) a una razon

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de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:11 celulas de la placenta adherentes humanas aisladas: dextrano 40 para producir dicha composicion.

En otra realizacion, el metodo de la presente invencion comprende:

(a) poner en contacto celulas de la placenta adherentes humanas aisladas con una solucion que comprende dextrano al 5,5% (p/v) y albumina de suero humano (HSA) al 10% (p/v);

en donde dicha composicion no comprende macro-cumulos de celulas, en donde un macro-cumulo de celulas comprende una agregacion de celulas mayor de aproximadamente 150 micrometros.

En una realizacion del metodo de la presente invencion, dichas celulas de la placenta adherentes humanas aisladas son CD10+, CD34- y CD105+; preferiblemente dichas celulas CD10+, CD34- y CD105+ son adicionalmente CD200+. En una realizacion adicional, dichas celulas CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+ son CD45- o CD90+. En una realizacion adicional mas, dichas celulas CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+ son CD45- y CD90+.

La presente invencion tambien se refiere a una composicion obtenible mediante los metodos de la presente invencion. En una realizacion, la composicion de la presente invencion comprende una pluralidad de celulas de la placenta adherentes humanas aisladas en una solucion que comprende dextrano 40 al 4-10% (p/v), en donde dicha composicion comprende entre 1,0 ± 0,3 x 106 celulas por mililitro y 5,0 ± 1,5 x 106 celulas por mililitro, y en donde dicha composicion no comprende macro-cumulos de celulas, en donde un macro-cumulo de celulas comprende una agregacion de celulas mayor de aproximadamente 150 micrometres. En otra realizacion, la composicion de la presente invencion comprende menos de aproximadamente 100 micro-cumulos de celulas por 106 celulas. En una realizacion adicional de la composicion de la presente invencion, las celulas de la placenta adherentes humanas aisladas son CD10+, CD34- y CD105+; preferiblemente dichas celulas CD10+, CD34- y CD105+ son adicionalmente CD200+. En una realizacion adicional de la composicion de la presente invencion, dichas celulas CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+ son CD45- o CD90+. En una realizacion adicional mas de la composicion de la presente invencion, dichas celulas CD10+, CD34', CD105+ y CD200+ son CD45' y CD90 +.

En una realizacion, se proporciona en la presente memoria un metodo de elaboracion de una composicion, que comprende filtrar una disolucion que comprende celulas (1) dextrano, maltodextrano, trehalosa o hetalmidon y (2) albumina de suero humano (HSA) a traves de un filtro de 70 jM a 100 |jM para producir una solucion que contiene celulas filtrada; diluir la solucion que contiene celulas filtrada con una primera solucion de dilucion que comprende dextrano a no mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, p. ej., antes de la crioconservacion; y, opcionalmente, diluir la solucion que contiene celulas filtrada resultante con una segunda solucion de dilucion que comprende dextrano pero no comprende HSA para producir dicha composicion. En otra realizacion, se proporciona en la presente memoria un metodo de elaboracion de una composicion, que comprende filtrar una solucion que comprende celulas (1) dextrano, maltodextrano, trehalosa o hetalmidon y (2) albumina de suero humano (HSA) a traves de un filtro de 70 jM a 100 jM para producir una solucion que contiene celulas filtrada; diluir la solucion que contiene celulas filtrada con una primera solucion de dilucion que comprende dextrano a no mas de aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro, p. ej., antes de la crioconservacion; y, opcionalmente, diluir la solucion que contiene celulas filtrada resultante con una segunda solucion de dilucion que comprende dextrano pero no comprende HSA para producir dicha composicion.

En una realizacion espedfica, las celulas de mairnfero son celulas madre. En una realizacion mas espedfica, las celulas madre son celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea o celulas madre adultas. En una realizacion espedfica, las celulas son celulas de la placenta aisladas. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta aisladas son celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta. En otra realizacion espedfica, las celulas son celulas de lfquido perfundido de la placenta, p. ej., celulas nucleadas de lfquido perfundido de la placenta. Los metodos para obtener celulas de lfquido perfundido de la placenta se describen en la Seccion 5.3.4, a continuacion.

En una realizacion espedfica, las celulas son crioconservadas entre dicha dilucion con una primera solucion de dilucion y dicha dilucion con dicha segunda solucion de dilucion. En otra realizacion espedfica, la primera solucion de dilucion comprende dextrano y HSA. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion es dextrano a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion o dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 1. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion y dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 1. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion o dicha segundo solucion de dilucion es dextrano 70. En otra realizacion espedfica, dicha primera solucion de dilucion y dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 70. En

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otra realizacion espedfica, el dextrano en dicha primera solucion de dilucion o dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 40. En otra realizacion espedfica, el dextrano en dicha primera solucion de dilucion y dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 40. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha primera solucion de dilucion es dextrano 40 de aproximadamente 2,5% a dextrano 40 a aproximadamente 10%. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha primera solucion de dilucion es dextrano 40 a aproximadamente 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5% 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% o 10%. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha primera solucion de dilucion es dextrano 40 a aproximadamente 5,5%.

En otras realizaciones, dichas primera y/o segunda soluciones de dilucion pueden comprender un polisacarido ademas de o distinto, es decir, en lugar de, dextrano. En ciertas realizaciones, el polisacarido es un polfmero (2 o mas subunidades) de glucosa, y no comprende subunidades de sacaridos que no sean de glucosa. En otras realizaciones, dichas primera y/o segunda soluciones de dilucion comprenden uno o mas de maltodextrina (p. ej., maltodextrina a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75 %, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%,

9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%), trehalosa (p. ej., trehalosa a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%,

7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%), o hetalmidon (p. ej., hetalmidon a

aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5 %, 4,75%, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%). En otras realizaciones, la primera y/o segunda soluciones de dilucion comprenden uno o mas de sacarosa (p. ej., sacarosa a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75 %, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%,

9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%), heparina (p. ej., heparina de aproximadamente 55 unidades USP/ml), o glucogeno (p.

ej., glucogeno a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5 %, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%,

5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%,

9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%). En una realizacion particular, dichas primera y/o segunda soluciones de dilucion comprenden maltodextrano ademas de o distinto, es decir, en lugar de, dextrano. En otra realizacion particular, dichas primera y/o segunda soluciones de dilucion comprenden trehalosa ademas de o distinto, es decir, en lugar de, dextrano. En otra realizacion particular, dichas primera y/o segunda soluciones de dilucion comprenden hetalmidon ademas de o distinto, es decir, en lugar de, dextrano.

En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA de aproximadamente 1 a 17%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16% o aproximadamente 17%. En otra realizacion espedfica, dicho HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA a aproximadamente 4 - 10%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA a aproximadamente 3,125%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA al 5%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA al 10%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA a aproximadamente 16,875%. En otra realizacion espedfica, dicha primera solucion de dilucion comprende HSA. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA a aproximadamente 1 a 17%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es hSa a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16% o 17%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA al 4 a 10%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA a aproximadamente 3,125%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA a aproximadamente 5%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA a aproximadamente 10%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera dilucion es HSA a aproximadamente 16,875%.

En otras realizaciones, se puede utilizar albumina de suero bovino (BSA) (p. ej., BSA a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%) o suero bovino fetal (FBS) (p. ej., FBS a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10 %, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%) ademas de HSA en dicha solucion.

En algunas realizaciones, la razon de HSA con respecto a dextrano, p. ej., dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la primera solucion esta entre aproximadamente HSA:dextrano 6:1 y HSA:dextrano aproximadamente 1:2,6. En algunas realizaciones, la razon de HSA con respecto a dextrano es HSA:dextrano de aproximadamente 6:1, 5,5:1, 5:1, 4,5:1, 4:1, 3,5:1, 3:1, 2,5:1, 2,0:1, 1,5:1, 1:1, 1:1,5, 1:2 o 1:2,6. En algunas realizaciones, la razon de HSA con respecto a dextrano, p. ej., dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la primera solucion es de aproximadamente HSA al 3,13%/dextrano al 8,25%. En algunas realizaciones, la razon de HSA con respecto a dextrano, p. ej., dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la primera solucion es de aproximadamente hSa al 16,88%/dextrano al 2,75%. En realizaciones particulares, la razon de HSA con respecto a dextrano, p. ej., dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70, en la primera solucion es de aproximadamente HSA al 10%/dextrano al 5,5%, p. ej., dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70.

En otra realizacion espedfica, dicha primera solucion de dilucion comprende adicionalmente un crioprotector. En una realizacion mas espedfica, dicho crioprotector es dimetilsulfoxido (DMSO). En una realizacion particular, dicha

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primera solucion de dilucion comprende adicionalmente DMSO de aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 2,5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 2,5% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 10% o de aproximadamente 10% a aproximadamente 15%. En una realizacion particular, dicha primera solucion de dilucion comprende adicionalmente DMSO a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%. En una realizacion particular, dicha primera solucion de dilucion comprende adicionalmente DMSO a aproximadamente 5%.

En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 40 a aproximadamente 10%. En otra realizacion espedfica, dicha composicion que comprende celulas comprende dextrano a aproximadamente 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5 %, 5,75%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5% 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% o 10%. En otra realizacion espedfica, dicha composicion que comprende celulas comprende dextrano de aproximadamente 7,5% a aproximadamente 9%. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende de aproximadamente 1,5 x 106 celulas por mililitro a aproximadamente 5,0 x 106 celulas por mililitro. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende de aproximadamente 1,0 ± 0,3 x 106 celulas por mililitro a aproximadamente 5,0 ± 1,5 x 106 celulas por mililitro. En una realizacion espedfica, dicha segunda solucion de dilucion no comprende HSA.

El dextrano utilizable en los metodos proporcionados en la presente memoria puede ser dextrano de peso molecular entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 150 kDa, p. ej., 1 kDa (dextrano 1), aproximadamente 40 kDa (dextrano 40) o aproximadamente 70 kDa (dextrano 70).

En otra realizacion espedfica, la solucion que comprende celulas comprende un crioprotector. Si la solucion que comprende celulas comprende menos de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, la primera etapa de dilucion se puede omitir, y, en ciertas realizaciones, la solucion en la que se suspenden las celulas puede comprender un crioconservante, p. ej., DMSO, p. ej., DMSO de aproximadamente 2% a aproximadamente 15%, p. ej., DMSO a aproximadamente 5%.

En otra realizacion, se proporciona en la presente memoria un metodo de elaboracion de una composicion, que comprende: (a) filtrar a traves de un filtro de 70 pM a 100 pM una solucion que comprende celulas, p. ej., celulas aisladas de la placenta, p. ej., celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta, o celulas aisladas de lfquido perfundido de la placenta, p. ej., celulas nucleadas totales aisladas a partir de lfquido perfundido de la placenta, dextrano y albumina de suero humano (HSA) para producir una solucion que contiene celulas filtrada; (b) si dicha solucion que contiene celulas comprende mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro diluir dicha solucion que contiene celulas filtrada a aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro con una primera solucion de dilucion que comprende dextrano; y (c) diluir opcionalmente la solucion que contiene celulas filtrada con una segunda solucion de dilucion que comprende dextrano pero no comprende HSA, elaborando de ese modo una composicion. En algunas realizaciones, la etapa (b) se lleva a cabo cuando la solucion que contiene celulas filtrada en (a) comprende mas de aproximadamente 15 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (b) es de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En algunas realizaciones, la etapa (b) se realiza cuando la solucion que contiene celulas filtrada en (a) comprende mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (b) es a aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En algunas realizaciones en las que dicha solucion que contiene celulas filtrada comprende menos de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, la dilucion en la etapa (b) se omite y la solucion en la etapa (a) comprende un crioprotector, p. ej., DMSO, p. ej., DMSO de aproximadamente 2% a aproximadamente 15%. En algunas realizaciones, la etapa

(b) se realiza cuando la solucion que contiene celulas filtrada en (a) comprende mas de aproximadamente 7,5 x 106 celulas por mililitro, en donde dicha dilucion en la etapa (b) es a aproximadamente 7,5 x 106 celulas por mililitro. En una realizacion espedfica del metodo, dichas celulas son crioconservadas antes de la etapa (c). En una realizacion espedfica del metodo, dichas celulas son crioconservadas antes de la etapa (c). En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion o dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 40. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion y dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 40. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha primera solucion de dilucion es dextrano 40 al 5,0%. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha primera solucion de dilucion es dextrano 40 al 5,5%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende celulas es de HSA a aproximadamente 1% a HSA a aproximadamente 15%. En otra realizacion espedfica, dicha primera solucion de dilucion comprende HSA. En una realizacion mas espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA al 5% o, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA al 10%. En otra realizacion espedfica, dicha primera solucion de dilucion comprende adicionalmente un crioprotector. En una realizacion mas espedfica, dicho crioprotector es DMSO, p. ej., DMSO de aproximadamente 2% a aproximadamente 15%. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 40 al 10%. En otra realizacion espedfica, dicha solucion en la etapa (a) comprende un crioprotector.

En un aspecto del metodo, el numero de cumulos de celulas en la composicion final que comprende celulas se reduce o elimina utilizando la filtracion, preferiblemente antes de la crioconservacion. En ciertas realizaciones en las

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que las celulas en la solucion que contiene celulas son crioconservadas, la solucion que contiene celulas se filtra antes de la crioconservacion. Por ejemplo, las celulas, p. ej., las celulas madre de la placenta, en solucion se pueden hacer pasar a traves de un filtro antes de la crioconservacion para eliminar los cumulos de celulas visibles (agregaciones de celulas, es dedr, macro-cumulos de celulas). De acuerdo con la invencion, la filtracion comprende filtrar la solucion que contiene celulas a traves de un filtro antes de la crioconservacion de dichas celulas, en donde dicho filtro comprende poros de entre aproximadamente 70 pM y aproximadamente 100 pM de diametro (es decir, el filtro es un filtro de 70 pM a un filtro de aproximadamente 100 pM), en donde el filtro es adecuado para filtrar soluciones que comprenden celulas. Por ejemplo, el filtro puede ser un filtro que comprende poros entre aproximadamente 70 y aproximadamente 80 pM, entre aproximadamente 70 pM y aproximadamente 90 pM, entre aproximadamente 70 pM y aproximadamente 100 pM, entre aproximadamente 80 pM y aproximadamente 100 pM o, entre aproximadamente 90 pM y aproximadamente 100 pM, puede ser un filtro de 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 pM. En una realizacion espedfica, dicho filtro es un filtro de 70 pM. En otra realizacion espedfica, dicho filtro es un filtro de 100 pM. En otra realizacion espedfica, dicho filtro es un filtro de 70 pM a un filtro de 100 pM. En otra realizacion espedfica, dicha solucion que contiene celulas se filtra despues de la descongelacion, ademas de ser filtrada antes de la congelacion.

En diversas realizaciones, el metodo de elaboracion de una composicion que comprende celulas p. ej., celulas de la placenta aisladas, comprende crioconservar las celulas a no mas de aproximadamente 10 x 106, 9,5 x 106, 9 x 106, 8,5 x 106, 8 x 106, 7,5 x 106, 7x 106, 6,5 x 106, 6x 106, 5,5 x 106, 5x 106, 4,5 x 106, 4 x 106, 3,5 x 106, 3x 106, o2,5x 106 celulas por mililitro. En una realizacion espedfica, las celulas son crioconservadas en no mas de

aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En otra realizacion espedfica, las celulas son crioconservadas en no mas de aproximadamente 13 x 106 celulas por mililitro. En otra realizacion espedfica, las celulas son crioconservadas en no mas de aproximadamente 5 x 106 celulas por mililitro. En otra realizacion espedfica, las celulas son crioconservadas en aproximadamente 5,0 x 106 a aproximadamente 7.5 x 106 celulas por mililitro. En otra realizacion espedfica, las celulas son crioconservadas en aproximadamente 5 x 106 celulas por mililitro. En otra realizacion espedfica, las celulas son crioconservadas en aproximadamente 7,5 x 106 celulas por mililitro. En una realizacion espedfica, las celulas son crioconservadas en aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En otra realizacion espedfica, dichas celulas son crioconservadas en un numero que, cuando dichas celulas se descongelan y se diluyen de 1:1 a 1:11 (v/v), p. ej., 1:1 a 1:5 (v/v), con dextrano 40, p. ej., dextrano 40 al 10%, da como resultado la formacion de 2 o menos cumulos de celulas visibles (es decir, macro-cumulos de celulas) por cada 106 celulas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas son crioconservadas en un numero que, cuando dichas celulas se descongelan y se diluyen de 1:1 a 1:11 (v/v), p. ej., de 1:1 a 1:5 (v/v), con dextrano 40, p. ej., dextrano 40 al 10%, da como resultado la formacion de cumulos de celulas no visibles. En otra realizacion espedfica, dichas celulas son crioconservadas en un numero que, cuando dichas celulas se descongelan y se diluyen de 1:1 a 1:11 (v/v), p. ej., de 1:1 a 1:5 (v/v), con dextrano 40 al 10%, da como resultado la formacion de menos de aproximadamente 150, 140, 130, 120, 110 o 100 micro-cumulos de celulas por 106 celulas.

En otra realizacion, el metodo de elaboracion de una composicion comprende poner en contacto las celulas, p. ej., celulas de la placenta aisladas, despues de la crioconservacion con una solucion que comprende dextrano 40, p. ej., resuspendiendo las celulas o diluyendo las celulas en una solucion que comprende dextrano 40. En una realizacion espedfica, la solucion comprende dextrano 40 de aproximadamente 2,5% a dextrano 40 a aproximadamente 10% (p/v). En realizaciones espedficas, la solucion comprende dextrano 40 de aproximadamente 5% a dextrano 40 a aproximadamente 10% (p/v). En otra realizacion espedfica, la solucion es una solucion de dextrano al 5,0% o una solucion de dextrano al 10%. En otra realizacion espedfica, la solucion es una solucion de dextrano al 5,5% o una solucion de dextrano al 10%. En otras realizaciones, el dextrano tiene un peso molecular, p. ej., un peso molecular medio, entre aproximadamente 1 kilodalton y aproximadamente 150 kilodalton. En otras realizaciones, el dextrano tiene un peso molecular, p. ej., un peso molecular medio, entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 150 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 125 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 75 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 25 kDa. En otras realizaciones, el dextrano tiene un peso molecular, p. ej., un peso molecular medio, entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 10 kDa, de aproximadamente 30 kDa a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 60 kDa a aproximadamente 80 kDa. En otras realizaciones, la solucion comprende entre dextrano a aproximadamente 2% y dextrano a aproximadamente 25%. En una realizacion espedfica, dicha solucion no comprende HSA. En otra realizacion espedfica, dicha solucion tiene densidad adaptada a dichas celulas, p. ej., dichas celulas madre de la placenta, p. ej., la solucion esta dentro de 5%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% o 0,1% de la densidad de las celulas de la placenta aisladas. En otra realizacion espedfica, la solucion tiene una densidad que no esta adaptada a dichas celulas.

En otra realizacion, el metodo de elaboracion de una composicion que comprende celulas, por ejemplo, celulas de la placenta aisladas, comprende (a) filtrar una solucion que contiene celulas que comprende dichas celulas antes de la crioconservacion a traves de un filtro de 70 pM a 100 pM, (b) crioconservar las celulas a aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro; (c) descongelar las celulas; y (d) diluir la solucion que contiene celulas de aproximadamente 1:1 (v/v) a aproximadamente 1:11 con una solucion de dextrano 40. En ciertas realizaciones, se crioconservan aproximadamente 10 x 106 celulas en la etapa (b). En ciertas realizaciones, las celulas se crioconservan en la etapa (b) a no mas de 10 x 106 celulas por mililitro. En ciertas realizaciones, se crioconservan no mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro en la etapa (b). En una realizacion mas espedfica, las celulas en la etapa (b) se

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crioconservan en una solucion que comprende dextrano 40 y HSA de aproximadamente 5% a aproximadamente 10%.

En otra realizacion, el metodo de elaboracion de una composicion comprende las siguientes etapas:

(a) filtrar una solucion que comprende celulas, solucion de dextrano 40 al 5,5% y HSA al 10% a traves de un filtro de 70 pM para producir una solucion que contiene celulas filtrada;

(b) diluir la solucion que contiene celulas filtrada con una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10%, y DMSO al 5% a aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro;

(d) crioconservar las celulas en dicha solucion que contiene celulas filtrada;

(e) descongelar las celulas; y

(f) diluir opcionalmente la solucion que contiene celulas filtrada con dextrano 40 al 10%.

En ciertas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (b) es a no mas de aproximadamente 10 x 106 celulas por mililitro. En ciertas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (b) es a no mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas/ml. En realizaciones en las que la solucion que contiene celulas filtrada comprende menos de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas/ml, la solucion en la etapa (a) comprende un crioprotector, p. ej., DMSO, p. ej., DMSO de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, y se omite la etapa (b). En algunas realizaciones, la etapa (f) comprende la dilucion de la solucion que contiene celulas filtrada de 1:1 a 1:11 (v/v) con dextrano 40 al 10%. En algunas realizaciones, la etapa (f) comprende la dilucion de la solucion que contiene celulas filtrada de 1:1 a 1:5 (v/v) con dextrano 40 al 10%.

En otra realizacion, el metodo de elaboracion de una composicion proporcionada en la presente memoria comprende las siguientes etapas:

(a) centrifugar una pluralidad de celulas para recoger las celulas;

(b) resuspender las celulas en dextrano 40 al 5,5%;

(c) centrifugar las celulas para recoger las celulas;

(d) resuspender las celulas en una solucion de dextrano 40 al 5,5% que comprende HSA al 10% para producir una solucion que contiene celulas;

(e) filtrar la solucion que contiene celulas a traves de un filtro de 70 pM para producir una solucion que contiene celulas filtrada;

(f) diluir la solucion que contiene celulas filtrada en dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10%, y DMSO al 5% a aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro;

(g) crioconservar las celulas en dicha solucion que contiene celulas filtrada;

(h) descongelar las celulas; y

(i) opcionalmente, diluir la solucion que contiene celulas filtrada con dextrano 40 al 10%.

En ciertas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (f) es a no mas de aproximadamente 10 x 106 celulas por mililitro. En ciertas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (f) es a no mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas/ml. En realizaciones en las que dicha resuspension en la etapa (d) produce una solucion que contiene celulas que comprende menos de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas/ml, la solucion en la etapa (d) comprende un crioprotector, p. ej., DMSO, p. ej., DMSO de aproximadamente 1 a aproximadamente 5%, y la etapa (f) se omite. En algunas realizaciones, la etapa (i) comprende la dilucion de la solucion que contiene celulas filtrada de 1:1 a 1:5 (v/v) con dextrano 40 al 10%. En algunas realizaciones, la etapa (i) comprende la dilucion de la solucion que contiene celulas filtrada de 1:1 a 1:11 (v/v) con dextrano 40 al 10%.

En una realizacion espedfica de cualquiera de los metodos anteriores, el DMSO se elimina sustancialmente de la composicion que comprende celulas, de manera que la concentracion final de DMSO en la composicion sea menor de aproximadamente 2,5%, 2,0%, 1,5%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% o aproximadamente 0,1%. La eliminacion de DMSO se puede lograr, p. ej., por centrifugacion de las celulas y resuspension de las celulas en dextrano 40 al 10%. Semejante etapa de centrifugacion y resuspension se puede repetir una o mas veces.

En otra realizacion espedfica de cualquiera de los metodos anteriores, el metodo comprende adicionalmente la concentracion de la composicion de celulas resultante de aproximadamente 5 x 106 celulas por mililitro a 1 x 108 celulas por mililitro. Semejante composicion es util, por ejemplo, para la administracion subcutanea de la composicion a un individuo que lo necesite.

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En otra realizacion espedfica de cualquiera de los metodos anteriores, la celula es una celula distinta de una celula madre de la placenta. En realizaciones mas espedficas, por ejemplo, las celulas pueden ser celulas madre o celulas no madre. En realizaciones espedficas en las que las celulas son celulas madre, las celulas madre pueden ser, p. ej., celulas madre adultas, celulas madre somaticas, celulas madre embrionarias, celulas germinales embrionarias, celulas madre de cordon umbilical, celulas madre de lfquido amniotico, celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, celulas madre mesenquimales derivadas de sangre de cordon, celulas madre mesenquimales derivadas de sangre periferica, celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo o celulas madre derivadas de periostio. En otra realizacion espedfica, las celulas son celulas asesinas naturales, p. ej., celulas asesinas naturales CD3-, CD56+.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente memoria composiciones, p. ej., una composicion farmaceutica elaborada por medio de los metodos anteriores. En ciertas realizaciones, las composiciones carecen de cumulos de celulas visibles, es dedr, macro-cumulos de celulas. En otras ciertas realizaciones, las composiciones comprenden un numero sustancialmente reducido de micro-cumulos de celulas (aquellos que solo son visibles con un microscopio, p. ej., un microscopio optico) en comparacion con composiciones que no han sido filtradas, p. ej., aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% menos micro-cumulos de celulas.

En una realizacion, se proporciona en la presente memoria una composicion, p. ej., una composicion farmaceutica, que comprende una pluralidad de celulas, p. ej., una pluralidad de celulas de la placenta aisladas, o celulas aisladas de lfquido perfundido de la placenta, p. ej., celulas nucleadas totales de lfquido perfundido de la placenta, en una solucion que comprende dextrano 40 al 10%, en donde dicha composicion comprende entre aproximadamente 1,0 ± 0,3 x 106 celulas por mililitro y aproximadamente 5,0 ± 1,5 x 106 celulas por mililitro, y en donde dicha composicion no comprende cumulos de celulas visibles (es decir, no comprende macro-cumulos de celulas). En algunas realizaciones, dicha composicion comprende entre aproximadamente 1,5 x 106 celulas por mililitro y aproximadamente 3,75 x 106 celulas por mililitro. En otras ciertas realizaciones, la composicion comprende entre aproximadamente 1,0 x 106 celulas por mililitro y 6,5 x 106 celulas por mililitro, por ejemplo, entre aproximadamente 1,3 x 106 celulas por mililitro y aproximadamente 6,5 x 106 celulas por mililitro. En una realizacion espedfica, dichas celulas han sido crioconservadas y descongeladas. De acuerdo con la invencion, dichas celulas se han filtrado a traves de un filtro de 70 pM a 100 pM. En otra realizacion espedfica, dicha composicion no comprende macro- cumulos de celulas. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende menos de aproximadamente 200 micro-cumulos de celulas por cada 106 celulas. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende menos de aproximadamente 150 micro-cumulos de celulas por cada 106 celulas. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende menos de aproximadamente 100 micro-cumulos de celulas por cada 106 celulas. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende DMSO a menos de 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, o 0,1%.

En otras realizaciones, dicha composicion comprende un polisacarido ademas de o distinto, es decir, en lugar de, dextrano. En ciertas realizaciones, el polisacarido es un polfmero de glucosa que no comprende subunidades de sacarido distintas de glucosa. En otras realizaciones, dicha composicion comprende maltodextrina (p. ej., maltodextrina a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%,

9,25%, 9,5%, 9,75 %, o 10%), trehalosa (p. ej., trehalosa a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%,

7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%), o hetalmidon (p. ej., hetalmidon a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25 %, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%). En otras realizaciones, dicha composicion comprende sacarosa (p. ej., sacarosa a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25%, 5,5 %, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5%, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%), heparina (p. ej., heparina de 55 unidades USP/ml), o glucogeno (p. ej., glucogeno a aproximadamente 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, 4,25%, 4,5%, 4,75%, 5,0%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6,0%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7,0%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8,0%, 8,25%, 8,5 %, 8,75%, 9,0%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, o 10%). En una realizacion particular, dicha composicion comprende maltodextrano ademas de o distinto, es decir, en lugar de, dextrano. En otra realizacion particular, dicha composicion comprende trehalosa ademas de, o en lugar de dextrano. En otra realizacion particular, dicha composicion comprende hetalmidon ademas de, o en lugar de dextrano.

En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende HSA de aproximadamente 1% a aproximadamente 17%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende HSA de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, o aproximadamente 17%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende HSA a aproximadamente 3,125%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende HSA a aproximadamente 5%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende HSA a aproximadamente

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En otras realizaciones, dicha composicion comprende albumina de suero bovino (BSA) (p. ej., BSA a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%) o suero bovino fetal (FBS) (p. ej., FBS a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%), ademas de HSA.

En algunas realizaciones, la composicion comprende un crioprotector, p. ej., DMSO, p. ej., DMSO de aproximadamente 1% a aproximadamente 15%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende DMSO de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende DMSO de aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 2,5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 2,5% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 10% o de aproximadamente 10% a aproximadamente 15%. En algunas realizaciones, dicha composicion comprende DMSO a aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%. En una realizacion particular, la composicion comprende DMSO a aproximadamente 5%.

Ademas se proporcionan en la presente memoria composiciones que comprenden celulas, en donde dichas composiciones son producidas por medio de uno de los metodos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, en una realizacion, se proporciona en la presente memoria una composicion que comprende celulas, en donde dicha composicion es producida por medio de un metodo que comprende filtrar una solucion que comprende las celulas a traves de un filtro de 70 pM a 100 pM para formar una solucion que contiene celulas filtrada; diluir la solucion que contiene celulas filtrada con una primera solucion que comprende dextrano a aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro, p. ej., antes de la crioconservacion; y diluir la solucion que contiene celulas filtrada resultante con una segunda solucion que comprende dextrano pero no comprende HSA para producir dicha composicion. En ciertas realizaciones, dicha dilucion es a no mas de aproximadamente 10 x 106 celulas por mililitro. En ciertas realizaciones, dicha dilucion es a no mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En ciertas realizaciones, dicha dilucion es a no mas de aproximadamente 7,5 x 106 celulas por mililitro. En una realizacion espedfica, las celulas son crioconservadas entre dicha dilucion con una primera solucion de dilucion y dicha dilucion con una segunda solucion de dilucion. En otra realizacion espedfica, la primera solucion de dilucion comprende dextrano y HSA. En otra realizacion espedfica, el dextrano en dicha primera solucion de dilucion o dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 40. En otra realizacion espedfica, el dextrano en dicha primera solucion de dilucion y dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 40. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha primera solucion de dilucion es dextrano 40 al 5,0%. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha primera solucion de dilucion es dextrano 40 al 5,5%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA al 10%. En otra realizacion espedfica, dicha primera solucion de dilucion comprende HSA. En una realizacion mas espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA al 10%. En otra realizacion espedfica, dicha primera solucion de dilucion comprende un crioprotector. En una realizacion mas espedfica, dicho crioprotector es DMSO. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha segunda solucion de dilucion es dextrano 40 a aproximadamente 10%. En otra realizacion espedfica, dicha composicion que comprende celulas comprende dextrano de aproximadamente 7,5% a aproximadamente 9%. De acuerdo con la invencion, dicha composicion que comprende celulas comprende de aproximadamente 1,0 ± 0,3 x 106 celulas por mililitro a aproximadamente 5,0 ± 1,5 x 106 celulas por mililitro. En otra realizacion espedfica, dicha composicion que comprende celulas comprende de aproximadamente 1,5 x 106 celulas por mililitro a aproximadamente 3,75 x 106 celulas por mililitro.

En otra realizacion, la composicion que comprende celulas se elabora mediante un metodo que comprende (a) filtrar a traves de un filtro de 70 pM a 100 pM una solucion que contiene celulas que comprende dichas celulas antes de la crioconservacion para producir una solucion que contiene celulas filtrada; (b) crioconservar las celulas en la solucion que contiene celulas filtrada a aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro; (c) descongelar las celulas; y (d) diluir la solucion que contiene celulas filtrada de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:11 (v/v) con una solucion de dextrano 40. En una realizacion mas espedfica, las celulas en la etapa (b) son crioconservadas a aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En una realizacion mas espedfica, las celulas en la etapa (b) son crioconservadas en una solucion que comprende dextrano 40 y HSA de aproximadamente 5% a aproximadamente 10%. En ciertas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (d) es a no mas de aproximadamente 10 x 106 celulas por mililitro.

En otra realizacion, la composicion que comprende celulas se elabora mediante un metodo que comprende: (a) suspender las celulas en una solucion de dextrano 40 al 5,5% que comprende HSA al 10% para formar una solucion que contiene celulas; (b) filtrar la solucion que contiene celulas a traves de un filtro de 70 pM; (c) diluir la solucion que contiene celulas con una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10%, y DMSO al 5% a aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro; (d) crioconservar las celulas; (e) descongelar las celulas; y (f) diluir la solucion que contiene las celulas 1:1 a 1:11 (v/v) con dextrano 40 al 10%. En ciertas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (c) es a no mas de aproximadamente 10 x 106 celulas por mililitro. En ciertas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (c) es a no mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas/ml. En otra realizacion, la composicion que comprende celulas se elabora mediante un metodo que comprende: (a) centrifugar una pluralidad de celulas para recoger las celulas; (b) resuspender las celulas en dextrano 40 al 5,5%; (c) centrifugar las celulas para recoger

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las celulas; (d) resuspender las celulas en una solucion de dextrano 40 al 5,5% que comprende HSA al 10%; (e) filtrar las celulas a traves de un filtro de 70 pM; (f) diluir las celulas en dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10%, y DMSO al 5% a aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro; (g) crioconservar las celulas; (h) descongelar las celulas; e (i) diluir las celulas de 1:1 a 1:11 (v/v) con dextrano 40 al 10%. En ciertas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (f) es a no mas de aproximadamente 10 x 106 celulas por mililitro. En ciertas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (f) es a no mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas/ml.

Las composiciones, p. ej., composiciones farmaceuticas, que comprenden las celulas descritas en la presente memoria pueden comprender cualquier celula de mairnfero, incluyendo celulas madre de mairnferos y celulas no madre de mairnferos. En algunas realizaciones, las composiciones, p. ej., composiciones farmaceuticas, que comprenden las celulas descritas en la presente memoria pueden comprender celulas de la placenta aisladas, p. ej., cualquiera de las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria (vease, p. ej., la Seccion 5.3, mas abajo). En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD34-, CD10+ y CD105+ segun se detecta por citometna de flujo. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son celulas madre de la placenta. En otra realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son celulas pluripotentes de la placenta. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas tienen el potencial de diferenciarse en celulas de un fenotipo neural, celulas de un fenotipo osteogenico, o celulas de un fenotipo condrogenico. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aislada son adicionalmente CD200+. En otra realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son adicionalmente CD90+ o CD45-, segun se detecta por citometna de flujo. En otra realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son adicionalmente CD90+ o CD45-, segun se detecta por citometna de flujo. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ o CD45-, segun se detecta por citometna de flujo. En otra realizacion mas espedfica, las celulas CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ son, adicionalmente, CD90+ y CD45-, segun se detecta por citometna de flujo. En otra realizacion mas espedfica, las celulas CD34-, CD10+, CD105+, CD200+, CD90+, y CD45- son, adicionalmente, CD80- y CD86-, segun se detecta por citometna de flujo.

En una realizacion mas espedfica, las celulas CD34-, CD10+, CD105+, son adicionalmente, uno o mas de CD29+, CD38-, CD44+, CD54+, CD80-, CD86-, SH3+ o SH4+. En otra realizacion mas espedfica, las celulas son adicionalmente CD44+. En una realizacion espedfica de cualquiera de las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas anteriores, las celulas son, adicionalmente, uno o mas de CD117-, CD133-, KDR-(VEGFR2 -), HLA- A,B,C+, HLA-DP,DQ, DR-, y/o ligando de muerte programada-1 (PDL1)+.

En otras ciertas realizaciones de las composiciones, dichas celulas de la placenta aisladas son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+ y CD200+; CD200+ y OCT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta que comprende dichas celulas de la placenta aisladas cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; u OCT-4+y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta, que comprende las celulas de la placenta aisladas cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide; o cualquier combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, dichas celulas CD200+, hLa-G+ son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas CD73+, CD105+ y CD200+ son CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas CD200+, OCT-4+ son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas CD73+, CD105+ y HLA-G+ son CD34-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas CD73+ y CD105+ son OCT-4+, CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion particular, dichas celulas OCT-4+ son CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- y CD45-. Las celulas de la placenta aisladas que pueden estar contenidas dentro de las composiciones que comprenden celulas, descritas en la presente memoria, se describen con mas detalle en la seccion 5.3, a continuacion.

En otras realizaciones espedficas de las composiciones proporcionadas en la presente memoria, la celula es una celula distinta de una celula madre de la placenta. En realizaciones mas espedficas, por ejemplo, las celulas pueden ser celulas madre o celulas no madre. En realizaciones espedficas en las que las celulas son celulas madre, las celulas madre pueden ser, p. ej., celulas madre adultas, celulas madre somaticas, celulas madre embrionarias, celulas germinales embrionarias, celulas madre de cordon umbilical, celulas madre de lfquido amniotico, celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, celulas madre mesenquimales derivadas de sangre de cordon, celulas madre mesenquimales derivadas de sangre periferica, celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo o celulas madre derivadas de periostio. En otra realizacion espedfica, las celulas son celulas asesinas naturales, p. ej., celulas asesinas naturales CD3-, CD56+.

5.3 Celulas de la placenta aisladas y poblaciones de celulas de la placenta aisladas

Las celulas pluripotentes de la placenta aisladas utiles en las composiciones, p. ej., composiciones farmaceuticas, proporcionadas en la presente memoria se pueden obtener a partir de una placenta o una parte de la misma, que se adhieren a un sustrato de cultivo de tejidos y tienen caractensticas de celulas pluripotentes o celulas madre. En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas utiles en los metodos descritos en la presente memoria tienen la capacidad de diferenciarse en tipos de celulas no placentarios. Las celulas de la placenta aisladas utiles en

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los metodos descritos en la presente memoria pueden ser o bien de origen fetal o bien de origen materno (es decir, pueden tener el genotipo del feto o de la madre, respectivamente). Preferiblemente, las celulas de la placenta aisladas y las poblaciones de celulas de la placenta aisladas son de origen fetal. Segun se utiliza en la presente memoria, la expresion "de origen fetal" o "de origen no materno" indica que las celulas de la placenta aisladas o poblaciones de celulas de la placenta aisladas se obtienen a partir del cordon umbilical o estructuras de la placenta asociadas con el feto, es decir, que tienen el genotipo fetal. Segun se utiliza en la presente memoria, la expresion "de origen materno" indica que las celulas o poblaciones de celulas se obtienen de estructuras de la placenta asociadas con la madre, p. ej., que tienen el genotipo de la madre. Las celulas de la placenta aisladas, o poblaciones de celulas que comprenden las celulas de la placenta aisladas, pueden comprender celulas de la placenta aisladas que son de origen unicamente fetal o materno, o puede comprender una poblacion mixta de celulas de la placenta aisladas de origen tanto fetal como materno. Las celulas de la placenta aisladas, y las poblaciones de celulas que comprenden las celulas de la placenta aisladas, pueden ser identificadas y seleccionadas por las caractensticas morfologicas, de los marcadores, y del cultivo descritas a continuacion. Las celulas de la placenta aisladas adecuadas para su uso en los metodos y composiciones descritas en la presente memoria pueden incluir, por ejemplo, las descritos en Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos Num. 2007/0275362 y en la Patente de Estados Unidos Num. 7.468.276.

5.3.1 Caractensticas fisicas y morfologicas

Las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria, cuando se cultivan en cultivos primarios o en cultivo celular, se adhieren al sustrato del cultivo de tejidos, p. ej., la superficie del recipiente de cultivo de tejidos (p. ej., plastico del cultivo de tejidos), o a una superficie de cultivo de tejido recubierta con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colageno (p. ej., nativo o desnaturalizad), gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina, y protema de la membrana extracelular (p. ej., MATRIGEL®). (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.). Las celulas de la placenta aisladas en cultivo adoptan una apariencia generalmente fibroblastoide, estrellada, con numerosos procesos citoplasmicos que se extienden desde el cuerpo celular central. Las celulas son, sin embargo, morfologicamente distinguibles de los fibroblastos cultivados en las mismas condiciones, ya que las celulas de la placenta aisladas muestran un mayor numero de estos procesos que los fibroblastos. Morfologicamente, las celulas de la placenta aisladas son tambien distinguibles de las celulas madre hematopoyeticas, que generalmente adoptan una morfologfa mas redondeada, o adoquinada en cultivo.

5.3.2 Marcadores moleculares y geneticos de la superficie celular

Las celulas aisladas de la placenta, p. ej., celulas pluripotentes o celulas madre, y las poblaciones de celulas de la placenta aisladas, expresan una pluralidad de marcadores que se pueden utilizar para identificar y/o aislar las celulas madre, o poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre. Las celulas de la placenta aisladas, y las poblaciones de celulas de la placenta descritas en la presente memoria (es decir, dos o mas celulas de la placenta aisladas) incluyen celulas de la placenta y poblaciones de celulas que contienen celulas de la placenta obtenidas directamente de la placenta, o cualquier parte de la misma (p. ej., amnios, corion, cotiledones placentarios, y similares). Las poblaciones de celulas de la placenta aisladas tambien incluyen poblaciones de (es decir, dos o mas) celulas de la placenta aisladas en cultivo, y una poblacion en un recipiente, p. ej., una bolsa. Las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria no son trofoblastos, citotrofoblastos, hemangioblastos, celulas germinales embrionarias o celulas madre embrionarias. Las celulas pluripotentes de la placenta que pueden utilizarse en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria se describen en la Publicacion de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Num. 2007/0275362 y las Patentes de los Estados Unidos Nums. 7.045.148 y 7.468.276, cuyas descripciones se exponen a continuacion.

Las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, por lo general expresan los marcadores CD73, CD105, CD200, HLA-G, y/u OCT-4, y no expresan CD34, cD38, o CD45, y son HLA-DP, DQ y DR-. Las celulas pluripotentes aisladas son tambien generalmente CD10+, CD29+, CD54+, CD90+, CD44+ y Cd38+. En ciertas realizaciones, las celulas son una o mas de SSEA3-, SSEA4- o ABC-p+. Las celulas de la placenta aisladas tambien pueden expresar HLA-ABC (MHC-1). Estos marcadores se pueden utilizar, en cualquier combinacion, para identificar las celulas de la placenta aisladas, p. ej., las celulas madre de la placenta aisladas o las celulas pluripotentes aisladas y para distinguir las celulas de la placenta aisladas de otros tipos de celulas. Debido a que las celulas de la placenta aisladas pueden expresar CD73 y CD105, pueden tener caractensticas similares a las de las celulas madre mesenquimales. La falta de expresion de CD34, cD38 y/o CD45, por ejemplo, identifica las celulas de la placenta aisladas como celulas madre no hematopoyeticas.

En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son celulas madre de la placenta aisladas. En otras ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son celulas pluripotentes de la placenta aisladas. En una realizacion, las celulas de la placenta aisladas son CD34-, CD10+ y CD105+ segun se detecta por medio de citometna de flujo. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, y CD105+ aisladas son celulas madre de la placenta. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD34', CD10+, CD105+ aislada son celulas de la placenta pluripotentes. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+, aislada tienen el potencial de diferenciarse en celulas de un fenotipo neural, celulas de un fenotipo osteogenico, o celulas de un fenotipo condrogenico. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD34-,

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CD10+, CD105+ aisladas son, adicionalmente, CD200+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son, adicionalmente, CD45- o CD90+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son, adicionalmente, CD45- y CD90+, segun se detecta por medio de citometna de flujo. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aisladas son adicionalmente CD90+ o CD45-, segun se detecta por medio de citometna de flujo. En otra realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aisladas son, adicionalmente, CD90+ y CD45-, segun se detecta por medio de citometna de flujo, es dedr, las celulas son CD34-, CD10+, CD45-, CD90+, CD105+ y CD200+. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas CD34-, CD10+, CD45-, CD90+, CD105+, CD200+ son, adicionalmente, CD80- y CD86-.

En una realizacion espedfica, cualquiera de las celulas CD34-, CD10+, CD105+ descritas anteriormente es, adicionalmente, una o mas de CD29+, CD38-, CD44+, CD54+, SH3+ o SH4+. En otra realizacion mas espedfica, las celulas son adicionalmente CD44+. En otra realizacion espedfica de cualquiera de las celulas de la placenta anteriores CD34-, CD10+, CD105+ aisladas, las celulas son, adicionalmente, una o mas de CD117-, CD133-, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR-, y/o PDL1+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ son, adicionalmente, una o mas de CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+,

CD117-, CD144/VE-cadherinabaja, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR", HLA-G+ o ligando de muerte programada-1 (PDL1)+, o cualquier combinacion de los mismos. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ son, adicionalmente, CD13+, CD29+, CD33+, CD38', CD44+, CD45', CD54/ICAM+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+(CD73+), SH4+(CD73+), CD80', CD86', CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE- cadherinabaja, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR-, HLA-G+, y ligando de muerte programada-1 (PDL1)+.

En otra realizacion, una poblacion de celulas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas de la placenta CD34-, CD10+ y CD105+. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD34-, CD10+ y CD105+. Preferiblemente, al menos aproximadamente 70% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD34-, CD10+ y CD105+. Mas preferiblemente, al menos aproximadamente 90%, 95%, o 99% de dichas celulas son celulas de la placenta CD34-, CD10+ y CD105+. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son adicionalmente CD200+. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ o CD45-, segun se detecta por medio de citometna de flujo. En otra realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aisladas son, adicionalmente, CD90+ y CD45-, segun se detecta por medio de citometna de flujo. En una realizacion mas espedfica, cualquiera de los celulas de la placenta CD34', CD10+, CD105+ aisladas descritas anteriormente son adicionalmente uno o mas de CD29+, CD38-, CD44+, CD54+, SH3+ o SH4+. En otra realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas, o las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aisladas son, adicionalmente, CD44+. En una realizacion espedfica de cualquiera de las poblaciones de celulas que comprenden las celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+ aisladas anteriores, las celulas de la placenta aisladas son, adicionalmente, una o mas de CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE-cadherinabaja, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT- 4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR-, HLA-G+, o ligando de muerte programada-1 (PDL1)+, o cualquier combinacion de los mismos. En una realizacion mas espedfica, las celulas CD34-, CD10+, CD105+ son, adicionalmente, CD13+, CD29+, CD33+, CD38', CD44+, CD45', CD54/ICAM+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80', CD86', CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD 144/VE-cadherinabaja, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA- A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR-, HLA-G+, y ligando de muerte programada-1 (PDL1)+.

En deltas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son uno o mas, o todos, de CD10 , CD29 , CD34-, CD38- CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y ABC-p+, en donde dichas celulas de la placenta aisladas se obtienen por rotura ffsica y/o enzimatica de tejido de la placenta. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+ y ABC-p+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+ y CD34-, en donde dichas celulas de la placenta aisladas tienen al menos una de las siguientes caractensticas: CD10+, CD29+, CD44+, CD45', CD54+, CD90+, SH3+, SH4+, SSEA3-, y SSEA4-. En otra

realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+, CD34-, CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH3+, SH4+, SSEA3-, y SSEA4-. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+, CD34-, SSEA3-, y SSEA4-. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+ y CD34-, y son o bien sH2+ o bien SH3+. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+, CD34-, SH2+, y SH3+. En otra realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+, CD34-, SSEA3-, y SSEA4-, y son o bien SH2+ o bien SH3+. En otra realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+ y CD34-, y, o bien SH2+ o bien SH3+, y son al menos uno de CD10+, CD29+, CD44+, CD45', CD54+, CD90+, SSEA3-, o SSEA4-. En otra realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+, CD34-,

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CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SSEA3-, y SSEA4-, y, o bien SH2+ o bien SH3+.

En una realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son CD200+ o HLA-G+. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD200+ y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas son CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD200+ o HLA-G+ aisladas facilitan la formacion de cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta, que comprende las celulas de la placenta aisladas, en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas se afslan de celulas de la placenta que no son celulas madre o pluripotentes. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas se afslan de las celulas madre de la placenta que no muestran estos marcadores.

En otra realizacion, una poblacion de celulas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende, p. ej., que se enriquece en, celulas de la placenta CD200+, HLA-G+. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD200+, HLA- G+. Preferiblemente, al menos aproximadamente 70% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD200+, HLA-G+. Mas preferiblemente, al menos aproximadamente 90%, 95%, o 99% de dichas celulas son celulas de la placenta CD200+, HLA-G+. En una realizacion espedfica de las poblaciones aisladas, dichas celulas de la placenta tambien son CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta son tambien CD34-, CD38- o CD45-. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta tambien son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otra realizacion, dicha poblacion de celulas aisladas produce uno o mas cuerpos de tipo embrioide, cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas de la placenta se afsla de celulas de la placenta que no son celulas madre. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas de la placenta se afsla de celulas de la placenta que no muestran estos marcadores.

En otra realizacion, las celulas de la placenta, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son CD73+, CD105+ y CD200+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta son HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta son CD34-, CD38-o CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta son CD34-, CD38- y CD45. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta son CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD73+, CD105+ y CD200+ aisladas facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de dichas celulas de la placenta, cuando la poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta se afslan de celulas de la placenta que no son celulas madre. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta se afslan de las celulas de la placenta que no muestran estos marcadores.

En otra realizacion, una poblacion de celulas que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende, p. ej., que se enriquece en, celulas de la placenta CD73+, CD105+, CD200+ aisladas. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD73+, CD105+, CD200+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente 70% de dichas celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD73+, CD105+, CD200+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD73+, CD105+, CD200+ aisladas. En una realizacion espedfica de dichas poblaciones, las celulas de la placenta aisladas son HLA-G+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son, adicionalmente, CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son, adicionalmente, CD34-, CD38- y CD45-. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta aisladas son, adicionalmente, CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas produce uno o mas cuerpos de tipo embrioide, cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas de la placenta se afsla de celulas de la placenta que no son celulas madre. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas madre de la placenta se afsla de las celulas de la placenta que no muestran estas caractensticas.

En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son CD200+ y OCT-4+. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas son HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ aisladas son CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ aisladas son CD34-, CD38- y CD45-. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ aisladas son CD34-, CD38- , CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD200+, OCT-4+

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aisladas facilitan la produccion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide por una poblacion de celulas de la placenta, que comprende las celulas aisladas, cuando la poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ aisladas, se afslan de celulas de la placenta que no son las celulas madre. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ aisladas se afslan de celulas de la placenta que no muestran estas caractensticas.

En otra realizacion, una poblacion de celulas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende, p. ej., que se enriquece en, celulas de la placenta CD200+, OCT-4+. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD200+, OCT- 4+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente el 70% de dichas celulas son dichas celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente 80%, 90%, 95%, o 99% de las celulas en dicha poblacion de celulas son dichas celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ aisladas. En una realizacion espedfica de las poblaciones aisladas, dichas celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, CD34", CD38" y CD45". En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, CD34", CD38", CD45", cD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, la poblacion de celulas produce uno o mas cuerpos de tipo embrioide cuando se cultiva en condiciones que permitan la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas se afsla de celulas de la placenta que no son celulas de la placenta CD200+, OCT-4+ aisladas. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas se afsla de celulas de la placenta que no muestran estos marcadores.

En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD73+, CD105+ y HLA-G+ aisladas son, adicionalmente, CD34", CD38" o CD45". En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas son, adicionalmente, CD34", CD38" y CD45". En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas son, adicionalmente, OCT-4+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas son adicionalmente CD200+. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas son, adicionalmente, CD34", CD38", CD45", OCT-4+ y CD200+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas facilitan la formacion de cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta que comprende dichas celulas, cuando la poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas se afslan de celulas de la placenta que no son celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas se afslan de celulas de la placenta que no muestran estos marcadores.

En otra realizacion, una poblacion de celulas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende, p. ej., que se enriquece en, celulas de la placenta CD73+, CD105+ y HLA-G+ aisladas. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente 70% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas. En una realizacion espedfica de las poblaciones anteriores, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas son, adicionalmente, CD34", CD38" o CD45". En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas son, adicionalmente, CD34", CD38" y cD45. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas son, adicionalmente, OCT-4+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas son, adicionalmente, CD200+. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ aisladas son, adicionalmente, CD34", CD38", CD45", OCT-4+ y CD200+. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas se afsla de celulas de la placenta que no son celulas de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas se afsla de celulas de la placenta que no muestran estos marcadores.

En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son CD73+ y CD105+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta aisladas que comprende dichas celulas CD73+, CD105+ cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas son, adicionalmente, CD34", CD38" o CD45". En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas son, adicionalmente, CD34", CD38" y CD45". En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas son, adicionalmente, OCT-4+. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas son, adicionalmente, OCT-4+, CD34", CD38" y CD45". En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta

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CD73+, CD105+ aisladas se a^slan de celulas de la placenta que no son dichas celulas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas se afslan de celulas de la placenta que no muestran estas caractensticas.

En otra realizacion, una poblacion de celulas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende, p. ej., que se enriquece en, celulas de la placenta aisladas que son CD73+, CD105+ y facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta aisladas que comprende dichas celulas cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las celulas en dicha poblacion de celulas son dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente 70% de las celulas en dicha poblacion de celulas son dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de las celulas en dicha poblacion de celulas son dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas. En una realizacion espedfica de las poblaciones anteriores, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas son, adicionalmente, CD34-, CD38 o CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas son, adicionalmente, CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas son, adicionalmente, OCT-4+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas son, adicionalmente, CD200+. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas son, adicionalmente, CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas se afsla de celulas de la placenta que no son dichas celulas de la placenta CD73+, CD105+ aisladas. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas se afsla de celulas de la placenta que no muestran estos marcadores.

En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son OCT-4+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta aisladas que comprende dichas celulas cuando se cultivan en condiciones que permiten formacion de cuerpos de tipo embrioide. En una realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, CD34-, CD38-, o CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, CD200+. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, Cd38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas se afslan de celulas de la placenta que no son celulas de la placenta OCT-4+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas se afslan de celulas de la placenta que no muestran estas caractensticas.

En otra realizacion, una poblacion de celulas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende, p. ej., que se enriquece en celulas de la placenta, aisladas que son OCT-4+ y facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta aisladas que comprende dichas celulas cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las celulas en dicha poblacion de celulas son dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente 70% de las celulas en dicha poblacion de celulas son dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente 80%, 90%, 95% o 99% de las celulas en dicha poblacion de celulas son dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas. En una realizacion espedfica de las poblaciones anteriores, dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, CD34-, CD38- o CD45. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, CD200+. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta OCT-4+ aisladas son, adicionalmente, CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas se afsla de celulas de la placenta que no son dichas celulas. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas se afsla de celulas de la placenta que no muestran estos marcadores.

En otras ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son uno o mas de CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, MHC-1+ o ABC-p+. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4- y OCT-4+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD45-, CD54+, SH2+, SH3+, y SH4+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD45-, CD54+, SH2+, SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, cD44+, CD45-, CD54+, CD90+, HLA-1+, SH2+, SH3+, SH4+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+ y ABC-p+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son SH2+, SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+, CD34-, SSEA3-, y SSEA4-. En una realizacion espedfica,

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dichas celulas de la placenta aisladas OCT-4+, CD34", SSEA3", y SSEA4" son, adicionalmente, CD10+, CD29+, CD34", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, y SH4+. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas son OCT-4+ y CD34", y SH3+ o SH4+. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas son CD34" y, o bien CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90 +, o bien OCT-4+.

En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son celulas de la placenta CD10+, CD34", CD105+ y CD200+ aisladas. En otra realizacion, una poblacion de celulas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende celulas de la placenta, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD10+, CD34", CD105+, CD200+. En una realizacion espedfica de las realizaciones anteriores, dichas celulas de la placenta son, adicionalmente, CD90+ y CD45". En una realizacion espedfica, dicha celula de la placenta o poblacion de celulas de la placenta se afsla de celulas de la placenta que no son celulas madre. En otra realizacion espedfica, dicha celula de la placenta o poblacion de celulas de la placenta se afsla de celulas de la placenta que no muestran estas caractensticas. En otra realizacion espedfica, dicha celula de la placenta aislada no es de origen materno. En otra realizacion espedfica, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de dichas celulas en dicha poblacion aislada de celulas de la placenta, no son de origen materno.

En otra realizacion espedfica de dichas celulas de la placenta aisladas o poblaciones de celulas que comprenden las celulas de la placenta aisladas, dichas celulas o poblacion se han ampliado, por ejemplo, se han hecho pasar al menos, aproximadamente, o no mas de, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, l2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 veces, o se han hecho proliferara lo largo de al menos, aproximadamente, o no mas de, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones de poblacion. En otra realizacion espedfica de las celulas de la placenta aisladas, o poblaciones de celulas que comprenden celulas de la placenta aisladas, que se describen en la presente memoria, dichas celulas de la placenta aisladas son de origen fetal (es decir, tienen el genotipo fetal).

En otra realizacion, las celulas de la placenta, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son OCT-4+y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de dichas celulas de la placenta aisladas cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En una realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta son CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta son CD34", CD38", o CD45". En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta son CD200+. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta son CD73+, CD105+, CD200+, CD34", CD38" y CD45". En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta se afslan de celulas de la placenta que no son celulas madre. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta se afslan de celulas de la placenta que no muestran estas caractensticas.

En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son celulas de la placenta HLA-A,B,C", CD45", CD133" y CD34" aisladas. En otra realizacion, una poblacion de celulas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende celulas de la placenta aisladas, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 99% de las celulas en dicha poblacion de celulas aisladas son celulas de la placenta HLA-A,B,C", CD45", CD133" y CD34" aisladas. En una realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas o poblacion de celulas de la placenta aisladas se afslan de celulas de la placenta que no son celulas de la placenta HLA-A,B,C", CD45", CD133" y CD34". En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas no son de origen materno. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas de la placenta aisladas estan sustancialmente libres de componentes maternos; p. ej., al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas celulas en dicha poblacion de celulas de la placenta aisladas no son de origen materno.

En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son celulas de la placenta CD10+, CD13+, CD33+, CD45", CD117"y CD133" aisladas. En otra realizacion, una poblacion de celulas que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende celulas de la placenta aisladas, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD10+, CD13+, CD33+, CD45", CD117" y CD133" aisladas. En una realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas o poblacion de celulas de la placenta aisladas se afsla de celulas de la placenta que no son dichas celulas de la placenta aisladas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta CD10+, CD13+, CD33+, CD45", cD117"y CD133" aisladas no son de origen materno, es decir, tienen el genotipo fetal. En otra realizacion espedfica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas celulas en dicha poblacion de celulas de la placenta aisladas, no son de origen materno. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas o poblacion de celulas de la placenta aisladas se afslan de celulas de la placenta que no muestran estas caractensticas.

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En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son celulas de la placenta CD10-, CD33-, CD44+, CD45-, y CD117- aisladas. En otra realizacion, una poblacion de celulas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende, p. ej., se enriquece en, celulas de la placenta aisladas, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta CD10-, CD33-, CD44+, CD45-, y CD117- aisladas. En una realizacion espedfica, dicha celula de la placenta aislada o poblacion de celulas de la placenta aisladas se afsla de celulas de la placenta que no son dichas celulas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas no son de origen materno. En otra realizacion espedfica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas celulas en dicha poblacion de celulas no son de origen materno. En otra realizacion espedfica, dicha celula de la placenta aislada o poblacion de celulas de la placenta aisladas se afsla de celulas de la placenta que no muestran estos marcadores.

En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son celulas de la placenta CD10-, CD13-, CD33-, CD45-, y CD117- aisladas. En otra realizacion, una poblacion de celulas util, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende, p. ej., se enriquece en, celulas de la placenta CD10-, CD13-, CD33-, CD45-, y CD117- aisladas en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las celulas en dicha poblacion son celulas de la placenta CD10-, CD13-, CD33-, CD45-, y CD117-. En una realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas o poblacion de celulas de la placenta aisladas se afslan de celulas de la placenta que no son dichas celulas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas no son de origen materno. En otra realizacion espedfica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas celulas en dicha poblacion de celulas no son de origen materno. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas o poblacion de celulas de la placenta aisladas se afslan de celulas de la placenta que no muestran estas caractensticas.

En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son HLA A,B,C+, CD45-, CD34-, y CD133-, y son, adicionalmente, CD10+, CD13+, CD38+, CD44+, CD90+, CD105+, CD200+y/o HLA-G+, y/o negativas para CD 117. En otra realizacion, una poblacion de celulas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, es una poblacion de celulas que comprende celulas de la placenta aisladas, en donde al menos aproximadamente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %, 95%, 98% o aproximadamente 99% de las celulas en dicha poblacion son celulas de la placenta aisladas que son HLA A,B,C-, CD45-, CD34-, CD133-, y que son, adicionalmente, positivas para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 y/o HLA-G, y/o negativas para CD117. En una realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas o poblacion de celulas de la placenta aisladas se afslan de celulas de la placenta que no son dichas celulas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas no son de origen materno. En otra realizacion espedfica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas celulas en dicha poblacion de celulas no son de origen materno. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas o poblacion de celulas de la placenta aisladas se afslan de las celulas de la placenta que no muestran estos marcadores.

En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son celulas de la placenta aisladas que son CD200+ y CD10+, como se determina por la union del anticuerpo, y CD117-, como se determina tanto por la union anticuerpo como por RT-PCR. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son celulas de la placenta aisladas, por ejemplo, celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta, que son CD10+, CD29-, CD54+, CD200+, HLA-G+, HLA de clase I-y p- 2-microglobulina-. En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son celulas de la placenta en donde la expresion de al menos un marcador celular es al menos dos veces mayor que para una celula madre mesenquimal (p. ej., una celula madre mesenquimal derivadas de medula osea). En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas no son de origen materno. En otra realizacion espedfica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas celulas en dicha poblacion de celulas no son de origen materno.

En otra realizacion, las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son celulas de la placenta aisladas, p. ej., celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta, que son uno o mas de CD10+, CD29+, CD44+, CD45", CD54/ICAM+, CD62-E", CD62-L", CD62-P", CD80-, CD86-, CD103-, CD104-, CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-cadherinabaja, CD184/CXCR4", p2-microglobulinabaja, MHC-Ibaja, MHC-II-, HLA-Gbaja, y/o PDL1baja. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son, al menos, CD29+ y CD54+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son, al menos, CD44+ y CD106+. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son al menos CD29+.

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En otra realizacion, una poblacion de celulas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, se compone de celulas de la placenta aisladas, y al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de la celulas de dicha poblacion de celulas son celulas de la placenta aisladas que son uno o mas de CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62-E-, CD62-L-, CD62-P-, CD80-, CD86-, CD103-, CD104-,

CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-cadherinabaja, CD184/CXCR4", p2-microglobulinabaJa, MHC-Ibaja, MHC-II-, HLA- GbaJa, y/o PDL1baja. En una realizacion mas espedfica, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las celulas en dicha poblacion de celulas son CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62-E-, CD62-L-, CD62- P-, CD80-, CD86-, CD103-, CD104-, CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VEcadherinabaJa, CD184/CXCR4-, p2- microglobulinabaJa, MHC-IbaJa, MHC-II-, HLA-GbaJa, y PDL1baJa.

En ciertas realizaciones de celulas de la placenta aisladas, dichas celulas de la placenta aisladas no se diferencian durante el cultivo en medio de crecimiento, es decir, medio formulado para promover la proliferacion, p. eJ., durante la proliferacion en medio de crecimiento. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas no requieren una capa de alimentacion para proliferar. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas no se diferencian en cultivo en ausencia de una capa de alimentacion, unicamente a causa de la falta de una capa de celulas de alimentacion.

En otra realizacion, las celulas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, son celulas de la placenta aisladas, en donde una pluralidad de dichas celulas de la placenta aisladas son positivas para aldelddo deshidrogenasa (ALDH), tal como se evaluo mediante un analisis de actividad de aldelddo deshidrogenasa. Tales analisis son conocidos en la tecnica (vease, p. eJ., Bostian y Betts, Biochem. J., 173, 787, (1978)). En una realizacion espedfica, dicho analisis de aLdH utiliza ALDEFLuOr® (Aldagen, Inc., Ashland, Oregon) como un marcador de la actividad aldelddo deshidrogenasa. En una realizacion espedfica, dicha pluralidad es de entre aproximadamente 3% y aproximadamente 25% de las celulas en dicha poblacion de celulas. En otra realizacion, se proporciona en la presente memoria una poblacion de celulas aisladas del cordon umbilical, p. eJ., celulas de cordon umbilical aisladas pluripotentes, en donde una pluralidad de dichas celulas del cordon umbilical aisladas son positivas para aldelddo deshidrogenasa, tal como se evalua por un analisis de actividad de aldelddo deshidrogenasa que utiliza ALDEFLUOR® como un indicador de la actividad aldelddo deshidrogenasa. En una realizacion espedfica, dicha pluralidad es de entre aproximadamente 3% y aproximadamente 25% de las celulas en dicha poblacion de celulas. En otra realizacion, dicha poblacion de celulas de la placenta aisladas o celulas de cordon umbilical aisladas muestra una actividad ALDH al menos tres veces, o al menos cinco veces, mas alta que una poblacion de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea que tiene aproximadamente el mismo numero de celulas y se cultiva en las mismas condiciones.

En otra realizacion espedfica de dichas celulas de la placenta aisladas o poblaciones de celulas que comprenden las celulas de la placenta aisladas, dichas celulas o poblacion se han ampliado, por eJemplo, se trasladaron al menos, aproximadamente, o no mas de, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, l3, 14, l5, 16, 17, 18, 19, o 20 veces, o proliferaron por lo menos, sobre, o no mas de, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones de poblacion. En otra realizacion espedfica de las celulas de la placenta aisladas, o poblaciones de celulas que comprenden celulas de la placenta aisladas, que se dan a conocer en la presente memoria, dichas celulas de la placenta aisladas son de origen fetal (es decir, tienen el genotipo fetal).

En una realizacion espedfica de cualquiera de las celulas de la placenta aisladas o poblaciones de celulas de la placenta aisladas anteriores, el cariotipo de las celulas, o al menos aproximadamente 95% o aproximadamente 99% de las celulas en dicha poblacion, es normal. En otra realizacion espedfica de cualquiera de las celulas de la placenta o poblaciones de celulas anteriores, las celulas, o celulas en la poblacion de celulas, no son de origen materno.

Las celulas de la placenta aisladas, o poblaciones de celulas de la placenta aisladas, que llevan cualquiera de las combinaciones de los marcadores anteriores, se pueden combinar en cualquier proporcion. Cualquiera de dos o mas de las poblaciones de celulas de la placenta aisladas anteriores se puede combinar para formar una poblacion de celulas de la placenta aisladas. Por eJemplo, una poblacion de celulas de la placenta aisladas puede comprender una primera poblacion de celulas de la placenta aisladas definida por una de las combinaciones de marcadores descritas anteriormente, y una segunda poblacion de celulas de la placenta aisladas definida por otra de las combinaciones de marcadores descritas anteriormente, en donde dichas primera y segunda poblaciones se combinan en una proporcion de aproximadamente 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, o aproximadamente 99:1. De la misma manera, se pueden combinar tres, cuatro, cinco o mas cualesquiera de las celulas de la placenta aisladas o poblaciones de celulas de la placenta aisladas descritas anteriormente.

Las celulas de la placenta aisladas, que se pueden utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, se pueden obtener, p. eJ., por la rotura de teJido placentario, con o sin digestion enzimatica (vease la Seccion 5.4.3) o perfusion (vease la Seccion 5.4.4). Por eJemplo, las poblaciones de celulas de la placenta aisladas pueden ser producidas de acuerdo con un metodo que comprende perfundir una placenta de mamffero cuya sangre se ha drenado del cordon umbilical y perfundido para eliminar la sangre residual; perfundir dicha placenta con una solucion de perfusion; y recoger dicha solucion de perfusion, en donde dicha solucion de perfusion despues de la perfusion comprende una poblacion de celulas de la placenta que comprende celulas de la placenta

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aisladas; y aislar una pluralidad de dichas celulas de la placenta aisladas de dicha poblacion de celulas. En una realizacion espedfica, la solucion de perfusion se hace pasar a traves tanto de la vena umbilical como de las arterias umbilicales y se recoge despues de que exude de la placenta. En otra realizacion espedfica, la solucion de perfusion se hace pasar a traves de la vena umbilical y se recoge de las arterias umbilicales, o se hace pasar a traves de las arterias umbilicales y se recoge de la vena umbilical.

En diversas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas, contenidas dentro de una poblacion de celulas obtenida a partir de la perfusion de la placenta, son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99,5% de dicha poblacion de celulas de la placenta. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas recogidas por perfusion comprenden celulas fetales y maternas. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas recogidas por perfusion son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99,5% celulas fetales.

En otra realizacion espedfica, se proporciona en la presente memoria una composicion que comprende una poblacion de celulas de la placenta aisladas, como se describe en la presente memoria, recogidas por perfusion, en donde dicha composicion comprende al menos una porcion de la solucion de perfusion utilizada para recoger las celulas de la placenta aisladas.

Las poblaciones aisladas de celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria se pueden producir mediante la digestion de tejido de la placenta con una enzima que desorganiza el tejido para obtener una poblacion de celulas de la placenta, que comprende las celulas, y el aislamiento de, o el aislamiento sustancial, de una pluralidad de celulas de la placenta del resto de dichas celulas de la placenta. La totalidad o cualquier parte de la placenta pueden ser digeridas para obtener las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria. En realizaciones espedficas, por ejemplo, dicho tejido de la placenta puede ser toda una placenta, una membrana amniotica, corion, una combinacion de amnios y corion, o una combinacion de cualquiera de los anteriores. En otra realizacion espedfica, la enzima que desorganiza el tejido es tripsina o colagenasa. En diversas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas, contenidas dentro de una poblacion de celulas obtenidas a partir de la digestion de una placenta, son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99,5% de dicha poblacion de celulas de la placenta.

El perfilado de genes confirma que las celulas de la placenta aisladas, y las poblaciones de celulas de la placenta aisladas, se distinguen de otras celulas, p. ej., celulas madre mesenquimales, p. ej., celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea. Las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria se pueden distinguir, p. ej., de las celulas madre mesenquimales basandose en la expresion de uno o mas genes, cuya expresion es significativamente mas alta en las celulas de la placenta aisladas, o en ciertas celulas madre del cordon umbilical aisladas, en comparacion con las celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea. En particular, las celulas de la placenta aisladas, que se puede utilizar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, se pueden distinguir de las celulas madre mesenquimales basandose en la expresion de uno o mas genes, cuya expresion es significativamente mayor (es decir, al menos dos veces superior) en las celulas de la placenta aisladas que en un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde uno o mas genes son ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A, o una combinacion de cualquiera de los anteriores, cuando se cultivan las celulas en condiciones equivalentes. Vease, p. ej., la Publicacion de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Num. 2007/0275362. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas expresan dichos uno o mas genes cuando se cultivan durante aproximadamente 3 a aproximadamente 35 duplicaciones de la poblacion en un medio que comprende DMEM-LG (Gibco); suero de ternera fetal al 2% (Hyclone Labs.); 1x insulina-transferrina-selenio (ITS); 1x acido linoleico- albumina de suero bovino (LA-BSA); dexametasona 10-9 M (Sigma); acido ascorbico 2-fosfato 10-4 M (Sigma); factor de crecimiento epidermico de 10 ng/ml (R & D Systems); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) de 10 ng/ml (R & D Systems). En una realizacion espedfica, el gen espedfico de celulas de la placenta aisladas o espedfico de celulas de cordon umbilical aisladas es CD200.

Las secuencias espedficas para estos genes se pueden encontrar en GenBank en los numeros de acceso NM_001615 (ACTG2), BC065545 (ADARB1), (NM_181847 (AMIGO2), AY358590 (ARTS-1), BC074884 (B4GALT6), BC008396 (BCHE), BC020196 (C11orf9), BC031103 (CD200), NM_001845 (COL4A1), NM_001846 (COL4A2), BC052289 (CPA4), BC094758 (DMD), AF293359 (DSC3), NM_001943 (DSG2), AF338241 (ELOVL2), AY336105 (F2RL1), NM_018215 (FLJ10781), AY416799 (GATA6), BC075798 (GPR126), NM_016235 (GPRC5B), AF340038 (ICAM1), BC000844 (IER3), BC066339 (IGFBP7), BC013142 (IL1A), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRT18, BC075839 (KRT8), BC060825 (LIPG), BC065240 (LRAP), BC010444 (MATN2), BC011908 (MEST), BC068455 (NFE2L3), NM_014840 (NUAK1), AB006755 (PCDH7), NM_014476 (PDLIM3), BC126199 (PKP-2), BC090862 (RTN1), BC002538 (SERPINB9), BC023312 (ST3GAL6), BC001201 (ST6GALNAC5), BC126160 o BC065328 (SLC12A8), BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN), y BC005001 (ZC3H12A) de Marzo de 2008.

En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas expresan cada uno de ACTG2, ADARB1,

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AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A a un nivel detectablemente mayor que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, cuando se cultivan las celulas en condiciones equivalentes.

En realizaciones mas espedficas, las poblaciones de celulas de la placenta se pueden seleccionar mediante la seleccion de celulas de la placenta que expresan uno o mas genes en un nivel detectablemente mayor que una celula madre mesenquimal derivada de medula osea, en donde dichos uno o mas genes se seleccionan del grupo que consiste en ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A, y en donde dichas celulas madre derivadas de la medula osea han sido objeto de una serie de pases en cultivo equivalente al numero de pases que ha experimentado dicha celula de la placenta. En una realizacion mas espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar celulas que expresan ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A a un nivel detectablemente mayor que una celula madre mesenquimal derivada de medula osea.

La expresion de los genes mencionados anteriormente se puede evaluar por medio de tecnicas convencionales. Por ejemplo, las sondas basadas en la secuencia del gen o los genes se pueden seleccionar individualmente y construir por medio de tecnicas convencionales. La expresion de los genes se puede evaluar, p. ej., en una micromatriz que comprende sondas para uno o mas de los genes, p. ej., una matriz Affymetrix GENECHIP® Human Genome U133A 2.0, o Affymetrix GENECHIP® Human Genome Ul33 Plus 2.0 (Santa Clara, California). La expresion de estos genes se puede evaluar incluso si la secuencia para un numero particular de acceso de GenBank se modifica porque las sondas espedficas para la secuencia modificada se pueden generar facilmente utilizando tecnicas convencionales bien conocidas.

El nivel de expresion de estos genes se puede utilizar para confirmar la identidad de una poblacion de celulas de la placenta aisladas, para identificar una poblacion de celulas que comprende al menos una pluralidad de celulas de la placenta aisladas, o similares. Las poblaciones de celulas de la placenta aisladas, cuya identidad se confirma, puede ser clonal, p. ej., las poblaciones de celulas de la placenta aisladas ampliadas a partir de una unica celula de la placenta aislada, o una poblacion mixta de celulas madre, p. ej., una poblacion de celulas que comprende unicamente celulas de la placenta aisladas que se amplfan a partir de multiples celulas de la placenta aisladas, o una poblacion de celulas que comprende celulas de la placenta aisladas, como se describe en la presente memoria, y al menos otro tipo de celula.

El nivel de expresion de estos genes se puede utilizar para seleccionar poblaciones de celulas de la placenta aisladas. Por ejemplo, se puede seleccionar una poblacion de celulas, p. ej., celulas ampliadas clonalmente, si la expresion de uno o mas de los genes mencionados anteriormente es significativamente mayor en una muestra de la poblacion de celulas que en una poblacion equivalente de celulas madre mesenquimales. Tal seleccion puede ser de una poblacion de una pluralidad de poblaciones de celulas de la placenta aisladas, de una pluralidad de poblaciones de celulas, cuya identidad no se conoce, etc.

Las celulas de la placenta aisladas se pueden seleccionar basandose en el nivel de expresion de uno o mas de dichos genes en comparacion con el nivel de expresion en dichos uno o mas genes, p. ej., un control de celulas madre mesenquimales, por ejemplo, el nivel de expresion en dichos uno o mas genes en un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea. En una realizacion, el nivel de expresion de dichos uno o mas genes en una muestra que comprende un numero equivalente de celulas madre mesenquimales se utiliza como control. En otra realizacion, el control, para celulas de la placenta aisladas sometidas a ensayo bajo ciertas condiciones, es un valor numerico que representa el nivel de expresion de dichos uno o mas genes en las celulas madre mesenquimales en dichas condiciones.

Las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria muestran las caractensticas anteriores (p. ej., combinaciones de marcadores de la superficie celular y/o perfiles de expresion genica) en cultivo primario, o durante la proliferacion en medio que comprende, p. ej., DMEM-LG (Gibco), suero de ternera fetal (FCS) al 2% (Hyclone Laboratories), 1x insulina-transferrina-selenio (ITS), 1x acido linolenico-albumina de suero bovino (LA-BSA), dexametasona 10-9 M (Sigma), acido ascorbico-2-fosfato 10-4 M (Sigma), factor de crecimiento epidermico (EGF) de 10 ng/ml (R & D Systems), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) de 10 ng/ml (R & D Systems), y 100 U de penicilina/1000 U de estreptomicina.

Las poblaciones aisladas de celulas de la placenta descritas anteriormente, y las poblaciones de celulas de la placenta aisladas en general, pueden comprender aproximadamente, al menos, o no mas de, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o mas de las celulas de la

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placenta aisladas. Las poblaciones de celulas de la placenta aisladas que se pueden usar en las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria comprenden al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% de celulas de la placenta aisladas viables, segun se determina, por ejemplo, mediante exclusion de azul de tripan.

5.3.3 Crecimiento en cultivo

El crecimiento de las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria, como para cualquier celula de mairnfero, depende en parte del medio particular seleccionado para el crecimiento. En condiciones optimas, las celulas de la placenta aisladas normalmente duplican su numero en 3-5 dfas. Durante el cultivo, las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria se adhieren a un sustrato en cultivo, p. ej., la superficie de un recipiente de cultivo de tejidos (p. ej., plastico de la placa de cultivo de tejidos, plastico recubierto de fibronectina, y similares) y forman una monocapa.

Las poblaciones de celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria, cuando se cultivan en condiciones apropiadas, forman cuerpos de tipo embrioide, es decir, agrupaciones tridimensionales de celulas que crecen encima de la capa de celulas madre adherentes. Las celulas dentro de los cuerpos de tipo embrioide expresan marcadores asociados con celulas madre muy temprano, p. ej., OCT-4, Nanog, SSEA3 y SSEA4. Las celulas dentro de los cuerpos de tipo embrioide no suelen ser adherentes al sustrato de cultivo, al igual que las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria, pero permanecen ancladas a las celulas adherentes durante el cultivo. Las celulas de los cuerpos de tipo embrioide dependen de las celulas de la placenta aisladas adherentes para la viabilidad, ya que los cuerpos de tipo embrioide no se forman en ausencia de celulas de la placenta aisladas adherentes. De ese modo, las celulas de la placenta aisladas adherentes facilitan el crecimiento de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta que comprende las celulas de la placenta aisladas adherentes. Sin desear estar limitado por la teona, se cree que las celulas de los cuerpos de tipo embrioide crecen sobre las celulas de la placenta aisladas adherentes tanto como crecen las celulas madre embrionarias sobre una capa de celulas de alimentacion. Las celulas madre mesenquimales, p. ej., celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, no desarrollan cuerpos de tipo embrioide en cultivo.

5.3.4 Celulas madre de la placenta hematopoyeticas

En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas son celulas de la placenta CD34+, p. ej., celulas de la placenta hematopoyeticas. Tales celulas CD34+ no estan, sin embargo, comprendidas en el termino "pluripotentes" segun se utiliza en la presente memoria. Tales celulas se pueden obtener a partir de tejido de la placenta, p. ej., a partir de una placenta cuya sangre se ha drenado del cordon umbilical y se ha perfundido para eliminar la sangre residual. En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas CD34+ son CD38+. En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas CD34+ son CD38-. En otras ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas CD34+ son CD45+. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD34+, CD38- y CD45+.

5.3.5 Celulas de liquido perfundido de la placenta

En ciertas realizaciones, las celulas de las composiciones proporcionadas en la presente memoria, formuladas por medio de los metodos proporcionados en la presente memoria, son celulas obtenidas de lfquido perfundido de la placenta. Segun se utiliza en la presente memoria, "celulas obtenidas de lfquido perfundido de la placenta" incluye celulas nucleadas totales obtenidas a partir de, p. ej., aisladas de, lfquido perfundido de placenta, un subconjunto de las celulas nucleadas obtenidas de lfquido perfundido de la placenta, o celulas cultivadas o que han proliferado a partir de celulas obtenidas directamente de lfquido perfundido de la placenta. El lfquido perfundido de la placenta se puede obtener a partir de una placenta cuya sangre se ha drenado del cordon umbilical y se ha perfundido para eliminar la sangre residual, antes de la perfusion para obtener celulas de la placenta. El lfquido perfundido de la placenta se puede obtener a partir de una placenta cuya sangre se ha drenado del cordon umbilical, pero no se ha perfundido para eliminar la sangre residual. El lfquido perfundido de la placenta se puede obtener a partir de una placenta cuya sangre no ha sido ni drenada del cordon umbilical ni perfundida para eliminar la sangre residual. En las dos ultimas realizaciones, las celulas de la placenta, p. ej., las celulas nucleadas de lfquido perfundido de la placenta, por ejemplo, las celulas nucleadas totales del lfquido perfundido de la placenta, comprenden celulas nucleadas de la sangre de la placenta y/o sangre del cordon. Los metodos para obtener el lfquido perfundido de la placenta, y las celulas del lfquido perfundido de la placenta, se describen en la Seccion 5.4.4, a continuacion.

5.4 Metodos para obtener celulas de la placenta aisladas

5.4.1 Composicion de recogida de celulas madre

Adicionalmente se describen en la presente memoria metodos de recogida y aislamiento de celulas de la placenta p. ej., las celulas de la placenta aisladas descritas en la Seccion 5.2, mas arriba. Generalmente, tales celulas se obtienen a partir de una placenta de mamffero utilizando una solucion fisiologicamente aceptable, p. ej., una composicion de recogida de celulas madre. Una composicion de la recogida de celulas se describe en detalle en la Publicacion de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Num. 2007/0190042, relacionada titulada "Improved Medium for Collecting Placental Stem cells and Preserving Organs".

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La composicion de recogida de celulas puede comprender cualquier solucion fisiologicamente aceptable adecuada para la recogida y/o cultivo de celulas, p. ej., las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria, por ejemplo, una solucion salina (p. ej., solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Krebs, solucion de Krebs modificada, solucion de Eagle, NaCl al 0,9%. etc.), un medio de cultivo (p. ej., DMEM, H.DMEM, etc.), y similares.

La composicion de recogida de celulas puede comprender uno o mas componentes que tienden a conservar las celulas de la placenta aisladas, es decir, evitar que las celulas de la placenta aisladas mueran, o retrasar la muerte de las celulas de la placenta aisladas, reducir el numero de celulas de la placenta aisladas en una poblacion de celulas que mueren, o similar, desde el momento de la recogida hasta el momento del cultivo. Tales componentes pueden ser, p. ej., un inhibidor de la apoptosis (p. ej., un inhibidor de caspasa o un inhibidor de JNK); un vasodilatador (p. ej., sulfato de magnesio, un farmaco antihipertensivo, peptido natriuretico atrial (ANP), adrenocorticotropina, hormona liberadora de corticotropina, nitroprusiato de sodio, hidralazina, adenosina trifosfato, adenosina, indometacina o sulfato de magnesio, un inhibidor de la fosfodiesterasa, etc.); un inhibidor de la necrosis (p. ej., 2-(1H-Indol-3-il)-3-pentilamino-maleimida, ditiocarbamato de pirrolidina, o clonazepam); un inhibidor de TNF- a; y/o un perfluorocarbono de transporte de oxfgeno (p. ej., bromuro de perfluorooctilo, bromuro de perfluorodecilo, etc.).

La composicion de recogida de celulas puede comprender una o mas enzimas que degradan el tejido, p. ej., una metaloproteasa, una serina proteasa, una proteasa neutra, una ARNasa, o una ADNasa, o similares. Tales enzimas incluyen, pero no se limitan a, colagenasas (p. ej., colagenasa I, II, III o IV, una colagenasa de Chlostridium histolyticum, etc.); dispasa, termolisina, elastasa, tripsina, LIBERASE, hialuronidasa, y similares.

La composicion de recogida de celulas puede comprender una cantidad eficaz como bactericida o bacteriostatico de un antibiotico. El antibiotico puede ser un macrolido (p. ej., tobramicina), una cefalosporina (p. ej., cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima o cefadroxil), una claritromicina, una eritromicina, una penicilina (p. ej., penicilina V) o una quinolona (p. ej., ofloxacina, ciprofloxacina o norfloxacina), una tetraciclina, una estreptomicina, etc. El antibiotico puede ser activo contra bacterias Gram (+) y/o (Gram (-), p. ej., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, y similares.

La composicion de recogida de celulas tambien puede comprender uno o mas de los siguientes compuestos: adenosina (de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM); D-glucosa (de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM); iones de magnesio (de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM); una macromolecula de peso molecular mayor de 20.000 dalton, p. ej., presente en una cantidad suficiente para mantener la integridad endotelial y la viabilidad celular (p. ej., un coloide de origen natural o sintetico, un polisacarido tal como dextrano o un polietilenglicol presente de aproximadamente 25 g/l a aproximadamente 100 g/l, o de aproximadamente 40 g/l a aproximadamente 60 g/l); un antioxidante (p. ej., hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutation, vitamina C o vitamina E presentes de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM); un agente reductor (p. ej., N-acetilcistema presente de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 5 mM); un agente que impide la entrada de calcio en las celulas (p. ej., verapamilo presente de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 25 mM); nitroglicerina (p. ej., de aproximadamente 0,05 g/L a aproximadamente 0,2 g/L); un anticoagulante, p. ej., presente en una cantidad suficiente para ayudar a prevenir la coagulacion de la sangre residual (p. ej., heparina o hirudina presentes a una concentracion de aproximadamente 1.000 unidades/l a aproximadamente 100.000 unidades/l); o un compuesto que contiene amilorida (p. ej., amilorida, etil isopropil amilorida, hexametilen amilorida, dimetil amilorida o isobutil amilorida presentes de aproximadamente 1,0 M a aproximadamente 5 mM).

5.4.2 Recogida y manipulacion de la placenta

En general, la placenta humana se recupera poco despues de su expulsion despues del nacimiento. La placenta se recupera preferiblemente de una paciente despues del consentimiento informado y despues de recoger un historial clmico completo de la paciente y asociarlo con la placenta. Preferiblemente, el historial medico continua despues del parto. Un historial medico de este tipo puede ser utilizado para coordinar el uso posterior de la placenta o las celulas madre recolectadas de la misma. Por ejemplo, las celulas madre de la placenta humana pueden ser utilizadas, a la luz del historial clmico, para la medicina personalizada para el recien nacido asociado a la placenta, o para los padres, hermanos u otros parientes del recien nacido.

Antes de la recuperacion de las celulas de la placenta aisladas, se eliminan la sangre del cordon umbilical y la sangre de la placenta. Despues del parto, se recupera la sangre del cordon umbilical de la placenta. La placenta se puede someter a un proceso de recuperacion de sangre de cordon convencional. Tfpicamente se utiliza una aguja o canula, con la ayuda de la gravedad, para desangrar la placenta (veanse, p. ej., Anderson, Patente de los Estados Unidos Num. 5.372.581; Hessel et al., Patente de Estados Unidos Num. 5.415.665). La aguja o canula se colocan generalmente en la vena umbilical y la placenta puede ser masajeada suavemente para ayudar a drenar la sangre del cordon de la placenta. Semejante recuperacion de sangre del cordon umbilical se puede realizar de manera comercial, p. ej., LifeBank USA, Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry and Cryocell. Preferiblemente, la placenta es drenada por gravedad sin manipulacion adicional con el fin de minimizar la desorganizacion del tejido durante la recuperacion de sangre del cordon.

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Tfpicamente, una placenta es transportada desde la sala de partos o alumbramientos a otra ubicacion, p. ej., un laboratorio, para la recuperacion de la sangre del cordon y la recogida de las celulas madre, p. ej., por medio de perfusion o disociacion del tejido. La placenta se transporta preferiblemente en un dispositivo de transporte esteril, aislado termicamente (manteniendo la temperatura de la placenta entre 20-28°C), por ejemplo, mediante la colocacion de la placenta, con el cordon umbilical proximal sujeto con unas pinzas, en una bolsa de plastico con cierre de cremallera esteril, que se coloca a continuacion en un recipiente aislado. Alternativamente, la placenta se transporta en un kit de recogida de sangre de cordon sustancialmente como se describe en la Patente de los Estados Unidos pendiente Num. 7.147.626. Preferiblemente, la placenta se entrega al laboratorio de cuatro a veinticuatro horas despues del parto. Por ejemplo, el cordon umbilical proximal se sujeta con pinzas, preferiblemente a 4-5 cm (cenffmetros) de la insercion en el disco de la placenta antes de la recuperacion de sangre del cordon. Alternativamente, el cordon umbilical proximal se sujeta con pinzas despues de la recuperacion de sangre del cordon, pero antes del procesamiento adicional de la placenta.

La placenta se puede almacenar, antes de la recogida de celulas, en condiciones esteriles y a la temperatura ambiente o a una temperatura de 5-25°C (grados cenffgrados). La placenta se puede conservar durante un penodo de cuatro a veinticuatro horas, hasta cuarenta y ocho horas, o mas de cuarenta y ocho horas, antes de la perfusion de la placenta para eliminar la sangre del cordon residual. Preferiblemente, la placenta se recoge entre aproximadamente cero horas y aproximadamente dos horas despues de la expulsion. La placenta se almacena preferiblemente en una solucion anticoagulante a una temperatura de 5-25°C (grados cenffgrados). Las soluciones anticoagulantes adecuadas son bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, se puede utilizar una solucion de heparina o warfarina sodica. Preferiblemente, la solucion anticoagulante comprende una solucion de heparina (p. ej., al 1% p/p en solucion 1:1000). La placenta desangrada se almacena preferiblemente durante no mas de 36 horas antes de recoger las celulas de la placenta.

La placenta de mairnfero o una parte de la misma, una vez recogidas y preparadas generalmente como anteriormente, pueden ser tratadas de cualquier manera conocida en la tecnica, p. ej., pueden ser perfundidas o rotas, p. ej., digeridas con una o mas enzimas de rotura de tejido, para obtener celulas de la placenta aisladas.

5.4.3 Rotura ffsica y digestion enzimatica del tejido de la placenta

Las celulas madre se pueden recoger de una placenta de mamffero por rotura ffsica de parte o de la totalidad del organo. Por ejemplo, la placenta, o una porcion de la misma, pueden ser, p. ej., trituradas, cortadas, picadas, cortadas en cubitos, picadas, maceradas o similares. El tejido se puede cultivar a continuacion para obtener una poblacion de celulas de la placenta aisladas. Tfpicamente, el tejido de la placenta se rompe utilizando, p. ej., una composicion de recogida de celulas de la placenta (vease la Seccion 5.2 y mas abajo).

La placenta puede ser diseccionada en componentes antes de la rotura ffsica y/o la digestion enzimatica y la recuperacion de las celulas madre. Las celulas madre de la placenta se pueden obtener a partir de la totalidad o de una porcion de la membrana amniotica, corion, cordon umbilical, cotiledones de la placenta, o cualquier combinacion de los mismos, incluso de toda una placenta. Preferiblemente, las celulas de la placenta aisladas se obtienen a partir de tejido de la placenta que comprende amnios y corion. Tfpicamente, las celulas de la placenta aisladas se pueden obtener por la rotura de un pequeno bloque de tejido de la placenta, p. ej., un bloque de tejido de la placenta que tiene un volumen de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 3o, 4o, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o aproximadamente 1000 miffmetros cubicos. Se puede utilizar cualquier metodo de rotura ffsica, siempre que el metodo de rotura deje una pluralidad, mas preferiblemente una mayor parte, y mas preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% de las celulas de dicho organo viables, como se determina, p. ej., por medio de exclusion de azul de tripan.

Las celulas madre generalmente se pueden recoger de una placenta, o una porcion de la misma, en cualquier momento dentro de los tres primeros dfas despues de la expulsion, pero preferiblemente entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 18 horas despues de la expulsion.

El tejido roto se puede cultivar en un medio de cultivo de tejido adecuado para la proliferacion de celulas de la placenta aisladas (vease, p. ej., la Seccion 5.5, mas abajo, que describe el cultivo de celulas de la placenta aisladas).

Alternativamente, la placenta aislada se recoge por rotura ffsica del tejido de la placenta, en donde la rotura ffsica incluye la digestion enzimatica, que se puede lograr mediante el uso de una o mas enzimas de digestion de tejido. La placenta, o una porcion de la misma, tambien se pueden romper ffsicamente y digerir con una o mas enzimas, y el material resultante se sumerge a continuacion en, o se mezcla en, una composicion de recogida de celulas.

Una composicion de recogida de celulas preferida comprende una o mas enzimas de rotura de tejidos. La digestion enzimatica utiliza preferiblemente una combinacion de enzimas, p. ej., una combinacion de una metaloproteasa de la matriz y una proteasa neutra, por ejemplo, una combinacion de colagenasa y dispasa. Por ejemplo, la digestion enzimatica de tejido de la placenta utiliza una combinacion de una metaloproteasa de la matriz, una proteasa neutra, y una enzima mucofftica para la digestion del acido hialuronico, tal como una combinacion de colagenasa, dispasa, y hialuronidasa o una combinacion de LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) y hialuronidasa.

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Otras enzimas que se pueden utilizar para romper el tejido de la placenta incluyen papama, desoxirribonucleasas, serina proteasas, tales como tripsina, quimotripsina, o elastasa. Las serina proteasas pueden ser inhibidas por la alfa 2 microglobulina del suero y, por tanto, el medio utilizado para la digestion esta por lo general libre de suero. Comunmente se utilizan EDTA y ADNasa en los procedimientos de digestion enzimatica para aumentar la eficacia de la recuperacion celular. El producto digerido se diluye preferiblemente con el fin de evitar que las celulas queden atrapadas dentro del producto digerido viscoso.

Se puede utilizar cualquier combinacion de enzimas de digestion de tejido. Las concentraciones tfpicas para las enzimas de digestion de tejido incluyen, p. ej., de 50 a 200 U/ml para la colagenasa I y la colagenasa IV, de 1 a 10 U/ml para la dispasa, y de 10 a 100 U/ml para la elastasa. Las proteasas se pueden utilizar combinadas, es decir, dos o mas proteasas en la misma reaccion de digestion, o se pueden utilizar de forma secuencial con el fin de liberar las celulas de la placenta, p. ej., celulas madre de la placenta y celulas pluripotentes de la placenta. Por ejemplo, una placenta, o porcion de la misma, se digiere primero con una cantidad apropiada de colagenasa I de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mg/ml durante, p. ej., 30 minutos, seguido de digestion con tripsina, a una concentracion de aproximadamente 0,25%, durante, p. ej., 10 minutos, a 37°C. Las serina proteasas se utilizan preferiblemente de manera consecutiva despues del uso de otras enzimas.

Alternativamente, el tejido puede ser roto adicionalmente por la adicion de un quelante, p. ej., acido etilenglicol- bis(eter 2-aminoetil eter)-N,N,N',N'-tetraacetico (EGTA) o acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) a la composicion de recogida de celulas de la placenta, o a una solucion en la que el tejido se rompe y/o digiere antes del aislamiento de las celulas de la placenta con la composicion de recogida de celulas de la placenta.

Despues de la digestion, el producto digerido se lava, por ejemplo tres veces, con medio de cultivo, y las celulas lavadas se siembran en frascos de matraces de cultivo. Las celulas se afslan a continuacion mediante adherencia diferencial, y se caracterizan por, p. ej., la viabilidad, los marcadores de superficie celular, la diferenciacion, y similares.

Se apreciara que, cuando toda una placenta, o una parte de una placenta que comprenden celulas tanto fetales como maternas (por ejemplo, cuando la porcion de la placenta comprende el corion o los cotiledones), las celulas de la placenta recogidas comprenderan una mezcla de celulas de la placenta, p. ej., celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta, derivadas de fuentes tanto fetales como maternas. Cuando una parte de la placenta que no comprende, o comprende un numero insignificante de, celulas maternas (por ejemplo, amnios), las celulas de la placenta recogidas comprenderan celulas de la placenta casi exclusivamente fetales, p. ej., celulas madre de la placenta fetales o celulas pluripotentes de la placenta fetales.

Las celulas de la placenta se pueden aislar a partir de tejido roto por tripsinizacion diferencial (vease la Seccion 5.4.5, a continuacion) seguido de cultivo en uno o mas nuevos recipientes de cultivo en medio de proliferacion de nueva aportacion, seguido opcionalmente por una segunda etapa de tripsinizacion diferencial.

5.4.4 Perfusion de la placenta

Las celulas de la placenta, p. ej., celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta, tambien se pueden obtener por perfusion de placenta de mairnfero. Los metodos de perfusion de la placenta de marnffero para obtener celulas de la placenta se describen, p. ej., en Hariri, Patentes de Estados Unidos Nums. 7.045.148 y 7.255.729 y en la Publicacion de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos relacionada No. 2007/0190042.

Las celulas de la placenta se pueden recoger por perfusion, p. ej., a traves de la vasculatura de la placenta, utilizando, p. ej., una composicion de recogida de celulas como solucion de perfusion. Por ejemplo, una placenta de mamffero es perfundida haciendo pasar la solucion de perfusion a traves de una o ambas de la arteria umbilical y la vena umbilical. El flujo de la solucion de perfusion a traves de la placenta se puede realizar utilizando, p. ej., el flujo por gravedad en la placenta. Preferiblemente, se hace que la solucion de perfusion pase a traves de la placenta por medio de una bomba, p. ej., una bomba peristaltica. La vena umbilical puede ser, p. ej., canulada con una canula, p. ej., una canula de TEFLON® o de plastico, que esta conectada con un aparato de conexion esteril, tal como un tubo esteril. El aparato de conexion esteril esta conectado a un colector de perfusion.

En la preparacion para la perfusion, la placenta se orienta preferiblemente (p. ej., se suspende) de una manera tal que la arteria umbilical y la vena umbilical se encuentran en el punto mas alto de la placenta. La placenta puede ser perfundida por el paso de un fluido de perfusion a traves de la vasculatura de la placenta y el tejido circundante. La placenta tambien puede ser perfundida mediante el paso de un fluido de perfusion a la vena umbilical y la recogida desde las arterias umbilicales, o el paso de un fluido de perfusion a las arterias umbilicales y la recogida desde la vena umbilical.

Por ejemplo, la arteria umbilical y la vena umbilical se conectan de forma simultanea, p. ej., a una pipeta que esta conectada a traves de un conector flexible a un deposito de la solucion de perfusion. La solucion de perfusion se hace pasar a la vena y la arteria umbilicales. La solucion de perfusion exuda desde y/o pasa a traves de las paredes de los vasos sangumeos en los tejidos circundantes de la placenta, y se recoge en un recipiente abierto adecuado de la superficie de la placenta que se adjunta al utero de la madre durante la gestacion. La solucion de perfusion tambien se puede introducir a traves de la apertura del cordon umbilical y dejar que fluya o se filtre fuera de las

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aberturas en la pared de la placenta que conectan con la pared del utero materno. Las celulas de la placenta que son recogidas por este metodo, que se puede denominar metodo "pan", son tipicamente una mezcla de celulas fetales y maternas.

Por ejemplo, la solucion de perfusion se hace pasar a traves de las venas umbilicales y se recoge de la arteria umbilical, o se hace pasar a traves de la arteria umbilical y se recoge de las venas umbilicales. Las celulas de la placenta recogidas por este metodo, al que se puede hacer referencia como un metodo de "circuito cerrado", son tipicamente casi exclusivamente fetales.

Se apreciara que la perfusion utilizando el metodo pan, es decir, por el que se recoge el lfquido perfundido despues de que haya exudado desde el lado materno de la placenta, da como resultado una mezcla de celulas fetales y maternas. Como resultado, las celulas recogidas por este metodo comprenden una poblacion mixta de celulas de la placenta, p. ej., celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta, de origen tanto fetal como materno. En contraste, la perfusion unicamente a traves de la vasculatura de la placenta en el metodo de circuito cerrado, por el que se hace pasar el fluido de perfusion a traves de uno o dos vasos de la placenta y se recoge unicamente a traves del vaso o los vasos restantes, da como resultado la recogida de una poblacion de celulas de la placenta casi exclusivamente de origen fetal.

El metodo de perfusion de circuito cerrado se puede realizar como sigue. Se obtiene una placenta despues del parto en el plazo de aproximadamente 48 horas despues del nacimiento. El cordon umbilical se pinza y se corta por encima de la pinza. El cordon umbilical se puede descartar, o se puede procesar para recuperar, p. ej., celulas madre del cordon umbilical, y/o para procesar la membrana del cordon umbilical para la produccion de un biomaterial. La membrana amniotica puede ser retenida durante la perfusion, o se puede separar del corion, p. ej., utilizando una diseccion roma con los dedos. Si la membrana amniotica se separa del corion antes de la perfusion, esta puede ser, p. ej., desechada, o procesada, p. ej., para obtener celulas de la placenta mediante digestion enzimatica, o para producir, p. ej., un biomaterial de membrana amniotica, p. ej., el biomaterial descrito en la Publicacion de la Solicitud de los Estados Unidos Num. 2004/0048796. Despues de limpiar la placenta de todos los coagulos de sangre visibles y de sangre residual, p. ej., utilizando una gasa esteril, los vasos del cordon umbilical se exponen, p. ej., cortando parcialmente la membrana del cordon umbilical para exponer una seccion transversal del cordon. Los vasos se identifican, y se abren, p. ej., haciendo avanzar una pinza cocodrilo cerrada a traves del extremo de corte de cada recipiente. El aparato, p. ej., un tubo de plastico conectado a un dispositivo de perfusion o bomba peristaltica, se inserta a continuacion en cada una de las arterias de la placenta. La bomba puede ser cualquier bomba adecuada para el proposito, p. ej., una bomba peristaltica. El tubo de plastico, conectado a un deposito de recogida esteril, p. ej., una bolsa de sangre, tal como una bolsa de recogida de 250 ml, se inserta despues en la vena de la placenta. Alternativamente, el tubo conectado a la bomba se inserta en la vena de la placenta, y los tubos para uno o varios depositos de recogida se insertan en una o ambas arterias de la placenta. La placenta se perfunde a continuacion con un volumen de solucion de perfusion, p. ej., aproximadamente 750 ml de solucion de perfusion. Las celulas en el lfquido perfundido se recogen a continuacion, p. ej., por centrifugacion.

La perfusion p. ej., para recoger las celulas de lfquido perfundido de la placenta, se puede realizar como sigue. La placenta o las placentas que contienen sangre de la placenta se perfunden solamente a traves de la vasculatura de la placenta mediante el bombeo de NaCl esteril al 0,9% (p. ej., aproximadamente 750 ml) utilizando, p. ej., una bomba peristaltica, y el lfquido perfundido resultante se recoge en una bolsa de recogida. Las celulas del lfquido perfundido se recogen por centrifugacion, p. ej., a aproximadamente 420 g, seguido de la eliminacion del exceso de sobrenadante (NaCl, plasma, anticoagulante). A continuacion se anade a las celulas del lfquido perfundido hetalmidon para obtener una dilucion al 30%. Las celulas del lfquido perfundido se colocan de nuevo en un extractor de plasma, p. ej., durante aproximadamente una hora, para separar los eritrocitos. El plasma y las celulas nucleadas resultantes se separan de la bolsa de recogida, y se colocan de nuevo en un extractor de plasma. Las celulas restantes se resuspenden en albumina de suero humano al 5% en un volumen final de aproximadamente 20 ml. Se anaden DMSO/PLASMALYTE A® (1:1 v/v) premezclados para obtener un volumen de aproximadamente 24 ml. Las celulas resultantes son crioconservadas. En aspectos espedficos de este metodo, se drena la sangre del cordon umbilical de la placenta a partir del cual se obtiene el lfquido perfundido, pero no se perfunde, antes de la perfusion para recoger las celulas de la placenta. Alternativamente, la placenta a partir de la cual se obtiene el lfquido perfundido se vada de sangre del cordon umbilical, y se perfunde para eliminar la sangre residual, antes de la perfusion para recoger celulas de la placenta.

Por ejemplo, el cordon umbilical proximal se sujeta con una pinza durante la perfusion, y mas preferiblemente, se sujeta con una pinza a 4-5 cm (centimetros) de la insercion del cordon en el disco de la placenta.

El volumen de lfquido de perfusion utilizado para recoger celulas de la placenta puede variar en funcion del numero de celulas que se vaya a recoger, del tamano de la placenta, del numero de recogidas que se vaya a realizar de una sola placenta, etc. El volumen de lfquido perfundido puede ser de 50 ml a 5000 ml, de 50 ml a 4000 ml, de 50 ml a 3000 ml, de 100 ml a 2000 ml, de 250 ml a 2000 ml, de 500 ml a 2000 ml o de 750 ml a 2000 ml. Por lo general, la placenta se perfunde con 700-800 ml de lfquido de perfusion tras el desangrado.

La placenta se puede perfundir una pluralidad de veces durante el curso de varias horas o varios dfas. Cuando la placenta se va a perfundir una pluralidad de veces, se puede mantener o cultivar en condiciones asepticas en un

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contenedor u otro recipiente adecuado, y perfundir con la composicion de recogida de celulas, o una solucion de perfusion convencional (p. ej., una solucion salina normal, tal como solucion salina tamponada con fosfato ("PBS")) con o sin un anticoagulante (p. ej., heparina, warfarina sodica, cumarina, bishidroxicumarina), y/o con o sin un agente antimicrobiano (p. ej., p-mercaptoetanol (0,1 mM); antibioticos tales como estreptomicina (p. ej., de 40 a 100 |jg/ml), penicilina (p. ej., a 40 U/ml), anfotericina B ( p. ej., a 0,5 jg/ml). Por ejemplo, una placenta aislada se mantiene o se cultiva durante una penodo de tiempo sin recoger el lfquido perfundido, de tal manera que la placenta se mantiene o se cultiva durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 horas, o 2 o 3 o mas dfas antes de la perfusion y la recogida de lfquido perfundido. La placenta perfundida se puede mantener una o mas veces adicionales, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o mas horas, y perfundir una segunda vez, p. ej., con 700-800 ml fluido de perfusion. La placenta se puede perfundir 1, 2, 3, 4, 5 o mas veces, por ejemplo, una vez cada 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. Preferiblemente, la perfusion de la placenta y la recogida de la solucion de perfusion, p. ej., composicion de recogida de celulas, se repiten hasta que el numero de celulas nucleadas recuperadas cae por debajo de 100 celulas/ml. Los lfquidos de perfusion en diferentes puntos temporales se pueden seguir procesando de forma individual para recuperar las poblaciones dependientes del tiempo de las celulas, p. ej., celulas madre. Los lfquidos de perfusion de diferentes puntos de tiempo tambien pueden ser combinados. Preferiblemente, las celulas madre se recogen de una vez o en momentos entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 18 horas despues de la expulsion.

La perfusion da como resultado preferiblemente la recogida de significativamente mas celulas de la placenta que el numero que se puede obtener a partir de una placenta de mairnfero no perfundida con dicha solucion, y no tratada de otra manera para obtener celulas de la placenta (p. ej., por rotura de tejido, p. ej., digestion enzimatica). En este contexto, "significativamente mas" significa al menos 10% mas. La perfusion proporciona significativamente mas celulas madre de la placenta que, p. ej., el numero de celulas de la placenta que se puede obtener a partir de medio de cultivo en el que se ha cultivado una placenta, o parte de la misma.

Las celulas de la placenta pueden ser aisladas de la placenta por perfusion con una solucion que comprende una o mas proteasas u otras enzimas de rotura de tejidos. Por ejemplo, una placenta o una porcion de la misma (p. ej., membrana amniotica, amnios y corion, lobulo o cotiledon de la placenta, cordon umbilical, o combinacion de cualquiera de los anteriores) se lleva a 25-37°C, y se incuba con una o mas enzimas de rotura de tejido en 200 ml de un medio de cultivo durante 30 minutos. Las celulas del lfquido perfundido se recogen, se llevan a 4°C, y se lavan con una mezcla fna inhibidora que comprende EDTA 5 mM, ditiotreitol 2 mM y beta-mercaptoetanol 2 mM. Las celulas de la placenta se lavan despues de varios minutos con una composicion de recogida de celulas madre fna (p ej., 4°C).

5.4.5 Aislamiento, clasificacion y caracterizacion de celulas madre de la placenta

Las celulas de la placenta aisladas, p. ej., las celulas descritas en la Seccion 5.3, anteriormente, ya sean obtenidas mediante perfusion o por rotura ffsica, p. ej., por digestion enzimatica, pueden inicialmente ser purificadas a partir de (es decir, ser aisladas de) otras celulas por centrifugacion en gradiente de Ficoll. Semejante centrifugacion puede seguir cualquier protocolo convencional para la velocidad de centrifugacion, etc. Por ejemplo, las celulas recogidas de la placenta se recuperan del lfquido perfundido por centrifugacion a 5000 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente, que separa las celulas, p. ej., de desechos contaminantes y plaquetas. Alternativamente, el lfquido perfundido de la placenta se concentra a aproximadamente 200 ml, ligeramente estratificado sobre Ficoll y se centrifuga a aproximadamente 1100 xg durante 20 minutos a 22°C, y la capa de celulas de la interfaz de baja densidad se recoge para su posterior procesamiento.

Los sedimentos celulares se pueden resuspender en la composicion de recogida de celulas madre de nueva aportacion, o un medio adecuado para el mantenimiento de celulas madre, p. ej., medio libre de suero IMDM que contiene 2 U/ml de heparina y EDTa 2 mM (Gibco BRL, NY). La fraccion total de celulas mononucleares se puede aislar, p. ej., utilizando Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante.

Las celulas de la placenta obtenidas mediante perfusion o digestion pueden ser aisladas, por ejemplo, adicionalmente, o inicialmente por tripsinizacion diferencial utilizando, p. ej., una solucion de tripsina al 0,05% con EDTA al 0,2% (Sigma, St. Louis MO). La tripsinizacion diferencial es posible porque las celulas de la placenta aisladas normalmente se separan de las superficies de plastico en aproximadamente cinco minutos, mientras que otras poblaciones adherentes requieren tfpicamente mas de 20 a 30 minutos de incubacion. Las celulas de la placenta separadas pueden ser cosechadas despues de la tripsinizacion y la neutralizacion con tripsina, utilizando, p. ej., Solucion Neutralizadora de Tripsina (TNS, Cambrex). En un ejemplo de aislamiento de celulas adherentes, se colocan alfcuotas, por ejemplo, aproximadamente 5-10 x 106 celulas en cada uno de varios matraces T-75, preferiblemente matraces T75 recubiertos de fibronectina. Preferiblemente, las celulas pueden ser cultivadas con Medio de Crecimiento de Celulas Madre Mesenquimales (MSCGM) (Cambrex) disponible comercialmente, y se colocan en una incubadora de cultivo de tejidos (37°C, CO2 al 5%). Despues de 10 a 15 dfas, las celulas no adherentes se retiran de los matraces mediante lavado con PBS. La PBS se reemplaza a continuacion por MSCGM. Los matraces se examinan preferiblemente todos los dfas para determinar la presencia de diversos tipos de celulas adherentes y, en particular, para identificar y ampliar las agrupaciones de celulas fibroblastoides.

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El numero y tipo de celulas recogidas a partir de una placenta de mairnfero se pueden monitorizar, por ejemplo, midiendo los cambios en la morfolog^a y los marcadores de la superficie celular utilizando tecnicas de deteccion de celulas convencionales estandar, tales como la citometna de flujo, la clasificacion celular, la inmunocitoqmmica (p. ej., tincion con anticuerpos espedficos del tejido o espedficos de marcadores celulares), la clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS), la clasificacion celular magnetica activada (MACS), mediante el examen de la morfologfa de las celulas utilizando microscopfa optica o confocal, y/o midiendo los cambios en la expresion genica utilizando mecanismos bien conocidos en la tecnica, tal como la PCR y el perfilado de la expresion genica. Estos mecanismos se pueden usar, tambien, para identificar las celulas que son positivas para uno o mas marcadores particulares. Por ejemplo, utilizando anticuerpos para CD34, se puede determinar, utilizando los mecanismos anteriores, si una celula comprende una cantidad detectable de cD34; si es asf, la celula es CD34+. Del mismo modo, si una celula produce suficiente ARN de OCT-4 para que sea detectable por RT-PCR, o significativamente mas ARN de OCT-4 que una celula adulta, la celula es OCT-4+. Los anticuerpos para marcadores de la superficie celular (p. ej., marcadores CD tales como CD34) y la secuencia de genes espedficos de celulas madre, tales como OCT-4, son bien conocidos en la tecnica.

Las celulas de la placenta, en particular las celulas que han sido aisladas por separacion con Ficoll, adherencia diferencial, o una combinacion de ambas, pueden ser clasificadas utilizando un clasificador de celulas activado por fluorescencia (FACS). La clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) es un metodo bien conocido para la separacion de partmulas, incluyendo las celulas, basado en las propiedades fluorescentes de las partmulas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151: 150-165). La excitacion laser de radicales fluorescentes en las partmulas individuales da como resultado una pequena carga electrica que permite la separacion electromagnetica de las partmulas positivas y negativas de una mezcla. Por ejemplo, los anticuerpos o ligandos espedficos de marcadores de la superficie celular se marcan con marcadores fluorescentes distintos. Las celulas se procesan a traves del clasificador de celulas, permitiendo la separacion de las celulas en funcion de su capacidad para unirse a los anticuerpos utilizados. Las partmulas clasificadas por FACS se pueden depositar directamente en pocillos individuales de placas de 96 pocillos o 384 pocillos para facilitar la separacion y la clonacion.

En un esquema de clasificacion, las celulas de la placenta, p. ej., las celulas madre de la placenta y las celulas pluripotentes de la placenta, se clasifican basandose en la expresion de los marcadores CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 y/o HLA-G. Esto se puede lograr en relacion con los procedimientos para seleccionar las celulas madre basandose en sus propiedades de adherencia en cultivo. Por ejemplo, se puede lograr un tronco de seleccion por adherencia antes o despues de la clasificacion basandose en la expresion del marcador. Por ejemplo, las celulas se clasifican primero basandose en su expresion de CD34; las celulas CD34- se conservan, y las celulas que son CD200+HLA-G+, se separan del resto de las celulas CD34-. Las celulas de la placenta se basan en su expresion de los marcadores CD200 y/o HLA-G; por ejemplo, las celulas que presentan cualquiera de estos marcadores son aisladas para su uso posterior. Las celulas que expresan, p. ej., CD200 y/o HLA-G pueden ser clasificadas adicionalmente basandose en su expresion de CD73 y/o CD105, o epftopos reconocidos por los anticuerpos SH2, SH3 o SH4, o la falta de expresion de CD34, CD38 o CD45. Por ejemplo, las celulas de la placenta se clasifican por la expresion, o la falta de la misma, de CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 y Cd45, y las celulas de la placenta que son CD200+, HLA-G+, CD73+, CD105+, CD34-, CD38- y CD45- se afslan de otras celulas de la placenta para su uso posterior.

Con respecto a la deteccion y clasificacion de celulas de la placenta mediada por anticuerpos, p. ej., celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta, se puede utilizar cualquier anticuerpo, espedfico para un marcador particular, combinado con cualquier fluoroforo u otra marca adecuada para la deteccion y clasificacion de las celulas (p. ej., clasificacion celular activada por fluorescencia). Las combinaciones de anticuerpo/fluoroforo para marcadores espedficos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de fluorescema (FITC) contra hLA-G (disponibles de Serotec, Raleigh, Carolina del Norte), CD10 (disponibles en BD Immunocytometry Systems, San Jose, California), CD44 (disponibles de BD Biosciences Pharmingen, San Jose, California), y CD105 (disponibles de R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota); anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina (PE) contra CD44, CD200, CD117, y CD13 (BD Biosciences Pharmingen); anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina-Cy7 (PE Cy7) contra CD33 y CD 10 (BD Biosciences Pharmingen); anticuerpos monoclonales conjugados con aloficocianina (APC) y estreptavidina contra CD38 (BD Biosciences Pharmingen); y CD90 biotinilado (BD Biosciences Pharmingen). Otros anticuerpos que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, CD133-APC (Miltenyi), KDR-Biotina (Cd309, Abcam), Citoqueratina K-FITC (Sigma o Dako), HLA ABC-FITC (BD), HLA DR,DQ,DP-PE (BD), p-2-microglobulina-PE (BD), CD80-PE (BD) y CD86-APC (BD).

Otras combinaciones de anticuerpo/marca que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, CD45-PerCP (protema clorofila peridina); CD44-PE; CD19-PE; CD10-F (fluorescema); HLA-GF y 7-amino-actinomicina-D (7-AAD); HlA-ABC-F; y similares.

Las celulas de la placenta aisladas proporcionadas en la presente memoria se pueden analizar para determinar la presencia de CD117 o CD133 utilizando, por ejemplo, anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina-Cy5 (PE Cy5), estreptavidina y biotina contra CD117 o CD133; sin embargo, utilizando este sistema, las celulas pueden parecer positivas para CD117 o CD133, respectivamente, debido al fondo relativamente alto.

Las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria se pueden marcar con un anticuerpo para un

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solo marcador y se detectan y clasifican. Las celulas de la placenta tambien se pueden marcar simultaneamente con multiples anticuerpos contra diferentes marcadores.

Adicionalmente se pueden utilizar esferas magneticas para separar las celulas. Las celulas se pueden clasificar utilizando una tecnica de clasificacion celular activada magnetica (MACS), un metodo para la separacion de partfculas en funcion de su capacidad para unirse a esferas magneticas (de 0,5 a 100 pm de diametro). Se puede llevar a cabo una variedad de modificaciones utiles en las microesferas magneticas, incluyendo la adicion covalente de anticuerpo que reconoce espedficamente una molecula de superficie celular o hapteno particular. Las esferas se mezclan a continuacion con las celulas para permitir la union. Despues las celulas se hacen pasar a traves de un campo magnetico para separar las celulas que tienen el marcador de superficie celular espedfico. Por ejemplo, estas celulas se pueden aislar a continuacion y volver a mezclar con esferas magneticas acopladas a un anticuerpo contra marcadores de la superficie celular adicionales. Las celulas se hacen pasar de nuevo a traves de un campo magnetico, aislando las celulas que se unen a ambos anticuerpos. Tales celulas pueden ser diluidas a continuacion en placas separadas, tales como placas de microtitulacion para el aislamiento clonal.

Las celulas de la placenta aisladas tambien se pueden caracterizar y/o clasificar en funcion de las caractensticas de morfologfa y crecimiento celulares. Por ejemplo, las celulas de la placenta aisladas se pueden caracterizar portener, y/o se pueden seleccionar en funcion de, p. ej., una apariencia fibroblastoide en cultivo. Las celulas de la placenta aisladas tambien se pueden caracterizar por tener, y/o se pueden seleccionar, en funcion de su capacidad para formar cuerpos de tipo embrioide. Por ejemplo, las celulas de la placenta aisladas que tienen una forma

fibroblastoide, expresan CD73 y CD105, y producen uno o mas cuerpos de tipo embrioide en cultivo son aisladas de

otras celulas de la placenta. En otro aspecto de la descripcion, las celulas de la placenta OCT-4+ que producen uno o mas cuerpos de tipo embrioide en cultivo son aisladas de otras celulas de la placenta.

Alternativamente, las celulas de la placenta aisladas pueden ser identificadas y caracterizadas por medio de un analisis de las unidades formadoras de colonias. Los analisis de las unidades formadoras de colonias se conocen comunmente en la tecnica, tales como el medio MESENCULT™ (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver, Columbia Britanica).

Las celulas de la placenta aisladas pueden ser evaluadas en cuanto a la viabilidad, el potencial de proliferacion, y la longevidad utilizando mecanismos convencionales conocidos en la tecnica, tales como el analisis de exclusion de azul de tripan, el analisis de absorcion de diacetato de fluorescema, el analisis de captacion de yoduro de propidio

(para evaluar la viabilidad); y el analisis de absorcion de timidina, el analisis de proliferacion celular MTT (para

evaluar la proliferacion). La longevidad se puede determinar por metodos bien conocidos en la tecnica, tales como la determinacion del numero maximo de duplicacion de la poblacion en un cultivo prolongado.

Las celulas de la placenta aisladas tambien se pueden separar de otras celulas de la placenta utilizando otros mecanismos conocidos en la tecnica, p. ej., el crecimiento selectivo de las celulas deseadas (seleccion positiva), la destruccion selectiva de celulas no deseadas (seleccion negativa); la separacion basada en la aglutinabilidad celular diferencial en la poblacion mixta, por ejemplo, con aglutinina de soja; procedimientos de congelacion y descongelacion; la filtracion; la centrifugacion convencional y zonal; la decantacion centnfuga (centrifugacion contra- corriente); la unidad de separacion por gravedad; la distribucion en contracorriente; la electroforesis; y similares.

5.5 Cultivo de celulas de la placenta aisladas

5.5.1 Medios de Cultivo

Las celulas de la placenta aisladas, o poblaciones de celulas de la placenta aisladas, o celulas o tejido de la placenta a partir de los cuales se desarrollan celulas madre de la placenta, se pueden utilizar para iniciar, o sembrar cultivos de celulas. Las celulas se transfieren generalmente a recipientes de cultivo de tejidos esteriles o bien no recubiertas o bien recubiertos con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colageno (p. ej., nativo o desnaturalizado), gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina, y protema de la membrana extracelular (p. ej., MATRIGEL® (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)).

Las celulas de la placenta aisladas se pueden cultivar en cualquier medio y bajo cualquier condicion, reconocida en la tecnica como aceptable para el cultivo de celulas, p. ej., celulas madre. Preferiblemente, el medio de cultivo comprende suero. Las celulas de la placenta aisladas se pueden cultivar, por ejemplo, en DMEM-LG (Medio Esencial Modificado de Dulbecco, bajo nivel de glucosa)/MCDB 201 (medio basal de fibroblastos de pollo) que contiene ITS (insulina-transferrina-selenio), LA+BSA (acido linoleico - albumina de suero bovino), dextrosa, acido L- ascorbico, PDGF, EGF, IGF-1, y penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (alto contenido de glucosa) que comprende suero bovino fetal (FBS) del 1% al 20%; DMEM-Hg comprende FBS al 15%; IMDM (medio de Dulbecco modificado de Iscove) que comprende FBS al 10%, suero de caballo al 10%, e hidrocortisona; M199 que comprende FBS al 10%, EGF, y heparina; a-MEM (medio esencial mmimo) que comprende FBS al 10%, GLUTAMAX™ y gentamicina; DMEM que comprende FBS al 10%, GLUTAMAX™ y gentamicina, etc.

Otros medios que se pueden utilizar para cultivar celulas de la placenta incluyen DMEM (alto o bajo contenido de glucosa), medio basal de Eagle, medio F10 de Ham (F10), medio F-12 de Ham (F12), medio de Dulbecco modificado por Iscove, Medio de Crecimiento de Celulas Madre Mesenquimales (MSCGM), medio L-15 de Liebovitz, MCDB,

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DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM avanzado (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma), y CELL-GRO FREE.

El medio de cultivo se puede complementar con uno o mas componentes incluyendo, por ejemplo, suero (p. ej., suero bovino fetal (FBS), preferiblemente a aproximadamente 2-15% (v/v); suero equino (de caballo) ((ES); suero humano (HS)); beta-mercaptoetanol (BME), preferiblemente a aproximadamente 0,001% (v/v); uno o mas factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor-1 de crecimiento de tipo insulmico (IGF-1), factor inhibidor de la leucemia (LIF), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), y eritropoyetina (EPO); aminoacidos, incluyendo L-valina; y uno o mas antibioticos y/o agentes antimicoticos para controlar la contamination microbiana, tal como, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina, ya sean solos o combinados.

Las celulas de la placenta aisladas se pueden cultivar en condiciones de cultivo de tejidos convencionales, p. ej., en placas de cultivo de tejidos o placas de multiples pocillos. Las celulas de la placenta aisladas tambien pueden ser cultivadas utilizando el metodo de la gota colgante. En este metodo, las celulas de la placenta aisladas se suspenden en aproximadamente 1 x 10 4 celulas por ml en aproximadamente 5 ml de medio, y se colocan una o mas gotas del medio en el interior de la tapa de un recipiente de cultivo de tejidos, p. ej., una placa de Petri de 100 ml. Las gotas pueden ser, p. ej., gotas individuales o multiples gotas, p. ej., de una pipeta multicanal. La tapa se invierte y se coloca cuidadosamente en la parte superior de la parte inferior de la placa, que contiene un volumen de Kquido, p. ej., PBS esteril suficiente para mantener el contenido de humedad en la atmosfera de la placa, y se cultivan las celulas madre.

Ademas, las celulas de la placenta aisladas se cultivan en presencia de un compuesto que actua para mantener un fenotipo indiferenciado en la celula de la placenta aislada. Por ejemplo, el compuesto es una 3,4-sustituido dihidroporidimol[4,5-d]pirimidina. Espetificamente, el compuesto es un compuesto que tiene la siguiente estructura qmmica:

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El compuesto se puede poner en contacto con celulas de la placenta aisladas, o con una poblacion de celulas de la placenta aisladas, a una concentration, por ejemplo, entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM.

5.5.2 Expansion y proliferation de las celulas de la placenta

Una vez que una celula de la placenta aislada, o una poblacion de celulas de la placenta aisladas (p. ej., una celula de placenta o una poblacion de celulas de la placenta separada de al menos 50% de las celulas de la placenta con las cuales la celula madre o la poblacion de celulas madre se asocia normalmente in vivo), la celula o poblacion de celulas se pueden hacer proliferar y expandir in vitro. Por ejemplo, una poblacion de las celulas de la placenta aisladas se puede cultivar en recipientes de cultivo de tejidos, p. ej., placas, matraces, placas de multiples pocillos, o similares, durante un tiempo suficiente para que las celulas proliferen hasta una confluencia de 70-90%, es decir, hasta que las celulas y su progenie ocupan 70-90% del area de la superficie de cultivo del recipiente de cultivo de tejidos.

Las celulas de la placenta aisladas se pueden sembrar en recipientes de cultivo a una densidad que permita el crecimiento celular. Por ejemplo, las celulas se pueden sembrar a baja densidad (p. ej., de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 5.000 celulas/cm2) a alta densidad (p. ej., aproximadamente 50.000 o mas celulas/cm2). Por ejemplo, las celulas se cultivan en presencia de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 por ciento en volumen de CO2 en el aire. Preferiblemente, las celulas se cultivan de aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento de O2 en el aire, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento O2 en el aire. Las celulas preferiblemente se cultivan de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente a 37°C. Las celulas se cultivan preferiblemente en una incubadora. El medio de cultivo puede serestatico o agitado, por ejemplo, utilizando un biorreactor. Las celulas de la placenta, p. ej., las celulas madre de la placenta o las celulas pluripotentes de la placenta, se cultivan preferiblemente bajo estres oxidativo bajo (p. ej., con la adicion de glutation, acido ascorbico, catalasa, tocoferol, N-acetilcistema, o similares).

Una vez que se obtiene una confluencia de menos de aproximadamente 100%, por ejemplo 70%-90%, las celulas se pueden trasladar. Por ejemplo, las celulas se pueden tratar enzimaticamente, p. ej., con tripsina, utilizando mecanismos bien conocidos en la tecnica, para separarlas de la superficie del cultivo de tejidos. Despues de retirar

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las celulas mediante pipeteo y someter las celulas a recuento, aproximadamente 10.000-100.000 celulas/cm2, preferiblemente aproximadamente 50.000 celulas/cm2, se hacen pasar a un nuevo recipiente de cultivo que contiene medio de cultivo de nueva aportacion. Tfpicamente, el nuevo medio es el mismo tipo de medio del cual se retiraron las celulas de la placenta aisladas. Las celulas de la placenta aisladas se pueden trasladar al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 veces, o mas.

Produccion de un banco de celulas de la placenta

Las celulas aisladas de placentas posparto, p. ej., las celulas de la placenta aisladas descritas en la Seccion 5.3, anterior, se pueden cultivar de numerosas maneras diferentes para producir un conjunto de lotes, p. ej., un conjunto de dosis que se pueden administrar individualmente, de celulas de la placenta aisladas. Tales lotes se pueden obtener, por ejemplo, a partir de celulas de lfquido perfundido de la placenta o de celulas de tejido de la placenta digerido con enzima. Los conjuntos de lotes de celulas de la placenta, obtenidos a partir de una pluralidad de placentas, se pueden organizar en un banco de celulas de la placenta aisladas, p. ej., para el almacenamiento a largo plazo. Generalmente, las celulas de la placenta adherentes al plastico de cultivo de tejidos se obtienen a partir de un cultivo inicial de material de la placenta para formar un cultivo de siembra, que se expande en condiciones controladas para formar poblaciones de celulas con un numero aproximadamente equivalente de duplicaciones. Los lotes derivan preferiblemente de tejido de una sola placenta, pero pueden derivar de tejido de una pluralidad de placentas.

Los lotes de celulas de la placenta se pueden obtener como sigue. Primero se rompe el tejido de la placenta, p. ej., mediante picado, se digiere con una enzima adecuada, p. ej., colagenasa (vease la Seccion 5.4.3, anterior). El tejido de la placenta comprende preferiblemente, p. ej., la totalidad del amnios, la totalidad del corion, o ambos, de una sola placenta, pero puede comprender solo una parte de cualquiera del amnios o corion. El tejido digerido se cultiva, p. ej., durante aproximadamente 1 a 3 semanas, preferiblemente aproximadamente 2 semanas. Despues de la eliminacion de las celulas no adherentes, se recogen las colonias de alta densidad que se forman, p. ej., por medio de tripsinizacion. Estas celulas se recogen y se resuspenden en un volumen conveniente de medio de cultivo, y a continuacion se utilizan para sembrar cultivos de expansion. Los cultivos de expansion pueden ser cualquier disposicion de aparatos de cultivo de celulas separados, p. ej., una Fabrica de Celulas NUNC™. Las celulas se pueden subdividir en cualquier grado, con el fin de sembrar cultivos de expansion, p. ej., con 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8x 103, 9x 103, 1 x 104, 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, o 10 x 104 celulas madre. Preferiblemente, se utilizan de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 104 celulas/cm2 para sembrar cada cultivo de expansion. El numero de cultivos de expansion puede ser mayor o menor en numero dependiendo de la placenta o placentas particulares, de las que se obtienen las celulas.

Los cultivos de expansion se hacen crecer hasta que la densidad de celulas en cultivo alcanza un cierto valor, p. ej., aproximadamente 1 x 105 celulas/cm2. Las celulas se pueden recolectar y crioconservar en este punto, o trasladar nuevos cultivos de expansion como se ha descrito anteriormente. Las celulas se pueden trasladar, p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces antes de su uso. Preferiblemente se mantiene un registro del numero acumulado de duplicaciones de la poblacion durante el cultivo o los cultivos de expansion. Las celulas se pueden expandir para 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones, o hasta 60 duplicaciones. Preferiblemente, sin embargo, el numero de duplicaciones de la poblacion, antes de dividir la poblacion de celulas en dosis individuales, es de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30. Las celulas se pueden cultivar de manera continua durante todo el proceso de expansion, o se pueden congelar en uno o mas puntos durante la expansion.

Las celulas que se van a utilizar para las dosis individuales se pueden congelar, p. ej., criocrioconservar para su uso posterior. Las dosis individuales pueden comprender, p. ej., de aproximadamente 1 millon a aproximadamente 50 millones de celulas por ml, y pueden comprender entre aproximadamente 106 y aproximadamente 1010 celulas en total.

Por lo tanto, se puede elaborar un banco de celulas de la placenta mediante un metodo que comprende: la expansion de las celulas de la placenta del cultivo primario a partir de una placenta humana despues del parto para una primera pluralidad de duplicaciones de la poblacion; la crioconservacion de dichas celulas de la placenta para formar un Banco de Celulas Patron; la expansion de una pluralidad de celulas de la placenta a partir del Banco de Celulas Patron para una segunda pluralidad de duplicaciones de la poblacion; la crioconservacion de dichas celulas de la placenta para formar un Banco de Celulas de Trabajo; la expansion de una pluralidad de celulas de la placenta desde el Banco de Celulas de Trabajo para una tercera pluralidad de duplicaciones de la poblacion; y la crioconservacion de dichas celulas de la placenta en dosis individuales, en donde dichas dosis individuales componen colectivamente un banco de celulas de la placenta. Por ejemplo, dichas celulas de la placenta de cultivo primario comprenden celulas de la placenta del lfquido perfundido de la placenta. Alternativamente, dichas celulas de la placenta de cultivo primario comprenden celulas de la placenta de tejido de la placenta digerido. Alternativamente, dichas celulas de la placenta de cultivo primario comprenden celulas de la placenta de lfquido perfundido de la placenta y de tejido de placenta digerido. Preferiblemente, todas dichas celulas de la placenta en dicho cultivo primario de celulas de la placenta son de la misma placenta. El metodo puede comprender adicionalmente la etapa de seleccionar celulas de la placenta CD200+ o HLA-G+ o celulas de la placenta CD10+, CD34", CD105+, CD200+, de

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dicha pluralidad de dichas celulas de la placenta a partir de dicho Banco de Celulas de Trabajo para formar dosis individuales. Adicionalmente, dichas dosis individuales pueden comprender de aproximadamente 104 a aproximadamente 105 celulas de la placenta, de aproximadamente 105 a aproximadamente 106 celulas de la placenta de aproximadamente 106 a aproximadamente 107 celulas de la p|acenta, de aproximadamente 107 a aproximadamente 10 celulas de la placenta, de aproximadamente 10 a aproximadamente 10 celulas de la placenta, o de aproximadamente 109 a aproximadamente 1010 celulas de la placenta.

Los metodos de preparacion de composiciones que comprenden celulas de la placenta, p. ej., celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta, segun lo previsto en la presente memoria, se pueden integrar en la construccion de un banco de celulas de la placenta en cualquier etapa como se ha descrito anteriormente. La composicion farmaceutica se produce despues de producir el Banco de Celulas Patron, y durante la produccion de uno o mas Bancos de Celulas de Trabajo a partir de dicho Banco de Celulas Patron, o durante la expansion de las celulas de la placenta a partir de dichos Bancos de Celulas de Trabajo. Por ejemplo, las celulas de la placenta se pueden descongelar a partir de un Banco de Celulas de Trabajo y cultivar durante una pluralidad de duplicaciones de la poblacion. Cuando se genera un numero deseado de celulas, o ha tenido lugar un numero deseado de duplicaciones de la poblacion, se pueden recoger las celulas de la placenta, p. ej., por centrifugacion, y resuspender en una solucion que comprende, p. ej., dextrano 40, p. ej., dextrano 40 al 5,5%. Las celulas madre de la placenta se recogen una segunda vez y se resuspenden en una solucion que comprende dextrano y un crioconservante, p. ej., una solucion de dextrano 40 al 5,5% que comprende HSA al 10% y DMSO al 5%, y se crioconservan. Las celulas de la placenta crioconservadas se descongelan, p. ej., inmediatamente antes del uso, p. ej., inmediatamente antes de la produccion final de la composicion como se describe en la Seccion 5.2, anterior.

Los metodos anteriores de produccion de una composicion que comprende celulas de la placenta, p. ej., celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta, se pueden utilizar una vez en la produccion y/o el uso de un banco de celulas de la placenta, p. ej., en cada punto en el cual senan crioconservadas las celulas de la placenta, o, p. ej., en el punto en el que se preparan celulas de la placenta para la administracion individual antes de la crioconservacion final, y despues de la descongelacion antes de la administracion a un individuo.

Preferiblemente, el donante del que se obtiene la placenta (p. ej., la madre) se somete a ensayo por lo menos para un patogeno. Si la madre da positivo por el patogeno sometido a ensayo, todo el lote de la placenta se descarta. Semejante ensayo se puede realizar en cualquier momento durante la produccion de lotes de celulas de la placenta, incluyendo antes o despues del establecimiento del cultivo celular inicial, o durante el cultivo de expansion. Los patogenos cuya presencia se somete a ensayo pueden incluir, sin limitacion, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, virus de la inmunodeficiencia humana (tipos I y II), citomegalovirus, virus del herpes, y similares.

5.6 Conservacion de las celulas de la placenta

Las celulas de la placenta aisladas, p. ej., las celulas pluripotentes de la placenta aisladas descritas en la Seccion 5.2, anterior, se pueden conservar, p. ej., durante la recogida, es decir, se colocan en condiciones que permiten el almacenamiento a largo plazo, o condiciones que inhiben la muerte celular, p. ej., por apoptosis o necrosis, p. ej., durante la recogida o antes de la produccion de las composiciones descritas en la presente memoria, p. ej., utilizando los metodos descritos en la presente memoria.

Las celulas de la placenta se pueden conservar utilizando, p. ej., una composicion que comprende un inhibidor de la apoptosis, un inhibidor de la necrosis y/o un perfluorocarbono de transporte de oxfgeno, como se describe en la Publicacion de la Solicitud de los Estados Unidos relacionada Num. 2007/0190042. Un metodo de conservacion de una poblacion de celulas, que se va a utilizar en las composiciones que comprenden celulas que se presentan en la presente memoria, puede comprender poner en contacto dicha poblacion de celulas con una composicion de recogida de celulas que comprende un inhibidor de la apoptosis y un perfluorocarbono de transporte de oxfgeno, en donde dicho inhibidor de la apoptosis esta presente en una cantidad y durante un tiempo suficientes para reducir o prevenir la apoptosis en la poblacion de celulas, en comparacion con una poblacion de celulas que no se pone en contacto con el inhibidor de la apoptosis. Por ejemplo, dicho inhibidor de la apoptosis es un inhibidor de caspasa o un inhibidor de JNK. En concreto, dicho inhibidor de JNK no modula la diferenciacion o la proliferacion de dichas celulas. Dicha composicion de recogida de celulas puede comprender dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono que transporta oxfgeno en fases separadas. Adicionalmente, dicha composicion de recogida de celulas puede comprender dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono que transporta oxfgeno en una emulsion. La composicion de recogida de celulas puede comprender, adicionalmente, un emulsionante, p. ej., lecitina. Por ejemplo, dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono estan entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 25°C, entre aproximadamente 2°C y 10°C, o entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 5°C en el momento de contacto con las celulas. Dicho contacto se puede producir durante el transporte de dicha poblacion de celulas. Alternativamente, dicho contacto se puede producir durante la congelacion y descongelacion de dicha poblacion de celulas.

Las poblaciones de celulas de la placenta se pueden conservar, p. ej., mediante un metodo que comprende poner en contacto dicha poblacion de celulas con un inhibidor de la apoptosis y un compuesto de conservacion de organos, en donde dicho inhibidor de la apoptosis esta presente en una cantidad y durante un tiempo suficientes para reducir o

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prevenir la apoptosis en la poblacion de celulas, en comparacion con una poblacion de celulas que no se ha puesto en contacto con el inhibidor de la apoptosis. Por ejemplo, el compuesto de conservacion de organos es la solucion de UW (descrita en la Patente de los Estados Unidos Num. 4.798.824; tambien conocida como ViaSpan; vease tambien Southard et al., Transplantation 49(2): 251-257 (1990)) o una solucion que describen Stem et al., en la Patente de los Estados Unidos No. 5.552.267. Alternativamente, dicho compuesto de conservacion de organos es hidroxietil almidon, acido lactobionico, rafinosa, o una combinacion de los mismos. Adicionalmente, la composicion de recogida de celulas comprende adicionalmente un perfluorocarbono de transporte de oxfgeno, ya sea en dos fases o en forma de una emulsion.

Las celulas madre de la placenta se pueden poner en contacto con una composicion de recogida de celulas que comprende un inhibidor de la apoptosis y perfluorocarbono de transporte de oxfgeno, compuesto de conservacion de organos, o una combinacion de los mismos, durante la perfusion. Alternativamente, dichas celulas se pueden poner en contacto durante un proceso de rotura del tejido, p. ej., digestion enzimatica. Alternativamente, las celulas de la placenta se pueden poner en contacto con dicho compuesto de recogida de celulas despues de la recoleccion por perfusion, o despues de la recogida por rotura del tejido, p. ej., digestion enzimatica.

Tfpicamente, durante la recogida de celulas de la placenta, el enriquecimiento y el aislamiento, es preferible reducir al mmimo o eliminar el estres celular debido a la hipoxia y a la tension mecanica. Por lo tanto, una celula, o una poblacion de celulas se pueden exponer a una condicion hipoxica durante la recogida, el enriquecimiento o aislamiento durante menos de seis horas durante dicha conservacion, en donde una condicion hipoxica es una concentracion de oxfgeno que es menor que la concentracion normal de oxfgeno en la sangre. Preferiblemente, dicha poblacion de celulas se expone a dicha condicion hipoxica a lo largo de menos de dos horas durante dicha conservacion. Mas preferiblemente, dicha poblacion de celulas se expone a dicha condicion hipoxica durante menos de una hora, o menos de treinta minutos, o no se expone a una condicion de hipoxia, durante la recogida, el enriquecimiento o el aislamiento. Adicionalmente, dicha poblacion de celulas no se expone a tension de cizallamiento durante la recogida, el enriquecimiento o el aislamiento.

Las celulas de la placenta se pueden crioconservar, en general o en los metodos espedficos descritos en la presente memoria. En una realizacion, el crioconservante utilizado para crioconservar las celulas de la placenta es DMSO. En otra realizacion, el crioconservante es propilenglicol, p. ej., propilenglicol aproximadamente 1,5 M. El crioconservante puede ser tambien, p. ej., glicerol, etilenglicol, polifenol (p. ej., aproximadamente 30 a aproximadamente 120 ppm) o similares. En otras realizaciones, el crioconservante es suero bovino fetal, suero humano o albumina de suero humano combinados con uno o mas de DMSO, trehalosa y dextrano. En una realizacion espedfica, el crioconservante es suero humano, DMSO, y trehalosa, o es suero bovino fetal y DMSO. En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta se crioconservan en un medio de crioconservacion en pequenos contenedores, p. ej., ampollas. Las celulas de la placenta se enfnan preferiblemente aproximadamente 1°C/min durante la crioconservacion. Una temperatura de crioconservacion preferida es de aproximadamente -80°C a aproximadamente -180°C, preferiblemente de aproximadamente -125°C a aproximadamente -140°C. Las celulas crioconservadas se pueden transferir a nitrogeno lfquido antes de la descongelacion para su uso. En algunas realizaciones, por ejemplo, una vez que las ampollas han alcanzado aproximadamente -90°C, se transfieren a un area de almacenamiento en nitrogeno lfquido. La crioconservacion tambien se puede llevar a cabo utilizando un congelador de velocidad controlada. Las celulas crioconservadas se descongelan preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 37°C.

5.7 Composiciones que comprenden celulas

5.7.1 Composiciones que comprenden celulas de la placenta

Las celulas de la placenta descritas en la presente memoria, p. ej., en la Seccion 5.3, pueden comprender una o mas de las celulas de la placenta, p. ej., celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta, descritas en la presente memoria, en donde las celulas han sido aisladas a partir de una placenta, p. ej., una placenta humana. En otra realizacion espedfica, cualquiera de las composiciones anteriores comprende una matriz. En una realizacion mas espedfica, dicha matriz es un armazon tridimensional. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende colageno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina, o vitronectina. En otra realizacion mas espedfica, la matriz es una membrana amniotica o un biomaterial derivado de la membrana amniotica. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende una protema de la membrana extracelular. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende un compuesto sintetico. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra realizacion mas espedfica, dicho compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, citoquina, anticuerpo, o molecula organica de menos de 5.000 dalton.

En otra realizacion, una composicion util en las composiciones, p. ej., composiciones farmaceuticas, proporcionada en la presente memoria comprende un medio acondicionado por cualquiera de las celulas de la placenta anteriores, o cualquiera de las poblaciones de celulas de la placenta anteriores. En una realizacion espedfica, cualquiera de dichas composiciones comprende una celula madre que no deriva de una placenta. En una realizacion mas espedfica, dicha celula madre es una celula madre embrionaria. En otra realizacion mas espedfica, dicha celula madre es una celula madre mesenquimal. En otra realizacion mas espedfica, dicha celula madre es una celula madre derivada de medula osea. En otra realizacion mas espedfica, dicha celula madre es una celula progenitora

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hematopoyetica. En otra realizacion mas espedfica, dicha celula madre es una celula madre somatica. En una realizacion aun mas espedfica, dicha celula madre somatica es una celula madre neural, una celula madre hepatica, una celula madre de pancreas, una celula madre endotelial, una celula madre cardiaca o una celula madre de musculo.

5.7.1.1 Composiciones farmaceuticas

Las poblaciones de celulas de la placenta aisladas, o poblaciones de celulas que comprenden las celulas de la placenta aisladas, estan contenidas dentro de, o son componentes de, una composicion farmaceutica. Las celulas de la placenta aisladas se pueden preparar en una forma que sea facilmente administrable a un individuo, p. ej., celulas de lfquido perfundido de la placenta o celulas de la placenta aisladas que estan contenidas dentro de un recipiente adecuado para uso medico. Dicho recipiente puede ser, por ejemplo, una jeringa, una bolsa de plastico esteril, matraz, frasco u otro recipiente del cual se pueda dispensar facilmente la poblacion de celulas madre de la placenta. Por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de sangre u otra bolsa de plastico, medicamente aceptable adecuada para la administracion intravenosa de un lfquido a un destinatario. El recipiente en ciertas realizaciones es uno que permite la crioconservacion de la poblacion de celulas de la placenta aisladas.

En una realizacion, el recipiente es un recipiente que facilita o permite, el rendimiento de una o mas de las etapas del metodo descritas en la presente memoria. Por ejemplo, cuando el metodo de produccion de una composicion que comprende celulas comprende, p. ej., las etapas de (a) poner en contacto dichas celulas con una solucion que comprende dextrano y albumina de suero humana (HSA) para producir una solucion que contiene celulas; (b) filtrar la solucion a traves de un filtro de 70 pM a 100 pM, (c) diluir dichas celulas a aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro con una primera solucion de dilucion que comprende dextrano; y (d) diluir dichas celulas con una segunda solucion de dilucion que comprende dextrano pero no comprende HSA, las celulas, p. ej., las celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, se pueden colocar en un recipiente, p. ej., entre las etapas (c) y (d), en donde el recipiente es un recipiente que, p. ej., facilita la crioconservacion y/o facilita el suministro de las celulas a un individuo que necesite celulas, o similares. En ciertas realizaciones, dicho diluyente esta a no mas de aproximadamente 10 x 106 celulas por mililitro. En ciertas realizaciones, dicho diluyente esta a no mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En otras ciertas realizaciones, si el numero de celulas es menor de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, la filtracion es opcional.

Por ejemplo, las celulas de la placenta aisladas se pueden crioconservar, p. ej., en una bolsa, p. ej., una bolsa de sangre o similar, y descongelar y diluir finalmente en la misma bolsa. En otra realizacion, en donde el metodo de produccion de una composicion que comprende celulas comprende, p. ej., (a) la centrifugacion de una pluralidad de celulas, p. ej., celulas de lfquido perfundido de la placenta o celulas de la placenta aisladas para recoger las celulas; (b) la resuspension de las celulas en dextrano 40 al 5,5%; (c) la centrifugacion de las celulas para recoger las celulas; (d) la resuspension de las celulas en una solucion de dextrano 40 al 5,5% que comprende HSA al 10%; (e) la filtracion de las celulas a traves de un filtro de 70 pM a 100 pM; (f) la dilucion de las celulas en dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10%, y DMSO al 5% a no mas de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas/ml; (g) la crioconservacion de las celulas; (h) la descongelacion de las celulas; e (i) la dilucion de las celulas de 1:1 a 1:11 con dextrano 40 al 10% para producir dicha composicion farmaceutica, la colocacion de las celulas en un recipiente que, p. ej., facilita la crioconservacion y/o la administracion de las celulas a un individuo que lo necesita se puede llevar a cabo, p. ej., en cualquier etapa despues de la etapa (e). En ciertas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (f) es de aproximadamente 1 a 10 x 106 celulas por mililitro. En ciertas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (f) es de no mas de aproximadamente 10 x 106 celulas por mililitro. En otras ciertas realizaciones, si el numero de celulas es menor de aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, la filtracion es opcional. En una realizacion espedfica, por ejemplo, las celulas, p. ej., celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, se pueden colocar en el recipiente despues de la filtracion, a continuacion, en el recipiente, diluir, crioconservar, descongelar, y/o finalmente diluir antes de la administracion al individuo.

Las celulas de la placenta aisladas en las composiciones, p. ej., composiciones farmaceuticas, proporcionadas en la presente memoria, pueden comprender celulas de la placenta derivadas de un solo donante o de multiples donantes. Las celulas de la placenta aisladas pueden ser completamente compatibles con HLA para un destinatario pretendido, o parcialmente o completamente incompatibles con HLA.

Las celulas de la placenta aisladas en las composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden administrar a un individuo que lo necesite. Por ejemplo, dichas celulas de la placenta aisladas se administran por via intramuscular, intradermica, intraperitoneal, intraarterial, subcutanea, intravenosa o intraocular. Adicionalmente, las celulas de la placenta aisladas en las composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden administrar a un individuo que lo necesite en forma de una composicion que comprende celulas de la placenta aisladas en un recipiente. Por ejemplo, el recipiente es una bolsa, matraz, o frasco. Preferiblemente, dicha bolsa es una bolsa de plastico esteril. Por ejemplo, dicha bolsa es adecuada para, permite o facilita la administracion intravenosa de dichas celulas de la placenta aisladas, p. ej., por infusion intravenosa, inyeccion en embolada, o similar. La bolsa puede comprender multiples lumenes o compartimentos que estan interconectados para permitir la mezcla de las celulas de la placenta aisladas y una o mas soluciones distintas, p. ej., un farmaco, antes de, o durante, la administracion. En otra realizacion espedfica, antes de la crioconservacion, la solucion que comprende las celulas de la placenta aisladas comprende uno o mas compuestos que facilitan la crioconservacion de las celulas combinadas. En otra

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realizacion espedfica, dichas celulas de la placenta aisladas estan contenidas dentro de una solucion acuosa fisiologicamente aceptable. Por ejemplo, dicha solucion acuosa fisiologicamente aceptable es una solucion de NaCl al 0,9%. Adicionalmente, dichas celulas de la placenta aisladas pueden comprender celulas de la placenta que son compatibles con HLA para un destinatario de dicha poblacion celular. Alternativamente, dichas celulas combinadas comprenden celulas de la placenta que son al menos parcialmente incompatibles con HLA para un destinatario de dicha poblacion celular. Dichas celulas de la placenta pueden derivar de una pluralidad de donantes.

Las celulas de la placenta aisladas en la composicion farmaceutica pueden ser cualquiera de las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria son celulas CD10+, CD34-, CD105+, CD200+, que estan contenidas dentro de un recipiente. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas descritas en la presente memoria son celulas CD200+, HLA-G+ que estan contenidos dentro de un recipiente. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son celulas CD73+, CD105+, CD200+ que estan contenidas dentro de un recipiente. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son celulas CD200+, OCT-4+ que estan contenidas dentro de un recipiente. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son celulas CD73+, CD105+ que estan contenidas dentro de un recipiente, en donde dichas celulas facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide cuando se cultivan con una poblacion de celulas de la placenta en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son celulas CD73+, CD105+, HLA-G+ que han sido crioconservadas, y estan contenidas dentro de un recipiente. En otra realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son celulas OCT-4+ que estan contenidas dentro de un recipiente, en donde dichas celulas facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide cuando se cultivan con una poblacion de celulas de la placenta en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En una realizacion espedfica de cualquiera de las celulas de la placenta anteriores, dicho recipiente es una bolsa.

Dicho recipiente puede comprender aproximadamente, al menos, o a lo sumo 1 x 106 celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, 5 x 106 celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, 1 x 107 celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, 5 x 1o7 celulas de la placenta aisladas o celulas de Kqddo perfundido de la placent^ 1 x 108 celulas de la placenta aisladas o celulas de Kqddo pgerfundido de la placenta, 5x10 celulas de la placenta aisladas o celulas de Kqddo perfundido de la placenta, 1x10 celulas de la placenta aisladas o celulas de Kqddo perfundido de la placenta, 5x10 celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, o 1 x 10 celulas de la placenta celulas aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta. Una dosis unitaria unica de celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta puede comprender, en diversas realizaciones, aproximadamente, al menos, o no mas de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5x 109, 1 x 1010, 5x 1010, 1 x 1011 o mas celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta. Alternativamente, un recipiente o dosis de celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta comprenden de 1 x 105 a 5 x 105 celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, de 5 x 105 a 1 x 106 celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, de 1 x 106 a 5 x 106 celulas de la placenta aisladas o celulas de Kqddo perfundido de la placenta, de 5 x 106 a 1 x 107 celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, de 1x10 a 5x10 celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la p^eda de 5 x 107 a 1 x 108 celulas de la placenta aisladas o celulas de Kqddo perfundido de la pta^nteria de91 x 10 a 5 x 10 celulas de la placenta aisladas o celulas de Kquid° perfundido de la place9nta, de 5x10 a 1 x 10 celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, de 1x10 a 5 x celulas de la placenta aisladas o celulas de Kquid° perfundido de la placenta, de 5x109 a 1 x 1010 celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, de 1x10 a 5 x 10 celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, de 5 x 1010 a 1 x 1011 celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta, o mas celulas de la placenta aisladas o de lfquido perfundido de la placenta. Por ejemplo, la composicion farmaceutica comprende un numero suficiente de celulas de la placenta aisladas o celulas de lfquido perfundido de la placenta para administrar de aproximadamente 2 x 107 a aproximadamente 10 x 107 celulas por kilogramo de un destinatario.

En otras realizaciones espedficas de cualquiera de las poblaciones crioconservadas anteriores, dichas celulas han sido trasladadas, al menos, o no mas de 5 veces, no mas de 10 veces, no mas de 15 veces, o no mas de 20 veces. En otra realizacion espedfica de cualquiera de las celulas crioconservadas anteriores, dichas celulas se han ampliado dentro de dicho recipiente.

Las composiciones farmaceuticas que comprenden las celulas madre de la placenta descritas en la presente memoria pueden comprender cualquiera, o cualquier combinacion, de las poblaciones de celulas de la placenta, aisladas o tipos de celulas de la placenta aisladas, descritas en otra parte en la presente memoria. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender celulas de la placenta fetales, maternas, o tanto fetales como maternas, p. ej., celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la placenta. Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria pueden comprender adicionalmente celulas de la placenta aisladas obtenidas a partir de un solo individuo o placenta, o de una pluralidad de individuos o placentas.

Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria comprenden poblaciones de celulas que comprenden 50% de celulas viables o mas (es decir, al menos 50% de las celulas de la poblacion son funcionales o estan vivas). Preferiblemente, al menos 60% de las celulas de la poblacion son viables. Mas preferiblemente, al

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menos 70%, 80%, 90%, 95%, o 99% de las celulas de la poblacion en la composicion farmaceutica son viables.

En una realizacion, la composicion farmaceutica comprende celulas de la placenta aisladas que son sustancialmente, o completamente, de origen no materno, es decir, tienen el genotipo fetal; p. ej., al menos aproximadamente 90%, 95%, 98%, 99% o aproximadamente 100% son de origen no materno. Por ejemplo, en una realizacion, una composicion farmaceutica comprende una poblacion de celulas de la placenta aisladas que son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+ y CD200+; CD200+ OCT-4+; CD73+, CD105+ HLA-G+; CD73+ CD105+ y facilitan

la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta que comprende dicha poblacion de celulas de la placenta aisladas cuando dicha poblacion de celulas de la placenta se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; u OCT-4+ y facilitan la formacion de uno o

mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta que comprende dicha poblacion de celulas de la placenta aisladas cuando dicha poblacion de celulas de la placenta se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; o una combinacion de lo anterior, en donde al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de dichas celulas de la placenta aisladas son de origen no materno. En otra realizacion, una

composicion farmaceutica que comprende una poblacion de celulas de la placenta aisladas que son CD10 , CD105 y CD34"; CD10+, CD105+, CD200+ y CD34-; CD10+, CD105+, CD200+, CD34- y al menos uno de CD90+ o CD45'; CD10+, CD90+, CD105+, CD200+, CD34- y CD45'; CD10+, CD90+, CD105+, CD200+, CD34- y CD45'; CD200+ y HLA- G+; CD73+, CD105+ y CD200+; CD200+ y OCT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilitan la

formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta que comprende dichas celulas de la placenta aisladas cuando dicha poblacion de celulas de la placenta se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; OCT-4+ y facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas de la placenta que comprende dichas celulas de la placenta aisladas cuando dicha poblacion de celulas de la placenta se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; o uno o mas deCD117-, CD133-, KDR-, CD80', CD86', HLA-A, B, C+, HLA-DP,DQ,DR- y/o PDL1+; o una combinacion de lo anterior, en donde al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de dichas celulas de la placenta aisladas son de origen no materno. En una realizacion espedfica, la composicion farmaceutica comprende, adicionalmente, una celula madre que no se obtiene a partir de una placenta.

Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria pueden comprender uno o mas compuestos que, p. ej., facilitan el injerto (p. ej., anticuerpos anti-receptor de celulas T, un inmunosupresor, o similares); estabilizantes tales como albumina, dextrano 40, gelatina, hidroxietilalmidon, Plasmalyte, y similares.

5.7.2 Composiciones que comprenden celulas de la placenta hematopoyeticas o celulas de liquido perfundido de la placenta

En ciertas realizaciones de las composiciones proporcionadas en la presente memoria, las celulas de la placenta aisladas son celulas madre de la placenta CD34+, p. ej., celulas de la placenta hematopoyeticas o celulas progenitoras. Tales celulas se pueden obtener a partir de tejido de la placenta, p. ej., a partir de una placenta cuya sangre del cordon umbilical se ha drenado y perfundido para eliminar la sangre residual. En ciertas realizaciones, las celulas madre de la placenta CD34 son CD38+. En ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas CD34+ son CD38-. En otras ciertas realizaciones, las celulas de la placenta aisladas CD34+ son CD45+. En una realizacion espedfica, las celulas de la placenta aisladas son CD34+, CD38' y CD45+. En ciertas realizaciones, las celulas son celulas hematopoyeticas. En una realizacion mas espedfica, las celulas de la placenta CD34+ son celulas hematopoyeticas. En ciertas realizaciones, las celulas CD34+ o las celulas hematopoyeticas se obtienen a partir de lfquido perfundido de la placenta. En ciertas realizaciones, las celulas CD34+ o celulas hematopoyeticas se obtienen mediante digestion enzimatica o rotura ffsica del tejido de la placenta. Las celulas CD34+ y las celulas hematopoyeticas se pueden obtener de una sola placenta, o de mas de una placenta.

En ciertas realizaciones, las celulas de las composiciones proporcionadas en la presente memoria, formuladas por los metodos proporcionados en la presente memoria, son celulas obtenidas de lfquido perfundido de la placenta. Segun se utiliza en la presente memoria, "celulas obtenidas de lfquido perfundido de la placenta" incluye celulas nucleadas totales obtenidas a partir de, p. ej., aisladas de, lfquido perfundido de la placenta, un subconjunto de celulas nucleadas obtenidas de lfquido perfundido de la placenta, o celulas cultivadas o que se hacen proliferar a partir de celulas obtenidas directamente de lfquido perfundido de la placenta. El lfquido perfundido de la placenta se puede obtener a partir de una placenta cuya sangre del cordon umbilical ha sido drenada y perfundida para eliminar la sangre residual, antes de la perfusion para obtener celulas de la placenta. El lfquido perfundido de la placenta se puede obtener a partir de una placenta cuya sangre del cordon umbilical ha sido drenada, pero no perfundida para eliminar la sangre residual. El lfquido perfundido de la placenta se puede obtener a partir de una placenta cuya sangre del cordon no ha sido drenada ni perfundida para eliminar la sangre residual. En las dos ultimas realizaciones, las celulas de la placenta, p. ej., las celulas nucleadas de lfquido perfundido de la placenta, por ejemplo, las celulas nucleadas totales de lfquido perfundido de la placenta, comprenden celulas nucleadas de sangre de la placenta y/o sangre de cordon. Las celulas de lfquido perfundido de la placenta se pueden obtener de una sola placenta, o de mas de una placenta.

5.7.3 Lineas celulares inmortalizadas de la placenta

Las celulas de la placenta de mamffero pueden ser inmortalizadas condicionalmente por transfeccion con cualquier

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vector adecuado que contenga un gen promotor del crecimiento, es dedr, un gen que codifica una protema que, en condiciones apropiadas, promueve el crecimiento de la celula transfectada, de manera que la produccion y/o actividad de la protema que promueve el crecimiento es regulable por un factor externo. En una realizacion preferida, el gen promotor del crecimiento es un oncogen tal como, pero no limitado a, v-myc, N-myc, c-myc, p53, el antigeno T grande de SV40, el antigeno T grande del polioma, E1a de adenovirus o protema E7 de virus del papiloma humano.

La regulacion externa de la protema promotora del crecimiento se puede lograr colocando el gen promotor del crecimiento bajo el control de un promotor externamente regulable, p. ej., un promotor cuya actividad puede ser controlada, por ejemplo, mediante la modificacion de la temperatura de las celulas transfectadas o la composicion del medio en contacto con las celulas. Por ejemplo, se puede emplear un sistema de expresion de genes controlado por tetraciclina (tet) (vease Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551, 1992; Hoshimaru et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1518-1523, 1996). En ausencia de tet, un transactivador controlado por tet (tTA) dentro de este vector activa fuertemente la transcripcion de phcwvM, un promotor mmimo de citomegalovirus humano fusionado a secuencias del operadortet. tTA es una protema de fusion del represor (tetR) del operon de resistencia a tet derivado del transposon 10 de Escherichia coli y el dominio acido de VP16 del virus del herpes simplex. Las bajas concentraciones notoxicas detet p. ej., 0,01-1,0 pg/ml) casi anulan completamente la transactivacion por tTA.

Por ejemplo, el vector contiene adicionalmente un gen que codifica un marcador seleccionable, p. ej., una protema que confiere resistencia a farmacos. El gen bacteriano de resistencia a neomicina (neoR) es uno de tales marcadores que puede ser empleado dentro de los presentes metodos. Las celulas que llevan neoR pueden ser seleccionadas por medios conocidos por los expertos normales en la tecnica, tales como la adicion de, p. ej., 100-200 pg/ml de G418 al medio de crecimiento.

La transfeccion se puede conseguir por cualquiera de una variedad de medios conocidos por los expertos normales en la tecnica, incluyendo, pero no limitados a, la infeccion retroviral. En general, un cultivo de celulas se puede transfectar por medio de incubacion con una mezcla de medio acondicionado recogido de la lmea celular productora para el vector y DMEM/F12 que contiene suplementos de N2. Por ejemplo, un cultivo de celulas de la placenta preparado como se ha descrito anteriormente puede estar infectado despues de, p. ej., cinco d^as in vitro por medio de incubacion durante aproximadamente 20 horas en un volumen de medio acondicionado y dos volumenes de DMEM/F12 que contiene suplementos de N2. Las celulas transfectadas que llevan un marcador de seleccion pueden ser seleccionadas a continuacion como se ha descrito anteriormente.

Despues de la transfeccion, los cultivos se trasladan sobre una superficie que permite la proliferacion, p. ej., permite que al menos 30% de las celulas se dupliquen en un penodo de 24 horas. Preferiblemente, el sustrato es un sustrato de poliornitina/laminina, que consiste en plastico de cultivo tisular recubierto con poliornitina (10 pg/ml) y/o laminina (10 pg/ml), un sustrato de polilisina/laminina o una superficie tratada con fibronectina. Los cultivos se alimentan a continuacion cada 3-4 dfas con medio de crecimiento, que puede o no ser complementado con uno o mas factores de mejora de la proliferacion. Factores de mejora de la proliferacion se pueden anadir al medio de crecimiento cuando los cultivos presentan una confluencia de menos de 50%.

Las lmeas celulares de la placenta inmortalizadas condicionalmente se pueden trasladar utilizando tecnicas convencionales, tales como tripsinizacion, cuando hay una confluencia de 80-95%. Hasta aproximadamente el vigesimo traslado, resulta beneficioso mantener la seleccion (mediante, por ejemplo, la adicion de G418 para las celulas que contienen un gen de resistencia a neomicina). Las celulas tambien se pueden congelar en nitrogeno lfquido para almacenamiento a largo plazo.

Las lmeas celulares clonales se pueden aislar a partir de una lmea de celulas de placenta humana inmortalizada condicionalmente preparada como se ha descrito anteriormente. En general, tales lmeas celulares clonales se pueden aislar utilizando tecnicas convencionales, tales como dilucion limitante o utilizando anillos de clonacion y se pueden expandir. Las lmeas celulares clonales pueden generalmente ser alimentadas y trasladadas como se ha descrito anteriormente.

Se puede inducir la diferenciacion de las lmeas celulares de la placenta humana inmortalizadas condicionalmente, que pueden, pero no necesitan, ser clonales, mediante la supresion de la produccion y/o actividad de la protema promotora del crecimiento en condiciones de cultivo que facilitan la diferenciacion. Por ejemplo, si el gen que codifica la protema promotora del crecimiento esta bajo el control de un promotor externamente regulable, las condiciones, p. ej., la temperatura o la composicion del medio, se pueden modificar para suprimir la transcripcion del gen promotor del crecimiento. Para el sistema de expresion del gen controlado por tetraciclina comentado anteriormente, la diferenciacion se puede conseguir mediante la adicion de tetraciclina para suprimir la transcripcion del gen promotor del crecimiento. En general, 1 pg/ml de tetraciclina durante 4-5 dfas es suficiente para iniciar la diferenciacion. Para promover aun mas la diferenciacion, se pueden incluir agentes adicionales en el medio de crecimiento.

5.7.4 Kits

En otro aspecto, se describen adicionalmente en la presente memoria kits para la produccion y/o la administracion de las composiciones que contienen celulas de la placenta aisladas de la presente invencion.

Se describe en la presente memoria un kit que comprende, en recipientes separados, una o mas de una solucion

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que comprende dextrano, p. ej., dextrano 40, una solucion que comprende albumina de suero humano (HSA), y un crioconservante. Por ejemplo, el kit comprende una pluralidad de celulas de la placenta aisladas, p. ej., celulas de la placenta aisladas crioconservadas. Alternativamente, el kit comprende un recipiente que comprende una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5% (p/v) y HSA al 10% (p/v). Alternativamente, el kit comprende un recipiente que 5 comprende una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10% y DMSO al 5% o, el kit comprende un recipiente que comprende una solucion de dextrano 40 al 10%.

Ademas, el kit comprende un filtro, o una pluralidad de filtros, adecuados para la filtracion de suspensiones de celulas. Preferiblemente, uno o mas de los filtros del kit comprenden poros entre aproximadamente 50 pM de diametro a aproximadamente 150 pM de diametro. Preferiblemente, el filtro es un filtro de 70 pM o el filtro es un filtro 10 de 100 pM.

Adicionalmente, el kit comprende uno o mas artfculos de material de vidrio o recipientes de plastico adecuados para la produccion o el uso de una de las composiciones descritas en la presente memoria. Por ejemplo, el kit puede comprender, p. ej., una bolsa de plastico adecuada para la crioconservacion o la dilucion o el suministro de una suspension de celulas, p. ej., una suspension de celulas de la placenta aisladas. Alternativamente, el kit comprende 15 (1) una pluralidad de celulas de la placenta aisladas, p. ej., celulas madre de la placenta o celulas pluripotentes de la

placenta, p. ej., en uno o mas viales; (2) material de plastico suficiente para el cultivo de dichas celulas de la placenta aisladas para, p. ej., 2-3 traslados; (3) un recipiente que comprende una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5% (p/v) y HSA al 10% (p/v); (4) un recipiente que comprende una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10% y DMSO al 5%; (5) un recipiente que comprende una solucion de dextrano 40 al 10%; y (6) uno o 20 mas filtros que comprenden poros de entre aproximadamente 50 pM de diametro a aproximadamente 150 pM de diametro, en donde los filtros son adecuados para soluciones de filtrado que comprenden celulas.

6. Ejemplos

6.1 Ejemplo 1: Metodo mejorado para producir composiciones administrables que comprenden celulas de la placenta aisladas

25 Este Ejemplo demuestra la formulacion de celulas de la placenta aisladas CD34", CD10+, CD105+, CD200+ humanas tanto antes como despues de la crioconservacion, para producir celulas de la placenta aisladas, de alta viabilidad, homogeneas para la administracion a seres humanos o animales. La composicion resultante comprende celulas de la placenta aisladas que presentan una alta viabilidad y sin macro-cumulos de celulas durante de al menos un penodo de 4 horas despues de la descongelacion. Un estudio de dosificacion aguda en raton demostro que los 30 ratones NOD/SCID toleraban una dosis maxima de al menos 1,5 millones de celulas por raton (aproximadamente 75 millones de celulas por kg suponiendo un peso medio de 20 gramos) utilizando la formulacion final descrita a continuacion mediante la administracion por infusion intravenosa sin ningun toxicidad cardfaca o pulmonar (evidenciada por respiracion dificultosa, movimiento en drculos, y ataxia), y hasta 250 millones de celulas por kg por via subcutanea, una mejora con respecto a las formulaciones anteriores. Mientras que el siguiente ejemplo describe 35 la formulacion de las celulas de la placenta aisladas que expresan marcadores de superficie particulares, los resultados presentados en la presente memoria indican que los metodos y las formulaciones se pueden utilizar, y son compatibles, con otras celulas, p. ej., celulas de mairnfero que expresan diferentes marcadores de superficie.

Analisis de cumulos de celulas

Los cumulos de celulas (agregaciones) fueron clasificados como macro-cumulos de celulas o micro-cumulos de 40 celulas. Se identificaron los macro-cumulos de celulas y los micro-cumulos de celulas, si estaban presentes, de acuerdo con los siguientes procedimientos.

Analisis de macro-cumulos de celulas

Las celulas se descongelaron en un recipiente en un bano de agua a 37°C hasta que solo quedo un pequeno trozo de hielo en el recipiente. Las celulas se extrajeron del recipiente utilizando una jeringa equipada con una aguja de 45 calibre 16, y las celulas fueron dispensadas desde el recipiente a un tubo conico de 50 ml. La presencia o ausencia de macro-cumulos de celulas se evaluo mediante inspeccion visual.

Analisis de micro-cumulos de celulas

Las celulas se contaron para determinar la concentracion de celulas. Las celulas se diluyeron a continuacion hasta 4 x 106 celulas/ml con dextrano 40 al 10%, y se anadieron 50 pl de las celulas, 40 pl de dextrano 40 al 10%, y 10 pl de 50 una solucion de esferas de medicion de 40 pM a un tubo de microcentnfuga de 1,7 ml. El contenido del tubo se mezclo suavemente. Se colocaron diez pl de la muestra mezclada en un portaobjetos de vidrio y se cubrieron con un cubreobjetos. Se contaron todos los micro-cumulos de celulas que comprendfan tres o mas celulas.

Las celulas de la placenta utilizadas fueron obtenidas inicialmente a partir de un banco de celulas que contema las poblaciones de celulas de la placenta adherentes, como se describe en la presente memoria, que se han sometido a 55 4-6 traslados antes de la crioconservacion.

Los datos de comparacion de los tampones compatibles con la inyeccion in vivo, utilizando dos lmeas celulares de placenta aisladas diferentes, indicaron que la solucion salina tamponada con fosfato (PBS), Plasmalyte A y el Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) con un suplemento de albumina de suero humano (HSA) al 1% son todos capaces de mantener una alta viabilidad de las celulas despues de 5 horas tras la descongelacion. La 5 concentracion final de celulas en el tampon fue de 25 * 106 celulas/ml. Se selecciono Plasmalyte A por promover la mas alta viabilidad de las celulas para los tampones sometidos a ensayo. Como se demuestra en la Tabla 10a y la Tabla 10b la alta viabilidad se mantuvo durante varias horas despues de la descongelacion; ademas, los fenotipos nominales no cambiaron a lo largo de mas de 3 horas despues de la descongelacion. La viabilidad de las celulas en la formulacion despues de la descongelacion no se vio afectada de manera significativa tras el traslado de las 10 celulas a traves de una aguja de calibre 26. No fue posible una determinacion de la formacion de cumulos de celulas en estos dos experimentos debido al pequeno volumen de la muestra utilizada.

Basandose en los datos de la Tabla 1a y la Tabla 1b, la formulacion despues de la descongelacion se finalizo como sigue: Las celulas se descongelaron a 37°C en un bano de agua, e inmediatamente se diluyeron 1:1 (v/v) con tampon de descongelacion (HSA al 2,5% + Dextrano 40 al 5%). Las celulas se centrifugaron a continuacion a 400 g 15 durante 5 minutos, y se resuspendieron en Plasmalyte A + HSA al 1%.

Tabla 1a: Viabilidad despues de la descongelacion y fenotipo de las celulas de la placenta en Plasmalyte A + HSA al

1% sin un ensayo con jeringa/aguja.

0 horas 1 hora 3 horas 5 horas

Viabilidad 98,0% 97,1% 92,4% 93,8%

CD105+/200+ 84,3% 87,9%

Tabla 1b: Viabilidad despues de la descongelacion y fenotipo de las celulas de la placenta en Plasmalyte A + HSA al 20 1% con un ensayo jeringa/aguja.

0 horas 1 hora 3 horas 5 horas

Viabilidad 98,0% 97,2% 93,7% 97,3%

CD105+/200+ 87,3% 87,3%

Estudio de biodistribucion en raton

La formulacion despues de la descongelacion anterior se aplico en un estudio piloto de biodistribucion en raton. No se observaron macro-cumulos de celulas durante la preparacion de celulas despues de la descongelacion, sobre 25 todo despues de la adicion de Plasmalyte. Con esta preparacion de celulas, se observo toxicidad pulmonar aguda a una dosis de 1 millon de celulas por raton (aproximadamente 20 g) por medio de dos infusiones intravenosas repetidas de 0,5 millones de celulas cada una. Estas dos observaciones llevaron a una mayor investigacion de la formulacion de celulas de la placenta.

Basandose en las observaciones de un estudio piloto de biodistribucion en raton de que se indudan cumulos de 30 celulas significativos despues de la adicion de Plasmalyte A, pero no de Dextrano 40, se utilizo Dextrano 40 para este estudio como un medio de dilucion, junto con Plasmalyte A, HSA y PBS.

Tabla 2: Clasificacion de cumulos de celulas a las 4 horas de la descongelacion. Los numeros mas bajos indican un

menor numero de cumulos.

Medio: Dextrano 40 al 5% + HSA al 10% Dextrano 40 al 5% + HSA al 2,5% Dextrano 40 al 5% PBS Plasmalyte A

Rango de cumulos de celulas: 1 1 2 33

35 Las celulas, previamente congeladas en Plasmalyte A + HSA al 10% + DMSO al 5%, se descongelaron en un bano de agua a 37°C, y se diluyeron 1:7 con los respectivos tampones. Los datos de la Tabla 2 muestran que el Dextrano 40 con HSA indudan menos cumulos de celulas entre los medios sometidos a ensayo.

Se observaron agregados de celulas inmediatamente despues de la descongelacion en diversas formulaciones. La adicion de una etapa de filtracion, en donde las celulas se filtraron despues de la descongelacion a traves de un filtro de 100 pm, elimino los agregados de celulas. Se sometieron a ensayo dos lotes de celulas de la placenta para determinar el efecto de la filtracion combinado con diluyentes espedficos. No se formaron macro-cumulos de celulas 5 despues de la filtracion cuando las celulas se diluyeron 1:1 con Dextrano 40 al 10% a lo largo de un penodo de tiempo de 4 horas post-descongelacion. Veanse las Tablas 3a-3c. Ademas, la viabilidad se mantuvo alta. Se observaron resultados similares a traves de varios lotes diferentes de celulas de la placenta.

Tabla 3a: Macro-cumulo de celulas

LOTE 1 LOTE 2

Macro-cumulo de celulas existente en la bolsa despues de la descongelacion

Sf, grandes laminas

Sf, pequenos puntos

Macro-cumulo de celulas recien formado despues de la filtracion

Plasmalyte A: Dextrano 40 al 5% Plasmalyte A

Sf: No Sf, pero mucho menos

que en el LOTE 1

Dextrano 40 al 5%

No

10

Tabla 3b: Micro-cumulos de celulas despues de la filtracion en Dextrano 40

3-5 cumulos de celulas (cumulos/106 celulas) 5 cumulos de celulas (cumulos/106 celulas)

LOTE 1 LOTE 2

1210: 416

491: 119

Tabla 3c: Viabilidad despues de la filtracion en Dextrano 40 y Plasmalyte A LOTE 1 LOTE 2

Dextrano 40 Plasmalyte A Dextrano 40 Plasmalyte A

0h: 91,5% 92,4% 94,2%

2 horas: 92,5% 93,9%

4 horas: 91,8% 94,7% 94,7%

94,5%

93,3%

Basandose en los estudios anteriores, la formulacion de celulas de la placenta despues de la descongelacion se 15 simplifico con el siguiente procedimiento: Las celulas se descongelaron en un bano de agua a 37°C durante hasta 3 minutos, despues se filtraron a traves de un colador de 100 pM. Las celulas coladas se diluyeron 1:1 (v:v) con dextrano 40 al 10%.

Formulacion antes de la congelacion

Tambien se observaron cumulos de celulas en la fase de pre-congelacion del procesamiento de las celulas. Se 20 estudiaron el medio de congelacion, la densidad celular de congelacion y una etapa de filtracion en suspension para reducir y/o eliminar los agregados de celulas antes de la congelacion.

Medio de congelacion

Basandose en el exito del Dextrano 40 en la formulacion despues de la descongelacion, anterior, se comparo el Dextrano 40 con Plasmalyte como medio de congelacion. Las celulas del LOTE 3 se congelaron a una concentracion 25 de 17 millones de celulas por ml en Plasmalyte A + HSA al 10% + DMSO al 5% o en Dextrano 40 al 5% + HSA al 10% + DMSO al 5%. La presencia de cumulos de celulas se evaluo como sigue:

Tabla 4a: Comparacion de Plasmalyte y Dextrano 40 como medio de congelacion - Macro-cumulos de celulas

Plasmalyte A Dextrano 40

Macro-cumulo de celulas

Perdida de celulas despues de la filtracion con colador de 100 pm

Mas que con Dextrano 40

20%

Menos que con Plasmalyte A

3%

Tabla 4b: Comparacion de Plasmalyte A y Dextrano 40 como medio de congelacion - Micro-cumulos de celulas

Plasmalyte A Dextrano 40

3-5 cumulos de celulas (cumulos/106 celulas) 1893 523

> 5 cumulos de celulas (cumulos/106 celulas) 929 205

5 Tabla 4c: Comparacion de Plasmalyte A y Dextrano 40 como medio de congelacion - Viabilidad

Plasmalyte Dextrano 40

0 horas despues de la descongelacion 89,9% 90,8%

4 horas despues de la descongelacion 89,2% 91,3%

El uso de dextrano 40 en estos experimentos dio como resultado menos macro-cumulos de celulas, menos micro- cumulos de celulas, y una mayor viabilidad celular que el uso de Plasmalyte A. Basandose en estos resultados, el Dextrano 40 fue seleccionado como medio de congelacion.

10 Densidad de celulas de congelacion y Filtracion pre-congelacion

Con el fin de eliminar los macro-cumulos de celulas y minimizar los micro-cumulos de celulas, se examinaron la densidad de celulas y la filtracion antes de la congelacion como sigue:

Tabla 5a: Efecto de la densidad de celulas de congelacion y la filtracion antes de la congelacion sobre la formacion

de cumulos de celulas.

Condicion 1 Condicion 2 Condicion 3 Condicion 4

Filtracion: Sf, colador 70 pm No

Concentracion: 20 x 106 20 x 106

Sf, colador 70 pm 5 x 106

No

5 x 106

Medio de congelacion

Dextrano 40 al 5% + Dextrano 40 al 5% + HSA al 10% + DMSO HSA al 10%+ DMSO al 5% al 5%

Dextrano 40 al 5% + Dextrano 40 al 5% + HSA al 10% + DMSO HSA al 10% + DMSO al 5% al 5%

Concentracion: celulas por mililitro. 15

5

10

Tabla 5b: Efecto de la densidad de celulas de congelacion y la filtracion antes de la congelacion sobre la formacion

de macro-cumulos de celulas.

Condicion 1 Condicion 2 Condicion 3 Condicion 4

Filtracion antes de la congelacion No: sf No sf

Filtracion despues de la descongelacion No: sf No sf

No: No hay formacion de macro-cumulos.

Sf: Formacion de macro-cumulos.

Tabla 5c: Efecto de la densidad de celulas de congelacion y la filtracion antes de la congelacion sobre los micro-

cumulos de celulas (cumulos por cada 106 celulas)

: Condicion 1 Condicion 2 Condicion 3 Condicion 4

: 3-5 micro- micro- micro- micro- micro- micro- micro-

: micro- cumulos cumulos cumulos cumulos cumulos cumulos cumulos

: cumulos de celulas de celulas de celulas de celulas de celulas de celulas de celulas

: de de >5 de 3-5 de >5 de 3-5 de >5 de 3-5 de >5

: celulas celulas celulas celulas celulas celulas celulas celulas

Antpc Hp Ip

: 188 0 291 194 231 46 237 172

congelacion

Despues de la: 688 375 631 655 231 116 323 366

descongelacion

Los resultados mostrados en las Tablas 5B y 5C muestran claramente que la filtracion antes de la congelacion elimina la formacion de macro-cumulos de celulas despues de la descongelacion. Los datos tambien indican que las muestras con alta concentracion de celulas, por ejemplo, 20 x 106 celulas/ml, tienen mas potencial para formar micro-cumulos de celulas despues de la descongelacion. Como resultado, se examino el efecto de la densidad de celulas de la congelacion sobre la formacion de cumulos de celulas.

Tabla 6a: Efecto de la densidad de celulas de congelacion sobre la formacion de cumulos de celulas LOTE 4 Condicion 1 Condicion 2 Condicion 3 Condicion 4

Concentracion

15 x 106

10 x 106

7,5 x 106

5 x 106

Filtracion

colador de 70 pm colador de 70 pm colador de 70 pm colador de 70 pm

Medio de congelacion

Dextrano 40 al 5% HSA al 10%+ DMSO al 5%

Dextrano 40 al 5% HSA al 10% + DMSO al 5%

Concentracion: numero de celulas por mililitro.

5

10

15

20

25

Tabla 6b: Efecto de la densidad de celulas de congelacion sobre la formacion de macro-cumulos de celulas

: Condicion 1 Condicion 2 Condicion 3 Condicion 4

Antes de la congelacion: Sf (1 cumulo) No No No

Despues de la descongelacion 0 h: Sf (3 cumulos) Sf (1 cumulo) No No

Despues de la descongelacion 4 h Sf (3 cumulos)s Sf (1 cumulo): No No

No: No hay formacion de macro-cumulos de celulas. Sf: Hay formacion de macro-cumulos de celulas

Tabla 6c: Efecto de la densidad de celulas de congelacion sobre los micro-cumulos de celulas

(cumulos por cada 106 celulas)

Condicion 1 Condicion 2 Condicion 3 Condicion 4

: 3-5 celulas > 5 celulas 3-5 celulas >5 celulas 3-5 celulas >5 celulas 3-5 celulas >5 celulas

Antes de la congelacion: 141 70 130 65 83 33 103 34

Despues de la descongelacion 0 h: 271 193 111 44 102 34 108 46

Despues de la descongelacion 4 h: 298 212 105 53 122 44 97 55

Los resultados de las Tablas 6b y 6c muestran que la densidad de congelacion a 7,5 x 106/ml o menos no induce macro-cumulos de celulas despues de la descongelacion. Por otra parte, a concentraciones de hasta 10 x 106 celulas/ml, el numero de micro-cumulos de celulas es razonablemente bajo, menos de 200 micro-cumulos de celulas/millon de celulas.

Basandose en los resultados anteriores, las formulaciones de antes de la congelacion y despues de la descongelacion se generaron como sigue. Para la formulacion de antes de la congelacion, se centrifugaron celulas de la placenta de cultivo lfquido a 220 xg durante 5 minutos, y se resuspendieron en Dextrano 40 al 5% a aproximadamente 7,5 x 106 celulas/ml. Las celulas se centrifugaron a 400 xg durante 10 minutos, despues se resuspendieron en Dextrano 40 al 6% y HSA al 10% a aproximadamente 7,5 x 106 celulas/ml. Las celulas resuspendidas se hicieron pasar a continuacion a traves de un filtro de 70 pM por gravedad. A continuacion, se diluyeron las celulas filtradas en Dextrano 40 al 5%, HSA al 10%, y DMSO al 5% a una concentracion de aproximadamente 7,5 x 106 celulas por ml. Las celulas diluidas se colocaron en crio-bolsas, se congelaron y se almacenaron en nitrogeno en fase de vapor. Para la formulacion despues de la descongelacion, las celulas congeladas se descongelaron en un bano de agua a 37°C, despues se diluyeron con dextrano 40 al 10% a diferentes proporciones en volumen de 1:1 a 1:5 de tampon que contiene celulas:dextrano 40.

Evaluacion de la Formulacion de celulas de la placenta

1. Ausencia de formacion de macro-cumulos de celulas despues de la descongelacion

Se produjeron cinco lotes de celulas de la placenta utilizando el metodo de formulacion anterior (incluyendo el LOTE 11 y el LOTE 12, descritos a continuacion). No se observaron macro-cumulos de celulas despues de la descongelacion en ninguno de los cinco lotes, y el numero de micro-cumulos de celulas permanecio bajo.

2. Ausencia de impacto sobre el fenotipo

El fenotipo de las celulas de la placenta no se vio afectado por la formulacion mejorada. Mas de 90% de las celulas en la formulacion siguio siendo CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+.

3. Estudios en raton GLP

Se utilizaron celulas del LOTE 12 para un estudio de biodistribucion en raton. Las celulas de la placenta se administraron en la formulacion anterior en forma de una sola y/o repetidas inyecciones intravenosas en la vena de la cola de ratones NOD-SCID macho y hembra o ratones macho C57BL/10SgSnAi-Rag2(tmi)Yc(tmi). Los ratones se sacrificaron a los 4, 14, 28 o 47 dfas del tratamiento y se procesaron y analizaron muestras de pulmon, fngado, 5 corazon, rinones, bazo, glandulas suprarrenales, medula osea, y cerebro por medio de Q-PCR para determinar la presencia de la secuencia de ADN de hTERT; hTERT es el gen de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana. Despues de la administracion i.v., se detecto el ADN humano en el ADN total aislado de las muestras de pulmon, cerebro, corazon y/o fngado de los ratones que fueron sacrificados a los 4 dfas de la administracion de dosificacion. Se detectaron los niveles mas altos de ADN en el pulmon. Los ratones fueron capaces de tolerar la 10 administracion de 25-100 millones de celulas por kg mediante infusion intravenosa sin ninguna toxicidad cardfaca o pulmonar. Se utilizaron celulas del LOTE 11 para un estudio de la tumorigenicidad en raton. Se administraron a los ratones hasta 250 millones de celulas por kg por via subcutanea (SC), sin efectos adversos.

6.2 Ejemplo 2: Composiciones mejoradas que se pueden administrar

Este Ejemplo demuestra una formulacion de celulas de la placenta CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ adherente al 15 plastico del cultivo de tejidos pluripotentes humanas, que incluso despues de la crioconservacion, representan celulas de alta viabilidad, homogeneas, adecuadas para la administracion a seres humanos o animales. Las celulas de la formulacion muestran, de media, una disminucion de 400 veces en la cantidad de agregados formados, y una mejora de la Dosis Maxima Tolerada (MTD) de aproximadamente 3 veces que una formulacion anterior en un modelo de raton por via intravenosa (datos no mostrados). Mientras que el siguiente ejemplo describe la formulacion 20 de las celulas de la placenta aisladas que expresan marcadores de superficie particulares, los resultados presentados en la presente memoria indican que los metodos y las formulaciones se pueden utilizar, y son compatibles, con otras celulas, p. ej., celulas de mairnfero que expresan diferentes marcadores de la superficie.

La formulacion (designada "Formulacion B") comprende celulas de la placenta del fenotipo celular anterior a una concentracion de 10 ± 3 x 106 celulas/ml, en una solucion que contiene Dextrano 40 al 5,5% (p/v), albumina de suero 25 humano (HSA) al 10% (p/v) y dimetilsulfoxido (DMSO) al 5% (v/v). La HSA y el Dextrano 40 utilizados en la presente memoria son de grado clmico; el DMSO es de calidad GMP.

En la Tabla 7, se describe una formulacion basada en Plasmalyte designada "Formulacion A", y se compara con la Formulacion B, una formulacion a base de Dextrano 40. Las celulas se filtran en suspension a traves de una malla de 70 pm en la preparacion de la Formulacion B, pero no se filtran en la preparacion de la Formulacion A.

30 Tabla 7: Composicion de la Formulacion A y la Formulacion B

Formulacion A Formulacion B

Concentracion celular 27 ± 8 x 106 celulas/ml 10 ± 3 x 106 celulas/ml

Excipiente a granel Plasmalyte Dextrano 40 al 5,5% en solucion salina

Concentracion de DMSO 5% (v/v) 5% (v/v)

Concentracion de HSA 10% 10%

Se observo una agregacion celular significativa cuando se descongelo la Formulacion A. La investigacion posterior demostro que numerosos parametros, incluyendo la composicion del medio de formulacion y la concentracion de celulas de congelacion eran los principales contribuyentes a la agregacion de las celulas. Se realizaron estudios de 35 optimizacion y la Formulacion B fue disenada espedficamente para reducir o eliminar estos efectos de la agregacion celular. Ademas, se introdujo la filtracion de la suspension celular a traves de una malla de 70 pm como parte del proceso para proporcionar un mejor control de las suspensiones de celulas durante la formulacion.

Para cuantificar los agregados de celulas en las formulaciones, se ideo un analisis de retencion en el filtro como una herramienta de desarrollo y se utilizo para comparar una serie de lotes de composicion de celulas de la placenta 40 producidos por la Formulacion Ay la Formulacion B. Esto se volvio particularmente cntico, ya que la agregacion de las celulas en la Formulacion B se redujo hasta el punto de que ya no era discernible a simple vista de una manera fiable. Una comparacion de multiples muestras analizadas de series representativas de la Formulacion A y la Formulacion B se muestra en la Tabla 8. El metodo cuantifica los agregados de celulas tenidas previamente retenidas en un filtro de diferentes muestras mediante la formacion de imagenes digitales del filtro, e informa de la 45 zona de filtro ("Zona Media") cubierta por los agregados. Como se muestra en la Tabla 8, la Formulacion B tema cada vez menos cobertura de la zona (agregados) que la Formulacion A, siendo la diferencia media de 400 veces. Los datos tambien muestran un buen control y reproducibilidad del proceso para la Formulacion B. Los lotes de composicion de celulas de la placenta aisladas de las dos formulaciones utilizadas para los estudios in vivo tambien se indican en la Tabla 16. El cambio de la Formulacion A a la Formulacion B mejoro la Dosis Maxima Tolerada

5

10

15

20

25

30

35

(MTD) aproximadamente 3 veces en un modelo in vivo intravenosa de raton (datos no mostrados).

Tabla 8: Formacion de agregados despues de la descongelacion en la Formulacion Ay la Formulacion B Lote Bolsas Filtros Zona media (px/MM) Des. ^p. CV Formulacion (ensayo in vivo se indica con *)

1: 2 13 97490 38369 0,39 Formulacion A

2: 1 12 98629 33165 0,34 Formulacion A *

1
1: 2 63 81 1,28 Formulacion B *

2: 1 2 38 12 0,32 Formulacion B

3: 1 2 1539 573 0,37 Formulacion B *

4: 1 2 137 43 0,31 Formulacion B

5: 3 6 125 162 1,29 Formulacion B

6: 3 6 71 57 0,81 Formulacion B

Clave: "Bolsas" indica el numero de bolsas de composicion de celulas aisladas descongeladas y sometidas a ensayo para ese Lote; "Filtros" indica el numero total de replicas del analisis para ese Lote; "Zona Media" indica la cobertura de la zona media de los filtros para ese Lote en unidades de pfxeles/millon de celulas aplicadas al filtro; "Desv. Tip." = desviacion tfpica; "CV" = Coeficiente de Variacion.

6.3 Ejemplo 3: Caracterizacion de las composiciones mejoradas que se pueden administrar

Este ejemplo proporciona una caracterizacion adicional de las formulaciones farmaceuticas que comprenden HSA, dextrano 40, y DMSO. Los metodos utilizados en uno o mas de los experimentos descritos a continuacion son los siguientes:

Evaluacion de la viabilidad celular: La viabilidad se analizo por medio de un analisis de exclusion de azul de tripan utilizando un hemocitometro o un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California). La viabilidad se expreso como el porcentaje de celulas viables de entre las celulas totales.

Recuentos de celulas: Las celulas se contaron utilizando un hemocitometro o un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California). Los recuentos de celulas se expresaron como millones de celulas por mililitro (MM/ml).

Agregacion celular: Se midio la cantidad de agregacion celular utilizando un Analisis de Retencion en Filtro (FRA), que mide la cantidad de agregacion celular mediante la tincion de las celulas y haciendolas pasar a traves de un filtro de 70 pm. Los agregados celulares superiores a 70 pm no pueden pasar por el filtro y se cuantifican mediante el analisis de imagenes utilizando un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California). Los datos se expresan en pfxeles por millon de celulas cargadas (px/MM).

Citometna de flujo: Las celulas fueron evaluadas para determinar los niveles de los marcadores celulares CD10, CD34, CD 105 y CD200 mediante citometna de flujo. Los valores se expresan como el porcentaje de celulas positivas y/o negativas para un marcador particular, o combinacion de marcadores.

Inmunosupresion: La actividad inmunosupresora de las celulas en las formulaciones descritas a continuacion se evaluo mediante un analisis de Reaccion de las celulas T con Esferas (BTR), que mide la capacidad de las celulas para suprimir una respuesta de celulas T a esferas antigenicas.

Si bien el siguiente ejemplo describe la formulacion de las celulas de la placenta aisladas que expresan marcadores de la superficie particulares, los resultados presentados en la presente memoria indican que se pueden utilizar los metodos y las formulaciones, y son compatibles con otras celulas, p. ej., celulas de mairnfero que expresan diferentes marcadores de la superficie.

6.3.1 Caracterizacion de las razones de DMSO y Dextrano:HSA

Este ejemplo describe el efecto de variar las concentraciones de HSA, Dextrano, y DMSO, y de variar la razon de dextrano con respecto a HSA, sobre la agregacion celular, la viabilidad y la recuperacion celulares, y el fenotipo y la funcionalidad de las celulas.

Condiciones experimentales

Se investigo el espacio de solucion de los tres componentes (HSA, dextrano 40 y DMSO) para la formulacion de celulas en las condiciones mostradas en el diagrama ternario de la FIG. 1. Las condiciones experimentales se eligieron a lo largo de dos ejes: uno que sometfa a ensayo diferentes porcentajes de DMSO mientras mantema la 5 razon de dextrano:HSA constante (veanse las formulaciones 1-4, a continuacion), y otro que variaba la razon de dextrano:HSA mientras mantema el porcentaje de DMSO constante (veanse las formulaciones 3, 5-8, a continuacion).

Metodos y Materiales

Se expandieron aproximadamente doce millones de celulas pluripotentes de la placenta CD10+, CD34-, CD105+, 10 CD200+ crioconservadas en Fabricas Celulares de 10 bandejas de Nunc™, una para cada una de las formulaciones

siguientes, a aproximadamente 1,2 x 108 celulas. Se recogieron las celulas por incubacion durante 10 min a temperatura ambiente con tripsina/EDTA al 0,25%. Las celulas disociadas se transfirieron a un tubo de centnfuga de 500 ml que contema 250 ml de suero bovino fetal (FBS) al 2% en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM). Las celulas se centrifugaron a continuacion a 1040 RPM en tubos de 500 ml en una centnfuga Sorvall 15 RC3BP. Las celulas se resuspendieron en solucion salina al 0,9%/solucion de dextrano 40 al 5%. Las celulas se centrifugaron a continuacion a 1420 RPM durante 10 min, y se suspendieron en 10 ml de una de las ocho formulaciones siguientes (las razones de dextrano:HSA se muestran en unidades de "fraccion en volumen de HSA al 25%" (VF HSA) para las formulaciones y 5-8):

20

25

Formulacion 1: Formulacion 2: Formulacion 3: Formulacion 4: Formulacion 5: Formulacion 6: Formulacion 7: Formulacion 8:

DMSO al 20%, HSA al 8,5%, dextrano 40 al 4,6%

DMSO al 10%, HSA al 9,5%, dextrano 40 al 5,2%

DMSO al 5%, HSA al 10%, dextrano 40 al 5,5% (VF HSA = 0,4) (formulacion de control) DMSO al 0%, HSA al 10,5%, dextrano 40 al 5,8%

DMSO al 5%, HSA al 0%, dextrano 40 al 9,5% (VF HSA = 0)

DMSO al 5%, HSA al 3,125%, dextrano 40 al 8,25% (VF HSA = 0,125)

DMSO al 5%, HSA al 16,88%, dextrano 40 al 2,75% (VF HSA = 0,675)

DMSO al 5%, HSA al 23,75%, dextrano 40 al 0% (VF HSA = 0,95)

Las formulaciones se prepararon a partir de las siguientes soluciones de partida: DMSO al 100% (Bioniche Pharma, Belleville, Ontario), hSa al 25% (Octapharma, Hoboken, Nueva Jersey) y dextrano 40 al 10% en solucion salina al 0,9% (Hospira, Lake Forest, Illinois).

30 Analisis de retencion en filtro: se evaluo la agregacion celular mediante el uso del analisis de retencion en filtro. La concentracion celular se ajusto a aproximadamente 1,2 x 107 celulas/ml antes de la filtracion. La carga del filtro (numero de celulas por unidad de area de filtro) se mantuvo constante a aproximadamente 2,4 x 108 celulas/filtro. Las celulas fueron crioconservadas en un congelador de velocidad controlada Thermo a -70°C a una concentracion de 7,5 x 106 celulas/ml. Las celulas se descongelaron antes de su uso, y las muestras se procesaron en breve

35 despues de la descongelacion. Se tomo una muestra de 100 pl de la suspension de celulas sin diluir tras la descongelacion, se diluyo con 900 pl de solucion salina tamponada con fosfato (PBS), y los recuentos de celulas se realizaron por duplicado utilizando un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) y se refirieron como el numero de pfxeles por millon de celulas (los numeros mas altos de pfxeles indican un mayor numero de agregados celulares).

40 Analisis de viabilidad celular (analisis MTS): La viabilidad celular se determino utilizando un Analisis de Proliferacion Celular No Radiactivo CellTiter96® (Promega, Madison, Wisconsin). Las celulas en placas de 96 pocillos se combinaron con (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) (MTS) y metosulfato de fenazina (PMS), un reactivo de acoplamiento de electrones, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuacion se determino la absorbancia a 490 nm del producto de formazano resultante, producido por 45 biorreduccion celular de MTS.

Analisis en placa de pocillos con Anexina: Las celulas descongeladas se diluyeron a una concentracion de 1 x 105 celulas/ml en una solucion de Marcaje de Anexina-V (Roche, Num. Cat. 11 828 681 001.). Se anadieron 100 pl de la suspension celular a una placa de 96 pocillos por triplicado y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente sin exposicion a la luz. Despues de 15 minutos, se tomaron imagenes de campo claro y bajo luz 50 fluorescente (longitud de onda de excitacion 488 nm y longitud de onda de deteccion 528 nm) de tres posiciones diferentes dentro de cada pocillo. Se utilizo un soporte logico de recuento de celulas automatizado (Axiovision) para contar las celulas totales por imagen. Las poblaciones de celulas apoptoticas/necroticas se determinaron mediante recuento de celulas positivas para Anexina en cada posicion (imagen fluorescente) y dividiendo por el total de celulas en cada posicion (imagen de campo claro). Las poblaciones de celulas apoptoticas/necroticas por condicion

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se determinaron promediando las poblaciones computadas en tres posiciones de los pocillos diferentes, de 3 pocillos.

Resultados

Agregacion celular

A traves de los porcentajes variables de DMSO, p. ej., de 0 a 20 por ciento (formulaciones 1-4), no se observo efecto sobre la agregacion celular, tal como se muestra en la FIG. 2. Todas las condiciones de DMSO mostraron niveles de agregacion dentro del intervalo observado para la formulacion de control que comprende DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5% y HSA al 10%. Las concentraciones de HSA y Dextrano tambien se variaron a una concentracion constante de DMSO al 5% (FIG. 3), con condiciones que variaban entre ausencia de HSA (fraccion en volumen de HSA = 0) y ausencia de dextrano (fraccion en volumen de HSA = 0,95). Los valores de FRA a traves de las fracciones en volumen de 0,125 a 0,95 de HSA al 25% (concentracion final de HSA de 3,125% a 23,75%, respectivamente) indican una agregacion minima. Los niveles observados de agregacion en presencia de HSA eran iguales o inferiores a los de la formulacion de control que comprende DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5% y HSA al 10%.

Viabilidad tras la descongelacion y recuperacion

Se midieron la viabilidad despues de la descongelacion (FIG. 4) y la recuperacion despues de la descongelacion (FIG. 5) a traves de diferentes porcentajes de DMSO (0, 5, 10 y 20%) por medio de exclusion de azul de tripan, utilizando el contador de celulas automatizado Vi-Cell, para evaluar las capacidades crioprotectoras de cada formulacion. La viabilidad despues de la descongelacion fue mayor de 90% con las formulaciones que comprendfan DMSO al 0%, 5% y 10%, respectivamente, observandose un valor maximo con DMSO al 5%, mientras que la viabilidad estaba por debajo de 75% con una formulacion que comprendfa DMSO al 20%. El restablecimiento del cultivo se midio mediante el analisis MTS. Se observo que el restablecimiento del cultivo era maximo con DMSO al 5% (FIG. 6).

El perfil de viabilidad a traves de las diferentes fracciones en volumen de HSA al 25%, es decir, diferentes razones de dextrano:HSA, se muestra en las FIGS. 7-9. La viabilidad despues de la descongelacion, determinada por exclusion de azul de tripan, mostro valores que oscilaban entre 83,5% y 98,5% a traves de las diferentes fracciones en volumen de HSA (FIG. 7). Se alcanzo un valor maximo a una fraccion de 0,40 de HSA al 25%, es decir, HSA al 10%:Dextrano 40 al 5,5%. La recuperacion de celulas despues de la descongelacion tambien se calculo, y los valores variaban de 80% a 120%, aunque las muestras que comprendfan al menos una fraccion en volumen de 0,2 de HSA al 25% mostraban valores que oscilaban de 100% a 120% (FIG. 8). Los datos de restablecimiento del cultivo, tal como se determina mediante el analisis MTS, exhiben un perfil similar al de la viabilidad despues de la descongelacion, apareciendo un valor maximo en una fraccion de 0,125 de BSA al 25%, es decir, HSA al 3,13%:Dextrano 40 al 8,25% (FIG. 9).

La viabilidad con tripan no tiene la capacidad de detectar las celulas apoptoticas. Sin embargo el analisis de las distribuciones de tamano de las celulas puede indicar cambios en la salud de las celulas. Para estimar el porcentaje de celulas apoptoticas en las poblaciones de celulas descongeladas a partir de celulas congeladas en ausencia de DMSO, se llevo a cabo un analisis de anexina en placas con pocillos tras la descongelacion. El analisis estima que 51% de las celulas congeladas en DMSO al 0% eran apoptoticas en comparacion con 15% de apoptoticas cuando se congelaron en DMSO al 5% (datos no mostrados).

Fenotipo y funcionalidad

La capacidad de mantener el fenotipo CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ de las celulas se sometio a ensayo a traves de los diferentes porcentajes de los componentes por medio de citometna de flujo. Las celulas formuladas en la formulacion 2 (dMsO al 10%, HSA al 9,5%, dextrano 40 al 5,2%), la formulacion 5 (DMSO al 5%, HSA al 0%, dextrano 40 al 9,5%), la formulacion 6 (DMSO al 5%, HSA al 3,13%, dextrano 40 al 8,25%) y la formulacion 7 (DMSO al 5%, HSA al 16,88%, dextrano 40 al 2,75%) mantuvieron este fenotipo aproximadamente, asf como la formulacion 3 de control, y tuvieron valores de CD105+/CD200+ entre 80,3% y 84,5%. Ademas, la expresion de CD10+/CD34- fue> 95% para cada formulacion. Las condiciones 1, 4 y 8 indican un cambio en las caractensticas ffsicas de las celulas, posiblemente debido a que los restos afectaron al analisis de citometna de flujo.

La funcionalidad celular se evaluo a traves del analisis de Reaccion de celulas T con Esferas (BTR), que mide la capacidad de las celulas para suprimir una respuesta de las celulas T a esferas antigenicas (FIG. 10). La formulacion 6 (DMSO al 5%, HSA al 3,13%, dextrano 40 al 8,25%), y la formulacion 7 (DMSO al 5%, HSA al 16,88%, dextrano 40 al 2,75%) presentaron una supresion dentro de una desviacion tfpica de 1 de una formulacion de control 3 que comprendfa DMSO al 5%/HSA al 10% y dextrano 40 al 5,5%. Estas tres muestras presentaron las mayores viabilidades con azul de tripan y los valores de restablecimiento del cultivo. Las otras muestras tuvieron niveles mas bajos de supresion, con una reduccion que generalmente se correlacionaba con una disminucion de MTS.

Conclusiones:

Las formulaciones que comprenden concentraciones de DMSO del 0 al 20% muestran niveles de agregacion celular

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comparables a los observados para la formulacion de control que comprende DMSO al 5%, HSA al 10% y dextrano 40 al 5,5%. Sin embargo, la viabilidad celular se redujo cuando las celulas se crioconservaron en la formulacion que comprende DMSO al 20%, y las celulas congeladas en DMSO al 0% mostraron una apoptosis significativamente mejorada despues de la descongelacion en relacion con las celulas congeladas en DMSO al 5%. No hubo una degradacion apreciable del fenotipo CD10+, CD34", CD105+, CD200+ para formulaciones que comprend^an DMSO al 5% y al 10%. Por lo tanto, los resultados anteriores demuestran que se prefiere el uso de formulaciones que comprenden DMSO al 5-10% para mantener la viabilidad despues de la descongelacion.

Con respecto a la variacion de la razon de HSA: dextrano, las formulaciones que comprenden HSA al 23,75%, dextrano al 0% mostraron cierta reduccion en la viabilidad despues de la descongelacion y el restablecimiento del cultivo, mientras que los valores viabilidad, actividad inmunosupresora y el restablecimiento despues de la descongelacion fueron mas altos para formulaciones que comprendfan razones de dextrano:HSA de: (i) HSA al 3,13% con respecto a dextrano al 8,25%; (ii) HSA al 10% con respecto a dextrano al 5,5%; y (iii) HSA al 16,88% con respecto a dextrano al 2,75%. Por lo tanto, estos resultados demuestran que la razon de HSA:dextrano de las formulaciones descritas en la presente memoria puede variar dentro de un intervalo definido sin una perdida apreciable de viabilidad celular, recuperacion de celulas despues de la descongelacion, degradacion del fenotipo CD10+, CD34", CD105+, CD200+ o actividad inmunosupresora, con relacion a las formulaciones que comprenden una razon de HSA:dextrano de HSA al 10% y dextrano 40 al 5,5%. Los datos presentados en la presente memoria apoyan un intervalo de trabajo de razones de HSA:dextrano entre al menos aproximadamente 6:1 de HSA:dextrano y aproximadamente 1:2,6 de HSA:dextrano.

6.3.2 Efecto de la densidad de celulas de congelacion

Este ejemplo describe los efectos de la concentracion de celulas, p. ej., densidades celulares de congelacion que oscilan entre 1-40 x 106 celulas/ml, sobre la viabilidad celular; el fenotipo CD10+, CD34", CD105+, CD200+; la agregacion celular; y la funcionalidad inmunosupresora de las celulas.

Metodos y Materiales

Se cultivaron celulas madre de la placenta CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ durante 3 dfas, se recogieron, se centrifugaron, y se resuspendieron en una formulacion que comprendfa DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10% a una concentracion de aproximadamente 3,5 x 107 celulas/ml, y se filtraron a traves de un filtro de 70 pm. Despues de la filtracion las celulas se diluyeron en serie en la formulacion anterior para crear muestras de celulas que comprendieran, en bolsas esteriles, las siguientes densidades de celulas: 1 x 106 celulas/ml, 7,5 x 106 celulas/ml, 15 x 106 celulas/ml y 20 x 106 celulas/ml. Las celulas se recogieron por separado para crear una muestra de celulas separada que comprendiera 4,0 x 107 celulas/ml. Las celulas de la muestra de 4,0 x 107 celulas/ml se resuspendieron en 5 ml de formulacion que comprendfa DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10% a una concentracion de aproximadamente 4,6 x 107 celulas/ml, se filtraron a traves de un filtro de 70 pm, y se diluyeron a 4,0 x 107 celulas/ml en una bolsa de 20 ml utilizando la formulacion anterior. Se congelaron una bolsa de 20 ml de la muestra de 4,0 x 107 celulas/ml, bolsas de 20 ml duplicadas de las muestras de 1 x 106 celulas/ml, 7,5 x 106 celulas/ml, 15 x 106 celulas/ml, y 20 x 106 celulas/ml, y cinco viales de 280 pl de cada muestra a -70°C utilizando un congelador de velocidad controlada. Estas muestras se descongelaron posteriormente y se analizaron para determinar los efectos de la concentracion de congelacion sobre varias caractensticas celulares, incluyendo (1) el recuento de celulas; (2) la viabilidad; (3) el fenotipo; (4) la agregacion de celulas; y (5) la potencia.

Analisis de retendon en filtro: Se evaluo la agregacion celular mediante el uso del analisis de retencion en filtro. La concentracion celular se ajusto a aproximadamente 1,2 x 107 celulas/ml antes de la filtracion. La carga del filtro (numero de celulas por unidad de area de filtro) se mantuvo constante a aproximadamente 2,4 x 108 celulas/filtro. Las celulas fueron crioconservadas en un congelador de velocidad controlada Thermo a -70°C a una concentracion de 7,5 x 106 celulas/ml. Las celulas se descongelaron antes de su uso, y las muestras se procesaron en breve despues de la descongelacion. Se tomo una muestra de 100 pl de la suspension de celulas sin diluir tras la descongelacion, se diluyo con 900 pl de solucion salina tamponada con fosfato (PBS), y los recuentos de celulas se realizaron por duplicado utilizando un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) y se refirieron como numero de pfxeles por millon de celulas (los numeros mas altos de pfxeles indican un mayor numero de agregados celulares).

Resultados:

Recuento/viabilidad de celulas

Se tomaron dos muestras de 1 ml de cada una de las bolsas descongeladas para los recuentos de celulas viables y la determinacion de la viabilidad utilizando un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La viabilidad promedio permanecio constante para todas las condiciones, a aproximadamente 97%. El recuento de celulas viables correspondio a la concentracion inicial de congelacion (vease la Tabla 9 a continuacion).

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Tabla 9: Concentracion de celulas viables Vi-Cell y viabilidad Concentracion de congelacion Recuento de celulas (x 106) celulas/ml Viabilidad (%)

: 1 x 106/ml 1,20 98,70

: 7,5 x 106/ml 8,32 97,12

: 15 x 106/ml 16,47 97,33

: 20 x 106/ml 20,80 97,61

: 40 x 106/ml 39,92 96,71

Fenotipo

Se sometio a ensayo la capacidad de mantener el fenotipo CD10+, CD34", CD105+, CD200+ de las celulas a traves de las diferentes densidades de celulas por citometna de flujo. Tal como se presenta en la Tabla 10, el fenotipo no cambia entre las diferentes concentraciones de congelacion. La expresion de CD200+/CD105+ se mantuvo a aproximadamente 86% y la expresion de CD347CD10+ se mantuvo a aproximadamente 99% para todas las condiciones.

: Tabla 10: Expresion de CD200+/CD105+ y CD347CD10+

: Concentracion de congelacion CD200+/CD105+ CD347CD10+

: 1 x 106/ml 87,3 98,2

: 7,5 x 106/ml 86,7 99,1

: 15 x 106/ml 85,8 99,1

: 20 x 106/ml 85,5 98,9

: 40 x 106/ml 86,3 98,5

: Control negativo 69,4 98,5

: Control positivo 91,1 98,8

Agregacion celular

Se analizaron replicas de cada condicion mediante un analisis de retencion en filtro para determinar el grado de agregacion celular a diferentes concentraciones de congelacion (FIG. 11). Los duplicados del analisis se realizaron para las muestras de 1 x 106 celulas/ml, 7,5 x 106 celulas/ml, 15 x 106 celulas/ml y 20 x 106 celulas/ml. Una muestra de celulas se analizo por duplicado para la muestra de 40 x 106 celulas/ml. La muestra de 40 x 106 celulas/ml produjo la senal de agregacion celular mas alta de todas las densidades celulares sometidas a ensayo. Todas las otras muestras estaban en o por debajo de la cantidad de agregacion observada con una muestra de control previamente crioconservada a 7,5 x 106 celulas/ml en DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10%.

Se realizo un analisis de agregacion celular separado adicional, para someter a ensayo las celulas crioconservadas en la formulacion que comprende DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10% en 7,5 x 106/ml y 20 x 106/ml (FIG. 12). Los datos adicionales mostraron un aumento de la senal a 20 x 106/ml, indicando que las celulas congeladas a 20 x 106/ml proporcionan resultados de agregacion celular variables. Como resultado, las celulas congeladas a esta concentracion o superior tienen un mayor potencial de agregacion. Estos datos demuestran que la agregacion aumenta al aumentar la concentracion de celulas, y una densidad de celulas de congelacion de 20 x 106 ml puede mostrar aumentos en la agregacion celular con respecto a una densidad celular de congelacion de 7,5 x 106/ml.

Funcionalidad

Se utilizo un vial de cada condicion para la reaccion de leucocitos mixtos (MLR) y el analisis de la reaccion de las celulas T con esferas (BTR) para evaluar las propiedades inmunomoduladoras de las celulas a diferentes

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densidades de celulas de congelacion, segun se mide por la supresion de la proliferacion de celulas T CD4+ y celulas T CD8+. Los resultados de MLR indican una cafda en la supresion de CD4 y CD8 a 15 x 106 celulas/ml y 40 x 106 celulas/ml, a pesar de que la supresion a 20 x 106 celulas/ml fue comparable a la observada a 1 x 106 celulas/ml y 7,5 x 106 celulas/ml. Sin embargo, los resultados de BTR muestran una reduccion en la supresion de CD4 y CD8 a 20 x 106 celulas/ml y 40 x 106 celulas/ml.

Tabla 11: Resultados de MLR y BTR - porcentaje de reactividad de las celulas T en comparacion con la reactividad de las celulas T en ausencia de celulas madre de la placenta.

MLR BTR

Muestra Supresion de CD4 Supresion de CD8 Supresion de CD4 Supresion de CD8

1 x 106/ml: 63 64 63 62

7,5 x 106/ml: 63 64 63 62

15 x 106/ml: 49 46 61 64

20 x 106/ml: 65 65 36 39

40 x 106/ml: 40 45 33 38

Conclusiones:

Los resultados anteriores demuestran que la viabilidad celular y el fenotipo CD10+, CD34", CD105+, CD200+ no cambian como funcion de la densidad celular de congelacion. Sin embargo, las celulas crioconservadas a una densidad de 20 x 106 celulas/ml demostraron un aumento variable en la agregacion celular y una disminucion variable en la actividad inmunosupresora, mientras que las celulas crioconservadas a una densidad de 40 x 106 celulas/ml mostraron un aumento constante de la agregacion celular y una disminucion constante de la actividad inmunosupresora. Como tal, mientras que las celulas se pueden formular en las formulaciones descritas en la presente memoria a una densidad de hasta, p. ej., 40 x 106 celulas/ml sin una disminucion apreciable en la viabilidad celular o en el numero de celulas que muestran un fenotipo CD10+, CD34", CD105+, CD200+, una densidad celular de congelacion en el intervalo de 1,0-15 x 106 celulas/ml es preferible para reducir al mmimo la agregacion celular despues de la descongelacion.

6.3.3 Efecto del peso molecular del dextrano

Este ejemplo describe el efecto de diferentes pesos moleculares de dextrano, por ejemplo, dextrano 1 (PM = 1000), dextrano 40 (PM = 40.000) y dextrano 70 (PM = 70.000) sobre la agregacion celular, la viabilidad, la recuperacion, el fenotipo CD10+, CD34-, cD105+, CD200+ y la funcionalidad.

Materiales y metodos

Se expandieron doce millones de celulas pluripotentes de la placenta CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ crioconservadas en fabricas de celulas de 10 bandejas de Nunc™, una para cada una de las formulaciones siguientes, a aproximadamente 1,2 x 108 celulas. Las celulas se recogieron por incubacion durante 10 min. a temperatura ambiente con Tripsina/EDTA al 0,25%. Las celulas disociadas se transfirieron a un tubo de centnfuga de 500 ml que contema 250 ml de suero bovino fetal al 2% (FBS) en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM). Las celulas se centrifugaron a 1040 RPM en tubos de 500 ml en una centnfuga Sorvall RC3BP. Las celulas se resuspendieron en una solucion salina al 0,9%/dextrano 40 al 5%. Las celulas se centrifugaron despues a 1420 rpm durante 10 min, y se suspendieron en 10 ml de las siguientes formulaciones:

Formulacion 1: DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5% (Hospira, Lake Forest, Illinois), HSA al 10% (control)

Formulacion 2: DMSO al 5%, dextrano 1 al 5,5% 1 (Pharmacosmos), HSA al 10%

Formulacion 3: DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5% (Pharmacosmos), HSA al 10%

Formulacion 4: DMSO al 5%, dextrano 70 al 5,5% (Pharmacosmos), HSA al 10%

Analisis de retencion en filtro: Se evaluo la agregacion celular mediante el uso del analisis de retencion en filtro. La concentracion celular se ajusto a aproximadamente 1,2 x 107 celulas/ml antes de la filtracion. La carga del filtro (numero de celulas por unidad de area de filtro) se mantuvo constante a aproximadamente 2,4 x 108 celulas/filtro.

Las celulas fueron crioconservadas a una concentracion de 7,5 x 106 celulas/ml en un congelador de velocidad

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controlada Thermo a -70°C. Las celulas se descongelaron antes de su uso, y las muestras se procesaron en breve despues de la descongelacion. Se tomo una muestra de 100 pl de la suspension de celulas sin diluir tras la descongelacion, se diluyo con 900 pl de solucion salina tamponada con fosfato (PBS), y se llevaron a cabo los recuentos de celulas por duplicado utilizando un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California).

Resultados:

Agregacion celular

Se evaluo la agregacion celular dentro de cada formulacion mediante el Analisis de retencion en filtro. La formulacion 2 (dextrano 1), la formulacion 3 (dextrano 40) y la formulacion 4 (dextrano 70) demostraron tasas de agregacion de celulas equivalentes a, o por debajo de, la formulacion de control de DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, y HSA al 10% (FIG. 13).

Viabilidad y recuperacion

La viabilidad despues de la descongelacion para las muestras que comprendfan dextrano 1, dextrano 40 o dextrano 70 vario de 96,0% a 97,7% de viables (FIG. 14). Del mismo modo, la recuperacion despues de la descongelacion fue comparable a la de la formulacion de control, con viabilidades de celulas que oscilaban entre 92% y 109% de la formulacion de control (FIG. 15).

Fenotipo y funcionalidad

Se sometio a ensayo la capacidad de mantener el fenotipo CD10+, CD34", CD105+, CD200+ de las celulas a traves de los diferentes pesos moleculares de dextrano por citometna de flujo, y se sometio a ensayo la capacidad inmunosupresora de las celulas en un analisis bTr. La expresion de CD200+/CD105+ a traves de todas las formulaciones sometidas a ensayo oscilo de 89,1% a 91,6%, y la expresion de CD347CD10+ fue > 95% para todas las condiciones (FIG. 16). Ademas, la supresion de las celulas T CD4+ y CD8+ a traves de los diferentes pesos moleculares de dextrano cayo dentro de una desviacion tfpica de 1 de un valor esperado derivado de 4 diferentes replicas experimentales de una formulacion de control convencional que comprendfa dextrano 40 (FIG. 17).

Conclusiones:

Estos resultados demuestran que el dextrano 1 o el dextrano 70 pueden ser sustituidos por dextrano 40 en las formulaciones descritas en la presente memoria, sin afectar a la agregacion celular, la viabilidad, la recuperacion, el fenotipo o la capacidad inmunosupresora.

6.3.4 Efecto de diferentes polisacaridos

El Ejemplo describe el efecto de los polisacaridos distintos de dextrano 40 en la formulacion de celulas sobre la viabilidad y la proliferacion celulares.

Materiales y metodos

Se expandieron doce millones de celulas pluripotentes de la placenta CD10+, CD34", CD105+, CD200+ crioconservadas en fabricas celulares de 10 bandejas de Nunc™, una para cada una de las formulaciones siguientes, a aproximadamente 1,2 x 108 celulas. Se recogieron las celulas por incubacion durante 10 min. a temperatura ambiente con tripsina/EDTA al 0,25%. Las celulas disociadas se transfirieron a un tubo de centnfuga de 500 ml que contema 250 ml de suero bovino fetal (FBS) al 2% en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM). Las celulas se centrifugaron a 1040 RPM en tubos de 500 ml en una centnfuga Sorvall RC3BP. Las celulas se resuspendieron en solucion salina al 0,9%/dextrano 40 al 5%. Las celulas se centrifugaron a 1420 RPM durante 10 min, y se suspendieron en 10 ml de las siguientes formulaciones:

Formulacion 1: DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10% (Control)

Formulacion 2: DMSO al 5%, maltodextrina al 5,5%, HSA al 10%

Formulacion 3: DMSO al 5%, sacarosa al 5,5%, HSA al 10%

Formulacion 4: DMSO al 5%, trehalosa al 5,5%, HSA al 10%

Formulacion 5: DMSO al 5%, 55USP/ml de heparina, HSA al 10%

Formulacion 6: DMSO al 5%, hetalmidon al 3,3%, HSA al 10%

Formulacion 7: DMSO al 5%, glucogeno al 5,5%, HSA al 10%

Analisis de retencion en filtro: Se evaluo la agregacion celular mediante el uso de un analisis retencion en filtro. La concentracion celular se ajusto a aproximadamente 1,2 x 107 celulas/ml antes de la filtracion. La carga del filtro

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35

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50

(numero de celulas por unidad de area de filtro) se mantuvo constante a aproximadamente 2,4 x 108 celulas/filtro. Las celulas fueron crioconservadas en congelador de velocidad controlada Thermo a -70°C. Las celulas se descongelaron antes de su uso, y las muestras se procesaron en breve despues de la descongelacion. Se tomo una muestra de 100 pl de la suspension de celulas sin diluir tras la descongelacion, se diluyo con 900 pl de solucion salina tamponada con fosfato (PBS), y se realizaron los recuentos de celulas por duplicado utilizando un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California).

Resultados:

Agregacion celular

Se evaluo la agregacion celular dentro de cada formulacion mediante el analisis de retencion en filtro. Se determino que las formulaciones 2-7 produdan una agregacion de celulas equivalente a, o por debajo de, formulacion de control con DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, y HSA al 10% (FlG. 18.). La formulacion 4, que comprendfa trehalosa, la formulacion 5, que comprendfa heparina, y la formulacion 7, que comprendfa glucogeno, demostraron tasas de agregacion de celulas sustancialmente por debajo de la formulacion de control.

Viabilidad y recuperacion tras la descongelacion

Se evaluaron la viabilidad despues de la descongelacion, la recuperacion de celulas viables y los datos de tamano de las celulas a traves de cada una de las formulaciones 1-7 para evaluar las capacidades crioprotectoras de las formulaciones. La viabilidad posterior a la descongelacion se evaluo mediante un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell por exclusion de azul de tripan (Beckman Coulter, Fullerton, California). La viabilidad despues de la congelacion oscilo entre 95,2% y 98,6%, con la sacarosa y el glucogeno en el extremo inferior del intervalo (FIG. 19). La formulacion de dextrano de control dio como resultado una viabilidad celular de 98%. La recuperacion de celulas viables despues de la descongelacion se calculo para descifrar las perdidas de celulas en todo el proceso de congelacion/descongelacion, los valores oscilaron entre 84% y 115% a traves de los diferentes polisacaridos (FIG. 20).

Fenotipo y funcionalidad

La capacidad de mantener el fenotipo CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ de las celulas se sometio a ensayo en los diferentes polisacaridos por citometna de flujo. Las celulas formuladas en las formulaciones 2-4 y 6 mantuvieron este fenotipo aproximadamente tan bien como la formulacion 1 de control, y entre 89,4% y 92,9% fueron CD105+/CD200+. La expresion de CD10+/CD34- fue > 95% para cada formulacion. De las celulas congeladas en heparina, 85,4% mantuvieron fenotipo CD105+/CD200+ (FIG. 21).

La funcionalidad celular se evaluo mediante el analisis de Reaccion de celulas T con Esferas (BTR), que mide la capacidad de las celulas para suprimir una respuesta de las celulas T a esferas antigenicas. Las celulas formuladas en sacarosa mostraron una disminucion de la supresion de celulas T en comparacion con la de una desviacion tfpica de 1 de un valor esperado derivado de 4 diferentes replicas experimentales de una formulacion de control convencional que comprendfa dextrano 40 (FIG. 22). A traves de los otros polisacaridos, la supresion n de celulas T CD4 y CD8 cayo dentro de una desviacion tfpica de 1 del valor esperado.

Conclusiones:

Con respecto a la agregacion celular, la viabilidad despues de la descongelacion, la recuperacion de celulas despues de la descongelacion y el mantenimiento del fenotipo, el uso de formulaciones que comprenden maltodextrano, trehalosa y hetalmidon dio como resultado poblaciones de celulas de la placenta que teman aproximadamente las mismas caractensticas que el uso de la formulacion con dextrano 40. Como tal, si bien las formulaciones que comprenden sacarosa, heparina o glucogeno se pueden utilizar para formular celulas madre de la placenta CD10+, CD34-, CD105+, CD200+, se prefiere el uso de formulaciones que comprenden dextrano 40, maltodextrano, trehalosa o hetalmidon.

6.3.5 Efecto de la proteina alternativa a HSA

Este Ejemplo demuestra que en una formulacion con dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10% y DMSO al 5%, la concentracion de albumina de suero humano se puede reducir, y que la HSA puede estar sustituida por albumina de suero bovino o suero bovino fetal.

La formulacion 1 (F1) esta compuesta por dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10% y DMSO al 5%. Con el fin de comprender el papel de HSA en F1 y conocer su impacto sobre las composiciones de celulas, se sometieron a ensayo formulaciones alternativas con protemas del mismo tipo similares a la albumina de suero humano, es decir, albumina de suero bovino (BSA) y suero bovino fetal (FBS).

Materiales y metodos

Se expandieron doce millones de celulas pluripotentes de la placenta CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ crioconservadas en fabricas celulares de 10 bandejas de Nunc™, una para cada una de las formulaciones

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siguientes, a aproximadamente 1,2 x 108 celulas. Se recogieron las celulas por incubacion durante 10 minutos a temperatura ambiente con tripsina/EDTA al 0,25%. Las celulas disociadas se transfirieron a un tubo de centnfuga de 500 ml que contema 250 ml de suero bovino fetal al 2% (FBS) en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM). Las celulas se centrifugaron a continuacion a 1040 RPM en tubos de 500 ml en una centnfuga Sorvall RC3BP. Las celulas se resuspendieron en solucion salina al 0,9%/solucion de dextrano 40 al 5%. Las celulas se centrifugaron a 1420 RPM durante 10 min, y se suspendieron en 10 ml de las siguientes formulaciones:

Formulacion 1: DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10% (control)

Formulacion 2: DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, HSA al 4%

Formulacion 3: DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, BSA al 10%

Formulacion 4: DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, FBS al 10%

Analisis de retendon en filtro; Se evaluo la agregacion celular mediante el uso del analisis retencion en filtro. La concentracion celular se ajusto a aproximadamente 1,2 x 107 celulas/ml antes de la filtracion. La carga del filtro (numero de celulas por unidad de area de filtro) se mantuvo constante a aproximadamente 2,4 x 108 millones de celulas/filtro. Las celulas se crioconservaron en un congelador de velocidad controlada Thermo a -70°C. Las celulas se descongelaron antes de su uso, y las muestras se procesaron en breve despues de la descongelacion. Se tomo una muestra de 100 pl de la suspension de celulas sin diluirtras la descongelacion, se diluyo con 900 pl de solucion salina tamponada con fosfato (PBS), y se realizaron por duplicado los recuentos de celulas utilizando un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California).

Resultados;

Agregacion celular

La agregacion celular, medida mediante Analisis de Retencion en Filtro (FRA), era igual o menor de 100 pfxeles por milfmetro cuadrado para todas las condiciones (FIG. 23). Sin embargo, la HSA al 10% y la BSA al 10% paredan producir claramente menos agregados que la HSA al 4% y el FBS al 10%.

Con el fin de comprender la capacidad crioprotectora de cada solucion, se evaluaron la viabilidad tras la descongelacion, la recuperacion y el tamano de las celulas mediante el uso de la exclusion de azul de tripan en un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California). La viabilidad despues de la descongelacion a traves de cada condicion estaba dentro de la variabilidad del analisis y variaba de 95% a 98% de viables (FIG. 24). Del mismo modo, la recuperacion de celulas despues de la descongelacion era comparable a la del control de hSa al 10%, con valores que oscilaban de 100 a 127% (FIG. 25).

Fenotipo y funcionalidad

Se sometio a ensayo la capacidad de mantener el fenotipo CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ de las celulas a traves de las diferentes formulaciones por citometna de flujo. (FIG. 26 y 27). Las celulas formuladas en las formulaciones 24 mantuvieron este fenotipo aproximadamente tan bien como la formulacion de control con HSA al 10%, con valores que oscilaban de 88,2% a 93,5% de las celulas sometidas a ensayo. La expresion de CD10+/CD34" fue > 95% para cada formulacion.

La funcionalidad celular se midio a traves del analisis de Reaccion de las celulas T con Esferas. En comparacion con las demas condiciones la supresion de las celulas T CD4 y CD8 fue elevada cuando las celulas se formularon en FBS con valores que cafan dentro de desviaciones tfpicas de 1,5 del valor esperado derivado de 4 diferentes replicas experimentales de una formulacion de control convencional que comprendfa HSA al 10% (FIG. 28). En todas las demas condiciones la supresion estaba dentro de una desviacion tfpica de 1 del valor esperado.

Conclusiones:

Los resultados anteriores demuestran que HSA al 4%, BSA al 10%, o FBS al 10% pueden ser sustituidos por HSA al 10% sin perdida apreciable de la viabilidad celular, la recuperacion de celulas despues de la descongelacion, la degradacion del fenotipo CD10+, CD34", CD105+, CD200+, o la actividad inmunosupresora. Por lo tanto, un intervalo de HSA, BSA y FBS al menos entre aproximadamente 4% y aproximadamente 10%, es particularmente adecuado para las formulaciones descritas en la presente memoria.

6.3.6 Compatibilidad con diferentes tipos de celulas

El Ejemplo demuestra que las celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea y las celulas asesinas naturales se pueden formular de la misma manera que las celulas pluripotentes de la placenta. Por lo tanto, este Ejemplo muestra que otras celulas, ademas de las celulas pluripotentes de la placenta, se pueden formular de la manera presentada en la presente memoria.

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Metodos y materiales:

Las celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea (BMMSC) y las celulas asesinas naturales (NK) se expandieron y se recogieron utilizando las siguientes formulaciones:

F1:

Cultivo de celulas durante 3 dfas, seguido de la recogida y la resuspension de las celulas en DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10%, filtracion de celulas a traves de un filtro de 70 pm, y crioconservacion de las celulas a aproximadamente 7,5 x 106 celulas/ml; y

F2:

Cultivo de celulas durante cuatro dfas, seguido de la recogida y la resuspension de las celulas en Plasmalyte A que comprende DMSO al 5% y HSA al 10%.

Las celulas se congelaron a -70°C utilizando un congelador de velocidad controlada. Las BMMSC fueron crioconservadas en bolsas de 20 ml en la formulacion F2 y bolsas de 10 ml en la formulacion F1; y las celulas NK CD3", CD56+ fueron crioconservadas en bolsas de 10 ml en la formulacion F2 y en viales de 1,5 ml en la formulacion F1. Estas muestras se descongelaron posteriormente y se analizaron para determinar los efectos de la congelacion de la formulacion sobre las caractensticas celulares.

Analisis de Retencion en Filtro: Se evaluo la agregacion celular mediante el uso del analisis de retencion en filtro. La concentracion celular se ajusto a aproximadamente 1,2 x 107 celulas/ml antes de la filtracion. La carga del filtro (numero de celulas por unidad de area de filtro) se mantuvo constante a aproximadamente 2,4 x 108 millones de celulas/filtro. Las celulas fueron crioconservados en un congelador de velocidad controlada Thermo a -70°C. Las celulas se descongelaron antes de su uso, y las muestras se procesaron en breve despues de la descongelacion. Se tomo una muestra de 100 pl de la suspension de celulas sin diluir tras la descongelacion, se diluyo con 900 pl de solucion salina tamponada con fosfato (PBS), y los recuentos de celulas se realizaron por duplicado utilizando un analizadorde la viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter, Fullerton, California).

Resultados

Viabilidad

Se utilizaron muestras despues de la descongelacion para determinar la viabilidad de las celulas congeladas en condiciones diferentes. La viabilidad de las BMMSC y las celulas NK no se vio afectada significativamente por las condiciones de congelacion.

Fenotipo

Los marcadores NK se analizaron para determinar los efectos de las formulaciones F1 y F2 sobre el fenotipo de NK (CD3", CD56+). Las dos formulaciones utilizadas no afectaron significativamente al porcentaje de celulas NK que mostraban el fenotipo NK. Las BMMSC tambien se analizaron para determinar la expresion de CD10, CD34, CD44, CD45, CD90, CD98, CD105, CD117, CD166, CD200, pan-citoqueratina, y KDR. La expresion, o la falta de expresion, de estos marcadores no variaron significativamente en las BMMSC formuladas en las formulaciones F1 o F2.

Agregacion celular

En el Analisis de Retencion en Filtro, se realizaron dos replicas de cada una de las formulaciones de BMMSC, y una replica del analisis de las formulaciones de NK. La formulacion F1 produjo significativamente menos agregados que la formulacion F2 tanto para las BMMSC como para las celulas NK; el efecto de la formulacion F2, sin embargo, fue mas pronunciado para las BMMSC que para las celulas NK (FIG. 29).

Conclusiones:

Los resultados anteriores demuestran que las celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea y las celulas asesinas naturales se pueden formular satisfactoriamente en DMSO al 5%, dextrano 40 al 5,5%, HSA al 10%, con una agregacion celular, una viabilidad y una retencion del fenotipo similares a los de las celulas pluripotentes de la placenta CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ en la misma formulacion. Ademas, para las celulas pluripotentes de la placenta, las formulaciones de BMMSC y celulas NK que contienen Plasmalyte muestran tasas de agregacion celular significativamente mayores; como tales, se prefieren las formulaciones que contienen dextrano.

Claims

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1. Un metodo de elaboracion de una composicion que comprende celulas de mai^ero, que comprende:

(a) poner en contacto dichas celulas con una solucion que comprende (1) dextrano, maltodextrano, trehalosa o hetalmidon; y (2) albumina de suero humano (HSA) para formar una solucion que contiene celulas;

(b) filtrar la solucion que contiene celulas a traves de un filtro de 70 micrometros a 100 micrometros; y

(c) si dicha solucion que contiene celulas comprende mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro, diluir dichas celulas a no mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro con una primera solucion de dilucion que comprende dextrano.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dichas celulas son crioconservadas tras la etapa (c).
3. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha solucion en la etapa (a) comprende HSA al 10% (p/v).
4. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha primera solucion de dilucion comprende dextrano 40 al 5,5% (p/v).
5. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha primera solucion de dilucion comprende HSA al 10% (p/v).
6. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha solucion en la etapa (a) o dicha primera solucion de dilucion comprenden adicionalmente un crioprotector.
7. El metodo de la reivindicacion 6, en donde dicho crioprotector en dicha primera solucion de dilucion es DMSO.
8. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente despues de la etapa (c):

(d) diluir la solucion que contiene celulas con una segunda solucion de dilucion que comprende dextrano, maltodextrano, trehalosa o hetalmidon pero no comprende HSA, elaborando de ese modo una composicion que comprende celulas de mairnfero.
9. El metodo de la reivindicacion 8, en donde dicha segunda solucion de dilucion comprende dextrano 40 al 5,5% o al 10% (p/v).
10. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicho filtro es un filtro de 70 micrometros o un filtro de 100 micrometros.
11. El metodo de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dichas celulas de marnffero son celulas de la placenta adherentes humanas aisladas.
12. El metodo de la reivindicacion 11, que comprende:

(a) suspender una pluralidad de celulas de la placenta adherentes humanas aisladas en una solucion de dextrano 40 al 5,5% (p/v), albumina de suero humano (HSA) al 10% (p/v) para formar una solucion que contiene celulas;

(b) filtrar la solucion que contiene celulas a traves de un filtro de 70 micrometros a 100 micrometros;

(c) diluir la solucion que contiene celulas en dextrano 40 al 5,5% (p/v), HSA al 10% (p/v), y DMSO al 5% a no mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro;

(d) crioconservar las celulas;

(e) descongelar las celulas; y

(f) diluir opcionalmente la solucion que contiene las celulas de 1:1 a 1:11 con dextrano 40 al 10% (p/v) para producir dicha composicion.
13. El metodo de la reivindicacion 11, que comprende:

(a) centrifugar una pluralidad de celulas de la placenta adherentes humanas aisladas para recoger las celulas;

(b) resuspender las celulas en dextrano 40 al 5,5% (p/v);

(c) centrifugar las celulas para recoger las celulas;

(d) resuspender las celulas en una solucion de dextrano 40 al 5,5% (p/v) que comprende albumina de suero humano (HSA) al 10% (p/v) para formar una solucion que contiene celulas;

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(e) filtrar la solucion que contiene celulas a traves de un filtro de 70 micrometros a 100 micrometros;

(f) diluir la solucion que contiene celulas en dextrano 40 al 5,5% (p/v), HSA al 10% (p/v), y DMSO al 5% a no mas de 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro;

(g) crioconservar las celulas;

(h) descongelar las celulas; e

(i) opcionalmente, diluir la solucion que contiene celulas de 1:1 a 1:11 con dextrano 40 al 10% (p/v) para producir dicha composicion.
14. El metodo de la reivindicacion 11, que comprende:

(a) proporcionar una pluralidad de celulas de la placenta adherentes humanas aisladas en una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5% (p/v) y albumina de suero humano al 10% (HSA) (p/v) para formar una solucion que comprende celulas de la placenta adherentes humanas aisladas;

(b) filtrar dicha solucion que comprende celulas de la placenta adherentes humanas aisladas a traves de un filtro de 70 micrometros a 100 micrometros para producir celulas de la placenta adherentes humanas aisladas filtradas;

(c) diluir dichas celulas de la placenta adherentes humanas aisladas filtradas con una cantidad de una solucion que comprende dextrano 40 al 5,5% (p/v), HSA al 10% (p/v) y dimetilsulfoxido al 5% (DMSO) suficiente para llevar dichas celulas de la placenta adherentes humanas aisladas filtradas a 10 ± 3 x 10° celulas por mililitro; y

(d) diluir dichas celulas de la placenta adherentes humanas aisladas con dextrano 40 al 10% (p/v) a una razon de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:11 celulas de la placenta adherentes humanas aisladas:dextrano 40 para producir dicha composicion.
15. El metodo de la reivindicacion 11, que comprende

(a) poner en contacto celulas de la placenta adherentes humanas aisladas con una solucion que comprende dextrano al 5,5% (p/v) y albumina de suero humano (HSA) al 10% (p/v);

(b) filtrar las celulas de la placenta adherentes humanas aisladas a traves de un filtro de 70 micrometros a 100 micrometros; y

(c) diluir dichas celulas de la placenta adherente humanas aisladas a 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro con una solucion que comprende dextrano 40 al 10% (p/v),

en donde dicha composicion no comprende macro-cumulos de celulas, en donde un macro-cumulo de celulas comprende una agregacion de celulas mayor de aproximadamente 150 micrometros.
16. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en donde dichas celulas de la placenta adherentes humanas aisladas son CD10+, CD34- y CD105+.
17. El metodo de la reivindicacion 16, en donde dichas celulas CD10+, CD34- y CD105+ son adicionalmente CD200+.
18. El metodo de la reivindicacion 17, en donde dichas celulas CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+ son CD45- o CD90+.
19. El metodo de la reivindicacion 17, en donde dichas celulas CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+ son CD45'y CD90+.
20. Una composicion obtenible por el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
21. La composicion de la reivindicacion 20, que comprende una pluralidad de celulas de la placenta adherentes humanas aisladas en una solucion que comprende dextrano 40 al 4-10% (p/v), en donde dicha composicion comprende entre 1,0 ± 0,3 x 106 celulas por mililitro y 5,0 ± 1,5 x 106 celulas por mililitro, y en donde dicha composicion no comprende macro-cumulos de celulas, en donde un macro-cumulo de celulas comprende una agregacion de celulas mayor de aproximadamente 150 micrometros.
22. La composicion de la reivindicacion 21, en donde dicha composicion comprende menos de aproximadamente 100 micro-cumulos de celulas por 106 celulas.
23. La composicion de la reivindicacion 21, en donde dichas celulas de la placenta adherentes humanas aisladas son CD10+, CD34'y CD105+.
24. La composicion de la reivindicacion 23, en donde dichas celulas CD10+, CD34- y CD105+ son adicionalmente

CD200+.
25. La composicion de la reivindicacion 24, en donde dichas celulas CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+ son CD45- o CD90+.
26. La composicion de la reivindicacion 24 en donde dichas celulas CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+ son CD45- y 5 CD90+.