CN112704687A

CN112704687A - 含间充质干细胞的制剂及其在银屑病治疗中的应用

Info

Publication number: CN112704687A
Application number: CN201910950035.4A
Authority: CN
Inventors: 戴成祥; 李苏克; 李蒙; 雷继刚; 李萍; 王静; 刘必佐
Original assignee: Wuxi Cellular Biopharmaceutical Group Ltd; Shanghai Cellular Biopharmaceutical Group Ltd
Current assignee: Shibiman Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2019-10-08
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2021-04-27

Abstract

本发明提供了含间充质干细胞的制剂及其用途。具体地，本发明提供间充质干细胞在用于制备治疗银屑病的制剂中的用途，以及含有间充质干细胞作为有效成分的制剂。本发明的含脂肪间充质祖细胞的制剂可以显著改善银屑病表皮层过度增生的症状，从而缓解银屑病。

Description

含间充质干细胞的制剂及其在银屑病治疗中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体的涉及一种含间充质干细胞的制剂及其在银屑病治疗中的应用。

背景技术

银屑病(psoriasis)是一种由自身免疫介导的皮肤慢性炎症性疾病。临床上，以寻常型银屑病最为常见。银屑病患者的皮肤组织病理性特征表现为表皮增厚、血管生成增加并扩张，以及浸润到真皮层中的炎症细胞数增加。银屑病发生主要与机体先天性免疫和获得性免疫功能的紊乱相关，且角质形成细胞 (keratinocyte)、树突状细胞(dendriticcell)和T细胞等炎症细胞在该疾病发生过程中发挥着至关重要作用。

银屑病患者在免疫应答过程中存在诸多异常。在其致病过程中，被激活的髓样树突状细胞分泌促炎症细胞因子TNF、IL-12和IL-23，其中IL-23负责活化 Th17细胞，促使其产生IL-17，从而进一步刺激角质形成细胞发生增生而出现银屑病症状。因此，这些促炎症细胞因子在银屑病的发病机制中发挥着重要作用，故而成为了治疗银屑病的靶点。

针对这些促炎症细胞因子，人们开发了一些人源化的单克隆抗体药物用于银屑病治疗。虽然取得了一定的治疗效果，但是这种治疗策略仍然会普遍产生诸多常见的副作用，甚至是一些严重的副作用。这主要包括潜在结核病的重新激活和机会性感染风险，以及机体针对这些药物而产生特异性抗体，从而降低了治疗反应的持续时间。此外，患者也需付出高昂的治疗成本等。因此，这类抗体药物在银屑病治疗上仍然存在着一定的局限性和潜在的风险。

人源脂肪间充质祖细胞是一种成体的多能性祖细胞，具有抗炎和免疫抑制作用，故而对自体免疫性疾病具有预防或治疗作用。此外，人源脐带间充质干细胞和人源胎盘间充质干细胞等，也具有免疫抑制作用，且具有低免疫原性。它们在治疗多种皮肤病(如伤口愈合、烧伤、大疱性表皮松解症、系统性红斑狼疮、皮肌炎、系统性硬化症、光老化、痤疮、特应性皮炎、银屑病等)中具有重要作用。因此，这些间充质干细胞在银屑病的治疗应用中具有一定潜力。

然而，目前已上市的治疗银屑病的药物中并没有干细胞类药物，也未见其临床前的详细研究报道。本领域迫切需要开发新的银屑病的治疗药物，尤其是干细胞类治疗药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够预防或治疗银屑病的制剂。

在本发明的第一方面，提供了一种间充质干细胞的用途，用于制备一制剂，所述制剂(a)用于预防或治疗皮肤病；或(b)用于抑制表皮层过度增生。

在另一优选例中，所述的间充质干细胞选自下组：

脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述的间充质干细胞包括自体的间充质干细胞和异体间充质干细胞。

在另一优选例中，所述的间充质干细胞为人源的。

在另一优选例中，所述的皮肤病为自身免疫介导的皮肤病。

在另一优选例中，所述的皮肤病选自下组：银屑病、烧伤、痤疮、特应性皮炎。

在另一优选例中，所述的治疗银屑病包括缓解银屑病症状，如抑制表皮层过度增生、减轻真皮层炎症细胞浸润。

在另一优选例中，所述的表皮层过度增生由咪喹莫特诱导。

在另一优选例中，所述制剂为药物组合物。

在另一优选例中，所述组合物包含(i)间充质干细胞；和(ii)药学上可接受的载体。

在本发明的第二方面，提供了一种治疗银屑病的制剂，所述制剂包含活性成分(a)间充质干细胞；活性成分(b)银屑病治疗药物；和(c)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的制剂为药物组合物。

在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的比例(mg:mg)为1:100至100:1，较佳地为1:20至20:1。

在另一优选例中，所述组合物中含有0.001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％的间充质干细胞，按组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述的组分(a)和组分(b)可以是混合的，也可以是独立存在的。

在另一优选例中，所述的制剂的剂型为注射剂。

在本发明的第三方面，提供了一种预防或治疗银屑病的方法，包括步骤：(a) 给需要的对象施用间充质干细胞。

在另一优选例中，所述的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的对象包括啮齿动物，如小鼠、大鼠。

在另一优选例中，所述的间充质干细胞的施用剂量为1×10⁶-2×10⁶个细胞/kg 体重。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了人源脂肪间充质祖细胞治疗咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠银屑病的示意图。

图2显示了咪喹莫特诱导C57BL/6小鼠银屑病模型的建立。其中，图2A 显示咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠背部皮肤呈淡红色，粗糙且结痂；图2B显示了咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠背部皮肤组织经石蜡切片后的H&E染色；经IMQ诱导后的小鼠皮肤表皮显著增厚，且有鳞片状结构，标尺为100μm；图2C和2D显示了咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠背部表皮的相对厚度、真皮层炎症细胞数量的统计分析。

图3显示人源脂肪间充质祖细胞可以改善咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠银屑病。其中，图3A显示了咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠分别经皮下注射0.9％ NaCl和人源脂肪间充质祖细胞治疗后的皮肤组织石蜡切片的H&E染色，标尺为50μm；图3B显示了咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠分别经皮下注射0.9％ NaCl(n＝6mice/group)和人源脂肪间充质祖细胞(n＝6mice/group)治疗后的表皮厚度的统计分析。

图4显示人脂肪、脐带和胎盘来源的间充质干细胞可以改善咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠银屑病。其中，图4A显示咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠分别经皮下注射0.9％NaCl、人脂肪(haMSCs)和脐带(huMSCs)和胎盘(hpMSCs)来源的间充质干细胞治疗后的皮肤组织石蜡切片的H&E染色，标尺为50μm；图 4B显示了咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠分别经皮下注射0.9％NaCl、人脂肪和脐带和胎盘来源的间充质干细胞治疗后的表皮厚度的统计分析。

图5显示人脂肪、脐带和胎盘来源的间充质干细胞可以抑制咪喹莫特诱导的表皮层角质细胞增殖。其中，图5A显示咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠分别经皮下注射0.9％NaCl、人脂肪(haMSCs)和脐带(huMSCs)和胎盘(hpMSCs)来源的间充质干细胞治疗后的皮肤组织的Ki67染色，标尺为50μm；图5B显示了咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠分别经皮下注射0.9％NaCl、人脂肪和脐带和胎盘来源的间充质干细胞治疗后的Ki67⁺细胞的统计分析。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现间充质干细胞能够非常有效地预防和治疗银屑病。实验表明，通过皮下注射脂肪间充质祖细胞，可以显著改善银屑病模型小鼠的表皮层过度增生，从而缓解银屑病。在此基础上完成了本发明。

间充质干细胞

如本文所用，术语“间充质干细胞”、“间充质祖细胞”具有相同含义，均是指一种多能干细胞，其具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于脂肪、骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的组织类型十分广泛，因此临床上具有广泛应用。

在优选的实施方式中，本发明的间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。

本发明的脂肪间充质干细胞由以下方法制备：

对获取的人脂肪组织进行磷酸盐缓冲液漂洗后，剪碎经0.1％I型胶原酶于37 ℃条件下消化处理1小时，再经100μm孔径的筛网过滤处理去除未消化的组织块，从而获得含脂肪间充质干细胞的滤液。之后，对这些细胞进行α-MEM培养，再经流式细胞仪鉴定其表达标志蛋白的细胞群体数量(例如，表达CD34和CD45的细胞数量低于2％，表达CD73、CD90和CD105的细胞数量大于95％)；同时，这群细胞再经成脂、成骨和成软骨分化诱导，从而被最终确定为脂肪间充质干细胞。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种含有间充质干细胞作为活性成分的用于预防或治疗银屑病的组合物。所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、食品组合物、膳食补充剂、饮料组合物等。

在本发明中，间充质干细胞可直接用于疾病治疗，例如，用于银屑病方面的治疗。在使用本发明间充质干细胞时，还可同时使用其他治疗剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明间充质干细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液等宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天2×10⁶个细胞/kg体重。

对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：注射、静脉输注等。

使用药物组合物时，是将安全有效量的间充质干细胞施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10⁶个细胞/kg体重，而且在大多数情况下不超过约 2×10⁶个细胞/kg体重，较佳地该剂量是约1×10⁶-2×10⁶个细胞/kg体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的的主要优点包括：

(a)本发明的间充质干细胞制剂可以预防和治疗银屑病。

(b)本发明的间充质干细胞制剂可以改善表皮层的过度增生。

(c)本发明的间充质干细胞制剂可以降低或消除单克隆抗体类药物治疗银屑病时所带来的潜在风险。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用材料和方法

1.试验动物

C57BL/6遗传背景的SPF级饲养的野生型小鼠(7周龄，雄性12只，购自上海斯莱克实验动物有限公司)。

2.主要材料

咪喹莫特软膏、0.9％NaCl医用注射液、4％水合氯醛(麻醉药)、4％多聚甲醛、H&E染色液、1ml注射器(针头大小26G)、人源脂肪间充质祖细胞(上海西比曼生物科技有限公司细胞生产部,P4批次,详情见表1)。

表1用于银屑病治疗的人源脂肪间充质祖细胞

3.数据统计分析

分别记录每组中每只试验小鼠所对应的组织切片的表皮厚度及其真皮层炎症细胞浸润数。所有数据均表示成平均值±标准误，并采用两尾非配对的t 检测分析对照组与试验组之间的数据在统计学上的差异是否显著；其中，P＜0.05 表示统计数据差异显著。

实施例1

咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠银屑病模型建立

为了评估人源脂肪间充质祖细胞治疗银屑病的药效作用情况，发明人建立了咪喹莫特诱导7天的C57BL/6小鼠银屑病模型，具体方法如下：

1.将C57BL/6遗传背景的野生型小鼠分成两组，并饲养于SPF级动物房，适应一周后用于试验；其中，一组为对照组，另一组为试验组。

2.使用电动剃毛器将对照组和试验组小鼠背部2cm×3.5cm范围内的毛发剃除。其中，对照组小鼠不涂抹咪喹莫特，而试验组小鼠背部剃毛处，涂抹 63mg咪喹莫特软膏(含5％咪喹莫特有效成分)，共涂抹7次，药效连续作用7 天。

3.在咪喹莫特诱导的第7天，颈椎脱臼处死对照组和试验组小鼠，取其皮肤组织并包被在锡箔纸中，再固定于4％多聚甲醛溶液中，用于石蜡切片制备。

4.H&E染色及其组织切片的显微镜下成像。

5.在Photoshop软件中统计对照组和试验组小鼠的表皮厚度及其真皮层浸润的炎症细胞数。

结果如图2所示，在咪喹莫特软膏连续诱导处理7天后，小鼠背部皮肤粗糙，呈淡红色，且明显结痂呈鳞片状(图2A)。病理性切片的H&E染色结果也显示，与对照组相比，经5％IMQ诱导的小鼠皮肤的表皮层厚度显著增加，具有显著的差异性(图2B,C)。此外，经5％IMQ诱导的小鼠皮肤的真皮层炎症细胞浸润数也比对照组的显著提高(图2D)。

因此，上述结果表明，成功获得了具有银屑病病理特征的C57BL/6小鼠模型。这为人源脂肪间充质祖细胞治疗银屑病的临床前研究提供了必不可少的动物试验模型。

实施例2

皮下注射人源脂肪间充质祖细胞治疗咪喹莫特诱导的银屑病

为了探究人源脂肪间充质祖细胞治疗银屑病的药效作用，对咪喹莫特诱导的银屑病C57BL/6小鼠进行了两次皮下注射人源脂肪间充质祖细胞重悬液 (2×10⁶细胞/小鼠)，具体实验方法如下：

1.将12只C57BL/6遗传背景的野生型小鼠分成两组，一组为对照组 (N＝6)，另一组为试验组(N＝6)，并饲养于SPF级动物房，适应一周后用于试验，以免小鼠机体产生应激反应。

2.在使用咪喹莫特诱导银屑病的前1天(D-1)及其诱导后的第2天(D2)，吸取100μl人源脂肪间充质祖细胞重悬液(2×10⁷细胞/ml)对试验组小鼠进行皮下注射(2×10⁶细胞/小鼠)，而对照组则皮下注射等体积的0.9％NaCl医用注射液。

3.每天均需对对照组和试验组中的每只小鼠背部2cm×3.5cm范围内的剃毛处，涂抹63mg咪喹莫特软膏(含5％咪喹莫特有效成分)，共涂抹7次(图 1)，药效连续作用7天(D0～D7)。

4.在咪喹莫特诱导的第7天(D7)，颈椎脱臼处死对照组和试验组小鼠，取其皮肤组织并包被在锡箔纸中，再固定于4％多聚甲醛溶液中，用于石蜡切片制备。

5.H&E染色及其组织切片的显微镜下成像，并在Photoshop软件中统计对照组和试验组小鼠的表皮厚度。

H&E染色结果如图3所示，经过人源脂肪间充质祖细胞治疗后，银屑病小鼠的背部皮肤表皮层过度增生情况得到明显改善(图3A)，统计分析表明其表皮厚度显著降低(图3B)。

上述结果表明，人源脂肪间充质祖细胞能够在一定程度上改善咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠银屑病症状。这是未来亟待发展的一种治疗银屑病皮肤炎症的潜在的干细胞治疗手段。

实施例3

皮下注射人脐带和胎盘来源的脂肪间充质祖细胞治疗咪喹莫特诱导的银屑病

实验方法与实施例2基本相同，区别在于分别用人脐带来源的间充质干细胞和胎盘来源的间充质干细胞替换脂肪间充质干细胞，以检测二者对治疗咪喹莫特诱导的银屑病的效果。

结果如图4和图5所示，人脐带和胎盘来源的间充质干细胞同样也具备治疗或改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮炎，且表现比人脂肪间充质祖细胞效果更佳。具体地，人脐带和胎盘来源的间充质干细胞治疗后的小鼠皮肤表皮增生得到显著改善(图4A)，且统计分析结果表明其表皮厚度显著降低(图4B)，并且，也抑制了表皮层角质细胞的增殖(图5A,5B)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种间充质干细胞的用途，其特征在于，用于制备一制剂，所述制剂(a)用于预防或治疗皮肤病；或(b)用于抑制表皮层过度增生。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的间充质干细胞选自下组：

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的间充质干细胞为人源的。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的皮肤病为自身免疫介导的皮肤病。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的皮肤病选自下组：银屑病、烧伤、痤疮、特应性皮炎。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述制剂用于治疗银屑病，并且所述的治疗银屑病包括缓解银屑病症状。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的缓解银屑病症状包括抑制表皮层过度增生、减轻真皮层炎症细胞浸润。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的表皮层过度增生由咪喹莫特诱导。

9.一种治疗银屑病的制剂，其特征在于，所述制剂包含(a)间充质干细胞；(b)银屑病治疗药物；(c)药学上可接受的载体。

10.如权利要求10所述的制剂，其特征在于，所述制剂的剂型为注射剂。