CN101480410B - 脐带间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了脐带间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。自身免疫性疾病患者的骨髓间质干细胞存在异常，在疾病的发生发展中起重要作用。脐带间质干细胞具有诱导免疫耐受和免疫调节的作用，能应用于制备治疗自身免疫性疾病的药物中。

Description

脐带间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，涉及脐带间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

背景技术

间质干细胞(MSCs)最初是特指骨髓基质细胞，后来研究发现在胎儿肝脏、肺脏、心脏等实质脏器、脐带及脐带血中均提取到了与骨髓基质细胞生物学特性相似、免疫表型相同的干细胞，因此将间质组织来源的与骨髓MSCs生物学性状相似，具有多向分化潜能的细胞统称为间质干细胞。MSCs是多潜能的成体基质细胞，能分化为多种间质起源的组织，如成骨、软骨和脂肪细胞，在特殊环境下，还能横向分化为肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝胰细胞等多种其他组织细胞。MSCs分裂40代后仍能维持转染基因的表达，是基因治疗的优良载体。目前已经有充分的证据表明，MSCs通过阻止细胞分裂抑制T细胞、B细胞和树突状细胞的增殖；MSCs同样能够抑制NK细胞的增殖，干扰树突状细胞的成熟和抗原递呈；MSCs对多种损伤组织具有替代修复作用。MSCs植入体内后，可在多种造血以外的组织如肺、骨、软骨和皮肤等处定位和分布；且移植后无免疫排斥反应，并能分泌多种细胞因子，参与免疫调节。体内外研究均表明MSCs具有诱导免疫耐受和免疫调节的作用。MSCs通过分泌多种细胞因子如转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-7、IL-10、干扰素γ(IFN-γ)、前列腺素E2(PGE2)等发挥免疫调节作用。

脐带MSCs具有骨髓间质干细胞的类似的生物学特性。如贴壁生长，脐带MSCs表达CD105(SH2)、CD73(SH3，SH4)、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106分子，不表达CD14，CD34，CD45等造血细胞标记，表达HLA-1，不表达HLA-DR，不表达共刺激分子CD80，CD86和CD40。与骨髓MSCs相比，脐带MSCs SH2、CD106和HLA-1表达低，OCT mRNA表达阳性，这说明脐带MSCs是一种更原始的MSCs群。大量的体外实验证明，在不同诱导条件下，脐带MSCs不仅可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等，还可以向外胚层和内胚层来源的神经元样细胞和肝细胞样细胞分化。最近研究表明脐带MSCs能在精原细胞诱导条件下，可以分化为精原细胞。脐带MSCs在适当条件下，可以诱导分化为胰岛样细胞。

Weiss等研究发现脐带MSCs能分泌细胞因子，支持造血，抑制刀豆素A所致的脾细胞增殖。不表达或表达极低水平的MHC-II分子，Fas配体和T细胞共刺激分子CD80，CD86，CD40，CD40L，因此不易被宿主T细胞识别，并能逃脱宿主免疫系统的排斥。猪脐带MSCs移植到鼠大脑，在没有用免疫抑制剂的情况下，猪脐带细胞在鼠脑内存活移行，并表达猪神经细胞的标记，表明脐带MSCs可逃脱宿主免疫系统的排斥。Ma等在人脐带华尔通(Wharton′s Jelly)来源的MSCs的特性及向神经细胞分化的研究中证实脐带MSCs不表达或低表达移植免疫排斥相关的表面标记CD80，CD86，CD40，CD40L。表明人脐带MSCs可能不表达MHC I和MHC II，同种异基因MSCs移植至中枢神经系统后未见短期排斥反应，推测脐带MSCs免疫调节的主要机制是通过抑制树突状细胞发育和分泌IL-10、TGF-β等细胞因子，从而抑制异体T细胞的活化，MSCs表达的MHC-I类分子可激活T淋巴细胞提供第一信号，但由于缺乏协同刺激分子，不能产生第二信号，导致T淋巴细胞无能，从而诱导免疫耐受。台湾学者将由脐带MSCs诱导分化的胰岛样细胞移植给STZ诱导的T1DM大鼠，能显著降低糖尿病大鼠血糖，大鼠体内人胰岛素水平显著提高，糖耐量恢复且无移植排斥反应。移植12周后，大鼠肝脏内可检测到表达人胰岛素和抗人细胞核单克隆抗体双阳性细胞。未分化的脐带MSCs则不具备类似作用。

已有大量动物试验表明脐带MSCs移植治疗肝脏损伤、移植物抗宿主病、神经系统疾病、糖尿病、骨质缺损有效。Nakamura等发现，在鼠胶原瘤模型实验中运用基因工程的MSCs具有抗肿瘤作用；Sato等将表皮细胞生子因子受体(EGFR)转染的MSCs移植于鼠脑胶质瘤内，实验组生存时间明显延长。体外实验显示基因转染的MSCs能较长时间的表达外源性基因，这使得基因修饰的MSCs治疗疾病成为可能。在治疗急性心肌梗死的研究中，Matsumotov等用腺病毒作为载体把血管内皮生长因子(VEGF)基因165修饰的MSCs直接注入左冠状动脉阻塞造成的鼠心脏梗死区域，1周后该区域可检测到VEGF表达明显增高，28天后梗死区域的左室大小、左室射血分数、E/A波比率、毛细血管密度均明显改善，表明基因修饰的MSCs移植在治疗急性心肌梗死中效果显著。此外，用转染显性负数突变体I型胶原基因的MSCs治疗易碎性骨疾病和成骨不全也获得成功。

自身免疫性疾病(autoimlnune disease)是指以自身免疫应答反应导致组织器官损伤和相应功能障碍为主要发病机制的一类疾病。是临床上常见的一大类疾病，目前已被公认的自身免疫性疾病至少有30多种。根据自身免疫反应对组织器官造成损伤的范围，通常将自身免疫性疾病分器官特异与非器官特性两大类。

临床上常见的自身免疫性疾病包括：结缔组织疾病：类风湿关节炎(RA)、幼年特发性关节炎(JIA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、多肌炎/皮肌炎(PM/DM)、硬皮病(SSc)、系统性血管炎；神经肌肉疾病：多发性硬化症(MS)、重症肌无力(MG)、脱髓鞘疾病；内分泌性疾病：原发性贤上腺皮质萎缩、慢性甲状腺炎、糖尿病；消化系统疾病：炎性肠病(克罗恩病、溃疡性结肠炎)、慢性活动性肝炎、恶性贫血与萎缩性胃炎；泌尿系统疾病：自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合征；血液系统疾病：自身免疫性溶血性贫血、原发性血小板减少性紫癜(ITP)、特发性白细胞减少症。

自身免疫性疾病的常规治疗方法有：

(1)肾上腺皮质激素：是多数自身免疫性疾病最常用的治疗药物，具有较快抑制免疫反应和较强的抗炎作用。近年采用的激素冲击疗法提高了危重症的缓解率，但是激素也有不少副作用，长期应用可以抑制下丘脑-垂体-肾上腺系统，垂体前叶分泌促肾上腺皮质激素的量明显减少，使肾上腺皮质素分泌减少，皮质腺出现萎缩，从而患者需要长期服用激素维持治疗，并且他们的应激能力减弱，容易出现感冒及各种感染，在受到外伤、冷风刺激、精神刺激、手术治疗其它疾病等应激状态时，由于体内激素的分泌不足，一方面可能诱发自身免疫性疾病发生或加重，另一方面会出现疲乏无力，食欲减退，低血糖反应，肌肉关节疼痛等肾上腺皮质分泌激素不足的症状。此外，激素还可导致肥胖、多毛、高血压、青光眼、糖尿病、消化道溃疡、出血、精神症状、骨质疏松、股骨头坏死等。

(2)免疫抑制剂：自身免疫反应对多数自身免疫性疾病的发生发展有密切关系，除激素外，临床工作中往往还需应用1-数种免疫抑制剂以控制患者病情发展。常用的免疫抑制剂有环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯等，这些药物的主要副作用有胃肠道反应、血液系统损害、泌尿系统反应、影响生育、脱发、增加肿瘤发生率等。大剂量人体免疫球蛋白静脉注射通过抗体封闭作用治疗激素和免疫抑制剂不能控制的难治性患者，国内外均有成功经验，但此法对不同的病人疗效差异很大，价格昂贵，应用受限。

(3)造血干细胞移植：尽管给予了激素和免疫抑制剂治疗，仍有不少病人病情得不到控制或不能耐受常规治疗带来的严重不良反应，这促使临床工作者不断探索新的治疗方法。造血干细胞移植(HSCT)是近十余年来发展起来的一项治疗手段，在治疗自身免疫性疾病时主要采用了自体HSCT方式，其治疗原理有两方面，一是在预处理时，通过大剂量化疗或全身照射摧毁患者的异常免疫系统，对自身免疫性疾病起缓解作用；二是移植的自体外周血干细胞以重建正常的免疫系统，在免疫重建中阻断自身抗体的产生或诱导对自身抗原的免疫耐受。根据最新统计，目前全世界有近1000例难治性自身免疫性疾病患者接受了HSCT，其中包括SSc 190例，SLE 86例，PM/DM 14例，RA86例，MS 368例，Crohn病21例。由于自体免疫疾病自体HSCT后仍有部分患者病情不能控制，并有一些病例在术后复发，加之移植治疗风险较高，相关死亡率约为7％，高于非自身免疫性疾病(3％)，制约了该技术的广泛应用。移植相关死亡率与具体病种相关，从高到低依次为SSc、SLE、MS和RA；病例选择、支持治疗、预处理方案、是否去移植物中的淋巴细胞等也影响患者的存活率。

发明内容

本发明的目的是提供脐带间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

脐带间质干细胞可以应用于制备治疗自身免疫性疾病的药物中。

所述的自身免疫性疾病是指包括系统性硬化症、炎性肠病、多发性肌炎/皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、混合性结缔组织病、类风湿关节炎、白塞病、原发性胆汁性肝硬化等在内的一大类疾病。

所述自身免疫性疾病尤其指系统性红斑狼疮、系统性硬化症、多发性肌炎和皮肌炎或多发性硬化。

所述脐带间质干细胞可以采用以下方法制备：

(1)脐带间质干细胞的分离与培养：取新生儿脐带立即放入80％DMEM和20％抗生素溶液中，4h内去掉脐带静脉，然后将所述脐带重新缝合形成环状，灌入含II型胶原酶的PBS缓冲液，6-8h后，从所述的环状脐带中移出悬液，用PBS稀释离心后，将沉淀的细胞接种于含有10％胎牛血清的L-DMEM完全培养液中，置于5％CO₂、37℃饱和湿度的培养箱内培养；

(2)脐带间质干细胞的传代：步骤(1)中所述脐带间质干细胞培养至贴壁细胞90％融合时，用PBS洗涤，然后用胰酶消化，完全培养液终止消化，离心去上清，将沉淀的细胞接种于L-DMEM完全培养液，置37℃、5％CO₂、饱和湿度CO₂培养箱培养；

(3)取各代骨髓间质干细胞测定细胞表面标记并测定其核型，得具有间质干细胞特征且染色体核型正常的骨髓间质干细胞。

发明人通过调研大量的案例，发现自身免疫性疾病患者的骨髓MSCs存在异常，在疾病的发生发展中起重要作用。例如系统性红斑狼疮患者的骨髓MSCs体外生长较正常人缓慢，易衰老，传代过程(10代)中活力会逐渐丧失，IL-6、IL-7mRNA表达降低，并且MSCs存在细胞骨架异常。发明人最近的研究又发现系统性红斑狼疮骨髓MSCs体外向脂肪及软骨细胞的分化能力较正常明显降低，移植到裸鼠体内成骨也明显下降。另外，还发现系统性红斑狼疮患者的骨髓MSCs和正常人外周血单个核细胞在体外共培养时，刺激调节性T细胞(Treg)上调的能力也明显低于正常MSCs。由于自身免疫性疾病患者存在MSCs异常，脐带MSCs具有诱导免疫耐受和免疫调节的作用，所以能应用于制备治疗自身免疫性疾病的药物中。

本发明提出脐带MSCs在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。采用脐带MSCs制备得到的治疗自身免疫性疾病的药物与自身免疫性疾病常规治疗药物相比较，具有以下优点：脐带间质干细胞作为治疗自身免疫性疾病药物的活性成分，用于治疗自身免疫性疾病具有“治疗方便、疗效持久”的特点，能帮助患者减少药物治疗的种类和数量以及药物带来的各种副作用，甚至可能停用免疫抑制剂等药物治疗，降低死亡率和致残率，改善患者生活质量；目前脐带来源的间质干细胞的基础研究扎实，技术可推广程度高，技术可控，并安全性好，治疗费用的接受程度好，受益面广泛。因此脐带MSCs在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用具有巨大的社会和经济效益。

附图说明

图1表示SLE患者移植脐带间质干细胞后24小时尿蛋白定量的变化；

图2表示SLE患者移植脐带间质干细胞后外周血CD4⁺Foxp3⁺Treg的变化；

图3表示SLE患者移植脐带间质干细胞后疾病活动评分(SLEDAI)评分变化；

图4表示SLE患者移植脐带间质干细胞后血清ANA变化；

图5表示SLE患者移植脐带间质干细胞后血清抗ds-DNA滴度变化；

图6表示系统性硬化患者移植脐带间质干细胞后56天脊髓MRI的变化；

其中图1、图2、图5的各“·”表示在同一条件下所取不同样品的测量值，“-”表示同一条件下各测量值的平均值；

图1-图5中，MSCT-脐带间质干细胞移植，MSCT(-)-脐带间质干细胞移植前，M-月，W-周，P＜...是具有统计学意义。

具体实施方式

实施例1脐带间质干细胞(MSCs)体外分离、培养

(一)细胞的来源

1新生儿脐带来源细胞经体外扩增培养而成

2商品化脐带间质干细胞(来源江苏省北科生物技术有限公司和细胞产品国家工程研究中心)

(二)新生儿脐带来源的脐带MSCs分离与培养

1所用设备，材料，试剂

超净工作台CO₂培养箱倒置显微镜离心机恒温水浴箱高压蒸气灭菌锅25cm²、75cm²细胞培养瓶离心管(50ml，15ml)吸管L-DMEM培养液胎牛血清青霉素/庆大霉素PBS液胰酶II型胶原酶

2脐带MSCs原代分离、培养

(1)取新生儿脐带立即放入80％DMEM和20％抗生素(青霉素G：167U/m L，庆大霉素：50mg/mL)溶液中，每段脐带长4-5cm。

(2)4h内沿着静脉血管长轴切开，去掉静脉。

(3)将脐带重新缝合形成环状，灌入12-15mL含1mg/mL II型胶原酶的PBS缓冲液。

(4)6-8h后，从脐带环管中移出悬液，用PBS稀释以减轻粘度，离心(400g，20min)。

(5)去掉悬液，用PBS重悬，离心(250g，5min)后，将沉淀的细胞接种于含有10％胎牛血清的L-DMEM培养液中，置于5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱内培养。

(6)培养每三天半量换液一次。换液后48-72h后可出现贴壁生长的间充质样细胞，呈短棒状或梭形样细胞，有较长的突起，有折光性，贴壁。

3脐带MSCs传代

(1)培养至贴壁细胞90％融合时，进行传代；

(2)吸除培养瓶内旧培养液；

(3)加入PBS 1ml，轻轻摇动培养瓶，以洗去残留在瓶内的培养液，吸除PBS；

(4)培养瓶内加入胰酶1ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面；

(5)在倒置显微镜下观察，发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即加入完全培养液1ml终止消化；

(6)反复吹打瓶壁细胞，细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液；

(7)将细胞悬液吸入离心管，离心(常温170g，5min)，弃上清；

(8)用L-DMEM完全培养液调整细胞浓度为5×10⁶个细胞/ml，接种于25cm²培养瓶中，每瓶5ml；

(9)置37℃、5％CO₂、饱和湿度CO₂培养箱培养。

培养代数2～3代。

4脐带MSCs细胞冻存

(1)消化贴壁细胞，步骤同3中的步骤(1)～(7)；

(2)加入0.1ml二甲基亚砜(DMSO)，0.9ml胎牛血清，移入细胞冻存管；

(3)冻存细胞(4℃，1小时；-20℃，4小时；-70℃，12小时；液氮罐保存)。

5脐带MSCs细胞复苏

(1)取出冻存管，立即放入37℃水浴中，摇动，迅速解冻；

(2)吸管吸出细胞悬液，放入离心管，加入10ml PBS，吹打；

(3)离心(常温170g，5min)，弃上清，重复一次；

(4)加入L-DMEM完全培养液接种于培养瓶中，

(三)脐带MSCs的鉴定

1细胞总数

测量细胞悬液的总体积。吸取0.1ml混匀的细胞悬液，滴于细胞计数板上，计数。计算出细胞总数。

2活细胞比例

进行台盼蓝染色，计数采集细胞中活细胞所占比例。

3流式细胞仪检测细胞表面标志

取各代MSCs与FITC或PE标记的CD14、CD29、CD14、CD44、CD45、CD105作用，流式细胞仪检测。结果显示CD14、CD14和CD45为阴性，CD29、CD44和CD105为阳性，呈现为间质干细胞的特征。

4脐带MSCs染色体核型测定

取各代脐带MSCs，培养上清中加入秋水仙素使其最终浓度为1μg/ml，继续培养30min，弃上清，1％枸橼酸钠低渗液处理50min，用固定液(甲醇∶冰乙酸3∶1)固定，原位收获细胞，45℃烤片过夜，胰酶法G显带。每例标本计数15个中期分裂相，分析5个核型。该染色体核型检测结果显示正常染色体核型。

实施例2脐带MSCs给药方法

(一)新生儿脐带来源的脐带MSCs使用前最终鉴定

1无菌试验

如培养过程中未出现任何异常，常规在脐带MSCs输注患者前3天，最后一次换液后，对每一培养瓶中的上清液作无菌试验，培养细菌和霉菌。无菌试验按《中国生物制品规程(1995)》的规定进行。细胞上清液不得有细菌、霉菌生长。

2外观及镜下观察

在输注的当天，如无菌试验报告无细菌、霉菌生长，对培养瓶中的上清液进行颜色观察，在倒置显微镜下观察细胞形态、细胞密度、有无细菌或霉菌生长。如有可疑，须再次抽样作无菌试验培养细菌、霉菌。

3活细胞比例

输注当天对收集的细胞悬液抽样检查活细胞比例占95％以上。

4染色体核型

脐带MSCs输注前3天抽样行染色体核型检查：应为正常染色体核型。

5表面标志

脐带MSCs输注前3天抽样行表面标志测定：CD14、CD34、CD45表达阴性；CD29、CD44、CD45表达阳性。

(二)商品化脐带间质干细胞买来后直接使用。

(三)脐带MSCs的给药方法

1.所用设备，材料，试剂

超净工作台离心机一次性注射器注射用生理盐水人血白蛋白

2.输注前操作

当细胞总数量达到(1～2)×10⁶/kg患者体重，可作输注准备：

(1)输注前2日留取细胞培养上清液做细菌、真菌培养、支原体检测及内毒素测定(送本院检验科细菌室)；

(2)在超净工作台内取细胞，计数细胞浓度、活细胞比例、细胞表面标志、细胞染色体核型测定，具体见MSCs的鉴定；

3.输注操作

(1)消化所有细胞(操作同前)，离心(常温170g，5min)，弃上清；

(2)将细胞转移至离心管中，加入生理盐水，混匀后离心，弃上清。重复一次。

(3)经过以上洗涤步骤后，加入含5％人血白蛋白的生理盐水100ml，输注的细胞悬液中仅残留不足0.5％的细胞培养液。抽取0.1ml细胞悬液计细胞数。标明患者姓名，准备输注。

(4)细胞输注前半小时给患者静脉甲强龙40mg。

(5)开放手背静脉，连接装有细胞的分离袋，调整输注速度。

(6)输注过程中观察患者反应，及时对症处理。整个过程耗时约15分钟。

实施例3脐带MSCs在制备治疗不同自身免疫性疾病的药物中的应用

(一)脐带MSCs在制备治疗系统性红斑狼疮(SLE)的药物中的应用

(1)脐带MSCs在制备治疗系统性红斑狼疮动物模型的药物中的应用MRL/lpr狼疮鼠为SLE的动物模型。我们应用脐带MSCs移植治疗MRL/lpr鼠，研究发现移植后，抗ds-DNA抗体滴度、24h尿蛋白定量、血肌酐及尿素氮水平较对照组明显减轻。对照组小鼠肾脏病理改变表现为肾小球硬化、肾小球系膜细胞增殖、基质增宽，并可见新月体形成，肾间质内大量淋巴细胞浸润；脐带MSCs移植治疗后肾小球硬化及间质纤维化程度均较对照组为轻，表现为系膜细胞、系膜基质轻至中度增生，局灶性硬化，偶尔可见的肾间质的炎症细胞的浸润。对照组IgG、IgM系膜下、上皮上、内皮下广泛沉积，治疗组肾小球IgG、IgM沉积明显减少，治疗组新月体形成率与对照组比有统计学差异。这种治疗作用可能与抑制单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)；上调调节性T细胞等有关。对照组MRL/lpr鼠出现典型间质性肺炎的改变，表现为肺间质内血管充血水肿以及淋巴细胞和单个核细胞浸润，细支气管和小血管周围出现灶性淋巴细胞和单个核细胞聚集，部分肺组织实变。脐带MSCs移植治疗组炎症程度明显减轻。CFSE标记的脐带MSCs在MRL/lpr鼠体内能归巢于肾脏、肺脏、肝脏等组织器官。

(2)脐带MSCs在制备治疗系统性红斑狼疮(SLE)的药物中的应用

18例SLE患者均符合美国风湿病学院(ARA)1997年修订的SLE分类诊断标准，疾病活动指数评分参照SLEDAI法，SLEDAI≥8分为活动期，SLEDAI＜8分为非活动期。

入选标准：i)确诊为SLE的患者，SLEDAI≥8，年龄15～70岁，男女兼有；ii)重症狼疮：难治性狼疮性肾炎，24小时尿蛋白定量≥1g；难治性全血细胞减少；重度肺动脉高压；难治性神经精神狼疮；重症狼疮性肺炎；iii)强的松维持量大于20mg/日；iv)环磷酰胺0.4～0.6/m2，半月1次，治疗半年无效；或其它免疫抑制剂，如骁悉2g/日，治疗3月无效；v)试验前签署知情同意书。

移植方案：预处理给予CTX0.8-1.8g，分2-3天静脉输入，隔日予MSCs移植，移植细胞数为1×10⁶/kg体重。

疗效评价：观察移植前及移植后1周、1月、3月、6月、12月、18月、24月患者SLEDAI评分、24小时尿蛋白、血清肌酐、尿素氮、ANA、抗ds-DNA抗体滴度、外周血调节性T细胞(Treg)数量及Th1、Th2型细胞因子变化，评价移植疗效。

结果：移植后患者尿蛋白下降，肾炎得到改善(见图1)，患者调节性T细胞上升(见图2)，疾病活动改善(见图3)，血清ANA抗体滴度下降(见图4)，血清ds-DNA抗体滴度下降(见图5)。

(二)脐带MSCs在制备治疗系统性硬化症的药物中的应用

1.病例入选标准：1)确诊为系统性硬化症，2)已用激素和1种以上免疫抑制剂治疗半年以上，无明显疗效者，3)签署知情同意书同意MSCs治疗。

2.排除标准：1)患者存在严重的感染，2)疾病终末期，已出现重要脏器功能严重受损。

3.移植方案：MSCs静脉输入，细胞数为1×10⁶/kg体重。

4.治疗评价：共治疗6例患者，其中男性4例。移植前、移植后1月、3月、12月对患者内脏损伤及皮肤硬化记分进行评估，结果显示患者心、肺、肾功能保持稳定，皮肤积分逐步改善，皮肤溃疡愈合加速。

典型病例：

俞×，男，40岁，因“四肢皮肤多发性改变4年”入院。患者4年前无明显诱因下出现双下肢外侧皮肤局限性肿胀、增厚、变硬，继之向周围蔓延融合，4个月后双下肢足部以外的皮肤全部变硬，踝关节和膝关节屈曲困难，踝关节侧面和腘窝皮肤皲裂、破溃、疼痛。继而出现双手臂、双足皮肤变硬。查体：头、面、颈、双手部皮肤地图样色素缺失，张口困难，四肢、臀部、下腹皮肤增厚变硬，有蜡样光泽，胸腹部皮肤局限性色素沉着，四肢大关节处皮肤变薄，有鳞屑样脱屑，腘窝、双踝关节屈侧皮肤散在溃疡，少量渗液，纱布包扎，四肢肌力正常，双踝关节和膝关节屈曲困难。皮肤活检示：(右前臂)复磷上皮轻度萎缩，真皮层胶原纤维增生，皮肤附属器上移，皮下脂肪组织内血管增生扩张，血管周围炎细胞浸润，诊断为“系统性硬化症”，强的松、青霉胺、秋水仙碱等治疗效果不明显。入院后完善相关检查，预处理给予CTX0.6×3d后，行脐带间质干细胞移植术，共输细胞数7.2×10⁷个。术后三天患者破溃处皮肤广泛发红，双腘窝破裂皮肤有愈合趋势，渗出减少，皮肤疼痛有明显改善，术后一周患者全身皮肤紧绷感、张口困难较前略有好转，疼痛明显减轻。脐带间质干细胞疗效显著，出院后强的松减量为10mgqd，继续服用丹参滴丸，门诊随诊调整环磷酰胺用量。

(三)脐带MSCs在制备治疗多发性肌炎/皮肌炎的药物中的应用

1.病例入选标准：1)确诊为多发性肌炎/皮肌炎，2)已用激素和1种以上免疫抑制剂治疗半年以上，无明显疗效者，3)签署知情同意书同意MSCs治疗。

2.排除标准：1)患者存在严重的感染，2)疾病终末期，已出现重要脏器功能严重受损。

3.移植方案：MSCs静脉输入，细胞数为1×10⁶/kg体重。

4.治疗评价：共治疗3例患者，其中男性2例。移植前、移植后1月、移植后3月、移植后12月对患者肌力、皮损情况进行评估，并行肌酶、肌肉MRI检查判断肌肉炎症有无变化。结果显示患者治疗后肌无力症状改善，肌酶迅速下降并保持稳定，MRI检查显示肌肉炎症好转。

典型病例：

徐××，女性，40岁，因“反复四肢无力5个月”入院(2008-09-21)。患者5个月前无明显诱因下出现双下肢近端肌肉乏力，步行、抬腿均费力，并进行性加重，伴双下肢近端肌肉酸痛，双手背部肿胀，随后出现双上肢近端肌肉无力，上抬双臂、持物困难，查CK6002U/L，肌电图示神经性损害，肺功能示重度限制性通气功能减退、弥散量明显降低；胸部CT示肺间质病变。诊断为“多发性肌炎、肺间质病变”，予“激素、CTX”等治疗后好转。3个月前又出现双下肢乏力，下蹲站起、抬腿、步行均困难，梳头困难，生活需家属协助；2月余前出现双下肢浮肿，间断发热，最高体温39.5℃，活动后胸闷气喘，查CK 1879U/L；血浆白蛋白29.7g/L；胸部CT示双肺间质性改变伴炎症；甲状腺功能示FT32.18pmol/L，T31.05nom/L。入院后体检：双手背轻度肿胀，双下肢轻度凹陷性浮肿，双上肢肌力5级，双下肢肌力4级，肌肉无压痛，肌张力正常。辅检：AST90U/L，CK4200U/L，LDH808U/L。2008-09-24行异基因脐带间质干细胞移植，共输细胞数6.2×10⁷个，术后患者无不适主诉。移植后一周患者感双下肢无力明显好转，查体：双上肢肌力5级，双下肢肌力4级，复查CK 400U/L，MRI检查显示肌肉炎症好转，予以出院。

(四)脐带MSCs在制备治疗多发性硬化的药物中的应用

1.病例入选标准：1)确诊为多发性硬化，2)已用激素和1种以上免疫抑制剂治疗半年以上，无明显疗效者，3)签署知情同意书同意MSCs治疗。

2.排除标准：1)患者存在严重的感染，2)疾病终末期，已出现重要脏器功能严重受损。

3.移植方案：MSCs静脉输入，细胞数为1×10⁶/g体重。

4.治疗评价：共治疗5例患者，其中男性2例。移植前、移植后1月、移植后3月、移植后12月对患者肌力情况进行评估，并行头颅及脊髓MRI检查判断移植前后有无变化。结果显示患者治疗后肌无力症状改善，头颅及脊髓MRI好转。

典型病例：

患者女性，55岁，因“全身麻木乏力5月”于2008年8月14日入院。患者于2008年3月出现双膝以下麻木并逐渐向上发展；5月麻木感发展到颈部，且出现双下肢乏力；7月双下肢乏力急剧加重，不能行走及活动，同时出现双上肢乏力，尤其左上肢抬举不能。入院时体格检查：体温：37℃，脉搏：78次/分，呼吸：21次/分，血压：104/70mmHg。心肺听诊正常，肝脾肋下未及，双下肢无水肿；语言尚流利，双侧瞳孔等大等圆，直径3mm，对光反射及集合反射均灵敏；颈部以下深、浅感觉均减退，腰部以下及左侧肢体明显；四肢肌肉萎缩，下肢明显；四肢肌张力正常；双下肢肌力0级，左上肢肌力2级，右上肢肌力3级；双侧巴氏征阳性。辅助检查：血、尿、大便常规及生化全套基本正常。查脑脊液细胞数6个/ul，单核细胞增多；头颅及脊髓MRI示胼胝体、双侧额、顶、枕叶异常信号，延髓至C6水平颈髓异常信号，脊髓圆锥内异常信号。诊断为多发性硬化，给予甲基泼尼松龙500mg/d×5d后逐渐减至维持量以及营养神经等治疗无明显疗效。根据扩展的功能障碍状况量表(expanded disbility status scale，EDSS)，该患者EDSS评分为8.5分。因传统方法治疗欠佳，在获得患者知情同意后，决定行MSCs移植。

在连用CTX 0.6g/d×3d后，我们于2008年8月19日对该患者行脐带MSCs移植，鞘内注射脐带MSCs 10ml(细胞数为1×10⁷)，并静脉输注脐带MSCs 20ml(细胞数为2×10⁷)。移植后第三天，下肢肌力开始恢复，左下肢肌力2^-级，右下肢肌力1级；移植后第六天，躯体麻木感开始减轻；移植后第九天，左下肢肌力2级，右下肢肌力2^-级，左上肢肌力3级，右上肢肌力4级，患者可在帮助下坐起，但需要旁人支撑，双下肢悬垂并可作主动活动，EDSS评分为8分；移植后第十六天，双下肢肌力2级，患者可在帮助下坐起，无需旁人支撑；移植后第六十天，双下肢肌力3级，可下地行走。复查脊髓MRI示C1～5颈段脊髓内及腰段脊髓内片状长T1长T2异常信号，颈段脊髓内病灶范围较移植前明显缩小(图6)，患者神经组织恢复，移植过程及移植后均未出现毒副反应。

发明人通过调研大量的案例，发现自身免疫性疾病患者的骨髓MSCs存在异常，在疾病的发生发展中起重要作用。因为脐带MSCs有独特的免疫调节和修复作用，所以能应用于制备治疗自身免疫性疾病药物中，不仅包括上述在制备治疗实施例中提到的系统性红斑狼疮、系统性硬化症、多发性肌炎/皮肌炎和多发性硬化的药物中的应用，还包括在制备治疗其它的自身免疫性疾病中的药物中的应用。

Claims (2)

1.脐带间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，所述自身免疫性疾病是指系统性红斑狼疮、系统性硬化症、多发性肌炎、皮肌炎或多发性硬化。

2.根据权利要求1所述脐带间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，所述脐带间质干细胞采用以下方法制备：

(1)脐带间质干细胞的分离与培养：取新生儿脐带立即放入80％DMEM和20％抗生素的溶液中，4h内去掉脐带静脉，然后将所述脐带重新缝合形成环状，灌入含II型胶原酶的PBS缓冲液，6-8h后，从所述的环状脐带中移出悬液，用PBS稀释离心后，将沉淀的细胞接种于含有10％胎牛血清的L-DMEM完全培养液中，置于5％CO₂、37℃饱和湿度的培养箱内培养；

(2)脐带间质干细胞的传代：步骤(1)中所述脐带间质干细胞培养至贴壁细胞90％融合时，用PBS洗涤，然后用胰酶消化，完全培养液终止消化，离心去上清，将沉淀的细胞接种于L-DMEM完全培养液，置37℃、5％CO₂、饱和湿度CO₂培养箱培养；

(3)取各代骨髓间质干细胞测定细胞表面标记并测定其核型，得具有间质干细胞特征且染色体核型正常的骨髓间质干细胞。

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