CN105062967A - 一种人骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用，属于医学领域。本发明人骨髓间充质干细胞的制备方法为：先对行髂后上棘骨髓进行穿刺，采集血液；然后对人骨髓间充质干细胞进行筛选、培养及纯化；最后细胞融合度达到80％时，进行细胞传代，得到人骨髓间充质干细胞。本发明制得的人骨髓间充质干细胞具有调节紊乱的免疫功能，并通过抑制MSC的病理性成骨，减缓或改变疾病进程，可用于制备治疗脊柱关节病的药物。
Description
技术领域
本发明属于医学领域，具体涉及一种人骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用。
背景技术
脊柱关节病(Spondyloarthritis，SpA)是一种常见的自身免疫性疾病，其分为中轴型和外周型两类，共同疾病特点主要累及中轴关节及肌腱附着点，以炎性背痛和不对称外周关节炎为主要症状，好发于青年，大多数23～30岁发病，男女比例约为2：1。来自欧洲的报道称脊柱关节病患病率为0.15％-1.8％，我国对12个省、市的120，451汉族人的流行病学调查数据显示脊柱关节病的患病率为0.2％-0.54％。脊柱关节病主要病理特征为自身免疫性炎症和病理性成骨，属高致残性疾病，随着疾病的发展可导致严重的功能障碍，给患者带来了沉重的心理和经济负担，但至今仍无治愈性治疗手段。现有的治疗手段主要包括：1.症状缓解药物(包括非甾体抗炎药(NSAIDs)、糖皮质激素(GC))、2.改善病情抗风湿药物(DMARD)(包括2.1甲氨喋呤(MTX)、2.2柳氮磺胺吡啶(SASP))、3.生物制剂(包括TNF-α拮抗剂)。
但它们均为非治愈性药物，且可造成胃肠道反映、感染，甚至骨髓抑制，肝肾功能异常等严重副作用。正因为现存治疗方法存在以上诸多不足。因此找到一种安全、有效且可改变疾病进程的治疗方法显得尤为重要。
1976年Friedenstein等首次描述骨髓中存在间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)并证实其对造血干细胞的增殖和分化具有支持作用。MSC主要存在于全身的结缔组织中，以骨髓的含量最丰富，其具有向中胚层多种组织如骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织甚至神经外胚层的神经组织等分化的潜能。
目前尚未筛选到MSC特有的标记分子，但一致的观点认为SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD102等呈阳性，而CD14、CD34和CD45等造血谱系分子表达阴性。由于MSC不表达主要组织相容性复合体(MHC)II分子、CD40、CD80、CD86等共刺激分子，不表达或极低水平表达MHCI，MSC不易被宿主T细胞识别，并能逃脱宿主免疫系统的排斥，因此认为MSC具有低免疫原性，并将其广泛应用于心肌病、肝脏疾病及神经系统疾病中。Strauer等选择18例陈旧性心肌梗死患者，病程5个月～8.5年，经冠状动脉注射自体MSC(间充质干细胞)，3个月后复查时发现梗死区面积减少30％，左心室射血分数升高15％，梗死壁运动速率升高57％，而对照组的以上三个指标与治疗前相比无明显变化。Mohamadnejad等利用MSC治疗4例晚期肝硬化患者，患者平均年龄47岁，且都具有慢性肝衰竭，门脉高压症状，彩超显示患者肝硬化，血清白蛋白、胆红素明显异常，晚期肝病模型(modelforendstageliverdisease,MELD)评分大于16。抽取患者自体骨髓，并培养至细胞量为10.2×106～6.0×106后，用20ml生理盐水混悬细胞，经肘静脉缓慢注射。随访1年发现所有患者均存活，且所有患者均未出现急性肾衰竭、肝脏失代偿加重及肝脏肿块等并发症。其中3例患者的肝功能明显改善，MELD评分下降，并以术后6个月时效果最显著。Mazzini等治疗一组肌萎缩侧索硬化患者，取骨髓培养MSC，溶于2ml自体脑脊液后注射入脊髓，随访3年，无死亡、脑脊髓的容积、结构改变和异常细胞增殖现象发生。
与此同时越来越多的证据表明MSCs具有强大的免疫调节及抑制炎症反应的能力，早在2002年人们已经发现MSCs可通过抑制T细胞的增殖发挥其免疫抑制作用，近期的研究已证明MSCs还可通过调节B淋巴细胞、NK细胞及树突状细胞来发挥其免疫调节作用，其免疫调节及炎症抑制功能的发挥有赖于其分泌的各种因子和/或细胞间接触。MSCs被广泛用于输注治疗自身免疫相关疾病，国内外众多科研院所不仅证明了MSCs输注的安全性，同时证明了其对自身免疫性疾病的可靠疗效。2005年Garcia-Olmod等对5例合并瘘管的克罗恩病(Cronhdisease)患者进行了自体MSC治疗的I期临床试验，除1例患者由于MSC体外培养受到细菌污染而退出试验，其余4例共8处瘘管接受了自体MSC瘘管局部注射，随访12～30个月(平均22个月)后，6处瘘管完全闭合，另2处部分闭合。LeBlancK等人在欧洲进行的一项多中心的II期临床试验证明：对55例对激素耐药的急性GVHD患者使用了MSC，尽管使用的MSC来源不同，包括HLA全相合、半相合或HLA完全不相合的第三方供者，而且有的患者接受了多名供者的MSC，但经治疗后30例患者获得了完全反应，2年后，获得完全反应的患者中有53％仍存活，而对MSC治疗无反应的2年生存率仅有16％，结果还显示，MSC供者的不同来源并不影响治疗结果。
同样，脊柱关节病患者也存在着免疫紊乱的情况：Yang等人的实验证明，与正常人相比，SpA患者体内的IL-23及IL-17水平明显上升，而这可能是HLA-B27阳性等遗传因素及各种环境因素综合作用产生。WendlingD等人也发现IL-17在SpA患者的关节滑液中有着较高的表达。而且在SpA患者外周血的研究中也发现了Th17细胞的增多。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种人骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种人骨髓间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)人血液采集：对行髂后上棘骨髓进行穿刺，采集血液；
(2)于20℃、以445×g的速度离心步骤(1)采集的血液30min，分离骨髓中的有核细胞，对人骨髓间充质干细胞进行筛选、培养及纯化，其中，培养液中含有DMEM培养基，培养液中还含体积分数为10％的胎牛血清、2U/L青霉素和2U/L链霉素；在37℃、5％CO2的条件下培养48h后，更换培养液并去除悬浮细胞，并在以后每3～4天进行一次相似操作；
(3)细胞融合度达到80％时，进行细胞传代：用PBS洗涤细胞，再用胰酶消化，当贴壁细胞变为游离时，终止消化，离心后弃去上清；用PBS洗涤一次后，将细胞接种于培养液中，在37℃，5％CO2的条件下进行传代培养，当细胞扩增进入第3代时，使用质量分数为0.25％的胰蛋白酶和1mmol/LEDTA进行消化，最后混悬于含有DMEM培养基并含有体积分数为10％胎牛血清的培养液中，得到人骨髓间充质干细胞。
作为本发明所述人骨髓间充质干细胞的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，采用Ficoll密度梯度离心法离心步骤(1)采集的血液。
作为本发明所述人骨髓间充质干细胞的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)和所述步骤(3)中，DMEM培养基均为低糖型。
本发明还提供了上述方法制得的人骨髓间充质干细胞在用于制备治疗脊柱关节病的药物中的应用。
作为人骨髓间充质干细胞在用于制备治疗脊柱关节病的药物中的应用的优选实施方式，所述脊柱关节病包括银屑病关节炎、反应性关节炎、炎性肠病性关节炎和青少年特发性关节炎。
本发明的有益效果为：脊柱关节病患者的外周血及坏死股骨头局部IL-17和IL-23等炎性因子的含量明显高于正常人；同时，脊柱关节病患者外周血Th17细胞增多，Treg细胞降低，Th17/Treg比例升高，全身处于炎性状态。另外，经实验证实虽然脊柱关节病患者MSC在增殖、分化及迁移能力等方面与正常人MSC没有任何差异，但是脊柱关节病患者MSC存在明显的免疫调节能力异常，表现为混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction，MLR)中脊柱关节病患者MSC较正常人MSC抑制淋巴细胞增殖的能力明显下降。因此，经体内试验和体外试验研究，脊柱关节病患者体内确实存在免疫紊乱，并且患者自身体内MSC也发生了免疫调节的异常，导致脊柱关节病患者体内免疫紊乱不能得到干预和纠正，体内炎性情况得以持续和加剧，反过来又进一步恶化和加重病情。
人骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有调节紊乱的免疫功能，并通过抑制MSC的病理性成骨，减缓或改变疾病进程。人骨髓间充质干细胞对脊柱关节病患者效果十分明显，病人病情改善情况令人满意，可帮助患者减少甚至停用NSAID等药物，并且安全有效、无任何不良副作用。此外，人骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源广，治疗费用较为合理。因此，将人骨髓间充质干细胞BMSCs应用在制备治疗脊柱关节病药物中具有巨大的社会和经济效益。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
下述BMSCs表示人骨髓间充质干细胞，SpA表示脊柱关节病。
实施例中，为了评价人骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗脊柱关节病(SpA)的效果，采用了下述评价指标：
1、主观评价：Pain-VAS(疼痛视觉模拟评分)、BAS-G(Bath脊柱关节病总体评分)、BASFI(Bath脊柱关节病功能指数评分)、BASDAI(Bath脊柱关节病病情活动指数评分)。
Pain-VAS——评估治疗前后患者疼痛改善情况；BAS-G——评估治疗前后患者病情总体改善情况；BASFI——评估治疗前后患者机体功能改善情况；BASDAI——评估治疗前后患者病情活动程度变化情况；
2、临床指标：
外周血检测CRP、ESR、TNF-α、IL-17、IL-23、BMP——评价治疗前后患者全身炎性状态变化情况；
流式细胞术分析CD4+T细胞、CD8+T细胞、Th17细胞、Treg细胞、NK细胞比例——评价治疗前后患者淋巴细胞数量及亚群比例变化情况；
脊柱活动度(包括扩胸度、枕墙距、耳墙距、踝间距、颈椎活动度、腰椎侧弯度、修订版Schober检查)—评估治疗前后患者脊柱活动度改善情况；
3、影像学检查：
全脊柱及双侧骶髂关节正侧位X片——影像学评估治疗前后患者中轴关节病情改善情况；
全脊柱及双侧骶髂关节MRI——影像学评估治疗前后患者中轴关节病情改善情况；
ASspiMRI评估(脊柱关节病MRI评估)——评价治疗前后患者影像学上病情改善情况。
实施例1
本发明人骨髓间充质干细胞的制备方法的一种实施例，本实施例所述人骨髓间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)人血液采集：对行髂后上棘骨髓进行穿刺，采集20～30岁健康志愿者的血液20mL；
(2)采用Ficoll密度梯度离心法，于20℃、以445×g的速度离心步骤(1)采集的血液30min，分离骨髓中的有核细胞，通过对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)在培养皿的附壁特性进行筛选、培养及纯化，其中，培养液中含有DMEM培养基，培养液中还含体积分数为10％的胎牛血清、2U/L青霉素和2U/L链霉素；在37℃、5％CO2的条件下培养48h后，更换培养液并去除悬浮细胞，并在以后每3～4天进行一次相似操作；
(3)细胞融合度达到80％时，进行细胞传代：用PBS洗涤细胞，再用胰酶消化，当贴壁细胞变为游离时，终止消化，离心后弃去上清；用PBS洗涤一次后，将细胞接种于培养液中，在37℃，5％CO2的条件下进行传代培养，当细胞扩增进入第3代时，使用质量分数为0.25％的胰蛋白酶和1mmol/LEDTA进行消化，最后混悬于含有DMEM培养基并含有体积分数为10％胎牛血清的培养液中，得到人骨髓间充质干细胞。
优选地，上述步骤(2)和所述步骤(3)中，DMEM培养基均为低糖型。
实施例2
为了考察本发明制得的人骨髓间充质干细胞在治疗脊柱关节病中的应用，我们选取了20个TNFα拮抗剂抵抗的脊柱关节病患者，对SpA患者分别于第0天、第1周、第2周、第3周人给予本发明的骨髓间充质干细胞BMSCs静脉注射，每周1次，人骨髓间充质干细胞(BMSCs)的用量为1×106MSCs/kg(体重)，于10ml生理盐水中悬混，并由患者肘静脉缓慢注入。完成4周的BMSCs注射后，检测患者的CRP、ESR、ASDAS-CRP、BASDAI、BASFI及血、大便、尿常规等。
结果表明，SpA患者ASDAS-CRP评分从治疗前的4.0±0.5降到2.4±0.5；而BASFI评分也从5.3±1.1降到3.7±0.9；关节肿胀数从治疗前的21个降到13个；ASAS20达到100％，ASAS40达到60％(治疗前后患者各项指标的变化如表1所示)。对输注人骨髓间充质干细胞BMSCs的患者进行了为期8周的随访，在随访中除了个别患者有注射点疼痛的症状外，无其他不适。同时包括血常规、尿常规、大便常规、肝功能在内的相关实验室和影像学检查也未发现明显异常。
表1
| ASDAS-CRP | BASDAI | BASFI | ESR(mm/h) | CRP mg/L | |
| 基础值 | 4.0±0.5 | 3.5±1.3 | 5.3±1.1 | 52.6±24.0 | 50.4±24.1 |
| 1周 | 3.7±0.5 | 3.0±1.2 | 4.9±1. | 47.8±22.4 | 46.5±23.0 |
| 2周 | 3.4±0.5 | 2.6±1.1 | 4.4±1.1 | 42.1±22.1 | 40.9±21.7 |
| 3周 | 2.9±0.5 | 2.0±1.1 | 4.0±1.0 | 37.3±19.3 | 31.1±19.7 |
| 4周 | 2.4±0.5 | 1.4±1.0 | 3.7±0.9 | 33.1±17.8 | 21.9±18.2 |
| 8周 | 2.6±0.6 | 1.7±1.0 | 3.8±0.9 | 31.5±17.4 | 26.1±19.0 |
由上可见，SpA患者静脉注射人骨髓间充质干细胞(BMSCs)，其治疗效果十分明显，病人病情改善情况令人满意，可帮助患者减少甚至停用NSAID等药物，并且安全有效、无任何不良副作用。
实施例3
我们以35岁的李XX(男，工人)为研究对象，考察了本发明制得的人骨髓间充质干细胞在治疗脊柱关节病中的应用。李XX因“腰背部僵硬双膝肿胀7月余，加重伴乏力3天”来我院就诊。患者7月前无明显诱因出现腰背部僵硬，晨起明显，活动后好转，每次持续约45min。同时自觉双膝肿胀，活动受限。查体：患者脊柱各向活动受限，双侧膝关节均一肿大，屈曲困难。实验室检查：ESR57mm/h、CRP54mg/L。X线显示：双侧骶髂关节间隙模糊，骨桥生成，腰椎小关节模糊。ASDAS-CRP评分5.1，BASDAI4.0，BASFI5.9。连续3周给予患者输注1×106/kg(体重)人骨髓间充质干细胞BMSCs后，患者腰背部僵硬及双膝肿胀情况明显减轻，复查ESR35mm/h、CRP29mg/L，ASDAS-CRP评分2.5，BASDAI2.0，BASFI3.9。
本发明通过对SpA患者静脉输注健康人骨髓间充质干细胞BMSCs，发现：患者的治疗效果十分明显，病人病情改善情况令人满意；绝大多数SpA患者全身炎性情况明显降低、病变关节疼痛程度明显减弱、个人活动范围和强度明显增强；部分原先服药的SpA患者在接受细胞治疗后停药数月病情仍不复发；少数对NSAIDs和TNF拮抗剂(如益赛普)等无效的SpA患者经过输注正常人骨髓间充质干细胞BMSCs治疗后临床症状改善情况显著。另外，静脉输注正常人骨髓间充质干细胞BMSCs治疗SpA患者起效快、持续时间久。病人在接受细胞输注1个月后治疗效果十分明显，相当长时间可持续发挥治疗作用。临床试验也证实静脉输注正常人骨髓间充质干细胞BMSCs治疗SpA患者具有安全有效、无任何不良副作用的特点。目前为止尚未发现任何一例接受静脉输入健康人骨髓间充质干细胞BMSCs治疗的SpA病人发生排斥反应、过敏反应、休克甚至出现死亡。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.一种人骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)人血液采集：对行髂后上棘骨髓进行穿刺，采集血液；
(2)于20℃、以445×g的速度离心步骤(1)采集的血液30min，分离骨髓中的有核细胞，对人骨髓间充质干细胞进行筛选、培养及纯化，其中，培养液中含有DMEM培养基，培养液中还含体积分数为10％的胎牛血清、2U/L青霉素和2U/L链霉素；在37℃、5％CO2的条件下培养48h后，更换培养液并去除悬浮细胞，并在以后每3～4天进行一次相似操作；
(3)细胞融合度达到80％时，进行细胞传代：用PBS洗涤细胞，再用胰酶消化，当贴壁细胞变为游离时，终止消化，离心后弃去上清；用PBS洗涤一次后，将细胞接种于培养液中，在37℃，5％CO2的条件下进行传代培养，当细胞扩增进入第3代时，使用质量分数为0.25％的胰蛋白酶和1mmol/LEDTA进行消化，最后混悬于含有DMEM培养基并含有体积分数为10％胎牛血清的培养液中，得到人骨髓间充质干细胞。
2.如权利要求1所述的人骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，采用Ficoll密度梯度离心法离心步骤(1)采集的血液。
3.如权利要求1所述的人骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)和所述步骤(3)中，DMEM培养基均为低糖型。
4.采用权利要求1～3任一项所述方法制得的人骨髓间充质干细胞在用于制备治疗脊柱关节病的药物中的应用。
5.如权利要求4所述的人骨髓间充质干细胞在用于制备治疗脊柱关节病的药物中的应用，其特征在于：所述脊柱关节病包括银屑病关节炎、反应性关节炎、炎性肠病性关节炎和青少年特发性关节炎。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151118 |