KR101070730B1

KR101070730B1 - Ｃｄ45가 발현되는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 질환 예방 및 치료용 의약 조성물

Info

Publication number: KR101070730B1
Application number: KR1020100128784A
Authority: KR
Inventors: 이권행; 지보근; 진영준
Original assignee: 하이스템 (주)
Priority date: 2010-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2011-10-07

Abstract

본 발명은 CD45가 발현되는 중간엽 줄기세포 또는 그 배양물을 유효성분으로 포함하는 아토피 질환 예방 및 치료용 의약 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조혈모세포의 양성 표면마커인 CD45를 특이하게 발현하는 중간엽 줄기세포 및 그 배양액은 아토피 증상을 억제하고, IgE 농도를 낮출 수 있다.

Description

ＣＤ45가 발현되는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 질환 예방 및 치료용 의약 조성물{Phamaceutical compostions for preventing and treating atopic diseases comprising mesenchymal stem cell expressing CD45 as an effective component}

본 발명은 중간엽 줄기세포를 포함하는 아토피 질환 예방 및 치료를 위한 의약 조성물에 관한 것이다.

아토피성 피부염은 재발되기 쉬운 만성 피부질환으로서, 유전적 소인, 환경적 원인, 면역학적 원인, 피부장벽 기능 이상 등의 내, 외부의 여러 요인이 복합적으로 관여하여 발생하는 질환으로 생각되고 있으며, 2차적으로 나타나는 증상으로 세균의 침입, 정신적 스트레스 등이 나타난다. 주요 원인으로 환경공해로 인한 알레르기 물질 증가 등이 아토피 피부염과 밀접한 관련이 있는 것으로 추정된다고 보고되고 있으나, 아직 구체적인 원인은 밝혀져 있지 않다.

현재 아토피성 피부염 치료를 위하여 사용되는 치료제들로는 국소 스테로이드제, 면역억제제, 항히스타민제, 그리고 세균감염을 예방하기 위해 항생제 연고 등이 사용되고 있으나, 이들 약물들의 사용으로 인한 다양한 부작용이 보고되고 있을 뿐만 아니라, 아토피성 피부염에 대한 근본적인 치료제는 아니므로 이들을 지속적으로 적용하기가 곤란하다.

또한, 약물 요법 이외에 아토피성 피부염의 개선이나 증상완화의 목적으로 상대적으로 부작용이 적은 화장료가 연구되고 있다. 상기 화장료에는 주로 보습제 성분이 함유되어 있으며, 예를 들어 세포막을 구성하는 인지질 성분인 세라마이드를 함유한다. 보습제 이외에 천연 식물 추출물이나 심층수로부터 분리한 천연 미네랄 등을 함유하는 기능성 화장료가 시판 중에 있다. 그러나 보습제, 천연 추출물, 혹은 미네랄 등을 함유하는 화장료에 있어서도, 아직 구체적인 임상적 활성이 명확하게 검증되어 있지는 않다.

중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포 (multipotent stem cell)로서, 중간엽 줄기세포가 면역억제 작용을 나타내는 것으로 보고되고 있으며, 이는 중간엽 줄기세포가 마이토젠(mitogen)이나 동종 세포로 자극된 T-세포의 증식을 억제함으로써 면역반응을 억제시키는 것으로 보고되고 있다(Djouad F. et al., Blood 2003).

중간엽 줄기세포 중, 골수 유래 간엽 줄기세포는 환자로부터 얻을 수 있으며, 자가이식 (autologous transplantation) 되면 면역거부반응에 대한 문제가 없으므로 임상적으로 사용하는데 이점을 갖는다. 그러나 골수 유래 중간엽 줄기세포의 채취는 여러 단계의 시술이 필요하고 시술과정이 복잡하여 채취 대상자에게 시간적, 정신적 및 육체적 고통과 부담을 주는 문제점도 있다. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 분만과정에서 버려지는 제대 (umbilical cord)로부터 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 제대혈의 보관산업이 활성화되어 이미 구축된 인프라를 통하여 공여자를 구하는 것도 쉬우므로 간엽 줄기세포의 확보가 용이하고, 타가 유래의 제대혈로부터 얻은 간엽 줄기세포의 경우에도 이식 후 면역반응을 일으키지 않아 면역학적 안정성을 갖는다는 이점이 있다.

이에 본 발명자들은 자가면역질환, 특히 아토피나 알레르기 질환의 새로운 치료법에 관하여 연구하던 중 조혈모세포의 양성 표면마커인 CD45를 특이하게 발현하는 중간엽 줄기세포 및 그 배양액이 아토피 질환모델 마우스에서 아토피 증상을 억제하고, IgE 농도를 낮춘다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 중간엽 줄기세포를 포함하는 아토피 치료용 의약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 아토피 질환 예방 및 치료용 의약 조성물은 CD45가 발현되는 중간엽 줄기세포 또는 그 배양물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 아토피 질환 예방 및 치료용 의약 조성물은 상기 CD45가 발현되는 중간엽 줄기세포의 배양물은 액체배지에서 배양한 배양액 또는 그 배양액을 여과 또는 원심분리하여 상기 중간엽 줄기세포를 제거한 여액인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 아토피 질환 예방 및 치료용 의약 조성물에서 상기 중간엽 줄기세포는 중간엽 줄기세포의 양성 표면마커인 CD13, CD14, CD29, CD44 및 CD105를 발현하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 아토피 질환 예방 및 치료용 의약 조성물에서 상기 중간엽 줄기세포는 조혈모세포의 양성 표면마커인 CD31, CD34, CD90, CD117을 발현하지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 아토피 질환 예방 및 치료용 의약 조성물에서 상기 중간엽 줄기세포는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 CD45가 발현되는 중간엽 줄기세포 또는 그 배양물을 유효성분으로 포함하는 의약 조성물은 아토피 질환 치료에 효과적이다.

도1은 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 집합으로 형성된 군집 사진이다.
도 2는 조혈모세포의 양성 표면마커이자 중간엽 줄기세포의 음성 표면마커인 CD31, CD34, CD90, CD117 및 CD45 의 면역학적 특성을 나타낸 것이다.
도 3은 중간엽 줄기세포의 양성 표면마커인 CD13, CD14, CD29, CD44 및 CD105의 면역학적 특성을 나타낸 것이다.
도 4는 DNFB로 처리하여 아토피를 유발한 마우스와 대조군의 사진이다.
도 5는 본 발명의 아토피 억제효과 확인 실험의 개략적인 과정을 보여주는 도표이다.
도 6은 본 발명의 실시예의 제대혈 줄기세포의 아토피 억제 효과를 보여주는그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예의 제대혈 줄기세포의 배양상등액의 아토피 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 각 실험군의 마우스 피부조직의 조직병리학적 사진이다.
도 9는 아토피와 같은 과잉면역질환에서 주로 나타나는 IgE농도를 나타낸 그래프이다.

본 발명에서 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 뼈(bone), 연골(cartilage), 지방(fat), 힘줄(건), 신경 조직(nerve tissue), 섬유아세포(fibroblast) 및 근육 세포(muscle cell) 등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 만능 전구 세포(pluripotent progenitors) 를 말한다. 이 중간엽 줄기세포는 골수(bone marrow), 말초신경 혈액, 재대혈, 골막(periosteum), 진피(dermis) 및 중배엽 기원의 조직 등으로부터 분리되고 정제될 수 있다.

본 발명의 중간엽 줄기세포를 배양하기 위한 배지로는, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), ISDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 및 MSCGM 등의 세포 기본배지를 사용할 수 있고 나아가 이 기본배지에 인슐린(insulin)(10ng/mL), 하이드로코리트존(hydrocortisone)(10nM), EGF (10ng/mL), FGF, NGF, LIF 등의 성장인자 또는 우태아혈청, 말혈청, 염소혈청, 인간혈청, 제대혈청 등의 성장에 필수적인 혈청 등이 포함된 배지를 사용할 수도 있다.

본 발명의 중간엽 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 국소 투여용 제제 등이 포함된다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약제학적으로 허용할 수 있는 용매를 사용한 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체 혹은 매체, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형체, 비히클 (vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당히 조합하여, 일반적으로 인정되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화할 수 있다.

상기 제제는 통상의 방법에 따라 비경구적으로 투여될 수 있다. 상기 비경구 투여는 국부적 또는 전신적 투여를 포함한다. 상기 국부적 투여는, 직접적으로 병변 또는 그 주변에 투여하는 것, 예를 들면 병변인 피부 조직에 직접 투여하는 것일 수 있다. 상기 전신적 투여는 복강내, 정맥 또는 동맥에 투여하는 것을 포함한다. 상기 동맥은 병변에 혈액을 공급하는 부위일 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포의 1일 투여량은 1x10⁴ 내지 1x10⁷ 세포/kg 체중일 수 있다. 투여회수는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 간엽 줄기세포, 예를 들면 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 증감이 가능하다.

본 발명의 중간엽 줄기세포는 중간엽 줄기세포 양성 표면마커인 CD13, CD14, CD29, CD44 및 CD105가 발현되는 것이고, 중간엽 줄기세포의 음성 표면마커이자 조혈모세포의 양성 표면마커인 CD31, CD34, CD90, CD117 및 CD45 중에서, CD31, CD34, CD90 및 CD117는 발현되지 않고, 특이하게도 CD45는 발현되는 것이다. 본 발명의 세포에서 양성 표면마커가 발현된다는 것은 세포에서 양성 표면마커가 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 발현되는 것을 포함하고, 음성 표면마커가 발현되지 않는 다는 것은, 음성 표면마커가 10%이하, 바람직하게는 5%이하로 발현되는 것을 포함하는 의미이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 분리 및 배양

제대혈로부터 얻은 혈액샘플을 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, WelGENE, Republic of Korea)과 1:1 비율로 희석한 후 1:2의 비율로 피콜 패크(Ficoll-paque, GE Healthcare, UK)상에서 30분간 300 x g로 원심분리를 실시하였다. 원심분리 후 단핵세포층(mononuclear cells layer)로 이뤄진 버피코트를 DMEM과 1:1의 비율로 희석한 후 CD45 mAb(DINONA, Republic of Korea)를 이용하여 CD45 양성 줄기세포를 얻었다. 상층액을 제거한 후 침전세포를 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, WelGENE)로 2번 세척을 하였다.

얻어진 단핵침전세포층을 항생제(1000 U/㎖ 페니실린, 1000 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, WelGENE)과 2 mM 글루타민(Glutamine, WelGENE)이 포함된 DMEM 배지에 20% 우태혈청(FBS; fetal bovine serum, WelGENE)과 함께 세포성장인자로서 M-CSF(Macrophage-Colony Stimulating Factor) 10 ng/㎖, G-CSF(Granulocyte-Colony Stimulating Factor) 10 ng/㎖, GM-CSF(Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor) 10 ng/㎖, IL-1α (Interleukin-1 alpha) 10 ng/㎖, IL-3(Interleukin-3) 10 ng/㎖ 및 SCF(Stem Cell Factor) 50 ng/㎖ 또는 GM-CSF(Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor) 10 ng/㎖, IL-3(Interleukin-3) 10 ng/㎖, SCF(Stem Cell Factor) 50 ng/㎖ 및 Flt3L (Fms-like Tyrosine kinase 3 Ligand) 50 ng/㎖를 첨가하여 5일간 배양하여 부유세포를 제거하고, 부착세포만을 20% 우태혈청이 포함된 DMEM으로 20일간 더 배양을 하였다.

위 방법으로 얻어진 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 보여주는 사진을 도 1에 나타내었다.

실험예 1 : 중간엽 줄기세포의 세포 표면항원 특성 확인

실시예 1에서 분리 및 배양된 중간엽 줄기세포(이하 'Histem cell'이라고도 한다)의 세포 표면항원 특성을 알아보기 위해 세포 표면항원을 FACS(fluorescence activated cell sorting; 유세포 분리기)로 분석하여 그 결과를 도 2 및 3에 나타내고, 그 결과를 표 1에 정리하였다.

도 2는 조혈모세포의 양성 표면마커이자 중간엽 줄기세포의 음성 표면마커인 CD31, CD34, CD90, CD117 및 CD45 의 면역학적 특성을 나타낸 것으로, 표면항원중 CD45에 특이적으로 양성반응을 나타내고 있다.

도 3은 중간엽 줄기세포의 양성 표면마커인 CD13, CD14, CD29, CD44 및 CD105의 면역학적 특성을 나타낸 것으로, 표면항원 모두에서 양성반응을 나타내어 본 발명의 세포가 중간엽 줄기세포임을 나타내고 있다.

조혈모세포	중간엽줄기세포	표면마커	Histem cell
+		CD31	음성
+		CD34	음성
+		CD45	양성
+		CD90	음성
+		CD117	음성
	+	CD13	양성
	+	CD14	양성
	+	CD29	양성
	+	CD44	양성
	+	CD105	양성

실시예 2 : 중간엽 줄기세포 배양상등액의 제조

실시예 1에서 분리 및 배양된 중간엽 줄기세포 배양액을 1500 rpm, 5 분간 원심분리 하여 상등액을 0.22㎛ 주사식 여과기로 여과하여 줄기세포 배양상등액을 준비하였다.

실험예 2 : 아토피 질환 억제 효과

(1) 아토피 질환모델 마우스의 제조

Balb/c 마우스를 0.5%의 DNFB (2,4-DINITROFLUOROBENZENE, DNFB를 acetone : oil = 4 : 1 용액으로 희석하여 사용함.)를 등 (back) 피부에 도포함으로써 감작 (sensitization) 시켰다. 5일 후 0.2%의 DNFB를 귀 (ear)에 도포하여 야기주사 (challenge)하였다. 4시간후에 세포를 1 X 10 ⁶cells씩 injection, 24시간 후 각 실험군에서 귀부종(ear swelling)과 귀의 조직학적 형태변화를 측정하고 관찰하였다.

DNFB로 처리하여 만들어진 아토피 질환모델 마우스와, DNFB를 처리하지 않은 마우스(대조군)의 사진을 도 4에 나타내었다. DNFB로 자극을 준 아토피 마우스 동물모델(실험군)의 귀가 처리하지 않는 대조군의 마우스 귀보다 눈에 띄게 커지고 두꺼워지며 혈관형성 또한 뚜렷하게 보여진다.

(2) 아토피 억제효과 확인

도 5에 나타낸 것과 같이 실험 첫 번째 날 0.5% DNFB를 이용하여 자극을 준 후, 5일 후에 다시 0.2% DNFB로 아토피를 유발시킨다. 4시간 후 실시예 1의 제대혈 줄기세포(MSC)를 아토피 쥐의 꼬리에 100 ㎕(1 X 10 ⁶cells)를 주사하였고, 실시예 2의 제대혈 줄기세포 배양상등액(Culture Supernatant)을 아토피 유발 부분에 100 ㎕ 를 발라주었다. 본 발명의 제대혈 줄기세포(실시예 1) 또는 그 배양액(실시예 2)로 처리했을 때 DNFB처리군에 비해 귀의 두께가 현저히 얇아진 것을 확인할 수 있었다(도 6 및 도 7).

또한 마우스 귀 피부조직의 조직병리학적 변화를 확인하기 위해 마우스의 귀 부분을 절단하여 4% paraformaldehyde으로 고정시킨 후, 파라핀을 이용하여 포매시키고, 박절기(microtome)를 이용하여 5 ㎛로 표본을 절단한 후, H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색(Jonathan M.S. et al., J.Clin. Invest. 101, 1614-1622, 1998)을 하여 현미경으로 관찰한 결과를 도 8에 나타내었다. 아무것도 처리하지 않은 대조군인 control과 비교하여 DNFB를 처리하여 아토피를 유발하였을 경우 매우 눈에 띄게 두꺼워진 조직을 볼 수 있다. 이렇게 귀가 두꺼워진 상태에 제대혈줄기세포(MSC)와 제대혈줄기세포 배양상등액(Culture sup.)을 처리하였을 경우 대조군(control) 과 유사한 두께로 회복되는 것을 알 수 있다.

실험예 3 : IgE 농도 억제 효과

실험예 2의 각 실험군의 마우스 심장에서 혈액을 채혈하여, IgE 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다. 채혈한 혈액을 6,000rpm으로 20분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청내 total IgE는 mouse IgE ELISA kit(Biolegnd. Inc. San Diego. USA) 사용, 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 450 nm에서 광학도 (optical density; O.D)를 측정하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.

ELIZA방법을 이용하여 급성면역질환에 관여하는 IgE의 농도를 알아본 결과 대조군에 비해서 통계적 유의성을 보이며 2배 이상 DNFB를 처리한 실험군에서 IgE의 농도가 높게 나타났다(약 17 ng/ml에서 DNFB를 처리할 경우엔 40 ng/ml까지 IgE의 농도가 올라간다. P<0.01). 이런 실험군에 제대혈 줄기세포(MSC, HSC, MSC+HSC)나 제대혈 줄기세포 배양액(Culture Sup.)를 처리할 경우엔 실험군보다 통계적 유의성을 가지며 절반 정도 IgE의 농도가 줄어드는 것을 알 수 있다(대조군인 17 ng/ml과 실험군인 40 ng/ml의 중간 정도되는 30 ng/ml까지 제대혈 줄기세포를 처리하거나 제대혈 줄기세포 배양액을 처리하면 IgE의 농도가 떨어진다. P<0.5).

Claims

제대혈에서 유래된 중간엽 줄기세포로서, 중간엽 줄기세포의 양성 표면마커인 CD13, CD29, CD44 및 CD105가 발현되고, 조혈모세포의 양성 표면마커이면서 중간엽 줄기세포의 음성 표면마커인 CD31, CD34, CD45 및 CD117 중에서 CD31, CD34 및 CD117 가 발현되지 않고, CD45가 발현되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 또는 그 배양물을 유효성분으로 포함하는 아토피 질환 예방 및 치료용 의약 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 CD45가 발현되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 배양물은 액체배지에서 배양한 배양액 또는 그 배양액을 여과 또는 원심분리하여 상기 중간엽 줄기세포를 제거한 여액인 것을 특징으로 하는 아토피 질환 예방 및 치료용 의약 조성물.
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